JP2019000060A - 白内障の誘導方法、白内障のモデル生物、白内障の予防剤ならびに治療剤のスクリーニング方法、および、白内障誘導剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】従来とは異なる糖尿病の発症モデルを開発するとともに、当該発症モデルを利用した技術を提供することを目的とする。【解決手段】水晶体のＤＮＡに損傷を与えることによって、白内障を誘導する。【選択図】なし
Description
本発明は、白内障の誘導方法、白内障のモデル生物、白内障の予防剤ならびに治療剤のスクリーニング方法、および、白内障誘導剤に関する。
白内障は、水晶体が混濁（例えば、白濁）することによって、視力が低下する疾患である。白内障の罹患者では、一般的に、水晶体の、核、皮質、または、後嚢下などに混濁が生じる。
白内障の種類としては、加齢白内障、および、糖尿病白内障などが挙げられる。加齢白内障は、罹患者の数が最も多い白内障である。加齢白内障の場合、加齢に伴って罹患者の数が増加し、６０歳代の日本人の約６６〜８５％、７０歳代の日本人の約８４〜９７％が加齢白内障を患っているという報告がある。一方、糖尿病白内障の場合、発症が比較的早期であり、４０歳代でも発症し得ることが知られている。
白内障を治すには、現時点では外科手術しか手段がない。白内障の進行を予防するための点眼剤として、グルタチオン製剤およびピレノキシン製剤が認可されてはいるが（非特許文献１および２参照）、これらの製剤を点眼していても混濁が進行し、手術を受けるに至る場合が多いのが現状である。それ故に、確実な予防効果を有する製剤の開発が求められている。
白内障の治療方法の開発、および、白内障の予防剤（または、治療剤）の開発を進めるにあたっては、白内障を誘導するための発症モデルが必要である。例えば、白内障の治療方法（または、治療剤）を開発する場合、まず、白内障の症状を示す水晶体を作製する必要がある。そして、当該水晶体に対して、新規な治療方法（または、新規な治療剤）を施し、これによって白内障の症状が緩和されれば、当該新規な治療方法（または、新規な治療剤）は、白内障の治療に有効であると考えることができる。一方、白内障の予防剤の開発を進める場合、水晶体と新規な予防剤とを接触させ、その後で、水晶体に対して白内障を誘導するための処置を施す。このとき、水晶体が白内障を発症しなければ、当該新規な予防剤は、白内障の予防に有効であると考えることができる。
上述したように、白内障に関連する分野において、白内障を誘導するための発症モデルは、極めて重要である。このような発症モデルとして、現在、ガラクトース添加培地を用いた、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて糖尿病白内障を誘導する発症モデルが用いられている（非特許文献３参照）。
Matensson.J et.al. (1989) Glutathione ester prevents buthionine sulfoximine-induced cataracts and lens epithelial cell damage, Proc Natl Acad Sci U S A, vol.86, pp.8727-8731.
Ciuffi.M et.al. (1999) Protective Effect of Pirenoxine and U74389F on Induced Lipid Peroxidation in Mammalian Lenses. An in vitro, ex vivo and in vivo study, EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, vol.68, pp.347-359.
Takamura.Y et al. (2003) Apoptotic cell death in the lens epithelium of rat sugar cataract. EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, vol.77, pp.51-57.
