JP2018536225A - ウイルスネオエピトープおよびその使用 - Google Patents

ウイルスネオエピトープおよびその使用 Download PDF

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Abstract

企図された抗ウイルス/癌治療は、宿主ゲノムに組み込まれたウイルスDNAのネオエピトープの解析、およびこのようなネオエピトープに対する免疫療法剤の設計を含む。【選択図】図2

Description

本願は、2015年10月12日に出願された米国仮出願第62/240471号に対する優先権の利益を主張する。
本発明の分野は、ウイルス性疾患および新生物性疾患の治療であり、特にこれらはウイルス関連疾患の免疫学的治療に関する。
本背景の説明は、本発明の理解に有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか、または現在請求されている発明と関連していること、または具体的もしくは暗示的に参照されている出版物がいずれも先行技術であることを認めるものではない。
ヒト乳頭腫ウイルスは、様々な上皮組織に感染する比較的小さいDNAウイルスであり、皮膚型および粘膜親和型に分類することができる。さらに、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)は、感染組織における悪性形質転換を促進するそれらの能力の違いに応じて、低および高リスク型として分類することもできる。例えば、HPV型16および18は、子宮頸癌の99%以上に関連する粘膜親和型HPVである。これらの癌の大部分において、ウイルスDNAゲノムは宿主のゲノムに組み込まれる。ほとんどのHPV型の感染は、かなりの数の症例において自己限定的である。しかし、特に感染が高リスク型HPVであった場合、臨床的に関連する患者の一部において、持続感染および新生物形質転換が観察される。
より近年では、ワクチン配合物が、最も一般的な高リスクHPV型に対して利用可能になっている。残念なことに、ワクチン接種は、一般に、すでに確立された感染に対しては有効ではない。さらに、ワクチン接種は、ウイルスが十分な遺伝的変化を受けた場合にはあまり効果的でないこともある。効果的なHPV治療は、同時のゲノム不安定性によってさらに複雑になり得る。これらは、ウイルスタンパク質E6およびE7と通常のDNA損傷応答(典型的には宿主p53およびpRbタンパク質を介して媒介される)との相互作用に一般的に起因する。
したがって、治療およびワクチン接種が改善されたにもかかわらず、HPV感染、および特に持続的なHPV感染に関するいくつかの問題が依然として残っている。したがって、HPV感染の治療を改善するシステムおよび方法が依然として必要とされている。
本発明者らは、現在、オミックス解析を用いて、病原体または疾患に対する免疫療法組成物の有効性を検証または増大させることができることを発見した。好ましくは、患者から得られたオミックスデータは、病原体および/または疾患に関する参照オミックスデータと比較され、ネオエピトープは、病原体および/または疾患についての参照オミックスデータに別の方法で見出されるエピトープと比較して、患者のHLA型に対して増加したか、または新しいか、かつ/または失われた結合親和性を有する患者のオミックスデータから同定される。さらに、病原体または疾患のオミックス解析は、患者のHLA型に高親和性で結合することが予想されるネオエピトープの合理的設計を導くためにも使用することができ、このように同定されたネオエピトープは発現のために病変細胞に発現/搬入させることができる。
最も好ましくは、オミックス解析ならびにHLAタイピングおよびHLAマッチングのすべてが、全ゲノムシーケンシングデータを用いてin silicoで実施される。さらに、ウイルス性疾患が特に企図されているが、遺伝病因を有する他の疾患もまた好適であると考えられる。
HLAタイピングは、患者配列データから、特に配列決定装置からのDNAおよび/またはRNA配列を用いたHLAタイピングのための高精度変異体呼び出しを伴うことが企図されている。いくつかの実施形態では、患者のHLA型の決定は、HLA参照配列を患者オミックスデータと適合させることを伴う。オミックスデータは、患者の健康な組織から誘導され得るが、好ましい実施形態では、このオミックスデータは病変組織から誘導される。HLA参照配列は、既知の異なるHLA対立遺伝子の複数の配列を含む。患者オミックスデータは、好ましくは複数のk−merのそれぞれのセットに分けることができる複数の配列リードを含み、HLA参照配列および複数のk−merのそれぞれのセットを使用して複合de Bruijnグラフを作成することができる。
好ましい実施形態では、既知のおよび異なるHLA対立遺伝子の各々は、票(vote)によって計算される複合適合スコアを使用してランク付けされる。票は、既知のおよび異なるHLA対立遺伝子の対応するセグメントと適合する各k−merについて集計し、かつ、対立遺伝子をランク付けするために使用され得る。ランク付けにおいて最上位の対立遺伝子は、患者の一次HLA型として同定され、一次HLA型と適合するk−merに対する偏りを有する残りの対立遺伝子を再ランク付けすることで、患者の二次HLA型となる。
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、同様の数字が同様の構成要素を表す添付の図面とともに、以下の好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかになるであろう。
図1の表は、予測されたHLA型に関してエピトープおよびネオエピトープを結合する例示的な結果を示す。 図2は、患者HLA型に対する高い結合親和性を有する予測された結合変異体エピトープ(ネオエピトープ)を示す(強調表示されている)。
本発明者らは、現在、免疫療法組成物の有効性が治療前に容易に確認でき、かつ/または免疫療法組成物が、患者および疾患特異的様式で病変組織を特に標的とするように調製できることを発見した。最も典型的には、企図される組成物、システムおよび方法は、ネオエピトープが獲得されるか、かつ/または人工的に導入される疾患または病原体に関連するネオエピトープの検出に依存する。例えば、ネオエピトープは、宿主ゲノムへのDNAのウイルス挿入(例えば、レトロ)ならびに宿主および病原体のゲノムにおける付随する変化(例えば、HPV組み込み後の突然変異率またはゲノム不安定性の増加による)によって獲得され得るか、(例えば、CRISPR/Cas9またはCRISPR/Cpf1カセットを介した)ネオエピトープ(複数可)をコードする組換え核酸の標的組み込みを介して宿主に導入され得る。最も好ましくは、標的化された挿入は、病原体(例えば、ウイルス)または疾患(例えば、癌遺伝子)に関連する核酸配列中またはその近傍にある。
例えば、本発明の主題の1つの特に企図された態様では、子宮頸癌または前腫瘍性病変(または他のウイルス関連腫瘍)から生検を行い、全ゲノムシーケンシングを行って、このように病変組織のオミックスデータを得るようにする。さらに、発現遺伝子および/または発現レベルを同定するために、エクソーム解析および/またはRNA解析を行うことができる。このようなものにはさらに、腫瘍に近接する1つ以上のリンパ節および遠隔転移または循環腫瘍細胞からの生検を含み得る。さらに、オミックス解析が行われ、オミックスデータが、患者適合正常組織(すなわち、同じ患者由来の非病変組織)に対して直接に比較され、患者特異的突然変異の変化が得られることが一般に好ましい。
ほとんどの場合、オミックスデータは、標準組織プロセシングプロトコルおよびシーケンシングプロトコルに従って生検試料から得られる。本発明の主題に限定されるものではないが、データが患者適合腫瘍データ(例えば、腫瘍データ対同一患者の正常データ)であり、データフォーマットがSAM、BAM、GAR、またはVCFフォーマットであることが典型的には好ましい。しかし、非適合または適合対他の参照(例えば、前の患者の正常データまたは前の患者の腫瘍データ、またはホモ統計学)も本明細書での使用に好適であると考えられる。したがって、オミックスデータは、「新鮮な」オミックスデータまたは前の手順(もしくは異なる患者であっても)から得られたオミックスデータであってもよい。
さらに企図される態様では、オミックス解析は、1つ以上のウイルス配列(例えば、国際公開WO2015/048546号に記載されているとおり、異なるウイルスまたは血清型のコレクション由来)を含み得る1つ以上の参照核酸配列も使用する。したがって、オミックス解析は、患者の天然核酸配列に限定されるものではなく、このようなオミックス解析はまた、非患者核酸および最も典型的には病原体核酸(例えば、寄生虫、ウイルス、細菌、真菌など)を検索し、同定することが認識されよう。別の例では、参照核酸はまた、以前の生検からの核酸配列、および以前の発癌性突然変異を含む核酸配列データであり得ることも認識されたい。したがって、異なる時点からではあるが、参照配列を患者から得ることもでき、このため、以前に存在しなかったまたは検出されなかった腫瘍におけるクローンドリフトの同定または新規突然変異の導入が可能になる。
別の観点から見ると、迅速な解析は、(健康な宿主組織または非宿主組織から得ることができる)参照ゲノムをin silicoで修飾することによって達成され得ることが企図される。in silicoでは、1つ以上の非患者ゲノム配列(および最も好ましくはウイルスゲノム全体)を参照ゲノムと融合させて、キメラ参照核酸配列を形成する。
結果として、本発明者らは、ウイルス関連腫瘍およびキメラ参照核酸配列からの核酸配列を保存する配列データベースに解析エンジンを情報的に連結する方法を企図しており、このキメラ参照核酸配列は少なくとも1つのウイルス核酸配列および哺乳動物核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラ参照核酸配列は、代替的または追加的に、少なくとも1つの疾患特異的核酸配列を含む。次いで、解析エンジンを使用して、キメラ参照核酸配列中のウイルス核酸配列のうちの少なくともいくつかと、ウイルス関連腫瘍由来の核酸配列中の対立遺伝子との組み込みを同定する。
キメラ参照核酸配列に使用するのに好適な参照ゲノムとしては、同じ患者の全ゲノム核酸配列が挙げられ、これらは、典型的には非病変組織から得られる。例えば、参照ゲノム核酸は、全血から、癌性組織に隣接する組織から、または頬側スワブもしくは生検から得ることができる。あるいは、参照ゲノムは、患者から早期に採取された試料、または以前の全ゲノムシーケンシングの試行から得られてもよい。さらに別の態様では、参照ゲノムは同じ種(例えば、ヒトまたは他の哺乳動物)由来のゲノム配列、好ましくは性別によって層別化されたもの、または同じ種の平均もしくはコンセンサス配列であってもよい。最も典型的には、参照ゲノムはゲノム全体であるか、またはそれを包含する。しかし、ゲノムの小さい部分も企図され、少なくとも1つの染色体、または2〜5の染色体、または5〜10の染色体、または10を超える染色体を含む。あるいは、参照ゲノムは、全エクソームまたは全トランスクリプトームの一部分(例えば、1〜10%、10〜30%、30〜60%、または60〜90%)の代表のみであってもよい。したがって、かつさらに別の観点から見て、参照ゲノムは、典型的には、ヒト(または他の種)の全ゲノムの少なくとも10%、または少なくとも30%、または少なくとも50%、または少なくとも70%を含むことになる。
キメラ参照核酸配列において使用するための好適な非患者ゲノムとしては、少なくとも1つのウイルスの全ゲノム核酸配列が挙げられ、より典型的には、疾患と既知の関連を有するウイルスのコレクション、特に、腫瘍関連ウイルス(すなわち、癌性疾患に関連することが公知のウイルス)が挙げられる。例えば、本明細書での使用に適していると考えられるウイルスのゲノム配列は、HTLV−1(成人T細胞白血病関連)、HPVウイルス(子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、および肛門性器癌関連)、HHV−8(カポジ肉腫、原発性滲出液リンパ腫、キャッスルマン病関連)、EBV(バーキットリンパ腫、上咽頭癌、移植後リンパ腫およびホジキン病関連)、HBVおよびHCV(肝細胞癌関連)、SV40(脳腫瘍、骨癌、中皮腫関連)、BKV(前立腺癌関連)、JCV(脳腫瘍関連)、HERV(胚細胞腫瘍、乳癌、卵巣癌、および黒色腫関連)、HMTV(乳癌関連)、KSHV(カポジ肉腫関連)、ならびにTTV(消化管癌、肺癌、乳癌、および骨髄腫関連)、のゲノム配列が挙げられる。しかし、好適なウイルスには、特定の疾患関連に関して現在知られていないものも含まれることを認識されたい。
