JP2018516538A - 治療剤の製造および放出のための遺伝子操作された細菌 - Google Patents
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Abstract
Description
2015年4月9日に出願された米国仮特許出願第62/145,417号を含む、本出願と同時に提出された出願データシートにおいて外国または国内の優先権主張が確認されるあらゆる出願は、米国特許法施行規則1.57に基づき参照により本明細書に援用される。
本発明は、米国国立衛生研究所の国立医学総合研究所によって与えられたNIH助成/契約第GM069811号の下での政府の支援、国立環境衛生学研究所からのコアセンター助成(Core Center Grant)P30−ES002109、および全米癌研究所(スワン
ソンバイオテクノロジーセンター(Swanson Biotechnology Center)からのコッホ研究所(Koch Institute)の支援助成P30−CA14051を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本明細書に記載のいくつかの実施形態は、細胞の集団が所望の密度に達したときにポリペプチドを放出するように遺伝子操作された細胞に関する。いくつかの実施形態では、放出されたポリペプチドは、治療用ポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、治療用ポリペプチドは、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害する。
シックな見解は、人体内に機能性微生物が広範に見られるという認識に変わってきた(Cho, I. & Blaser, M. J. The human microbiome: at the interface of health and disease.Nature Reviews Genetics 13, 260-270 (2012); Xuan, C. et al.Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer.PloS One 9, e83744 (2014); Fischbach, M. A., Bluestone, J. A. & Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine.Science Translational Medicine 5, 179ps7-179ps7 (2013))。この広大な環
境を考えると、おそらく必然的に、特定の細菌が腫瘍内で優先的に増殖するように進化し、それゆえ、遺伝子操作療法の開発のための天然のプラットフォームを提供するであろう(Pawelek, J. M., Low, K. B. & Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel
anticancer vector.Cancer research 57, 4537-4544 (1997); Ruder, W. C., Lu, T. & Collins, J. J. Synthetic biology moving into the clinic.Science 333, 1248-1252 (2011); Weber, W. & Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic
biology.Nature Reviews Genetics 13, 21-35 (2011))。腫瘍内の微生物の局在化は、
癌細胞を標的とする宿主免疫系を刺激するために利用されているが、このような療法は、局所的に放出される抗腫瘍剤を絶えず産生しながら、全身性炎症応答を安全に回避するようにプログラムされた細菌からなることが理想的である(Baban, C. K., Cronin, M., O
’Hanlon, D., O’Sullivan, G. C. & Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy of cancer.Bioeng Bugs 1, 385-394, 2010; Cann, S. H., Van Netten, J. & Van Ne
tten, C. Dr William Coley and tumour regression: a place in history or in the future.Postgraduate Medical Journal 79, 672-680, 2003) Davila, M. L. et al.Efficacy and toxicity management of 19-28z CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia.Science Translational Medicine 6, 224-224ra25, 2014)。本明細書に
記載の実施形態の中には、閾値集団密度で溶解し、遺伝子にコードされた抗腫瘍治療剤を放出する、遺伝子操作された臨床的検査を受けた細菌の使用がある。溶解すると、少数の生き残った細菌が集団を再生し、したがってステルスなインビボでのフットプリントを有するパルス溶解および送達サイクルをもたらす。
細胞。
チドである、項3に記載の細胞。
でなる、項34に記載の細胞。
プチドである、項56に記載の方法。
ンを産生し、前記第2の株が、前記第1の株の増殖を殺すか、または阻害するバクテリオシンを産生する、項63に記載の方法。
プチドである、項71に記載の使用。
以下の詳細な説明では、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面において、類似の記号は、別段の記載がない限り、通常、類似の構成要素を識別する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載された例示的な実施形態は、限定することを意味するものではない。本明細書に提示される対象の精神または範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用することができ、他の変更をなすことができる。本明細書に一般的に記載され、図に示された本開示の態様は、種々様々な異なる構成で配置され、置換され、結合され、設計され得、これらの全てが明示的に企図され 、本開示の一部をなすことが
容易に理解できるであろう。
、細菌によって産生され、次いで、溶解で放出されて、他の細菌を殺すことができる(特定のバクテリオシンに抵抗性を付与することができる)。例えば、ある実施形態は、株Aが株Bを殺すバクテリオシンを産生し、株Bが株Cを殺すバクテリオシンを産生し、株Cが株Aを殺すバクテリオシンを産生するという3種の系である。ある実施形態では、1日目に株Cを投与し、次いで2日目に株Bを投与し(Cを消失させる)、次いで3日目に株Aを投与し(Bを消失させる)、次いで株Cを投与するといったこと等をし得る。この系は、治療用細菌と競合し得る腫瘍環境内に存在する細菌を除去するというさらなる利点を有する。
るための株の使用。これを、強力であるが潜在的に遅い作用の治療剤のより低頻度の送達または溶解を生じる株と組み合わせ得る。異なる薬剤の作用の時間スケールは重要である− 一方では防御を弱め、他方ではハンマーを下げる。溶解の頻度は、以下により詳細に
議論される様々なアプローチによって調整することができる。高頻度および低頻度溶解株は、所望の溶解頻度を達成するために適切な改変を加えた溶解回路(SDCまたはSLC)で形質転換された株であり得る。
亘って同期溶解を利用する場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、その開示がその全体で参照により本明細書に援用される2012年12月14日に出願された「Multiscale platform for coordinating cellular activity using synthetic biology」と題されたPCT出願第PCT/US2012/069914号に記載された組成物および方法、又はその開示がその全体で参照により本明細書に援用される2011年12月16日に出願された米国仮特許出願第61/576,976号に記載されている組成物および方法を使用し得る。特に、いくつかの実施形態では、センチメートルの長さスケールを超える同期オシレータを使用し得る。いくつかの実施形態において、H2O2長距離シグナル伝達は、腫瘍長スケールに亘って溶解バーストを同期させるために使用される。このような状況では、溶解は制限的な形状を必要とせずにコロニーの大きさを規定するので、マイクロ流体の「ピクセル」がコロニーを収容する必要はない。センチメートルスケールに亘る同期送達に加えて、ラジカルが癌と相互作用する可能性もある。