しかしながら、ガラクトース添加培地を用いた発症モデルは、糖尿病白内障を誘導するための発症モデルであって、糖尿病白内障以外の白内障を誘導するための発症モデルではない。現在、糖尿病白内障以外の白内障の治療方法および予防剤（または、治療剤）の開発に用いることができる発症モデルは存在せず、糖尿病白内障を誘導するメカニズムとは異なるメカニズムを介して白内障を誘導する発症モデルの開発が望まれている。
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、従来とは異なる糖尿病の発症モデルを開発するとともに、当該発症モデルを利用した技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、ガラクトースなどの糖を用いることなく、ＤＮＡに損傷を与えることによって白内障を誘導することができることを見出し、本発明を完成するに至った。なお、本発明は、ガラクトースなどの糖を用いていないことから、糖尿病白内障を誘導するメカニズムとは異なるメカニズムを用いた、白内障を誘導する技術であると考え得る。本発明の一実施形態は、以下の構成からなるものである。
＜１＞採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程を有する、白内障の誘導方法。
＜２＞上記白内障は、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、または、糖尿病白内障である、＜１＞に記載の白内障の誘導方法。
＜３＞上記損傷工程は、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体に所定の強度の刺激を加えることによって、ＤＮＡに損傷を与える工程であり、上記刺激は、当該刺激を加えた後の当該水晶体の断面の一部分のみが混濁する程度の強度の刺激である、＜１＞または＜２＞に記載の白内障の誘導方法。
＜４＞上記損傷工程は、以下の（ｉ）および／または（ｉｉ）を包含する、＜１＞〜＜３＞の何れかに記載の白内障の誘導方法：
（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線を照射すること、
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。
（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線を照射すること、
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。
＜５＞＜１＞〜＜４＞の何れかに記載の方法によって得られる、白内障のモデル生物。
＜６＞採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、上記接触工程の後で、上記採取された水晶体のＤＮＡ、または、上記非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、を有する、白内障の予防剤のスクリーニング方法。
＜７＞採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、上記損傷工程の後で、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、を有する、白内障の治療剤のスクリーニング方法。
＜８＞ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を有効成分として含有している、白内障誘導剤。
＜９＞上記ＤＮＡの損傷を引き起こす物質は、ＤＮＡのアルキル化、ＤＮＡの切断、ＤＮＡへの化合物の付加、または、ＤＮＡへの塩基類似体の挿入を引き起こすものである、＜８＞に記載の白内障誘導剤。
本発明の一態様によれば、糖による発症メカニズムとは異なる発症メカニズムを用いて、白内障を誘導することができる。
本発明の一態様によれば、糖による発症メカニズムとは異なる発症メカニズムを標的とした、糖尿病用の新たな予防剤、および、治療剤をスクリーニングすることができる。
本発明の一態様によれば、糖による発症メカニズムとは異なる発症メカニズムを用いて白内障を誘導することができる、新たな白内障誘導剤を提供することができる。
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態及び実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態及び実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。本明細書中、数値範囲に関して「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
〔１．用語の定義〕
［１−１．白内障］
本明細書において「白内障」とは、水晶体に混濁（例えば、白濁）を生じる疾患を意図する。白内障によって水晶体に生じる混濁には、例えば、皮質混濁；核混濁；後嚢下混濁；皮質スポーク状混濁；前嚢下混濁；線維ひだ、水隙、または、核周囲の徹照下点状混濁；水疱；点状混濁；冠上混濁などの類型がある。「白内障」の種類としては、加齢白内障、および、併発白内障（例えば、糖尿病白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、および、ステロイド白内障）などを挙げることができる。
［１−１．白内障］
本明細書において「白内障」とは、水晶体に混濁（例えば、白濁）を生じる疾患を意図する。白内障によって水晶体に生じる混濁には、例えば、皮質混濁；核混濁；後嚢下混濁；皮質スポーク状混濁；前嚢下混濁；線維ひだ、水隙、または、核周囲の徹照下点状混濁；水疱；点状混濁；冠上混濁などの類型がある。「白内障」の種類としては、加齢白内障、および、併発白内障（例えば、糖尿病白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、および、ステロイド白内障）などを挙げることができる。
「糖尿病白内障」とは、血液中または血漿中のグルコース濃度が持続的に上昇している状態によって特徴づけられる疾患（例えば、高血糖症、または、糖尿病（例えば、一型糖尿病、または、二型糖尿病））の罹患者に発症している、水晶体の混濁を意図する。糖尿病白内障では、水晶体の皮質または後嚢下に混濁が生じることが多いことが大規模疫学調査で知られているが、混濁の生じる箇所はこれらに限定されない。
本発明の対象となる白内障は、特に限定されないが、例えば、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、および、糖尿病白内障を挙げることができる。
［１−２．予防剤］
