JP2019000082A - 侵襲性歯周炎の遺伝子検査および治療剤 - Google Patents

Abstract

【課題】侵襲性歯周炎の遺伝子検査方法を提供すること。【解決手段】ＮＯＤ２遺伝子中の変異を同定することにより、侵襲性歯周炎をｉｎ ｖｉｔｒｏで検査する。より具体的には、ヒトＮＯＤ２タンパク質中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を調べることにより、侵襲性歯周炎の発症傾向を判定する。この知見に基づき、ＮＯＤ２活性阻害剤を含有する侵襲性歯周炎の治療剤も提供される。【選択図】図１

Description

本発明は、侵襲性歯周炎の検査方法に関する。より詳細には、遺伝子配列を調べることにより、侵襲性歯周炎の罹患の有無または発症傾向を判定する方法に関する。また、本発明は、そのような検査方法に用いる試薬組成物およびキットにも関する。さらに、本発明は、侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物にも関する。

歯周炎は、歯の支持組織における慢性炎症性疾患であり、成人の歯の損失の主要な原因の一つとなっている。患者は、咀嚼効率の低下や見た目の問題に苦しむだけでなく、この病気により全身の健康にも影響が及び、生活の質にも低下がもたらされうる。歯周炎は、糖尿病、アテローム硬化性心血管疾患、妊娠成績の悪化、関節リウマチなど、多くの全身性疾患に関連していることが、数多くの研究で示されている。６５歳以上の人口の６０％以上が、様々な程度で、この疾患の影響を受けていると考えられており、歯周炎は公衆衛生上の世界的な大問題であるともみなされている。その病因には、細菌感染によって惹起される過剰な免疫応答が含まれ、それにより歯を機械的に支持する歯槽骨を含む歯周組織が最終的に破壊される。この過程はゆっくりと進行するため、患者は通常、早期には病気を認識せず、そして時に、後の段階で見られる不可逆的な骨破壊によって引き起こされる歯の損失が歯科医と患者の両者を悩ませることになる。

侵襲性歯周炎（ＡｇＰ：ＭＩＭ １７０６５０）として知られる稀な重度の歯周炎は、歯周炎以外の病歴のない急速な歯槽骨破壊と家族集積性によって特徴付けられる（非特許文献１）。これまでの研究では、世界的に低いＡｇＰの罹患率（＜０．１３％〜５．５％）が報告されており、ヨーロッパでは０．１〜０．１３％、北米では０．１３〜０．８％、南米では０．３２〜５．５％、アジアでは０．１３〜０．８６％といった、ある程度の地域的な変動が見られている（非特許文献２）。ＡｇＰは家族集積性を頻繁に示すため、ＡｇＰの原因には遺伝的要因が主要な役割を果たすと考えられており、ＡｇＰの遺伝率は約３０％と推定されている（非特許文献３）。以前の研究では、免疫関連遺伝子に焦点を当てた候補遺伝子アプローチを通して遺伝的寄与を評価することが試みられたが、原因遺伝子は同定されていない（非特許文献４〜７）。最近、複数の遺伝子がＡｇＰの病因に寄与するという仮説に基づいたゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）が行われているが、ＡｇＰに遺伝的関連を示す有意な遺伝子座の重複は、これまで同定されていない（非特許文献８）。

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本発明は、遺伝子配列の分析に基づく侵襲性歯周炎の検査方法を提供することを目的の一つとする。また、本発明は、侵襲性歯周炎の検査に用いるキットを提供することも別の目的の一つとしている。

上記の目的のために、発明者らは日本人を祖先とする２つのＡｇＰ家系のＷＥＳ（Whole Exome Sequencing）を行い、ＮＯＤ２の変異を同定した。発明者らはまた、９４例の遺伝的に無関係なＡｇＰ患者の包括的なターゲットエクソンシーケンシングを行い、この遺伝子中にさらに３つの変異を見出した。よって、ヒトＮＯＤ２タンパク質中に同定された１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を調べることにより、侵襲性歯周炎の検査を行うことができる。

