JP2019054752A

JP2019054752A - 口腔細菌叢中の構成叢比を予測する方法

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Publication number: JP2019054752A
Application number: JP2017181000A
Authority: JP
Inventors: 光博岡野; Mitsuhiro Okano; 厚司湯田; Atsushi Yuda
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2019-04-11
Anticipated expiration: 2037-09-21
Also published as: JP6836756B2

Abstract

【課題】本発明は口腔細菌叢の構成叢比を簡易に予測する方法を提供する。【解決手段】単球細胞の培養液に被験者から採取した唾液を加え、更に培養した後、培養液中のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の量を測定することによりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌に対する量比、口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の含有比率および口腔細菌叢中のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の含有比率を予測することにより解決される。【選択図】図４

Description

本発明は口腔細菌叢の構成叢比を簡易に予測する方法に関するものである。

口腔細菌叢（フローラ）の主要な構成叢として、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門細菌がある。口腔細菌叢の構成異常は歯周病などの口腔疾患のみならず、炎症性腸疾患などの重篤な全身疾患にも関与すると言われており（非特許文献１）、例えば炎症性腸疾患では口腔細菌叢のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌が増加し、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌が減少することが報告されており（非特許文献２）、癌において同様の報告がされている（非特許文献３）。さらに発明者らは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌やＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の含有率が、アレルギー性鼻炎の治療方法である舌下免疫療法の治療効果に関与することを見いだしている（図１）。

一方、口腔などの菌叢構造を網羅的に解析する手法として、現在ではメタ１６ｓＲＮＡ解析とメタゲノム解析が主流であるが、これらの方法では、詳細な菌叢を検知できるが、解析に必要な時間と費用の面で課題がある。すなわち、１検体当たりのメタ１６ｓＲＮＡ解析には高額の費用が必要であり、メタゲノム解析ではさらに高額となる。また、医療機関内で解析を行うことが困難であるため、医療機関で唾液を採取し、専門検査機関に唾液を送付し、口腔細菌叢（フローラ）解析を依頼してから解析結果を得るまでに２月以上を要することもある。

Wade WG. The oral microbiome in health and disease. Pharmacological Research 69: 137-143, 2013 Said HS, et al. Dysbiosis of salivary microbiota in inflammatory bowel disease and its association with oral immunological biomarkers. DNA Research 21: 15-25, 2014. Le Bars P, et al. The oral cavity microbiota: between health, oral disease, and cancers of the aerodigestive tract. Canadian Journal of Microbiology 63: 475-492, 2017.

これらのことから、簡便で医療機関内の施設で解析でき、短期間、安価な口腔細菌叢の解析方法が求められている。

本発明者らは、ＴＨＰ−１細胞の培養液に被験者から採取した唾液を加え、更に培養した後、培養液中のインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の量を測定することによりＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌に対する量比、口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の含有比率（以下、単に比率ということもある）および口腔細菌叢中のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の含有比率を予測することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
［１］単球細胞培養液に唾液を加え、さらに培養し、培養液中のインターロイキン−１０の量を測定する工程を含む、口腔細菌叢中の構成叢比の予測方法、
［２］単球細胞がヒト単球細胞である［１］記載の方法、
［３］ヒト単球細胞がＴＨＰ−１細胞である［２］記載の方法、
［４］構成叢比が、口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の含有比率である［１］記載の方法、
［５］構成叢比が、口腔細菌叢中のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の含有比率である［１］記載の方法、
［６］構成叢比が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の含有比率のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の含有比率に対する量比である［１］記載の方法、および
［７］口腔細菌叢中の構成叢比を予測するためのインターロイキン−１０量測定キット。