本明細書において「予防剤」とは、予防効果をもたらす薬剤を意図する。当該予防効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。
（１）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の発症を防止する、または、発症のリスクを低減する。
（２）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の再発を防止する、または、再発のリスクを低減する。
（３）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、または、兆候が生じるリスクを低減する。
本明細書において「予防剤」とは、予防効果をもたらす薬剤を意図する。当該予防効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。
（１）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の発症を防止する、または、発症のリスクを低減する。
（２）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の再発を防止する、または、再発のリスクを低減する。
（３）予防剤を投与しなかった場合と比較して、予防剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の兆候が生じることを防止する、または、兆候が生じるリスクを低減する。
なお、疾患に係る１つ以上の症状は、全身的なものであってもよいし、局所的なものであってもよい。
［１−３．治療剤］
本明細書において「治療剤」とは、治療効果をもたらす薬剤を意図する。当該治療効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。
（１）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。
（２）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または、重症度の進行を防止する。
（３）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または、重症度の進行速度を低減する。
本明細書において「治療剤」とは、治療効果をもたらす薬剤を意図する。当該治療効果とは、以下に例示される効果を意図するが、これらに限定されるものではない。
（１）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度を低減する。
（２）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加、または、重症度の進行を防止する。
（３）治療剤を投与しなかった場合と比較して、治療剤を投与した場合には、疾患に係る１つ以上の症状の重症度の増加速度、または、重症度の進行速度を低減する。
なお、疾患に係る１つ以上の症状は、全身的なものであってもよいし、局所的なものであってもよい。
〔１．白内障誘導剤〕
本実施の形態の白内障誘導剤は、ＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡなど）の損傷を引き起こす物質を有効成分として含有している。
本実施の形態の白内障誘導剤は、ＤＮＡ（例えば、染色体ＤＮＡなど）の損傷を引き起こす物質を有効成分として含有している。
上記物質によってＤＮＡに引き起こされる損傷は、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡのアルキル化、ＤＮＡの切断（例えば、一本鎖ＤＮＡの切断、または、二本鎖ＤＮＡの切断）、ＤＮＡへの化合物の付加（例えば、ＤＮＡの欠失、ＤＮＡの挿入、または、塩基ミスマッチを引き起こすもの）、または、ＤＮＡへの塩基類似体の挿入があり得る。
上記損傷がＤＮＡのアルキル化である場合、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質が、直接的にＤＮＡをアルキル化してもよいし、間接的にＤＮＡをアルキル化（例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質によって誘導された他の物質がＤＮＡをアルキル化）してもよい。ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の具体例としては、ＭＭＳ（methyl methane sulfonate）、ＥＭＳ（ethyl methane sulfonate）、シクロホスファミド（Cyclophosphamide）、メクロレタミン（Mechlorethamine）、ウラムスチン（Uramustine）、メルファラン（Melphalan）、クロラムブシル（Chlorambucil）、イホスファミド（Ifosfamide）、ベンダムスチン（Bendamustine）、カルムスチン（Carmustine）、ロムスチン（Lomustine）、ストレプトゾシン（Streptozocin）、ブスルファン（Busulfan）、ニトロソグアニジン（nitrosoguanidine）、ニトロソアミン、および、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレアを挙げることができる。
上記損傷がＤＮＡの切断である場合、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質が、直接的にＤＮＡを切断してもよいし、間接的にＤＮＡを切断（例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質によって誘導された他の物質（例えば、フリーラジカル）がＤＮＡを切断）してもよい。ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の具体例としては、ブレオマイシン、および、ネオカルジノスタチンを挙げることができる。
上記損傷がＤＮＡへの化合物の付加である場合、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質が、直接的にＤＮＡに付加してもよいし、間接的にＤＮＡへ化合物を付加（例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質によって誘導された他の物質がＤＮＡを架橋）してもよい。ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の具体例としては、シスプラチン（Cisplatin）、オキサリプラチン（Oxaliplatin）、カルボプラチン（Carboplatin）、ネダプラチン（Nedaplatin）、サトラプラチン（Satraplatin）、トリプラチン テトラニトレート（Triplatin tetranitrate）、ベンゾピレン、臭化エチジウム、クリセン、マイトマイシンＣ（Mitomycin C）、アンゲリシン（Angelicin）、ソラレン、および、トリオキシサレンを挙げることができる。
