JP2019028053A - New measurement method for sflt-1 (soluble type vascular endothelial growth factor-1) - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、妊娠高血圧症候群の主要な原因であるsFlt-1(soluble Fms-like tyrosine kinase-1)タンパク質(可溶型血管内皮増殖因子受容体-1、sVEGFR-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1)とも呼ばれるもの)の、1種類の特異抗体とヘパリンを利用することによる、短時間で手技的に単純な、また作製上安価な測定法に関する。 The present invention relates to sFlt-1 (soluble Fms-like tyrosine kinase-1) protein (soluble vascular endothelial growth factor receptor-1, sVEGFR-1 (soluble vascular endothelial growth factor receptor), which is a major cause of gestational hypertension syndrome. -1)), which is a technique that is simple and technically simple in a short time and inexpensive to manufacture by using one kind of specific antibody and heparin.
近年においては、晩婚化や育児環境の困難さを背景に、世界的な出産児数の減少、すなわち少子化の状態となり、社会的に大きな問題となっている。このような状況においては、胎児や母体を傷害する疾患を克服し、母子ともに健康な出産をより確実にすることが喫緊の課題である。産科における疾患のなかでも妊娠の5〜7%に発症する妊娠高血圧症候群(従来、妊娠中毒症と呼ばれていたもの)は、重症例においては胎児と母体の双方において致死的な結果をもたらすことから、その早期発見と早期治療は極めて重要な医学的課題である。 In recent years, against the backdrop of late marriage and difficulties in child-rearing environments, the number of births worldwide has decreased, that is, the number of children has decreased, which has become a major social problem. Under such circumstances, it is an urgent issue to overcome diseases that damage the fetus and mother, and to ensure healthy birth for both mother and child. Pregnancy-induced hypertension syndrome (formerly called pregnancy toxemia) that occurs in 5-7% of pregnancy among obstetrical diseases has fatal consequences in both fetus and mother in severe cases Therefore, its early detection and early treatment are extremely important medical issues.
血管新生の制御機構は、胎児の発育、個体の成熟、創傷治癒等において重要な役割を果たす他、母体側の胎盤の形成と成熟においても重要な役割を果たしていることが明らかになりつつある。血管新生にはVEGF(血管内皮細胞増殖因子)、FGF(fibroblast growth factor;線維芽細胞増殖因子)、Angiopoietinなど多くの因子が関与するが、なかでもVEGFとその受容体であるVEGFRは、中心的な役割を果たすことが明らかになりつつある(非特許文献1および2)。本発明者らは1990年に新規チロシンキナーゼ型受容体遺伝子Flt-1 (Fms-like tyrosine kinase-1)を最初に単離し、報告した(非特許文献3)。Flt-1はVEGFに結合し受容体として働くことから、VEGFR-1とも呼ばれている。Flt-1遺伝子は受容体を発現する成熟型mRNAとともに、Flt-1の細胞外領域のみのタンパク質を産生するための短鎖mRNAを発現するが(非特許文献4)、妊娠高血圧症候群の胎盤からは主に2種類の短鎖Flt-1 mRNAとその産物であるe15a sFlt-1およびi13 sFlt-1タンパク質が正常妊娠時よりも大量に産生され、血清レベルでは正常妊婦の5〜10倍に達することが明らかとなっている(非特許文献5、6および7)。これらの異常に産生されたsFlt-1はVEGFやPlGF(胎盤増殖因子)と結合してその働きを抑制すること、また母体に高血圧やタンパク尿を引き起こすことから、本疾患の重要な原因物質のひとつと考えられており、体内のsFlt-1量、たとえば妊婦血液中のsFlt-1量は、現在では重要な生物学的指標・バイオマーカーとなっている(非特許文献7)。
It is becoming clear that the control mechanism of angiogenesis plays an important role in the development and maturation of the placenta on the maternal side, in addition to playing an important role in fetal development, individual maturation, wound healing, and the like. Many factors such as VEGF (vascular endothelial growth factor), FGF (fibroblast growth factor), and Angiopoietin are involved in angiogenesis. Among them, VEGF and its receptor VEGFR are central. It is becoming clear that these roles play a role (
さらに、昨年(2016年)には、sFlt-1の血中レベルは産科における妊娠高血圧症候群に限らず、急性膵臓炎においても重傷例においては軽症例よりも高値であることが報告された(非特許文献8)。他の疾患では、加齢黄斑変性症における網膜組織のsFlt-1発現低下や、実験動物において腎臓・足細胞のsFlt-1発現低下とネフローゼ様の慢性タンパク尿発症が報告されている(非特許文献9、10)。今後、血液中や体液中のsFlt-1がバイオマーカーとして利用される疾患がさらに増加する可能性が高い。
Furthermore, last year (2016), blood levels of sFlt-1 were reported to be higher than those in light cases in acute pancreatitis as well as in pregnancy-induced hypertension syndrome in obstetrics (non-incidence) Patent Document 8). In other diseases, decreased sFlt-1 expression in retinal tissues in age-related macular degeneration, and decreased sFlt-1 expression in kidney and podocytes and onset of nephrotic-like chronic proteinuria in experimental animals (non-patented)
これまでにsFlt-1測定法としてはsFlt-1に対する2種類の特異抗体を利用したサンドイッチELISA法が基本であった(非特許文献5−7)。しかし、2種類の適切な特異抗体を開発し測定法を確立するには時間と費用がかかり、その結果、2種類の特異抗体によるサンドイッチELISA法は高価格であり、また測定法も手技的に多段階で時間も必要であることから、バイオマーカー検査法として妊娠早期から産科的に広く利用するには困難があった。本発明はそのようなsFlt-1測定法の困難を克服し、広く利用できる簡便な測定法の開発を目指す。 Until now, the basic method for measuring sFlt-1 was the sandwich ELISA method using two specific antibodies against sFlt-1 (Non-patent Documents 5-7). However, it takes time and money to develop two types of specific antibodies and establish a measurement method. As a result, sandwich ELISA using two types of specific antibodies is expensive, and the measurement method is also technical. Since time is required at multiple stages, it has been difficult to use it widely in obstetrics from the early stages of pregnancy as a biomarker test method. The present invention overcomes the difficulties of the sFlt-1 measurement method and aims to develop a simple measurement method that can be widely used.
これまでに、sFlt-1タンパク質はその糖鎖修飾などからヘパリンと結合することが知られていた。この性質により、組織や培養細胞から得られたsFlt-1を精製するためにヘパリンカラムが用いられてきた(非特許文献11)。妊娠高血圧症候群の治療を試みる方法として、本疾患を発症した妊婦の血液をヘパリンカラムを通して還流させ、sFlt-1を減少させる試みも臨床試験で用いられている(非特許文献12)。しかし、ヘパリンに結合したsFlt-1が同時に特異抗体と安定に結合し、簡便な測定法として利用できるかは不明であった。 So far, it has been known that sFlt-1 protein binds to heparin due to its sugar chain modification. Due to this property, heparin columns have been used to purify sFlt-1 obtained from tissues and cultured cells (Non-patent Document 11). As a method of trying to treat gestational hypertension syndrome, an attempt to reduce sFlt-1 by refluxing the blood of a pregnant woman who has developed this disease through a heparin column is also used in non-patent literature 12). However, it was unclear whether sFlt-1 bound to heparin could simultaneously bind to a specific antibody stably and be used as a simple measurement method.