本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の態様を包含する：
態様１
ＮＯＤ２遺伝子中の少なくとも１つの変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法。
態様２
ヒトＮＯＤ２タンパク質（配列番号１）中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を同定することを特徴とする、態様１記載の検査方法。
態様３
ヒトＮＯＤ２遺伝子塩基配列（配列番号２）中の３２８位、９３１位、１１０８位、１３７５位および／または２６０２位の塩基における変異を同定することを特徴とする、態様１記載の検査方法。
態様４
ＮＯＤ２遺伝子中の少なくとも１つの変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法に用いるための少なくとも１つのプライマーまたはプローブを含むキット。
態様５
ヒトＮＯＤ２タンパク質中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を同定することを特徴とする、態様４記載のキット。
態様６
ヒトＮＯＤ２遺伝子塩基配列中の３２８位、９３１位、１１０８位、１３７５位および／または２６０２位の塩基における変異を同定することを特徴とする、態様４記載のキット。
態様７
プライマーが、配列番号３〜１０６に記載の配列から選択される配列から成ることを特徴とする、態様４記載のキット。
態様８
ＮＯＤ２遺伝子中の少なくとも１つの変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法に用いるための少なくとも１つのプライマーまたはプローブを含む組成物。
態様９
ヒトＮＯＤ２タンパク質中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を同定することを特徴とする、態様８記載の組成物。
態様１０
ヒトＮＯＤ２遺伝子塩基配列中の３２８位、９３１位、１１０８位、１３７５位および／または２６０２位の塩基における変異を同定することを特徴とする、態様８記載の組成物。
態様１１
プライマーが、配列番号３〜１０６に記載の配列から選択される配列から成ることを特徴とする、態様８記載の組成物。
態様１２
侵襲性歯周炎の予防または治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、ｉ）in vitroでＮＯＤ２タンパク質と試験物質とを接触させる工程、ｉｉ）ＮＯＤ２タンパク質の活性を測定する工程、およびｉｉｉ）該試験物質がＮＯＤ２タンパク質の活性を低下させるか否かを決定する工程を含む、方法。
態様１３
ＮＯＤ２活性の阻害剤を含有する、侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物。
態様１４
侵襲性歯周炎の治療用または予防用の医薬の製造における、ＮＯＤ２活性の阻害剤の使用。
態様１５
ＮＯＤ２活性の阻害剤を対象に投与する工程を含む、侵襲性歯周炎の治療または予防のための方法。
態様１６
ＧＳＫ６６９、ＧＳＫ７１７、ＳＫ４００、アレーンクロム錯体、およびクルクミンから成る群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する、侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物。

本願に開示の研究において調べられたＡｇＰの表現型および家系を示した図である。上段ａの左側上下２枚の写真は、ＩＩＩ−２（家系１）の口腔内写真とＸ線写真であり、下顎前歯が支持歯周組織を失っていることが示されている。上段ａの右側上下２枚の写真は、ＩＩ−１およびＩＩ−２（家系２）の放射線写真であり、ほぼ全ての歯が歯周組織を失っていることが示されている。下段ｂの左側は、家系１のＡｇＰに関する系図である。下段ｂの右側は、家系２のＡｇＰに関する系図である。アスタリスクは、本研究の参加者を示している。白および黒の色はそれぞれ、罹患していない個体と、罹患した患者を表している。 ＮＯＤ２遺伝子およびＮＯＤ２タンパク質の構造を示した図である。上段ａはＮＯＤ２の遺伝子およびタンパク質の構造を示している。Ａｌａ１１０Ｔｈｒ変異はＣＡＲＤ１ドメインに位置する。Ａｒｇ３１１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ３７０ＴｙｒおよびＡｒｇ４５９ＣｙｓはＮＢＤドメインに位置する。Ａｌａ８６８Ｔｈｒ変異はＬＲＲドメインに位置する。略語の意味は次のとおり。ＣＡＲＤ：カスパーゼ活性化動員ドメイン；ＮＢＤ：ヌクレオチド結合ドメイン；ＬＲＲ：ロイシンリッチリピートドメイン。下段ｂは１０例のＡｇＰ症例と１例の遺伝的に影響を受けていない個体におけるＮＯＤ２変異部位のクロマトグラムを示している。 ヒトＮＯＤ２タンパク質のアミノ酸配列を示した図である。 ヒトＮＯＤ２遺伝子のＣＤＳ（コーディング配列）を示した図である。

上述のとおり、本発明者らは、侵襲性歯周炎の原因となるＮＯＤ２遺伝子中の変異を同定した。ＮＯＤ２遺伝子中の変異を同定することにより、侵襲性歯周炎をｉｎ ｖｉｔｒｏで検査することが可能である。より具体的には、ヒトＮＯＤ２タンパク質中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を調べることにより、侵襲性歯周炎の罹患の有無または発症傾向を判定する。また、この知見に基づき、ＮＯＤ２活性阻害剤を含有する侵襲性歯周炎の治療剤も提供される。以下に、本発明を詳細に説明する。

ＮＯＤ２遺伝子
ＮＯＤ２（ＭＩＭ：６０５９５６）は、パターン認識受容体（ＰＲＲ）の一種であるヌクレオチド結合性多量体ドメイン受容体（ＮＬＲ）のメンバーである。先天性免疫に関連するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）もまたＰＲＲに含まれる。ＮＯＤ２は、マクロファージや樹状細胞などの抗原提示細胞だけでなく、口腔上皮細胞や歯根膜細胞でも発現されている。ＮＯＤ２の発現は、健康な歯周組織においては非常に弱いが、患者の歯周組織における炎症細胞浸潤部付近の単核細胞および線維芽細胞においては検出される。ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）による刺激を通した歯周炎の実験モデルにおいて、ＮＯＤ２は歯周病の病原体を感知し、ＮＦκＢの活性化を促進することに加えて、骨吸収の進行に寄与する。