上記損傷がＤＮＡへの塩基類似体の挿入である場合、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質が、直接的にＤＮＡに挿入されてもよいし、間接的にＤＮＡへ塩基類似体を挿入（例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質によって誘導された塩基類似体がＤＮＡへ挿入）してもよい。ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の具体例としては、ＢｒｄＵ、および、ＥｄＵを挙げることができる。
本実施の形態の白内障誘導剤によって誘導される白内障としては、特に限定されないが、例えば、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、および、糖尿病白内障を挙げることができる。
本実施の形態の白内障誘導剤は、液体状の剤型であってもよいし、固体状の剤型であってもよい。本実施の形態の白内障誘導剤が液体状の剤型である場合には、有効成分と、必要に応じて有効成分以外の成分とを、所望の溶媒に溶かすことによって、白内障誘導剤を作製することができる。上記溶媒は、水晶体に対して毒性が低いものであればよく、例えば、水、および、生理的食塩水であってもよい。本実施の形態の白内障誘導剤が固体状の剤型である場合には、有効成分と、必要に応じて有効成分以外の成分とを、混合することによって、白内障誘導剤を作製することができる。なお、本実施の形態の白内障誘導剤の製造方法は、特に限定されず、公知の方法に従えばよい。
本実施の形態の白内障誘導剤は、有効成分以外の成分を含有していてもよい。
上記有効成分以外の成分としては、特に限定されないが、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、防腐剤、抗酸化剤、高分子量重合体、賦形剤、担体、希釈剤、溶媒、可溶化剤、安定剤、充填剤、結合剤、界面活性剤、安定化剤等が挙げられる。
上記緩衝剤の例としては、リン酸またはリン酸塩、ホウ酸またはホウ酸塩、クエン酸またはクエン酸塩、酢酸または酢酸塩、炭酸または炭酸塩、酒石酸または酒石酸塩、ε−アミノカプロン酸、トロメタモール等が挙げられる。上記リン酸塩としては、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等が挙げられる。上記ホウ酸塩としては、ホウ砂、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム等が挙げられる。上記クエン酸塩としては、クエン酸ナトリウム、クエン酸二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム等が挙げられる。上記酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等が挙げられる。上記炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等が挙げられる。上記酒石酸塩としては、酒石酸ナトリウム、酒石酸カリウム等が挙げられる。
ｐＨ調整剤の例としては、塩酸、リン酸、クエン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
上記等張化剤の例としては、イオン性等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等）、非イオン性等張化剤（グリセリン、プロピレングリコール、ソルビトール、マンニトール等）が挙げられる。
上記防腐剤の例としては、ベンザルコニウム塩化物、ベンザルコニウム臭化物、ベンゼトニウム塩化物、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、クロロブタノール等が挙げられる。
上記抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム等が挙げられる。
上記高分子量重合体の例としては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、アテロコラーゲン等が挙げられる。
本実施の形態の白内障誘導剤は、所定の強度の刺激を水晶体に加えることができる濃度の有効成分を含有していることが好ましい。なお、「所定の強度の刺激」については、後述する〔２．白内障の誘導方法〕にて、詳細に説明する。当該構成であれば、重度の症状の白内障ではなく、中度〜軽度の症状の白内障を誘導することができる。重度の症状の白内障の場合には、当該白内障を予防または治療することは難しい。一方、中度〜軽度の症状の白内障の場合には、当該白内障を予防または治療することは容易である。つまり、当該構成であれば、後述するスクリーニング方法において、スクリーニングの感度を向上させ、これによって、白内障の予防剤および治療剤を容易にスクリーニングすることができる。
本実施の形態の白内障誘導剤に含有されている有効成分の量は、特に限定されず、例えば、白内障誘導剤を１００重量％とした場合に、０．００１重量％〜１００重量％であってもよく、０．０１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜１００重量％であってもよく、０．１重量％〜９５重量％であってもよく、０．１重量％〜９０重量％であってもよく、０．１重量％〜８０重量％であってもよく、０．１重量％〜７０重量％であってもよく、０．１重量％〜６０重量％であってもよく、０．１重量％〜５０重量％であってもよく、０．１重量％〜４０重量％であってもよく、０．１重量％〜３０重量％であってもよく、０．１重量％〜２０重量％であってもよく、０．１重量％〜１０重量％であってもよい。
本実施の形態の白内障誘導剤に含有されている有効成分の量は、また、例えば、１ｍＬの白内障誘導剤あたり、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであってもよく、１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであってもよく、１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬであってもよく、１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであってもよい。