路モチーフを使用し、この場合、結合されたネガティブおよびポジティブフィードバックループを利用する。集団の溶解により、細菌集団を低く維持することができ、全身性の炎症反応を回避することに役立つ。集団溶解が周期的に起こるので、ペイロード放出もパルス様式で起こる。さらに、系は、細菌が閾値サイズに達することを可能にする環境において内部ペイロードのみを放出する。したがって、いくつかの実施形態は、腫瘍内部の高密度集団において自己誘発し、内部ペイロードを放出し、細菌集団を低レベルに維持して、有害な免疫応答を回避することができる腫瘍標的化デバイスと考えられ得る。
操作された細菌集団は、閾値集団サイズまで増殖し、この時点で、十分なAHLがコロニー内に蓄積してLuxIプロモーターからの転写を活性化し、溶解タンパク質を産生する。集団の一部が溶解し、小さいコロニーサイズが残り、それによりAHL濃度が低下するようになる。これらの生き残った細菌は、その後、閾値集団サイズまで再増殖し、さらなる溶解事象を呈する。この過程は周期的な様式で継続する。溶解すると、細胞は、治療的遺伝子の産物を含む細胞内の内容物を細胞外空間に放出するようになる。したがって、集団は細胞内ペイロードを放出しながら動的に減弱する。回路の図および上記の様々な段階の図については、図1を参照されたい。
弱毒化され、集団が遺伝子にコードされた治療用タンパク質を放出することが可能になる。使用される細菌は、注射または摂取時に腫瘍の内部に内在化し、壊死組織内で増殖する弱毒化「腫瘍標的化」細菌であり得る。遺伝子操作された細菌は腫瘍の壊死領域内でしか増殖することができないため、回路は、集団センサーとして機能し、特に腫瘍内でのペイロード放出を可能にする。
菌内で使用することができる溶解系のいずれか、例えば、バクテリオファージΦX174由来の溶解遺伝子E、ラムダファージ溶解遺伝子、コリシン産生細菌由来のE7溶解遺伝子などが含まれる。本明細書に記載のいくつかの実施形態では、ポジティブフィードバック遺伝因子は、LuxIプロモーターから遺伝子発現を駆動する(LuxIアクチベーターおよびLuxR遺伝子を含んでなる)Luxクオラムセンシング系を含んでなり得る。このプロモーターは、LuxI遺伝子、溶解遺伝子、およびレポーター遺伝子の転写を可能にする。したがって、一旦活性化されると、このプロモーターは、ネガティブフィードバック因子、例えばバクテリオファージΦX174由来の溶解遺伝子E、および蛍光または発光レポーター遺伝子の転写を駆動する。これらの回路プラスミドを含む細菌集団(遺伝子操作された細菌)は、コロニー中の隣接する細胞間で拡散し、pLuxI転写(LuxIプロモーター)についてコロニーを同期させることができる小分子である、Lux系のためのAHL(アシルホモセリンラクトン)を酵素的に産生するLuxIタンパク質を産生するようになる。異なるAHLは、Las、Rhl、およびRpa系などの異なるクオラムセンシング系の自己誘発因子として機能する。その後、AHLはLuxRタンパク質(またはそれぞれのRタンパク質、例えば、LasR、RhlR、またはRpaR)に結合し、LuxRタンパク質は、AHL濃度が閾値レベルに達するとLuxIプロモーターからの転写を活性化する。従って、遺伝子操作された細菌集団は、閾値集団サイズまで増殖し、この時点で、十分なAHLがコロニー内に蓄積してLuxIプロモーターからの転写を活性化し、溶解タンパク質を産生する。集団の一部が溶解し、小さいコロニーサイズが残り、それによりAHL濃度が低下するようになる。これらの生き残った細菌は、その後、閾値集団サイズまで再増殖し、さらなる溶解事象を呈する。この過程は周期的な様式で継続する。溶解すると、細胞は、治療的遺伝子の産物を含む細胞内の内容物を細胞外
空間に放出するようになる。したがって、集団は細胞内ペイロードを放出しながら動的に減弱する。
シックな見解は、人体内に機能性微生物が広範に見られるという認識に変わってきた(Cho, I. & Blaser, M. J. The human microbiome: at the interface of health and disease.Nature Reviews Genetics 13, 260-270 (2012); Xuan, C. et al.Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer.PloS one 9, e83744 (2014); Fischbach, M. A., Bluestone, J. A. & Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine.Science translational medicine 5, 179ps7-179ps7 (2013))。この広大な環
境を考えると、おそらく必然的に、特定の細菌が腫瘍内で優先的に増殖するように進化し、それゆえ、遺伝子操作療法の開発のための天然のプラットフォームを提供するであろう(Pawelek, J. M., Low, K. B. & Bermudes, D. Tumor-targeted salmonella as a novel
anticancer vector.Cancer research 57, 4537-4544 (1997); Ruder, W. C., Lu, T. & Collins, J. J. Synthetic biology moving into the clinic.Science 333, 1248-1252 (2011); Weber, W. & Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic
biology.Nature Reviews Genetics 13, 21-35 (2011))。腫瘍内の微生物の局在化は、
癌細胞を標的とする宿主免疫系を刺激するために利用されているが、このような療法は、局所的に放出される抗腫瘍剤を絶えず産生しながら、全身性炎症応答を安全に回避するようにプログラムされた細菌からなることが理想的である(Baban, C. K., Cronin, M., OSHanlon, D., OSSullivan, G. C. & Tangney, M. Bacteria as vectors for gene therapy
of cancer.Bioeng Bugs 1, 385-394 (2010); Cann, S. H., Van Netten, J. & Van Netten, C. Dr William Coley and tumour regression: a place in history or in the future.Postgraduate medical journal 79, 672-680 (2003); Davila, M. L. et al.Efficacy
and toxicity management of 19-28z car t cell therapy in b cell acute lymphoblastic leukemia.Science translational medicine 6, 224ra25-224ra25 (2014))。ここで
、我々は、閾値集団密度で溶解し、遺伝子にコードされた抗腫瘍治療剤を放出するように臨床的検査を受けた細菌を設計する。溶解すると、少数の生き残った細菌が集団を再生し、したがってステルスなインビボでのフットプリントを有するパルス溶解および送達サイクルをもたらす。マイクロ流体デバイスを使用して、遺伝子操作された細菌のロバストで
調整可能な特性を明らかにし、マイクロケモスタット(microchemostats)およびバッチ
培養でそれぞれヒト癌細胞と共培養したときの治療可能性を実証する。インビボでの送達動態をモニタリングするために、ルシフェラーゼを用いた癌の同系大腸マウスモデルにおける溶解プログラムのステルス特性を試験する。断続的な発光ピークは、プログラムされていない株と比較して、最終的な腫瘍容積の2倍の減少とともに、平均コロニー発光の32倍の減少と相関する。我々のプラットフォームは、ウイルスおよびナノ粒子などの他の治療剤と組み合わせて新規な送達戦略の実施を可能にし得る(Cheong, I. et al.A bacterial protein enhances the release and efficacy of liposomal cancer drugs.Science
314, 1308-1311 (2006))。
array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012))。用語「同期溶解回路」(SLC)および「ステルス送達回路」(SDC)は、本開示では交換可能に使用される。我々の回路(図1A)では、共通のプロモーターが、それぞれそれ自身のアクチベーター(ポジティブフィードバック)および溶解遺伝子(ネガティブフィードバック)の両方の発現を駆動する。例えば、luxIプロモーターは、LuxRに結合し、LuxRがプロモーターを転写活性化することを可能にする自己誘発因子(AHL)の産生を制御する。これは、それぞれのAHL、Rタンパク質、およびアクチベータータンパク質を有する細菌からの他のクオラムセンシング系の場合にも当てはまる。そのような要素の例には、RhlR、LasR、LasIまたはRhlIが含まれる。
