JP2019007961A - 低酸素領域可視化試薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】発光性能に優れた低酸素領域可視化試薬を提供する。【解決手段】下記式（Ｉ）で表される錯体を含む低酸素領域可視化試薬。ここで、環Ｒ１は単環又は多環式の含窒素芳香族環を示し、環Ｒ２は単環又は多環式の含硫黄芳香族環を示し、環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方又は両方が重水素を含み、Ｌ１はβ−ジケトネート構造を有する二座配位子を示す。［化１］【選択図】なし
Description
本発明は、イリジウム（ＩＩＩ）錯体を含む低酸素領域可視化試薬に関する。
生体組織や細胞内の酸素濃度を非侵襲的にリアルタイムで検出する方法の開発は、細胞生物学や医療の分野において重要な課題となっている。
このような酸素濃度を定量するための方法として、ｂｔｐ（２−（２’−ベンゾチエニル）−ピリジナート−Ｎ，Ｃ３’）等のシクロメタル化配位子を有するイリジウム（ＩＩＩ）錯体を用いる方法が提案されている（例えば特許文献１〜５）。このイリジウム（ＩＩＩ）錯体は、酸素濃度が低いときほど強いりん光を発生する性質を有する。
このような酸素濃度を定量するための方法として、ｂｔｐ（２−（２’−ベンゾチエニル）−ピリジナート−Ｎ，Ｃ３’）等のシクロメタル化配位子を有するイリジウム（ＩＩＩ）錯体を用いる方法が提案されている（例えば特許文献１〜５）。このイリジウム（ＩＩＩ）錯体は、酸素濃度が低いときほど強いりん光を発生する性質を有する。
イリジウム（ＩＩＩ）錯体の配位子を変化させると、発光色や発光寿命、量子収率が変化する。例えばＩｒ（ｐｐｙ）２（ａｃａｃ）とＩｒ（ｆｐｐｙ）２（ｐｉｃ）とＩｒ（ｂоｎ）２（ａｃａｃ）とでは発光色が異なる。また、Ｉｒ（ｂｔｐ）２（ａｃａｃ）とＩｒ（α−ｂｓｎ）２（ａｃａｃ）とは、それぞれ赤色付近に発光を示すが発光寿命や量子収率が異なる。
非特許文献１〜３では、有機ＥＬ素子に使用されるイリジウム系錯体の配位子上の水素を重水素に置換することで、発光材料の分解劣化等を抑制し、有機ＥＬ素子の耐久性向上（長寿命化）を図ることが検討されている。
非特許文献４，５には、イリジウム系錯体の配位子として、フェナントロリン骨格を有する構造が記載されている。
非特許文献１〜３では、有機ＥＬ素子に使用されるイリジウム系錯体の配位子上の水素を重水素に置換することで、発光材料の分解劣化等を抑制し、有機ＥＬ素子の耐久性向上（長寿命化）を図ることが検討されている。
非特許文献４，５には、イリジウム系錯体の配位子として、フェナントロリン骨格を有する構造が記載されている。
Ｙ．Ｋａｗａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，２０１０，４９１，１９９−２０２
Ｙ．Ｋａｗａｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｋｏｂｕｎｓｈｉ Ｒｏｎｂｕｎｓｈｕ，２０１１，６８，６６４．Ｙ．Ｋａｗａｎｉｈｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｑｕａｒｅ，２０１１，２
Ｓ．Ｌａｍａｎｓｋｙ，Ｐ．Ｄｊｕｒｏｖｉｃｈ，Ｄ．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｆ．Ａｂｄｅｌ−Ｒａｚｚａｑ，Ｈ．Ｅ．Ｌｅｅ，Ｃ．Ａｄａｃｈｉ，Ｐ．Ｅ．Ｂｕｒｒｏｗｓ，Ｓ．Ｒ．Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ｍ．Ｅ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２３，４３０４−４３１２（２００１）
Ｔ．Ｙｏｓｈｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ａ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．，２０１５，２９９，１７２―１８２
Ｎ．Ｈａｓｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ａ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ．，２０１６，３２４，１３４―１４４
特許文献１〜５に記載の錯体は、りん光強度、りん光寿命等の発光性能が必ずしも充分ではなく、生体組織や細胞内の酸素濃度を高感度に検出することが難しい。
なお、非特許文献１〜３では、イリジウム系発光錯体を酸素濃度の測定や酸素濃度が低い領域を可視化するための試薬として用いることについては検討されていない。
なお、非特許文献１〜３では、イリジウム系発光錯体を酸素濃度の測定や酸素濃度が低い領域を可視化するための試薬として用いることについては検討されていない。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、発光性能に優れた低酸素領域可視化試薬を提供することを目的とする。
既存の低酸素領域可視化試薬の発光強度又は発光寿命を向上させるために、シクロメタル化配位子の構造を変化させることが考えられる。しかし、シクロメタル化配位子の構造を変化させるための分子設計は手間がかかる。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、イリジウム（ＩＩＩ）錯体のシクロメタル化配位子の水素原子を、天然存在比よりも高濃度の重水素に置き換えるだけで、骨格は変えずに発光性能を向上できることを見出し、本発明を完成させた。
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、イリジウム（ＩＩＩ）錯体のシクロメタル化配位子の水素原子を、天然存在比よりも高濃度の重水素に置き換えるだけで、骨格は変えずに発光性能を向上できることを見出し、本発明を完成させた。
本発明は以下の態様を有する。
〔１〕下記式（Ｉ）で表される錯体を含む低酸素領域可視化試薬。
ここで、環Ｒ１は単環又は多環式の含窒素芳香族環を示し、環Ｒ２は単環又は多環式の含硫黄芳香族環を示し、環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方又は両方が重水素を含み、Ｌ１はβ−ジケトネート構造を有する二座配位子を示す。
〔２〕前記式（Ｉ）中の環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合が天然存在比よりも高値である、〔１〕の低酸素領域可視化試薬。
〔３〕前記式（Ｉ）中の環Ｒ１の重水素化率が５０原子％以上である、〔１〕又は〔２〕の低酸素領域可視化試薬。
〔４〕溶媒をさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかの低酸素領域可視化試薬。
〔５〕下記式（ＩＩ）で表される錯体を含む低酸素領域可視化試薬。
式（ＩＩ）中、環Ｒ１は単環又は多環式の含窒素芳香族環を示し、環Ｒ２は単環又は多環式の含硫黄芳香族環を示し、環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方又は両方が重水素を含み、Ｌ２はフェナントロリン骨格を有する二座配位子を示す。
〔６〕前記式（ＩＩ）中の環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合が天然存在比よりも高値である、〔５〕の低酸素領域可視化試薬。
〔７〕前記式（ＩＩ）中の環Ｒ１の重水素化率が５０％以上である、〔５〕又は〔６〕の低酸素領域可視化試薬。
〔８〕溶媒をさらに含む、〔５〕〜〔７〕のいずれかの低酸素領域可視化試薬。
〔１〕下記式（Ｉ）で表される錯体を含む低酸素領域可視化試薬。
〔２〕前記式（Ｉ）中の環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合が天然存在比よりも高値である、〔１〕の低酸素領域可視化試薬。
〔３〕前記式（Ｉ）中の環Ｒ１の重水素化率が５０原子％以上である、〔１〕又は〔２〕の低酸素領域可視化試薬。
〔４〕溶媒をさらに含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかの低酸素領域可視化試薬。
〔５〕下記式（ＩＩ）で表される錯体を含む低酸素領域可視化試薬。
〔６〕前記式（ＩＩ）中の環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合が天然存在比よりも高値である、〔５〕の低酸素領域可視化試薬。
〔７〕前記式（ＩＩ）中の環Ｒ１の重水素化率が５０％以上である、〔５〕又は〔６〕の低酸素領域可視化試薬。
〔８〕溶媒をさらに含む、〔５〕〜〔７〕のいずれかの低酸素領域可視化試薬。
本発明によれば、発光性能に優れた低酸素領域可視化試薬を提供できる。
（第一の態様の低酸素領域可視化試薬）
本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬は、下記式（Ｉ）で表される錯体（以下、「錯体（Ｉ）」ともいう。）を含む。本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬に含まれる錯体（Ｉ）は１種でも２種以上でもよい。
本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬は、下記式（Ｉ）で表される錯体（以下、「錯体（Ｉ）」ともいう。）を含む。本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬に含まれる錯体（Ｉ）は１種でも２種以上でもよい。
ここで、環Ｒ１は単環又は多環式の含窒素芳香族環を示し、環Ｒ２は単環又は多環式の含硫黄芳香族環を示し、環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方又は両方が重水素を含み、Ｌ１はβ−ジケトネート構造を有する二座配位子を示す。
重水素を含むとは、芳香環（Ｒ１の含窒素芳香族環又はＲ２の含硫黄芳香族環）の環骨格を構成する炭素原子に重水素が結合していることを示す。
重水素を含むとは、芳香環（Ｒ１の含窒素芳香族環又はＲ２の含硫黄芳香族環）の環骨格を構成する炭素原子に重水素が結合していることを示す。
環Ｒ１としては、例えば、下記式（１−１）、（１−２）、（１−３）又は（１−４）で表される構造の含窒素芳香族環が挙げられる。
ここで、Ｘ１は水素又は重水素を示す。
各構造中の複数のＸ１は同一でもよく異なってもよい。環骨格を構成する炭素原子のうち、Ｎの隣の炭素原子から伸びる結合手はＲ２に結合している。ＮはＩｒに配位している。
各構造中の複数のＸ１は同一でもよく異なってもよい。環骨格を構成する炭素原子のうち、Ｎの隣の炭素原子から伸びる結合手はＲ２に結合している。ＮはＩｒに配位している。
環Ｒ１としては、環Ｒ２との組み合わせにおいて発光が近赤外に近づき、生体内での透過性がよい点で、多環式の含窒素芳香族環が好ましく、前記式（１−２）、（１−３）又は（１−４）で表される構造の含窒素芳香族環がより好ましい。
環Ｒ２としては、例えば、以下の式（２−１）、（２−２）又は（２−３）で表される構造の含硫黄芳香族環が挙げられる。
ここで、Ｘ２は水素又は重水素を示す。
各構造中の複数のＸ２は同一でもよく異なってもよい。環骨格を構成する炭素原子のうち、Ｓの隣の炭素原子から伸びる結合手はＲ２に結合し、この炭素原子の隣の炭素原子はＩｒに配位している。
各構造中の複数のＸ２は同一でもよく異なってもよい。環骨格を構成する炭素原子のうち、Ｓの隣の炭素原子から伸びる結合手はＲ２に結合し、この炭素原子の隣の炭素原子はＩｒに配位している。
