JP2019041668A - Antibody against advanced glycation end product and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）、特にグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。 The present invention relates to a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to advanced glycation end products (AGEs), particularly glyceraldehyde-derived AGEs or an epitope of glycolaldehyde-derived AGEs.
終末糖化産物（ＡＧＥｓ）は、生体内でアミノ酸、主にリシンのアミノ基が還元糖によって非酵素的に修飾された後、酸化・脱水・縮合などの複雑な反応を経て生成する物質の総称である。加齢や高血糖状態で生成するＡＧＥｓは糖尿病合併症や動脈硬化などの生活習慣病と関連していると考えられている。特に、糖代謝中間体のグリセルアルデヒドに由来するＡＧＥｓ（グリセルＡＧＥｓ；Glycer-AGEs）は、毒性ＡＧＥｓ（Toxic AGEs：ＴＡＧＥ）とも称され、診断、予防において有用なバイオマーカーとして注目されている（非特許文献１〜３）。 Advanced glycation end products (AGEs) is a generic term for substances that are generated in vivo via complex reactions such as oxidation, dehydration, condensation, etc. after amino acids, mainly the amino group of lysine, are modified non-enzymatically by reducing sugars is there. It is thought that AGEs produced in aging and hyperglycemic state are associated with lifestyle-related diseases such as diabetes complications and arteriosclerosis. In particular, AGEs (glycer AGEs; Glycer-AGEs) derived from glyceraldehyde, which is a sugar metabolism intermediate, are also referred to as toxic AGEs (Toxic AGEs: TAGE), and are noted as useful biomarkers in diagnosis and prevention ( Non-patent documents 1 to 3).
ＡＧＥｓに含まれる構造はいくつか特定されており、その一つであるカルボキシメチルリシン（Ｎε−（カルボキシメチル）リシン、ＣＭＬ）は、グルコースとリシンの反応で生成するアマドリ化合物の糖部分が遷移金属の存在下で酸化的に解裂してエリスロン酸とともに生成される物質として同定されている。ＡＧＥｓ研究の歴史から、ＡＧＥｓの定量は構造が明らかになっているＣＭＬの定量で代替されてきた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＣＭＬの主な生成経路は、シッフ塩基あるいはアマドリ化合物の酸化的開裂によると考えられている。また、ＣＭＬはグリオキサール（ＧＯ）およびグリコールアルデヒドを前駆体とする分子内カニッツァロ反応やグルコースの自動酸化によっても生成することが知られている。タンパク質中のＣＭＬは酸加水分解に安定なこともあり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法やガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）法で定量することが可能である（非特許文献１）。 Several structures included in AGEs have been specified, and one of them, carboxymethyl lysine (Nε- (carboxymethyl) lysine, CML), has a sugar moiety of the Amadori compound formed by the reaction of glucose and lysine as a transition metal It has been identified as a substance that is oxidatively cleaved in the presence of and is produced with erythronic acid. From the history of AGEs research, quantification of AGEs has been replaced by quantification of CML whose structure has been clarified. The main generation pathway of CML in vitro is considered to be by oxidative cleavage of a Schiff base or Amadori compound. CML is also known to be produced by intramolecular Cannizzaro reaction using glyoxal (GO) and glycolaldehyde as precursors and autoxidation of glucose. CML in proteins may be stable to acid hydrolysis and can be quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) or gas chromatography / mass spectrometry (GC / MS) (Non-patent document 1) .
エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法によるＡＧＥｓの定量として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて作成したＡＧＥｓ（ＡＧＥｓ含有ウシ血清アルブミン、ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）を抗原とする、抗ＡＧＥｓ−ＢＳＡ抗体を用いた競合enzyme-linked immunosorbent assay（ＥＬＩＳＡ）法に始まるが、後にこれらの抗体はＣＭＬ構造をエピトープとする抗ＣＭＬ抗体であることが判明した（非特許文献１）。一方で、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）にグリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、メチルグリオキサール、またはグリオキサールを添加してそれぞれ作成したＡＧＥｓを抗原として抗血清を調製し、得られた抗血清を精製してＣＭＬ非結合性の画分を得たとの報告がされている（非特許文献４）。当該画分として得られたポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイが行われており、ＣＭＬ以外のＡＧＥｓの定量方法として利用されている（非特許文献５および６）。 As quantification of AGEs by enzyme immunoassay (EIA) method, competition enzyme using anti-AGEs-BSA antibody which uses AGEs (bovine serum albumin containing AGEs, AGEs-BSA) prepared using bovine serum albumin (BSA) as an antigen Starting with -linked immunosorbent assay (ELISA) method, these antibodies were later found to be anti-CML antibodies whose epitope is CML structure (Non-patent Document 1). On the other hand, glyceraldehyde, glycolaldehyde, methylglyoxal or glyoxal is added to rabbit serum albumin (RSA) to prepare an antiserum using AGEs prepared as antigens, and the obtained antiserum is purified to obtain CML It has been reported that a binding fraction has been obtained (Non-patent Document 4). An ELISA assay using a polyclonal antibody obtained as the fraction has been carried out, and is used as a method for quantifying AGEs other than CML (Non-patent Documents 5 and 6).
例えば、不妊治療の成否とグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）との相関についての研究がされており、血中のGlycer-AGEs量が高いと継続妊娠率が不良であるとの報告がされている（非特許文献１〜３、５および６）。そういった研究においては、上述のポリクローナル抗体のうちの抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイが利用されている（非特許文献５および６）。 For example, research has been conducted on the correlation between the success or failure of infertility treatment and glyceraldehyde-derived AGEs (Glycer-AGEs), and it has been reported that the continuous pregnancy rate is poor when the amount of Glycer-AGEs in blood is high. (Non-Patent Documents 1 to 3, 5 and 6). In such research, an ELISA assay using anti-glyceraldehyde-derived AGE antibody among the above-mentioned polyclonal antibodies is used (Non-patent Documents 5 and 6).
また、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥｓを抗原としたモノクローナル抗体の作成について報告がされている（非特許文献７）。 In addition, it has been reported about the preparation of a monoclonal antibody using AGEs derived from glyceraldehyde as an antigen (Non-patent Document 7).
本発明の目的は、ＡＧＥｓ、特にグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに対して高い選択性および親和性を有するモノクローナル抗体、およびそれを利用した分析方法を提供することである。さらに本発明の目的は、前記モノクローナル抗体を用いた疾患の診断方法、治療方法および予防方法、特に不妊症の診断方法、治療方法、および予防方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a monoclonal antibody having high selectivity and affinity for AGEs, particularly glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs, and an analysis method using the same. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for diagnosing, treating and preventing a disease using the monoclonal antibody, in particular, a method for diagnosing, treating and preventing infertility.
本発明者らは、研究の結果、特定のモノクローナル抗体が、良好な選択性および抗原への高い結合性を有し、分析方法や診断方法、治療方法および予防方法に利用可能であることを見いだし、本発明を完成させるに至った。 As a result of the study, the present inventors have found that a specific monoclonal antibody has good selectivity and high binding to an antigen, and can be used for analysis methods, diagnostic methods, therapeutic methods and prophylactic methods. The present invention has been completed.
本発明により、以下の発明が提供される。
［１］１）重鎖可変領域の各相補性決定領域（ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３）および軽鎖可変領域の各相補性決定領域（ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、
（Ａ）
（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
（Ｂ）
（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：１０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：１１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：１３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：１４に示すアミノ酸配列に含まれる連続する１２残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：１５に示すアミノ酸配列に含まれる連続する９残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
を含む、抗体またはその抗原結合断片；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［２］１）重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、それぞれ：
配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
配列番号：１２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：１６のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、である、抗体またはその抗原結合断片；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
［１］に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［３］前記エピトープがグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープである、［１］または［２］に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［４］完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である、［１］〜［３］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［５］マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはその抗原結合断片である、［１］〜［４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［６］１×１０−５Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ値）でグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する、［１］〜［５］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
［７］［１］〜［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
［８］糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病から選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、［７］に記載の医薬組成物。
［９］疾患が、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんから選択されるがんである、［８］に記載の医薬組成物。
［１０］［１］〜［６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。
［１１］［１０］に記載の核酸を含む発現ベクター。
［１２］［１１］の発現ベクターを含む宿主細胞。
The present invention provides the following inventions.
[1] 1) Amino acids of each complementarity determining region (VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3) of the heavy chain variable region and amino acids of each complementarity determining region (VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3) of the light chain variable region The array is
(A)
(A) VH CDR1: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(B) VH CDR2: the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(C) VH CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or amino acid sequence substantially identical thereto;
(D) VL CDR1: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(E) VL CDR2: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(F) VL CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or amino acid sequence substantially identical thereto; or (B)
(A) VH CDR1: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(B) VH CDR2: the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(C) VH CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(D) VL CDR1: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(E) VL CDR2: amino acid sequence of 12 consecutive residues contained in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(F) VL CDR3: amino acid sequence of 9 consecutive residues contained in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, or an amino acid sequence substantially identical thereto;
An antibody or antigen-binding fragment thereof; or 2) an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with said antibody or antigen-binding fragment thereof for binding to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs;
A monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to a glyceraldehyde-derived AGEs or an epitope of glycolaldehyde-derived AGEs.
[2] 1) The amino acid sequences of heavy chain variable region and light chain variable region are respectively:
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence substantially identical thereto, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence substantially identical thereto; or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or substantially identical thereto An amino acid sequence and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence substantially identical thereto, an antibody or an antigen-binding fragment thereof; or 2) binding to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs An antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with the antibody or antigen-binding fragment thereof,
The monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1].
[3] The monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof according to [1] or [2], wherein the epitope is an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs.
[4] The antibody according to any one of [1] to [3], which is a full-length antibody, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, scFv, dsFv, diabody, or sc (Fv) 2 Monoclonal antibody or antigen binding fragment thereof.
[5] The monoclonal antibody or the antigen binding fragment thereof according to any one of [1] to [4], which is a mouse antibody, a humanized antibody, a human antibody, a chimeric antibody, or an antigen binding fragment thereof.
[6] The monoclonal antibody or the monoclonal antibody according to any one of [1] to [5], which binds to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs with a dissociation constant (Kd value) of 1 × 10 −5 M or less Its antigen binding fragment.
[7] A pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof according to any of [1] to [6].