その一方で、本明細書での使用に好適なウイルス配列はまた、1つ以上の共通分類子によって層別化することができ、これらは、ウイルスの群において、臓器特異性(例えば、HBV、HCV)、癌型特異性、またはリスクタイプを含むことができる。例えば、ウイルスがHPVウイルスである場合、好適な非患者ゲノム配列としては、HPV型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、69、73、および/または82など、高リスクの頸部または他の泌尿生殖器癌に関連するものを挙げることができる。最も典型的には、非患者ゲノムは、ゲノム全体であるか、またはそれを包含する。しかし、ゲノムのより小さい部分も企図され、非患者ゲノムの一部分、例えば、1つ以上の単一の非患者遺伝子または転写単位、またはウイルスの全ゲノムの少なくとも10%、または少なくとも30%、または少なくとも50%、または少なくとも70%を含む。
キメラ参照核酸配列に使用するための好適な疾患特異的核酸配列には、少なくとも1つの疾患特異的な既知のネオエピトープ、スプライス変異または染色体転座が含まれ、より典型的には、疾患特異的な既知のネオエピトープ、スプライス変異、または染色体転座のコレクションが含まれる。例えば、疾患特異的な既知のネオエピトープは、当技術分野で公知のもの、またはCancer Research Instituteのペプチドデータベース、免疫エピトープデータベース、Cancer Immunome Atlasなどの利用可能なデータベースで同定されたものを含むことができる。疾患特異的スプライス変異は、当技術分野で公知のもの、またはEnsembl、TCGA SpliceSeqなど(例えば、子宮頸癌組織におけるKLHDC7B、sycp2、またはHMMR遺伝子の選択的スプライシング)の利用可能なデータベースで同定されたものを含み得ることを認識されたい。疾患特異的染色体転座には、当技術分野で公知のもの、またはDisease Associated Chromosomal Rearrangements Online、Database of Chromosomal Rearrangements In Diseases、Mitelman Databaseなど(例えば、2.3Mb間隔の子宮頚癌組織における3番染色体の11q13転座)の利用可能なデータベースで同定されたものを含み得ることが企図されている。
キメラ参照核酸配列は、参照ゲノム核酸配列に付加される1つ以上の個々の単位として非患者核酸配列(複数可)を含むことが特に好ましい。最も典型的には、それぞれの非患者核酸配列の個々の単位は、個々の染色体として編成/標識される。他の利点の中でも、このような配置(特に、配列比較が漸増同期アライメント(incremental synchronous alignment)を用いて行われる場合)を用いることにより、ゲノム組み込み、コピー数決定、および影響を受ける対立遺伝子の位置の迅速な同定が可能になることに留意されたい。したがって、非患者核酸配列は、参照ゲノム核酸配列と同じフォーマット(例えば、BAM、SAM、FASTA、またはFASTAインデックス)で編成されることも企図される。ただし、代替的フォーマットは明示的に除外されない。したがって、上記を考慮して、哺乳動物のキメラ参照核酸配列の染色体数が、ウイルス関連腫瘍由来の核酸配列の染色体数を有意に超え得ることを認識されたい。例えば、キメラ参照核酸配列の染色体数は、ウイルス関連腫瘍由来の核酸配列の染色体数を少なくとも1、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも50、さらに多く超えてもよい。実際、正確な染色体数は、含まれる非患者ゲノム配列の数によって決定される。
そのために、本発明者らは、患者の病変組織における非患者核酸の存在を同定する方法を企図する。この方法では、哺乳動物組織由来の1つ以上の核酸配列およびそれぞれの異なる供給源(例えば、異なるウイルス、異なる病原体、異なる細菌、それらの組み合わせなど)由来の1つ以上の非患者核酸配列を保存している配列データベースに編集エンジンを情報的に連結することによってゲノム解析のための参照配列を修飾させる。次いで、編集エンジンを用いて、哺乳動物組織由来の核酸配列(複数可)を複数の非患者核酸配列にマージして単一のキメラ核酸配列ファイルとする。当然ながら、このような編集は、比較的少数の選択された非患者ゲノム配列を用いる場合は手動で、ウイルスのコレクションが比較的大きい場合には自動化様式で実施できることを認識されたい。さらに、編集エンジンは、任意のフォーマットの非患者配列を(例えば、哺乳動物/ヒト)参照配列にマージすることができ、また、非患者配列は、いつでも所望の最終フォーマット(例えば、BAM、SAM、FASTA、またはFASTAのインデックスフォーマット)に変換できることを認識されたい。しかし、非患者配列が既に所望の最終フォーマット(例えば、BAM、SAM、FASTA、またはFASTAインデックスフォーマット)にあることが一般に好ましい。例えば、参照配列(複数可)は、関連するFASTAインデックスを有するFASTAファイルに保存され得、次いで、そのファイルは、上記のように1つ以上の非患者ゲノム配列とマージされ得る。所望/必要に応じて、BAMフォーマットを更に変換することができる。さらに、非患者配列を含む患者の病変問題(patient’s diseased issue)の配列データも、BAMファイルに保存することができる。
さらに、キメラ核酸配列の構造に関しては、哺乳動物組織由来の核酸配列が、染色体構造に続く単一のキメラ核酸配列ファイルに編成され(例えば、BAMフォーマットの場合)、ウイルス核酸配列が、単一のキメラ核酸配列ファイル内でそれぞれの単一の染色体として編成されていることが特に好ましい。一旦キメラ核酸配列ファイルが組み立てられると、このようにして生成されたキメラ核酸配列ファイルを用いて配列データベースを更新することが好ましい。当然、編集エンジンは、哺乳動物組織由来の核酸配列とウイルスゲノム配列ライブラリー由来の1つ以上のウイルス核酸配列とのオンザフライマージ(on−the−fly merge)のために用いてもよく、これにより、漸増同期アライメントを以下にさらに説明するように実施できることを認識されたい。好適な配列およびそれの一部分に関しては、上記で既に説明したのと同じ考慮が適用される。
本発明の主題のさらに特に好ましい態様において、キメラ参照核酸配列およびウイルス関連腫瘍由来の核酸配列は、漸増同期アライメントを用いて処理され、ゲノム交換の組み込み、共増幅および位置の迅速な同定が可能になる。例えば、本発明の主題を限定するものではないが、ゲノム解析は、ソフトウェアツールを用いて実施し、このソフトウェアツールでは、キメラ参照核酸配列(健常組織または参照組織由来のゲノム核酸配列を含む)が同期され、ウイルス関連腫瘍(または他の病変組織)由来の核酸配列に対して段階的に比較されることが一般的に好ましい。1つの特に好ましいツールとしては、以前に国際公開WO2013/074058(A1)に記載されたBAMBAMが挙げられる。
このようなアプローチを使用することで、異種間で組み込まれた配列の存在がそれぞれの試料(例えば、ウイルスおよび患者)内に発見され得るのみでなく、位置、コピー数、突然変異など、その全てが、疾患の存在、進行および/または転帰に関して重要な影響を有し得ることは特に認識されたい。特に、患者ゲノムにおけるウイルス配列の組み込みが、ゲノム突然変異の増加と関連している場合、患者ゲノムに組み込まれたウイルス配列における突然変異も同様に検出され得る。したがって、本発明者らは、1つ以上の異種間の組み込み事象を検出する方法のみでなく、このような事象の特徴付けを行い、その後治療および予後の評価の基礎として使用することを企図する。
例えば、本発明者らはさらに、患者の子宮頸癌由来の核酸配列およびキメラ参照核酸配列を保存している配列データベースに解析エンジンを情報的に連結させる方法を企図しており、キメラ参照核酸配列は、患者由来の参照配列(好ましくは適合した正常な核酸配列)およびHPVウイルスの1つ以上のウイルス核酸配列を含む。次いで、解析エンジンを使用して、キメラ参照核酸配列中のウイルス核酸配列のうちの少なくともいくつかと、子宮頸腫瘍由来の核酸配列中において癌遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子(例えば、ERBB2などの増殖因子受容体をコードする遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子、細胞周期調節に関与する遺伝子、および/または細胞の分裂に関与する遺伝子)との組み込みを同定する。
参照配列は、複数のエピトープを計算するために使用されることが一般に好ましい。最も典型的には、エピトープは、2〜50個のアミノ酸、より典型的には5〜30個のアミノ酸、最も典型的には9〜15個のアミノ酸の長さを有すると計算される。このようなエピトープは、参照配列全体を段階的に網羅してもよいか、または特定の一部分(例えば、エキソンのみ)を網羅してもよい。同様に、非患者核酸は、少なくとも非患者核酸が参照配列と異なる位置について、複数のネオエピトープを計算するために使用される。このようにして計算されたエピトープおよびネオエピトープは、以下にさらに詳細に記載されるように、患者特異的HLA型に対するそれらの親和性についてin silicoで解析が行われる。
このようなネオエピトープのHLA親和性の知識は、以下の少なくとも2項目の貴重な情報を提供することを認識されたい:(a)別の方法で免疫療法に適したエピトープの欠失を認識し、それに応じて欠失されたエピトープを標的としないように免疫療法を調節し得る。(b)免疫療法に適したネオエピトープの生成を認識し、それに応じてネオエピトープを標的とするように免疫療法を調節し得る。病原体(または癌遺伝子、または腫瘍抑制遺伝子)の核酸が突然変異率の増加を受ける疾患で、エピトープにおけるこのような変化が特に関連することは、さらに認識されるものとする。このような突然変異率の増加は、ゲノム不安定性に起因し得る。このゲノム不安定性は、病原体または他の遺伝的欠陥(例えば、ウイルスE6/E7遺伝子産物の干渉を介して)、化学療法薬または放射線への曝露などによって導入され得る。異なる観点から見ると、免疫療法治療の選択肢は調節または予測することができ、このため、より効果的な治療に繋がり得る。
ネオエピトープについては、ネオエピトープは、独特の腫瘍特異的抗原を生成する腫瘍細胞におけるランダム突然変異として特徴付けられることを認識されたい。したがって、ハイスループットゲノムシーケンシングは、患者特異的ネオエピトープの迅速かつ特異的な同定を可能にするものである。この解析では、同じ患者の適合した正常組織も考慮する。特に、同時係属中の米国仮出願第62/144745号に開示されているように、非常に少数のネオエピトープはある免疫応答を違法にする必要があるようであり、結果的に癌免疫療法の作り出すための独特の機会を提示する。
特に好ましい態様において、腫瘍特異的ネオエピトープは、少なくとも2つの基準を使用して同定される:第一に、腫瘍ゲノム試料中の突然変異が患者の適合した正常試料に対して同定され、オミックスデータ中の非患者(または以前に突然変異した患者)の核酸の存在を検出する。第二に、非患者(または以前に突然変異した患者)の核酸を病原体の参照核酸または同じ患者の事前に突然変異した核酸配列と相関させる。当然のことながら、確認された発現を有する配列は、その後の解析のために一般的に好ましいことに留意されたい。
当然のことながら、癌および患者特異的突然変異に基づいて新しいペプチド配列を導くものを同定するために、同定された配列の差異についてさらなる下流解析を実施し得ることも認識されたい。換言すれば、サイレント突然変異は、同定されたネオエピトープのリストから排除され得る。したがって、ネオエピトープは、変異のタイプ(例えば、欠失、挿入、転換、遷移、転座)および影響(例えば、ナンセンス、ミスセンス、フレームシフトなど)を考慮することによって同定することができ、これは、第1のコンテンツフィルタとして機能し得、このフィルタを介して、サイレントおよび他の非関連(例えば、非発現)突然変異が排除される。ネオエピトープ配列は、比較的短い長さ(例えば7〜11mer)の配列ストレッチとして定義することができ、このようなストレッチがアミノ酸配列内に変化(複数可)を含むことはさらに認識されたい。最も典型的には、変化したアミノ酸は中心アミノ酸位置またはその近傍にある。例えば、典型的なネオエピトープは、A−N−A、またはA−N−A、またはA−N−A、またはA−N−A、またはA−N−Aの構造を有することができ、Aはアミノ酸であり、Nは変化したアミノ酸である(野生型または適合した正常と比較して)。