環Ｒ１及び環Ｒ２で構成される配位子は、シクロメタル化配位子であり、錯体（Ｉ）の発光性能に寄与する。
環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方又は両方が重水素を含むことで、環Ｒ１及び環Ｒ２が重水素を含まない場合に比べて、錯体のりん光強度、りん光寿命等の発光性能が優れる。
重水素を含むのは、環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方のみでもよく両方でもよい。発光性能の向上効果に優れる点から、少なくとも環Ｒ１が重水素を含むことが好ましい。
環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方又は両方が重水素を含むことで、環Ｒ１及び環Ｒ２が重水素を含まない場合に比べて、錯体のりん光強度、りん光寿命等の発光性能が優れる。
重水素を含むのは、環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方のみでもよく両方でもよい。発光性能の向上効果に優れる点から、少なくとも環Ｒ１が重水素を含むことが好ましい。
環Ｒ１の重水素化率は、天然存在比よりも高値であればよく、５０原子％以上が好ましく、７０原子％以上がより好ましく、９０原子％以上がさらに好ましく、９７原子％以上が特に好ましい。環Ｒ１の重水素化率が前記下限値以上であれば、より優れた発光性能が得られる。例えば環Ｒ２が重水素を含まない場合でも、環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素化率が９７原子％以上である場合と同等の発光性能が得られる。
環Ｒ１が重水素を含まない場合、環Ｒ２の重水素化率は、７０原子％以上が好ましく、９０原子％以上がより好ましく、９７原子％以上が特に好ましい。
環Ｒ１が重水素を含む場合、環Ｒ２が重水素を含まなくても優れた発光性能が得られるため、環Ｒ２の重水素化率は０原子％であってもよい。環Ｒ２の重水素化率が０原子％であれば、原料費、製造工程数等を削減し、低酸素領域可視化試薬の低価格化が可能である。
環Ｒ１が重水素を含む場合、環Ｒ２が重水素を含まなくても優れた発光性能が得られるため、環Ｒ２の重水素化率は０原子％であってもよい。環Ｒ２の重水素化率が０原子％であれば、原料費、製造工程数等を削減し、低酸素領域可視化試薬の低価格化が可能である。
重水素化率とは、環Ｒ１及び環Ｒ２のうち、重水素を含む原料を用いた環、つまり重水素を含む環（環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方でもよく両方でもよい。）についての、重水素及び水素の合計に対する重水素の割合（原子％）を示す。例えば、環Ｒ１が前記式（１−１）、（１−２）、（１−３）又は（１−４）で表される構造であり、環Ｒ１に対応する材料として重水素を含む原料を用いた場合、重水素化率は、Ｘ１の総数のうち、重水素であるＸ１の数の割合を示す。環Ｒ１が前記式（１−１）、（１−２）、（１−３）又は（１−４）で表される構造であり、環Ｒ２が前記式（２−１）、（２−２）又は（２−３）で表される構造であり、環Ｒ１及び環Ｒ２の両方に対応する原料として重水素を含む原料を用いた場合、重水素化率は、Ｘ１とＸ２の総数のうち重水素であるものの数の割合を示す。重水素化率は、１Ｈ−核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により測定できる。
環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合は、天然存在比よりも高値であればよく、１０原子％以上が好ましく、３０原子％以上がより好ましく、９０原子％以上が特に好ましい。環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合が前記下限値以上であれば、より優れた発光性能が得られる。
Ｌ１は、β−ジケトネート構造を有する二座配位子を示す。Ｌ１は発光性能には影響しないが、Ｌ１を有することで、生体親和性が高まり、錯体（Ｉ）が生体組織や細胞内に取り込まれやすくなる。
Ｌ１としては、例えば下記式（Ｌ−１）で表される構造の二座配位子が挙げられる。この場合、錯体（Ｉ）は、下記式（Ｉ−１）で表される。
Ｌ１としては、例えば下記式（Ｌ−１）で表される構造の二座配位子が挙げられる。この場合、錯体（Ｉ）は、下記式（Ｉ−１）で表される。
ここで、Ｒ３は、置換又は無置換のアルキル基を示す。
構造中の２つの酸素原子はそれぞれＩｒに配位している。
構造中の２つの酸素原子はそれぞれＩｒに配位している。
Ｒ３のアルキル基としては、例えば炭素数１〜５のアルキル基が挙げられる。
アルキル基が置換基を有する場合、置換基としては、例えばハロゲン、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、置換又は無置換のアミノ基、置換又は無置換のアミド基、置換又は無置換のアシル基、アミノ酸残基、ペプチド残基等が挙げられる。
アルキル基が置換基を有する場合、置換基としては、例えばハロゲン、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、置換又は無置換のアミノ基、置換又は無置換のアミド基、置換又は無置換のアシル基、アミノ酸残基、ペプチド残基等が挙げられる。
式（Ｌ−１）で表される構造の例として、下記式（Ｌ−１１）、（Ｌ−１２）、（Ｌ−１３）、（Ｌ−１４）又は（Ｌ−１５）で表される構造が挙げられる。これらはそれぞれ、前記式（Ｌ−１）において、Ｒ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＮＲ４Ｒ５、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｎＣＯＲ６、又は−ＣＨ３である構造である。
ここで、ｍは１〜５の整数を示し、Ｒ４は水素、ハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基又は炭素数１〜２０の炭化水素基を示し、Ｒ５は水素又は炭素数１〜６の炭化水素基を示し、ｎは１〜５の整数を示し、Ｒ６はアミノ酸残基又はペプチド残基を示す。
前記式（Ｌ−１１）中、ｍは１〜３の整数が好ましく、２が特に好ましい。
Ｒ４のハロゲンとしては、Ｃｌ、Ｂｒ又はＦが好ましい。
アミノ基は、−ＮＨ2でもよいし、アルキルアミノ基でもよい。
炭素数１〜２０の炭化水素基は、直鎖でもよいし分岐鎖でもよいし環状でもよい。また、飽和でもよく不飽和結合を含んでいてもよい。１以上の水素原子がハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基等の置換基で置換されていてもよい。炭素数は好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５であり、さらに好ましくは１〜３である。
Ｒ５の炭素数１〜６の炭化水素基は、直鎖でもよいし分岐鎖でもよいし環状でもよい。
また、飽和でもよく不飽和結合を含んでいてもよい。１以上の水素原子がハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基等の置換基で置換されていてもよい。炭素数は好ましくは１〜３である。
前記式（Ｌ−１１）においては、Ｒ４及びＲ５がいずれもメチル基であり、ｎが２であることが好ましい。
Ｒ４のハロゲンとしては、Ｃｌ、Ｂｒ又はＦが好ましい。
アミノ基は、−ＮＨ2でもよいし、アルキルアミノ基でもよい。
炭素数１〜２０の炭化水素基は、直鎖でもよいし分岐鎖でもよいし環状でもよい。また、飽和でもよく不飽和結合を含んでいてもよい。１以上の水素原子がハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基等の置換基で置換されていてもよい。炭素数は好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５であり、さらに好ましくは１〜３である。
Ｒ５の炭素数１〜６の炭化水素基は、直鎖でもよいし分岐鎖でもよいし環状でもよい。
また、飽和でもよく不飽和結合を含んでいてもよい。１以上の水素原子がハロゲン、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基等の置換基で置換されていてもよい。炭素数は好ましくは１〜３である。
前記式（Ｌ−１１）においては、Ｒ４及びＲ５がいずれもメチル基であり、ｎが２であることが好ましい。
前記式（Ｌ−１４）中、ｎは１〜３の整数が好ましく、２が特に好ましい。
「アミノ酸残基及びペプチド残基」とは、アミノ酸またはペプチドがそのアミノ基を介してアミド結合したときの残基をいう。
Ｒ６としては、側鎖に水酸基、カルボキシ基又はアミノ基を有するアミノ酸の残基又は該アミノ酸からなるペプチドの残基であることが好ましい。 側鎖に水酸基を有するアミノ酸としては、チロシン、セリン、スレオニン等が挙げられ、チロシンがより好ましい。
側鎖にカルボキシ基を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。側鎖にアミノ基を有するアミノ酸としては、リシン、アルギニン等が挙げられる。なお、アミノ酸はＬ体でもＤ体でもよく、非天然のアミノ酸でもよい。
ペプチド残基としては、上記アミノ酸の１種又は複数種からなるペプチド残基が挙げられ、その長さは好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５である。
Ｒ６としては、アスパラギン酸残基である−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２、又はアスパラギン酸ジペプチド残基である−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２が好ましい。
「アミノ酸残基及びペプチド残基」とは、アミノ酸またはペプチドがそのアミノ基を介してアミド結合したときの残基をいう。
Ｒ６としては、側鎖に水酸基、カルボキシ基又はアミノ基を有するアミノ酸の残基又は該アミノ酸からなるペプチドの残基であることが好ましい。 側鎖に水酸基を有するアミノ酸としては、チロシン、セリン、スレオニン等が挙げられ、チロシンがより好ましい。
側鎖にカルボキシ基を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。側鎖にアミノ基を有するアミノ酸としては、リシン、アルギニン等が挙げられる。なお、アミノ酸はＬ体でもＤ体でもよく、非天然のアミノ酸でもよい。
ペプチド残基としては、上記アミノ酸の１種又は複数種からなるペプチド残基が挙げられ、その長さは好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５である。
Ｒ６としては、アスパラギン酸残基である−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２、又はアスパラギン酸ジペプチド残基である−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）２が好ましい。
式（Ｌ−１）で表される構造としては、上記の中でも、生体親和性の点で、前記式（Ｌ−１１）、（Ｌ−１２）、（Ｌ−１３）又は（Ｌ−１４）で表される構造が好ましい。これらの構造は、式（Ｌ−１５）で表される構造（アセチルアセトナート（ａｃａｃ））に官能基が導入された構造である。官能基が導入されていることで、生体親和性がより優れる。