[8] Diabetes, glucose intolerance, retinopathy, nephropathy, peripheral neuropathy, gangrene of the lower extremities, arteriosclerosis, thrombosis, nonalcoholic fatty liver disease, nonalcoholic steatohepatitis, cancer, polycystic ovary syndrome The pharmaceutical composition according to [7], for use in the diagnosis, treatment or prevention of a disease selected from ovarian dysfunction, central nervous disorder and Alzheimer's disease.
[9] The pharmaceutical composition according to [8], wherein the disease is a cancer selected from melanoma, lung cancer and liver cancer.
[10] A nucleic acid encoding the monoclonal antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any of [1] to [6].
[11] An expression vector comprising the nucleic acid according to [10].
[12] A host cell comprising the expression vector of [11].
ＡＧＥｓの中でも、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）は、ＴＡＧＥ（Toxic AGEs）とも称せられ、糖尿病、特に糖尿病血管合併症、糖尿病網膜症、糖尿病腎症、および糖尿病大血管症などに関わることが報告されている。さらに、Glycer-AGEsは高血圧症、アルツハイマー病などの認知症、がん（例えば肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、膀胱がん、悪性黒色腫、および肺がん）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、不妊症などに慣用することが報告されている。したがって、Glycer-AGEsはこれらの疾患の診断のためのバイオマーカーとして使用することができ、本発明の抗体はバイオマーカーの検出において使用することができる。 Among AGEs, glyceraldehyde-derived AGEs (Glycer-AGEs) are also referred to as TAGE (Toxic AGEs) and are involved in diabetes, particularly diabetic vascular complications, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, and diabetic macroangiopathy, etc. It has been reported. Furthermore, Glycer-AGEs are hypertension, dementia such as Alzheimer's disease, cancer (eg liver cancer, pancreas cancer, uterine cancer, colon cancer, rectal cancer, breast cancer, bladder cancer, malignant melanoma, And lung cancer), non-alcoholic steatohepatitis (NASH), infertility, etc. are reported to be used regularly. Thus, Glycer-AGEs can be used as a biomarker for the diagnosis of these diseases, and the antibodies of the invention can be used in the detection of biomarkers.
さらに本発明にかかる抗体は、生体におけるGlycer-AGEsの効果を中和するために使用することができ、疾患の治療などにおいても使用することができる。 Furthermore, the antibody according to the present invention can be used to neutralize the effects of Glycer-AGEs in a living body, and can also be used in the treatment of diseases and the like.
本発明の１つの側面において、本発明の抗体は単離された抗体である。単離された抗体は、天然に存在して何ら外的操作（人為的操作）が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこに留まっている状態の抗体は含まれない。本発明の抗体は典型的にはモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。 In one aspect of the invention, the antibodies of the invention are isolated antibodies. An isolated antibody is a naturally occurring antibody which has not been subjected to any external manipulation (artificial manipulation), ie, an antibody which is produced in the body of an individual and remains there. The antibodies of the invention are typically monoclonal antibodies, or antigen binding fragments thereof.
アミノ酸配列に関して使用する用語「実質的に同一」とは、比較される二つのアミノ酸配列間で配列上の相違が比較的小さく且つ配列上の相違が抗原に対する特異的結合性に関して実質的な影響を与えないことを意味する。実質的に同一なアミノ酸配列はアミノ酸配列の一部の改変を含んでいてもよく、例えば、アミノ酸配列を構成する１〜数個（例えば、１〜３個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（例えば、１〜３個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列が改変されていてもよい。アミノ酸配列の変異の位置は特に限定されず、複数の位置で変異を生じていてもよい。アミノ酸配列において改変されるアミノ酸の数は示された全アミノ酸の例えば１０％以内に相当する数であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内に相当する数である。 The term "substantially identical" as used in reference to amino acid sequences refers to the relatively small differences in sequence between the two amino acid sequences being compared and the substantial difference in sequence differences with respect to specific binding to an antigen. It means not giving. The substantially identical amino acid sequence may include partial modification of the amino acid sequence, for example, deletion, substitution, or substitution of one to several (for example, 1 to 3) amino acids constituting the amino acid sequence. The amino acid sequence may be modified by addition, insertion, or a combination of one or several (for example, 1 to 3) amino acids. The position of mutation of the amino acid sequence is not particularly limited, and mutations may occur at a plurality of positions. The number of amino acids modified in the amino acid sequence is a number corresponding to, for example, 10% or less of the total amino acids shown, preferably a number corresponding to 5% or less of the total amino acids. More preferably, it is a number corresponding to 1% or less of all amino acids.
アミノ酸を置換する場合には、置換するアミノ酸の側鎖と類似の生化学的特性を持った側鎖を有するアミノ酸と置換することができる（保存的アミノ酸置換）。１つの態様において、実質的に同一なアミノ酸配列は、例えば、１つもしくは複数の保存的置換を含んでいてもよい。保存的アミノ酸置換は当業者に知られており、例えば以下の表に示す例が挙げられる（例えば、ＷＯ２０１０／１４６５５０など）。 When substituting an amino acid, it can be substituted with an amino acid having a side chain having similar biochemical properties to the side chain of the replacing amino acid (conservative amino acid substitution). In one embodiment, substantially identical amino acid sequences may, for example, comprise one or more conservative substitutions. Conservative amino acid substitutions are known to those skilled in the art and include, for example, the examples shown in the following table (eg, WO 2010/146550, etc.).
また、天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）極性、荷電なし：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
Also, naturally occurring amino acids are classified into the following groups based on common side chain properties:
(1) Nonpolar: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile,
(2) Polarity, no charge: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln,
(3) Acidic (negative): Asp, Glu,
(4) Basic (positively charged): Lys, Arg, His,
(5) Residues affecting chain orientation: Gly, Pro, and (6) Aromatics: Trp, Tyr, Phe.
１つの態様として、置換するアミノ酸と同じ群に属するアミノ酸を用いて置換してもよい。 In one embodiment, amino acids belonging to the same group as the amino acid to be substituted may be used for substitution.
二つのアミノ酸配列が実質的に同一であるか否かは、各アミノ酸配列を含む抗体（他の領域の配列は同一）の抗原に対する結合特異性を比較することによって判定できる。例えば、基準となる抗体の生理食塩水環境下での抗原に関する解離定数（Ｋｄ値）をＡとしたとき、比較対象の抗体のＫｄ値がＡ×１０−１〜Ａ×１０の範囲であれば実質的な同一性を認定できる。 Whether or not two amino acid sequences are substantially identical can be determined by comparing the binding specificities of the antibodies containing the respective amino acid sequences (the sequences of the other regions are identical) to the antigen. For example, when the dissociation constant (Kd value) of an antibody as a reference in the physiological saline environment is A, if the Kd value of the antibody to be compared is in the range of A × 10 −1 to A × 10 Substantial identity can be found.
本発明に係る核酸は、典型的には、単離された核酸であり、例えばｃＤＮＡ分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。 The nucleic acid according to the present invention is typically an isolated nucleic acid, and in the case of a nucleic acid produced by genetic engineering techniques such as, for example, a cDNA molecule, the “isolated nucleic acid” is preferably a cell component or culture A nucleic acid in a state substantially free of fluid and the like. Similarly, the “isolated nucleic acid” in the case of a nucleic acid produced by chemical synthesis is preferably in a state substantially free of precursors (raw materials) such as dNTPs, chemicals used in the synthesis process, etc. Refers to a nucleic acid.
本明細書における用語「核酸」はＤＮＡ（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、ＤＮＡ類似体、およびＲＮＡ類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち１本鎖および２本鎖のいずれであってもよい。好ましくは２本鎖ＤＮＡである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。 The term "nucleic acid" as used herein includes DNA (including cDNA and genomic DNA), RNA (including mRNA), DNA analogues, and RNA analogues. The form of the nucleic acid of the present invention is not limited, that is, it may be either single stranded or double stranded. Preferably, it is a double stranded DNA. Also considered is the degeneracy of the codon. That is, in the case of a nucleic acid encoding a protein, it may have any base sequence as long as the protein can be obtained as its expression product.
ＡＧＥｓはタンパク質の糖化反応により形成される。グルコースやフルクトースなどの還元糖とタンパク質の遊離のアミノ基が非酵素的に反応してシッフ塩基からアマドリ化合物を生成し、その後不可逆的な脱水や縮合、酸化、還元などの反応を繰り返し、特有の蛍光を持つ黄褐色の複雑な物質ＡＧＥｓが生成するに至る。一方で、リシンなどのアミノ酸残基が糖と反応して得られる化合物がＡＧＥｓの構造として特定されており、蛍光を有さないピラリン、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、Ｎε−カルボキシエチルリシン（ＣＥＬ）、およびＮω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）などもＡＧＥｓとして知られている。その他、芳香環を有するアルグピリミジン、ペントシジン、クロスリン、ＧＡ−ピリジン、ベスペルリシン、ピロピリジンなどの化合物がＡＧＥｓとして特定されている。これらの化合物をアミノ酸残基として含有するペプチドやタンパク質もＡＧＥｓに含まれる。 AGEs are formed by glycation of proteins. A reducing sugar such as glucose or fructose and the free amino group of the protein react non-enzymatically to form an amadori compound from the Schiff base, and then repeat reactions such as irreversible dehydration, condensation, oxidation, reduction, etc. It leads to the formation of a complex complex AGEs of fluorescent yellowish brown. On the other hand, a compound obtained by reacting an amino acid residue such as lysine with a sugar is specified as the structure of AGEs, and pyraline having no fluorescence, Nε-carboxymethyllysine (CML), Nε-carboxyethyllysine ( CEL) and Nω-carboxymethyl arginine (CMA) are also known as AGEs. In addition, compounds such as argpyrimidine having an aromatic ring, pentosidine, crosulin, GA-pyridine, besperlysin, pyropyridine and the like are specified as AGEs. Peptides and proteins containing these compounds as amino acid residues are also included in AGEs.