細胞に拡散することができ、それにより、細胞間の同期機構を与える。
ポータープロファイルのピークが集団溶解に対応するマイクロ流体チャンバ内の周期的な溶解事象が観察された(図1C)。発振はロバストであり、時間と共に減衰せず、18時間の増殖にわたって全細胞数において5%未満だけ変化する一定の集団サイズを生じた(図5A)。さらに、インビボの微小環境は変動する環境条件によって特徴付けられるため、可変インキュベーション温度(36℃〜40℃)および灌流速度(100μm/s〜200μm/s)を試験し、全ての条件に亘って3時間の平均周期を測定した(図1D)。これらの実験の結果は、本明細書に与えられている補足ビデオ1、2、および3の議論にさらに要約されている。したがって、我々は、SDCが、インビボの状況で起きる可能性のある環境変動に晒されても、溶解および放出のロバストなサイクルを生じることを予想
した。
ストであったという我々の観察を説明した(Prindle, A. et al.Genetic circuits in Salmonella typhimurium.ACS synthetic biology 1, 458-464 (2012))(図5B〜E)。従って、回路のロバストな挙動は、結局、宿主細菌の固有のパラメータに依存する。
ローチおよび技術を使用することもできる。
時的蛍光顕微鏡検査を描写するビデオ(補足ビデオ4)にさらに記録した。このビデオは、実験の最初の部分において、200nMのAHLを含む培地を使用し、細菌が一定の溶解状態になるのを見ることができることを示している。このデバイスでは、蛍光色素(赤色チャネル)で示されている。その後、培地を蛍光色素が存在しないAHLなしの別の源に切り替え、細菌は発振状態に戻り、コロニーはイメージング終了前に4回の溶解サイクルの間持続した。チャンバサイズは100×100μmであり、2分ごとに画像を撮った。したがって、SDCは、発振的および構成的様式の集団溶解を示すことができる可変系を表す。
typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.Cancer research 70, 18-23 (2010))。グロースチャンバの下に位置する小さなマイクロ流体シンクを用いて放出されたsfGFPを視覚化することによって細胞内の内容物を放出する回路の能力を確認した(図6A〜C)。インビトロでの細菌の溶解および癌細胞の死滅を可視化するために、細菌の溶解および癌細胞死の単一細胞視覚化を可能にする、より小さい細菌グロースチャンバに隣接するグロースチャネル内に癌細胞が接着する新規なマイクロ流体技術を採用した(図6D)。HeLa細胞と回路を有するサルモネラ(S. Typhimurium )とを共培
養すると、細菌溶解の開始時にHeLa細胞死が観察され、効率的な毒素放出が示された(図3A〜B)。これらの実験の結果は、本明細書に与えられている補足ビデオ5および6の議論にさらに要約されている。トラップの外側の完全な細胞死は、最初のsfGFP蛍光の約111分以内に実現された(図3C)。したがって、SDCはインビトロで癌細胞を殺すのに必要なレベルでHlyEを放出することが可能であった。
い構成的hlyE発現からの基礎毒素放出も評価した。予想通り、hlyEモジュールを有するSDCの培養物からの上清に晒されたHeLa細胞が、生存率のほぼ完全な低下を示したことが分かった(図3D)。hlyEモジュールを有しないSDCの上清に晒されたHeLa細胞、または溶解のない構成的hlyE株は、約15%の生存率のわずかな低下を示した。我々は、溶解がインビトロでの効率的なHlyE放出を可能にすること、および、天然の細胞内の細菌の内容物の方がHeLa細胞生存率に有意に影響しないことを結論付けた。我々はさらに、ウェルプレート中のHeLa培養物を用いて様々な量の回路保有細菌を播種することにより、hlyEを有するSLCの薬剤送達特性を調べた。最初の播種からのHeLa細胞死のタイミングは、細菌がクオラム閾値に達するのに必要な時間が長くなることにより、細菌の播種量が少なくなるにつれて長くなることが観察された(図3E)。これらの実験の結果は、20倍の倍率で組織培養ウェルプレートで共培養した細菌および癌細胞を描写するビデオ(補足ビデオ7)にも記録されている。このビデオは、株4(運動性サルモネラ(S. Typhimurium ),HlyEを有するSDC)を、単層
HeLa細胞とウェルに入れたことを示している。細菌が増殖した後、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によってクオラム事象を可視化した。まもなくHeLa細胞が細胞死を呈することを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を1分ごとに撮った。また、sfGFPおよび溶解遺伝子Eなどのクオラム依存性遺伝子の発火速度または産生速度が、播種密度が高くなるにつれて増加することも観察された。これを、臨界放出時間、または発火からHeLa細胞死までの時間の発火速度に対する依存性によって確認した。全ての場合において必要とされる曝露量は類似しているように見えるが、速度の増加は、放出時間の短縮に対応し、溶解および治療剤放出の増加を示す(図3F)。このようにして、播種された細菌の量は、回路の初期タイミングおよび放出特性を決定する。
identifies many uncharacterized actin-like proteins (alps) in bacteria: regulated polymerization, dynamic instability and treadmilling in alp7a.Molecular microbiology 73, 534-552 (2009))。さらに、細菌発光を介したhlyE産生およびクオラム発火の指標として、hlyE遺伝子およびluxCDABE遺伝子の両方(インビボレポーターモジュール)をluxIプロモーター下に配置した(図1A)。免疫適合性マウスで大腸癌の皮下モデル(MC26細胞系)を用いて、治療用ステルス送達回路(tSDC)を静脈内および腫瘍内に注射した(図7B)。細菌はこれまでに観察されているように腫瘍微小環境に局在し、IVIS測定値が定期的に得られた(Danino, T., Prindle, A.,
Hasty, J. & Bhatia, S. Measuring growth and gene expression dynamics of tumor-targeted S.typhimurium bacteria.JoVE (Journal of Visualized Experiments) e50540-e50540 (2013))。腫瘍領域に局在する細菌発光における断続的な14時間および76時間のピークから回路の挙動を観察した(図4A〜B)。次に、組み込まれた構成的発光カセットを含む対照株を試験し、断続的なピークを示さない細菌発光の安定した増加が観察さ
れた(図4C)。また、tSDCを有する腫瘍からの発光強度が、構成的株よりも平均して約32倍低く、コロニーサイズの減少を示すことが観察された(図4C,右)。これらの結果は、tSDCがインビボで動的挙動を保持し、腫瘍内の細菌集団を弱毒化することができることを示している。
作されたウイルス、細菌、および宿主細胞(T細胞など)からなる腫瘍環境における治療群の構築を可能にし得る。複数の構成要素が相乗的に働く環境は、腫瘍の異なる領域で様々な治療機能の具現をもたらすことができる。
株およびプラスミド
我々の回路株を、37℃のインキュベーターで、0.2%グルコースと共に、カナマイシンおよびクロラムフェニコールをそれぞれ50μgml-1、34μgml-1含むLB培地中で培養した。哺乳類細胞を、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(CellGro30−002−CI)を補充したDMEM培地で培養し、37℃で5%CO2を維持した組織培養インキュベーター内に置いた。プラスミドを、クロー
ニングのCPEC法を用いて、または標準的な制限消化/ライゲーションクローニングを用いて構築した(Quan, J. & Tian, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways.PloS one 4, e6441 (2009))。我々のグループの以
前の研究では、アクチベータープラスミド(Kan,ColE1)を使用したが、ePopプラスミドから溶解遺伝子EをPCRで取り出し、LuxIプロモーターの制御下でこれをベクター(Chlor、p15A)にクローニングすることにより溶解プラスミドを構築した(Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012); Marguet, P., Tanouchi, Y., Spitz, E., Smith, C.