ヒトＮＯＤ２のアミノ酸配列（例えば、アイソフォーム１の場合、配列番号１）およびコーディング配列（例えば、アイソフォーム１の場合、配列番号２）は、公共データベースから取得することができる。
NOD2 [ Homo sapiens (human) ]
Gene ID：64127
ｍＲＮＡ：NM_022162.2（アイソフォーム１）
タンパク質：NP_071445.1（アイソフォーム１）
ｍＲＮＡ：NM_001293557.1（アイソフォーム２）
タンパク質：NP_001280486.1（アイソフォーム２）
ヒトＮＯＤ２のアイソフォーム２はアイソフォーム１に比べて一部が短くなっているのみで、それ以降の配列も変化はない。本開示において同定されている５カ所について、エクソーム解析とターゲットシークエンスの結果では、アイソフォーム２も同様にミスセンス変異と判定され、塩基およびアミノ酸の変化には違いがない。よって、本開示におけるサンガー法の結果はそのままアイソフォーム２にも適用できる。なお、アイソフォーム１の配列に基づくｐ．Ａｌａ１１０Ｔｈｒ（ｃ．３２８Ｇ＞Ａ）、ｐ．Ａｒｇ３１１Ｔｒｐ（ｃ．９３１Ｃ＞Ｔ）、ｐ．Ｈｉｓ３７０Ｔｙｓ（ｃ．１１０８Ｃ＞Ｔ）、ｐ．Ａｒｇ４５９Ｃｙｓ（ｃ．１３７５Ｃ＞Ｔ）、ｐ．Ａｌａ８６８Ｔｈｒ（ｃ．２６０２Ｇ＞Ａ）の変異はそれぞれ、アイソフォーム２の配列に基づくとｐ．Ａｌａ８３Ｔｈｒ（ｃ．２４７Ｇ＞Ａ）、ｐ．Ａｒｇ２８４Ｔｒｐ（ｃ．８５０Ｃ＞Ｔ）、ｐ．Ｈｉｓ３４３Ｔｙｓ（ｃ．１０２７Ｃ＞Ｔ）、ｐ．Ａｒｇ４３２Ｃｙｓ（ｃ．１２９４Ｃ＞Ｔ）、ｐ．Ａｌａ８４１Ｔｈｒ（ｃ．２５２１Ｇ＞Ａ）と表記される。

ＮＯＤ２タンパク質は、特定の微生物病原体に応答するセンサーとして、先天性免疫において本質的な役割を担う、細胞質型のパターン認識受容体（ＰＲＲ）である。ＮＯＤ２タンパク質は、カスパーゼ活性化動員ドメイン（ＣＡＲＤ）、ヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）、およびロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインの３つのドメインを有する（図２ａ）。各ドメインは、タンパク質タンパク質間相互作用のメディエーターとして、あるいは、自己オリゴマー化もしくはリガンド認識のファシリテーターとして働く。ＬＲＲは、グラム陰性細菌の細胞壁を構成する、ペプチドグリカン（ＰＧＮ）の最小構造であるムラミルジペプチド（ＭＤＰ）を認識して、ＮＢＤが媒介するオリゴマー化によりＮＯＤタンパク質の構造変化を引き起こす。オリゴマー化後に生じるタンデム状のＮ末端ＣＡＲＤの相互作用は、ＮＦκＢおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の活性化を誘発する。ＮＯＤ２は、クローン病、Ｂｌａｕ症候群、および若年性サルコイドーシスを含む、いくつかの疾患の原因となる遺伝子の１つとして報告されている。クローン病患者の変異は主にＬＲＲドメイン内に位置し、機能喪失型の表現型をもたらすが（Inohara N, Ogura Y, Fontalba A, Gutierrez O, Pons F, Crespo J, Fukase K, Inamura S, Kusumoto S, Hashimoto M et al. 2003. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through nod2. Implications for Crohn's disease. J Biol Chem. 278(8):5509-5512.）、Ｂｌａｕ症候群および若年性サルコイドーシスの変異はＮＢＤドメイン内に位置し、機能獲得型の表現型を生じる（Chamaillard M, Zouali H, Thomas G, Hugot JP. 2001. Card15 mutations in Blau syndrome. Nat Genet. 29(1):19-20.; Kanazawa N, Okafuji I, Kambe N, Nishikomori R, Nakata-Hizume M, Nagai 1 S, Fuji A, Yuasa T, Manki A, Sakurai Y, et al. 2005. Early-onset sarcoidosis and card15 mutations with constitutive nuclear factor-kappab activation: Common genetic etiology with Blau syndrome. Blood. 105(3):1195-1197.）。本願に開示の変異のうち、Ａｌａ１１０Ｔｈｒ変異はＣＡＲＤ１ドメインに位置するが、他の３つの変異Ａｒｇ３１１Ｔｈｒ、Ｈｉｓ３７０ＴｙｒおよびＡｒｇ４５９Ｃｙｓは、ＮＢＤドメインに位置し、残りのＡｌａ８６８Ｔｈｒ変異はＬＲＲドメインに位置する（図２ａ）。特定の理論に縛られることを意図するものではないが、この遺伝子の変異がＡｇＰを引き起こすＮＯＤ２タンパク質の機能にどのように影響するのかについて一つの仮説は、ＣＡＲＤドメインの変異がＮＦκＢシグナル伝達経路を活性化して、ＩＬ１βのプロセシングと放出を増強し、それにより、広範な炎症誘発性遺伝子の活性化を介して、口腔内の炎症に寄与する、というものである。