錯体（Ｉ）としては、下記式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）又は（Ｉｄ）で表される構造の錯体が好ましい。
ここで、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素又は重水素を示し、構造中の複数のＸ１及び複数のＸ２の一部又は全部は重水素であり、Ｌ１１〜Ｌ１４はそれぞれ前記式（Ｌ−１１）、（Ｌ−１２）、（Ｌ−１３）、（Ｌ−１４）又は（Ｌ−１５）で表される構造の二座配位子を示す。
各構造の好ましい重水素化率は前記と同様である。
各構造において、複数のＸ１の一部又は全部が重水素であることが好ましく、複数のＸ１の全てが重水素であることが特に好ましい。
Ｌ１１〜Ｌ１４は、前記式（Ｌ−１１）、（Ｌ−１２）、（Ｌ−１３）又は（Ｌ−１４）で表される構造の二座配位子であることが好ましい。
各構造において、複数のＸ１の一部又は全部が重水素であることが好ましく、複数のＸ１の全てが重水素であることが特に好ましい。
Ｌ１１〜Ｌ１４は、前記式（Ｌ−１１）、（Ｌ−１２）、（Ｌ−１３）又は（Ｌ−１４）で表される構造の二座配位子であることが好ましい。
錯体（Ｉ）は、環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれか一方又は両方に対応する原料として重水素を含む原料（例えば重水素化ピリジン、重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン等）を用いる以外は、公知の製造方法に従って合成できる。例えば後述の実施例に記載の方法に従って合成できる。重水素を含む原料は、市販品を用いてもよく、公知の方法により重水素化したものを用いてもよい。
本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬は、溶媒をさらに含んでもよい。溶媒を含むと、低酸素領域可視化試薬をそのまま細胞や組織に添加して酸素濃度測定を実施できる。
溶媒としては、錯体（Ｉ）を溶解可能であればよく、例えばテトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒、水、これらの混合溶媒等のなかから適宜選択できる。細胞へ添加するときの溶媒としては、ジメチルスルホキシドと水の混合溶媒が好ましい。
溶媒としては、錯体（Ｉ）を溶解可能であればよく、例えばテトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒、水、これらの混合溶媒等のなかから適宜選択できる。細胞へ添加するときの溶媒としては、ジメチルスルホキシドと水の混合溶媒が好ましい。
本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬が、錯体（Ｉ）と溶媒とを含む液状組成物である場合、低酸素領域可視化試薬中の錯体（Ｉ）の濃度は、錯体（Ｉ）の種類にもよるが、５〜５００μＭが好ましく、２５〜７５μＭが特に好ましい。
本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬は、必要に応じて、錯体（Ｉ）及び溶媒以外の他の成分をさらに含んでもよい。
本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬は、低酸素領域の可視化に用いられる。特に生体組織や細胞内の低酸素領域の可視化に有用である。
錯体（Ｉ）は、生体組織や細胞が存在する環境下においたときに、生体組織や細胞の生体膜に集積する。また、錯体（Ｉ）の周囲の酸素濃度が低いときに、より強いりん光を発する。そのため、りん光の強度に基づいて低酸素領域を可視化でき、酸素濃度を測定することも可能である。すなわち、りん光が強い領域が、相対的に酸素濃度の低い低酸素領域であるというような判定ができる。また、あらかじめ酸素濃度とりん光強度との関係を求めておくことにより、酸素濃度を定量的に測定することもできる。
測定対象としての生体組織や細胞の種類は特に制限されず、例えば株化培養細胞、初代培養細胞等が挙げられる。
また、本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬をマウス、ラット等の実験動物やヒトに投与し、酸素濃度が低下している部位の検出等を行うこともできる。癌組織では酸素供給が不足しているので、酸素濃度が低下している部位の検出を行うことにより、癌組織を特異的に染色し、癌の診断薬として使用することもできる。
りん光は画像化できるため、本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬は、細胞内酸素濃度の画像化試薬、癌等の低酸素細胞の画像化試薬等としても使用できる。
錯体（Ｉ）は、生体組織や細胞が存在する環境下においたときに、生体組織や細胞の生体膜に集積する。また、錯体（Ｉ）の周囲の酸素濃度が低いときに、より強いりん光を発する。そのため、りん光の強度に基づいて低酸素領域を可視化でき、酸素濃度を測定することも可能である。すなわち、りん光が強い領域が、相対的に酸素濃度の低い低酸素領域であるというような判定ができる。また、あらかじめ酸素濃度とりん光強度との関係を求めておくことにより、酸素濃度を定量的に測定することもできる。
測定対象としての生体組織や細胞の種類は特に制限されず、例えば株化培養細胞、初代培養細胞等が挙げられる。
また、本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬をマウス、ラット等の実験動物やヒトに投与し、酸素濃度が低下している部位の検出等を行うこともできる。癌組織では酸素供給が不足しているので、酸素濃度が低下している部位の検出を行うことにより、癌組織を特異的に染色し、癌の診断薬として使用することもできる。
りん光は画像化できるため、本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬は、細胞内酸素濃度の画像化試薬、癌等の低酸素細胞の画像化試薬等としても使用できる。
本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬を用いた低酸素領域の検出は、例えば以下の手順で実施できる。
低酸素領域可視化試薬を検体（生体組織又は細胞）に添加してインキュベートし、その後、検体に取り込まれた錯体（Ｉ）を励起してりん光を観察する。
錯体（Ｉ）の励起は、検体に可視光を照射することにより行うことができる。
りん光の観察は、例えば蛍光顕微鏡、蛍光測定装置、蛍光イメージング装置等の公知の装置を用いて行うことができる。
低酸素領域可視化試薬を検体（生体組織又は細胞）に添加してインキュベートし、その後、検体に取り込まれた錯体（Ｉ）を励起してりん光を観察する。
錯体（Ｉ）の励起は、検体に可視光を照射することにより行うことができる。
りん光の観察は、例えば蛍光顕微鏡、蛍光測定装置、蛍光イメージング装置等の公知の装置を用いて行うことができる。
本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬にあっては、錯体（Ｉ）を含むため、発光性能に優れる。例えば、環Ｒ１及び環Ｒ２のいずれも重水素を含まない錯体に比べて、りん光量子収率が高く、りん光寿命が長く、無放射速度定数に対する放射速度定数の比率が高い。そのため、本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬を用いることで、生体組織や細胞内の低酸素領域を非侵襲的にリアルタイムで可視化できる。高感度での定量も可能である。
従来、発光性能を向上させる手法としては、配位子の構造自体を変化させる手法が一般的であるが、分子設計に手間がかかる。本発明にあっては、既存の配位子の骨格を変えることなく、水素原子を天然存在比よりも高濃度の重水素に置き換えるだけで、発光性能を向上させることができる。
従来、発光性能を向上させる手法としては、配位子の構造自体を変化させる手法が一般的であるが、分子設計に手間がかかる。本発明にあっては、既存の配位子の骨格を変えることなく、水素原子を天然存在比よりも高濃度の重水素に置き換えるだけで、発光性能を向上させることができる。
（第二の態様の低酸素領域可視化試薬）
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬は、下記式（ＩＩ）で表される錯体（以下、「錯体（ＩＩ）」ともいう。）を含む。本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬に含まれる錯体（ＩＩ）は１種でも２種以上でもよい。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬は、下記式（ＩＩ）で表される錯体（以下、「錯体（ＩＩ）」ともいう。）を含む。本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬に含まれる錯体（ＩＩ）は１種でも２種以上でもよい。
本発明の第二の態様における錯体（ＩＩ）は、Ｌ１がＬ２である点以外は、第一の態様における錯体（Ｉ）と同様である。すなわち、錯体（ＩＩ）における環Ｒ１及び環Ｒ２は、錯体（Ｉ）における環Ｒ１及び環Ｒ２と同様であり、錯体（ＩＩ）の発光性能に寄与する。錯体（ＩＩ）における環Ｒ１及び環Ｒ２の好ましい態様は、錯体（Ｉ）における環Ｒ１及び環Ｒ２と同様である。
Ｌ２は、フェナントロリン骨格を有する二座配位子を示す。Ｌ２は発光性能には影響しないが、Ｌ２を有することで、Ｌ１を有する場合よりさらに生体親和性がさらに高まり、錯体（ＩＩ）が生体組織や細胞内にさらに取り込まれやすくなる。
Ｌ２としては、例えば下記式（Ｌ−２）で表される構造の二座配位子が挙げられる。この場合、錯体（ＩＩ）は、下記式（ＩＩ−１）で表される。
Ｌ２としては、例えば下記式（Ｌ−２）で表される構造の二座配位子が挙げられる。この場合、錯体（ＩＩ）は、下記式（ＩＩ−１）で表される。
ここで、Ｒ７は、窒素原子、酸素原子、硫黄原子等のヘテロ原子を有する置換基を示し、Ｘ３は水素を示す。
フェナントロリン骨格を構成する２つの窒素原子（Ｎ）は、それぞれＩｒに配位している。
フェナントロリン骨格を構成する２つの窒素原子（Ｎ）は、それぞれＩｒに配位している。
Ｒ７の具体例としては、アミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、シアノ基、アセチル基、カルボキシル基、ピペリジル基、ピペラジル基が挙げられる。
錯体（ＩＩ）としては、下記式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）又は（ＩＩｄ）で表される構造の錯体が好ましい。
ここで、Ｘ１及びＸ２はそれぞれ独立に水素又は重水素を示し、構造中の複数のＸ１及び複数のＸ２の一部又は全部は重水素であり、Ｌ２は前記式（Ｌ−２）で表される構造の二座配位子を示す。
錯体（ＩＩ）における環Ｒ１及び環Ｒ２のそれぞれの重水素化率は、錯体（Ｉ）における環Ｒ１及び環Ｒ２のそれぞれの重水素化率と同様であり、その好ましい態様も同様である。
錯体（ＩＩ）における環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合は、錯体（Ｉ）における環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合と同様であり、その好ましい態様も同様である。