本実施の形態の白内障誘導剤に含有されている有効成分の濃度は、また、例えば、白内障誘導剤において、１ｎＭ〜１Ｍであってもよく、１ｎＭ〜１００ｍＭであってもよく、１ｎＭ〜５０ｍＭであってもよく、１ｎＭ〜１０ｍＭであってもよく、１ｎＭ〜５ｍＭであってもよく、１ｎＭ〜１ｍＭであってもよい。
本実施の形態の治療剤に含有されている有効成分以外の成分の量は、特に限定されず、例えば、治療剤を１００重量％とした場合に、０重量％〜９９．９９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９９重量％であってもよく、０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５重量％〜９９．９重量％であってもよく、１０重量％〜９９．９重量％であってもよく、２０重量％〜９９．９重量％であってもよく、３０重量％〜９９．９重量％であってもよく、４０重量％〜９９．９重量％であってもよく、５０重量％〜９９．９重量％であってもよく、６０重量％〜９９．９重量％であってもよく、７０重量％〜９９．９重量％であってもよく、８０重量％〜９９．９重量％であってもよく、９０重量％〜９９．９重量％であってもよい。
本実施の形態の治療剤に含有されている有効成分以外の成分の量は、また、例えば、１ｍＬの白内障誘導剤あたり、０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、０ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬであってもよく、０ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬであってもよく、０ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬであってもよく、０ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬであってもよい。
本実施の形態の白内障誘導剤に含有されている有効成分以外の成分の濃度は、また、例えば、白内障誘導剤において、０ｎＭ〜１Ｍであってもよく、０ｎＭ〜１００ｍＭであってもよく、０ｎＭ〜１０ｍＭであってもよく、０ｎＭ〜５ｍＭであってもよく、０ｎＭ〜１ｍＭであってもよい。
〔２．白内障の誘導方法〕
本実施の形態の白内障の誘導方法は、採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程を有している。
本実施の形態の白内障の誘導方法は、採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程を有している。
本実施の形態の誘導方法によって誘導される白内障としては、特に限定されないが、例えば、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、および、糖尿病白内障を挙げることができる。
上記損傷は、特に限定されないが、例えば、ＤＮＡのアルキル化、ＤＮＡの切断（例えば、一本鎖ＤＮＡの切断、または、二本鎖ＤＮＡの切断）、ＤＮＡへの化合物の付加（例えば、ＤＮＡの欠失、ＤＮＡの挿入、または、塩基ミスマッチを引き起こすもの）、または、ＤＮＡへの塩基類似体の挿入であり得る。
上記水晶体は、生体から採取された水晶体であってもよいし、生体が非ヒト生物である場合には、生体内に保持されている水晶体であってもよい。上記生体としては、特に限定されず、例えば、ヒト、および、非ヒト生物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラットなどの、ヒト以外の哺乳類）を挙げることができる。
上記損傷工程は、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体に所定の強度の刺激（例えば、紫外線、放射線、または、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質など）を加えることによって、ＤＮＡに損傷を与える工程であってもよい。この場合、できるだけ弱い強度の刺激を水晶体に加えることが好ましい。当該構成であれば、重度の症状の白内障ではなく、中度〜軽度の症状の白内障を誘導することができる。重度の症状の白内障の場合には、当該白内障を予防または治療することは難しい。一方、中度〜軽度の症状の白内障の場合には、当該白内障を予防または治療することは容易である。つまり、当該構成であれば、後述するスクリーニング方法において、スクリーニングの感度を向上させ、これによって、白内障の予防剤および治療剤を容易にスクリーニングすることができる。
上記刺激の強度は、損傷工程に先立って、予め決定することができる。刺激の強度の決定方法の一例について、以下に説明する。勿論、本発明は、以下の決定方法に限定されない。また、刺激の種類は、特に限定されない。
上記刺激は、採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に刺激を加えてから所定の時間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、７日間、１０日間など）が経過してから当該水晶体の断面を観察した場合に、断面の一部分のみ（換言すれば、断面の全体では無く、一部分のみ）が混濁する強度の刺激であることが好ましい。
水晶体の断面の全面積を「Ａ」とし、当該断面において混濁している箇所の面積を「ａ」とした場合、「ａ／Ａ」の値は、特に限定されないが、「０＜ａ／Ａ＜１．０」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．９」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．８」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．７」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．６」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．５」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．４」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．３」、より好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．２」、最も好ましくは「０＜ａ／Ａ＜０．１」である。なお、上述した「ａ／Ａ」の値の下限値は、「０」に限定されず、例えば、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７、または、０．０９であってもよい。