本発明の課題は、sFlt-1タンパク質がヘパリンと結合することを利用して、ヘパリンとsFlt-1に対する特異抗体でsFlt-1を挟むサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法を用い、新規で安価で実用的なsFlt-1測定法を提供することにある。 An object of the present invention is to use an immunoassay based on a sandwich method in which sFlt-1 protein is bound to heparin, sandwiching sFlt-1 with a specific antibody against heparin and sFlt-1, The object is to provide a new, inexpensive and practical sFlt-1 measurement method.
本発明者は、sFlt-1試料に、(1)ヘパリンを結合させたビーズ(既に市販されているもの)、(2)抗ヒトsFlt-1特異マウス抗体(以下、一次抗体と称する)、ならびに(3)アルカリフォスファターゼ標識もしくはHRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)標識の抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体(以下、二次抗体と称する)、の三者を混ぜることにより、固定化ヘパリンと特異抗体による簡便なサンドイッチsFlt-1測定法が確立し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明において、sFlt-1のヘパリン結合性を利用することにより、必要な抗sFlt-1特異抗体の数を2種類から1種類に減らし、安価で反応時間も短縮された新規sFlt-1測定法を提供することができる。 The present inventor has (1) a bead having heparin bound (already commercially available), (2) an anti-human sFlt-1-specific mouse antibody (hereinafter referred to as a primary antibody), and an sFlt-1 sample, and (3) A simple sandwich of immobilized heparin and specific antibody by mixing the anti-mouse immunoglobulin / goat antibody (hereinafter referred to as secondary antibody) labeled with alkaline phosphatase or HRP (horseradish peroxidase). The inventors have found that an sFlt-1 measurement method can be established, and have completed the present invention. That is, in the present invention, by utilizing the heparin-binding property of sFlt-1, the number of necessary anti-sFlt-1-specific antibodies is reduced from two to one, and the novel sFlt-1 that is inexpensive and shortens the reaction time A measurement method can be provided.
本発明は以下のとおりである。
[1] ヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法。
[2] ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、[1]のsFlt-1を測定する方法。
[3] ELISA法またはイムノクロマト法である、[1]または[2]のsFlt-1を測定する方法。
[4] ヘパリンを結合したビーズを用いる、[1]〜[3]のいずれかのsFlt-1を測定する方法。
[5] ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、[1]〜[4]のいずれかのsFlt-1を測定する方法。
[6] [1]〜[5]のいずれかの方法で、被験体から採取した検体中のsFlt-1を測定し、検体中のsFlt-1濃度が健常者に比較して高い場合、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価する、妊娠高血圧症候群の検出方法。
[7] 少なくともヘパリンもしくは抗sFlt-1抗体を固相化した担体、ならびに標識した抗sFlt-1抗体もしくはヘパリンを含む、検体中のsFlt-1を測定するためのキット。
[8] 少なくともヘパリンを固相化した担体、抗sFlt-1抗体および該抗sFlt-1抗体に結合する標識した二次抗体を含む、検体中のsFlt-1を測定するためのキット。
[9] ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体が、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維により形成された膜状形成物または立体形成物である、[7]または[8]の検体中のsFlt-1を測定するためのキット。
[10] ELISA法キットまたはイムノクロマト法キットである、[7]〜[9]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[11] ヘパリンを結合したビーズを用いる、[7]〜[10]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[12] ヘパリンの代りに、ヘパリンと構造類似性を有し、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合する物質を用いる、[7]〜[11]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
[13] 妊娠高血圧症候群を検出するための、[7]〜[12]のいずれかのsFlt-1を測定するためのキット。
The present invention is as follows.
[1] A method for measuring sFlt-1 in a specimen by forming a sandwich complex sandwiching sFlt-1 with heparin and an anti-sFlt-1 antibody, comprising heparin or anti-sFlt-1 immobilized on a carrier A specimen is contacted with an antibody, a complex of heparin or anti-sFlt-1 antibody and sFlt-1 in the specimen is formed on the carrier, and the presence of the complex is labeled with the anti-sFlt-1 antibody or anti-sFlt- A method for measuring sFlt-1 in a sample, comprising detecting using 1 antibody and a labeled anti-immunoglobulin antibody that binds to the antibody, or labeled heparin.
[2] The sFlt- of [1], wherein the carrier for immobilizing heparin or anti-sFlt-1 antibody is a film-form product or a three-dimensional product formed by synthetic resin, synthetic fiber, or fiber derived from a natural product How to measure 1
[3] A method for measuring sFlt-1 of [1] or [2], which is an ELISA method or an immunochromatography method.
[4] A method for measuring sFlt-1 of any one of [1] to [3], using beads bound with heparin.
[5] Instead of heparin, a substance having structural similarity to heparin and binding to sFlt-1 of mammals, birds and amphibians including humans is used. How to measure.
[6] When sFlt-1 in a sample collected from a subject is measured by any of the methods of [1] to [5] and the sFlt-1 concentration in the sample is higher than that in a healthy subject, A method for detecting pregnancy-induced hypertension syndrome, wherein the subject is evaluated as suffering from pregnancy-induced hypertension syndrome.
[7] A kit for measuring sFlt-1 in a specimen, comprising at least a carrier on which heparin or anti-sFlt-1 antibody is immobilized, and a labeled anti-sFlt-1 antibody or heparin.
[8] A kit for measuring sFlt-1 in a sample, comprising at least a carrier on which heparin is immobilized, an anti-sFlt-1 antibody, and a labeled secondary antibody that binds to the anti-sFlt-1 antibody.
[9] The carrier on which the heparin or anti-sFlt-1 antibody is immobilized is a film-form product or a three-dimensional product formed by a synthetic resin, a synthetic fiber, or a fiber derived from a natural product, [7] or [8 A kit for measuring sFlt-1 in the specimen.
[10] A kit for measuring sFlt-1 of any one of [7] to [9], which is an ELISA method kit or an immunochromatography method kit.
[11] A kit for measuring sFlt-1 according to any one of [7] to [10], wherein heparin-bound beads are used.
[12] Instead of heparin, a substance having structural similarity to heparin and binding to sFlt-1 of mammals, birds and amphibians including humans is used. Kit for measuring.
[13] A kit for measuring sFlt-1 of any one of [7] to [12] for detecting pregnancy-induced hypertension syndrome.
