JP2018536424A - インビトロのトポロジカルなニューロンネットワークにおける哺乳動物細胞 - Google Patents

Abstract

潜在的な生物学的活性薬剤化合物のハイスループットスクリーニングについて、哺乳動物のニューロン細胞の封じ込め及び成長のための３次元面トポグラフィーネットワークを作製する方法を提供する。本開示において、ウェルのｎ×ｎアレイをウェルとウェル間の相互接続したチャネルの両方を含む担体基材上に作製し、ニューロン細胞間の軸索の成長を促進し、次にインビボのニューロンの動作を模倣するインビトロの生きている相互作用ニューロンネットワークの作製を促進する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月９日に出願された米国特許出願第６２／２６５，３９９号明細書の利益を主張し、開示は参照により本明細書に援用される。

本開示は、インビトロの幹細胞のための物理的及び論理的トポロジカルなネットワークを作製する方法に関する。一実施形態において、電気的及び光学的にモニターし、ニューロンのシグナル伝達 (signaling)及び連絡 (communications)に対する生物学的活性化合物の影響を確認することができる、生きている生物学的機能的ネットワークを作製するために、ニューロン及び軸索の成長を促進するパターンを含む基材を提供する。

ネットワークトポロジは、概して、コンピュータネットワークの様々な要素、リンク、ノードの配置を指す。基本的には、ネットワークトポロジは、ネットワークのトポロジカルな構造であり、物理的又は論理的に記述することができる。物理トポロジは、デバイスの位置及びケーブルの設置を含むネットワークの様々な要素の配置であるのに対し、論理トポロジは、物理的設計に関わらず、ネットワーク内のデータの流れ方を説明する。ノード間の距離、物理的相互接続、送信速度、又は信号の種類は、２つのネットワーク間で異なっていてもよいが、そのトポロジは同じであってもよい。例として、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）があり、ＬＡＮ内の特定のノードは、ネットワークにおいてその他のデバイスと１つ又は複数の物理的リンクを有し、これらのリンクをグラフィカルにマッピングすることでネットワークの物理トポロジを記述するために使用することができる幾何学的形状になる。逆に、要素間のデータフローをマッピングすることで、ネットワークの論理トポロジが決定する。

デバイスをリンクするために使用される配線レイアウトは、ネットワークの物理トポロジである。この配線レイアウトは、配線のレイアウト、ノードの位置、及びノードと配線との相互接続を指す。ネットワークの物理的なトポロジは、ネットワークアクセスデバイス及びメディアの能力、望まれる制御又はフォールトトレランスのレベル、ならびに配線又は通信回路に関連するコストによって決定される。論理トポロジは、対照的に、信号のネットワークメディアへの作用の仕方、又はデバイスの物理的相互接続に関係なく、データが１つのデバイスから次のデバイスへネットワークを通過する方法である。ネットワークの論理トポロジは、必ずしもその物理トポロジと同じではない。

ネットワークトポロジの論理的な分類は、概して、ネットワークトポロジの物理的分類と同じ分類に従うが、ノード間の実際の物理的接続と対照的に、データがノード間を通過する経路を記述する。論理トポロジは、概して、配線、ワイヤ、及びネットワークデバイスの物理的レイアウトによって、又は電気信号の流れによって決定されるのに対し、ネットワークプロトコルによって決定されるが、多くの場合、電気信号がノード間を通過する経路は、データの論理フローに密接に一致しうるため、慣習的に、論理トポロジ及びシグナルトポロジという用語は同じ意味で使用する。

ネットワークトポロジの研究では、８つの基本的なトポロジ：ポイントツーポイント、バス、スター、リングもしくは円形、メッシュ、ツリー、ハイブリッド、又はデイジーチェーンが認識されている。図１は、ネットワークトポロジの様々な例の図を示す。