& You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden face
ts of host-circuit physiology.PloS one 5, e11909 (2010))。MG1655のゲノム
DNAからPCRを介してhlyE遺伝子を取り、ptacまたはpLuxIプロモーターの制御下で溶解プラスミドにクローニングした(De Boer, H. A., Comstock, L. J. & Vasser, M. The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters.Proceedings of the National Academy of Sciences 80, 21-25 (1983))。共培養は、HeLa細胞および運動性または非運動性のサルモネラ(S. typhimurium)、SL1344で行った。完全な株およびプラスミド情報については、補足情報を参照されたい。
この研究で使用されたマイクロ流体デバイスおよび実験準備プロトコルは、以前に我々のグループから報告されたものと同様である(Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012))。細菌グロース
チャンバは、面積が100×100μm、高さが約1.4μmであった。チップ上での共培養実験では、最初にHeLa細胞の浮遊培養物を非常に低い流速でデバイス培地チャネルにロードして接着させた後、デバイスを組織培養インキュベーター中で0.5〜2日間インキュベートして増殖させた(Kolnik, M., Tsimring, L. S. & Hasty, J. Vacuum-assisted cell loading enables shear-free mammalian microfluidic culture.Lab on a chip 12, 4732-4737 (2012))。実験の日に、デバイスを顕微鏡に移し、回路を含む細菌を
イメージング前にグロースチャンバにロードした。画像の取得は、Photometrics CoolSnap冷却CCDカメラを用いるNikon TI2で行った。スコープおよび付属品を、Nikon Elementsソフトウェアを使用してプログラミングした。マイクロ流体工学および顕微鏡検査に関するさらなる詳細は、補足情報で見ることができる。
腫瘍モデル:移植されたマウス大腸癌細胞系(MC26, Tanabe lab, Massachusetts General Hospital)由来の両側皮下後部側腹腫瘍を有する6週齢のメスBALB/cマウス(Taconic)で動物実験を行った。腫瘍細胞を、DMEM(フェノールレッドなし)中1e8
細胞ml-1の濃度で移植用に調製した。次いで、細胞を側腹当り100μLの容量で皮下に1e7細胞からなる各移植片で移植した。腫瘍は直径が4〜10mmに達するまで約2週間増殖した。
我々の溶解回路を有する株を、37℃の振盪インキュベーターで、0.2%グルコース
と共に、それぞれの抗生物質(カナマイシンおよびクロラムフェニコール)を50μgml-1、34μgml-1含むLB培地中で増殖させた。luxRプロモーターがCAP−cAMP活性化複合体のための結合部位を有するので、このプロモーターからの発現を減少させるためにグルコースを添加した(Meighen, E. A. Genetics of bacterial bioluminescence.Annual review of genetics 28, 117-139 (1994))。細胞内のグルコースレベル
が高い場合、cAMPレベルは低く、CAP−cAMPからの転写活性化を低下させる。
は、発光発現がより高い回路宿主(ELH430:ΔphoPQ)として、サルモネラ(S. typhimurium)SL1344の別の弱毒化株を利用した(図7Aおよび図23A参照)。構成的発光の場合では、構成的発光カセットを有するよく特徴付けられた細菌、p16Sluxを組み込んだ大腸菌Nissle 1917を使用した(Riedel, C. U. et al.Construction of p16slux, a novel vector for improved bioluminescent labeling of gram-negative bacteria.Applied and Environmental Microbiology 73, 7092-7095 (2007))。株およびプラスミドのリストを以下の表1および2に示す。
7℃、5%CO2で、組織培養インキュベーター内に置いた。マイクロ流体チップまたは
ウェルプレートにロードするために、HeLa細胞を最初にdPBSで洗浄し、0.05%または0.25%トリプシンEDTAで剥離させた。次いで、細胞をペレット化し、DMEM+FBSおよび適切な抗生物質に再懸濁した。
我々の回路は、アクチベータープラスミドおよび溶解/治療用プラスミドの2つのプラスミドから構成される。主なアクチベータープラスミドは、我々のグループの以前の研究で使用されたpTD103LuxI sfGFPである(Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012))。こ
のプラスミドは、LuxIおよびsfGFP上のssrA−LAA分解タグ(AANDENYALAAのアミノ酸配列)、スーパーフォールディング緑色蛍光タンパク質変異体を含む(Pedelacq, J.-D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C. & Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein.Nature Biotechnology 24, 79-88 (2005))。LuxIからssrA−LAAタグを除去す
ることによってpTD103LuxI(−LAA)およびpTD103LuxI(TS)を構築した。構築の大部分は、クローニングのCPEC法を用いて行った(Quan, J. & Tian, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways.PloS One 4, e6441 (2009))。
k毒素−抗毒素系およびalp7ARカセットの添加が、インビボでほぼ完全なプラスミド保持を可能にすることを示している(Gerdes, K. The parB (hok/sok) locus of plasmid R1: a general purpose plasmid stabilization system.Nature Biotechnology 6, 1402-1405 (1988); Wood, T., Kuhn, R. & Peretti, S. Enhanced plasmid stability through post-segregational killing of plasmid-free cells.Biotechnology Techniques 4,
39-44 (1990))。
本明細書に記載されている顕微鏡検査およびマイクロ流体工学技術は、以前に我々のグループから報告されたものと同様である(Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (
2010))。手短に言えば、我々のマイクロ流体デバイスを、架橋フォトレジストによって
形成されたミクロンスケールの特徴を有するシリコンウェーハ上に成形され焼成されたPDMS(ポリジメチルシロキサン)から構築した。その後、(ウェーハからPDMSに移された一組の特徴によって形成された)個々のデバイスを焼成したPDMSから切り取り、デバイスに穴をあけて流体ラインの接続を可能にした。次いで、デバイスをカバーガラス上に接着し、細胞ローディングおよびイメージングのために顕微鏡ステージ上に置いた。流体ラインは、培地、細胞を供給する、または廃棄リザーバとして機能する様々なシリンジからデバイスに接続された。デバイス内の流れの方向は、関連するシリンジ間の相対的な高さを変化させ、静水圧によって駆動される流れを生じさせることによって制御した。
細胞を約0.1の光学密度(A600nm)に培養した。ロードする前に、デバイスを培地シリンジで「濡らし」、チャネル内の気泡を除去した(Ferry, M., Razinkov, I. & Hasty, J. Microfluidics for synthetic biology from design to execution.Methods Enzymol 497, 295 (2011))。細胞ローディングシリンジおよび廃棄シリンジの高さの相対的な変化が、細胞ポートから廃棄ポートへの細胞の流れをもたらすように、所定の廃棄ポートを下げることによって、デバイスを細胞ポートからロードした。細胞がトラップにロードされたら、流れの方向を逆転させて培地を全てのポートに流し、トラップされた細胞に栄養分の連続的な灌流を供給した。これらのマイクロ流体実験では、培地および細胞懸濁液に0.075%Tween20を添加して、細胞がデバイス内のチャネルおよびポートに接着するのを防いだ。図1〜2の回路挙動を特徴付ける実験を、これまでに記載されているように、サイドトラップアレイデバイスで行った(Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010))。GFPシンクと共に使用されるデバイスを、サイドトラップアレ
イとしても配置する。トラップおよびシンクの図については、図6Aおよび図22Aを参照されたい。
全てに流体抵抗を加えた。哺乳類細胞のローディングでは、細胞をトリプシン処理し、ペレット化し、ローディング前に0.5〜1.0mLのDMEM+FBS+抗生物質(カナマイシンおよびクロラムフェニコール)に再懸濁した。未接着細胞が、ほぼ停滞した流動条件下で、培地チャネルに局在するように、細胞を光学顕微鏡下でロードした。次いで、ほぼ停滞した流動を維持するようにシリンジの相対的高さの変化を回避しながら、マイクロ流体チップおよびシリンジ装置をCO2インキュベーター内に注意深く置いた。細胞を
2〜4時間以内に接着させた後、培地シリンジをわずかに上昇させてチャネルに新鮮な培地を供給し、その後一晩増殖させた。翌日、チップおよびシリンジ装置を、これまでに記載されている温度およびCO2環境チャンバ下で、顕微鏡に移した(Kolnik, M., Tsimring, L. S. & Hasty, J. Vacuum-assisted cell loading enables shear-free mammalian microfluidic culture.Lab On a Chip 12, 4732-4737, 2012)。次いで、細菌培養物を調
製し、イメージングの前に上記のようにロードした。流速が高すぎる場合、放出された治療剤の哺乳類グロースチャネルへの良好な拡散を可能にするために、(sfGFPの出現によって示される)細菌集団がクオラム閾値に達したときに、流速を下げた。関連する主なステップの図については、図6Dおよび図22Dを参照されたい。
al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012)。手短に言えば、位相差に基づくイメージングと共にNikon Eclipse TI落射蛍光顕微鏡を使用した。画像の取得には、PhotometricsのCoolSNAP HQ2 CCDカメラを使用した
。顕微鏡検査および取得は、Nikon Elementsソフトウェアによって制御した。マイクロ流体デバイスの温度を維持するために、ステージの周りの広い領域を包含する加熱ユニットに接続されたプレキシガラスインキュベーションチャンバを使用した。位相差画像を50〜200msの露光時間で60倍の倍率で撮った。60倍での蛍光イメージングは、GFPについては150msで、Lumencor SOLA光源で30%設定で実施した。通常の実験の