本発明によれば、sFlt-1タンパク質に対する、安価で手技的にも容易で、時間も短縮可能なsFlt-1測定法を提供することができる。すなわち、本発明において、ヘパリンのsFlt-1結合性を利用することにより、必要な抗sFlt-1特異抗体の数を1種類に減らし、固相化ヘパリンと特異抗体1種類のサンドイッチ法による、安価で反応時間も短縮された新規sFlt-1測定法を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the sFlt-1 measuring method with respect to sFlt-1 protein can be provided which is cheap, is easy also in a technique, and can shorten time. That is, in the present invention, the number of necessary anti-sFlt-1-specific antibodies is reduced to one by using the sFlt-1 binding property of heparin, and the cost is low by the sandwich method of solid-phased heparin and one specific antibody. Thus, a novel sFlt-1 measurement method with a shortened reaction time can be provided.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、血液中のsFlt-1をサンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法により測定する方法である。ここで本発明のサンドイッチ法を測定原理とした免疫学的測定法とは、標的物質であるsFlt-1をsFlt-1に結合するヘパリンおよび抗sFlt-1抗体を用いて挟み込むように捕捉して、sFlt-1を測定する方法をいい、単にサンドイッチ法ともいう。ヘパリンおよび抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んで形成された複合体をサンドイッチ複合体と呼ぶ。サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法としては、例えばイムノクロマト法、酵素免疫測定吸着法(ELISA(Enzyme-linked immune-sorbent assay)法)、ウエスタンブロット法等が挙げられる。
なお、本発明において、「測定」という場合、定量、半定量、検出のいずれも含む。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention is a method for measuring sFlt-1 in blood by an immunoassay based on the sandwich method. Here, the immunoassay based on the sandwich method of the present invention is to capture the target substance sFlt-1 by sandwiching it with heparin and anti-sFlt-1 antibody that bind to sFlt-1. , Refers to the method of measuring sFlt-1, also simply referred to as the sandwich method. A complex formed by sandwiching sFlt-1 with heparin and anti-sFlt-1 antibody is called a sandwich complex. Examples of the immunoassay based on the sandwich method include an immunochromatography method, an enzyme immunoassay adsorption method (ELISA (Enzyme-linked immune-sorbent assay) method), a Western blot method, and the like.
In the present invention, the term “measurement” includes any of quantitative, semi-quantitative, and detection.
本発明の方法の一例として、固相化担体にヘパリンを固相化し、該固相化担体にsFlt-1を含む可能性がある検体を添加して接触させ、固相化担体上でヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させる。さらに、ヒトsFlt-1に対する特異的抗体(抗sFlt-1抗体)を添加して接触させ、固相化担体上のヘパリンとsFlt-1の複合体に抗sFlt-1抗体を結合させ、担体上のヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を検出すればよい。 As an example of the method of the present invention, heparin is solid-phased on a solid-phased carrier, a specimen that may contain sFlt-1 is added to the solid-phased carrier and brought into contact, and heparin and sFlt-1 complex is formed. Furthermore, a specific antibody against human sFlt-1 (anti-sFlt-1 antibody) is added and contacted, and the anti-sFlt-1 antibody is bound to the complex of heparin and sFlt-1 on the immobilized carrier, The sandwich complex of heparin, sFlt-1 and anti-sFlt-1 antibody may be detected.
検出は、抗sFlt-1抗体をアルカリフォスファターゼ(ALP)やホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)等の酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、着色ポリスチレン粒子等の有色粒子や金コロイド等のコロイド粒子などで標識しておき、標識物質が発するシグナルを測定することにより行うことができる。酵素を用いる場合、好ましくは高感度での測定を可能にするホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)を用いる。測定は、標識が酵素による場合、それぞれの酵素に対する基質を添加し、酵素反応を行わせ、発色を吸光度の測定により測定すればよい。標識が蛍光物質の場合は、蛍光検出器を用いて蛍光を測定すればよい。抗体の標識は公知の方法で行うことができる。 For detection, anti-sFlt-1 antibody is enzyme such as alkaline phosphatase (ALP) or horseradish peroxidase (HRP), radioisotope, fluorescent substance, luminescent substance, colored particles such as colored polystyrene particles, colloidal particles such as gold colloid, etc. This can be performed by measuring the signal emitted from the labeling substance. When an enzyme is used, horseradish peroxidase (HRP) that enables measurement with high sensitivity is preferably used. In the measurement, when the label is an enzyme, a substrate for each enzyme is added to cause an enzyme reaction, and the color development may be measured by measuring the absorbance. When the label is a fluorescent substance, the fluorescence may be measured using a fluorescence detector. Labeling of the antibody can be performed by a known method.
抗sFlt-1抗体は、マウス単クローン抗体に限らず、ラット、ウサギ、ヤギなど、どのような動物で作製した抗体も利用でき、ポリクローナル抗体でもよい。 The anti-sFlt-1 antibody is not limited to a mouse monoclonal antibody, and an antibody produced in any animal such as a rat, rabbit, or goat can be used, and may be a polyclonal antibody.
また、抗sFlt-1抗体を標識する代りに、抗sFlt-1抗体に結合する二次抗体であって標識した二次抗体を用いてもよい。この場合、固相担体上にヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体と二次抗体のサンドイッチ複合体が形成され、二次抗体の標識物質から発するシグナルを測定すればよい。二次抗体としては、抗sFlt-1抗体に特異的に結合する抗体を用いることができ、抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体等のsFlt-1抗体の作製に用いた動物の免疫グロブリンに対する抗体を用いればよい。 Further, instead of labeling the anti-sFlt-1 antibody, a labeled secondary antibody that binds to the anti-sFlt-1 antibody may be used. In this case, a sandwich complex of heparin, sFlt-1, anti-sFlt-1 antibody and secondary antibody is formed on the solid phase carrier, and the signal emitted from the labeling substance of the secondary antibody may be measured. As the secondary antibody, an antibody that specifically binds to the anti-sFlt-1 antibody can be used, and an antibody against the animal immunoglobulin used to produce the sFlt-1 antibody such as an anti-mouse immunoglobulin / goat antibody is used. That's fine.
二次抗体を用いる場合のELISA法の概略図を図1に、二次抗体を用いない場合のELISA法の概略図を図2に示す。 A schematic diagram of the ELISA method when a secondary antibody is used is shown in FIG. 1, and a schematic diagram of the ELISA method when a secondary antibody is not used is shown in FIG.
抗体は、FabやF(ab’)2のような免疫グロブリン断片、あるいは、組換え体として発現されたscFv、dsFv、diabody、minibody等の組換え抗体であってもよい。本発明において、「抗体」という語は、これらの断片も含む。これらの断片は公知の方法で調製することができる。 The antibody may be an immunoglobulin fragment such as Fab or F (ab ′) 2 , or a recombinant antibody such as scFv, dsFv, diabody, minibody expressed as a recombinant. In the present invention, the term “antibody” also includes these fragments. These fragments can be prepared by a known method.
