JP2018521655A - 組み換えタンパク質の産生プロファイルを修飾する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
潅流培養、回分培養、及び流加培養は、組み換えタンパク質を生産するために動物細胞を培養するための基本的方法である。
更なる態様において、本発明は、組み換えタンパク質の産生を増加する方法であって、有効量のトリアジン染料を含んでなる少なくとも1つの供給物(feed)を補充した細胞培養培地中で、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること含む前記方法を提供する。
別の態様において、本発明は、有効量のトリアジン染料を含んでなるか又は有効量のトリアジン染料を補充した細胞培養培地を含んでなる組成物を提供する。
更なる態様において、本発明は、組み換えタンパク質の産生増加のための、細胞培養培地におけるトリアジン染料の使用を提供する。
本明細書中で言及した出版物、特許出願、特許、及び他の参照文献の全ては、参照によりその全体を援用したものとする。本明細書中で論じられる出版物及び出願は、もっぱら本願の出願日以前に開示されている。本明細書において、本発明が、先願発明の効果により、斯かる出版物に先行する権利を与えられないことへの承認として解釈されるべきではない。加えて、材料、方法、及び実施例は、ただの実例であって、限定を意図するものではない。
明細書及び請求項で使用される場合、用語「細胞培養」又は「培養物」は、インビトロ、すなわち、生物体又は組織の外側での細胞の成長及び繁殖を意味する。哺乳動物細胞のための好適な培養条件は、当該技術分野で知られており、例えば、Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies (2005)内に教示されている。哺乳動物細胞は、懸濁液中で培養されてもよいが、一方で、固形の基板に取り付けられてもよい。
用語「より高い力価」又は「より高い比生産性」、及びその相当語句は、対照培養条件と比較して、力価又は生産性が少なくとも10%増強されることを意味する。力価又は比生産性は、対照培養条件と比較して、それが−10%〜10%の範囲内にある場合には、維持されていると見なされる。用語「より低い力価」又は「より低い生産性」、及びその相当語句は、対照培養条件と比較して、力価又は生産性が少なくとも10%減少することを意味する。
明細書及び請求項で使用される場合、用語「抗体(antibody)」及びその複数形「抗体(antibodies)」としては、とりわけ、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び抗原結合性フラグメント、例えばF(ab’)2や、Fabタンパク質分解フラグメントや、一本鎖可変領域フラグメント(scFvs)などが挙げられる。遺伝子操作された完全な抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、scFv及びFabフラグメント、並びに合成抗原結合性ペプチド及びポリペプチドなども含まれる。
用語「誘導剤」、「誘導因子」又は「生産能エンハンサー」は、細胞培養に加えられるとタンパク質の産生の増強を可能にする化合物を指す。例えば、E.コリ(E. coli)産生のための既知の誘導因子の1つが、IPTG(イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド)である;そして、CHO産生のための誘導因子は、特に酪酸ナトリウム、ドキシサイクリン又はデキサメサゾンである。
本発明のある実施形態において、宿主細胞は、これだけに限定されるものではないが、HeLa、Cos、3T3、骨髄腫細胞株(例えば、NS0、SP2/0)、及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を含めた哺乳類宿主細胞(本明細書中では、哺乳動物細胞とも呼ばれる)を含むのが好ましい。好ましい実施形態において、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である。
I.細胞、細胞増殖、及び細胞成長
1)細胞
アッセイを、2種類のCHO細胞株を用いて実施した:
−CHO−S細胞は、IgG1 mAb1を発現、本明細書中では「Cells mAb1」又は「mAb1 cells」」。「mAb1」は、可溶性タンパク質に対する完全なヒトモノクローナル抗体である。等電点(pI)は、約8.20〜8.30である。
−CHO−K1細胞、IgG1 mAb2を発現、本明細書中では「Cells mAb2」又は「mAb2 cells」。「mAb2」は、細胞膜上に見られる受容体に対するヒト化モノクローナル抗体である。等電点(pI)は、約9.30である。
細胞増殖を、チューブ内において細胞増殖に好適な培地中で実施した。流加培養におけるアッセイは、少なくとも1週間の増殖後に開始した。
3)接種
mAb2を発現する細胞を、1ミリリットル(mL)あたり0.2×106細胞にて接種し、mAb1を発現する細胞を、1mLあたり0.3×106細胞にて接種した。
全てのアッセイを、流加培養において実施した。宿主細胞を、マイクロプレート(「深いウェルプレート」)又はSpin tubes(登録商標)のいずれかの流加培養系で培養し、そして、36.5℃、90%の相対湿度、5%のCO2にて及び320rpmにて振盪しながら、14日間インキュベートした。
生存細胞密度及び生存率を、Guava easyCyte(登録商標)フローサイトメーター又はViCellで計測した。