水晶体の断面の観察は、市販の顕微鏡を用いて行うことができる。このとき、断面の写真をとり、市販の画像解析ソフトを用いて解析することにより、混濁が生じている領域を特定することができる。例えば、水晶体の断面の写真をとり、当該断面を複数の領域に細分化し、各領域における白色度を複数の段階（例えば、３段階、５段階、７段階、または、１０段階など）に評価する。そして、白色度の高い段階（例えば、最も白色度が高い段階、最も白色度が高い段階および２番目に白色度が高い段階、など）に評価された領域を、混濁が生じている領域として特定することができる。
上記損傷工程は、以下の（ｉ）または（ｉｉ）を包含することが可能である：
（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線（例えば、α線、β線、γ線、または、Ｘ線）を照射すること、または、
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。
（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線（例えば、α線、β線、γ線、または、Ｘ線）を照射すること、または、
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。
換言すれば、上記損傷工程では、上記の（ｉ）または（ｉｉ）によって、上述した所定の強度の刺激を水晶体に加え、これによって、ＤＮＡに損傷を与えてもよい。
上記水晶体に対して照射される紫外線、または、放射線の線量は、特に限定されない。例えば、様々な生物種（例えば、酵母、および、ショウジョウバエ）において突然変異体を作製する時に用いる線量であり得る。
上記水晶体に対して接触させるＤＮＡの損傷を引き起こす物質の濃度は、特に限定されない。例えば、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の濃度を、１ｎｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜１ｍｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５００μｇ／ｍＬ、または、１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬに調整した水溶液を準備し、当該水溶液と、水晶体とを接触させてもよい。また、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の濃度を、１ｎＭ〜１Ｍ、１ｎＭ〜１００ｍＭ、１ｎＭ〜５０ｍＭ、１ｎＭ〜１０ｍＭ、１ｎＭ〜５ｍＭ、または、１ｎＭ〜１ｍＭに調整した水溶液を準備し、当該水溶液と水晶体とを接触させてもよい。
ＤＮＡの損傷を引き起こす物質としては、〔１．白内障誘導剤〕の欄で既に説明した具体的な物質を用いることができる。
本実施の形態の白内障の誘導方法は、損傷工程の後で、ＤＮＡに損傷を与えられた水晶体を培養する培養工程を有していてもよい。当該構成によれば、白内障を誘導するための時間を確保することができる。
培養工程の時間は、特に限定されず、水晶体に加える刺激の強度に応じて、適宜、設定すればよい。培養工程の時間は、例えば、１日間〜１０日間、１日間〜７日間、１日間〜４日間、１日間〜４日間、１日間〜３日間、または、１日間〜２日間であってもよい。重度の症状の白内障ではなく、中度〜軽度の症状の白内障を誘導するという観点からは、１日間〜４日間が好ましく、３日間〜４日間が更に好ましく、４日間が最も好ましい。
培養工程では、生体内に保持されている水晶体を生体内に保持された状態で維持してもよいし、生体から採取した水晶体を培地中で培養してもよい。当該培地としては、特に限定されないが、例えば、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いることができる。
〔３．白内障のモデル生物〕
本実施の形態の白内障のモデル生物は、上述した〔２．白内障の誘導方法〕に記載の方法によって得られるモデル生物である。例えば、当該モデル生物を用いれば、後述する〔４．白内障の予防剤または治療剤のスクリーニング方法〕を行うことができる。また、当該モデル生物を用いれば、白内障の発症メカニズムを解明することができる。
本実施の形態の白内障のモデル生物は、上述した〔２．白内障の誘導方法〕に記載の方法によって得られるモデル生物である。例えば、当該モデル生物を用いれば、後述する〔４．白内障の予防剤または治療剤のスクリーニング方法〕を行うことができる。また、当該モデル生物を用いれば、白内障の発症メカニズムを解明することができる。
上記モデル生物は、生体そのものであってもよいし、生体から採取された組織（例えば、水晶体）であってもよい。上記生体としては、ヒト、および、非ヒト生物（例えば、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、および、ラットなどの、ヒト以外の哺乳類）を挙げることができる。
より具体的に、本実施の形態の白内障のモデル生物は、採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程によって得られるものであり得る。
本実施の形態の白内障のモデル生物では、上記白内障は、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、または、糖尿病白内障であり得る。
本実施の形態の白内障のモデル生物では、上記損傷工程は、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体に所定の強度の刺激を加えることによって、ＤＮＡに損傷を与える工程であり、上記刺激は、当該刺激を加えた後の当該水晶体の断面の一部分のみが混濁する程度の強度の刺激であり得る。
本実施の形態の白内障のモデル生物では、上記損傷工程は、以下の（ｉ）および／または（ｉｉ）を包含し得る：（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線を照射すること、（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。
本実施の形態の白内障のモデル生物では、水晶体のＤＮＡの様々な箇所に、様々な種類の損傷が与えられていると考えられる。出願時において、これらを特定することは、困難を極め、過大な経済的支出や時間を要する。
それ故に、本願には、出願時において、本実施の形態の白内障のモデル生物を構造または特性などにより直接特定することが不可能である、または、実際的でない事情が存在する。
〔４．白内障の予防剤または治療剤のスクリーニング方法〕