最もシンプルなトポロジは、２つのエンドポイント間の専用のリンク（ポイントツーポイント(point-to-point)）である。スイッチポイントツーポイントトポロジは、従来の電話の基本モデルである。恒久的なポイントツーポイントネットワークの価値は、２つのエンドポイント間の妨害のない通信である。オンデマンドポイントツーポイント接続の価値は、潜在的なサブスクライバーの組の数に比例し、メトカーフ (Metcalfe)の法則として表された。ポイントツーポイントトポロジの多様性を最も容易に理解するには、２つのエンドポイントに恒久的に関連するようにユーザに見えるポイントツーポイント通信チャネルである。子どものブリキ缶電話は、物理的な専用チャネルの一例である。

バストポロジを使用するローカルエリアネットワークにおいて、各ノードは、インターフェースコネクタの助けによって、単一ケーブルに接続される。この中央ケーブルがネットワークのバックボーンであり、バス（したがって名前）として知られる。ソースからの信号は、意図した受け手に見つけられるまで、バスケーブル上に接続された全ての機械に両方向で移動する。機械のアドレスがデータの意図するアドレスと一致しない場合、機械はそのデータを無視する。あるいは、データが機械のアドレスと一致する場合、データは受け入れられる。バストポロジは、１つのワイヤのみで構成されるため、その他のトポロジに比べ、設置にそれほどコストがかからない。しかし、この技術を設置する低コストは、ネットワークの管理にかかる高いコストによって相殺される。さらに、１つのワイヤのみを使用するため、シングルポイント障害が起こる可能性がある。

ネットワークの全てのノードが、厳密に２つのエンドポイントを有する共通の送信メディアに接続されるネットワークトポロジの種類（バックボーン又は基幹 (trunk)として呼ばれることも多い「バス」）では、ネットワークのノード間に送信されるデータは、この共通の送信メディアに送信され、ネットワークの全ノードによって同時に受信することができる。

スター型トポロジを有するローカルエリアネットワークにおいて、各ネットワークのホストが、ポイントツーポイント接続を有する中央ハブに接続される。そのため、全てのコンピュータが、ハブの助けを借りて全ての他のノードに間接的に接続すると言うことができる。スター型トポロジにおいて、全ノード（コンピュータワークステーション又はその他の周辺機器）が、ハブ、ルーター又はスイッチと呼ばれる中央ノードに接続される。スイッチはサーバーであり、周辺機器はクライアントである。ネットワークは、スター型ネットワークとして分類されるスターに似ている必要は必ずしもないが、ネットワーク上の全ノードは、１つの中央デバイスに接続していなければならない。ネットワークを通過する全てのトラフィックは、中央ハブを通過する。ハブは信号中継器として動作する。スター型トポロジは、設計及び設置に最も容易なトポロジと考えられる。スター型トポロジの利点は、追加のノードを加えるのが単純であることである。スター型トポロジの主な欠点は、ハブがシングルポイント障害を起こすことである。

ネットワークトポロジは、閉ループを作るように円形に築かれる。この方法では、データは一方向にリングの周りを移動し、リング上の各デバイスは、移動しているときに信号の強さを維持する中継器として機能する。各デバイスは、入ってくる信号の受信機及びリングの次のデバイスにデータを送る送信機を組み込む。ネットワークは、リングの周りを移動する信号の能力に依存する。デバイスがデータを送るとき、データは、目的地に到着するまで、リング上の各デバイスを通って移動しなければならない。全ノードが重要なリンクである。リングトポロジでは、サーバーコンピュータが存在せず、全ノードがサーバーとして働き、信号を中継する。リングトポロジの欠点は、１つのノードが停止した場合、ネットワーク全体が影響を受け、又は動作が停止することである。

完全なメッシュネットワークの価値は、サブスクライバーの数の指数に比例し、任意の２つのエンドポイントから全てのエンドポイントを含む通信グループが、リードの法則 (Reed’s Law)によって近似されると考えられる。

完全接続ネットワークは、各ノードが互いに接続される（完全に接続されたメッシュネットワーク）通信ネットワークである。グラフ理論において、完全接続ネットワークは、完全グラフとして知られる。完全接続ネットワークは、スイッチング又はブロードキャスティングを使用する必要がない。しかし、その主な欠点は、以下の式により、接続数がノード数で二次的に増えることである。