本明細書で企図されるネオエピトープ配列は、比較的短い長さ(例えば、5〜30mer、より典型的には7〜11mer、または12〜25mer)を有する配列ストレッチとして定義され得、このようなストレッチはアミノ酸配列内に変化(複数可)を含むことをさらに認識されたい。最も典型的には、変化(複数可)は、中心または中心近傍(例えば、中心位置から4未満、または5未満、または6未満のアミノ酸)に位置する。したがって、異なる観点から見ると、本明細書で企図されるネオエピトープ配列は、適合した正常配列に対して単一のアミノ酸が交換されたもの、および変化したアミノ酸の位置がネオエピトープ配列の中心に位置しているか、もしくは中心近傍にあるもの(例えば、9merでは、変化したアミノ酸は2、3、4または5位にあり、より典型的には3、4または5位にあり、最も典型的には4または5位にある)を特に含む。したがって、変化したアミノ酸の位置に応じて、変化したアミノ酸を含む多数のネオエピトープ配列に単一のアミノ酸変化が提示され得ることを認識されたい。有利には、このような配列の可変性により、ネオエピトープの複数の選択肢が可能になり、したがって、1つ以上の望ましい形質(例えば、患者HLA型に対する最も高い親和性、最も高い構造安定性など)を基準として選択可能な潜在的に有用な標的の数が増える。最も典型的には、ネオエピトープは、2〜50個のアミノ酸、より典型的には5〜30個のアミノ酸、最も典型的には9〜15個のアミノ酸の長さを有するように計算され、変化したアミノ酸は、好ましくは、主要組織適合複合体(MHC)へのその結合を改善する様式で、中心に配置されるか、または別の場所に置かれる。
例えば、エピトープがMHC−I複合体によって提示される場合、典型的なエピトープ長は約8〜11個のアミノ酸であり、MHC−II複合体により提示するための典型的なエピトープ長は、約13〜17個のアミノ酸の長さを有する。容易に認識されるように、ネオエピトープにおける変化したアミノ酸の位置は中心以外であってもよく、実際のペプチド配列およびその配列を有するネオエピトープのその実際のトポロジーはかなり変化し得る。さらに、ネオエピトープが合成ペプチドとして免疫コンピテント(または他の)細胞に提示される場合、合成ペプチドは、MHC−IまたはMHC−II系によって最終的に結合されるペプチド部分よりも有意に長くなり得、これにより、細胞内でのタンパク質分解プロセシングが可能になることを認識されたい。例えば、企図される合成ペプチドは、このため、変化したアミノ酸の上流および下流に8〜15個のアミノ酸を有してもよい。
コンピュータ解析を容易にする(および上記のような)好ましい実施形態では、エピトープおよびネオエピトープの解析は、抗体結合に必要な最小サイズ(例えば、少なくとも5〜6個のアミノ酸)、および最大サイズ20個のアミノ酸(場合によってはさらに長い)を有する比較的小さい断片に限定されることが企図される。したがって、エピトープおよびネオエピトープは、好ましくは、7〜12個のアミノ酸の長さを有する。例えば、好適なネオエピトープは、変化したアミノ酸を含む9個のアミノ酸の長さを有し得る。
ゲノム解析は、任意の数の解析方法によって実施され得ることが一般に企図されるが、特に好ましい解析方法としては、WGS(全ゲノムシーケンシング)ならびに腫瘍および適合した正常試料の両方のエクソームシーケンスが挙げられる。同様に、配列データのコンピュータ解析は、多数の様式で実施され得る。しかし、最も好ましい方法では、例えば、BAMファイルおよびBAMサーバを用いて、例えば、米国明細書US2012/0059670(A1)および同US2012/0066001(A1)に開示されている、腫瘍と正常試料の位置誘導同期アライメントにより、in silicoで解析が実施される。コンピュータに向けられたいずれの言語も、サーバ、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、コントローラなどのコンピューティングデバイス、または個別にもしくは集合的に動作する他のタイプのコンピューティングデバイスの任意の好適な組み合わせを含むように、読み取るべきであることに留意されたい。コンピューティングデバイスは、有形の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体(例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、RAM、フラッシュ、ROMなど)に保存されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを備えることは認識されたい。ソフトウェア命令は、開示された装置に関して以下に説明するように、役割、責任、または他の機能を提供するようにコンピューティングデバイスを構成することが好ましい。さらに、開示された技術は、コンピュータに基づくアルゴリズム、プロセス、方法、または他の命令の実施に関連する開示されたステップをプロセッサに実行させるソフトウェア命令を保存する非一時的なコンピュータ可読媒体を含むコンピュータプログラム製品として具現化することができる。特に好ましい実施形態では、標準化プロトコルまたはアルゴリズムを使用する様々なサーバ、システム、データベース、またはインターフェース交換データは、可能であれば、HTTP、HTTPS、AES、公開−非公開鍵交換、ウェブサービスAPI、既知の金融取引プロトコル、または他の電子的情報交換方法に基づく。デバイス間のデータ交換は、パケット交換ネットワーク、インターネット、LAN、WAN、VPN、または他のタイプのパケット交換ネットワーク、回線交換ネットワーク、セル交換網、または他のタイプのネットワークを介して行うことができる。
結果として、患者および腫瘍特異的ネオエピトープは、患者および腫瘍の種類に固有の可能性のあるエピトープまたはネオエピトープを最終的に予測する、排他的in silico環境において同定され得ることは認識されたい。そのように同定され、選択されたエピトープまたはネオエピトープは、次に、同定された患者のHLA型に対して、in silicoでさらにフィルタ処理され得る。このようなHLAマッチングは、エピトープまたはネオエピトープのMHC複合体への強い結合を確実に行い、したがって、エピトープまたはネオエピトープに対する免疫応答を引き起こすのを助けると考えられる。選択または同定されたネオエピトープは、患者にとって非天然であり得ることはさらに認識されたい。しかし、対象のエピトープおよびネオエピトープを同定するために、代替的または追加的フィルタ処理方法を使用できることを認識されたい。
同定されたネオエピトープをフィルタ処理することに関して、ネオエピトープは、オミックス(または他の)解析により、実際にネオエピトープが発現することが明らかになる本明細書での使用に特に好適であることが一般に企図されている。ネオエピトープの発現および発現レベルの同定は、当技術分野で公知のあらゆる様式で実施することができ、好ましい方法としては、RNA−seq、定量的RNA(hnRNAまたはmRNA)解析および/または定量的プロテオミクス解析が挙げられる。最も典型的には、ネオエピトープを含めるための閾値レベルは、対応する適合した正常配列の少なくとも20%の発現レベル、より典型的には少なくとも50%の発現レベルであり、したがって、(ネオ)エピトープは確実に免疫系で少なくとも潜在的に「目に見える」。結果として、オミックス解析はまた、遺伝子発現の解析(トランスクリプトーム解析)も含み、突然変異を有する遺伝子の発現レベルをこのように同定するのを助けることが一般に好ましい。当技術分野で公知のトランスクリプトーム解析法は数多くあり、既知の方法の全てが本明細書での使用に好適であると考えられる。例えば、好ましい物質としては、mRNAおよび一次転写物(hnRNA)が挙げられ、RNA配列情報は、同じ患者の腫瘍試料および適合した正常な(健康な)試料から順に得られる逆転写ポリA±RNAから得ることができる。同様に、ポリA±RNAは典型的にはトランスクリプトームの表現として好ましいが、他の形態のRNA(hn−RNA、非ポリアデニル化RNA、siRNA、miRNAなど)も本明細書での使用に適していると考えられることに留意されたい。好ましい方法には、定量的RNA(hnRNAもしくはmRNA)解析および/または定量的プロテオミクス解析が含まれる。最も典型的には、qPCRおよび/またはrtPCRに基づく方法を用いてRNA定量およびシーケンシングが行われるが、他の方法(例えば、固相ハイブリダイゼーションに基づく方法)も好適であると考えられる。別の観点から見ると、トランスクリプトーム解析は、癌および患者特異的突然変異を有する遺伝子を同定し、定量化するために(単独またはゲノム解析と組み合わせて)好適であり得る。
したがって、上記を考慮して、腫瘍および適合した正常組織由来のDNAおよびRNAを含む患者試料を使用して、特定の突然変異を同定し、このような突然変異を定量化できることを認識されたい。
同様に、プロテオミクス解析は、多数の様式で実施されて、ネオエピトープの発現を確認することができ、全ての既知の様式またはプロテオミクス解析が本明細書において企図される。しかし、特に好ましいプロテオミクス法としては、抗体に基づく方法および質量分光法(例えば、SRM、CRM、MRM)が挙げられる。さらに、プロテオミクス解析は、タンパク質そのものに関する定性的または定量的情報を提供するのみでなく、タンパク質が触媒活性または他の機能的活性を有するタンパク質活性データも含み得ることに留意されたい。プロテオミクスアッセイを実施するための技術の一例としては、2004年3月10日に出願の米国特許明細書第7,473,532号(Darflerら)表題「Liquid Tissue Preparation from Histopathologically Processed Biological Samples, Tissues, and Cells」が挙げられる。
さらに、ネオエピトープは、所定の構造的および/または細胞内位置パラメータを使用して、詳細な解析およびフィルタ処理を受けてもよい。例えば、ネオエピトープ配列は、それらが膜関連位置を有するものとして同定される場合(例えば、細胞の細胞膜の外側に位置する場合)、および/またはin silico構造計算によってネオエピトープが溶媒に暴露される可能性があり、または構造的に安定なエピトープなどを提示することが確認される場合、さらに使用するために選択されることが企図される。
フィルタ処理のさらに別の態様において、ネオエピトープは、既知のヒト配列を含むデータベースと比較して、ヒトと同一の配列の使用をこのように避けることができる。さらに、フィルタ処理はまた、患者内のSNPに起因するネオエピトープ配列を除去することを含み得る。例えば、The Single Nucleotide Polymorphism Database(dbSNP)は、National Human Genome Research Institute(NHGRI)と協力して国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)によって開発され、主催されている様々な生物種内および様々な生物種間の遺伝的変異に関する無料公開アーカイブである。データベースの名前は、多型の1つのクラス(すなわち、一塩基多型(SNP))のみのコレクションを意味するが、実際には、以下の比較的広い範囲の分子変異を含む:(1)SNP、(2)短い欠失および挿入多型(indel/DIP)、(3)マイクロサテライトマーカーまたは短いタンデムリピート(STR)、(4)多ヌクレオチド多型(MNP)、(5)ヘテロ接合配列、および(6)名前付きの突然変異体。dbSNPは、明らかに中性の多型、既知の表現型に対応する多型および変化のない領域を受け入れる。このようなデータベースを用いて、患者および腫瘍特異的ネオエピトープをさらにフィルタ処理して、これらの既知の配列を除去し、複数のネオエピトープ配列を有する治療配列セットを得ることができる。
いくつかの実施形態では、ネオエピトープは、対立遺伝子頻度にTPM数を乗じたものに基づいてスコア付け/ランク付けして、尤度スコアを得ることができる。次にこのスコアは、HLA情報および患者のHLA型に対する計算されたまたは実際の結合親和性を用いてさらに増強することができる。例えば、例示的なランク付け形式は、以下のとおりであってもよい。
Figure 2018536225
ここで、ファイルはFASTAフォーマットのファイルであり、エントリは文字「>」で始まる。これは、単に試料情報を報告するのみである。次行はネオエピトープである。試料情報行には、インデックス付けに使用される番号を含む。試料(例えば、254)、Refseq遺伝子ID(例えば、NM_001000.3)、HUGO一般名(例えば、RPL39)、変異体分類(例えば、ミスセンス)、タンパク質変化(例えば、p.M29K)、塩基対変化(例えば、A−>T)、正常エピトープ(例えば、正常:WIRMKTGNK)、対立遺伝子頻度(例えば、AF:0.179104477612)、遺伝子のTPM(例えば、TPM:1023.96)、TPM_MEDIAN(すべての遺伝子の中央値発現レベル)(例えば、TPM_MEDIAN:7.35)、LLスコア(ちょうどAFxTPMである)(例えば、LL:183.395820896)、netMHC予測結合値(例えば、netMHC:242.96)、ネオエピトープが結合する特異的HLA対立遺伝子(例えば、対立遺伝子:HLA−A0301)。次の行はネオエピトープである(例えば、WIRKKTGNK)。