担体上のヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体、あるいはヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体(一次抗体)と二次抗体のサンドイッチ複合体を形成させる場合、最初にヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させ、洗浄し、その後抗sFlt-1抗体を添加し、ヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を形成させる2ステップの方法、あるいは最初にヘパリンとsFlt-1の複合体を形成させ、洗浄し、その後抗sFlt-1抗体を接触させヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体のサンドイッチ複合体を形成させ、洗浄し、その後二次抗体を添加し、ヘパリンとsFlt-1と抗sFlt-1抗体(一次抗体)と二次抗体のサンドイッチ複合体を形成させる3ステップの方法で行ってもよいし、各試薬を同時に添加し、サンドイッチ複合体を形成する反応を同時に行う1ステップの方法で行ってもよい。 When forming a sandwich complex of heparin, sFlt-1 and anti-sFlt-1 antibody or heparin, sFlt-1, anti-sFlt-1 antibody (primary antibody) and secondary antibody on the carrier, A two-step method in which a complex of heparin and sFlt-1 is formed, washed and then anti-sFlt-1 antibody is added to form a sandwich complex of heparin, sFlt-1 and anti-sFlt-1 antibody, or first To form a heparin-sFlt-1 complex, washed, and then contacted with an anti-sFlt-1 antibody to form a heparin-sFlt-1 and anti-sFlt-1 antibody sandwich complex, washed, and then secondary The antibody may be added to form a sandwich complex of heparin, sFlt-1, anti-sFlt-1 antibody (primary antibody) and secondary antibody. Alternatively, each reagent may be added simultaneously and sandwiched. One step to perform the complex formation reaction simultaneously It may be carried out in.
ヘパリンとsFlt-1との結合反応、および抗原抗体反応は4℃〜45℃、好ましくは20℃〜40℃、さらに好ましくは25℃〜38℃で行うことができ、また、それぞれの結合反応あるいは1ステップで行うときの反応時間は、10分〜18時間、より好ましくは10分〜3時間、さらに好ましくは30分〜2時間程度である。 The binding reaction between heparin and sFlt-1 and the antigen-antibody reaction can be performed at 4 ° C to 45 ° C, preferably 20 ° C to 40 ° C, more preferably 25 ° C to 38 ° C. The reaction time in one step is 10 minutes to 18 hours, more preferably 10 minutes to 3 hours, and even more preferably about 30 minutes to 2 hours.
上記の方法は、ヘパリンを担体に固相化して行う方法であるが、サンドイッチ法を測定原理とする免疫学的測定法においては、ヘパリンと特異抗体の位置を逆向きにすることも可能である。すなわち、抗sFlt-1特異抗体を担体に固相化して、試料中のsFlt-1と結合させ、それに対して適切な大きさのヘパリンであって標識したものを結合させてサンドイッチ複合体を形成させて測定することも可能である。 The above method is a method in which heparin is immobilized on a carrier, but in the immunoassay based on the sandwich method, it is possible to reverse the position of heparin and a specific antibody. . In other words, an anti-sFlt-1-specific antibody is immobilized on a carrier and bound to sFlt-1 in the sample, and then heparin of an appropriate size and labeled are bound to form a sandwich complex. It is also possible to measure.
すなわち、本発明は、ヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法であって、担体に固相化したヘパリンまたは抗sFlt-1抗体に検体を接触させ、該担体上にヘパリンまたは抗sFlt-1抗体と検体中のsFlt-1との複合体を形成させ、該複合体の存在を標識した抗sFlt-1抗体もしくは抗sFlt-1抗体とそれに結合する標識した抗イムノグロブリン抗体、または標識したヘパリンを用いて検出することを含む、検体中のsFlt-1を測定する方法である。 That is, the present invention is a method for measuring sFlt-1 in a specimen by forming a sandwich complex sandwiching sFlt-1 with heparin and an anti-sFlt-1 antibody, which comprises heparin or anti-antigen immobilized on a carrier. a specimen is contacted with the sFlt-1 antibody, a complex of heparin or anti-sFlt-1 antibody and sFlt-1 in the specimen is formed on the carrier, and the presence of the complex is labeled with the anti-sFlt-1 antibody or It is a method for measuring sFlt-1 in a sample, comprising detecting using an anti-sFlt-1 antibody and a labeled anti-immunoglobulin antibody that binds to the antibody, or labeled heparin.
ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化する担体としては、合成樹脂、合成繊維または天然物由来の繊維等により形成された膜状形成物または立体形成物が挙げられ、具体的にはELISA用マイクロタイタープレート、スライドガラス、ニトロセルロース膜、セルロース膜、セファロース膜、セルロースビーズやセファロースビーズなどの樹脂ビーズ、磁性化ビーズ等種々のものを用いることができる。また、ヘパリンを結合させた市販の樹脂ビーズを用いることもでき、例えば、セファロースビーズにヘパリンを結合した市販のヘパリンビーズ(Heparin Sepharose 6 Fast Flow, 17-0998-01, GE Healthcare)を用いることができる。また、ヘパリンを溶出しないように固定化したゲルや繊維膜を用いてもよい。本発明において、担体として、ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化した樹脂ビーズ等を用い、該樹脂ビーズをELISA用マイクロタイタープレートのウエルに添加して測定する方法もELISAという。ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の担体への結合は、物理的吸着、官能基を利用した共有結合等、公知の方法で行うことができる。固相化量は、特に限定されないが担体が96ウェルマイクロタイタープレートの場合、1ウエル当たり数ngから数十μgが望ましい。固相化は固相化すべきヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の溶液を担体と接触させることにより行うことができる。例えば、マイクロタイタープレートを用いる場合、ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体の溶液をマイクロタイタープレートのウエルに分注し一定時間置くことにより固相化することができる。ヘパリンまたは抗sFlt-1抗体を固相化した後は、アッセイ中の非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ウサギ血清アルブミン、卵白アルブミン等を含んだブロッキング溶液を用いてブロッキングを行うのが好ましい。
Examples of the carrier for immobilizing heparin or anti-sFlt-1 antibody include a film-form product or a three-dimensional product formed from a synthetic resin, a synthetic fiber, or a fiber derived from a natural product, specifically for ELISA. Various materials such as a microtiter plate, a slide glass, a nitrocellulose membrane, a cellulose membrane, a sepharose membrane, resin beads such as cellulose beads and sepharose beads, and magnetized beads can be used. In addition, commercially available resin beads to which heparin is bound can be used. For example, commercially available heparin beads in which heparin is bound to sepharose beads (
ヘパリンは、化学的にはグリコサミノグリカンの一種であり、D-グルクロン酸あるいはL-イズロン酸とグルコサミンが1,4結合により重合し二糖の繰り返し単位を形成している高分子物質である。ヘパリンに限らず、ヘパリンに類似した構造を有しsFlt-1に結合する化合物すべてを利用することができる。ヘパリンに類似した構造を有しsFlt-1に結合する化合物として、例えば、ムコ多糖の多糖硫酸化エステルが挙げられ、代表的な物質として、ヘパラン硫酸が挙げられる。sFlt-1はヒトに限らず、マウスにおいてもi13型sFlt-1が血管内皮細胞や胎盤栄養層細胞などから発現し、ヘパリンと結合することが示されている。従って、本発明をマウスsFlt-1測定系にも応用することができる。また、哺乳類、鳥類、両生類のsFlt-1と結合するヘパリンまたはヘパリンと類似構造を有する物質を用いることによりヒトやマウスを含む哺乳類、鳥類、両性類のsFlt-1の測定にも応用することができる。ヘパリンやヘパリンと類似構造を有する物質の由来は限定されず、例えば、ウシやブタの腸粘膜由来のものを用いることができる。 Heparin is a kind of glycosaminoglycan chemically, and it is a high-molecular substance in which D-glucuronic acid or L-iduronic acid and glucosamine are polymerized by 1,4 bonds to form disaccharide repeating units. . Not only heparin but all compounds having a structure similar to heparin and binding to sFlt-1 can be used. As a compound having a structure similar to heparin and binding to sFlt-1, for example, a polysaccharide sulfated ester of mucopolysaccharide is exemplified, and a representative substance is heparan sulfate. It has been shown that sFlt-1 is expressed not only in humans but also in mice, i13 type sFlt-1 is expressed from vascular endothelial cells, placental trophoblast cells, etc. and binds to heparin. Therefore, the present invention can be applied to a mouse sFlt-1 measurement system. It can also be applied to the measurement of sFlt-1 in mammals, birds, and amphibians, including humans and mice, by using heparin that binds to sFlt-1 in mammals, birds and amphibians, or a substance having a similar structure to heparin. it can. The origin of a substance having a structure similar to heparin or heparin is not limited, and for example, a substance derived from bovine or porcine intestinal mucosa can be used.