錯体（ＩＩ）における環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合は、錯体（Ｉ）における環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合と同様であり、その好ましい態様も同様である。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬は、溶媒をさらに含んでもよい。溶媒を含むと、低酸素領域可視化試薬をそのまま細胞や組織に添加して酸素濃度測定を実施できる。溶媒は、第一の態様で挙げたものと同様であり、好ましい態様も同様である。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬が、錯体（ＩＩ）と溶媒とを含む液状組成物である場合、低酸素領域可視化試薬中の錯体（ＩＩ）の濃度は、第一の態様における錯体（Ｉ）の濃度と同様であり、好ましい態様も同様である。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬は、必要に応じて、錯体（ＩＩ）及び溶媒以外の他の成分をさらに含んでもよい。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬は、低酸素領域の可視化に用いられる。特に生体組織や細胞内の低酸素領域の可視化に有用である。
錯体（ＩＩ）は、生体組織や細胞が存在する環境下においたときに、生体組織や細胞の生体膜に集積する。また、錯体（ＩＩ）の周囲の酸素濃度が低いときに、より強いりん光を発する。そのため、りん光の強度に基づいて低酸素領域を可視化でき、酸素濃度を測定することも可能である。すなわち、りん光が強い領域が、相対的に酸素濃度の低い低酸素領域であるというような判定ができる。また、あらかじめ酸素濃度とりん光強度との関係を求めておくことにより、酸素濃度を定量的に測定することもできる。
測定対象としての生体組織や細胞の種類は特に制限されず、例えば株化培養細胞、初代培養細胞等が挙げられる。
また、本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬をマウス、ラット等の実験動物やヒトに投与し、酸素濃度が低下している部位の検出等を行うこともできる。本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬を用いる場合でも、酸素濃度が低下している部位の検出を行うことにより、癌組織を特異的に染色し、癌の診断薬として使用できる。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬も、第一の態様と同様に、細胞内酸素濃度の画像化試薬、癌等の低酸素細胞の画像化試薬等としても使用できる。
錯体（ＩＩ）は、生体組織や細胞が存在する環境下においたときに、生体組織や細胞の生体膜に集積する。また、錯体（ＩＩ）の周囲の酸素濃度が低いときに、より強いりん光を発する。そのため、りん光の強度に基づいて低酸素領域を可視化でき、酸素濃度を測定することも可能である。すなわち、りん光が強い領域が、相対的に酸素濃度の低い低酸素領域であるというような判定ができる。また、あらかじめ酸素濃度とりん光強度との関係を求めておくことにより、酸素濃度を定量的に測定することもできる。
測定対象としての生体組織や細胞の種類は特に制限されず、例えば株化培養細胞、初代培養細胞等が挙げられる。
また、本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬をマウス、ラット等の実験動物やヒトに投与し、酸素濃度が低下している部位の検出等を行うこともできる。本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬を用いる場合でも、酸素濃度が低下している部位の検出を行うことにより、癌組織を特異的に染色し、癌の診断薬として使用できる。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬も、第一の態様と同様に、細胞内酸素濃度の画像化試薬、癌等の低酸素細胞の画像化試薬等としても使用できる。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬を用いた低酸素領域の検出の手順は、第一の態様で説明した低酸素領域の検出の手順と同様である。錯体（ＩＩ）の励起は、検体に可視光を照射することにより行うことができ、りん光の観察は、第一の態様で挙げた装置と同様の装置を用いて行うことができる。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬にあっては、上述の本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬と同様の効果を奏するほか、さらに下記の効果を奏する。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬は錯体（ＩＩ）を含むため、例えば、Ｌ２を有さない錯体を含む低酸素領域可視化試薬に比べて、細胞内に取り込まれる際の効率がさらに向上し、かつ、生体親和性がさらに向上する。
本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬は錯体（ＩＩ）を含むため、例えば、Ｌ２を有さない錯体を含む低酸素領域可視化試薬に比べて、細胞内に取り込まれる際の効率がさらに向上し、かつ、生体親和性がさらに向上する。
＜実施例＞
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
本実施例で用いた測定方法を以下に示す。
以下、実施例によって本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
本実施例で用いた測定方法を以下に示す。
＜重水素化率＞
重水素化率は、１Ｈ−ＮＭＲにより測定した。
重水素化率は、１Ｈ−ＮＭＲにより測定した。
＜りん光量子収率＞
りん光量子収率は、積分球型絶対発光量子収率測定装置を用いて測定した。
りん光量子収率は、積分球型絶対発光量子収率測定装置を用いて測定した。
＜りん光寿命＞
りん光寿命は、時間相関単一光子計数法を用いたりん光寿命計を用いて測定した。
りん光寿命は、時間相関単一光子計数法を用いたりん光寿命計を用いて測定した。
＜放射速度定数、無放射速度定数＞
放射速度定数（ｋｐ）、無放射速度定数(ｋｎｒ)は、りん光量子収率(Φｐ)、りん光寿命(τｐ)を用いて公式であるｋｐ＝Φｐ／τｐ、ｋｎｒ＝１−Φｐ／τｐにより算出した。
放射速度定数（ｋｐ）、無放射速度定数(ｋｎｒ)は、りん光量子収率(Φｐ)、りん光寿命(τｐ)を用いて公式であるｋｐ＝Φｐ／τｐ、ｋｎｒ＝１−Φｐ／τｐにより算出した。
＜実験１＞
実験１では、各種の錯体を合成し、溶液中での発光性能を評価した。
以下の合成例において、Ｉｒ（ｂｔｐ）２（ａｃａｃ）、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ａｃａｃ）、Ｉｒ（ｂｔｐｈ）２（ａｃａｃ）それぞれのシクロメタル化配位子（ｂｔｐ、ｂｔｑ、ｂｔｐｈ）の水素原子の一部又は全部が重水素化されたイリジウム（ＩＩＩ）錯体を合成した。合成方法は特許第５３９２７４６号公報、特許第５３５３５０９号公報、特開２０１５−１０１５６７号公報を参照した。
なお、各略称は以下の意味である。
ｂｔｐ：［２−（２’−ベンゾチエニル）−ピリジナート−Ｎ，Ｃ３’ ］。
ｂｔｑ：［２−（２’−ベンゾチエニル）−キノリナート−Ｎ，Ｃ３’］。
ｂｔｐｈ：［９−（２’−ベンゾチエニル）−フェナンスリナート−Ｎ，Ｃ３’］。
ａｃａｃ：アセチルアセトナート。
ＳＡ：サクシニルアセトネート（前記式（Ｌ−１）においてＲ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである二座配位子）。
ｐｈｅｎｐｉｐｅ：５−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ−１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ。
以下において、配位子の略号の後のｄに付された数値は、その配位子が有する重水素の数を示す。
実験１では、各種の錯体を合成し、溶液中での発光性能を評価した。
以下の合成例において、Ｉｒ（ｂｔｐ）２（ａｃａｃ）、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ａｃａｃ）、Ｉｒ（ｂｔｐｈ）２（ａｃａｃ）それぞれのシクロメタル化配位子（ｂｔｐ、ｂｔｑ、ｂｔｐｈ）の水素原子の一部又は全部が重水素化されたイリジウム（ＩＩＩ）錯体を合成した。合成方法は特許第５３９２７４６号公報、特許第５３５３５０９号公報、特開２０１５−１０１５６７号公報を参照した。
なお、各略称は以下の意味である。
ｂｔｐ：［２−（２’−ベンゾチエニル）−ピリジナート−Ｎ，Ｃ３’ ］。
ｂｔｑ：［２−（２’−ベンゾチエニル）−キノリナート−Ｎ，Ｃ３’］。
ｂｔｐｈ：［９−（２’−ベンゾチエニル）−フェナンスリナート−Ｎ，Ｃ３’］。
ａｃａｃ：アセチルアセトナート。
ＳＡ：サクシニルアセトネート（前記式（Ｌ−１）においてＲ３が−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨである二座配位子）。
ｐｈｅｎｐｉｐｅ：５−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ−１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ。
以下において、配位子の略号の後のｄに付された数値は、その配位子が有する重水素の数を示す。
「合成例１：Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ８）２（ａｃａｃ）の合成）」
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＩＳＯＴＥＣ社製）と、重水素化２−ブロモピリジン（ＩＳＯＴＥＣ社製）を、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ｐｐｈ３）４）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、ベンゼン、エタノールに溶解させ、窒素雰囲気下で１２時間加熱還流した。生成した重水素化ベンゾチエニルピリジンをクロロホルムで抽出し、減圧乾固後、シリカクロマトグラフィーで精製した。
精製した重水素化ベンゾチエニルピリジンに、イリジウム三水和物、２−エトキシエタノール、水を加え、１２時間加熱還流した後室温まで冷却し、生成した固体をろ取した。ろ物に２−メトキシエタノール、アセチルアセトン、炭酸ナトリウムを加え、３時間加熱還流をした。溶媒を減圧乾固し、シリカクロマトグラフィーで精製し、Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ８）２（ａｃａｃ）を得た。ＭＳ（質量分析）で生成物の同定をした。また、錯体形成前の配位子及び錯体化後の配位子それぞれについて、１Ｈ−ＮＭＲで重水素濃縮度を測定し、重水素化率（原子％）を求めた。結果を表１に示した。錯体形成前の配位子の重水素化率を「配位子 重水素化率」、錯体形成後の配位子の重水素化率を「錯体 重水素化率」と表記した（以下同様）。
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＩＳＯＴＥＣ社製）と、重水素化２−ブロモピリジン（ＩＳＯＴＥＣ社製）を、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ｐｐｈ３）４）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、ベンゼン、エタノールに溶解させ、窒素雰囲気下で１２時間加熱還流した。生成した重水素化ベンゾチエニルピリジンをクロロホルムで抽出し、減圧乾固後、シリカクロマトグラフィーで精製した。