本実施の形態の白内障の予防剤のスクリーニング方法は、採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、当該接触工程の後で、上記採取された水晶体のＤＮＡ、または、上記非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、を有している。
本実施の形態の白内障の予防剤のスクリーニング方法は、採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、当該接触工程の後で、上記採取された水晶体のＤＮＡ、または、上記非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、を有している。
一方、本実施の形態の白内障の治療剤のスクリーニング方法は、採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、当該損傷工程の後で、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、を有している。
上記白内障としては、特に限定されないが、例えば、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、および、糖尿病白内障を挙げることができる。
損傷工程については既に説明したので、その説明を省略する。以下では、接触工程について説明する。
上記接触工程では、採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる。
上記被検物質は、白内障の予防剤または治療剤に含まれる有効成分の候補となる物質であって、その具体的な構成は、限定されない。被検物質は、低分子化合物、または、高分子化合物であってもよい。また、被検物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、糖、または、これらの複合体であってもよい。
水晶体と被検物質との接触は、培地中で培養されている水晶体と被検物質とを接触させることによって行うことも可能であるし、生体内に保持されている水晶体と被検物質とを接触させることによって行うことも可能である。上記培地としては、特に限定されず、例えば、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いることができる。
本実施の形態の白内障の予防剤のスクリーニング方法は、損傷工程の後（例えば、損傷工程の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、７日後、または、１０日後）で、水晶体の断面において混濁している領域を検出するための検出工程を有していてもよい。また、本実施の形態の白内障の治療剤のスクリーニング方法は、接触工程の後（例えば、接触工程の１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、７日後、または、１０日後）で、同様に、水晶体の断面において混濁している領域を検出するための検出工程を有していてもよい。
上記検出工程において、被検物質と接触した水晶体の断面において混濁している領域の面積が、被検物質と接触していない水晶体の断面において混濁している領域の面積よりも小さくなっていれば、当該被検物質を、白内障の予防剤または治療剤の有効成分として用いることができる。
より具体的に、上記検出工程において、被検物質と接触していない水晶体の断面において混濁している領域の面積を１００％とした場合、被検物質と接触した水晶体の断面において混濁している領域の面積が、好ましくは９０％以下、より好ましくは８０％以下、より好ましくは７０％以下、より好ましくは６０％以下、より好ましくは５０％以下、より好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下、最も好ましくは１０％以下であれば、当該被検物質を、白内障の予防剤または治療剤の有効成分として用いることができる。
なお、混濁している領域は、市販の顕微鏡を用いて特定することができる。例えば、水晶体の断面の写真をとり、市販の画像解析ソフトを用いて解析することにより、混濁している領域を特定することができる。より具体的に、水晶体の断面の写真をとり、当該断面を複数の領域に細分化し、各領域における白色度を複数の段階（例えば、３段階、５段階、７段階、または、１０段階など）に評価する。そして、白色度の高い段階（例えば、最も白色度が高い段階、最も白色度が高い段階および２番目に白色度が高い段階、など）に評価された領域を、混濁が生じている領域として特定することができる。勿論、混濁している領域の特定は、当該方法以外の周知の方法によっても行うことができる。
＜試験１＞
６週齢のＳＤラット（三協ラボサービス社製）の左右の眼球から、水晶体を摘出した。右眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて培養した。一方、左眼から摘出した水晶体は、（ｉ）Ｍ１９９培地に、４ｍＭ、２ｍＭ、若しくは、１ｍＭのＭＭＳ（methyl methanesulfonate）を添加した培地、または、（ｉｉ）Ｍ１９９培地に、８００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、若しくは、２００μｇ／ｍＬのブレオマイシンを添加した培地、を用いて培養した。
６週齢のＳＤラット（三協ラボサービス社製）の左右の眼球から、水晶体を摘出した。右眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて培養した。一方、左眼から摘出した水晶体は、（ｉ）Ｍ１９９培地に、４ｍＭ、２ｍＭ、若しくは、１ｍＭのＭＭＳ（methyl methanesulfonate）を添加した培地、または、（ｉｉ）Ｍ１９９培地に、８００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、若しくは、２００μｇ／ｍＬのブレオマイシンを添加した培地、を用いて培養した。
各水晶体の培養にはインキュベーターを使用し、当該インキュベーター内の温度を３７℃に保った。培養開始から４日後に、培地から各水晶体を取り出し、ＳＺＸ１２（Ｏｌｙｍｐａｓ社製）を用いて顕微鏡観察を行った。
図１に、ＭＭＳの試験結果を示し、図２に、ブレオマイシン（ＢＭ：bleomycin）の試験結果を示す。図１および図２から明らかなように、ＭＭＳ、および、ブレオマイシンは、何れも、濃度依存的に、水晶体に混濁（具体的には、白濁）を発生させた。このことは、ＭＭＳ、および、ブレオマイシンが、何れも、白内障を誘導する能力を有していることを示している。