漸増同期解析および膨大なサイズのシーケンスファイルでは、本発明の主題の方法をヒトに実施するには全く適さないものであることを認識されたい。これは、このようなファイル解析を行うことで、1日当たり10,000の塩基を解析するとしてもヒトの寿命を容易に上回るためである。さらに、ゲノム配置の解の計算は、ヒトによる行為が不可能になる可能性をさらに高める。さらに、キメラ参照核酸の特定のファイル構造(すなわち、ウイルス配列を個々の染色体として編成/インデックス付けさせ、マージしたウイルス核酸配列および哺乳動物核酸配列)は、劇的に解析時間を改善する技術的効果を有することが指摘されるものとする。これは、こうしたファイル構造が、(a)配列全体をメモリにロードするのと比較して、多くのメモリを必要とせずに迅速に処理することができ、かつ(b)このような方法が、非患者オミックスのための情報源の数ごとに別途指示されるため、3つ以上ではなく2つのシーケンスファイルの解析のみを必要とするため、エピトープまたはネオエピトープのゲノム組み込みおよび同定の迅速な解析を可能にするためである。
HLA決定は、当技術分野において周知の湿式化学法における種々の方法を用いて実施することができ、これらの方法の全ては、本明細書での使用に好適であると考えられる。しかし、特に好ましい方法では、HLA型は、以下でより詳細に示されるように、既知のおよび/または共通のHLA型の大部分または全てを含む参照配列を用いて、in silicoのオミックスデータから予測することもできる。要するに、患者のHLA型が確認され(湿式化学法またはin silico決定を使用して)、HLA型の構造解が計算されるか、またはデータベースから取得され、次にそれがin silicoのドッキングモデルとして使用され、ネオエピトープのHLA構造解への結合親和性を決定する。結合親和性の決定に好適な系としては、NetMHCプラットフォームが挙げられる(例えば、Nucleic Acids Res.2008年7月1日;36(Web Server issue):W509−W512参照)。次いで、以前に決定されたHLA型に対して高親和性(例えば、100nM未満、75nM未満、50nM未満)を有するネオエピトープが選択される。最も高い親和性を計算する際に、ネオエピトープに対する修飾は、エピトープにN−および/またはC−末端修飾を加えて、ウイルスに発現したネオエピトープのHLA型への結合をさらに増やすことによって実施することができる。したがって、ネオエピトープは、同定されるときに天然型であり得るか、または特定のHLA型により良く適合するように、さらに修飾されてもよい。
いくつかの態様では、HLAタイピングは、患者のHLAタイプをin silicoで予測する方法を伴い、この方法では、既知のおよび異なるHLA対立遺伝子の複数の配列を含む参照配列が提供され、かつ複数の患者配列リードが提供され、患者配列リードのうちの少なくともいくつかは、患者特異的HLAをコードする配列を含む。更なるステップでは、患者配列リードを、複数のk−merのそれぞれのセットに分け、次いで、参照配列および複数のk−merのそれぞれのセットを使用して複合de Bruijnグラフを作成する。既知のおよび異なるHLA対立遺伝子の各々は、複数の患者配列リードのそれぞれの票から計算された複合適合スコアを用いてランク付けされ、各票は、既知のおよび異なるHLA対立遺伝子において対応するセグメントに適合するk−merを使用することがさらに企図される。
好ましい実施形態では、オミックスデータは、カラーのDe Bruijnグラフを使用して解析することができ、エッジは、k−merがどの供給源(例えば、参照、正常試料および/または腫瘍試料、異なる時間または年齢で採取された試料、異なる患者または対象群からの試料など)に発見されたかを同定する「色」を有するk−mer(k=15)であり、および各エッジが隣接するエッジに接続している。例示的なシステムおよび方法は、米国仮出願第62/209858号に記載されている。例えば、ゲノム中のk−mer位置を保存するために、第1のグラフを参照配列から構築することができる。この参照配列は、すべての既知の(または少なくともすべての共通のHLA型配列)から構築されることに留意されたい。好ましくは、必要とされる特定のタスクに依存して、k−merは、3〜300塩基、より好ましくは10〜100塩基、最も好ましくは10〜20または13〜18塩基の長さを有する(例えば、k=13)。最初のグラフが確立されると、ゲノムの所与の領域に位置する腫瘍および正常な生シーケンシングデータからのk−mer(マッピングされていないアンカーされたリードを含む)が加えられる。必要に応じて、最大サポートが特定のユーザ定義の閾値(例えば、k=13であり、閾値は8である)よりも低いリードを刈り込むために、グラフから弱いエッジを除去することができる。このような刈り込みが、通常、配列の予測/アライメントの精度を高める。
さらなるステップにおいて、このように構築された複合グラフは、腫瘍および参照が発散する接合部について解析が行われる。各発散について、縦型探索を使用して、結果的に腫瘍が参照と収束する腫瘍縁部を通るすべての固有の経路を同定する。これは、バブル(k−merを用いた配列情報の違いによって生じる発散点および収束点)として発現し得る。
次に、各バブル解の終点からの統計解析を用いて、最も可能性の高いアラインメントおよび/または配列を同定することができる。最も一般的な実施形態のように、配列は単純な生配列リードではなく、注釈付きSAMまたはBAMファイルであることから、統計解析は各リードのメタデータに基づくリード固有パラメータを含むことができる。したがって、統計解析には、最大サポート、k−merのマッピング/ベース品質、適合正常組織におけるサポートなどが含まれ得る。結果として、参照配列を再構築するための参照エッジに沿ったバックトラック法と、ゲノム中での位置の決定は、典型的にはユーザ定義基準(例えば、最小サポート>Xリード、正常組織中の最大サポート<Yリードなど)を満たすグラフ内での経路について実施され得ることを認識されたい。次いで、こうして再構築された配列および/または構造を使用して、特定の変異体を分類することができる。好ましくは、突然変異体の分類はVCFフォーマットで表されるが、他のフォーマットも企図される。
前述したように、HLA/MHC参照配列は、典型的には既知の対立遺伝子のライブラリーを含み、このライブラリーはその後、患者のDNAまたはRNAを用いて複合グラフを構築するために使用される参照グラフを形成するために使用される。例えば、患者試料に関してHLAを予測するために、所与のHLA型(A、B、C、G、DRB1、...)に対する全ての対立遺伝子のグラフが構築される。本発明の主題に限定するものではないが、単一の患者のBAMファイルからの一対のシーケンシングリードは断片として結合され、HLA−Aグラフを介して「繋がれ」、これによってベストフィットを確立するためにランク付けされる。例えば、問題の断片(共有されたk−merの画分として定義される)と最良(または同等)の類似性を有するHLA対立遺伝子は、各共有k−merについてスコアを1カウント増加させ、次いで、そのスコアに従って最上位のHLA対立遺伝子を選択することができる。当然のことながら、他のメトリック(例えば、全体的なカバレッジ深度、グラフエッジ、断片によって覆われたHLA配列の分画など)を収集し、スコアリングに用いることもできることに留意されたい。
最も典型的には、HLA参照配列は、少なくとも1%の対立遺伝子頻度を有する少なくとも1つのHLA型の対立遺伝子を含むか、またはHLA参照配列は、少なくとも1つのHLA型の少なくとも10の異なる対立遺伝子を含み、かつ/または少なくとも2つの異なるHLA型の対立遺伝子を含む。HLA型に関しては、好適なHLA型は、HLA−A型、HLA−B型、HLA−C型、HLA−DRB−1型、および/またはHLA−DQB−1型を含むことが企図されている。
本発明の主題の1つの例示的な態様では、データベースまたはシーケンシングマシンによって、染色体6p21.3(またはHLA対立遺伝子が発見される近傍/その付近にある他の任意の位置)にマッピングする比較的多数の患者配列リードが提供される。最も一般的には、配列リードは、約100〜300塩基の長さを有し、リード品質、アライメント情報、配向、位置などのメタデータを含む。例えば、好適なフォーマットには、SAM、BAM、FASTA、GARなどが含まれる。本発明の主題に限定されるものではないが、患者配列リードが、少なくとも5倍、より典型的には少なくとも10倍、さらにより典型的には少なくとも20倍、最も典型的には少なくとも30倍のカバレッジ深度を提供することが一般に好ましい。
企図された方法は、患者配列リードに加えて、既知のおよび異なるHLA対立遺伝子の複数の配列を含む1つ以上の参照配列をさらに使用する。例えば、典型的な参照配列は、そのHLA型の複数のHLA対立遺伝子を有する少なくとも1つのHLA型の配列セグメントを含む合成(対応するヒトまたは他の哺乳動物対応物のない)配列であり得る。例えば、好適な参照配列は、HLA−Aの少なくとも50の異なる対立遺伝子についての既知のゲノム配列のコレクションを含む。代替的に、または追加的に、参照配列は、HLA−Aの少なくとも50の異なる対立遺伝子についての既知のRNA配列のコレクションを含んでもよい。当然のことながら、さらに詳細に後述するように、参照配列はHLA−Aの50の対立遺伝子に限定されず、HLA型に関する代替的組成および対立遺伝子の数/組成を有してもよい。最も典型的には、参照配列はコンピュータ可読フォーマットであり、データベースまたは他のデータ記憶装置から提供される。例えば、好適な参照配列フォーマットとしては、FASTA、FASTQ、EMBL、GCG、またはGenBankフォーマットが挙げられ、公共のデータレポジトリ(例えば、IMGT、the International ImMunoGeneTics information system、またはThe Allele Frequency Net Database、EUROSTAM、www.allelefrequencies.net)のデータから直接得るか、またはこれらのデータから構築されてもよい。あるいは、参照配列は、対立遺伝子頻度、民族対立遺伝子分布、共通または希少対立遺伝子型などの1つ以上の所定の基準に基づいて、個々の既知のHLA対立遺伝子から構築されてもよい。
ここでは、参照配列を使用して、患者配列リードを、de Bruijnグラフを介して繋げることができ、ベストフィットを有する対立遺伝子を同定することができる。この文脈において、各個体は各HLA型について2つの対立遺伝子を保有し、これらの対立遺伝子は非常に類似しているか、場合によっては同一であってもよいことに留意されたい。このような高度の類似性は、従来のアライメントスキームにとって重要な問題を提起する。比較的小さいk−mer(典型的には10〜20塩基の長さを有する)に配列リードを分けることによってde Bruijnグラフが構築されるアプローチを使用して、および対立遺伝子の配列と適合するその配列リードのk−merを基準として、各患者配列リードが対立遺伝子の各々についての票(「定量的リードサポート」)を提供する加重投票プロセスを実施することによって、HLA対立遺伝子および非常に密接に関連する対立遺伝子を解明し得ることが企図される。次いで、対立遺伝子の累積的に最も高い票は、予測される最も可能性の高いHLA対立遺伝子を示す。さらに、対立遺伝子に適合する各断片が、その対立遺伝子の全体的なカバレッジおよびカバレッジ深度を計算するためにも使用されることが、一般に好ましい。高精度in silico HLAタイピングのさらなる態様、好適な方法および考慮事項は、共通に所有されている国際PCT/US16/48768に記載されている。
スコアリングは、特に、多くの最上位ヒットが類似している場合(例えば、スコアのかなりの部分が高度に共有されたk−merセット由来である場合)、必要に応じて更に改善または改良することができる。例えば、スコアの改良は、現在の最上位ヒットと実質的に類似する対立遺伝子(例えば、>99%、または他の所定の値)が将来の検討から除去される重み付けスキームを含むことができる。現在の最上位ヒットによって使用されるk−merの数は、因子(例えば、0.5)によって再度重み付けされ、各HLA対立遺伝子のスコアは、これらの重み付け数を合計することによって再計算される。この選択プロセスが繰り返し行われて、新しい最上位ヒットを見つける。この方法の精度は、DNAに存在する2つの対立遺伝子のうちのただ1つであり得る腫瘍によって発現される対立遺伝子の同定を可能にするRNA配列データを用いてさらに改善され得る。企図されるシステムおよび方法のさらなる有利な態様では、DNAもしくはRNA、またはDNAとRNAの両方の組み合わせを処理して、非常に正確であり得るHLA予測を行うことができ、かつ腫瘍または血液DNAまたはRNAから誘導され得る。