妊娠高血圧症候群の胎盤では、sFlt-1の短いアイソフォームであるe15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質が産生され、これらのタンパク質は、妊娠高血圧症候群の血液中に、正常妊婦の2倍以上、3倍以上、例えば、2〜5倍、3〜5倍、あるいは5〜10倍の濃度で含まれる。本発明の方法において、e15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質を区別する必要はなく、どちらを測定してもよい。そのため、抗sFlt-1抗体はe15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質の両方に結合するものを用いればよい。本発明において、sFlt-1と言う場合、e15a sFlt-1タンパク質およびi13 sFlt-1タンパク質も含む。 In the placenta of gestational hypertension syndrome, e15a sFlt-1 protein and i13 sFlt-1 protein, which are short isoforms of sFlt-1, are produced. It is contained at a concentration of 3 times or more, for example, 2 to 5 times, 3 to 5 times, or 5 to 10 times. In the method of the present invention, it is not necessary to distinguish between the e15a sFlt-1 protein and the i13 sFlt-1 protein, and either may be measured. Therefore, an anti-sFlt-1 antibody that binds to both the e15a sFlt-1 protein and the i13 sFlt-1 protein may be used. In the present invention, the term sFlt-1 includes e15a sFlt-1 protein and i13 sFlt-1 protein.
本発明で測定するsFlt-1は、ヒトsFlt-1に限定されず、ヒトを含む哺乳類、鳥類、両性類のsFlt-1も含む。 The sFlt-1 measured in the present invention is not limited to human sFlt-1, and includes sFlt-1 of mammals, birds and amphibians including humans.
sFlt-1は身体の多くの組織で発現していることから、本発明において、検体は、血清、血漿、全血のみならず、胸水、腹水、脳髄液、唾液、尿など、ほぼ全ての体液を含む。ただし、血液の抗凝固剤としてヘパリンを用いて調製した血漿は、ヘパリン除去後に使用可能となる。 Since sFlt-1 is expressed in many tissues of the body, in the present invention, specimens include not only serum, plasma, whole blood, but also almost all body fluids such as pleural effusion, ascites, cerebrospinal fluid, saliva, urine, etc. including. However, plasma prepared using heparin as a blood anticoagulant can be used after heparin removal.
添加する検体および各試薬の量は数μL〜数百μLである。検体は数倍から十数倍に希釈して用いてもよい。 The amount of the sample and each reagent to be added is several μL to several hundred μL. The specimen may be used after being diluted several times to a dozen times.
被験体から採取した検体中のsFlt-1を測定することにより被験体が妊娠高血圧症候群に罹患しているか否かを評価することができ、あるいは評価するための補助的データを得ることができる。すなわち、被験体から採取した検体中のsFlt-1濃度が健常者に比較して高い場合、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価することができる。 By measuring sFlt-1 in a sample collected from a subject, it can be evaluated whether or not the subject suffers from gestational hypertension syndrome, or auxiliary data for evaluation can be obtained. That is, when the sFlt-1 concentration in a sample collected from a subject is higher than that of a healthy person, the subject can be evaluated as suffering from a gestational hypertension syndrome.
また、あらかじめ健常人の検体中のsFlt-1を測定しておき、該測定値に基づいてsFlt-1の濃度測定値についてカットオフ値(閾値)を定めておいてもよい。該カットオフ値を基準とし、被験体から採取した検体中のsFlt-1濃度がカットオフ値以上か、またはカットオフ値を超えた場合に、該被験体は妊娠高血圧症候群に罹患していると評価することができる。 Alternatively, sFlt-1 in a sample of a healthy person may be measured in advance, and a cut-off value (threshold value) may be determined for the concentration measurement value of sFlt-1 based on the measurement value. Based on the cut-off value, when the sFlt-1 concentration in the sample collected from the subject is equal to or higher than the cut-off value or exceeds the cut-off value, the subject is suffering from pregnancy-induced hypertension syndrome. Can be evaluated.
本発明のヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法で測定した場合、正常分娩例では血清中のsFlt-1濃度は、12ng/ml程度 (+/- 約7ng/ml)であり、妊娠高血圧症候群症例では平均値56ng/ml程度 (+/- 約33ng/ml)であり、正常分娩例の約4.7倍である。さらに、妊娠37週6日以前に分娩となった前期発症例(いわゆる重症例)では平均値が約70ng/mlであり、正常分娩例の約5.8倍である。さらに、妊娠38週0日以後に出産となった後期発症例ではsFlt-1平均値は約24ng/mlで、正常分娩例の約2倍程度である。
When measured by the method of measuring sFlt-1 in a specimen by forming a sandwich complex sandwiching sFlt-1 with the heparin of the present invention and anti-sFlt-1 antibody, the concentration of sFlt-1 in serum in normal delivery cases Is about 12 ng / ml (+/- about 7 ng / ml), the average is about 56 ng / ml (+/- about 33 ng / ml) in gestational hypertension syndrome cases, about 4.7 times that of normal delivery cases . Furthermore, in the first-onset cases (so-called severe cases) that delivered before 37 weeks and 6 days of pregnancy, the average value is about 70 ng / ml, which is about 5.8 times that of normal deliveries. Furthermore, in the late onset cases that gave birth after 38
従って、例えば、血清中のsFlt-1濃度のカットオフ値として、12ng/ml×2〜5の値と設定することができる。このカットオフ値は、好ましくは本発明のヘパリンと抗sFlt-1抗体によりsFlt-1を挟んだサンドイッチ複合体を形成させて検体中のsFlt-1を測定する方法で測定したときの値である。 Therefore, for example, the value of 12 ng / ml × 2 to 5 can be set as the cut-off value of the sFlt-1 concentration in serum. This cut-off value is preferably a value obtained by measuring sFlt-1 in a specimen by forming a sandwich complex sandwiching sFlt-1 with the heparin of the present invention and an anti-sFlt-1 antibody. .
また、本発明は、妊娠高血圧症候群を検出するための補助的データを取得する方法も含む。 The present invention also includes a method for obtaining auxiliary data for detecting pregnancy-induced hypertension syndrome.