精製した重水素化ベンゾチエニルピリジンに、イリジウム三水和物、２−エトキシエタノール、水を加え、１２時間加熱還流した後室温まで冷却し、生成した固体をろ取した。ろ物に２−メトキシエタノール、アセチルアセトン、炭酸ナトリウムを加え、３時間加熱還流をした。溶媒を減圧乾固し、シリカクロマトグラフィーで精製し、Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ８）２（ａｃａｃ）を得た。ＭＳ（質量分析）で生成物の同定をした。また、錯体形成前の配位子及び錯体化後の配位子それぞれについて、１Ｈ−ＮＭＲで重水素濃縮度を測定し、重水素化率（原子％）を求めた。結果を表１に示した。錯体形成前の配位子の重水素化率を「配位子 重水素化率」、錯体形成後の配位子の重水素化率を「錯体 重水素化率」と表記した（以下同様）。
「合成例２：Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ４ｐｙ）２（ａｃａｃ）の合成」
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりにベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件で（ｂｔｐ−ｄ４ｐｙ）２Ｉｒ（ａｃａｃ）を合成した。
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりにベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件で（ｂｔｐ−ｄ４ｐｙ）２Ｉｒ（ａｃａｃ）を合成した。
「合成例３：Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）の合成」
重水素化２−ブロモピリジンの代わりに２−ブロモピリジン（ＴＣＩ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｐ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）を合成した。
重水素化２−ブロモピリジンの代わりに２−ブロモピリジン（ＴＣＩ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｐ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）を合成した。
Ｉｒ（ｂｔｐ）２（ａｃａｃ）、合成例１〜３で得たイリジウム（ＩＩＩ）錯体をそれぞれテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解し、錯体濃度２０μＭの溶液とし、吸収波長、りん光波長、りん光量子収率、りん光寿命を測定、放射速度定数、無放射速度定数を算出した。結果を表１に示す。表中、各イリジウム錯体の欄にはシクロメタル化配位子の構造のみを示した（以下同様）。
表１中、Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ４ｐｙ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ１における重水素化率である。また、Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ２における重水素化率である。
「配位子 重水素化率」と「錯体 重水素化率」との対比から、錯体化後も重水素化率が維持されたことが確認できた。
表１中、Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ４ｐｙ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ１における重水素化率である。また、Ｉｒ（ｂｔｐ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ２における重水素化率である。
「配位子 重水素化率」と「錯体 重水素化率」との対比から、錯体化後も重水素化率が維持されたことが確認できた。
「合成例４：Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）の合成」
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりにベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）を、重水素化２−ブロモピリジンの代わりに重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）用いた以外は合成例１と同様の条件で重水素化ベンゾチエニルキノリンを得た。
この重水素化ベンゾチエニルキノリンにイリジウム三水和物、２−エトキシエタノール、水を加え１５時間加熱還流した。生成した固体を２−エトキシエタノール、水で洗浄し、ろ取した。ろ物に２−メトキシエタノール、サクシニルアセトン、トリエチルアミンを加え、８０℃で１５時間加熱還流をした。溶媒を減圧乾固し、シリカクロマトグラフィーで精製し、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）を得た。
ＭＳで生成物の同定をし、実施例１と同様に１Ｈ−ＮＭＲで重水素濃縮度を測定し、重水素化率（原子％）を求めた。結果を表２に示した。
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりにベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）を、重水素化２−ブロモピリジンの代わりに重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）用いた以外は合成例１と同様の条件で重水素化ベンゾチエニルキノリンを得た。
この重水素化ベンゾチエニルキノリンにイリジウム三水和物、２−エトキシエタノール、水を加え１５時間加熱還流した。生成した固体を２−エトキシエタノール、水で洗浄し、ろ取した。ろ物に２−メトキシエタノール、サクシニルアセトン、トリエチルアミンを加え、８０℃で１５時間加熱還流をした。溶媒を減圧乾固し、シリカクロマトグラフィーで精製し、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）を得た。
ＭＳで生成物の同定をし、実施例１と同様に１Ｈ−ＮＭＲで重水素濃縮度を測定し、重水素化率（原子％）を求めた。結果を表２に示した。
「合成例５：Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）の合成」
ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりに重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸を用いた以外は合成例４と同様の条件でＩｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）を合成した。
ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりに重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸を用いた以外は合成例４と同様の条件でＩｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）を合成した。
「合成例６：Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ＳＡ）の合成」
ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりに重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸を、重水素化２−ブロモキノリンの代わりに２−ブロモキノリン（ＴＣＩ社製）を用いた以外は合成例４と同様の条件でＩｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ＳＡ）を合成した。
ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりに重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸を、重水素化２−ブロモキノリンの代わりに２−ブロモキノリン（ＴＣＩ社製）を用いた以外は合成例４と同様の条件でＩｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ＳＡ）を合成した。
Ｉｒ（ｂｔｑ)２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ＳＡ）をそれぞれテトラヒドロフランに溶解し、錯体濃度２０μＭの溶液とし、吸収波長、りん光波長、りん光量子収率、りん光寿命を測定、放射速度定数、無放射速度定数を算出した。これらの結果を表２に示す。
表２中、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ１における重水素化率である。また、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ＳＡ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ２における重水素化率である。
「配位子 重水素化率」と「錯体 重水素化率」との対比から、錯体化前後で重水素化率にほぼ変化がなく、錯体化後も重水素化率が維持されたことが確認できた。
表２中、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ１における重水素化率である。また、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ＳＡ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ２における重水素化率である。
「配位子 重水素化率」と「錯体 重水素化率」との対比から、錯体化前後で重水素化率にほぼ変化がなく、錯体化後も重水素化率が維持されたことが確認できた。
「合成例７：Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ａｃａｃ）の合成」
重水素化２−ブロモピリジンの代わりに重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｐ−ｄ８）２（ａｃａｃ）を合成した。
重水素化２−ブロモピリジンの代わりに重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｐ−ｄ８）２（ａｃａｃ）を合成した。
「合成例８：Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ａｃａｃ）の合成」
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりにベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）を用い、重水素化２−ブロモピリジンの代わりに重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｐ−ｄ６ｑｕ）２（ａｃａｃ）を合成した。