ＮＯＤ２遺伝子の分析による侵襲性歯周炎の検査方法
上述のとおり、本発明者らは、侵襲性歯周炎の原因となるＮＯＤ２遺伝子中の変異を同定した。ＮＯＤ２遺伝子中の変異を同定することにより、侵襲性歯周炎の発症傾向をｉｎ ｖｉｔｒｏで検査することが可能である。より具体的には、ヒトＮＯＤ２タンパク質（配列番号１）中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を調べることにより、侵襲性歯周炎の罹患の有無あるいはその発症傾向を判定する。さらにより具体的には、ヒトＮＯＤ２タンパク質におけるＡｌａ１１０Ｔｈｒ、Ａｒｇ３１１Ｔｒｐ、Ｈｉｓ３７０Ｔｙｒ、Ａｒｇ４５９Ｃｙｓ、およびＡｌａ８６８Ｔｈｒから成る群より選択される少なくとも１つの変異を同定する。

タンパク質中の変異の分析は、当業者に公知の任意の方法で行うことができる。分析方法の例としては、例えば、質量分析装置を用いる方法、エドマン分解を用いる方法、変異タンパク質を認識する抗体を用いる方法などが挙げられるが、これらに限定はされない。

ＮＯＤ２遺伝子中の変異は、当業者に公知の任意の手法により、被検者のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ（コーディング配列）を用いて分析することができる。例えば、ＮＯＤ２遺伝子領域のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡの塩基配列の全長またはその一部を決定し、変異の有無、特に、タンパク質中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位に対応する塩基における変異の有無を調べる。ＮＯＤ２のコーディング配列（配列番号２）を分析する場合、具体的には、ｃ．３２８Ｇ＞Ａ、ｃ．９３１Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１０８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３７５Ｃ＞Ｔ、およびｃ．２６０２Ｇ＞Ａから成る群より選択される少なくとも１つの変異を同定することができるが、タンパク質中のアミノ酸残基の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位に対応する塩基の変異であれば、これらに限定はされない。例えば、サンガーシーケンシングによりｃ．３２８Ｇ＞Ａ、ｃ．９３１Ｃ＞Ｔ、ｃ．１１０８Ｃ＞Ｔ、ｃ．１３７５Ｃ＞Ｔ、および／またはｃ．２６０２Ｇ＞Ａの変異を同定するために使用可能なプライマーを表１に示す。

ターゲットエクソンシーケンシングによりＮＯＤ２遺伝子の塩基配列を分析する際に使用可能なプライマーを表２および３に示す。

他の核酸配列中の変異を調べる方法としては、例えば、ＰＣＲやＬＡＭＰ法などの遺伝子増幅手法を用いる方法、制限酵素を用いる方法、ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法、プライマーのハイブリダイゼーションを用いる方法などが挙げられるが、これらに限定はされない。遺伝子の変異を検出する手法の例には、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、シーケンシング（塩基配列決定）、ダイレクトゲルアッセイ法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法が含まれる。

分析に用いる試料は、例えば、被検者の唾液、血液、皮膚組織、粘膜組織などに含まれる細胞もしくは核酸を利用することができるが、これらに限定はされない。好ましい被検者はヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。

本発明の侵襲性歯周炎の検査方法の一つの態様は、ＮＯＤ２遺伝子中の変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎の検査方法に関する。本発明の検査方法では、変異の同定は体外またはｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。ＮＯＤ２遺伝子中の変異は、例えば、ヒトＮＯＤ２タンパク質中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異でありうる。塩基配列中の変異としては、例えば、ヒトＮＯＤ２遺伝子塩基配列中の３２８位、９３１位、１１０８位、１３７５位および／または２６０２位の塩基における変異でありうる。

本発明の侵襲性歯周炎の検査方法の一つの態様は、（ｉ）ヒト被検者のＤＮＡまたはＲＮＡを含む単離された試料を用意する工程、（ｉｉ）試料に含まれるＤＮＡまたはＲＮＡに基づき、ＮＯＤ２遺伝子中の変異の有無を判定する工程を含み、ＮＯＤ２遺伝子中に変異が存在することにより、被検者が侵襲性歯周炎を発症しているか、発症する可能性が高いことが示される、方法に関する。このような検査方法により、変異が同定された未発症の被検者に対しては、予防対策を早期に開始することができる。既に歯周炎を発症している患者に対しては、ＮＯＤ２を標的とした治療を検討してもよい。