本発明は、検体中のsFlt-1を測定するためのキットを包含し、該キットは少なくともヘパリンまたはヘパリンと構造類似性を有する物質を固相化した担体を含み、さらに、標識した抗sFlt-1抗体または抗sFlt-1抗体と該抗sFlt-1抗体に結合する標識した二次抗体を含む。あるいは、該キットは抗sFlt-1抗体を固相化した担体を含み、さらに標識したヘパリンまたはヘパリンと構造類似性を有する物質を含む。 The present invention includes a kit for measuring sFlt-1 in a sample, the kit comprising at least heparin or a carrier on which a substance having structural similarity to heparin is immobilized, and further labeled anti-sFlt- 1 antibody or an anti-sFlt-1 antibody and a labeled secondary antibody that binds to the anti-sFlt-1 antibody. Alternatively, the kit includes a carrier on which an anti-sFlt-1 antibody is immobilized, and further includes labeled heparin or a substance having a structural similarity to heparin.
以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
<実施例1>
[ヘパリンビーズと特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイ]
本発明における新規ELISA測定法が効果を発揮するかどうかを確認するために、アルカリフォスファターゼ標識二次抗体を用いて以下のようなアッセイを試みた。
<Example 1>
[SFlt-1 ELISA assay using heparin beads and specific antibodies]
In order to confirm whether the novel ELISA assay method in the present invention is effective, the following assay was attempted using an alkaline phosphatase-labeled secondary antibody.
ヘパリンビーズ(GE Healthcare)と抗sFlt-1特異抗体(KM1750, Kanno S. et al. Oncogene 19, 2138-46, 2000)によるサンドイッチELISA法により、ヒトe15a型sFlt-1産生ヒト293細胞株の培養上清の測定を行った。定量化されたヒト7N-Flt-1(遺伝子発現ベクターを用いた昆虫細胞株の培養から得られたもので、ヒトFlt-1受容体タンパク質の細胞外領域のうち1〜7番目までの7個の免疫グロブリンドメインを含むペプチド. Cell, 151:384-399, 2012.)を対照タンパクとした。 Culture of human sFlt-1 producing human 293 cell line by sandwich ELISA using heparin beads (GE Healthcare) and anti-sFlt-1 specific antibody (KM1750, Kanno S. et al. Oncogene 19, 2138-46, 2000) The supernatant was measured. Quantified human 7N-Flt-1 (obtained from the culture of insect cell lines using gene expression vectors, 7 of the extracellular region of the human Flt-1 receptor protein from 1 to 7 A peptide containing the immunoglobulin domain of. Cell, 151: 384-399, 2012.) was used as a control protein.
(1)反応溶液の作製
1mlの溶液中に、(a)0、20または50ngの対照7N-Flt-1タンパク質(100μl生理的食塩水中)、または、sFlt-1試料(ヒトe15a sFlt-1産生293細胞株の培養上清(CM)100μl)、(b)ウシ胎児血清100μl、(c)ヘパリンビーズ25μl、(d)抗ヒトsFlt-1マウス単クローン特異抗体KM1750約75ng、(e)アルカリフォスファターゼ標識の抗マウス免疫グロブリン・ヤギ抗体(KURABO ZT6550)約0.3μl、(f)スキムミルク(雪印-北海道)約100μg、(g)0.1% Tween-20添加生理的食塩水775μlを含む反応溶液を作製した。(a)については、293細胞親株の培養上清や、培地のみ、あるいは、対照7N-Flt-1タンパクとsFlt-1試料を共に加えたものも測定した。
(1) Preparation of reaction solution
In 1 ml of solution, (a) 0, 20 or 50 ng of
(2)反応溶液の撹拌と遠心による洗浄
この反応溶液を1.5mlエッペンドルフチューブに入れてふたを閉じ、3〜4時間、4℃において緩やかに回転させ、撹拌した。撹拌後、毎分300回転、7〜8秒の低速・短時間遠心(2回)によりヘパリンビーズ結合体を沈殿させた。上清を十分に除去した後、洗浄の目的で1mlの0.1% Tween-20を含む生理的食塩水を加え、ふたを閉じ、4℃において緩やかに回転させ、5分間、撹拌した。撹拌後、毎分300回転、7〜8秒の低速・短時間遠心(2回)によりヘパリンビーズ結合体を沈殿させ、上清を十分除去した。
(2) Stirring of reaction solution and washing by centrifugation The reaction solution was placed in a 1.5 ml Eppendorf tube, the lid was closed, and the mixture was gently rotated at 4 ° C. for 3 to 4 hours and stirred. After stirring, the heparin bead conjugate was precipitated by centrifugation at 300 rpm for 7 to 8 seconds at low speed for a short time (twice). After sufficiently removing the supernatant, 1 ml of physiological saline containing 0.1% Tween-20 was added for the purpose of washing, the lid was closed, gently rotated at 4 ° C., and stirred for 5 minutes. After stirring, the heparin bead conjugate was precipitated by low-speed, short-time centrifugation (twice) at 300 rpm for 7 to 8 seconds, and the supernatant was sufficiently removed.
(3)アルカリフォスファターゼ反応液による測定
洗浄したヘパリンビーズ結合体(sFlt-1タンパク質、一次抗体、二次抗体、これら三者が結合していると予想されるもの、約15μl)に、アルカリフォスファターゼ測定試薬 (BCIP-NBT, Nacalai tesque社)を含むアルカリ溶液(pH 8.8) 0.2mlを加え、撹拌した後に96穴プレートに移して反応を観察した。約20〜30分後、対照の7N Flt-1タンパク質を含む反応液が青色に変化したことを確認して、プレートリーダーを用いて595nmで計測した。
(3) Measurement with alkaline phosphatase reaction solution Measurement of alkaline phosphatase on washed heparin bead conjugate (sFlt-1 protein, primary antibody, secondary antibody, those expected to be bound by these three, approximately 15 μl) 0.2 ml of an alkaline solution (pH 8.8) containing a reagent (BCIP-NBT, Nacalai tesque) was added, stirred, and then transferred to a 96-well plate to observe the reaction. After about 20 to 30 minutes, it was confirmed that the reaction solution containing the
(4)結果
結果を図3に写真で示す。全て、同一試料を2回(今回は、1と2、3と4、5と6、7と8、9と10、11と12、13と14、15と16、17と18は同じ内容の試料)測定した。対照の7N Flt-1無添加の反応液(No.1、2)はアルカリフォスファターゼ反応による発色は認められず黄色であるが、7N Flt-1を20ng(No.3、4)、50ng(No.5、6)加えたものではアルカリフォスファターゼ反応により青色となっている。293細胞親株の培養上清(293 CM)(No.7、8)は、ほぼ黄色であり、大きな変化は認められないが、e15a sFlt-1 cDNAを発現させた293細胞株の培養上清(e15a CM)(No.11、12)では、青色への変化が認められる。
(4) Results The results are shown as photographs in FIG. All of the same sample twice (this
また、293細胞親株の培養上清に対照7N Flt-1タンパク質を20ng添加した試料(No.9、10)では、No.3、4に近い青色反応が得られたことから、培養上清中に非特異的に反応を抑える物質は含まれていないことが理解できる。
In addition, in the sample (Nos. 9 and 10) obtained by adding 20 ng of
図4に各測定における測定値を示す。
図4中の、[測定値]にプレートリーダーで測定した数値を示した。[平均値]は、1と2、3と4、5と6、7と8、9と10、11と12、13と14、15と16の平均値を示した。さらに、[平均値-208]は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.1とNo.2の平均値208を差し引いた値である。図5に示すように、反応液中のsFlt-1量は、20ng以下の場合により良い定量性が期待される。
FIG. 4 shows measured values in each measurement.