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりにベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）を用い、重水素化２−ブロモピリジンの代わりに重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｐ−ｄ６ｑｕ）２（ａｃａｃ）を合成した。
「合成例９：Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）の合成」
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりにベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）を用い、重水素化２−ブロモピリジンの代わりに２−ブロモキノリン（ＴＣＩ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）を合成した。
重水素化ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸の代わりにベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）を用い、重水素化２−ブロモピリジンの代わりに２−ブロモキノリン（ＴＣＩ社製）を用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）を合成した。
Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ａｃａｃ）、合成例７〜９で得たイリジウム（ＩＩＩ）錯体をそれぞれテトラヒドロフランに溶解し、錯体濃度２０μＭの溶液とし、吸収波長、りん光波長、りん光量子収率、りん光寿命を測定、放射速度定数、無放射速度定数を算出した。結果を表３に示す。
表３中、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ１における重水素化率である。またＩｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ２における重水素化率である。
「配位子 重水素化率」と「錯体 重水素化率」との対比から、錯体化前後で重水素化率にほぼ変化がなく、錯体化後も重水素化率が維持されたことが確認できた。
表３中、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ１における重水素化率である。またＩｒ（ｂｔｑ−ｄ４ｂｔ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ２における重水素化率である。
「配位子 重水素化率」と「錯体 重水素化率」との対比から、錯体化前後で重水素化率にほぼ変化がなく、錯体化後も重水素化率が維持されたことが確認できた。
「合成例１０：Ｉｒ（ｂｔｐｈ−ｄ８ｐｈ）２（ａｃａｃ）の合成」
フェナンスリジノン、重水、白金炭素触媒を高圧反応容器にいれ，Ｎ２＋Ｈ２（３．０５％）ガスを２．５ＭＰａ充填した。１８０℃に加熱し２４時間反応させた。濃縮乾固し白色粉末を得た。合成確認と同定を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）と１Ｈ−ＮＭＲで行った。
重水素化２−ブロモピリジンの代わりに上記重水素化フェナンスリジリンを用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｐｈ−ｄ８ｐｈ）２（ａｃａｃ）を合成した。
フェナンスリジノン、重水、白金炭素触媒を高圧反応容器にいれ，Ｎ２＋Ｈ２（３．０５％）ガスを２．５ＭＰａ充填した。１８０℃に加熱し２４時間反応させた。濃縮乾固し白色粉末を得た。合成確認と同定を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）と１Ｈ−ＮＭＲで行った。
重水素化２−ブロモピリジンの代わりに上記重水素化フェナンスリジリンを用いた以外は合成例１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｐｈ−ｄ８ｐｈ）２（ａｃａｃ）を合成した。
Ｉｒ（ｂｔｐｈ）２（ａｃａｃ）、Ｉｒ（ｂｔｐｈ−ｄ８ｐｈ）２（ａｃａｃ）をそれぞれテトラヒドロフランに溶解し、錯体濃度２０μＭの溶液とし、吸収波長、りん光波長、りん光量子収率、りん光寿命を測定、放射速度定数、無放射速度定数を算出した。結果を表４に示す。
表４中、Ｉｒ（ｂｔｐｈ−ｄ８ｐｈ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ１における重水素化率である。
「配位子 重水素化率」と「錯体 重水素化率」との対比から、錯体化前後で重水素化率にほぼ変化がなく、錯体化後も重水素化率が維持されたことが確認できた。
表４中、Ｉｒ（ｂｔｐｈ−ｄ８ｐｈ）２（ａｃａｃ）の重水素化率は、重水素化原料を用いた環Ｒ１における重水素化率である。
「配位子 重水素化率」と「錯体 重水素化率」との対比から、錯体化前後で重水素化率にほぼ変化がなく、錯体化後も重水素化率が維持されたことが確認できた。
上記結果に示すとおり、シクロメタル配位子（環Ｒ１−環Ｒ２）が重水素化されているイリジウム錯体は、シクロメタル配位子が重水素化されていない場合に比べて、発光性能に優れていた。溶液内の評価では、酸素濃度がゼロの時最大１．４倍の発光効率、発光寿命の向上が確認された。
シクロメタル配位子が全て重水素化されている場合と、環Ｒ１のみが重水素化されている場合に、重水素化による効果が大きかった。
シクロメタル配位子が全て重水素化されている場合と、環Ｒ１のみが重水素化されている場合に、重水素化による効果が大きかった。
＜実験２＞
実験２では、本発明の低酸素領域可視化試薬について、細胞に取り込まれたときの発光性能を評価した。具体的には、Ｉｒ（ｂｔｑ)２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）（合成例４）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）（合成例５）を用いて、以下の手順で、酸素分圧２１％、２．５％中のりん光強度、及びりん光寿命の測定を実施した。
実験２では、本発明の低酸素領域可視化試薬について、細胞に取り込まれたときの発光性能を評価した。具体的には、Ｉｒ（ｂｔｑ)２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）（合成例４）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）（合成例５）を用いて、以下の手順で、酸素分圧２１％、２．５％中のりん光強度、及びりん光寿命の測定を実施した。
「りん光強度の測定」
ＨｅＬａ細胞をコンフルになるように９６ウェルプレートに撒き２日間培養した。そこにＩｒ（ｂｔｑ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）を５μＭで添加し、その後、２時間、３７℃のインキュベーターで培養した。培養条件は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），ペニシリン（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ））とした。次いで、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）×２回、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ−）×３回の条件でウォッシングした。次いで、酸素分圧２１％にて細胞中に取り込まれた各プローブのりん光強度は、マイクロプレートリーダー「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ(Ｔｅｃａｎ)」を用いて測定した。
ＨｅＬａ細胞をコンフルになるように９６ウェルプレートに撒き２日間培養した。そこにＩｒ（ｂｔｑ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）を５μＭで添加し、その後、２時間、３７℃のインキュベーターで培養した。培養条件は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），ペニシリン（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ））とした。次いで、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）×２回、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ−）×３回の条件でウォッシングした。次いで、酸素分圧２１％にて細胞中に取り込まれた各プローブのりん光強度は、マイクロプレートリーダー「Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏ(Ｔｅｃａｎ)」を用いて測定した。
「りん光寿命の測定」
ＨｅＬａ細胞をコンフルになるようにシャーレに撒き２日間培養した。そこにＩｒ（ｂｔｑ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）を１μＭで添加し、その後、１．５時間、３７℃のインキュベーターで培養した。培養条件は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），ペニシリン（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ））とした。次いで、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）×２回、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ−）×３回の条件でウォッシングした。次いで、酸素分圧２１％にて細胞中に取り込まれた各プローブのりん光強度、倒立型顕微鏡像及びりん光寿命(各３回）を測定した。
りん光寿命は、パルスレーザー（波長：５３２ｎｍ、パルス幅：１ｎｓ、繰り返し：２０ｋＨｚ）でプローブ分子を励起し、得られたりん光（観測波長：６７０ｎｍ）を時間相関単一光子計数法に基づく装置（Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ、浜松ホトニクス社製）で取得した。
続いて、酸素分圧を２．５％に落とし、同様に測定した。倒立型顕微鏡としては、ＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を使用し、倍率を４０倍とした。結果を表５に示す。
ＨｅＬａ細胞をコンフルになるようにシャーレに撒き２日間培養した。そこにＩｒ（ｂｔｑ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）を１μＭで添加し、その後、１．５時間、３７℃のインキュベーターで培養した。培養条件は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ），ペニシリン（５０ｕｎｉｔ／ｍＬ）−ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ））とした。次いで、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ＋）×２回、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ−）×３回の条件でウォッシングした。次いで、酸素分圧２１％にて細胞中に取り込まれた各プローブのりん光強度、倒立型顕微鏡像及びりん光寿命(各３回）を測定した。