完全接続 (fully connected)ネットワークは、大規模なネットワークには極めて実用的ではない。２ノードネットワークは、技術的に完全に接続されたネットワークである。ヒトの脳は、脳ネットワークに可塑性を与える全ニューロン間で、静的又は動的になりうる膨大な接続を有する完全接続ネットワークのように振る舞い、新しい情報を学習及び処理するのに優れている。

ツリートポロジは、本質的にバストポロジとスター型トポロジの組み合わせである。バストポロジのノードは、スタンドアロンスター型トポロジネットワークに置き換えられる。このことは、バストポロジの欠点とスター型トポロジの利点の両方を有することになる。

例えば、ネットワークの２つのグループ間の接続が、中央リニアコア上の接続の断線によって壊れた場合、２つのグループはバストポロジのノードのように通信することができない。しかし、スター型トポロジのノードは、互いに効果的に通信する。

ハイブリッドネットワークは、結果としてのネットワークが標準のトポロジ（例えば、バス、スター、リング等）の１つを示すように、２つ以上のトポロジの組み合わせを使用する。例えば、ツリーネットワークに接続されるツリーネットワークは、ツリーネットワークトポロジのままである。ハイブリッドトポロジは、２つの異なる基本ネットワークトポロジが接続されるとき、常に生成される。ハイブリッドネットワークの２つの共通例は、スターリングネットワーク及びスターバスネットワークである。スターリングネットワークは、中央のハブを使用して接続される２つ以上のスター型トポロジから構成される。スターバスネットワークは、バス基幹を使用して接続される２つ以上のスター型トポロジから構成される（バス基幹はネットワークのバックボーンとしての役割を担う）。

ヒトの脳は、前述のネットワークの１つ以上又は全てのように組織化される個別のニューロンの非常に複雑なネットワークである。本開示は、生物学的活性化合物に曝露されたときのニューロン間のシグナル伝達及び連絡の動作を研究するために、軸索によって相互接続されるインビトロの担体基材に、ニューロンのトポロジカルネットワークを提供する。本開示は、インビトロのニューロンネットワークの物理トポロジと論理トポロジの両方を観察し、測定するためのプラットフォームを提供する。

一実施形態において、インビトロで細胞を培養するためのウェルのネットワークとウェルを接続するチャネルとを含む、生体適合性基材を提供する。一実施形態において、前記基材は、チャネルによって接続される２つ以上のウェルを有し、ここで前記チャネルは、２つ以上のウェル間のネットワークを形成するように、かつ細胞間接続を促進するように構成されている。一実施形態において、ウェルの少なくとも１つは、ニューロンを有するか、又は神経細胞 (neural cells)に分化することができる幹細胞もしくは前駆細胞を有する。一実施形態において、ネットワークは、リング、メッシュ、スター、ライン、ツリー又はバストポロジである。一実施形態において、基材は、ガラス又は合成ポリマーを含む。一実施形態において、基材は、天然ポリマーを含む。一実施形態において、基材は、電極アレイを含む。一実施形態において、基材は、液体鋳造、射出成形、熱的及び／又はＵＶマイクロエンボシング、微細加工、熱成形、及び／又は高圧スタンピングによって形成される。一実施形態において、少なくとも１つのウェルは、神経筋細胞、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、又は皮膚細胞を含む。一実施形態において、少なくとも１つのウェルは、運動ニューロンを含む。一実施形態において、少なくとも１つのウェルは、非運動ニューロンを含む。一実施形態において、非運動ニューロンは、皮質ニューロン、海馬ニューロン、又は後根ニューロンを含む。一実施形態において、隣接するウェルは、異なる細胞タイプを有する。一実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、約５〜約２５０ミクロンの直径を有する。一実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、約５〜約２５ミクロンの直径を有する。一実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、約１０〜約２０ミクロンの直径を有する。一実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、約５ミクロン〜約１ｍｍの長さを有する。一実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、約５〜約２５ミクロンの長さを有する。一実施形態において、少なくとも１つのチャネルは、約１０〜約２２ミクロンの長さを有する。