ＡＧＥｓを形成するタンパク質糖化反応の基質としては、グルコース、フルクトースなどの還元糖の他に、生体内の糖代謝などにより生成する、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、メチルグリオキサール、グリオキサール、および３−デオキシグルコソンなどが想定されている。こうした還元糖およびアルデヒドを使用し、ＢＳＡなどのタンパク質と反応させてＡＧＥｓを形成する試みがされている。このようにして調製されるグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）、グルコース由来ＡＧＥｓ（Glu-AGEs）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycol-AGEs）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Fru-AGEs）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（MGO-AGEs）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（GO-AGEs）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（3-DG-AGEs）などの各種ＡＧＥｓのうち、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓは、糖尿病などの各種疾患に関与するとの報告がされており、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓを抗原とするポリクローナル抗体を用いた分析方法により、Glycer-AGEsの血中濃度を測定する手法が知られている。 As substrates for protein glycation reactions that form AGEs, glyceraldehyde, glycolaldehyde, methylglyoxal, glyoxal, and 3-deoxyglucoside produced by glucose metabolism in vivo, as well as reducing sugars such as glucose and fructose Son and others are assumed. Attempts have been made to use these reducing sugars and aldehydes to react with proteins such as BSA to form AGEs. Glyceraldehyde-derived AGEs (Glycer-AGEs), glucose-derived AGEs (Glu-AGEs), glycolaldehyde-derived AGEs (Glycol-AGEs), fructose-derived AGEs (Fru-AGEs), methylglyoxal-derived AGEs thus prepared Among various AGEs such as (MGO-AGEs), glyoxal-derived AGEs (GO-AGEs), and 3-deoxyglucosone-derived AGEs (3-DG-AGEs), glyceraldehyde-derived AGEs are associated with various diseases such as diabetes. It has been reported to be involved, and there is known a method for measuring the blood concentration of Glycer-AGEs by an analysis method using a polyclonal antibody having glyceraldehyde-derived AGEs as an antigen.
本発明のモノクローナル抗体は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）およびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycol-AGEs）に対して特異的に結合する特性を有している。 The monoclonal antibody of the present invention has the property of binding specifically to glyceraldehyde-derived AGEs (Glycer-AGEs) and glycolaldehyde-derived AGEs (Glycol-AGEs).
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）および／またはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycol-AGEs）のエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Glu-AGEs）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Fru-AGEs）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（MGO-AGEs）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（GO-AGEs）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（3-DG-AGEs）から選択される、１以上のＡＧＥｓとは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。より具体的には、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycer-AGEs）およびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Glycol-AGEs）のエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Glu-AGEs）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Fru-AGEs）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（MGO-AGEs）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（GO-AGEs）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（3-DG-AGEs）とは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。さらに具体的には、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓおよびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Glu-AGEs）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Fru-AGEs）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（MGO-AGEs）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（GO-AGEs）、３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（3-DG-AGEs）、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、およびＮε−カルボキシエチルリシン（ＣＥＬ）とは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。 In one aspect of the present invention, glyceraldehyde-derived AGEs (Glycer-AGEs) and / or glycolaldehyde-derived AGEs (Glycol-AGEs) are combined with glucose-derived AGEs (Glu-AGEs), fructose-derived AGEs (Fru) -AGEs), methylglyoxal-derived AGEs (MGO-AGEs), glyoxal-derived AGEs (GO-AGEs), and 3-deoxyglucosone-derived AGEs (3-DG-AGEs), one or more AGEs having a bond A monoclonal antibody or antigen-binding fragment thereof is provided. More specifically, it binds to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs (Glycer-AGEs) and glycolaldehyde-derived AGEs (Glycol-AGEs), and glucose-derived AGEs (Glu-AGEs), fructose-derived AGEs (Fru-AGEs), Provided is a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that does not bind to methylglyoxal-derived AGEs (MGO-AGEs), glyoxal-derived AGEs (GO-AGEs), and 3-deoxyglucosone-derived AGEs (3-DG-AGEs) . More specifically, they bind to glyceraldehyde-derived AGEs and epitopes of glycolaldehyde-derived AGEs, and are derived from glucose-derived AGEs (Glu-AGEs), fructose-derived AGEs (Fru-AGEs), methylglyoxal-derived AGEs (MGO-AGEs), A monoclonal antibody or non-binding to glyoxal-derived AGEs (GO-AGEs), 3-deoxyglucosone-derived AGEs (3-DG-AGEs), Nε-carboxymethyllysine (CML), and Nε-carboxyethyllysine (CEL) The antigen binding fragment is provided.
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。ここで、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓおよびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥは、グリセルアルデヒドまたはグリコールアルデヒドの存在下でＢＳＡ、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）などのタンパク質糖化反応により生じるＡＧＥｓであり、ＡＧＥｓを含むタンパク質である。本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、タンパク質糖化反応で生じた化学構造をエピトープとするという特徴を有している。好ましい態様において、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、還元糖および糖代謝などで生じるアルデヒド、特にグルコース由来ＡＧＥｓ、フルクトース由来ＡＧＥｓ、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ、グリオキサール由来ＡＧＥｓ、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓとは結合しない。これらのＡＧＥｓも各還元糖またはアルデヒドをＢＳＡなどのタンパク質に添加してタンパク質糖化反応により調製される。抗体の結合特異性については、公知の手法、例えば競合ＥＬＩＳＡ法などにより特定することができる。 In one aspect of the present invention, there is provided a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs. Here, glyceraldehyde-derived AGEs and glycolaldehyde-derived AGE are AGEs produced by protein glycation reaction such as BSA and mouse serum albumin (MSA) in the presence of glyceraldehyde or glycolaldehyde, and are proteins including AGEs . The monoclonal antibody and the antigen-binding fragment thereof of the present invention are characterized in that the chemical structure generated in the protein glycation reaction is an epitope. In a preferred embodiment, the antibody of the present invention and its antigen-binding fragment are derived from aldehydes generated by reducing sugars and sugar metabolism etc., particularly glucose-derived AGEs, fructose-derived AGEs, methylglyoxal-derived AGEs, glyoxal-derived AGEs, and 3-deoxyglucosone-derived It does not combine with AGEs. These AGEs are also prepared by protein glycation reaction by adding each reducing sugar or aldehyde to a protein such as BSA. The binding specificity of the antibody can be identified by a known method such as competitive ELISA.
本発明は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、該抗体または断片は、ＡＧＥｓが関与する疾患の治療、予防および／または診断に使用することができる。本発明で使用できる抗体は、本明細書に記載のとおり、複数の形態をとることができ、本発明は、本明細書で定義するとおり６個のＣＤＲのセット（それと実質的に同一のアミノ酸配列、例えば、１〜３個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加を含む配列を含む）を含む抗体構造を提供する。 The present invention provides a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to glyceraldehyde-derived AGEs or an epitope of glycolaldehyde-derived AGEs, said antibody or fragment being used for the treatment, prevention and / or diagnosis of diseases involving AGEs. It can be used. The antibodies that can be used in the present invention can take multiple forms, as described herein, and the present invention provides a set of six CDRs (as substantially identical to the amino acids as defined herein) Provided is an antibody structure comprising a sequence, including, for example, a sequence comprising deletion, substitution, addition of 1 to 3 amino acid residues.
従来の抗体構造ユニットは、典型的には４量体を含む。各４量体は、典型的には、２つの同一のポリペプチチド鎖対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）と１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体アイソタイプを定義する。ＩｇＧは複数のサブクラスを有し、サブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられるがこれらに限定されない。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有するが、これらに限定されない。従って、本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的および抗原的特徴により定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。治療用抗体には、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含まれ得る。 Conventional antibody structural units typically comprise tetramers. Each tetramer typically consists of two identical polypeptide chain pairs, each pair comprising one "light" chain (typically having a molecular weight of about 25 kDa) and one "heavy" With chains (typically having a molecular weight of about 50-70 kDa). Human light chains are classified as kappa and lambda light chains. Heavy chains are classified as mu, delta, gamma, alpha or epsilon, and define antibody isotypes as IgM, IgD, IgG, IgA and IgE, respectively. IgG has multiple subclasses, including, but not limited to, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4. IgM has subclasses including, but not limited to, IgM1 and IgM2. Thus, as used herein, "isotype" means any subclass of immunoglobulin as defined by the chemical and antigenic characteristics of its constant region. Known human immunoglobulin isotypes are IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD and IgE. Therapeutic antibodies can also include isotype and / or subclass hybrids.
各鎖には、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。可変領域では３つのループが重鎖および軽鎖の各Ｖドメインについて集合しており、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域とも称され（以下、「ＣＤＲ」とも称する）、この部分におけるアミノ酸配列の変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が最も顕著である。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントが、抗体の配列において広範囲に異なるという事実を意味する。可変領域内の可変性は、均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１５アミノ酸長以上の「超可変領域」と称される極度に可変性の短い領域により分離される１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変のストレッチからなる。 Each chain contains a variable region of about 100 to 110 or more amino acids primarily responsible for antigen recognition. In the variable region, three loops are assembled for each heavy chain and light chain V domain to form an antigen binding site. Each loop is also referred to as a complementarity determining region (hereinafter also referred to as "CDR"), and the variation of the amino acid sequence in this portion is most prominent. By "variable" is meant the fact that certain segments of the variable region differ extensively in sequence of the antibody. The variability within the variable domain is not evenly distributed. Instead, the V regions are referred to as framework regions (FRs) of 15 to 30 amino acids separated by an extremely variable short region, referred to as the "hypervariable region", each 9 to 15 amino acids long or longer It consists of relatively invariant stretches.
各ＶＨおよびＶＬは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）と４つのＦＲからなり、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。 Each VH and VL consists of three hypervariable regions ("complementarity determining regions", "CDRs") and four FRs, arranged from the amino terminus to the carboxy terminus in the following order: FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4.
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域における、アミノ酸残基２４〜３４付近（ＶＬ ＣＤＲ１；「ＶＬ」は軽鎖の可変領域を意味する）、５０〜５６付近（ＶＬ ＣＤＲ２）および８９〜９７付近（ＶＬ ＣＤＲ３）と重鎖可変領域における、３１〜３５付近（ＶＨ ＣＤＲ１；「ＶＨ」は重鎖の可変領域を意味する）、５０〜６５付近（ＶＨ ＣＤＲ２）および９５〜１０２付近（ＶＨ ＣＤＲ３）のアミノ酸残基；Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)、および／または超可変性ループを形成するそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＶＬ ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＶＬ ＣＤＲ２）および９１〜９６（ＶＬ ＣＤＲ３）と、重鎖可変領域における２６〜３２（ＶＨ ＣＤＲ１）、５３〜５５（ＶＨ ＣＤＲ２）および９６〜１０１（ＶＨ ＣＤＲ３）；Chothia and Lesk (1987)J. Mol. Biol. 196:901-917を包含する。 The hypervariable region is generally around amino acid residues 24-34 (VL CDR1; "VL" means light chain variable region), around 50-56 (VL CDR2) and 89-97 in the light chain variable region. 31 to 35 (VH CDR1; “VH” means the variable region of heavy chain), 50 to 65 (VH CDR2) and 95 to 102 (VH CDR3) in the vicinity (VL CDR3) and the heavy chain variable region Amino acid residues of Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), and / or those forming hypervariable loops Residues (eg, residues 26-32 (VL CDR1), 50-52 (VL CDR2) and 91-96 (VL CDR3) in the light chain variable region) That 26~32 (VH CDR1), 53~55 (VH CDR2) and 96~101 (VH CDR3); Chothia and Lesk (1987) J Mol Biol 196:... Encompasses 901-917.