In FIG. 4, [Measured Value] shows the value measured with a plate reader. [Average value] shows average values of 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8, 9 and 10, 11 and 12, 13 and 14, and 15 and 16. Furthermore, [average value−208] is a value obtained by subtracting the
<実施例2>
[ヘパリンビーズと市販の特異抗体を用いたsFlt-1 ELISAアッセイ]
本発明における新規ELISA測定法が通常市販されている抗sFlt-1抗体によって効果を発揮するかどうかを確認するために、以下のようなアッセイを試みた。
<Example 2>
[SFlt-1 ELISA assay using heparin beads and commercially available specific antibody]
In order to confirm whether or not the novel ELISA assay method in the present invention exerts an effect by a commercially available anti-sFlt-1 antibody, the following assay was attempted.
方法は実施例1と基本的に同じであるが、一次抗体である抗sFlt-1抗体として、実施例1で用いた抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体KM1750と、それの代わりとして、市販の抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体(PK-AB704-64426, PromoKine社)の両者を比較した。予備実験から市販抗体は抗体力価がKM1750よりも2分の1程度と考えられたため、抗体量としては2倍量を用いた。その結果を図6に示した。対照として7N Flt-1 20ng、試料としてe15a発現293細胞株の培養上清100μlを測定した。 The method is basically the same as in Example 1, except that the anti-sFlt-1 antibody that is the primary antibody is the anti-human sFlt-1 mouse monoclonal antibody KM1750 used in Example 1, and a commercially available alternative. Both anti-human sFlt-1 mouse monoclonal antibodies (PK-AB704-64426, PromoKine) were compared. It was considered from the preliminary experiment that the antibody titer of the commercially available antibody was about one-half that of KM1750, so the amount of the antibody was doubled. The results are shown in FIG. As a control, 20 ng of 7N Flt-1 and 100 μl of culture supernatant of an e15a-expressing 293 cell line as a sample were measured.
図6において結果を写真で示す。[A]の1から8までは実施例1と同じ抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体KM1750を、[B]の9から16までは市販の抗ヒトsFlt-1マウス単クローン抗体を使用して測定した。対照の7N Flt-1は、No.1、2、3、9、10、11では0ngの量を用い、No.4、5、6、12、13、14では20ngの量を用いた。No.7、8、15、16では、e15a発現293細胞株の培養上清100μl量を測定した。青色の程度には差があるが、2種類の抗sFlt-1抗体を利用しても7N Flt-1 20ngで弱めの青色反応が認められた(No.4、5、6、12、13、14)。一方、e15a発現293細胞株の培養上清で強い青色反応が認められた(No.7、8、15、16)。
In FIG. 6, the results are shown as photographs. [A] from 1 to 8 using the same anti-human sFlt-1 mouse monoclonal antibody KM1750 as in Example 1, and [B] from 9 to 16 using a commercially available anti-human sFlt-1 mouse monoclonal antibody. It was measured. As the
図7に測定値を示す。図7中の[測定値]にプレートリーダーで測定した数値を示した。[平均値]は、1〜3、4〜6、7と8、9〜11、12〜14、および15と16の平均値を示した。さらに、上半分の[平均値-228] 0、170、435は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.1〜3の平均値228を、[平均値] 228、398および663から差し引いた値である。下半分の[平均値-210] 0、78、364は、sFlt-1を添加していないバックグラウンドのNo.9〜11の平均値210を、[平均値]210、288および574から差し引いた値である。e15a発現293細胞株の培養上清100μl中のsFlt-1の量は、2種類の抗体の間で[435/170 x 20]=51ng、[364/78 x 20]=93ngの値となっている。平均すると72ng/0.1ml (720ng/ml)である。以上から、市販の一次抗体(抗sFlt-1抗体)も十分に利用可能であることが明らかとなった。
FIG. 7 shows the measured values. Numerical values measured with a plate reader are shown in [Measured values] in FIG. [Average value] showed average values of 1 to 3, 4 to 6, 7 and 8, 9 to 11, 12 to 14, and 15 and 16. In addition, [average value -228] 0, 170, 435 in the upper half is the
<実施例3>
(1)反応方法
測定感度を上げるために、実施例1、2で用いたアルカリフォスファターゼ標識二次抗体の代わりに、HRP(ホースラディッシュペルオキシダーゼ)標識二次抗体(ab6789, Abcam社)を用いて測定を行った。sFlt-1量としては、反応チューブ当たり、0、0.1、0.3、1ngを用い、各々について3回の反応を行った。反応液の容量は実施例1、2と同じであるが、一次抗体KM1750 150ng/チューブ、HRP標識二次抗体は約200ng/チューブを用いた。実施例1、2と同様の反応と洗浄の後、HRP測定液(A+B液、R&D Systems社)200μlを加え、撹拌の後に96穴プレートに移し、約20分間反応の後、595nmで測定した。
<Example 3>
(1) Reaction method In order to increase measurement sensitivity, measurement was performed using an HRP (horseradish peroxidase) labeled secondary antibody (ab6789, Abcam) instead of the alkaline phosphatase labeled secondary antibody used in Examples 1 and 2. Went. As the amount of sFlt-1, 0, 0.1, 0.3, and 1 ng were used per reaction tube, and three reactions were performed for each. The volume of the reaction solution was the same as in Examples 1 and 2, but 150 ng / tube of the primary antibody KM1750 and about 200 ng / tube of the HRP-labeled secondary antibody were used. After the same reaction and washing as in Examples 1 and 2, 200 μl of HRP measurement solution (A + B solution, R & D Systems) was added, and after stirring, transferred to a 96-well plate. After reaction for about 20 minutes, measured at 595 nm did.
(2)結果
図8に、結果を写真で示す。同一のsFlt-1量を含む試料を3回(1〜3、0ng;4〜6、0.1ng; 7〜9、0.3ng; 10〜12、1 ng)測定した。7N Flt-1無添加の反応液(No.1、2、3)は弱い青色であるが、7N Flt-1量の増加に従って、より強い青色となっている。
(2) Results FIG. 8 shows the results with photographs. Samples containing the same amount of sFlt-1 were measured 3 times (1-3, 0 ng; 4-6, 0.1 ng; 7-9, 0.3 ng; 10-12, 1 ng). The reaction liquid without addition of 7N Flt-1 (Nos. 1, 2, and 3) is weak blue, but becomes stronger blue as the amount of 7N Flt-1 increases.