インビトロで細胞を培養するためのウェルのネットワークと前記ウェルを接続するチャネルとを有する、生体適合性基材を作製する方法も提供する。一実施形態において、ウェルの直径が約１０ミクロン〜約２５０００ミクロンである、マルチウェルプレートを提供する。１つ又は複数のウェル間に１つ又は複数のチャネルを作製し、チャネルの幅は約２ミクロン〜約２５０ミクロンであり、それによって相互接続したウェルのネットワークを形成する。一実施形態において、複数のチャネルは、約５〜２５ミクロンの幅を有する。一実施形態において、複数のチャネルは、約５〜２５ミクロンの長さを有する。一実施形態において、ネットワークは、リング、メッシュ、スター、ライン、ツリー又はバストポロジである。一実施形態において、基材は、ガラス又は合成ポリマーを含む。一実施形態において、基材は、電極アレイを含む。

一実施形態において、細胞活動をモニターするために基材を使用してもよい。例えば、基材のウェルの培地を１つ又は複数の化合物に接触させ、接触後のウェルの細胞の活動をモニターする。一実施形態において、電気活動をモニターする。一実施形態において、少なくとも２つのウェルを異なる化合物に接触させる。一実施形態において、各ウェルの培地は同じである。一実施形態において、少なくとも１つのウェルは、神経筋細胞、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、又は皮膚細胞を含む。一実施形態において、ウェルの細胞は同じ種類の細胞である。一実施形態において、少なくとも１つのウェルは、運動ニューロンを含む。一実施形態において、少なくとも１つのウェルは、非運動ニューロンを含む。一実施形態において、非運動ニューロンは、皮質ニューロン、海馬ニューロン、又は後根ニューロンを含む。一実施形態において、隣接するウェルは、異なる細胞タイプを有する。一実施形態において、１つ又は複数のチャネルは、軸索を含む。

本開示おいて、担体基材に作製することができる様々なネットワーク構成を示す。 本開示を用いてニューロン間の軸索の成長を促進するための３×３アレイのウェル及びウェル相互接続チャネルを示す。

図２を参照すると、図２は、本開示に有用な単純な３×３アレイを示す。３×３アレイは、ウェル１０と、前記ウェルを相互接続して単純なメッシュネットワークを形成するチャネル２０とを含む。アレイは、ガラス、ポリマーフィルム、成形したマイクロプレート、及び電極アレイを有するプレート等のいくつかの基材に作製することができる。アレイは、ｎ＝１である単純なｎ×ｎであってもよく、又は各「ｎ」は、１〜約１０，０００であってもよく、例えば、ｎは１〜１００である。ニューロンを含むウェルの直径は、約１０ミクロン〜約２５．４ｍｍの範囲であってもよい。ウェルは、円形、正方形、又は多形等のいくつかの幾何学的形状であってもよい。ウェル１０は、細胞に栄養を与え、成長を促すために一定量の液体を含有してもよく、概して、マイクロリットルからミリリットルの適切な培地を含んでもよい。

基材３０は、液体鋳造、射出成形、熱的及び／又はＵＶマイクロエンボシング、微細加工、熱成形、及び／又は高圧スタンピング等の当該技術分野で知られるいくつかの技術によって形成することができる。一実施形態において、射出成形及び／又はマイクロエンボシングを使用する。一実施形態において、その後にトポロジカルなネットワークに光学分析を実施する場合、基材は透明であってもよい。しかし、生物適合性活性化合物に曝露している最中に、ネットワークの動作を観察するために電気生理学が望ましい場合、基材は透明である必要はない。

ウェル１０に接続するチャネル２０は、作製しているトポロジカルなネットワークの複雑さの程度及び種類に依存して、幅、長さ及び深さを変えることができる。一実施形態において、チャネルの幅は、概して、約２ミクロン〜約１００ミクロン、例えば、約５ミクロン〜約１５ミクロンである。チャネルの深さは、ウェル１０の壁の深さにおおよそ等しい。チャネルは、マイクロ成形、マイクロエンボシング、微細加工、又はレーザーアブレーションによって作製することができる。チャネルによって、ニューロンによって生成される軸索は隣接又は遠位のウェル１０に連絡することができる。ウェル１０は、ニューロンのみ、又は神経筋細胞、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、もしくは皮膚細胞等のその他の細胞タイプを集合させ、複雑なニューロン臓器のインビトロモデルを作製することができる。