本明細書にわたり、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）について言及する場合には、Ｆｃ領域で使用されるＥＵナンバーシステムとともに、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを通常用いる（例えば、Kabat et al., 上記 (1991))。 Throughout the specification, the EU number used in the Fc region when referring to residues of the variable domain (approximately, residues 1 to 10 of the light chain variable region and residues 1 to 113 of the heavy chain variable region) The Kabat numbering system is usually used with the system (e.g. Kabat et al., Supra (1991)).
ＣＤＲは、抗原結合の形成に寄与し、より詳細には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位（パラトープ）と相互作用する決定基を意味する。エピトープは、アミノ酸や糖側鎖などの分子にグループ分けされ、通常、特異的な構造特性および特異的な電荷特性を有する。本明細書で示すとおり、本発明に係る「６Ｂ３」および「１１Ｇ４」と本明細書で称する２つの異なる抗体は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓへの結合に関して交差競合することが確認されており、同じエピトープに結合すると考えられている。 The CDRs contribute to the formation of antigen binding, and more particularly to the formation of the epitope binding site of the antibody. By "epitope" is meant a determinant that interacts with a specific antigen binding site (paratope) in the variable region of an antibody molecule. Epitopes are grouped into molecules such as amino acids and sugar side chains and usually have specific structural characteristics and specific charge characteristics. As shown herein, two different antibodies, referred to herein as "6B3" and "11G4" according to the present invention, have been identified to cross-compete for binding to glyceraldehyde-derived AGEs and are identical It is believed to bind to the epitope.
各種ＡＧＥｓは、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ），ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）など）とアルデヒドまたは還元糖を混合し、反応をさせることにより調製することができる。例えば、グリセルアルデヒドをＢＳＡと反応させることにより、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡを調製することができ、これをＡＧＥｓの標品として使用することができる。グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓにおいて、本発明の抗体は、例えば、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡに対して結合性を有し、ＢＳＡに対して結合性を有さない抗体を選抜することにより、調製することができる。本発明の１つの側面において、本発明の抗体が結合するエピトープは、グリセルアルデヒドとタンパク質から非酵素的反応により生成する構造を含む。 Various AGEs can be prepared by mixing and reacting proteins (eg, bovine serum albumin (BSA), mouse serum albumin (MSA), rabbit serum albumin (RSA), etc.) with an aldehyde or reducing sugar. For example, glyceraldehyde can be reacted with BSA to prepare glyceraldehyde-derived AGEs-containing BSA, which can be used as a standard of AGEs. In glyceraldehyde-derived AGEs, the antibody of the present invention is prepared, for example, by selecting an antibody having binding ability to glyceraldehyde-derived AGEs-containing BSA and having no binding ability to BSA. be able to. In one aspect of the present invention, the epitope to which the antibody of the present invention binds comprises a structure generated from glyceraldehyde and a protein by non-enzymatic reaction.
本発明の１つの側面において、以下の（Ａ）および（Ｂ）で特定されるアミノ酸配列を重鎖可変領域および軽鎖可変領域の相補性決定領域に含む抗体、またはその抗原結合断片が提供される：
（Ａ）
（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
（Ｂ）
（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：１０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：１１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：１３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：１４に示すアミノ酸配列に含まれる連続する１２残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：１５に示すアミノ酸配列に含まれる連続する９残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列。
In one aspect of the present invention, there is provided an antibody, or an antigen-binding fragment thereof, comprising the amino acid sequences specified in the following (A) and (B) in the complementarity determining regions of heavy chain variable region and light chain variable region: Ru:
(A)
(A) VH CDR1: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(B) VH CDR2: the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(C) VH CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or amino acid sequence substantially identical thereto;
(D) VL CDR1: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(E) VL CDR2: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(F) VL CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or amino acid sequence substantially identical thereto; or (B)
(A) VH CDR1: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(B) VH CDR2: the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(C) VH CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(D) VL CDR1: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(E) VL CDR2: amino acid sequence of 12 consecutive residues contained in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(F) VL CDR3: amino acid sequence of consecutive 9 residues contained in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, or an amino acid sequence substantially identical thereto.
本発明の１つの側面によれば、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片；または重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：１６のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列である、抗体またはその抗原結合断片が提供される。その具体的な態様として、本発明は本明細書記載のモノクローナル抗体である６Ｂ３および１１Ｇ４を含む。これらの抗体はマウス由来の抗体であり、上記の配列番号で示される重鎖可変領域と軽鎖可変領域に加えて、マウス抗体の定常領域を有している。なお、上記の配列番号で示される重鎖可変領域または軽鎖可変領域と実質的に同一のアミノ酸配列の例として、Ｎ末端またはＣ末端に１または２のアミノ酸が付加された配列が挙げられる。例えば、上記の配列番号で示される重鎖可変領域と実質的に同一のアミノ酸配列として、Ｎ末端またはＣ末端に１または２のアミノ酸（例えば、天然型アミノ酸から選択されるアミノ酸）、より具体的にはＧｌｕおよびＧｌｎから選択される１つのアミノ酸が付加した配列が挙げられる。 According to one aspect of the present invention, the amino acid sequence of the heavy chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence substantially identical thereto, and the amino acid sequence of the light chain variable region is SEQ ID NO: 8 A monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence substantially identical thereto; or an amino acid sequence of the heavy chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or an amino acid sequence substantially identical thereto; An antibody or antigen-binding fragment thereof is provided, wherein the amino acid sequence of the light chain variable region is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence substantially identical thereto. In a specific embodiment, the present invention comprises the monoclonal antibodies 6B3 and 11G4 described herein. These antibodies are mouse-derived antibodies, and in addition to the heavy chain variable region and light chain variable region shown by the above-mentioned SEQ ID NO, they have a mouse antibody constant region. In addition, as an example of the amino acid sequence substantially identical to the heavy chain variable region or light chain variable region shown by the above-mentioned SEQ ID NO, a sequence in which 1 or 2 amino acids are added to the N terminus or C terminus is mentioned. For example, as the amino acid sequence substantially identical to the heavy chain variable region shown by the above-mentioned SEQ ID NO, one or two amino acids at the N-terminus or C-terminus (eg, amino acids selected from natural amino acids), more specific Includes a sequence to which one amino acid selected from Glu and Gln is added.
本発明の１つの側面によれば、上記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域またはそれらのＣＤＲで特定される抗体またはその抗原結合断片を参照抗体として、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、参照抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。本発明の１つの態様において、モノクローナル抗体である６Ｂ３または１１Ｇ４を参照抗体として、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、参照抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。 According to one aspect of the present invention, glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs are obtained by using the above-mentioned heavy chain variable region and light chain variable region or the antibody or antigen-binding fragment thereof specified by the CDRs thereof as a reference antibody. An antibody or antigen-binding fragment thereof is provided that cross-competes with a reference antibody for binding to an epitope of In one embodiment of the present invention, an antibody or an antigen-binding fragment thereof which cross competes with a reference antibody for binding to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs using monoclonal antibodies 6B3 or 11G4 as reference antibodies Provided.
本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体である６Ｂ３または１１Ｇ４を参照抗体として、Glycer-AGEsまたはGlycol-AGEsとの標準的な結合アッセイを行うことにより交差競合に関する特性を確認することができる。交差競合の確認は、例えば、フローサイトメトリーや交差競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。 The antibody of the present invention can be characterized, for example, by performing standard binding assay with Glycer-AGEs or Glycol-AGEs using, for example, monoclonal antibody 6B3 or 11G4 as a reference antibody. Confirmation of cross competition can be confirmed by, for example, flow cytometry or cross competition ELISA assay.
本発明の１つの側面において、上記の抗体またはその抗原結合断片を含む、疾患の治療、予防または診断のための医薬組成物が提供される。対象疾患としては、Glycer-AGEsまたはGlycol-AGEsが関与する疾患であれば特に限定されず、例えば、糖尿病、糖尿病最小血管合併症（糖尿病網膜症、糖尿病腎症、および糖尿病神経障害）、および糖尿病大血管症、高血圧症、アルツハイマー病などの認知症、がん（例えば肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、膀胱がん、悪性黒色腫、および肺がん）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、不妊症などが挙げられる。本発明の別の態様によれば、疾患は、糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん（例えば、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんなど）、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病が挙げられる。 In one aspect of the present invention, there is provided a pharmaceutical composition for the treatment, prevention or diagnosis of a disease, which comprises the above-mentioned antibody or antigen-binding fragment thereof. The target disease is not particularly limited as long as it is a disease involving Glycer-AGEs or Glycol-AGEs, and examples thereof include diabetes, minimal diabetic vascular complications (diabetes retinopathy, diabetic nephropathy, and diabetic neuropathy), and diabetes. Dementia such as macroangiopathy, hypertension, Alzheimer's disease, cancer (eg liver cancer, pancreas cancer, uterine cancer, colon cancer, rectal cancer, breast cancer, bladder cancer, malignant melanoma, and lung cancer And non-alcoholic steatohepatitis (NASH), infertility and the like. According to another aspect of the invention, the disease is diabetes, glucose intolerance, retinopathy, nephropathy, peripheral neuropathy, lower extremity gangrene, arteriosclerosis, thrombosis, non-alcoholic fatty liver disease, non-alcoholic fatty Hepatitis, cancer (eg, melanoma, lung cancer, and liver cancer, etc.), polycystic ovary syndrome, ovarian dysfunction, central neuropathy, and Alzheimer's disease.