(3)測定値
図9に各測定における測定値を示し、図10にグラフを示す。7N Flt-1が各々0、0.1、0.3および1ngの測定値の平均は、それぞれ303、386、552および807であり、0ngの平均値を差し引いた値は0.1ngで83であり、0.3ngで249であり、1ngで504となり、ある程度、定量的に増加した。このHRP標識二次抗体を用いることにより、実施例1および2で用いたアルカリフォスファターゼ標識二次抗体法(7N Flt-1 10-50ngを測定)に比較して、約100倍に感度を上げることが出来た。
(3) Measurement Value FIG. 9 shows measurement values in each measurement, and FIG. 10 shows a graph. The average of the measured values for 7N Flt-1 of 0, 0.1, 0.3 and 1 ng is 303, 386, 552 and 807, respectively, and the value obtained by subtracting the average of 0 ng is 83 for 0.1 ng and 0.3 ng for It was 249, and it became 504 at 1 ng, and increased to some extent quantitatively. By using this HRP-labeled secondary antibody, the sensitivity is increased about 100 times compared to the alkaline phosphatase-labeled secondary antibody method (7N Flt-1 10-50ng measured) used in Examples 1 and 2. Was made.
<実施例4>
[臨床検体の測定]
(1)方法
本測定法が実際に臨床の患者血清中のsFlt-1を測定できるか、検討した。共同研究契約・倫理委員会承認、同意書作成のもとで某大学病院産婦人科より供与された、正常分娩例5症例、妊娠高血圧症候群症例13例の血清を測定した。1測定には、血清20μl, 50μl,あるいは100μlを用いた。また、反応液1ml中のヒト血清とウシ血清の合計量を100μlに合わせた。すなわち、ヒト血清20μlの場合はウシ血清を80μl, ヒト血清50μlの場合はウシ血清を50μl, ヒト血清100μlの場合はウシ血清を0μlとした。反応時間は4℃,3時間(測定-1)、あるいは、室温(約25℃), 30分(測定-2)、として測定した。
<Example 4>
[Measurement of clinical samples]
(1) Method It was examined whether this measurement method could actually measure sFlt-1 in clinical patient serum. Serum was measured from 5 cases of normal delivery and 13 cases of pregnancy-induced hypertension syndrome, which were provided by the Department of Obstetrics and Gynecology at Kashiwa University Hospital under the approval of the joint research agreement and ethics committee. For one measurement, 20 μl, 50 μl, or 100 μl of serum was used. The total amount of human serum and bovine serum in 1 ml of the reaction solution was adjusted to 100 μl. Specifically, bovine serum was 80 μl for
(2)結果
図11に、妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-1(反応温度4℃, 反応時間3時間)の例の結果を写真で示す。左のレーンでは、標準のsFlt-1(0ng, 0.3ng, 1ng, 3ng)を測定した。右のレーンでは、妊娠高血圧症候群症例aの分娩前、および、分娩5日後、また、妊娠高血圧症候群症例bの分娩前、および、分娩5日後のsFlt-1を測定した。血清は20μlを用いた。両症例ともに分娩前には血清sFlt-1値が100ng/ml程度の高い値を示したのに対し、分娩5日後でsFlt-1の血清中濃度は速やかに低下することが示された。
(2) Results FIG. 11 is a photograph showing the results of an example of measurement-1 (
図12に、妊娠高血圧症候群患者の血清中 sFlt-1の測定-2(反応温度室温(約25℃),反応時間、約30分)の例の結果を写真で示す。左のレーンでは、標準のsFlt-1(0ng, 0.3ng, 1ng, 3ng)を測定した。右のレーンでは、妊娠高血圧症候群症例c(分娩2日前と分娩直後)および d(分娩直後と分娩前)の血清を測定した。反応温度4℃、反応時間3時間の例(図11)と比較すると標準のsFlt-1の青色反応は若干低いが、測定法は標準と試料の反応の相対的な比較であり、測定に全く支障はなかった。 FIG. 12 is a photograph showing the results of an example of measurement of serum sFlt-1 in a gestational hypertension syndrome patient-2 (reaction temperature room temperature (about 25 ° C.), reaction time, about 30 minutes). In the left lane, standard sFlt-1 (0 ng, 0.3 ng, 1 ng, 3 ng) was measured. In the right lane, sera of gestational hypertension syndrome cases c (2 days before and immediately after delivery) and d (immediately after and before delivery) were measured. The blue reaction of standard sFlt-1 is slightly lower than that of the example with the reaction temperature of 4 ° C and the reaction time of 3 hours (Fig. 11), but the measurement method is a relative comparison of the reaction between the standard and the sample. There was no hindrance.
正常分娩例5症例、妊娠高血圧症候群症例13例の血清の測定の結果、sFlt-1 濃度(ng/ml血清)は、正常分娩例では平均値12程度 (+/- 約7)、妊娠高血圧症候群症例では平均値56程度 (+/- 約33)となり、本疾患では正常分娩例に比べて約4.7倍の高い値を示した。さらに、妊娠37週6日以前に分娩となった前期発症例(いわゆる重症例の9例)では平均値が約70となり、正常分娩例の約5.8倍であった。一方、妊娠38週0日以後に出産となった後期発症例(4例)ではsFlt-1平均値は約24で、正常分娩例の約2倍程度に留まった。本測定から得られた結果、すなわち、妊娠高血圧症候群患者の血清中sFlt-1の平均が正常分娩症例の2倍〜5倍程度となることは、これまでの報告(J. Clin. Invest. 111, 649-658, 2003.; J. Clin. Endocrinol. Metab. 88, 2348-2351, 2003.; およびN. Engl. J. Med. 350, 672-683, 2004.)に添うものであり、この新規sFlt-1測定法が臨床検査に十分に利用できることを示している。
As a result of the measurement of serum in 5 cases of normal delivery and 13 cases of gestational hypertension syndrome, sFlt-1 concentration (ng / ml serum) averaged around 12 (+/- about 7) in cases of normal delivery, gestational hypertension syndrome The average value in cases was around 56 (+/- about 33), and the value of this disease was about 4.7 times higher than that in normal delivery cases. Furthermore, in the first-onset cases (9 cases of so-called severe cases) that delivered before 37 weeks and 6 days of gestation, the average value was about 70, which was about 5.8 times that of normal delivery cases. On the other hand, in the late onset cases (4 cases) that gave birth after 38
本発明のsFlt-1測定法は、安価で手技的にも容易で、時間も短縮可能な、臨床的に使い易いsFlt-1スクリーニング法を提供することができる。 The sFlt-1 measurement method of the present invention can provide a clinically easy-to-use sFlt-1 screening method that is inexpensive, easy to perform by technique, and can be shortened in time.
Claims (13)
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PCT/JP2018/028541 WO2019026870A1 (en) | 2017-08-01 | 2018-07-31 | Novel method for measuring sflt-1 (soluble vascular endothelial growth factor receptor-1) |
Applications Claiming Priority (2)
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2018
- 2018-03-09 JP JP2018042917A patent/JP2019028053A/en active Pending
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