りん光寿命は、パルスレーザー（波長：５３２ｎｍ、パルス幅：１ｎｓ、繰り返し：２０ｋＨｚ）でプローブ分子を励起し、得られたりん光（観測波長：６７０ｎｍ）を時間相関単一光子計数法に基づく装置（Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−Ｔａｕ、浜松ホトニクス社製）で取得した。
続いて、酸素分圧を２．５％に落とし、同様に測定した。倒立型顕微鏡としては、ＩＸ７１（ＯＬＹＭＰＵＳ社製）を使用し、倍率を４０倍とした。結果を表５に示す。
表５に示すように、りん光強度については、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）の方が、酸素分圧２．５％と酸素分圧２１％の比を比較すると非標識対比１．１倍のりん光強度が得られた。Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）についても同様の結果（非標識対比１．１倍）が得られた。
なお、表５には示していないが、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）及びＩｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）をそれぞれＨＴ−２９細胞、ＭＣＦ−７細胞に添加し、ＨｅＬａ細胞と同様の実験を行ったところ、ＨＴ−２９細胞では、それぞれりん光強度は非標識対比で１．３倍、１．３倍であり、ＭＣＦ−７細胞では、非標識対比で１．２倍、１．３倍高いりん光強度が観察された。
なお、表５には示していないが、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）及びＩｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）をそれぞれＨＴ−２９細胞、ＭＣＦ−７細胞に添加し、ＨｅＬａ細胞と同様の実験を行ったところ、ＨＴ−２９細胞では、それぞれりん光強度は非標識対比で１．３倍、１．３倍であり、ＭＣＦ−７細胞では、非標識対比で１．２倍、１．３倍高いりん光強度が観察された。
りん光寿命については、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）の方が、酸素分圧２．５％と酸素分圧２１％の比を比較すると、長いりん光寿命（非標識対比１．１倍）が観察された。Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）についても同様の結果（非標識対比１．２倍）が得られた。
図１に、酸素分圧２１％、２．５％それぞれにおける倒立型顕微鏡像を示す。図１中、上段の３つの画像は各々酸素分圧２１％の場合の倒立型顕微鏡像を示し、下段の３つの画像は各々酸素分圧２．５％の場合の倒立型顕微鏡像を示す。また、上段、下段各々の３つの画像のうち、左側の画像は、Ｉｒ（ｂｔｑ)２（ＳＡ）を用いた場合の倒立型顕微鏡像を示し、中央の画像は、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）を用いた場合の倒立型顕微鏡像を示し、右側の画像はＩｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）を用いた場合の倒立型顕微鏡像を示す。
上記結果に示すように、Ｉｒ（ｂｔｑ)２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）は、共に細胞内に集積した。
なお、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）及びＩｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）をそれぞれＨＴ−２９細胞、ＭＣＦ−７細胞に添加し、ＨｅＬａ細胞と同様の実験を行った。
その結果、酸素分圧２．５％と酸素分圧２１％の比をそれぞれ比較すると、ＨＴ−２９細胞では、非標識対比でそれぞれ１．１倍、１．１倍長いりん光寿命が観察された。同様に、ＭＣＦ−７細胞では、非標識対比でそれぞれ１．１倍、１．１倍長いりん光寿命が観察された。
なお、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）及びＩｒ（ｂｔｑ−ｄ１０）２（ＳＡ）をそれぞれＨＴ−２９細胞、ＭＣＦ−７細胞に添加し、ＨｅＬａ細胞と同様の実験を行った。
その結果、酸素分圧２．５％と酸素分圧２１％の比をそれぞれ比較すると、ＨＴ−２９細胞では、非標識対比でそれぞれ１．１倍、１．１倍長いりん光寿命が観察された。同様に、ＭＣＦ−７細胞では、非標識対比でそれぞれ１．１倍、１．１倍長いりん光寿命が観察された。
＜実験３＞
「合成例１１：Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）の合成」
ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）と、重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）を、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ｐｐｈ３）４）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、ベンゼン、エタノールに溶解させ、窒素雰囲気下で加熱還流した。生成した２−（２−キノリル−ｄ６）ベンゾ［ｂ］チオフェンをクロロホルムで抽出し、減圧乾固後、シリカクロマトグラフィーで精製した。
精製した２−（２−キノリル−ｄ６）ベンゾ［ｂ］チオフェン及び塩化イリジウム・３水和物を２−エトキシエタノールと水の混合液に懸濁させ、還流を行った。室温に冷却後、溶媒を留去し、生成物を少量のクロロホルムに溶解させ、ヘキサンを加えて固体を析出させた。生成した固体をろ過し、塩素架橋２核錯体を得た。塩素架橋２核錯体及びt−ブチル４−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートをテトラヒドロフラン、メタノールに溶解させ、窒素雰囲気下、４時間還流した。室温に冷却後、ヘキサフルオロリン酸カリウム（ＫＰＦ６）を加え１時間撹拌した。溶媒を留去し、アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成したＩｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）を精製した。
精製物を水とトリフルオロ酢酸とトリイソプロピルシランとの混合液に加え、１時間静置した。混合液に冷ジエチルエーテルを加え固体を析出させ、遠心分離により固体を沈殿させた。次いで、冷ジエチルエーテルを除き、再び冷ジエチルエーテルを加え、遠心分離により固体を沈殿させた。この操作をさらに２回行いＩｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）を得た。ＭＳ（質量分析）で生成物の同定をした。
「合成例１１：Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）の合成」
ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルボロン酸（ＴＣＩ社製）と、重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）を、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（Ｐｄ（ｐｐｈ３）４）、２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液、ベンゼン、エタノールに溶解させ、窒素雰囲気下で加熱還流した。生成した２−（２−キノリル−ｄ６）ベンゾ［ｂ］チオフェンをクロロホルムで抽出し、減圧乾固後、シリカクロマトグラフィーで精製した。
精製した２−（２−キノリル−ｄ６）ベンゾ［ｂ］チオフェン及び塩化イリジウム・３水和物を２−エトキシエタノールと水の混合液に懸濁させ、還流を行った。室温に冷却後、溶媒を留去し、生成物を少量のクロロホルムに溶解させ、ヘキサンを加えて固体を析出させた。生成した固体をろ過し、塩素架橋２核錯体を得た。塩素架橋２核錯体及びt−ブチル４−（１，１０−フェナントロリン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートをテトラヒドロフラン、メタノールに溶解させ、窒素雰囲気下、４時間還流した。室温に冷却後、ヘキサフルオロリン酸カリウム（ＫＰＦ６）を加え１時間撹拌した。溶媒を留去し、アミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーで生成したＩｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）を精製した。
精製物を水とトリフルオロ酢酸とトリイソプロピルシランとの混合液に加え、１時間静置した。混合液に冷ジエチルエーテルを加え固体を析出させ、遠心分離により固体を沈殿させた。次いで、冷ジエチルエーテルを除き、再び冷ジエチルエーテルを加え、遠心分離により固体を沈殿させた。この操作をさらに２回行いＩｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）を得た。ＭＳ（質量分析）で生成物の同定をした。
「合成例１２：Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）の合成」
重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）の代わりに２−ブロモキノリン（ＴＣＩ社製）を用いた以外は、合成例１１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）を合成した。
重水素化２−ブロモキノリン（ＩＳＯＴＥＣ社製）の代わりに２−ブロモキノリン（ＴＣＩ社製）を用いた以外は、合成例１１と同様の条件でＩｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）を合成した。
合成例１１，１２で得たイリジウム（ＩＩＩ）錯体をそれぞれアセトニトリルに溶解し、錯体濃度２０μＭの溶液とし、りん光量子収率、りん光寿命を測定、放射速度定数、無放射速度定数を算出した。結果を表６に示す。
Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）では、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）と比較して、りん光量子収率及びりん光寿命がともに１．５倍ほど向上することが確認できた。また、放射速度定数は、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）とＩｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）との間で、ほぼ変化しなかった。一方、無放射速度定数は、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）と比較してＩｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）では低い値であった。この結果から、無放射速度定数が相対的に低い値に抑制されることで、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）のりん光量子収率及びりん光寿命が向上していることが確認できた。