本発明の１つに態様において、対象の組織（例えば血液）中に存在するGlycer-AGEsおよびGlycol-AGEsの量を本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて測定する工程を含む、疾患の診断方法が提供される。ここでの診断とは既に記載した通りである。本発明の別の態様において、試料（例えば、採血により得られた血液試料）中に存在するGlycer-AGEsおよびGlycol-AGEsの量を本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて測定する工程を含む、試料の分析方法が提供される。 In one embodiment of the present invention, the method comprises the step of measuring the amount of Glycer-AGEs and Glycol-AGEs present in a target tissue (eg, blood) using an antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof. Diagnostic methods are provided. The diagnosis here is as already described. In another embodiment of the present invention, the step of measuring the amount of Glycer-AGEs and Glycol-AGEs present in a sample (eg, a blood sample obtained by blood collection) using an antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof A method of analyzing a sample is provided, including:
本発明の抗体の抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である。本発明の抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である。これらの抗体またはその抗原結合断片は、当業者に公知の方法により調製することができる。 The antigen-binding fragment of the antibody of the present invention is, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2 , Fv, scFv, dsFv, diabody, or sc (Fv) 2 . The antibody of the present invention is, for example, a mouse antibody, a humanized antibody, a human antibody or a chimeric antibody. These antibodies or antigen binding fragments thereof can be prepared by methods known to those skilled in the art.
本発明の抗体の抗原結合断片は、例えば、１×１０−４Ｍ以下、具体的には１×１０−５Ｍ以下、より具体的には１×１０−６Ｍ以下、さらに具体的には１×１０−７Ｍ以下、好ましくは１×１０−８Ｍ以下の平衡解離定数Ｋｄでグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する。抗体のＫｄ値は、当技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫｄ値を決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いること、好ましくはBiacore(登録商標)システムのようなバイオセンサーシステムを用いることによる。 The antigen-binding fragment of the antibody of the present invention is, for example, 1 × 10 −4 M or less, specifically 1 × 10 −5 M or less, more specifically 1 × 10 −6 M or less, more specifically It binds to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs with an equilibrium dissociation constant Kd of 1 × 10 −7 M or less, preferably 1 × 10 −8 M or less. Kd values for antibodies can be determined using methods well established in the art. A preferred method for determining the Kd value of antibodies is by using surface plasmon resonance, preferably by using a biosensor system such as the Biacore® system.
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の製造方法が提供される。該方法は、本発明の抗体をコードする核酸がトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程を含み、周知技術に基づいて様々な方法で実施され得る。 In one aspect of the present invention, there is provided a method for producing a monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to glyceraldehyde-derived AGEs or an epitope of glycolaldehyde-derived AGEs. The method comprises the step of culturing a host cell transfected with a nucleic acid encoding the antibody of the present invention, which can be carried out in various ways based on known techniques.
本発明の１つの側面において、本発明の抗体をコードする核酸が提供される。このようなポリヌクレオチドは、例えば、重鎖および軽鎖それぞれの可変領域および定常領域の両方をコードする。ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であってもＤＮＡの形態であってもよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は、遺伝コードの冗長性または縮重を含んでいてもよい。 In one aspect of the invention, nucleic acids encoding the antibodies of the invention are provided. Such polynucleotides encode, for example, both the variable and constant regions of each of the heavy and light chains. The polynucleotide may be in the form of RNA or in the form of DNA. The coding sequence encoding the polypeptide may include genetic code redundancy or degeneracy.
いくつかの実施態様において、本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸は、発現ベクターに組み込まれ、当該発現ベクターは、導入される宿主細胞の染色体外であるか、またはそのゲノム中にインテグレートされるよう設計され得る。発現ベクターは、任意数の適切な制御配列（転写および翻訳調節配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されない）または他の要素（選択遺伝子など）を含むことができ、これらは全て、当分野でよく知られるように操作可能に連結される。いくつかの場合、２つの核酸を用いて、それぞれを異なる発現ベクターに入れるか（例えば、第一の発現ベクターに重鎖、第二の発現ベクターに軽鎖）、あるいはそれらを同一の発現ベクターにいれることができる。制御配列の選択を含む、１つ以上の発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの因子によって決まり得る。 In some embodiments, one or more nucleic acids encoding an antibody of the invention are incorporated into an expression vector, which is extrachromosomal in the host cell into which it is introduced, or integrated into its genome. It can be designed to be The expression vector contains any number of suitable control sequences (including but not limited to transcription and translation control sequences, promoters, ribosome binding sites, enhancers, origins of replication etc.) or other elements (such as selection genes) All of which are operably linked as is well known in the art. In some cases, using two nucleic acids, each may be placed in a different expression vector (eg, heavy chain for the first expression vector, light chain for the second expression vector), or they may be in the same expression vector It can be The design of the one or more expression vectors, including the choice of control sequences, may depend on such factors as the choice of host cell, the level of expression of the desired protein, and the like.
一般に、選択される宿主細胞に適した任意の方法（例えば、トランスフォーメーション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インフェクションなど）を用いて、１つ以上の核酸が１つ以上の発現調節要素に操作可能に連結されるように（例えば、ベクターにおいて、細胞でのプロセスにより作出される構築物において、宿主細胞のゲノムにインテグレートされて）、核酸および／または発現が適した宿主細胞に導入され、組換え宿主細胞が作出される。得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下（例えば、インデューサーの存在下、適した非ヒト動物中、適した塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などを添加した培地など）で維持でき、それによりコードされた１つ以上のポリペプチドが製造される。いくつかの場合において、重鎖が１つの細胞で製造され、軽鎖が別の細胞で製造される。 In general, one or more nucleic acids can be manipulated into one or more expression control elements using any method (eg, transformation, transfection, electroporation, infection etc.) suitable for the host cell selected The nucleic acid and / or expression is introduced into a suitable host cell to be linked (eg, integrated in the genome of the host cell in a construct made by a process in the cell, eg in a vector), and the recombinant host cell Is created. The resulting recombinant host cell is prepared under conditions suitable for expression (eg, in a suitable non-human animal in the presence of an inducer, a medium supplemented with a suitable salt, growth factor, antibiotic, nutritional supplement, etc.) And one or more polypeptides encoded thereby are produced. In some cases, heavy chains are produced in one cell and light chains are produced in another cell.
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当分野で既知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な多くの不死化細胞株が含まれ、これには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓がん細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および多数の他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。細菌、酵母、昆虫および植物を含む（これらに限定されない）非哺乳動物細胞を用いて、組換え抗体を発現させることもできる。いくつかの実施態様において、抗体は、ウシやニワトリなどのトランスジェニック動物において製造することができる。 Mammalian cell lines available as hosts for expression are known in the art and include many immortalized cell lines available from the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, including: Chinese hamster ovary (CHO) cells, HEK 293 cells, NSO cells, HeLa cells, baby hamster kidney (BHK) cells, monkey kidney cells (COS), human liver cancer cells (eg, Hep G2), and many others Cell lines include, but are not limited to. Non-mammalian cells can also be used to express recombinant antibodies, including but not limited to bacteria, yeast, insects and plants. In some embodiments, antibodies can be produced in transgenic animals such as cows and chickens.
［実施例１］ＡＧＥｓの調製
ＡＧＥｓは公知の方法により調製することができる（Hum. Reprod. 26: 604-610 (2011)、Mol. Med. 6: 114-125 (2000)など）。具体的には以下の方法により各種ＡＧＥｓを調製した。
Example 1 Preparation of AGEs AGEs can be prepared by known methods (Hum. Reprod. 26: 604-610 (2011), Mol. Med. 6: 114-125 (2000), etc.). Specifically, various AGEs were prepared by the following method.
（１）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ウシ血清アルブミン（Glycer-AGEs-BSA）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（ＤＬ−ＧＬＡ、ナカライテスク）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ、同仁化学研究所）は購入により入手した。
ＤＬ−ＧＬＡ（１８０ｍｇ）とＤＴＰＡ（３９ｍｇ）を秤量し、５０ｍｌの培養用チューブに移した。チューブにリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４、２０ｍｌ）を加えてボルテックスミキサーにてＤＬ−ＧＬＡが溶解するまで攪拌した。その後、ＢＳＡ（５００ｍｇ）を加えて溶解するまで攪拌した（溶液中のＢＳＡの濃度：２５ｍｇ／ｍｌ）。
(1) Glyceraldehyde-derived AGEs-containing bovine serum albumin (Glycer-AGEs-BSA)
Bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich), DL-glyceraldehyde (DL-GLA, Nacalai Tesque), diethylenetriamine-N, N, N ′, N ′, N ′ ′, N ′ ′-pentaacetic acid (DTPA, Dojin Chemical Laboratory) Was obtained by purchase.
DL-GLA (180 mg) and DTPA (39 mg) were weighed and transferred to a 50 ml culture tube. Phosphate buffer (0.2 M, pH 7.4, 20 ml) was added to the tube and stirred with a vortex mixer until the DL-GLA was dissolved. Thereafter, BSA (500 mg) was added and stirred until dissolution (concentration of BSA in solution: 25 mg / ml).
得られた混合物をクリーンベンチ内で０．２μｍフィルターに通して無菌溶液とした。チューブ内の液体が蒸発しないように、パラフィルム（商標）などのフィルムにてチューブの蓋を密閉して３７℃で１週間インキュベートした。 The resulting mixture was passed through a 0.2 μm filter in a clean bench to form a sterile solution. The lid of the tube was sealed with a film such as ParafilmTM and incubated for 1 week at 37 ° C. to prevent evaporation of the liquid in the tube.
得られた反応溶液（２．５ｍｌずつ）をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア、８本）にアプライし、ＰＤ−１０カラムのプロトコールにしたがって、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４、３．５ｍｌずつ）で溶出させた。 The resulting reaction solution (2.5 ml each) was applied to a PD-10 column (GE Healthcare, 8 tubes), and phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.) according to the protocol of the PD-10 column. Elute with 3.5 ml each).
カラム４本分の溶出液（計１４ｍｌ）を集めて分画分子量６〜８ｋＤａの透析チューブ（Spectra/Por Dialysis Membrane、幅：２３ｍｍ）に入れ、１４ｍｌのチューブ２本を予め冷やしておいた２ＬのＰＢＳ中に入れて攪拌して透析した。透析は低温室内（５℃）で行い、２４時間ごとに透析液（ＰＢＳ）を交換し、３日間透析した。 Collect the eluate (total 14 ml) for 4 columns and put in a dialysis tube (Spectra / Por Dialysis Membrane, width: 23 mm) with a molecular weight cut off of 6 to 8 kDa, and 2 L of pre-chilled 2 tubes of 14 ml It was placed in PBS, stirred and dialyzed. Dialysis was performed in a cold room (5 ° C.), and dialysis fluid (PBS) was changed every 24 hours and dialyzed for 3 days.