また、本実施例は糖を用いずに白内障を誘導していることから、誘導された白内障は、糖尿病白内障のみならず、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、または、ステロイド白内障のモデルとして用いることが可能な白内障であると考えられる。
また、水晶体の断面の全面積を「Ａ」とし、当該断面において混濁している箇所の面積を「ａ」とした場合、本実施例における「ａ／Ａ」の値は、何れのデータも「０＜ａ／Ａ＜１．０」を満たしていた。
また、ＭＭＳは、ＤＮＡをアルキル化することによって、ＤＮＡに損傷を引き起こす物質であり、一方、ブレオマイシンは、フリーラジカルによってＤＮＡを切断することによって、ＤＮＡに損傷を引き起こす物質である。つまり、ＭＭＳと、ブレオマイシンとでは、ＤＮＡに引き起こされる損傷の種類が異なっている。そして、損傷の種類が異なっていても白内障を誘導化できるということは、本願発明では、ＤＮＡに損傷を引き起こす方法、および、ＤＮＡに損傷を引き起こす薬剤の種類が限定されないことを示している。
＜試験２＞
６週齢のＳＤラット（三協ラボサービス社製）の左右の眼球から、水晶体を摘出した。右眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて培養した。一方、左眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地に、４００ｍＭ、４０ｍＭ、４ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または、０．１ｍＭのＭＭＳ（methyl methanesulfonate）を添加した培地、を用いて培養した。
６週齢のＳＤラット（三協ラボサービス社製）の左右の眼球から、水晶体を摘出した。右眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ社製）を用いて培養した。一方、左眼から摘出した水晶体は、Ｍ１９９培地に、４００ｍＭ、４０ｍＭ、４ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、または、０．１ｍＭのＭＭＳ（methyl methanesulfonate）を添加した培地、を用いて培養した。
各水晶体の培養にはインキュベーターを使用し、当該インキュベーター内の温度を３７℃に保った。培養開始から１日後、２日後、または、４日後に、培地から各水晶体を取り出し、ＳＺＸ１２（Ｏｌｙｍｐａｓ社製）を用いて顕微鏡観察を行った。
図３および図４に、ＭＭＳの試験結果を示す。図３および図４から明らかなように、ＭＭＳは、濃度依存的に、水晶体に混濁（具体的には、白濁）を発生させた。このことは、ＭＭＳが、白内障を誘導する能力を有していることを示している。
また、本実施例は糖を用いずに白内障を誘導していることから、誘導された白内障は、糖尿病白内障のみならず、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、または、ステロイド白内障のモデルとして用いることが可能な白内障であると考えられる。
また、水晶体の断面の全面積を「Ａ」とし、当該断面において混濁している箇所の面積を「ａ」とした場合、本実施例における「ａ／Ａ」の値は、ＭＭＳの濃度が低濃度の場合には、「０＜ａ／Ａ＜１．０」を満たしていた。当該試験結果から、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質の濃度は、４０ｍＭ未満が好ましく、０．１ｍＭ以上４０ｍＭ未満がより好ましく、０．５ｍＭ以上４ｍＭ以下がより好ましく、０．５ｍＭ以上１ｍＭ以下が最も好ましい、と考えられる。
本発明は、白内障の発症メカニズムの解明を目的とする分野、および、白内障の治療方法の開発を目的とする分野などに、広く利用することができる。
Claims (9)
- 採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程を有する、白内障の誘導方法。
- 上記白内障は、加齢白内障、先天白内障、外傷性白内障、アトピー白内障、放射線白内障、ステロイド白内障、または、糖尿病白内障である、請求項１に記載の白内障の誘導方法。
- 上記損傷工程は、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体に所定の強度の刺激を加えることによって、ＤＮＡに損傷を与える工程であり、
上記刺激は、当該刺激を加えた後の当該水晶体の断面の一部分のみが混濁する程度の強度の刺激である、請求項１または２に記載の白内障の誘導方法。 - 上記損傷工程は、以下の（ｉ）および／または（ｉｉ）を包含する、請求項１〜３の何れか１項に記載の白内障の誘導方法：
（ｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、紫外線、または、放射線を照射すること、
（ｉｉ）上記採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体に対して、ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を接触させること。 - 請求項１〜４の何れか１項に記載の方法によって得られる、白内障のモデル生物。
- 採取された水晶体、または、非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、
上記接触工程の後で、上記採取された水晶体のＤＮＡ、または、上記非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、を有する、白内障の予防剤のスクリーニング方法。 - 採取された水晶体のＤＮＡ、または、非ヒト生物の水晶体のＤＮＡに損傷を与える損傷工程と、
上記損傷工程の後で、上記採取された水晶体、または、上記非ヒト生物の水晶体と、被検物質と、を接触させる接触工程と、を有する、白内障の治療剤のスクリーニング方法。 - ＤＮＡの損傷を引き起こす物質を有効成分として含有している、白内障誘導剤。
- 上記ＤＮＡの損傷を引き起こす物質は、ＤＮＡのアルキル化、ＤＮＡの切断、ＤＮＡへの化合物の付加、または、ＤＮＡへの塩基類似体の挿入を引き起こすものである、請求項８に記載の白内障誘導剤。
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|---|---|---|---|---|
| WO2020141608A1 (ja) | 2019-01-04 | 2020-07-09 | 国立大学法人京都大学 | 潰瘍性大腸炎及び原発性硬化性胆管炎の検査方法 |
-
2017
- 2017-06-16 JP JP2017119108A patent/JP6964864B2/ja active Active
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