過程では、2〜3分ごとに画像を撮った。デバイスチャネルの流速を推定するために、蛍光灯の200ms露光時の蛍光ビーズ(1.0μm)のトレースの長さを測定して平均流体速度を推定した。これらの画像の分析に関するその他の情報は、以下のデータ分析セクションで与えられている。
生存率実験では、ペニシリンおよびストレプトマイシン抗生物質を含む標準組織培養96ウェル平底プレート(Fisher Scientific)上に単層のHeLa細胞を播種した。50
mLの培養物中の図3Dからの4つの細菌株を、0.08の光学密度まで増殖させた後、ペレット化し、適切な抗生物質を含む1.2mLの培地に再懸濁した。次いで、細菌培養物を1時間増殖させ、次いで、1.5mLマイクロ遠心管中でペレット化した。得られた各上清100μLを3つのHeLa培養ウェルに添加した。その後、Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit (V-13154, Molecular Probes)のプロトコルを実施して、HeLa細胞の生存率を測定した。
蛍光強度プロファイルを、蛍光チャネルからのフレームを分析し、平均ピクセル強度を経時的にプロットすることによって得た。測定した周期は、蛍光プロファイルのピーク・トゥ・ピーク期間である。トラップ内の細胞の数は、ImageJの位相差画像を分析することによって分かった。細菌はグロースチャンバ内で単層を形成したので、最初に個々の細菌細胞の平均面積および平均空隙率(トラップ内の細菌間のオープンスペース)を推定した。画像のμm/ピクセルを考慮して、ImageJを用いて細胞によって取り込まれたトラップ
の面積を測定し、細菌細胞の平均面積で割った。次いで、この値に(1−空隙率)を掛けて、トラップ内の総推定細胞数を得た。主要細胞群に近接していない細菌を個々に数え、最終数に加えた。溶解前の細菌の最大数で溶解した細菌の数を割ることによって、1周期当りの溶解した細胞の割合が分かった。プロットはMATLABを使用して得た。
SDCの動的挙動を説明するために、細胞集団サイズ(N)、AHL(H)、細胞間LuxI(I)、および細胞間溶解タンパク質E(L)に関する式を有する常微分方程式モデルを開発した。集団変数は、細胞集団数(N)および細胞外AHL(H)である(LuxR−AHL結合が速いと仮定する)。このモデルは、細胞数とともに続いて増加する細胞外AHLに応答する実験を通して生存している系統を(単一の細胞を介して)追跡する系と考えることができる。細胞外AHL閾値に達すると、活性化項Pluxによってもた
らされるポジティブフィードバックのために、Lux駆動遺伝子であるLuxIおよびEの細胞内産生がON状態(第2安定状態)になる。溶解タンパク質の増加は、溶解タンパク質の濃度に基づいて死滅をON/OFFに切り替えるヒル関数としてモデル化された死滅項γNを介して細胞数の急速な減少をもたらす。AHLおよび溶解タンパク質レベルが減衰すると、PluxおよびγNはOFF状態に戻り、細胞数が上昇して過程を繰り返す。発火はAHLの閾値に依存するので、SLCは積分発火挙動を示す回路と考えることができる。
される。細胞は、細胞増殖(μG)の結果としてトラップを離れる。溶解による細胞分解
の速度は、ヒル関数γNによって説明される。我々は、トラップ内の全AHL(H)の動
的記述を可能にするために、細胞膜を通るAHLの拡散が速いと仮定した。AHL(H)の産生は、細胞集団(N)とLuxI(I)の細胞当り濃度との積に比例する。AHL希釈は、細胞蓄積の結果としてのトラップからのAHL除去の妨害の増加のために、Nに反比例する。LuxIおよび溶解タンパク質の内部産生は、Pluxによって説明される。両
方のタンパク質の分解は、細胞増殖(μG)ならびにある程度の基礎分解(γIおよびγL)に起因する。さらに、LuxIは、ClpXP機構(γC)によってさらに分解される
。
モデルパラメータを選択して、実験集団およびGFP(LuxIの代用)軌跡に定性的に適合させた(図2A)。大腸菌と比較したサルモネラ(S.typhimurium)のタンパク質
産生および分解の増加は、以前の研究で報告されている(Prindle, A. et al.Genetic circuits in Salmonella typhimurium.ACS Synthetic Biology 1, 458-464 (2012))。大腸菌とサルモネラ(S.typhimurium)との間の挙動の主要な定性的差異を説明する3つのパ
ラメータ(AHL、LuxI産生速度、および基礎LuxI分解速度:CL、CI、γL、γI)を見出した(図2B)。3つのパラメータ全てを精査して、3つ全てにおける増加が回路発振の領域を拡大することが分かった(図5E)。
本明細書に記載のいくつかの実験では、以下のモデルパラメータ値を使用した:μG(
細胞増殖による希釈)0.2;N0(最大細胞集団サイズ)10;k(細胞溶解の最大速
度)10;L0(最大溶解の半分をもたらす溶解遺伝子の濃縮)2;n(溶解関数のヒル
係数)4;b(AHL産生速度)50;μ(流動による最大AHL除去速度)15;CL
(溶解遺伝子コピー数)0.5;CI(LuxIコピー数)1;α0(Luxプロモーター基礎産生)0.5;αH(LuxプロモーターAHL誘発産生)30;H0(Luxプロモーターに対するAHL結合親和性)5;γL(溶解タンパク質の基礎分解)2;γI(LuxIの基礎分解)2;γC(LuxIのClpXP分解)8。
補足ビデオ1.株1(サルモネラ(S.typhimurium),LuxI上のssrAタグなし)
中のステルス送達回路(SDC)の60倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、(回路遺伝子のクオラム活性化を示す)細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖したことを示す。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを8回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約3時間であった。100×100μmのチャンバの底部で2分ごとに画像を撮った。
中のSDCの60倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、溶解周期が長いと、LuxIでの分解効率が高いことを示す。(回路遺伝子のクオラム活性化を示す)細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖した。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを6回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約6時間であった。チャンバのサイズは100×100μmであり、2分ごとに画像を撮った。
時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、実験の最初の部分において、200nMのAHLを有する培地を使用し、細菌が一定の溶解状態になるのを見ることができることを示している。このデバイスでは、蛍光色素(赤色チャネル)で示されている。その後、培地を蛍光色素が存在しないAHLなしの別の源に切り替え、細菌は、コロニーがイメージング終了前に4回の溶解サイクルの間持続する発振状態に戻った。チャンバ
のサイズは100×100μmであり、2分ごとに画像を撮った。
ースチャンバにロードされたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のHeLa細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を3分ごとに撮った。
チャンバにロードされたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のHeLa細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を3分ごとに撮った。
Eを有するSDC)を、単層HeLa細胞とウェルに入れたことを示している。細菌が増殖した後、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によってクオラム事象が可視化された。まもなくHeLa細胞が細胞死を呈することを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を1分ごとに撮った。
toggle switch from Escherichia coli.Nature 403, 339-342; Siuti, P., Yazbek, J. & Lu, T. K. Synthetic circuits integrating logic and memory in living cells.Nature Biotechnol.31, 448-452 (2013); Tigges, M., Marquez-Lago, T., Stelling, J. & Fussenegger, M. A tunable synthetic mammalian oscillator.Nature 457, 309-312 (2009); Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Multi-input
RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells.Science 333, 1307-1311 (2011)), a major challenge for their integration into larger circuits is the generation of sufficiently fast and precise communication between modules (Moon, T. S., Tamsir, A., Stanton, B. C. & Voigt, C. A. Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells.Nature 491, 249-253, 2012; Del
Vecchio, D., Ninfa, A. J. & Sontag, E. D. Modular cell biology: retroactivity and insulation.Mol.Syst.Biol.4, 161, 2008)。魅力的なアプローチは、ロバストな細胞シグナル伝達を容易にする宿主過程を設計した回路に組み込むことである(Nandagopal, N. & Elowitz, M. B. Synthetic biology: integrated gene circuits.Science 333, 1244-1248 (2011))。これに関連して、最近の研究では、細菌タンパク質分解が、限られた
細胞内プロテアーゼの供給に過負荷をかけることにより、ストレスに対する正確な応答を引き起こすことができることが示されている(Fredriksson, A. et al.Decline in ribosomal fidelity contributes to the accumulation and stabilization of the master stress response regulator σS upon carbon starvation.Genes Dev.21, 862-874 (2007);
Merrikh, H., Ferrazzoli, A. E., Bougdour, A., Olivier-Mason, A. & Lovett, S. T.