このような改良は、各HLA型が多くの場合非常に類似した対立遺伝子を有するために、DNAおよび/またはRNAシーケンシング情報からのHLA決定に特に有利である。また、従来のアライメント方法は、典型的には、配列が高度の類似性を有する場合には有意な差別化能力を有さない。
当然のことながら、解析およびHLA予測は、上に示した特定のHLA型に限定される必要はなく、本明細書では、HLA−E、HLA−F、HLA−G、HLA−H、HLA−J、HLA−K、HLA−L、HLA−V、HLA−DQA1、HLA−DMA、HLA−DMB、HLA−DOA、HLA−DOB、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DRA、HLA−DRB345、HLA−MICA、HLA−MICB、HLA−TAP1、HLA−TAP2、などの全てのHLA型および対立遺伝子多型、さらには新たに発見されたHLA型およびそれらの対応する対立遺伝子が企図されることを認識されたい。さらに、解析は単一のHLA型に限定される必要はなく、複数のHLA型が本明細書での使用に好適であることを認識されたい。結果として、参照配列は、それぞれのHLA型についての対立遺伝子のコレクションを有する2つ、3つ、4つまたはそれ以上のHLA型を含み得る。各HLA型は有意な数の対立遺伝子を有するので、既知の対立遺伝子の全てを参照配列に含める必要はないことが企図される。例えば、参照配列は、少なくとも0.1%、または少なくとも0.5%、または少なくとも1%、または少なくとも2%、または少なくとも5%の対立遺伝子頻度などの特定の閾値を上回る対立遺伝子頻度を有する対立遺伝子を含んでもよい。したがって、異なる観点から見ると、好適な参照配列は、少なくとも1つのHLA型に対して、少なくとも10個、または少なくとも30個、または少なくとも50個、または少なくとも100個、または少なくとも200個、または少なくとも500個、またはそれ以上の異なる対立遺伝子を含み得る。
一旦、患者および腫瘍特異的ネオエピトープおよびHLA型が同定されると、ネオエピトープをHLAにドッキングさせ、最良の結合剤(例えば、最低K、例えば、50nM未満)を決定することによって、コンピュータ解析を行うことができる。このようなアプローチは、患者および腫瘍にとって真性である特定のネオエピトープを同定するだけでなく、細胞上に提示される可能性が最も高いネオエピトープおよび治療効果を有する免疫応答を誘発する可能性が最も高いネオエピトープも同定するであろうことを認識されたい。当然のことながら、このように同定されたHLA適合ネオエピトープは、さらに後述するようにエピトープをコードする核酸をペイロードとしてウイルスに含める前にin vitroで生化学的に検証できることも認識されたい。
当然のことながら、患者および腫瘍特異的ネオエピトープに対する患者のHLA型の適合は、NetMHC以外のシステムを用いて行うことができ、好適なシステムとしては、NetMHC II、NetMHCpan、IEDB Analysis Resource(URL immuneepitope.org)、RankPep、PREDEP、SVMHC、Epipredict、HLABinding、およびその他が挙げられる(例えば、J Immunol Methods 2011;374:1−4参照)ことは認識されたい。最も高い親和性を計算する際には、変更されたアミノ酸の位置が移動したネオエピトープ配列のコレクション(上記)を用いることができることに留意されたい。代替的に、または追加的に、ネオエピトープの修飾は、発現されたネオエピトープの患者へのHLA型への結合をさらに増やすために、N−および/またはC−末端修飾を加えることによって実施され得る。したがって、ネオエピトープは、同定されるときに天然型であり得るか、または特定のHLA型により良く適合するように、さらに修飾されてもよい。
さらに、所望の場合、対応する野生型配列(すなわち、アミノ酸変化のないネオエピトープ配列)の結合を計算して、確実に高い示差的親和性とすることができる。例えば、ネオエピトープとその対応する野生型配列との間のMHC結合における特に好ましい高い示差的親和性は、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍など)である。
このような方法は、特定の患者ゲノムに組み込まれたウイルス配列の特異的突然変異など、特定の患者ゲノムにおける特定の突然変異に基づいて免疫療法治療のための新しいウイルスエピトープを同定するという利点を提供することを認識されたい。このようなウイルスエピトープは、「従来」のワクチン接種プロトコルでは同定できない。
遺伝子修飾されたアデノウイルスの「ペイロード」については、2つ以上、例えば2つ、3つ、4つ、5つ、およびそれ以上のネオエピトープの発現が好ましく、これは、複数の別個の修飾ウイルス、または(例えば、コンカテマーまたはキメラ配列として)2つ以上のネオエピトープ配列を有するウイルスを用いて達成され得ることが企図されている。
次いで、同定されたHLA適合ネオエピトープは、1つ以上のタイプの患者、腫瘍、および位置特異的免疫療法において使用されることが好ましい。例えば、免疫療法は、免疫応答を誘発するように発現させるためにウイルス媒介性癌抗原を送達することを含んでもよく、これは、チェックポイント阻害剤でさらに増強され得る。一方、このように同定されたネオエピトープに対する患者特異的抗体、腫瘍特異的抗体および位置特異的抗体(または合成抗体)は、薬物または放射性化学物質の標的化部分として使用され得るか、またはNK細胞と共に使用されて、細胞傷害性T細胞応答を誘発し得る。
組換えウイルスを使用する場合、組換えウイルスを作製する全ての既知の様式が本明細書での使用に好適であると考えられるが、特に好ましいウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなど、遺伝子治療において既に確立されているものであることが企図される。しかし、他の適切な選択の中でも、アデノウイルスが特に好ましい。さらに、ウイルスが、選択されたウイルスタンパク質(例えば、E1、E3タンパク質)の標的化された欠失によって典型的に達成される複製欠損および非免疫原性ウイルスであることが、さらに一般に好ましい。このような望ましい特性は、E2b遺伝子機能を欠失させることによってさらに増強され得、高力価の組換えウイルスは、近年報告された(例えば、J Virol.1998年2月;72(2):926−933)などの遺伝子修飾ヒト293細胞を用いて得ることができる。最も典型的には、(ウイルス感染細胞からの発現のための)所望の核酸配列は、当技術分野で周知の適切な調節エレメントの制御下にある。
最も好ましくは、組換え核酸(複数可)の治療用調製物は、エピトープがMHC−1および/またはMHC−II提示経路に向けられるような配置で、癌関連もしくは癌特異的エピトープ、または患者特異的ネオエピトープをコードする。このような免疫刺激は、皮下送達または共刺激分子および/もしくはチェックポイント阻害剤の(より典型的な)発現によってさらに増強される、より頑強な免疫応答を生じると考えられる。当然のことながら、こうした組換え核酸(複数可)の全ての送達様式が好適であると考えられ、組換え核酸(複数可)は、DNAワクチンとして配合され得るか、組換えウイルスゲノムの一部であるか、またはトランスフェクション組成物中において送達可能であり得ることは認識されたい。さらに、ウイルスビヒクル(およびペムブロリズマブ、ニボルマブ、イピリムマブなどの任意のチェックポイント阻害剤)の皮下投与は、適切なB細胞応答および付随するIgG1産生をもたらし、これらは、移入されたNK細胞を使用して増幅し得る。最も好ましくは、修飾NK細胞は高親和性Fcγ受容体(CD16)を含み、(腫瘍関連エピトープおよび/またはネオエピトープに対して高い特異性を有する)キメラ抗原受容体をさらに発現し得る。
ウイルスは、典型的には、投与単位当たり10〜1011個のウイルス粒子のウイルス力価を有する滅菌注射用組成物として配合される、医薬組成物中の治療用ワクチンとして個々にまたは組み合わせて使用され得る。しかし、代替的配合物も本明細書での使用に好適であると考えられ、全ての既知の投与経路および投与様式が本明細書において企図される。本明細書中で使用される場合、医薬組成物または薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物または薬物の直接投与および間接的投与の両方を指し、医薬組成物または薬物の直接投与は、典型的には、医療従事者(例えば、医師、看護師など)によって実施され、間接的投与には、直接投与(例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などを介して)のために医薬組成物もしくは薬物を医療従事者に提供するか、または利用できるようにするステップを含む。
最も好ましい態様では、シグナルペプチドは、エンドソームおよびリソソーム区画への輸送のために、または細胞質空間における保持のために使用され得る。例えば、ペプチドがプレ配列を標的とするエンドソームおよびリソソーム区画に搬出される場合、内部標的ペプチドを使用することができる。標的ペプチドのプレ配列は、好ましくはN末端に付加され、6〜136個の塩基性および疎水性アミノ酸を含む。ペルオキシソームが標的の場合、標的配列はC末端にあってもよい。他のシグナル(例えば、シグナルパッチ)を使用してもよく、ペプチド配列において分離し、適切なペプチドの折り畳みの際に機能的になる配列エレメントを含むことができる。さらに、グリコシル化などのタンパク質修飾は、標的化を誘導し得る。他の好適な標的シグナルのうち、本発明者らは、ペルオキシソーム標的シグナル1型(PTS1)、C末端トリペプチド、およびN末端近くに位置するノナペプチドであるペルオキシソーム標的シグナル2型(PTS2)を企図する。さらに、エンドソームおよびリソソームへのタンパク質の選別は、タンパク質の細胞質ゾルドメイン内のシグナル(典型的には短い線状配列を含む)によって媒介されてもよい。いくつかのシグナルは、チロシンベースの選別シグナルと呼ばれ、NPXYまたは
Figure 2018536225
コンセンサスモチーフに適合する。ジロイシンベースのシグナルとして公知の他のシグナルは、[DE]XXXL[LI]またはDXXLLコンセンサスモチーフに適合する。これらのシグナルは全て、膜の細胞質面の周辺に関連するタンパク質コート成分によって認識される。
Figure 2018536225
および[DE]XXXL[LI]シグナルは、アダプタタンパク質(AP)複合体AP−1、AP−2、AP−3およびAP−4によって特徴的な細かい特異性により認識されるが、DXXLLシグナルは、GGAとして公知のアダプタの別のファミリによって認識される。また、液胞タンパク質の選別およびエンドソーム機能に関連するFYVEドメインを加えることができる。さらなる態様において、エンドソーム区画は、ヒトCD1テール配列を用いて標的化することもできる(例えば、Immunology、122,522−531参照)。
このような方法は、そのペプチドが別の方法でそのMHCサブタイプによって提示されなくても、ペプチドとの最も高い親和性を有するMHCサブタイプへのペプチドの特異的送達を可能にすることを認識されたい。
細胞質ゾル区画への輸送または細胞質ゾル区画内での保持は、必ずしも1つ以上の特異的配列要素を必要としない場合がある。しかし、少なくともいくつかの態様では、膜アンカータンパク質または膜アンカータンパク質の膜アンカードメインなど、NまたはC末端の細胞質保持シグナルが加えられてもよい。例えば、膜アンカータンパク質としては、SNAP−25、シンタキシン、シナプトプレビン(synaptoprevin)、シナプトタグミン、小胞関連膜タンパク質(VAMP)、シナプス小胞糖タンパク質(SV2)、高親和性コリン輸送体、ニューレキシン、電位依存性カルシウムチャネル、アセチルコリンエステラーゼおよびNOTCHが挙げられる。
さらに別の企図される態様では、様々なネオエピトープを多数の様式で配置することができ、転写または翻訳単位は、典型的には短いリンカー(例えば、4〜20個のアミノ酸を有するフレキシブルリンカー)によって分離された複数のエピトープのコンカテマー配置を有することができ、これはさらにプロテアーゼ切断部位を含み得ることに留意されたい。このようなコンカテマーは、1〜20個のネオエピトープ(典型的には、ウイルスを介して送達され得る組換え核酸のサイズによって制限される)を有することができ、コンカテマーは、MHC−IおよびMHC−II複合体への送達について同一であり得るか、または異なることに留意されたい。したがって、MHC−Iおよび/またはMHC−IIによる優先的または特異的な提示をこのように達成するために、様々なペプチドを特定の細胞区画に送ることができることを認識されたい。別の観点から見ると、腫瘍関連抗原およびネオエピトープは、両方の提示経路を介して、または同時にもしくは連続した投与経路で選択的に一方もしくは他方の経路を介して提示され得ることを認識されたい。さらなる好適な構成および発現カセットに関しては、2016年2月11日に出願された同時係属中の米国仮出願、表題「Compositions And Methods For Coordinated Antigen Presentation」、またはそれに関連する出願を参照する。