侵襲性歯周炎の検査に用いる試薬組成物およびキット
本発明の侵襲性歯周炎の検査方法の一つの態様は、ＮＯＤ２遺伝子中の少なくとも１つの変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法に用いるための少なくとも１つのプライマーまたはプローブを含むキットに関する。このようなキットは、ヒトＮＯＤ２タンパク質中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を同定するためのものであってもよく、あるいは、ヒトＮＯＤ２遺伝子塩基配列中の３２８位、９３１位、１１０８位、１３７５位および／または２６０２位の塩基における変異を同定するためのものであってもよい。より具体的には、プライマーは、配列番号３〜１０６に記載の配列から選択される配列から成るものとすることができるが、これらに限定はされない。当業者であれば、本願に開示の配列情報および公知の配列情報を利用して、適切なプライマーまたはプローブを設計することができる。プライマーまたはプローブの長さは、例えば、１２〜３０塩基長でありうる。プライマーまたはプローブは、例えば、配列番号２の塩基配列またはその相補配列にハイブリダイズするように設計することができる。プライマーまたはプローブは、例えば、配列番号２の塩基配列またはその相補配列の一部、好ましくは、連続する１２〜３０塩基の配列から成る核酸であってもよい。キットには、方法に用いる酵素、標識物質、基材、取扱い説明書等の他の要素が含まれていてもよい。

本発明の侵襲性歯周炎の検査方法の一つの態様は、ＮＯＤ２遺伝子中の少なくとも１つの変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法に用いるための少なくとも１つのプライマーまたはプローブを含む組成物に関する。このような組成物は、ヒトＮＯＤ２タンパク質中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を同定するためのものであってもよく、あるいは、ヒトＮＯＤ２遺伝子塩基配列中の３２８位、９３１位、１１０８位、１３７５位および／または２６０２位の塩基における変異を同定するためのものであってもよい。組成物中には、異なる複数のプライマーまたはプローブが含まれていてもよい。より具体的には、プライマーは、配列番号３〜１０６に記載の配列から選択される配列から成るものとすることができるが、これらに限定はされない。当業者であれば、本願に開示の配列情報および公知の配列情報を利用して、適切なプライマーまたはプローブを設計することができる。

侵襲性歯周炎の治療または予防に有用な物質のスクリーニング方法
本発明者らは、ＮＯＤ２の変異が侵襲性歯周炎に寄与することを見出した。ＮＯＤ２は、たとえばＮＦκＢシグナル伝達経路を活性化して、口腔内の炎症に寄与すると考えられることから、ＮＯＤ２の活性を阻害する物質をスクリーニングすることにより、侵襲性歯周炎に対する治療薬または予防薬として有用な物質を取得しうると理解される。

本発明の一つの態様は、侵襲性歯周炎の予防または治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでＮＯＤ２タンパク質と試験物質とを接触させる工程、ｉｉ）ＮＯＤ２タンパク質の活性を測定する工程、およびｉｉｉ）該試験物質がＮＯＤ２タンパク質の活性を低下させるか否かを決定する工程を含む、方法に関する。

このようなスクリーニング方法により同定された物質は、ＮＯＤ２タンパク質を標的とした歯周炎の治療剤として有用となりうる。ＮＯＤ２タンパク質の活性は、例えば、ＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化を指標として測定することができる。あるいは、例えば、Rickard et al.に開示されているもののような、他のアッセイ系を使用してもよい（Rickard DJ, Sehon CA, Kasparcova V, Kallal LA, Zeng X, et al. (2013) Identification of Benzimidazole Diamides as Selective Inhibitors of the NucleotideBinding Oligomerization Domain 2 (NOD2) Signaling Pathway. PLoS ONE 8(8): e69619. doi:10.1371/journal.pone.0069619）。

侵襲性歯周炎に対する治療／予防薬
本発明の一つの態様は、ＮＯＤ２活性の阻害剤を含有する、侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物に関する。別の言い方をすれば、本発明の一つの態様は、侵襲性歯周炎の治療用または予防用の医薬の製造における、ＮＯＤ２活性の阻害剤の使用に関する。さらに別の言い方をすれば、本発明の一つの態様は、ＮＯＤ２活性の阻害剤を対象に投与する工程を含む、侵襲性歯周炎の治療方法または予防方法に関する。

ＮＯＤ２活性の阻害剤としては、例えば、ＧＳＫ６６９（Rickard DJ, Sehon CA, Kasparcova V, Kallal LA, Zeng X, et al. (2013) Identification of Benzimidazole Diamides as Selective Inhibitors of the NucleotideBinding Oligomerization Domain 2 (NOD2) Signaling Pathway. PLoS ONE 8(8): e69619. doi:10.1371/journal.pone.0069619）、ＧＳＫ７１７、ＧＳＫ４００、およびそれらの類似体、アレーンクロム錯体（Bielig H, Velder J, Saiai A, Menning M, Meemboor S, et al. (2010) Anti-inflammatory arene-chromium complexes acting as specific inhibitors of NOD2 signaling. ChemMedChem 5: 2065-2071.）、クルクミン（Huang S, Zhao L, Kim K, Lee DS, Hwang DH (2008) Inhibition of Nod2 signaling and target gene expression by curcumin. Mol Pharmacol 74: 274-281.）を挙げることができるが、これらに限定はされない。阻害剤は、ＮＯＤ２に対して選択的な阻害剤（ＧＳＫ６６９、ＧＳＫ７１７、ＧＳＫ４００など）でも、非選択的な阻害剤（クルクミンなど）であってもよい。副作用を考慮して、薬効の範囲を限定するためには、選択的な阻害剤を用いることが好ましい。ＮＯＤ２活性の阻害剤は、抗体や、ＮＯＤ２のタンパク質発現に影響を与える核酸（アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡなど）であってもよい。

侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物は、錠剤や注射剤などの医薬組成物でありうる。侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物は、歯磨き粉や洗口液であってもよい。あるいは、侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物は、ガムやジュースなどの食品組成物であってもよい。

以下に、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、これらにより本発明は何ら制限を受けるものではない。

＜材料および方法＞
（参加者）
２０１３年４月から２０１５年３月まで、東京医科歯科大学の歯周病科に来院した９９例のＡｇＰ患者が参加した。ＡｇＰの診断は1999 International Workshop for a Classification of Periodontal Disease and Conditionsの基準に基づいて行われた。包含および除外の基準は以下のとおりである：診断基準は、急速なアタッチメントロスと骨の破壊、歯周炎の存在を除き臨床的に健康であること、ならびに家族集積性であった。除外基準は、両顎において１９歯未満であること、歯科矯正器具の使用、抗炎症薬の長期にわたる使用、または妊娠もしくは授乳していることであった。参加した患者の中にＩＢＤマッピングとエクソーム解析に適した複数の患者を有する家系が２つ見つかった（図１ｂ）。３世代家系である１つの家系では、罹患していない親類の１人もこの研究に参加することに同意した。東京医科歯科大学倫理委員会の承認（Ｎｏ．８９０）を得て、参加者全員に対して、採血やＤＮＡ分析などの研究参加に関するインフォームドコンセントを書面により行った。ゲノムＤＮＡは、標準的なプロトコールによって末梢血白血球から抽出した。

（一塩基多型（ＳＮＰ）マイクロアレイ遺伝子型解析およびＩＢＤマッピング）
５例の罹患患者および１例の健康な個体を含む２つの家系（図１ｂ）について、Human CoreExome BeadChip（Illumina）を用いた全ゲノムＳＮＰ遺伝子型解析を製造業者のプロトコールに従って行った。バリアントコーリング（variant calling）はGenomeStudio v1.0 Genotyping Module（Illumina）を用いて行った。サンプルについては０．９８以上、ＳＮＰについては０．９９以上のコールレートカットオフ閾値を適用し、過剰なヘテロ接合性を示すものは除外した。新たに開発されたノンパラメトリックな家系同一性（ＩＢＤ）解析を行った（Okada Y, Diogo D, Greenberg JD, Mouassess F, Achkar WA, Fulton RS, Denny JC, Gupta N, Mirel D, Gabriel S et al. 2014. Integration of sequence data from a consanguineous family with genetic data from an outbred population identifies plb1 as a candidate rheumatoid arthritis risk gene. PLoS One. 9(2):e87645.）。簡単に説明すると、この方法では、罹患者のサンプルにおいてホモ接合性遺伝子型の一方または両方を失う領域性ＩＢＤを探索するために、スライディングウインドウアプローチを用いて全ゲノムＳＮＰ遺伝子型データを使用する。１Ｍｂビンにわたるウインドウが、このビン内のすべてのＳＮＰ遺伝子型が１個以下のＳＮＰを除き上記の規則に従った場合、ＩＢＤとして定義され、ＩＢＤウインドウが２Ｍｂｐ長よりも続く場合にＩＢＤストレッチが定義された。このノンパラメトリックなＩＢＤマッピングのためのＪａｖａ（登録商標）ソフトウェアはhttp：//plaza.umin.ac.jp/~yokada/datasource/software.htmで公開されている。

（全エクソームシーケンシング）
全エクソームシーケンシング（ＷＥＳ）をＳＮＰマイクロアレイ遺伝子型決定に含めたものと同じサンプルについて行った。エクソンキャプチャーは、Ion Ampliseq Exome RDY Kit（Thermo Fisher）を用いて製造者のプロトコールに従って行った。簡単に説明すると、まず、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）をQubit 2.0蛍光光度計（Thermo Fisher）によって定量した。１００ｎｇのｇＤＮＡを用いて、多重ＰＣＲ増幅により、全てのエクソンを濃縮した。ＰＣＲサイクリングの完了後、固有のバーコードを各サンプルに適合させた。次にライブラリーを精製し、Ion Library Quantitation kit（Thermo Fisher）を用いてｑＰＣＲにより定量した。各ライブラリーを、エマルジョンＰＣＲのためにOne Touch OT 2（Thermo Fisher）を用いて処理し、濃縮のためにOneTouch ES（Thermo Fisher）を用いて処理した。配列決定はIon PI Chip Kit v2を用いてIon Protonシーケンサー（Thermo Fisher）上で行った。ｈｇ１９ヒト参照ゲノムとのアラインメントおよびバリアントコーリングは、Ion Torrent Suite Software v4.0（Thermo Fisher）によって処理した。病原性は、インシリコ予測ツール（PROVEAN、MutationTaster、SIFT、およびPolyPhen2）におけるバリアントによって予測した。