ポリマーフィルムにＵＶマイクロエンボシングを使用する一例において、その加工でニューロンのトポロジカルな基材が形成された。この例では、ウェル１０及びチャネル２０は、高速ロールツーロール (roll to roll)法で、目的の微細構造ジオメトリを作製するエンボス加工具を用いることによって、１回のステップで作製した。ウェルは、約１ｍｍの直径を有し、ウェルを相互接続するチャネルは、約１０ミクロンの幅を有した。

別の例では、当該技術分野で知られる３８４ウェルプレートは、ウェル間の１０ミクロンのチャネルをレーザー彫刻又はアブレートすることによって、ニューロンのトポロジカル基材に変換され、プレート上にメッシュのトポロジカルなネットワークを形成した。また別の例では、９６ウェル電極プレートは、ウェル間の１０ミクロンのチャネルを微細加工することによって、トポロジカルなニューロンネットワークに変換された。

前述の全ての例において、適切な哺乳動物細胞、培地及びインキュベーション条件を有するトポロジカルなアレイは、その後、（ウェルを）活性生物学的化合物に曝露した。トポロジカルなニューロンアレイは、その後、光学的又は電気的のいずれかによってモニターされ、メッシュネットワークの細胞間の軸索配線の物理的及び論理的動作を観察することができる。一実施形態では、アレイのニューロンは多極である。一実施形態では、アレイのニューロンは偽単極である。一実施形態では、アレイのニューロンは双極である。一実施形態では、アレイのニューロンはプルキンエ(Purkinje)細胞である。一実施形態では、アレイのニューロンは微粒細胞である。一実施形態では、アレイのニューロンは錐体細胞である。一実施形態では、アレイのニューロンはシャンデリア細胞である。一実施形態では、アレイのニューロンはスピンドルニューロンである。一実施形態では、アレイのニューロンは星細胞である。

一実施形態において、アレイのウェルは、同じ培地を有する。例えば、ニューロンについての例示的な培地はＢｒａｉｎＰｈｙｓ（Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada）であり、心臓細胞についての例示的な培地はｉＰＳ細胞である。一実施形態において、ニューロン、例えば、海馬ニューロン、皮質ニューロン又は後根ニューロンを有する特定のニューロンは、運動ニューロンを有するウェルに隣接し、これらの細胞は、同培地で保持される。

一実施形態において、チャネルの長さは、約５ミクロン〜約１ｍｍである。一実施形態において、チャネルの長さは、約５ミクロン〜約３０ミクロンである。一実施形態において、チャネルの長さは、約１０ミクロン〜約２０ミクロンである。

一実施形態において、チャネルの直径（幅）は、約５ミクロン〜約２５０ミクロンである。一実施形態において、チャネルの幅は、約５ミクロン〜約３０ミクロンである。一実施形態において、チャネルの幅は、約１０ミクロン〜約２０ミクロンである。

一実施形態において、アレイの異なるウェルにおける細胞が異なる培地を有するとき、ウェルをリンクするチャネルは、隣接するウェル間の培地の拡散を制限する大きさであってもよい。例えば、脳細胞、肝臓細胞及び心臓細胞を有するアレイにおいて、チャネルの直径は、約５〜約１００ミクロン、例えば、約１５〜約２５ミクロンであってもよい。一実施形態において、チャネルの直径は、表面張力により、培地による隣接するウェルへの拡散を最小にする。

一実施形態において、軸索の生成を可能にするために、チャネルの直径は、約１５〜約２５ミクロンである。一実施形態において、チャネルのベース及びウェルのベースは、同じレベルにある。一実施形態において、チャネルは、Ｕ字形である。一実施形態において、チャネルの形状は、円柱である。一実施形態において、チャネルは、形状が角形であり、例えば、直方体（立方体）、三角柱又は六角柱である。

本明細書の主題は、例によって記述され、主題を実施する異なる方法を記載した。しかし、本出願によって網羅される主題は、いかなる特定の実施形態もしくは使用又はその等価物に制限されない。その後の薬剤投与で細胞マイクロアレイを作製する方法の特定の実施形態を記載したが、本発明及び以下の請求項の記載から逸脱することなく、変更及び修正がなされることは当業者によって理解される。