本発明の主題に限定されるものではないが、ネオエピトープ配列は、タンデムミニ遺伝子(例えば、aa12−ネオエピトープ12−aa12)として、または単一の転写単位として構成されることが一般に好ましく、これはキメラタンパク質に翻訳されてもされなくてもよい。このように、エピトープは、上記ですでに論じたように、単量体、多量体、個々にもしくはコンカテマーとして、またはN末端および/もしくはC末端ペプチドとのハイブリッド配列として提示することができることを認識されたい。最も典型的には、核酸配列は、ウイルスおよび/または宿主コドンの選好に適応するために好適なコドン使用を用いて逆翻訳されることが好ましい。しかし、代替コドン使用または非適合コドン使用もまた適切であると考えられる。
さらに、ウイルス送達ビヒクルは、少なくとも1つ、より典型的には少なくとも2つ、より典型的には少なくとも3つ、最も典型的には少なくとも4つの共刺激分子もコードして、感染した樹状細胞とT細胞との間の相互作用を増強することが好ましい。例えば、好適な共刺激分子としては、特にB7.1(CD80)および/またはB7.2(CD86)と組み合わせたICAM−1(CD54)、ICOS−LおよびLFA−3(CD58)が挙げられる。さらに企図される共刺激分子としては、4−1BBL、CD30L、CD40、CD40L、CD48、CD70、CD112、CD155、GITRL、OX40LおよびTL1Aが挙げられる。さらに、共刺激分子の発現は、好ましくは、抗原および/またはネオエピトープが1つ以上の共刺激分子と共に提示されるように配位されることを認識されたい。したがって、典型的には、共刺激分子は、内部リボソーム進入部位もしくは2A配列を使用する単一転写産物から、または複数の転写産物から産生されることが企図される。
同様に、ウイルスベクターは、チェックポイント受容体に結合する1つ以上のペプチドリガンドをコードする配列部分をさらに含むことが企図される。最も典型的には、結合は受容体を介するシグナル伝達を阻害するか、少なくとも低減する。特に企図される受容体としては、CTLA−4(特にCD8+細胞)PD−1(特にCD4+細胞)が挙げられる。例えば、ペプチド結合剤としては、抗体断片、特にscFv、および受容体に特異的に結合する小分子ペプチドリガンドを挙げることができる。さらに、ペプチド分子の発現は、好ましくは、抗原および/またはネオエピトープが1つ以上のペプチド分子と共に提示されるように配位されることを認識されたい。したがって、典型的には、ペプチド分子は、内部リボソーム進入部位もしくは2A配列を使用する単一転写産物から、または複数の転写産物から産生されることが企図される。
最後に、ウイルスが複数のネオエピトープをコードする核酸ペイロードを含む場合、複数のネオエピトープが少なくとも付加的にまたは相乗的に宿主免疫応答を増強し得ることが企図されることに留意されたい。同様に、複数のウイルスが異なるネオエピトープを有する各ウイルスとともに使用される場合、複数のネオエピトープが少なくとも付加的にまたは相乗的に宿主免疫応答を増強し得ることが企図される。このような付加的または相乗的効果は、特定の腫瘍または病期に対して真性であり得るか、または特定の患者パラメータ(例えば、年齢、性別、以前の治療など)に特異的であり得る。
1つ以上の患者およびウイルス特異的ネオエピトープに対する合成抗体は、n−mer長(典型的には7〜11mer)を有する固有のネオエピトープ配列を得るためにオミックスデータのin silico解析(典型的には、全ゲノムシーケンシングおよび発現プロファイリング)によって生成され得る。次いで、これらの配列を用いて実際のペプチド配列を調製する。例えば、癌性ネオエピトープ配列を有するペプチドは、固相(例えば、メリフィールド合成を用いて)で、液相合成を介して、またはより小さいペプチド断片から調製することができる。あまり好ましくない態様では、ペプチドは、好適な宿主での(特に複数のネオエピトープが単一のペプチド鎖上にあり、任意によりネオエピトープまたは切断部位の間にスペーサーがある場合)組換え核酸の発現によって産生させることもできる。ペプチドは固相に固定化され、ネオエピトープに対する特異的結合親和性を有するフィッシング抗体の餌として使用される。次いで、抗体を解析し、解析の結果を用いて合成組換え抗体を調製する。このようにして産生された合成抗体(合成体(synbody))は結果的に、患者特異的エピトープに高特異性で結合することが期待される。最も顕著なことに、このような合成体は、患者突然変異のコンピュータ解析から収集された情報のみを使用して完全に人工的に生成される。
例えば、1つ以上のペプチドネオエピトープ(例えば、9mer)を固体担体(例えば磁性または色分けしたビーズ)上に固定化し、表面提示抗体断片または抗体に結合させるための餌として使用することができる。最も典型的には、このような表面提示抗体断片または抗体は、M13ファージ(例えば、タンパク質III、VIIIなど)と会合しており、抗体断片に関する多数のライブラリーが当技術分野で公知であり、本明細書中に提示された教示と併せて好適である。必要に応じて、より小さいライブラリーを使用して、親和性成熟に供して、当技術分野で周知の方法を用いて結合親和性および/または動力学を改善することもできる(例えば、Briefings in functional genomics and proteomics第1巻、第2号、189‐203.2002年7月参照)。さらに、抗体ライブラリーが一般に好ましいが、他の足場もまた好適であると考えられ、βバレル、リボソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイなどが含まれることに留意されたい(例えば、Protein Sci.2006年1月;15(1)14−27参照)。しかし、合成ネオエピトープを使用して、モノクローナル抗体を含む抗体を作製する他の従来の様式も本明細書において明らかに企図される。
合成ペプチド(癌性ネオエピトープを含むまたは対応する)が固相に固定化されるいくつかの実施形態では、ネオエピトープに対する親和性薬剤、ならびに特に抗体を単離および/または精製することができる。最も好ましくは、このような単離には、予め作製された抗体の高多様性ライブラリーが含まれる。本明細書で使用されるとき、文脈によって別段の指示がない限り、用語「抗体(複数可)」は、抗体の全てのアイソタイプおよびサブタイプ(例えば、IgG、IgM、IgEなど)、ならびにこれらの全ての断片、一価のIgG、F(ab’)、Fab’、Fab、scFv、scFv−Fc、VhHなどが挙げられる。さらに、ヒトまたは非ヒト(例えば、げっ歯類)起源の企図される抗体は、ヒト化され得るか、またはキメラであり得る。典型的な方法において、高多様性ライブラリーは、典型的にはM13ファージに基づき、少なくとも10の多様メンバー、または少なくとも1010の多様メンバー、もしくはそれ以上の多様性を有するファージディスプレイライブラリー、ならびにpIII、pVIII、pVI、もしくはpIXを介するか、またはT7ファージおよび遺伝子10キャプシドタンパク質に基づくディスプレイであってもよい。容易に認識されるように、大きな多様性ライブラリーを使用することで、最良の結合剤についてさらに選択され得るいくつかの結合候補抗体が比較的短時間で提供される。実際、固定化合成ペプチドに対する結合親和性が所望よりも小さい場合、当技術分野で周知のプロトコルを用いて親和性成熟によって親和性を改善できることを認識されたい。例えば、低親和性(K>10−7M)の結合剤またはより小さいライブラリーのメンバーを、親和性成熟に供して、当技術分野で周知の方法を用いて結合親和性および/または動力学を改善することができる(例えば、Briefings In Functional Genomics and Proteomics、1巻、第2号、189‐203.2002年7月参照)。さらに、抗体ライブラリーが一般に好ましいが、他の足場もまた好適であると考えられ、βバレル、リボソームディスプレイ、細胞表面ディスプレイなどが含まれることに留意されたい(例えば、Protein Sci.2006年1月;15(1)14−27参照)。したがって、好ましい態様では、合成ペプチドは抗体ライブラリー中において餌として使用され、高親和性結合(K<10−7M、より典型的にはK<10−8M)抗体をこのように同定することを認識されたい。
抗体は、これらの抗体をコードする核酸を保有する細胞に直接結合するので、このような核酸を解析して、それぞれ、軽鎖および重鎖のならびに/またはSDR(特異性決定残基)の高頻度可変性ループ、CDR1、CDR2およびCDR3をコードする配列要素を同定することができることをさらに認識されたい。最も典型的には、決定は標準的なシーケンシング法を用いて行われる。一旦決定されると、高頻度可変性ループ、またはCDR1−H、CDR2−H、および/もしくはCDR3−H、および/またはCDR1−L、CDR2−Lおよび/もしくはDR3−L、ならびに/またはSDRは、ヒトまたはヒト化抗体足場または抗体上にグラフトされることが企図される。容易に認識されるように、グラフトは、ヒトまたはヒト化抗体足場または抗体をコードする核酸の遺伝子工学によって行うことができる。例えば、各CDR内には、抗原との相互作用に直接関与するより多くの可変位置、すなわち特異性決定残基(SDR)が存在するが、CDRループのコンフォメーションを維持するより保存された残基が存在する。SDRは、抗原−抗体複合体の3D構造および/またはCDRの突然変異解析から同定され得る。SDRグラフトヒト化抗体は、SDRおよびCDRのコンフォメーションをヒト鋳型上に維持する残基をグラフトすることによって構築される。したがって、癌性ネオエピトープに対する特異性を有するヒトまたはヒト化抗体は、事前に抗原と接触していない細胞において抗体が発現される完全合成様式で調製され得ることは認識されたい。さらに、企図された方法では、ネオエピトープに対する抗体を産生しないかまたは効果的に使用することができなかった患者の治療のための患者および癌特異的抗体の産生が可能になる。
本発明の主題に限定するものではないが、このように調製された合成抗体は、IgG(または他のアイソタイプ)として、断片(例えば、二重特異性Fabもしくは他の二重特異性断片)として、および/またはキメラタンパク質として(例えば、キメラT細胞受容体中の外部ドメインとしてのscFvなど)、単独で、または治療剤もしくは診断剤と結合させて、および/または細胞への抗体の膜アンカーを確実に行うための膜貫通ドメインを有するハイブリッドタンパク質として、直接使用することができる。
ネオエピトープ配列に対応するかまたはそれを含む合成ペプチドの構造は、X−L−(A−L)mQであってもよく、式中、Xは、共有結合または非共有結合により、合成ペプチドを固相に付着させるのに好適である任意のカップリング基または部分であり、Lは、合成ペプチドを固相またはカップリング基に共有結合によりリンクする任意のリンカーであることが企図される。Aは、Aが天然(タンパク質原性)アミノ酸であり、nが7〜30の整数であり、最も典型的には7〜11または15〜25の整数である、ネオエピトープ配列を有する合成ペプチドである。Lは、特に複数の合成ペプチド配列(同一または異なる)が構築物中に存在し得える任意のリンカーであり、mが整数、典型的には1〜30、最も典型的には2〜15の整数である。最後に、Qは、合成ペプチドの末端を固相(例えば、ペプチドを立体的に拘束するため)、またはレポーター基(例えば、蛍光マーカー)または他の機能的部分(例えば、親和性マーカー)に連結するために使用され得る末端基である。結果として、合成ペプチドが直接MHC−1結合に使用される場合、全長は8〜10個のアミノ酸であることに留意されたい。同様に、合成ペプチドが直接MHC−II結合に使用される場合、全長は14〜20個のアミノ酸である。一方、MHC提示の前に合成ペプチドが細胞内でプロセシングされる場合(典型的にはプロテアソームプロセシングを介して)、全長が典型的には10〜40個のアミノ酸であり、変化したアミノは、合成ペプチド中の中心位置にあるか、中心位置の近傍にある。
例えば、Xは、固相上の対応する結合剤(例えば、アビジン)に結合する非共有結合親和性部分(例えば、ビオチン)であり得るか、または、ペプチドのN末端もしくはC末端のアミノもしくはカルボキシル基と反応する化学基(スペーサーを有するかもしくは有さない)であり得るか、またはペプチドもしくはリンカーL中のスルフヒドリル基と反応する選択的反応性の基(例えば、ヨードアセチルもしくはマレイミド基)であり得る。Lは、合成ペプチドの固相からの距離を増加させるために使用され得、したがって、典型的には、Lは、約2〜20個の炭素−炭素結合(例えば、0.3nm〜3nm)に等しい長さを有するフレキシブルな直鎖部分(例えば、グリコール基、アルコキシ基、グリシンなどを含む)を含む。当然のことながら、合成ペプチドは、固相上にペプチドが生成され、したがって別個のカップリング基またはリンカーを必要としない固相を使用し得ることも認識されたい。