透析終了後、２本の透析チューブ内の液を合わせて５０ｍｌの培養用チューブに入れて、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glycer-AGEs-BSA）としてタンパク質量を測定し、培養用ＰＢＳにて必要なタンパク質濃度に調整した。
ＤＬ−ＧＬＡを添加しなかったことを除いて実施例１と同じ手法で、対照ＢＳＡを調製した。
After completion of dialysis, the solutions in the two dialysis tubes are combined and placed in a 50 ml culture tube, and the amount of protein is measured as glyceraldehyde-derived AGEs-containing BSA (Glycer-AGEs-BSA), and cultured with PBS Adjusted to the required protein concentration.
Control BSA was prepared in the same manner as Example 1 except that no DL-GLA was added.
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有マウス血清アルブミン（Glycer-AGEs-MSA）およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ウサギ血清アルブミン（Glycer-AGEs-RSA）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、２５ｍｇ／ｍＬのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Sigma-Aldrich）あるいはウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ、Sigma-Aldrich）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（０．１Ｍ，ナカライテスク）、およびジエチレントリアミン５酢酸（５ｍＭ、ＤＴＰＡ、同仁化学研究所）を含有する溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の未反応物などは、ＰＤ−１０ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
(2) Glyceraldehyde-derived AGE-containing mouse serum albumin (Glycer-AGEs-MSA) and glyceraldehyde-derived AGEs-containing rabbit serum albumin (Glycer-AGEs-RSA)
25 mg / mL mouse serum albumin (MSA, Sigma-Aldrich) or rabbit serum albumin (RSA, Sigma-Aldrich), DL-glyceraldehyde (0.1 M in 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) (Nacalai Tesque) and a solution containing diethylenetriaminepentaacetic acid (5 mM, DTPA, Dojin Chemical Laboratory) was prepared. The solution was rendered sterile by 0.2 μm filter sterilization and incubated for 1 week at 37 ° C. Low molecular weight unreacted materials are removed using PD-10 gel filtration column (GE Healthcare) and dialyzed for 3 days in PBS (phosphate buffered saline) in a low temperature room (5 ° C) , Changed the PBS every day).
（３）グルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glu-AGEs-BSA）およびフルクトース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Fru-AGEs-BSA）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、２５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma-Aldrich）、Ｄ−グルコース（０．５Ｍ、和光純薬）またはＤ−フルクトース（０．５Ｍ、和光純薬）、およびＤＴＰＡ（５ｍＭ、同仁化学研究所）を含む溶液を調製し、該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で８週間インキュベートした。低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
(3) Glucose-derived AGEs-containing BSA (Glu-AGEs-BSA) and fructose-derived AGEs-containing BSA (Fru-AGEs-BSA)
25 mg / mL bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich), D-glucose (0.5 M, Wako Pure Chemical Industries) or D-fructose (0.5 M, in 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) A solution containing Wako Pure Chemical Industries, Ltd. and DTPA (5 mM, Dojin Chemical Laboratory) was prepared, the solution was sterilized by 0.2 μm filter sterilization, and incubated at 37 ° C. for 8 weeks. Unreacted substances of low molecular weight and the like were removed using a PD-10 gel filtration column, and further dialyzed with PBS for 3 days in the cold room (5 ° C.) (during which, PBS was replaced daily).
（４）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glycer-AGEs-BSA）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glycol-AGEs-BSA）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（MGO-AGEs-BSA）、およびグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（GO-AGEs-BSA）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、０．１Ｍのグリセルアルデヒド（ナカライテスク）、グリコールアルデヒド（ナカライテスク）、メチルグリオキサール（Sigma-Aldrich）、あるいはグリオキサール（Sigma-Aldrich）と、ＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍＬ）およびＤＴＰＡ（５ｍＭ）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で１週間インキュベートした。無菌条件下、３７℃で１週間インキュベートし、その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
(4) Glyceraldehyde-derived AGEs-containing BSA (Glycer-AGEs-BSA), glycolaldehyde-derived AGEs-containing BSA (Glycol-AGEs-BSA), methylglyoxal-derived AGEs-containing BSA (MGO-AGEs-BSA), and glyoxal-derived AGEs Containing BSA (GO-AGEs-BSA)
0.1 M glyceraldehyde (Nacalai Tesque), glycolaldehyde (Nacalai Tesque), methylglyoxal (Sigma-Aldrich) or glyoxal (Sigma-Aldrich) in 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) A solution containing BSA (25 mg / mL) and DTPA (5 mM) was prepared. The solution was rendered sterile by 0.2 μm filter sterilization and incubated for 1 week at 37 ° C. Under sterile conditions, incubate at 37 ° C for 1 week, then remove low molecular weight non-reactant etc using PD-10 gel filtration column and dialyze in PBS in cold room (5 ° C) for 3 days (during this period) , Changed the PBS every day).
（５）３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（3-DG-AGEs-BSA）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich）、３−デオキシグルコソン（０．２Ｍ、同仁化学研究所）およびＤＴＰＡ（５ｍＭ）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で２週間インキュベートした。その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
(5) 3-deoxyglucosone derived AGEs containing BSA (3-DG-AGEs-BSA)
Prepare a solution containing BSA (25 mg / mL, Sigma-Aldrich), 3-deoxyglucosone (0.2 M, Dojin Chemical Laboratory) and DTPA (5 mM) in 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) did. The solution was rendered sterile by 0.2 μm filter sterilization and incubated for 2 weeks at 37 ° C. Thereafter, unreacted low molecular weight substances and the like were removed using a PD-10 gel filtration column, and dialysis was further performed for 3 days with PBS in a low temperature room (5 ° C.) (during which, PBS was replaced daily).
（６）Ｎε−カルボキシメチルリジン含有ＢＳＡ（CML-BSA）
０．２ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ、Sigma-Aldrich）、グリオキシル酸（４５ｍＭ、和光純薬）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１５０ｍＭ、Sigma-Aldrich）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。
(6) N ε-carboxymethyl lysine-containing BSA (CML-BSA)
BSA (50 mg / mL, Sigma-Aldrich), glyoxylic acid (45 mM, Wako Pure Chemical Industries) and sodium cyanoborohydride (150 mM, Sigma-Aldrich) in 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) The solution containing it was prepared. The solution was rendered sterile by 0.2 μm filter sterilization and incubated at 37 ° C. for 24 hours. Thereafter, unreacted low molecular weight substances and the like were removed using a PD-10 gel filtration column, and dialysis was further performed for 3 days with PBS in a low temperature room (5 ° C.) (during which, PBS was replaced daily).
［実施例３］Glycer-AGEsに特異的なモノクローナル抗体の作製
（１）マウスへの免疫
免疫抗原として、Glycer-AGEs-MSA（１ｍｇ／ｍｌ）を同じ容量のFreund’s Adjuvant, Complete（Sigma-Aldrich）と混合してエマルジョンを調製し（抗原の濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）、ＧＡＮＰ（登録商標）マウス（トランスジェニック社）３匹の背部皮下に初回免疫をした（抗原の量：２００μｇ／匹ずつ）。Glycer-AGEs-MSA（１ｍｇ／ｍｌ）を同じ容量のFreund’s Adjuvant, Incomplete（Sigma-Aldrich）と混合して調製したエマルジョン（抗原の濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて２週間おきに追加免疫（抗原の量：５０μｇ／匹）を行った。初回免疫から４回免疫した後に尾静脈より採血を行い、抗体価の確認を行った。抗体価の高かったものに対して、追加免疫用のエマルジョン（抗原の量：５０μｇ）をマウスの腹腔内に最終投与し、その３日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。
[Example 3] Preparation of monoclonal antibody specific to Glycer-AGEs (1) Immunization to mice Glycer-AGEs-MSA (1 mg / ml) as an immunizing antigen in the same volume of Freund's Adjuvant, Complete (Sigma-Aldrich) An emulsion was prepared by mixing it with an emulsion (concentration of antigen: 0.5 mg / mL), and priming was performed subcutaneously on the back of 3 GANP (registered trademark) mice (Transgenics) (amount of antigen: 200 μg / animal). ). An emulsion (concentration of antigen: 0.5 mg / mL) prepared by mixing Glycer-AGEs-MSA (1 mg / ml) with the same volume of Freund's Adjuvant, Incomplete (Sigma-Aldrich), boost every 2 weeks (The amount of antigen: 50 μg / animal) was performed. After 4 immunizations from the primary immunization, blood was collected from the tail vein to confirm the antibody titer. For those with high antibody titers, the booster emulsion (amount of antigen: 50 μg) was finally administered intraperitoneally to mice, and three days later, spleens were removed for cell fusion.
（２）抗体価の測定
抗血清の力価をＥＬＩＳＡで評価した。９６穴マイクロタイタープレート（NUNC）に、免疫抗原であるグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）を１μｇ／ｍｌの濃度で５０μｌ／ウェルずつ加え、一晩４℃で固相化した。０．０５％（ｖ/ｖ）Tween 20を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％（ｗ/ｖ）ゼラチンを含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で１時間ブロッキングした。抗血清は１０００倍から３倍ずつ段階希釈し、７２９０００倍までの希釈系列を調製後、抗原固相化プレートに５０μｌ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで２５００倍に希釈した２次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ （ZYMED）を５０μｌ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ/ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製したｏ−フェニレンジアミン溶液１００μＬを添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液１００μＬを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。
その結果、抗血清の９０００倍以上の希釈溶液において、抗原と有意な反応性を示したマウスを細胞融合に使用した。
(2) Measurement of antibody titer The titer of antiserum was evaluated by ELISA. 50 μl / well of glyceraldehyde-derived AGE-containing MSA (Glycer-AGEs-MSA) as the immunizing antigen was added to a 96-well microtiter plate (NUNC) at a concentration of 1 μg / ml and immobilized overnight at 4 ° C. . After washing 3 times with PBS (PBS-T) containing 0.05% (v / v) Tween 20, it was blocked for 1 hour with carbonate buffer (pH 9.5) containing 0.5% (w / v) gelatin . The antiserum was serially diluted 1000 times to 3 times, and after preparing a dilution series up to 729000 times, 50 μl / well was placed on the antigen-immobilized plate and allowed to stand for 1 hour. After washing, 50 μl / well of secondary antibody (horseradish peroxidase (HRP) -labeled anti-mouse IgG (ZYMED)) diluted 2500 folds with PBS-T was added and allowed to stand for 1 hour. Add 100 μl of o-phenylenediamine solution adjusted to 0.5 mg / mL with 0.1 M citrate phosphate buffer (pH 5.0) containing 02% (w / v) hydrogen peroxide and After standing for a minute, 100 μL of 1 M sulfuric acid solution was added to each well to stop the color reaction, and then the absorbance at 490 nm was measured by a microplate reader.