本発明によれば簡便に口腔細菌叢の予測をすることができる。

舌下免疫療法の有効性と口腔細菌叢の構成叢比との関係を示す。すなわち、舌下免疫療法が著効した患者（Ｖｉｓｕａｌａｎａａｌｏｇｕｅｓｃａｌｅ（ＶＡＳ）スコアが０）が、無効であった患者（ＶＡＳスコアが９５以上）の患者に比べＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の比率が高く、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の比率が低いことを示す。図中、Ｐは有意確率（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙｔｅｓｔ）を示す。培養液中のＩＬ−１０濃度と口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌含有比率の相関を示す。図中、Ｒは相関係数を、Ｐは有意確率（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙｔｅｓｔ）を示す。培養液中のＩＬ−１０濃度と口腔細菌叢中のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌含有比率の相関を示す。図中、Ｒは相関係数を、Ｐは有意確率（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙｔｅｓｔ）を示す。培養液中のＩＬ−１０濃度と、口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌に対する量比（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の比率／Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の比率）を示す。図中、Ｒは相関係数を、Ｐは有意確率（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙｔｅｓｔ）を示す。

本発明に用いる単球細胞は、単球細胞であれば適宜用いることができるが、ヒト単球細胞が好ましく、ＴＨＰ−１細胞がより好ましい。ＴＨＰ−１細胞は商業的に入手可能であり、例えば、コスモバイオ株式会社から入手できる。

ＴＨＰ−１細胞の培養は、一般にＴＨＰ−１細胞の培養方法として用いられている方法であれば適宜用いることができるが、ＲＰＭＩ１６４０などの培地を１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）存在下、５％ＣＯ_２（二酸化炭素）、３７℃の環境において培養することが好ましい。培養中、培地は２〜３日に一度交換し、細胞数を２〜８ｘ１０^５個／ｍＬに維持し、必要に応じて継代培養することが好ましい。

単球細胞を上記条件下で培養し、被験者から採取した唾液を培養液に加える。唾液の採取方法は適宜選択することができるが、Ｓａｌｉｖａｃｏｌｌｅｃｅｔｉｏｎａｉｄ（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ社）または類似の器具を用いることができる。唾液は希釈せずに用いることもできるが、適宜希釈して用いることもできる。希釈は通常用いられる緩衝液を適宜用いて行うことができるが、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いることが好ましい。また、唾液は採取後冷蔵保存したのちに用いることもできるが、採取直後に用いることが好ましい。

唾液はＴＨＰ−１細胞培養液０．５ｍＬあたり０．０５μＬ〜５０μＬ（希釈なしの場合）加えることができ、好ましくは５μＬである。

唾液を加えたのち、単球細胞（例えば、ＴＨＰ−１細胞）を更に培養する。単球細胞（例えば、ＴＨＰ−１細胞）は上記培養方法と同様に行うことができる。培養時間は、好ましくは１２〜４８時間、より好ましくは１２〜３６時間、さらに好ましくは２４時間である。

培養終了後、培養上清に含まれるＩＬ−１０量を測定する。ＩＬ−１０量の測定は自体公知の方法を用いることができ、特に限定されない。ウエスタンブロット法、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法などを用いることができるが、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。ＥＬＩＳＡ法は、ＩＬ−１０量を測定できるものであればよいが、抗ヒトIＬ−１０モノクローナル抗体（キャプチャー用抗体）でコートしたプレートにＩＬ−１０を含む培養液を添加し、さらに抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体（検出用抗体）を添加し、当該検出抗体量を測定するサンドイッチＥＬＩＳＡ法が好ましい。検出用抗体は標識することができ、標識方法としてビオチン化標識を選択した場合、アビジンと結合させた酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅなど）などを用い、酵素活性を測定することによりＩＬ−１０量を測定することができる。

口腔細菌叢中の構成叢比を予測するためのインターロイキン−１０量測定キットは、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ法によりＩＬ−１０量を測定するものが挙げられ、キットには、例えば、抗ヒトIＬ−１０モノクローナル抗体などのキャプチャー用抗体、ビオチン化された抗ＩＬ−１０モノクローナル抗体などの検出用抗体、アビジンと結合させた酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅなど）、酵素活性測定用試薬、検量線作成のためのスタンダードとして用いるためのヒトＩＬ−１０、各種緩衝液、９６穴プレート、取扱説明書などが含まれる。

培養液中のＩＬ−１０の測定値が、例えば、３０ｐｇ／ｍＬ以上のとき、口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌含有比率が３０％以上と予測することができる（感度８９％、特異度８３％）。培養液中のＩＬ−１０の測定値が、例えば、３０ｐｇ／ｍＬ以上のとき、口腔細菌叢中のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌含有比率が２０％未満と予測することができる（感度８３％、特異度８９％）。また、培養液中のＩＬ−１０の測定値が、例えば、８５ｐｇ/ｍＬ以上のとき、口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌に対する量比（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の比率／Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の比率）が１．７以上と予測することができる（感度１００％、特異度８８％）。