特定の合成ペプチドおよびカップリング方法に依存して、固相の性質がかなり変わることがあり、ペプチドの付着のための既知の固相は全て、本明細書での使用に好適であると考えられることは認識されたい。例えば、好適な固相としては、アガロースビーズ、ポリマービーズ(着色または他の方法で個別に対応可能)、マイクロタイタープレート中のウェルの壁面、紙、ニトロセルロース、ガラスなどが挙げられる。当業者は、固相および付着化学的性質の好適な選択を容易に評価することができる。さらに好ましい態様では、固相は一般に、ファージ(または他の足場担体)上に提示されたペプチドが、合成ペプチドを介して固相に可逆的に結合し得るなどの、ファージディスプレイ法に関連するプロトコルに好適であることに留意されたい。さらに企図される用途において、固相は、特に、合成タンパク質が哺乳動物においてワクチンとして、または抗体産生のために非ヒト哺乳動物において免疫原性化合物として使用される場合には、ワクチン接種に使用される担体タンパク質(例えば、アルブミン、KLH、破傷風トキソイド、ジフテリア毒素など)であり得ることが認識されよう。同様に、合成タンパク質は、いかなる担体もなく、ワクチンまたは免疫原性化合物として使用することもできる。
合成ネオエピトープに結合する抗体断片または抗体を同定する特定の方法にかかわらず、表示された抗体断片または抗体は、提示構造体(例えば、細胞またはファージ)を介して、表示された抗体の産生を導く対応する遺伝情報、およびそれにより、結合ポケットを形成するために必要なヌクレオチド配列に関する情報を提供することを認識されたい。例えば、表示された構造体が抗体断片または抗体である場合、核酸配列は、それぞれ軽鎖および重鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3ドメインの配列情報を提供する。次いで、この情報は、軽鎖および重鎖のそれぞれCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインの配列情報がグラフトされた核酸配列をインビトロで生成するために使用することができる。次いで、好適な系へのトランスフェクションは、同一の結合特性を有する合成抗体(「合成体」)の発現および産生をもたらす。当然のことながら、抗体という用語は、全長抗体ならびにその断片/部分を含むことに留意されたい。
次いで、このようにして産生された抗体断片または抗体をさらに修飾させて、治療または診断エンティティを作り出すことができる。例えば、抗体断片または抗体が(例えば、PETまたはSPECT活性の)同位体で標識されている場合、修飾された抗体断片または抗体を画像化に使用することができる。一方、抗体断片または抗体が放射性核種または化学療法剤で標識されている場合、修飾された抗体断片または抗体は、標的化学療法のために使用され得る。さらに企図される態様では、抗体断片または抗体は、免疫原性抗原であることが公知である抗原で修飾することもできる。このような修飾は、患者が以前に同じ抗原で免疫された場合に特に有利である。このようなシナリオでは、ネオエピトープを有する癌細胞は、免疫原性抗原を提示する修飾された抗体で塗装されることが企図される。これは、元のネオエピトープに対する免疫応答が免疫原性でないかまたは抑制されていない場合に特に有利である。
本出願人は、本発明の主題によって同定されたペプチド(例えば、TAA、ネオエピトープなど)と共に患者のバルク白血球(WBC)を培養することができることをさらに認識している。このようなアプローチは、バルクWBC中の抗原提示細胞による所望のMHC/ネオエピトープ複合体の産生を引き起こすことが予想される。したがって、患者のマクロファージ、樹状細胞およびB細胞は、病変組織を標的とする所望の性質を呈するように、NK細胞およびT細胞に指示を与える。
本発明の技術のさらに別の態様は、T細胞(例えば、CD4+T細胞、CD8+T細胞など)に関連する1つ以上の特徴を検出する方法を含む。より具体的には、試験は、ネオエピトープ反応性T細胞の同定に用いることができる特定のネオエピトープ(例えば、MHCIについては8mer〜12mer、MHCIIについては12mer〜25merなど)を提供することができる。このT細胞は、ネオエピトープ/MHCタンパク質複合体に対する特異的T細胞受容体を有する。したがって、この方法は、ネオエピトープ反応性T細胞を採取することを含むことができる。採取されたT細胞は、患者に再度組み込むための準備として、エクスビボで増殖または拡大することができる。あるいは、採取されたT細胞中のT細胞受容体遺伝子を単離し、ウイルスまたは他の養子細胞治療システム(例えば、CAR−T、CAR−TANKなど)に移入することができる。ネオエピトープ以外に、本発明の主題の方法は、1つ以上の腫瘍関連抗原(TAA)も提供し得る。したがって、試験から同定されたTAAに対して感受性である受容体を有するT細胞を採取することもできる。これらはまた、エクスビボで増殖または培養され、上述のような同様の治療様式で使用され得る。T細胞は、合成例のペプチドを産生し、商業的に産生されたMHCまたはMHC様タンパク質と結合させ、次いでこれらのエクスビボ複合体を用いて標的T細胞に結合させることによって同定することができる。採取されたT細胞には、疾患、枯渇T細胞、または論じられた特徴に応答する他のT細胞に対する患者の免疫応答によって活性化されたT細胞が含まれ得ることが認識されたい。
別の観点から見ると、ネオエピトープに対する抗体は、NK細胞、特にNK−92細胞(高親和性Fc−細胞受容体を呈するようにさらに修飾されていてもよい)を使用して、標的エンティティとして使用することができる。したがって、本発明の主題のさらに企図された態様において、抗体断片または抗体は、ネオエピトープを表示する細胞に対してこのように免疫応答を刺激し、指向させるために、T細胞、特にNK細胞に結合され得る。結果的に、患者または他の生物において、免疫化を必要としないプロセスを用いることで、癌性ネオエピトープに対する有効な免疫応答が誘発され、治療抗体の応答時間および利用可能性が劇的に低下する可能性があることは認識されたい。
枯渇T細胞は、いくつかの異なる経路を介して再活性化され得ることがさらに企図される。1つの経路としては、細胞を再活性化するために、採取された枯渇T細胞にサイトカイン(例えば、IL−2、IL−12、IL−15など)を外因的に添加することが挙げられる。再活性化されたT細胞は、おそらくチェックポイント阻害剤(例えば、イピリムマブなど)と共に患者に戻って再度導入することができる。別の経路は、遮断点チェックポイント阻害による枯渇を防ぐことであり、これは、標的のネオエピトープおよび好適な阻害剤(例えば、LAG3など)を有するテーラードウイルスを投与することによって達成することができる。
実施例
本発明の主題の方法の一例として、HPV16を保有する子宮頸癌患者を生検し、組織試料を上記のように解析した。非患者参照配列は、HPV16参照配列を含むHPV配列を含んでいた。特に、配列解析は、ウイルスゲノム中のいくつかの突然変異も明らかにし、4つのネオエピトープを導いた。より具体的には、E6遺伝子において4つの変異体が見出され、E7遺伝子において1つの変異体が見出された。ウイルス参照配列を使用する、HPV16ウイルスに対するワクチンのin silico生成により、E6およびE7にわたって、242個の可能性のあるエピトープを生成させた。患者のオミックス配列データもまたHLA型を予測するために使用され、その結果を以下の表1に示す。エピトープのHLA型への結合、ならびにネオエピトープの患者のHLA型への結合を計算した。次いで、この第2の計算を使用して、患者が結合可能であったエピトープにHPV16中の変異体が有意に影響を及ぼすか否かを決定した。
Figure 2018536225
図1の表は、予測されたHLA型に関してエピトープおよびネオエピトープを結合する例示的な結果を示す。予測された結合エピトープおよびネオエピトープが強調表示されている。第1の列(エントリ)は、評価された242個のエピトープおよびネオエピトープのいくつかの識別子を列挙する。第2の列(ペプチド)は、E6およびE7にわたる野生型エピトープおよびネオエピトープのアミノ酸配列を列挙する。第3の列から第7の列(HLA−A02:01;HLA−A68:01;HLA−B44:02;HLA−B44:03;およびHLA−C05:01)は、予測された患者のHLA型の一部について、列挙されたエピトープおよびネオエピトープの予測される結合親和性(nM)を列挙する。注目すべきことに、この例では、高い予測結合親和性(<500nM)を有するエピトープおよびネオエピトープが強調表示されている。第8の列(遺伝子)は、同定する場合には、参照遺伝子のエピトープおよびネオエピトープを同定している(本明細書では、HPV16のE6遺伝子およびE7遺伝子)。第9の列(影響を受けた変異体)は、アミノ酸配列によりネオエピトープを同定している。ネオエピトープは、野生型エピトープまたは第2の列のネオエピトープの変異である。
注目すべきことに、エントリ_70は、検出されたHPV16変異体によって有意に変化する図1に示された唯一のエピトープである。別の観点から見ると、本発明の主題の方法は、患者のゲノム中のHPV16配列の突然変異、本明細書では、KLPQLCTELからKLPDLCTELへのHPV16参照アミノ酸配列の突然変異を含む患者およびウイルス特異的ネオエピトープを確実に同定した。
図2は、患者HLA型に対する高い結合親和性を有する予測された結合変異体エピトープ(ネオエピトープ)を示す(強調表示されている)。個別HPVワクチンは、HPV16参照ゲノムに基づくか、または健康組織オミックスと病変組織オミックスとの比較に基づいてもよく、図2の2つの変異体エピトープ(ネオエピトープ)を標的化することができなかったことは、特に認識されたい。別の観点から見ると、図2に列挙されたネオエピトープの同定は、ウイルス参照ゲノムと患者ゲノム中に特異的に組み込まれた(および潜在的に引き続き突然変異した)ウイルス配列と比較することなく行うのは不可能である。有利には、患者におけるネオエピトープにつながるミスセンス突然変異は、図2に列挙する患者のHLA型のうちの少なくとも1つに結合すると予測された。
具体的には、図2に示すように、ネオエピトープKLPDLCTELは、グアニンからチミンへの野生型E6核酸配列の塩基変化の結果生じ、野生型グルタミンから変異型アスパラギン酸へのアミノ酸変化を生じる。有利に、ネオエピトープKLPDLCTELは、HLA−A02:01では、非常に高い予測結合親和性を有する(12nM)。さらに、ネオエピトープFQDPQERPIは、グアニンからチミンへの野生型E6核酸配列の塩基変化の結果生じ、野生型アルギニンから変異型イソロイシンへのアミノ酸変化を生じる。ネオエピトープFQDPQERPIは、HLA−C05:01では高い予測結合親和性を有する(299nM)。
したがって、ウイルスDNAが、本発明の主題の方法を用いることによって、比較的高い突然変異率および/またはゲノム不安定性を受ける場合に、ワクチン効力を予測することさえできることは認識されたい。また、本明細書に提示されたデータからも分かるように、患者のHLA型に結合する18個の全予測エピトープが同定され、非結合変異体が生成されることにより1つのエピトープも存在せず、これらの変異体により2つのネオエピトープが生成された(およびさもなければ失われた)。
本発明の主題のさらに別の態様では、既に上記で簡単に述べたように、ネオエピトープをin silicoで計算し、続いて罹患組織内の1つ以上の組換え核酸から発現させることもでき、核酸の送達が、好ましくは遺伝子および/または細胞特異的様式で行われる。例えば、病変組織に組み込まれたウイルスDNAが含まれている場合、その非患者DNAは、RNA誘導CRISP/Cas9またはCRISPR/Cpf1ヌクレアーゼ複合体のアデノウイルスベクター送達を用いて特異的に変化させることができる。これにより、ウイルスDNAに、(典型的にはHLA適合)宿主において免疫原性であることが既知であるか、または疑われるエピトープがもたらされる。このような送達のための例示的プロトコルは、Nature、Scientific Reports 4、Article Number:5105(2014年)に見出すことができる。一方、病変組織が癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の変異型を含む場合、免疫原性ネオエピトープを細胞に導入するDNAを送達することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を記載および請求するために使用される、成分の量、濃度、反応条件などの特性を表す数字は、場合によっては、用語「約」によって変更されると理解されるものとする。したがって、いくつかの実施形態では、記載された説明および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の切り上げ法を適用して解釈されるべきである。