As a result, mice showing significant reactivity with the antigen were used for cell fusion in a 9,000-fold dilution solution of antiserum.
（３）脾臓細胞の調製と細胞融合
マウスから摘出した脾臓をすりつぶし、１匹あたり約１×１０８個の脾臓細胞を調製した。ミエローマ細胞であるＰ３Ｕ１を培養し、細胞融合当日に生細胞率が９５％以上のＰ３Ｕ１を調製した。前記脾臓細胞とＰ３Ｕ１を５：１（細胞数の比）で混ぜ、５０％（ｗ/ｖ）濃度の分子量１，４５０のポリエチレングリコールにより細胞融合を行った。融合後、細胞を培地で洗浄し、ＨＡＴ培地に懸濁させ、９６穴培養プレートの各ウェルに１×１０５個／ウェルとなるように細胞を播きこみ、ハイブリドーマの選択培養を行った。細胞融合１０日目にハイブリドーマ培養上清を回収し、培養上清中の抗体価の測定を行った。
(3) Preparation of spleen cells and cell fusion The spleen removed from the mouse was ground to prepare about 1 × 10 8 spleen cells per mouse. Myeloma cells P3U1 were cultured, and on the day of cell fusion, P3U1 cells having a viable cell rate of 95% or more were prepared. The spleen cells and P3U1 were mixed at a ratio of 5: 1 (cell number ratio), and cell fusion was performed with 50% (w / v) concentration of 1,450 molecular weight polyethylene glycol. After fusion, the cells were washed with medium, suspended in HAT medium, and seeded at 1 × 10 5 cells / well in each well of a 96-well culture plate to carry out selective culture of hybridomas. The hybridoma culture supernatant was collected on the 10th day of cell fusion, and the antibody titer in the culture supernatant was measured.
（４）抗体産生陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合後、１０日目の培養上清を回収し、抗体産生陽性ウェルのスクリーニングを後述の実施例４の方法で行った。グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）に陽性、ウシ血清アルブミン由来カルボキシメチルリシン（CML-BSA）、およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に陰性であるクローンについて選択し、細胞を２４穴プレートに移した。細胞を１〜２日間培養し、再度実施例４の方法でスクリーニングをしたところ、最終的に、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）に陽性、グリコールアルデヒドＡＧＥｓ由来ＢＳＡ（Glycol-AGEs-BSA）に弱陽性、グルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glu-AGEs-BSA）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（MGO-AGEs-BSA）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（GO-AGEs-BSA）、Ｎε−カルボキシメチルリシン含有ＢＳＡ（CML-BSA）、及びマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）陰性であるクローンを選択した。
(4) Screening of Antibody-Producing Positive Wells After cell fusion, the culture supernatant on day 10 was collected, and screening of antibody-producing positive wells was performed by the method of Example 4 described later. Select for clones that are positive for glyceraldehyde-derived AGEs containing MSA (Glycer-AGEs-MSA), negative for bovine serum albumin-derived carboxymethyllysine (CML-BSA), and negative for mouse serum albumin (MSA); Transfer to plate. The cells were cultured for 1 to 2 days and screened again according to the method of Example 4. Finally, glyceraldehyde-derived AGEs-containing MSA (Glycer-AGEs-MSA) was positive, glycolaldehyde AGEs-derived BSA (Glycol- AGEs-BSA) weakly positive, glucose-derived AGEs-containing BSA (Glu-AGEs-BSA), methylglyoxal-derived AGEs-containing BSA (MGO-AGEs-BSA), glyoxal-derived AGEs-containing BSA (GO-AGEs-BSA), Nε- Clones that were negative for carboxymethyllysine-containing BSA (CML-BSA) and mouse serum albumin (MSA) were selected.
（５）クローニング
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）に対する特異性の高かったクローンを限界希釈法でクローニングを行った。すなわち、細胞を１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で５個／ｍＬに調製し、９６穴培養プレート２枚分の各ウェルに２００μＬずつ添加した。１０日後、後述の実施例４の方法で培養上清中のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）に対する抗体価を測定し、陽性であることを確認し、それぞれのウェルに由来するクローンを得た。特異性を十分に備えた本発明の抗体として６Ｂ３、および１１Ｇ４を得た。
(5) Cloning A clone highly specific for glyceraldehyde-derived AGE-containing MSA (Glycer-AGEs-MSA) was cloned by the limiting dilution method. That is, cells were prepared at 5 cells / mL in RPMI medium containing 10% FCS, and 200 μL was added to each well of two 96-well culture plates. After 10 days, the antibody titer against glyceraldehyde-derived AGEs-containing MSA (Glycer-AGEs-MSA) in the culture supernatant is measured by the method of Example 4 to be described later to confirm that the antibody is positive. To obtain a clone. 6B3 and 11G4 were obtained as antibodies of the present invention with sufficient specificity.
［実施例４］抗体のスクリーニング
９６穴マイクロタイタープレート（NUNC）の各ウェルに、固相化抗原としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに調製したグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（Glycer-AGEs-MSA）を５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間放置した。また、同時に特異性確認のためグルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glu-AGEs-BSA）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Glycol-AGEs-BSA）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（MGO-AGEs-BSA）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（GO-AGEs-BSA）、Ｎε−カルボキシメチルリシン含有ＢＳＡ（CML-BSA）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を同様に５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間放置した。次に、０．０５％（ｖ/ｖ）Tween20を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％ゼラチンを含むＰＢＳ−Ｔ（ブロッキング液）を各ウェルに２００μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。洗浄後、培養上清を原液のまま各ウェルに５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、各ウェルに２５００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ZYMED）を５０μＬずつ添加し、２５℃で１時間静置した。次に、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ/ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製したｏ−フェニレンジアミン溶液１００μＬを添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液１００μＬを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。
[Example 4] Screening of antibodies Glyceraldehyde-derived AGEs-containing MSA prepared at 1 μg / mL in PBS (pH 7.4) as immobilized antigen in each well of 96-well microtiter plate (NUNC) 50 .mu.L of (MSA) was added and left at 25.degree. C. for 1 hour. At the same time, for confirmation of specificity, glucose-derived AGEs-containing BSA (Glu-AGEs-BSA), glycolaldehyde-derived AGEs-containing BSA (Glycol-AGEs-BSA), methylglyoxal-derived AGEs-containing BSA (MGO-AGEs-BSA), glyoxal Similarly, 50 μL each of AGEs-containing BSA (GO-AGEs-BSA), Nε-carboxymethyllysine-containing BSA (CML-BSA), and bovine serum albumin (BSA) were added and left at 25 ° C. for 1 hour. Next, after washing three times with PBS (pH 7.4) (PBS-T) containing 0.05% (v / v) Tween 20, PBS-T (blocking solution) containing 0.5% gelatin was added to each well. 200 μL of each was added and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. After washing, 50 μL of the culture supernatant as it was, was added to each well, and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. Next, after washing three times with PBS-T, 50 μL each of HRP-labeled anti-mouse IgG antibody (ZYMED) diluted 2500-fold was added to each well and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. Next, after washing 3 times with PBS-T, 0.5 mg / mL in 0.1 M citrate phosphate buffer (pH 5.0) containing 0.02% (w / v) hydrogen peroxide in each well 100 μL of the o-phenylenediamine solution prepared above was added and allowed to stand at 25 ° C. for 10 minutes, then 100 μL of 1 M sulfuric acid solution was added to each well to stop the color reaction. The absorbance at 490 nm was then measured by a microplate reader.
特異性を十分に備えた本発明の抗体として６Ｂ３、および１１Ｇ４を得た。対照のＢＳＡを１とした場合の吸光度を図１（６Ｂ３）および図２（１１Ｇ４）に示す。
６Ｂ３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号：４および配列番号：８のアミノ酸配列であり、１１Ｇ４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号：１２および配列番号：１６のアミノ酸配列であることを確認した。
6B3 and 11G4 were obtained as antibodies of the present invention with sufficient specificity. The absorbance when the control BSA is 1 is shown in FIG. 1 (6B3) and FIG. 2 (11G4).
The amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of 6B3 are the amino acid sequences of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 8, respectively, and the amino acid sequences of the heavy chain variable region and the light chain variable region of 11G4 are the respective sequences The amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 16 was confirmed.
［実施例５］モノクローナル抗体の解離定数測定
得られたモノクローナル抗体について、以下の手法で解離定数（Ｋｄ値）を測定した。グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＭＳＡ（２００μｇ/ｍＬ、９８μＬ）をセンサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア）上にアミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア）を用いて固定後、各種抗体を（６Ｂ３：０．００１〜１００ｎＭ、１１Ｇ４：０．８〜８００ｎＭ、ウサギポリクローナル抗体：０．１〜１０００ｎＭ）の濃度で希釈した抗体希釈液を作成し、Biacore T200（ＧＥヘルスケア）を用いてＫｄ値を算出した。その結果、６Ｂ３は４７．６ｎＭ、１１Ｇ４は３７６ｎＭ、ウサギポリクローナル抗体は７５１ｎＭであった。
[Example 5] Measurement of dissociation constant of monoclonal antibody The dissociation constant (Kd value) of the obtained monoclonal antibody was measured by the following method. After immobilizing glyceraldehyde-derived AGEs-containing MSA (200 μg / mL, 98 μL) on the sensor chip CM5 (GE healthcare) using an amine coupling kit (GE healthcare), various antibodies (6B3: 0.001 to 1) An antibody dilution diluted with a concentration of 100 nM, 11 G 4: 0.8 to 800 nM, rabbit polyclonal antibody: 0.1 to 1000 nM) was prepared, and the Kd value was calculated using Biacore T200 (GE Healthcare). As a result, 6B3 was 47.6 nM, 11G4 was 376 nM, and rabbit polyclonal antibody was 751 nM.
［実施例６］６Ｂ３と１１Ｇ４の交差競合確認試験
（１）ビオチン標識化６Ｂ３の調製
Biotin Sulfo-OSu（３．２ｍｇ、同仁化学研究所）をＲＯ水（１４５．４μＬ）に溶解させ、ビオチン化溶液として使用した。下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、さらにＲＯ水を９Ｌ加えてＰＢＳとして使用した。
[Example 6] Cross competition confirmation test of 6B3 and 11G4 (1) Preparation of biotin-labeled 6B3
Biotin Sulfo-OSu (3.2 mg, Dojindo Laboratories) was dissolved in RO water (145.4 μL) and used as a biotinylation solution. The following reagent was dissolved in RO water to make 1 L, and 9 L of RO water was further added and used as PBS.