培養液中のＩＬ−１０濃度の高いほど口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌に対する量比（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の比率／Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の比率）が大きく、炎症性腸疾患の罹患リスクが高い（あるいは罹患している）と予測することができる。

培養液中のＩＬ−１０濃度の高いほど口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌に対する量比（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の比率／Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の比率）が大きく、舌下免疫療法の有効性が高いと予測することができる。

メタ１６ｓＲＮＡ解析は、Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils. Leininger, S. et al. Nature. 2006 442, 806-809.、Pyrosequencing enumerates and contrasts soil microbial diversity. Roesch, L.F. et al. ISME J. 2007 1, 283-290.、A core gut microbiome in obese and lean twins. Turnbaugh, P.J. et al. Nature. 2009 457, 480-484.、Human gut microbiota in obesity and after gastric bypass. Zhang, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2009 106, 2365-2370.等の文献を参考にして行うことができる。

［実施例１］
１５名の被験者から唾液を採取し、冷蔵保存し、ＰＢＳで唾液が１％になるように希釈した。１０％のウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌｃａｌｆｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）を加えたＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２において培養液中の濃度が０．８×１０^６個／ｍＬになるように培養したＴＨＰ−１細胞培養液５００μＬに、唾液５μＬを添加した。さらに３７℃、５％ＣＯ_２において２４時間培養したのち培養上清を回収し、上清中のＩＬ−１０量をＥＬＩＳＡ法により測定した。ＥＬＩＳＡは、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＨｕｍａｎＩＬ−１０ＥｌｉｓａＳｅｔ（カタログ番号：５５５１５７）を用い、添付されたＴｅｃｈｎｉｃａｌＤａｔａＳｈｅｅｔに記載された方法で行った。

被験者から採取した同一の唾液サンプル中に含まれるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門細菌の量比をメタ１６ｓＲＮＡ解析により算出した（株式会社マクロジェン・ジャパン）。

被験者ごとのＩＬ−１０濃度およびメタ１６ｓＲＮＡ解析結果（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌およびＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門細菌の比率）を表１に示す。

培養液中のＩＬ−１０濃度とＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌比率が正の相関（Ｒ＝０．８１４）を示し（図２）、培養液中のＩＬ−１０濃度とＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌が負の相関（Ｒ＝−０．８７３）を示した（図３）。また、同様に培養液中のＩＬ−１０濃度と、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌とＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌との量比（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の比率／Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の比率）が正の相関（Ｒ＝０．８９６）を示すことが明らかとなった（図４）。相関係数はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを用いてスピアマンの順位相関係数を算出した。

以上の事から、ＩＬ−１０量を測定することにより口腔細菌叢の構成比を予測できることが明らかとなった。

本発明によって、安価かつ短時間で口腔内細菌の構成（主要細菌叢）を予測することができる。例えば本検査法にてＩＬ−１０量を測定することにより、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の優位性（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌比率／Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌比率が大きい）が確認できれば、炎症性腸疾患のリスクを示すことができる。このことから、本発明が口腔細菌叢の関与する疾患の早期発見や早期治療、舌下免疫療法の治療効果予測などに有用である可能性が示される。

Claims

単球細胞培養液に唾液を加え、さらに培養し、培養液中のインターロイキン−１０の量を測定することによる、口腔細菌叢中の構成叢比の予測方法。
単球細胞がヒト単球細胞である、請求項１記載の方法。
ヒト単球細胞がＴＨＰ−１細胞である、請求項２記載の方法。
構成叢比が、口腔細菌叢中のＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の含有比率である、請求項１記載の方法。
構成叢比が、口腔細菌叢中のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の含有比率である、請求項１記載の方法。
構成叢比が、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ門細菌の含有比率のＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌の含有比率に対する量比である、請求項１記載の方法。
口腔細菌叢中の構成叢比を予測するためのインターロイキン−１０量測定キット。