本明細書の説明および以下の特許請求の範囲を通じて使用されるように、「a」「an」「the」の意味は、文脈が明確に別のように指示しない限り、複数の言及を含む。また、本明細書の説明で使用されているように、「in(において)」の意味は、文脈が明確に別のように指示しない限り、「in(において)」および「on(の上で)」の意味を含む。文脈が反対に指示しない限り、本明細書に記載された全ての範囲は、その終点を含むものとして解釈されるべきであり、オープンエンド形式の範囲は、商業的に実用的な値を含むと解釈されるべきである。同様に、文脈が反対を示さない限り、値の全てのリストは中間値を含むものとして考慮されたい。
本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書の特定の実施形態に関して提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言語(例えば、「など(such as)」)の使用は、単に本発明をよりよく示すことを意図しており、別に請求された本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
本明細書の発明概念から逸脱することなく、既に説明した以外の多くの変更が可能であることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて限定されるものではない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両方を解釈するにあたり、全ての用語は、文脈と一致する最も広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、用語「を含む(comprises)」および「を含んでいる(comprising)」は、要素、構成要素またはステップを非排他的様式で参照するものとして解釈されるべきであり、参照された要素、構成要素、またはステップは、明示的に参照されていない他の要素、構成要素、またはステップと共に存在するか、利用するか、または組み合わせてもよい。明細書の請求項が、A、B、C、….、およびNからなる群から選択されるものの少なくとも1つを指す場合、A+N、またはB+Nなどではなく、その群の1つのみの要素を必要とするものと解釈されるべきである。


Claims (33)

  1. 患者のオミックスデータを解析する方法であって、
    患者の病変組織のオミックスデータを解析すること、および前記オミックスデータ中の非患者核酸の存在を同定することと、
    前記非患者核酸を病原体の参照核酸と相関させることと、
    前記病原体の前記参照核酸の複数のエピトープを同定すること、および前記非患者核酸内のネオエピトープを同定することと、
    前記複数のエピトープおよび前記ネオエピトープのそれぞれのHLA適合スコアを計算することと、
    前記複数のエピトープおよび前記ネオエピトープの前記それぞれのHLA適合スコアを使用して、患者特異的免疫療法組成物を生成することと、を含む、方法。
  2. 前記オミックスデータは、全ゲノムシーケンシングを介して得られる、請求項1に記載の方法。
  3. 前記オミックスデータが、同じ患者の非病変組織に対して適合される、請求項1または2に記載の方法。
  4. 前記病原体がウイルスである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記病原体が、前記病原体ゲノムの少なくとも一部分を前記患者ゲノムに組み込む病原体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記参照核酸の前記複数のエピトープが、前記病原体の少なくとも1つの発現された遺伝子について計算される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記病変組織の前記オミックスデータを使用して、前記患者のHLA型をin silicoで決定するステップをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 既知のおよび異なるHLA対立遺伝子の複数の配列を含むHLA参照配列を提供するステップと、
    前記オミックスデータを複数のk−merのそれぞれのセットに分けるステップと、
    前記HLA参照配列および前記複数のkmerのそれぞれのセットを使用して複合de Bruijnグラフを作成するステップと、
    前記既知のおよび異なるHLA対立遺伝子中の対応するセグメントに適合するkmerによってそれぞれの票(vote)から計算される複合適合スコアを使用して、前記既知のおよび異なるHLA対立遺伝子のそれぞれをランク付けするステップと、
    前記患者の前記HLA型として最上位のHLA対立遺伝子を同定するステップと、によって前記患者のHLA型を決定するステップをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記複数のエピトープおよび前記ネオエピトープの前記それぞれのHLA適合スコアが、MHC−IサブタイプおよびMHC−IIサブタイプの適合スコア間で区別される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記患者特異的免疫療法組成物が、MHC−II提示経路についてMHC−IIと適合するエピトープまたはネオエピトープを誘導し、前記エピトープまたはネオエピトープの前記MHC−II提示は、100nM以下の計算された解離定数を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記患者特異的免疫療法組成物が、100nM以下の計算された解離定数を有するHLA適合エピトープを使用して生成される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記患者特異的免疫療法組成物が、100nM以下の計算された解離定数を有するHLA適合エピトープを排他的に使用して生成される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記患者特異的免疫療法組成物が、100nM以下の計算された解離定数を有するHLA適合ネオエピトープを使用して生成される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記患者特異的免疫療法組成物が、100nM以下の計算された解離定数を有するHLA適合ネオエピトープを排他的に使用して生成される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記患者特異的免疫療法組成物が、癌を治療するために前記患者に投与される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 患者のオミックスデータを使用する方法であって、
    患者の病変組織のオミックスデータを解析すること、および前記オミックスデータ中の非患者核酸または疾患特異的核酸の存在を同定することと、
    前記非患者核酸または疾患特異的核酸を病原体の参照核酸または疾患の参照核酸と相関させることと、
    前記非患者核酸または前記疾患特異的核酸の複数のネオエピトープをin silicoで生成することと、
    前記複数のネオエピトープのHLA適合スコアを計算することと、
    100nM以下の計算された解離定数を有するHLA適合ネオエピトープをコードする核酸を使用して、前記HLA適合ネオエピトープをコードする前記核酸を前記患者に送達することができる核酸構築物を生成することと、を含む、方法。
  17. 前記非患者核酸がウイルス核酸である、請求項16に記載の方法。
  18. 前記複数のネオエピトープが、前記疾患の前記病原体核酸の発現遺伝子について生成される、請求項16〜17のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記核酸構築物がアデノウイルスを含む、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記核酸構築物がCRISPR/Cas9カセットを含む、請求項16〜19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記核酸構築物が、前記非患者核酸または前記疾患特異的核酸に排他的に特異的であるガイドRNAをさらに含む、請求項20に記載の方法。
  22. 患者のオミックスデータを用いて癌を治療する方法であって、
    患者の病変組織のオミックスデータを解析すること、および前記オミックスデータ中の非患者核酸または疾患特異的核酸の存在を同定することと、
    前記非患者核酸または疾患特異的核酸を病原体の参照核酸または疾患の参照核酸と相関させることと、
    前記非患者核酸または前記疾患特異的核酸の複数のネオエピトープをin silicoで生成することと、
    前記複数のネオエピトープのHLA適合スコアを計算することと、
    100nM以下の計算された解離定数を有するHLA適合ネオエピトープをコードする核酸を生成して、前記HLA適合ネオエピトープをコードする前記核酸を前記患者に送達することができる核酸構築物を生成することと、
    前記癌を有する患者に前記核酸構築物を含む免疫治療組成物を投与することと、を含む、方法。
  23. 前記オミックスデータは、全ゲノムシーケンシングを介して得られる、請求項22に記載の方法。
  24. 前記オミックスデータが、同じ患者の非病変組織に対して適合される、請求項22または23に記載の方法。
  25. 前記病原体がウイルスである、請求項22〜24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記病原体が、前記病原体ゲノムの少なくとも一部分を前記患者ゲノムに組み込む病原体である、請求項22〜25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記非患者核酸または前記疾患特異的核酸の前記複数のネオエピトープが、前記病原体の少なくとも1つの発現遺伝子について生成される、請求項22〜26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記病変組織の前記オミックスデータを使用して、前記患者のHLA型をin silicoで決定するステップをさらに含む、請求項22〜27のいずれか一項に記載の方法。
  29. 既知のおよび異なるHLA対立遺伝子の複数の配列を含むHLA参照配列を提供するステップと、
    前記オミックスデータを複数のk−merのそれぞれのセットに分けるステップと、
    前記HLA参照配列および前記複数のkmerのそれぞれのセットを使用して複合de Bruijnグラフを作成するステップと、
    前記既知のおよび異なるHLA対立遺伝子中の対応するセグメントに適合するkmerによってそれぞれの票から計算される複合適合スコアを使用して、前記既知のおよび異なるHLA対立遺伝子のそれぞれをランク付けするステップと、
    前記患者の前記HLA型として最上位のHLA対立遺伝子を同定するステップと、によって、前記患者のHLA型を決定するステップをさらに含む、請求項22〜28のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記複数のネオエピトープの前記それぞれのHLA適合スコアが、MHC−IサブタイプおよびMHC−IIサブタイプの適合スコア間で区別される、請求項22〜29のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記免疫療法組成物が、MHC−II提示経路についてMHC−IIと適合したネオエピトープを誘導し、前記ネオエピトープの前記MHC−II提示が100nM以下の計算された解離定数を有する、請求項22〜30のいずれかに一項に記載の方法。
  32. 前記免疫療法組成物が、100nM以下の計算された解離定数を有するHLA適合ネオエピトープを使用して生成される、請求項22〜31のいずれか一項に記載の方法。
  33. 100nM以下の計算された解離定数を有するHLA適合ネオエピトープを排他的に用いて前記免疫療法組成物が生成される、請求項22〜32のいずれか一項に記載の方法。



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