塩化ナトリウム（和光純薬） ８０ｇ
リン酸２水素カリウム（和光純薬） ２ｇ
リン酸水素２ナトリウム１２水和物（和光純薬） ２９ｇ。
Sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries) 80 g
Potassium dihydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 2 g
Hydrogen sodium disodium dodecahydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 29 g.
ビオチン化溶液（１３．４μＬ）を６Ｂ３抗体（１０ｍｇ／ｍＬ、５００μＬ）に加え、ミニディスクローター（バイオクラフト）を用いて転倒混和しながら２時間室温で反応させた。反応中に精製用プレパックカラム（ＮＡＰ−５、ＧＥヘルスケア）にＰＢＳ（１０ｍＬ）を加えて平衡化を行った。平衡化したＮＡＰ−５に反応液を加え、その後ＰＢＳ（１ｍＬ）を加えてビオチン標識化６Ｂ３抗体を回収した。 Biotinylated solution (13.4 μL) was added to the 6B3 antibody (10 mg / mL, 500 μL) and allowed to react for 2 hours at room temperature with end-over-end mixing using a minidisc rotor (BioCraft). During the reaction, PBS (10 mL) was added to a purification pre-packed column (NAP-5, GE Healthcare) to perform equilibration. The reaction solution was added to the equilibrated NAP-5, and then PBS (1 mL) was added to recover a biotin-labeled 6B3 antibody.
（２）試薬調製
下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、コーティング溶液として使用した。
炭酸ナトリウム（和光純薬） １．５９ｇ
炭酸水素ナトリウム（和光純薬） ２．９３ｇ。
ＢＳＡ（５ｇ、Sigma-Aldrich）をＰＢＳ（５００ｍＬ）に溶かし、ブロッキング溶液として使用した。
(2) Preparation of Reagent The following reagent was dissolved in RO water to make 1 L and used as a coating solution.
Sodium carbonate (Wako Pure Chemical Industries) 1.59 g
Sodium bicarbonate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 2.93 g.
BSA (5 g, Sigma-Aldrich) was dissolved in PBS (500 mL) and used as a blocking solution.
５０ｍＭトリス（６．１ｇ、和光純薬）をＲＯ水（約９００ｍＬ）に溶解させて、６Ｎ塩酸（和光純薬）でｐＨ７．４に調整した。得られた溶液にグリセロール（１ｍＬ、Sigma-Aldrich）、Tween-20 （１ｍＬ、ナカライテスク）を加え、ＲＯ水にて１Ｌにメスアップした。得られた溶液を希釈溶液として使用した。 50 mM Tris (6.1 g, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in RO water (about 900 mL), and adjusted to pH 7.4 with 6 N hydrochloric acid (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Glycerol (1 mL, Sigma-Aldrich) and Tween-20 (1 mL, Nacalai Tesque) were added to the obtained solution, and the solution was adjusted to 1 L with RO water. The resulting solution was used as a diluted solution.
下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、さらにＲＯ水を９Ｌ加えた後で、Tween-20 （５ｍＬ）を加えた。得られた溶液を洗浄溶液として使用した。
塩化ナトリウム（和光純薬） ８０ｇ
リン酸２水素カリウム（和光純薬） ２ｇ
リン酸水素２ナトリウム１２水和物（和光純薬） ２９ｇ。
The following reagent was dissolved in RO water to 1 L, and 9 L of RO water was further added, and then Tween-20 (5 mL) was added. The resulting solution was used as a wash solution.
Sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries) 80 g
Potassium dihydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 2 g
Hydrogen sodium disodium dodecahydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 29 g.
（３）抗原の固相化
コーティング溶液中で１．０μｇ／ｍＬに調整したグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（原液：１０ｍｇ／ｍＬＰＢＳ溶液）の溶液を、１００μＬずつ９６穴マイクロタイタープレート（COSTAR）に加え、４℃で一晩インキュベートした。
(3) Immobilization of antigen 100 μL each of a solution of glyceraldehyde-derived AGEs-containing BSA (stock solution: 10 mg / mL in PBS) adjusted to 1.0 μg / mL in a coating solution in 96-well microtiter plates (COSTAR) In addition, it was incubated overnight at 4 ° C.
（４）ブロッキング
固相化の処理を行った各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液（２００μＬ）を加え、室温で１時間放置した。
(4) Blocking Each well subjected to the immobilization treatment was washed 3 times with a washing solution (300 μL), a blocking solution (200 μL) was added, and left at room temperature for 1 hour.
（５）競合実験
希釈溶液を用いて、抗体（１１Ｇ４）と対照のマウスＩｇＧ（Thermo Fisher）の３倍希釈系列を、各抗体につき１ｍｇ／ｍＬより８点調製した。ビオチン標識化６Ｂ３抗体ＰＢＳ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）をＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ、和光純薬）含有希釈溶液にて１０，０００倍に希釈し、ビオチン標識化６Ｂ３抗体希釈溶液とした。
(5) Competition Experiment A 3-fold dilution series of antibody (11G4) and control mouse IgG (Thermo Fisher) was prepared at 8 points from 1 mg / mL for each antibody using diluted solution. The biotin-labeled 6B3 antibody PBS solution (1 mg / mL) was diluted 10,000-fold with a diluted solution containing BSA (1 mg / mL, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to obtain a biotin-labeled 6B3 antibody diluted solution.
ブロッキング溶液で処理した各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、１１Ｇ４と対照のマウスＩｇＧの３倍希釈系列溶液（各５０μＬ）およびビオチン標識化６Ｂ３抗体希釈溶液（５０μＬ）を加え、プレートミキサーで２分間撹拌後、３０℃水平振とう条件下で２時間インキュベートした Each well treated with blocking solution is washed 3 times with washing solution (300 μL), and a 3-fold dilution solution (50 μL each) of 11G4 and control mouse IgG and 50 μL of biotin-labeled 6B3 antibody dilution solution are added to the plate. After stirring for 2 minutes with a mixer, it was incubated for 2 hours under 30 ° C horizontal shaking conditions
（６）二次抗体の添加
洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液（Thermo Fisher、１．２５ｍｇ/ｍＬを希釈溶液にて５，０００倍に希釈した溶液、１００μＬ）を加え、プレートミキサーで３０秒間撹拌後、３７℃で１時間インキュベートした。
(6) Addition of secondary antibody After washing 3 times with washing solution (300 μL), HRP labeled streptavidin solution (Thermo Fisher, a solution obtained by diluting 1.25 mg / mL with a dilution solution of 5,000 mg, 100 μL) In addition, the plate mixer was stirred for 30 seconds and then incubated at 37 ° C. for 1 hour.
（７）発色
洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄後、１００μＬの基質溶液（ELISA POD基質 TMB溶液(Easy)、ナカライテスク）を加え、プレートミキサーで３０秒間撹拌後、室温で３０分間インキュベート後に１Ｎ ＨＣｌ（１００μＬ）を加え発色を停止した。
(7) Color development After washing 3 times with washing solution (300 μL), add 100 μL of substrate solution (ELISA POD substrate TMB solution (Easy), Nacalai Tesque), stir for 30 seconds with plate mixer and incubate for 30 minutes at room temperature and 1N HCl (100 μL) was added to stop color development.
（８）吸光度測定およびデータ解析
マイクロプレートリーダー(Cytation5、Biotek）で４５０ｎｍの吸光度を測定し、得られた吸光度の値から競合率を算出した。結果を図３に示す。１１Ｇ４の添加により濃度依存的に発色が低下し、１１Ｇ４が６Ｂ３と交差競合することが確認された。
(8) Absorbance Measurement and Data Analysis The absorbance at 450 nm was measured by a microplate reader (Cytation 5, Biotek), and the competition rate was calculated from the obtained absorbance values. The results are shown in FIG. The addition of 11G4 reduced the color development in a concentration dependent manner, confirming that 11G4 cross competes with 6B3.
Claims (12)
（Ａ）
（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
（Ｂ）
（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１：配列番号：９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ ＣＤＲ２：配列番号：１０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ ＣＤＲ３：配列番号：１１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ ＣＤＲ１：配列番号：１３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ ＣＤＲ２：配列番号：１４に示すアミノ酸配列に含まれる連続する１２残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ ＣＤＲ３：配列番号：１５に示すアミノ酸配列に含まれる連続する９残基のアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
を含む、抗体またはその抗原結合断片；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 1) The amino acid sequences of the respective complementarity determining regions (VH CDR1, VH CDR2 and VH CDR3) of the heavy chain variable region and the respective complementarity determining regions (VL CDR1, VL CDR2 and VL CDR3) of the light chain variable region
(A)
(A) VH CDR1: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(B) VH CDR2: the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(C) VH CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or amino acid sequence substantially identical thereto;
(D) VL CDR1: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(E) VL CDR2: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(F) VL CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 or amino acid sequence substantially identical thereto; or (B)
(A) VH CDR1: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(B) VH CDR2: the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10, or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(C) VH CDR3: amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, or amino acid sequence substantially identical thereto;
(D) VL CDR1: the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(E) VL CDR2: amino acid sequence of 12 consecutive residues contained in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence substantially identical thereto;
(F) VL CDR3: amino acid sequence of 9 consecutive residues contained in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, or an amino acid sequence substantially identical thereto;
An antibody or antigen-binding fragment thereof; or 2) an antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with said antibody or antigen-binding fragment thereof for binding to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs;
A monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof that binds to a glyceraldehyde-derived AGEs or an epitope of glycolaldehyde-derived AGEs.
配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
配列番号：１２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：１６のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、である、抗体またはその抗原結合断片；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。 1) Amino acid sequences of heavy chain variable region and light chain variable region respectively:
The amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence substantially identical thereto, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence substantially identical thereto; or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 or substantially identical thereto An amino acid sequence and an amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or an amino acid sequence substantially identical thereto, an antibody or an antigen-binding fragment thereof; or 2) binding to an epitope of glyceraldehyde-derived AGEs or glycolaldehyde-derived AGEs An antibody or antigen-binding fragment thereof that cross-competes with the antibody or antigen-binding fragment thereof,
The monoclonal antibody or an antigen-binding fragment thereof according to claim 1.
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