A DNA damage response in Escherichia coli involving the alternative sigma factor, RpoS.Proc.Natl Acad.Sci.USA 106, 611-616 (2009); Cookson, N. A. et al.Queueing up for enzymatic processing: correlated signaling through coupled degradation.Mol.Syst.Biol.7, 561 (2011))。ここで、我々は、プロテアーゼ競合を利用して、複数
の空間スケールおよび時間スケールにわたる遺伝子回路の迅速かつ調整可能な結合を設計する。我々は、標準的な転写因子ベースの結合法よりも一桁以上速い結合遅延時間(約20〜40分と比較して1分未満)を特徴付け、タンパク質とその分解タグとの間のリンカーの操作による調整可能性を実証する。我々は、細胞内およびコロニーレベルで遺伝子クロックを結合させ、次に、両方のクロックの変動性を減少させるためにマルチコロニー動態を同期させるプラットフォームとしてこの機構を使用する。我々は、結合されたクロックネットワークを用いて、独立した環境入力を単一の時系列出力にコード化し、それにより、遺伝子回路情報(context)において周波数分割多重化(別個の周波数によって共通
チャネル上に伝達される情報)を可能にする方法を示す。我々の結果は、競合するタンパク質分解などの天然の「キューイング」過程の使用による遺伝子回路の迅速かつ調整可能な結合のための一般的なフレームワークを確立する。
sensitivity arising from covalent modification in biological systems.Proc.Natl Acad.Sci.USA 78, 6840-6844 (1981))、そのため、有意な誘発遅延(31±5分、図10Aの誘発因子の添加からGFP出現までの経過時間)にもかかわらず、タグ付けされたモジュールは、密接に整列したままである(1±1分(±sem)、図10AのGFP−CFP(緑色蛍光タンパク質−シアン蛍光タンパク質)実験軌跡対)。この結合法は、標準的な転写因子ベースの結合法(約20〜40分)よりも1桁以上速い遅延を生じる(Rosenfeld, N. & Alon, U. Response delays and the structure of transcription networks.J. Mol.Biol.329, 645-654 (2003); Hooshangi, S., Thiberge, S. & Weiss, R. Ultrasensitivity and noise propagation in a synthetic transcriptional cascade.Proc.Natl Acad.Sci.USA 102, 3581-3586 (2005))。ClpXP活性を調節することによりモジュール出力を調整させることによって達成できる応答時間を直接説明するために、外部から提供される低レベル(90mM)のH2O2「誘発因子」が、迅速に(<2分、我々の実験時間ステップ)かつ可逆的に、構成的に発現されるGFPの濃度をClpXP依存的様式で調節することを示す(図10B)。ここで、H2O2は、ClpXPによる分解のための代替的なシグマ因子RpoSを標的とするアダプタータンパク質であるRssBを妨害することによって、ClpXP上への天然の基質のロードを低減する(Fredriksson, A. et
al.Decline in ribosomal fidelity contributes to the accumulation and stabilization of the master stress response regulator σS upon carbon starvation.Genes Dev.21, 862-874 (2007); Merrikh, H., Ferrazzoli, A. E., Bougdour, A., Olivier-Mason, A. & Lovett, S. T. A DNA damage response in Escherichia coli involving the alternative sigma factor, RpoS.Proc.Natl Acad.Sci.USA 106, 611-616 (2009); Mika, F.
& Hengge, R. A two-component phosphotransfer network involving ArcB, ArcA, and RssB coordinates synthesis and proteolysis of σS (RpoS) in E. coli.Genes Dev.19, 2770-2781 (2005))。RpoSがClpXPによって連続的に産生され、分解されるので、その律速アダプタータンパク質を不活性化すると、LAAタグ付きタンパク質の有効なClpXP分解速度が瞬間的に上昇する(Pruteanu, M. & Hengge-Aronis, R. The cel
lular level of the recognition factor RssB is transduction in σS turnover in Escherichia coli.Mol.Microbiol.45, 1701-1713 (2002))。
クロック変異体は、PLlacO-1プロモーターを使用する公表されたバージョンの高速動態
および単純な遺伝的構造を保持する。細胞内クロックは、発振をもたらす遅延を有するネガティブフィードバックループに基づいている。Plac/ara-1またはPLlacO-1プロモーターは、それらの転写リプレッサーであるLacIタンパク質の発現を駆動する。LacI転写リプレッサーのフォールディングおよび成熟において引き起こされる遅延は、転写活性の発振バーストをもたらす。より一般的には、発振をもたらすこのネガティブフィードバックモチーフを、TetRを駆動するtet抑制性プロモーターまたはcIリプレッサーを駆動するラムダプロモーターなどの他のプロモーター/リプレッサーの組み合わせを用いて構築してもよい。Plac/ara-1プロモーターをベースとする細胞内クロックの周期
は、染色体araCの存在下で、イソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシド(
IPTG)およびアラビノースの両方によって調節可能である。クオラムクロックは機能するためには臨界コロニーサイズを必要とするため、最初に小さなマイクロ流体デバイス(100細胞)を使用し、クオラムクロックの影響を受けない高速かつ非同期の細胞内クロック発振を観察した。より大きなデバイス(5,000細胞)では、集団が大きくなるにつれて、非同期発振から同一の細胞内発振およびクオラムクロック発振への移行が観察された(図11B)。より大きい集団の場合、クオラムクロックパルスの間のClpXPへの基質のロードは、細胞内クロックをその発振状態からシフトさせるのに十分であり、その空間的および時間的スケールがはるかに異なるにもかかわらず、2つのクロック間の完全な連動を可能にする。したがって、細胞間コミュニケーションのモード自体が欠如しているにもかかわらず、細胞内クロックは、クオラムクロックとのClpXP媒介性結合によって、コロニーレベルで効果的に同期される。
逆に生じさせたので、個々の細胞の細胞内クロック周期を変えることがクオラムクロック周期を間接的に調整することが分かった(図11C)。この効果を説明するために、ロード媒介パルス周波数調節の一形態を含むオシレータネットワークの計算モデルを開発した(図11D〜F)。結合したパルス間では、より大きな細胞内クロックロードがより高いレベルのAHL−シンターゼを産生するので、LuxIの分解速度のロード媒介による減少を通じてクオラムパルス開始を加速する(図11E、左および図11A−E)。結合したパルスの間に、細胞内クロックの寄与は、パルス自体の持続時間を未変化のままにする(図11e,左(モデル)および右(実験))。細胞内クロックおよびクオラムクロックを分解によって連結することにより、クオラムクロックのみと比較して、流速に関して結合系の発振状態が拡大した(図11F)。このようにして、細胞内クロックはクオラムクロックを連続的に発火させ、より高い外部流速でよりロバストな機能を可能にする(図12A〜C)。
がより遅いクオラムクロックから完全に分離されるので(Danino, T., Mondrago´n-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010); Stricker, J. et al.A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator.Nature 456, 516-519 (2008))、IPTGおよびアラビノースの入力と
流速の入力との両方を、時間領域で周波数変調発振にコード化し、フーリエ変換によって独立して抽出することができる。したがって、単一のクロック過程の測定は、基礎となるクロックネットワークの両方の活性を明らかにする。
トワークおよび我々の合成回路との間のClpXPにおけるH2O2媒介相互作用も観察した(図13B)。元のデザインでは、H2O2は、好気性応答制御系ArcABを介したluxプロモーターの転写アップレギュレーションにより、クオラムクロック発振を同期させた(Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012))。転写量の増加に加えて(図13C,上)、外部から供
給されたH2O2に応答したClpXP活性の増加と一致して、H2O2による見かけの分解速度の増加が見られた(図13C,下、ならびに図17Aおよび17B)。また、H2O2に応答した転写出力および有効なClpXP分解速度の結合された増加は、個々のコロニーにおける周期変動の影響を緩和することによって、マルチコロニーレベルで周期分布を狭める(図13C、上および図17C、17D)。