抗体力価を、forteBIO Octet(登録商標)又はBiacore C(登録商標)で計測した。
グリコシル化プロファイルを、レーザー誘起蛍光(CGE−LIF)を用いた毛管ゲル電気泳動によって確立した。凝集物及び断片の調整を、Size Exclusion High Performance Liquid Chromatography(SE−HPLC)及びSDS−毛管ゲル電気泳動によってそれぞれ実施した。
実施例1−Reactive Red 120
Reactive Red 120の活性を、抗体mAb1を発現する宿主細胞に対してマイクロプレート内で、及び抗体mAb1又はmAb2を発現する宿主細胞に対してSpinチューブ内で試験した。
最初に、mAb1を発現する宿主細胞を、マイクロプレート内、約0.4μM〜約17μMのReactive Red 120の存在下で培養した。細胞密度、細胞生存率、及び力価を、培養中に計測した(図1A〜1C)。これらの濃度のときに、Reactive Red 120は、生存細胞密度及び力価を有意に増強したが、細胞生存率は(わずかに)低減した。特に、17.3μMにて、生存細胞密度は、7日目に1.5倍に増加し、そして、力価は14日目に1.3倍に増加した。生存率は、10日目まで対照のものと同様であり、産生プロセスの最後には、対照と比較して、わずかに減少していた。
約17μMの濃度にて、細胞密度及び力価は最大になったので、Reactive Red 120の毒性限度に達したように見えなかった。これは、Reactive Red 120の濃度増加がさらに良好な結果を得るのに使用できることを示唆している。
Reactive Red 120と同様に、Cibacron Blue 3GAは、力価に対して興味深い影響を有した。マイクロプレートにおけるmAb1を発現する宿主細胞に対するアッセイに加えて、Cibacron Blue 3GAの有効性を、Spin Tubesにおいて、抗体mAb1又はmAb2を発現する宿主細胞に対して評価した。
結果として、Reactive Red 120やCibacron Blue 3GAなどのトリアジン染料は、タンパク質のグリコシル化プロファイルを変更することなく、又は細胞生存率に対して負の影響を及ぼすことなく、産生される組み換えタンパク質の量を増強するための非常に有望な化合物である。よって、トリアジン染料は、文献において酪酸ナトリウムで観察された細胞生存率に対する欠点のない誘導剤として使用され得る。
Claims (12)
- 組み換えタンパク質の産生を増加する方法であって、有効量のトリアジン染料を含んでなるか又は有効量のトリアジン染料を補充した細胞培養培地中で、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること含む前記方法。
- 組み換えタンパク質の産生を増加する方法であって、有効量のトリアジン染料を含んでなる少なくとも1つの供給物を補充した細胞培養培地中で、前記タンパク質を発現する宿主細胞を培養すること含む前記方法。
- 組み換えタンパク質を発現する宿主細胞を培養する方法であって、有効量のトリアジン染料を含んでなるか又は有効量のトリアジン染料を補充した細胞培養培地中で、前記宿主細胞を培養すること含む前記方法。
- 前記トリアジン染料が、Cibacron Blue 3GA、Reactive Red 120、Reactive Yellow 86、Reactive Green 19、Reactive Blue 4、Reactive Brown 10を含んでなる群から選択される、請求項1又は3に記載の方法。
- 前記トリアジン染料が、Cibacron Blue 3GA又はReactive Red 120である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 有効量のトリアジン染料を含んでなるか又は有効量のトリアジン染料を補充した細胞培養培地を含んでなる組成物。
- 前記トリアジン染料が、Cibacron Blue 3GA、Reactive Red 120、Reactive Yellow 86、Reactive Green 19、Reactive Blue 4、Reactive Brown 10を含んでなる群から選択される、請求項7に記載の組成物。
- 前記組み換えタンパク質が、抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばヒト抗体又はその抗原結合性部分、ヒト化抗体又はその抗原結合性部分、キメラ抗体又はその抗原結合性部分など、組み換え融合タンパク質、増殖因子、ホルモン、或いはサイトカインから成る群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法又は請求項7〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 組み換えタンパク質の産生を増強するための、細胞培養培地におけるトリアジン染料の使用。
- 細胞培養における誘導因子としてのトリアジン染料の使用。
- 前記トリアジン染料が、Cibacron Blue 3GA、Reactive Red 120、Reactive Yellow 86、Reactive Green 19、Reactive Blue 4、Reactive Brown 10を含んでなる群から選択される、請求項10又は11に記載の使用。
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