Claims (32)

1. インビトロで細胞を培養するためのウェルのネットワークと前記ウェルを接続するチャネルとを含む、生体適合性基材であって、
   チャネルによって接続された、２つ以上の培地を含むウェルを含み、前記チャネルは、２つ以上の前記ウェルの間にネットワークを形成するように、かつ細胞間接続を促進するように構成されており、
   前記ウェルの少なくとも１つがニューロンを有するか、又は神経細胞に分化することができる幹細胞もしくは前駆細胞を有する、
   生体適合性基材。
2. 前記ネットワークが、リング、メッシュ、スター、ライン、ツリー又はバストポロジを有する、請求項１に記載の基材。
3. 前記ネットワークが、スター又はツリートポロジを有する、請求項２に記載の基材。
4. 前記基材がガラス又は合成ポリマーを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基材。
5. 前記基材が天然ポリマーを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の基材。
6. 前記基材が電極アレイを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の基材。
7. 液体鋳造、射出成形、熱的及び／又はＵＶマイクロエンボシング、微細加工、熱成形、及び／又は高圧スタンピングによって形成される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の基材。
8. 少なくとも１つのウェルが、神経筋細胞、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、又は皮膚細胞を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の基材。
9. 少なくとも１つのウェルが運動ニューロンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の基材。
10. 少なくとも１つのウェルが非運動ニューロンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の基材。
11. 前記非運動ニューロンが、皮質ニューロン、海馬ニューロン、又は後根ニューロンを含む、請求項１０に記載の基材。
12. 隣接するウェルが異なる細胞タイプを有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の基材。
13. 少なくとも１つのチャネルが約５〜約２５ミクロンの直径を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の基材。
14. 少なくとも１つのチャネルが約５〜約２５ミクロンの長さを有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の基材。
15. インビトロで細胞を培養するためのウェルのネットワークと前記ウェルを接続するチャネルとを含む、生体適合性基材の作製方法であって、
    マルチウェルプレートを提供し、ここで前記プレート中の前記ウェルの直径が約１０ミクロン〜約２５０００ミクロンであり、
    １つ又は複数の前記ウェル間に１つ又は複数のチャネルを作製し、ここで前記チャネルの幅が約２ミクロン〜約２５０ミクロンであり、それによって相互接続したウェルのネットワークを形成すること
    を含む、方法。
16. 前記チャネルが約５〜約２５ミクロンの幅を有する、請求項１５に記載の方法。
17. 前記チャネルが約５〜約２５ミクロンの長さを有する、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記ネットワークが、リング、メッシュ、スター、ライン、ツリー又はバストポロジである、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 前記基材がガラス又は合成ポリマーを含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 前記基材が電極アレイを含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 液体鋳造、射出成形、熱的及び／又はＵＶマイクロエンボシング、微細加工、熱成形、及び／又は高圧スタンピングによって形成される、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の方法。
22. 請求項１〜１４のいずれか１項に記載の基材を提供し、
    ウェル中の細胞を１つ又は複数の化合物に接触させ、そして
    接触後、前記細胞の活動をモニターすること
    を含む、細胞の活動をモニターする方法。
23. 電気活動をモニターする、請求項２２に記載の方法。
24. 少なくとも２つのウェルを異なる化合物に接触させる、請求項２２又は２３に記載の方法。
25. 各ウェルの前記培地が同じである、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 少なくとも１つのウェルが、神経筋細胞、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、又は皮膚細胞を含む、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記ウェル中の前記細胞が同じ種類の細胞である、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 少なくとも１つのウェルが運動ニューロンを含む、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
29. 少なくとも１つのウェルが非運動ニューロンを含む、請求項２２〜２６又は２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記非運動ニューロンが、皮質ニューロン、海馬ニューロン、又は後根ニューロンを含む、請求項２９に記載の方法。
31. 隣接するウェルが異なる細胞タイプを有する、請求項２２〜２６又は２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. １つ又は複数の前記チャネルが軸索を含む、請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。