Stelling, J. & Fussenegger, M. A tunable synthetic mammalian oscillator.Nature 457, 309-312 (2009); Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R. & Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer
cells.Science 333, 1307-1311 (2011); Moon, T. S., Tamsir, A., Stanton, B. C. & Voigt, C. A. Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells.Nature 491, 249-253 (2012); Del Vecchio, D., Ninfa, A. J. & Sontag, E. D. Modular cell biology: retroactivity and insulation.Mol.Syst.Biol.4, 161 (2008))、翻訳後結合機構にはあまり注意を払っていない(Grunberg, R. & Serrano, L. Strategies for protein synthetic biology.Nucleic Acids Res.38, 2663-2675, 2010)。
、酵素、転写因子、結合部位)に対する競合は、ノイズを低減し、入力濃度に対する感受性を高め、複数の入力を識別するのに役立つ非線形結合効果をもたらす(Goldbeter, A. & Koshland, D. E. An amplified sensitivity arising from covalent modification in
biological systems.Proc.Natl Acad.Sci.USA 78, 6840-6844 (1981); Burger, A., Walczak, A. M. & Wolynes, P. G. Abduction and asylum in the lives of transcription factors.Proc.Natl Acad.Sci.USA 107, 4016-4021 (2010); Mukherji, S. et al.MicroRNAs can generate thresholds in target gene expression.Nature Genet.43, 854-859 (2011); Buchler, N. E. & Louis, M. Molecular titration and ultrasensitivity in regulatory networks.J. Mol.Biol.384, 1106-1119 (2008); Strogatz, S. Nonlinear Dynamics and Chaos: with Applications to Physics, Biology, Chemistry and Engineering (Perseus Books, 2001))。本来備わっている細胞過程を介して設計した回路を調整する
こと−我々が「宿主連鎖性」結合と呼ぶもの−は、合成モジュール間のロバストなシグナリングを促進することにより、より精巧な回路を生み出す可能性を有することが想定される。
one, J. A. & Lim, W. A. Cell-based therapeutics: the next pillar of medicine.Science Translational Medicine 5, 179 ps7-179ps7, 2013; Ruder, W. C., Lu, T. & Collins, J. J. Synthetic biology moving into the clinic.Science 333, 1248-1252, 2011; Weber, W. & Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology.Nature Reviews Genetics 13, 21-35, 2011; and Folcher, M. & Fussenegger, M. Synthetic biology advancing clinical applications.Current opinion in chemical biology, 2012)。有益な微生物が広範に見られること、およびその体内での機能的役割を考えると、細菌は、代謝障害、胃腸疾患、および癌の治療における生物療法の開発のための天然のプラットフォームに相当する(Cho, I. & Blaser, M. J. The human microbiome: at the interface of health and disease.Nature Reviews Genetics 13, 260-270 (2012); Garrett, W. S. Cancer and the microbiota.Science 348, 80-86, 2015; Pawelek, J. M., Low, K. B. & Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector.Cancer Research 57, 4537-4544, 1997)。治療的遺伝子発現のためのモジュールの開発の継続的な進歩により、コロニーの成長および治療的発現を動的に制御する回路の構築が、探求されてない実現可能な事項となっている(Jeong, J.-H. et al.Anti-tumoral effect of the mitochondrial target domain of noxa delivered by an engineered Salmonella typhimurium.PloS One 9, e80050, 2014; Loessner, H. et al.Remote control of tumour-targeted Salmonella enterica serovar typhimurium by the use of l-arabinose as inducer of bacterial gene expression in vivo.Cellular Microbiology 9, 1529-1537, 2007; Swofford, C. A., Van Dessel, N. & Forbes, N. S. Quorum-sensing Salmonella selectively trigger protein expression within tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 112, 3457-3462, 2015)。これらの遺伝子操作された細菌は、集団密度を自己維持する一方で、その部位で治療剤を絶えず産生し放出することが理想的である。本明細書に記載の実施形態の中には、閾値集団密度で同調的に溶解し、遺伝子にコードされた治療剤を放出する臨床的に意義のある特徴を有する遺伝子操作された細菌の使用がある。溶解すると、少数の生き残った細菌が増殖集団を再生し、したがってパルス溶解および放出サイクルをもたらす。マイクロ流体デバイスを使用して、遺伝子回路のロバスト性および調整可能性を特徴付け、インビトロでヒト癌細胞との共培養における抗癌剤としてのその可能性を実証する。マウスの移植同系大腸腫瘍に「同期溶解菌株」を注射し、ルシフェラーゼレポーターを使用してインビボでパルス性コロニー動態を観察する。細菌が化学療法に天然の補助物質を提供できるというこれまでの知見に基づいて(Dang, L. H., Bettegowda, C., Huso, D. L., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 15155-15160, 2001)、ヒトの結果の不完全な予測にもかかわらず、前臨床試験においてパラダイムを保持する動物モデルで我々の系を試験した(Begley, C. G. & Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer re- search.Nature 483, 531-533 2012; Sausville, E. A. & Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development.Cancer Research 66, 3351-3354, 2006)。肝臓大腸転移の実験的同系移植モデルで化学
療法および遺伝子操作された細菌の組み合わせを使用して、治療可能性を実証し、併用療法が顕著な生存利益とともに全身腫瘍組織量の顕著な減少をもたらすことを見出す。我々のアプローチは、伝統的な医学、新しい生物学的治療法、またはナノ粒子との併用で遺伝子操作された細菌を用いる新規の送達戦略を可能にし得る(Cheong, I. et al.A bacterial protein enhances the release and efficacy of liposomal cancer drugs.Science 314, 1308-1311, 2006; O’Shea, C. C. Viruses-seeking and destroying the tumor program.Oncogene 24, 7640-7655, 2005; June, C. H. et al.Engineered t cells for cancer therapy.Cancer Immunology, Immunotherapy, 1-7, 2014)。
バックループを用いて同期溶解回路(SLC)を設計した(Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330, 2010; Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012)。回路(図1A)は、それ自身のアクチベーター(ポジティブフィードバック)および溶解遺伝子(ネガティブフィードバック)の両方の発現を駆動する共通のプロモーターからなる。具体的には、luxIプロモーターは、LuxRに結合し、LuxRがプロモーターを転写活性化することを可能にする自己誘発因子(AHL)の産生を制御する。