（機能アノテーションと変異のフィルタリング）
SnpEffとSnpSiftを用いて、機能アノテーションを行った。ｄｂＳＮＰ（ビルド１４１）データベースのＳＮＰ ＩＤをSnpSiftの“annotate”コマンドを使用してアノテートし、効果情報はSnpEffの“eff”コマンドを使用してアノテートした。フィルタリングパイプラインを表４に記す。

（サンガーシーケンシング）
候補変異は、サンガーシーケンシングにより確認を行った。プライマー配列は、ＮＯＤ２およびＯＢＳＣＮの候補変異を含む領域を増幅するように設計した。ＰＣＲ産物を精製し、BigDye terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Thermo Fisher）およびABI 3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems）によって配列を決定した。

（ターゲットシーケンシング）
Ion AmpliSeq Library Preparation Kit（Thermo Fisher）およびIonProton Systemを使用して、９４例の遺伝的に無関係なＡｇＰ患者について、ターゲットシーケンシングを行った。プライマーは、ＮＯＤ２の全１２個のコーディングエクソンを標的とするように設計した。

＜例１：２つのＡｇＰ家系のＩＢＤマッピング＞
診断時の平均年齢は３２．７±５．６歳であった。症例は男性４７例、女性５２例であり、いずれも日本人であった。そのうち３１例が喫煙者で、３４例が非喫煙者であった。残りの３４例については、喫煙状況に関する記録がなかった。２つの家系（家系１：ＡｇＰ患者３名と無影響の親族１名；家系２：のＡｇＰを発症した兄妹２名）について、原因変異を含むと予想される家系内のＩＢＤ（Identical-By-Descent）領域を同定するために、新たに開発されたノンパラメトリック連鎖解析を用いて、ＳＮＰをゲノムワイドに調査した。家系１の娘（ＩＩＩ−２）は、２８歳の時にＡｇＰと診断された。彼女は局所的に、特に歯茎切歯および第一臼歯について歯槽骨を失っており、歯肉は腫れていた（図１ａ、左）。家系２の両患者のＸ線写真（図１ａ、右）は、複数の歯がその支持骨を６５％以上失っていることを示し、そう長くはもたないと予想された。妹（ＩＩ−２）と兄（ＩＩ−１）はそれぞれ３２歳と３６歳であるが、両者の歯槽骨は病歴なしに、重度に失われていた（図１ａ、左）。連鎖解析を用いて、ＡｇＰ患者間で共有される５４．２Ｍｂｐ（ヒトゲノムの１．５２％）にわたる３２のＩＢＤ領域を同定した。

＜例２：エクソーム解析＞
それから、同じ２つの家系について全エクソーム塩基配列解読を行い、原因変異を同定した。平均３５，１５４，４１７リードをｈｇ１９ヒト参照ゲノムにマッピングした。標的比およびカバレッジの平均はそれぞれ９３．３６％および９３．０１％であった。Torrent Suite Software v4.0によって実施されたバリアントコーリング（variant calling）は、平均して４８，７３３のコーディング変異を同定した。フィルタリング後、家系１においては９６の変異、家系２においては３２１の変異がそれぞれ同定された。２つの家系間のフィルター後の変異を比較すると、１６ｑ１２のＮＯＤ２（ＭＩＭ：６０５９５６）と１ｑ４２のＯＢＳＣＮ（ＭＩＭ：６０８６１６）の２つの遺伝子のみが共通して検出された。患者において、これらの遺伝子はそれぞれ、２つのミスセンス変異を含んでいた。これらの候補変異をサンガーシーケンシングによってダブルチェックしたところ、家系２の患者の１人においてはＯＢＳＣＮ変異が見つからず、この結果は誤りであることが示された。一方、ＮＯＤ２ではｃ．３２８Ｇ＞Ａ（ｐ．Ａｌａ１１０Ｔｈｒ）とｃ．９３１Ｃ＞Ｔ（ｐ．Ａｒｇ３１１Ｔｒｐ）という２つの変異遺伝子型を確認できた（図２ｂ）。これらのＮＯＤ２の変異は、ゲノムワイドなＳＮＰのＩＢＤマッピングによって見出されるＩＢＤ領域内にあったが、ＯＢＳＣＮ候補変異はそうでなかった。２つの変異、ｃ．３２８Ｇ＞Ａおよびｃ．９３１Ｃ＞Ｔは既知の変異であり（ｒｓ５７１１０２６２０およびｒｓ１０４８９５４２７）、公的データベースによれば、それらの対立遺伝子頻度はＡｇＰの罹患率にも適合する：１０００人ゲノムプロジェクト（1000 Genomes Project）では０．２％および０．０９％、ＨＧＶＤでは０．２５％および０．７％、NHLBI ESPではデータなしおよび０．０２３％、ExACでは０．００７４％および０．０５％（表５）。