＜実験４＞
実験４では、本発明の低酸素領域可視化試薬について、培養細胞に取り込まれたときの発光性能を評価した。具体的には、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）（合成例１１）、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）（合成例１２）を用いて、以下の手順で、酸素分圧が２１％、２．５％である場合について、倒立型顕微鏡像を取得し、りん光強度及びりん光寿命を測定した。
倒立型顕微鏡像の取得は上述の実験２と同様にして行った。
実験４では、本発明の低酸素領域可視化試薬について、培養細胞に取り込まれたときの発光性能を評価した。具体的には、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）（合成例１１）、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）（合成例１２）を用いて、以下の手順で、酸素分圧が２１％、２．５％である場合について、倒立型顕微鏡像を取得し、りん光強度及びりん光寿命を測定した。
倒立型顕微鏡像の取得は上述の実験２と同様にして行った。
ＨｅＬａ細胞におけるりん光強度の測定は、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）を５μＭでＨｅＬａ細胞に添加する代わりに、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）のそれぞれを１μＭでＨｅＬａ細胞に添加した以外は、実験２と同様の条件で行った。結果を表７に示す。
次いで、ＨｅＬａ細胞の代わりに、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）をＨＴ−２９細胞、ＭＣＦ−７細胞にそれぞれ添加し、それぞれの細胞におけるりん光強度の測定を行った。ＭＣＦ−７細胞におけるりん光強度の測定結果を表８に示し、ＨＴ−２９細胞におけるりん光強度の測定結果を表９に示す。
次いで、ＨｅＬａ細胞の代わりに、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）をＨＴ−２９細胞、ＭＣＦ−７細胞にそれぞれ添加し、それぞれの細胞におけるりん光強度の測定を行った。ＭＣＦ−７細胞におけるりん光強度の測定結果を表８に示し、ＨＴ−２９細胞におけるりん光強度の測定結果を表９に示す。
ＨｅＬａ細胞におけるりん光寿命の測定は、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ＳＡ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ＳＡ）をＨｅＬａ細胞に添加する代わりに、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）のそれぞれをＨｅＬａ細胞に添加した以外は、実験２と同様の条件で行った。結果を表１０に示す。
次いで、ＨｅＬａ細胞の代わりに、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）をＨＴ−２９細胞、ＭＣＦ−７細胞にそれぞれ添加し、それぞれの細胞におけるりん光寿命の測定を行った。ＭＣＦ−７細胞におけるりん光寿命の測定結果を表１１に示し、ＨＴ−２９細胞におけるりん光寿命の測定結果を表１２に示す。
次いで、ＨｅＬａ細胞の代わりに、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）をＨＴ−２９細胞、ＭＣＦ−７細胞にそれぞれ添加し、それぞれの細胞におけるりん光寿命の測定を行った。ＭＣＦ−７細胞におけるりん光寿命の測定結果を表１１に示し、ＨＴ−２９細胞におけるりん光寿命の測定結果を表１２に示す。
図２は、ＨｅＬａ細胞を用いた場合における倒立型顕微鏡像であり、図３はＨＴ−２９細胞を用いた場合における倒立型顕微鏡像である。図２、３中、上段の２つの画像は各々酸素分圧２１％の場合の倒立型顕微鏡像であり、下段の２つの画像は各々酸素分圧２．５％の場合の倒立型顕微鏡像である。また、上段、下段各々の２つの画像のうち、左側の画像は、Ｉｒ（ｂｔｑ)２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）を用いた場合の倒立型顕微鏡像であり、右側の画像はＩｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）を用いた場合の倒立型顕微鏡像である。
図２、３に示すように、Ｉｒ（ｂｔｑ)２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）は、共に細胞内に集積することが確認された。
表７〜９に示すように、りん光強度は、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）の方がＩｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）より高かった。また、酸素分圧２．５％と酸素分圧２１％の比（Ｉ２１／Ｉ２．５）／を比較するとＨｅＬａ細胞では非標識対比で１．２倍のりん光強度が確認され（表７）、ＭＣＦ−７細胞では非標識対比で１．１倍の高いりん光強度が確認され（表８）、ＨＴ−２９細胞では、非標識対比で１．２倍のりん光強度が確認された（表９）。
表１０〜１２に示すように、りん光寿命は、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）の方がＩｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）より高かった。また、酸素分圧２．５％と酸素分圧２１％の比（μ２１／μ２．５）を比較すると、ＨｅＬａ細胞では非標識対比で１．１倍のりん光寿命が確認され（表１０）、ＭＣＦ−７細胞では、非標識対比で１．２倍のりん光寿命が確認され（表１１）、ＨＴ−２９細胞では、非標識対比で１．２倍のりん光寿命が確認された（表１２）。
以上表７〜１２で示した結果から、Ｉｒ（ｂｔｑ−ｄ６ｑｕ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）は、Ｉｒ（ｂｔｑ）２（ｐｈｅｎｐｉｐｅ）と比較して低酸素濃度下におけるりん光強度が高く、かつ、りん光寿命が長くなることが確認できた。
錯体（Ｉ）及び錯体（ＩＩ）は、酸素濃度が低いほど強い発光（りん光）を示す性質がある。そのため、錯体（Ｉ）を含む本発明の第一の態様の低酸素領域可視化試薬及び錯体（ＩＩ）を含む本発明の第二の態様の低酸素領域可視化試薬は、生体内で発生する低酸素領域（癌細胞や虚血性疾患）のイメージングに利用できる。
本発明の低酸素領域可視化試薬を用いることで、生きた細胞や組織の酸素濃度を非侵襲的に高感度リアルタイムで可視化でき、定量も可能である。そのため、本発明の低酸素領域可視化試薬は、細胞内酸素濃度画像化試薬、低酸素細胞画像化薬として有効である。
本発明の低酸素領域可視化試薬は、ガン組織の診断にも利用できる。例えば低酸素腫瘍診断試薬等に有効である。
本発明の低酸素領域可視化試薬によれば、感度を従来の低酸素領域可視化試薬より最大３０％高め、低酸素領域を検出することが可能である。そのため、試薬投与量を最大３０％減量することが可能である。
本発明の低酸素領域可視化試薬を用いることで、生きた細胞や組織の酸素濃度を非侵襲的に高感度リアルタイムで可視化でき、定量も可能である。そのため、本発明の低酸素領域可視化試薬は、細胞内酸素濃度画像化試薬、低酸素細胞画像化薬として有効である。
本発明の低酸素領域可視化試薬は、ガン組織の診断にも利用できる。例えば低酸素腫瘍診断試薬等に有効である。
本発明の低酸素領域可視化試薬によれば、感度を従来の低酸素領域可視化試薬より最大３０％高め、低酸素領域を検出することが可能である。そのため、試薬投与量を最大３０％減量することが可能である。
Claims (8)
- 下記式（Ｉ）で表される錯体を含む低酸素領域可視化試薬。
- 前記式（Ｉ）中の環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合が天然存在比よりも高値である、請求項１に記載の低酸素領域可視化試薬。
- 前記式（Ｉ）中の環Ｒ１の重水素化率が５０％以上である、請求項１又は２に記載の低酸素領域可視化試薬。
- 溶媒をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の低酸素領域可視化試薬。
- 下記式（ＩＩ）で表される錯体を含む低酸素領域可視化試薬。
- 前記式（ＩＩ）中の環Ｒ１及び環Ｒ２全体での重水素及び水素の合計数に対する重水素の数の割合が天然存在比よりも高値である、請求項５に記載の低酸素領域可視化試薬。
- 前記式（ＩＩ）中の環Ｒ１の重水素化率が５０％以上である、請求項５又は６に記載の低酸素領域可視化試薬。
- 溶媒をさらに含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の低酸素領域可視化試薬。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| JP2017124478 | 2017-06-26 | ||
| JP2017124478 | 2017-06-26 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=65029528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018120180A Pending JP2019007961A (ja) | 2017-06-26 | 2018-06-25 | 低酸素領域可視化試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2019007961A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020183372A (ja) * | 2019-04-29 | 2020-11-12 | 寧波盧米藍新材料有限公司 | 縮合多環化合物及びその製造方法と用途 |
-
2018
- 2018-06-25 JP JP2018120180A patent/JP2019007961A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020183372A (ja) * | 2019-04-29 | 2020-11-12 | 寧波盧米藍新材料有限公司 | 縮合多環化合物及びその製造方法と用途 |
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| US11706982B2 (en) | 2019-04-29 | 2023-07-18 | Ningbo Lumilan Advanced Materials Co., Ltd. | Fused polycyclic compound, and preparation method and use thereof |
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