ＮＯＤ２は細胞質性タンパク質であり、パターン認識受容体として先天性免疫において重要な役割を担い、核因子κＢ（ＮＦκＢ）および分裂促進因子キナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達カスケードを促進する。また、サンガーシーケンシングにより、家系内のすべてのＡｇＰ患者が、ＮＯＤ２のいずれかの変異についてヘテロ接合性であることが確認された（図２ｂ）。どちらの変異も、高度に保存された座位においてＮＯＤ２のアミノ酸配列を変化させており（Ａｌａ１１０ＴｈｒおよびＡｒｇ３１１Ｔｒｐ）、Ａｌａ１１０Ｔｈｒ変異は、それぞれPolyPhen2.0およびSIFTによって「おそらく有害（PROBABLY DAMAGING）」および「有害（Damaging）」であると予測され、一方、Ａｒｇ３１１Ｔｒｐ変異は、評価した予測ツールのすべてによって、タンパク質機能に有害に影響すると予測された（表６）。なお、SIFTスコアの閾値は、バイナリ分類（有害（Damaging）vs許容（Tolerated））について０．０５に設定した。PolyPhen-2の出力は、おそらく有害（PROBABLY DAMAGING）、有害の可能性あり（POSSIBLY DAMAGING）、または良性（BENIGN）という予測であり、０．０（良性；BENIGN）から１．０（有害；DAMAGING）の範囲の数値を伴う。

＜例３：ターゲットエクソンシーケンシング＞
ＡｇＰの原因となるＮＯＤ２の他の変異の可能性を評価するため、Ion AmpliSeq Kit（Thermo Fisher）を用いて、９４例の遺伝的に関係の無いＡｇＰ患者において、ターゲットエクソンシーケンシングを行った。９４例のＡｇＰ患者のうち、この遺伝子に非同義変異を有する患者を５例（５．３％）同定した。その中から、３つの追加の変異（Ｈｉｓ３７０Ｔｙｒ、Ａｒｇ４５９Ｃｙｓ、Ａｌａ８６８Ｔｈｒ）が同定され、それらは、ヒトの遺伝子変異に関する最新の公的データベース（HGVD、NHLBI ESP、1000 Genomes Project、およびExAC）によると、アジア人集団においては存在しないか、または稀であるかのいずれかであった（マイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）≦０．００１）。また、Ａｒｇ３１１Ｔｈｒ変異は２例の患者において同定され、これはサンガーシーケンシングによって確認された（図２ｂ）。本研究では、ＮＯＤ２に２つ以上の稀なミスセンス変異を持つ患者は同定されなかった。

本明細書には、本発明の好ましい態様を示してあるが、そのような態様が単に例示の目的で提供されていることは、当業者には明らかであり、当業者であれば、本発明から逸脱することなく、様々な変形、変更、置換を加えることが可能であろう。本明細書に記載されている発明の様々な代替的実施形態が、本発明を実施する際に使用されうることが理解されるべきである。また、本明細書中において参照している特許および特許出願書類を含む、全ての刊行物に記載の内容は、その引用によって、本明細書中に明記された内容と同様に取り込まれていると解釈すべきである。

本発明者らは、侵襲性歯周炎とＮＯＤ２遺伝子中の変異の関係を明らかにした。ＮＯＤ２遺伝子中の変異を同定することにより、侵襲性歯周炎の有無、またはその発症傾向をｉｎ ｖｉｔｒｏで検査することができる。このような検査は、侵襲性歯周炎の確定診断に有用である。また、侵襲性歯周炎の遺伝的素因を発症前に検出できることから、予防や早期の治療が可能となる。

Claims (8)

1. ＮＯＤ２遺伝子中の少なくとも１つの変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法。
2. ヒトＮＯＤ２タンパク質（配列番号１）中の１１０位、３１１位、３７０位、４５９位および／または８６８位のアミノ酸残基における変異を同定することを特徴とする、請求項１記載の検査方法。
3. ヒトＮＯＤ２遺伝子塩基配列（配列番号２）中の３２８位、９３１位、１１０８位、１３７５位および／または２６０２位の塩基における変異を同定することを特徴とする、請求項１記載の検査方法。
4. ＮＯＤ２遺伝子中の少なくとも１つの変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法に用いるための少なくとも１つのプライマーまたはプローブを含むキット。
5. ＮＯＤ２遺伝子中の少なくとも１つの変異を同定する工程を含む、侵襲性歯周炎のｉｎ ｖｉｔｒｏ検査方法に用いるための少なくとも１つのプライマーまたはプローブを含む組成物。
6. 侵襲性歯周炎の予防または治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、ｉ）in vitroでＮＯＤ２タンパク質と試験物質とを接触させる工程、ｉｉ）ＮＯＤ２タンパク質の活性を測定する工程、およびｉｉｉ）該試験物質がＮＯＤ２タンパク質の活性を低下させるか否かを決定する工程を含む、方法。
7. ＮＯＤ２活性の阻害剤を含有する、侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物。
8. ＧＳＫ６６９、ＧＳＫ７１７、ＧＳＫ４００、アレーンクロム錯体、およびクルクミンから成る群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する、侵襲性歯周炎の治療または予防に用いるための組成物。