C. & You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden facets of host-circuit physiology.PloS One 5, e11909, 2010)。重要なことに、AH
Lは、隣接する細胞に拡散することができ、それにより、細胞間の同期機構を与える。
代用物としてsfGFPを使用して、増殖、溶解、およびタンパク質放出を観察するためにマイクロ流体デバイスを使用した。集団溶解に対応する蛍光レポータープロファイルのピークによって特徴付けられる周期的な溶解事象を観察した(図1C)。各サイクル後に生存している細胞は、溶解感受性の子孫を産生するため、溶解した細胞の割合がサイクルを通して一定のままであり、溶解および生存が確率的様式で起こることを示唆する(図21A〜B)。変動する生体内微小環境における実施という最終目標を前提に、我々のマイクロ流体デバイスにおいて、全ての条件にわたって、インキュベーション温度(36℃〜40℃)および灌流速度(100μm/s〜200μm/s)の範囲を試験し、3時間の平均周期を測定した。(図1D)。これらの実験の結果は、本明細書に与えられている補足ビデオ1、2、および3の議論にさらに要約されている。これらの知見は、SLCが、インビボの状況で起きる可能性のある関連する環境変動にさらされても、溶解および放出のロバストなサイクルを生じさせる能力を有することを示唆する。
び分解の速度がより低いことがこれまでに判明している大腸菌よりもロバストであったという我々の観察と一致している(Prindle, A. et al.Genetic circuits in Salmonella typhimurium.ACS Synthetic Biology 1, 458-464, 2012),(図21C)。
溶解周期の調整可能性を探った。モデル予測と一致して、周期およびコロニー発火振幅の増加が実験的に観察された(図18C〜Dおよび図21D)。したがって、SLCは薬剤送達周期および量の調整を可能にする。
Nguyen, V. H. et al.Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer.Cancer Research 70, 18-23, 2010)。インビトロで
の細菌の溶解および癌細胞の死滅を可視化するために、細菌の溶解および癌細胞死の単一細胞視覚化を可能にする、より小さい細菌グロースチャンバに隣接するグロースチャネル内に癌細胞が接着するように、マイクロ流体デバイスを設計した(図22D)。ヒト子宮頸癌HeLa細胞とSLC回路を有するサルモネラ(S. Typhimurium )とを共培養した
後、細菌溶解の開始時にHeLa細胞死が観察され、効率的な毒素放出が示された(図3A〜B)。これらの実験の結果は、本明細書に与えられている補足ビデオ5および6の議論にさらに要約されている。トラップの外側の完全な細胞死は、最初のsfGFP蛍光の約111分以内に起こった(図3C)。したがって、SLCはインビトロで癌細胞を殺すのに必要なレベルでHlyEを放出することが可能であった。
されたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のHeLa細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を3分ごとに撮った。全ての場合に必要とされる曝露量は類似しているが、発火速度の上昇は細胞死までのHlyEへのより短い曝露時間に対応し、溶解および治療剤放出の増加を示した(図3F)。このようにして、播種された細菌の初期集団レベルは、回路の初期タイミングおよび放出特性を決定する。
1402-1405, 1988; Wood, T., Kuhn, R. & Peretti, S. Enhanced plasmid stability through post-segregational killing of plasmid-free cells.Biotechnology Techniques 4, 39-44, 1990; Derman, A. I. et al.Phylogenetic analysis identifies many uncharacterized actin-like proteins (alps) in bacteria: regulated polymerization, dyna
mic instability and treadmilling in alp7a.Molecular Microbiology 73, 534-552, 2009; Danino, T., Lo, J., Prindle, A., Hasty, J. & Bhatia, S. N. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria.ACS Synthetic Biology 1, 465-470, 2012; Danino, T. et al.Programmable probiotics for detection of cancer in urine.Science translational medicine 7, 289ra84-289ra84; 2015)。さらに、細菌発光を介したhlyE産生およびクオラム発火の指標として、治療的遺伝子およびluxCDABE遺伝子の両方(インビボレポーターモジュール)をluxIプロモーター下に配置した(図1A)。免疫適合性マウスで大腸癌の皮下モデル(MC26細胞系)を用いて、SLC細菌の株(SLC−hly)を腫瘍内に注射した。インビボイメージング(IVIS)技術を使用して(Danino, T., Prindle, A., Hasty, J. & Bhatia, S. Measuring growth and
gene expression dynamics of tumor-targeted S. typhimurium bacteria.JoVE, Journal of Visualized Experiments, e50540-e50540, 2013)、設計およびインビトロの特徴付けと一致して、腫瘍内のパルス性細菌集団動態が観察された(図19A〜C、図23A)。発光強度の大きさは、構成的対照株より平均して約300倍低く、腫瘍内の細菌集団レベルの有意な減少を示した(図23C)。これらの結果は、インビボ適用のための細菌集団動態の成功裏の設計を実証する。
Reed, J. C. Salmonella typhimurium engineered to produce CCL21 inhibit tumor growth.Cancer Immunology, Immunotherapy 58, 769-775, 2009)(図23)。腫瘍に直接
送達される反復注射は、複数のSLC−3株と対照との間に有意な重量差をもたらさず、SLC−3株で処置したマウスが有意な治療効果を示すことが分かった(図23F〜G)。さらに、SLC−3株、化学療法、または非回路細菌で処置したマウスから採取した腫瘍切片の組織像を調べた。SLC−3の場合では、腫瘍の細菌コロニー形成が観察され、組織における有意に高い細胞死も観察された(図24)。まとめると、これらの結果は、回路が、静脈内に注射されたマウスに対して安全性を高め、腫瘍内の細胞死の増加ももたらすことを示している。癌治療との関連で我々の回路を適用するための原理証明を確立するために、化学療法は酸素欠乏のために効果がないと考えられている無血管の腫瘍コンパートメントを嫌気性細菌が占めることができることを示した以前の研究からインスピレーションを得た(Dang, L. H., Bettegowda, C., Huso, D. L., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 15155-15160, 2001)。最適な治療アプローチには、細菌が腫瘍の壊死性コアに薬剤を送達し、一方で、標準的な化学療法を血管新生領域に使用するという相乗的な組み合わせが含まれ得ることが提唱されている(Dang, L. H., Bettegowda, C., Huso, D. L., Kinzler, K. W. & Vogelstein, B. Combination bacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors.Proceedings of the National Academy of Sciences 98, 15155-15160, 2001; Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy.Nature Reviews Cancer 10, 785-794, 2010)。このパラダイムに基づいて、肝臓大腸転移の実験的同系移植モデルにおいて、SLC細菌と一般的な化学療法(5−フルオロウラシル、または略して5−FU)と
の併用を試験した。細菌株の経口送達は、樹立肝腫瘍の安全かつ効率的なコロニー形成をもたらし、移植後5〜7日間送達され、したがってマウスに有害な影響を与えない反復投薬を可能にすることが観察された(図20A〜B)。細菌療法のみの反復経口送達、または0日目および21日目の化学療法の単独の投与に応答して、腫瘍は同様の活性軌跡を示した(図20C)。しかしながら、2つの療法の併用は、18日間に亘る腫瘍活性の顕著な低下をもたらした(図20D)。この最初の18日間、腫瘍の大部分は、腫瘍サイズの30%以上の減少を誘発するものとして認定された(図20E)。全体の応答は、不治の大腸転移を有する動物の生存期間の約50%の増加をもたらした(図20F)。長期的な回路安定性のための戦略または追加の治療用カーゴの利用により、改良が為され得る。
株およびプラスミド
本開示に記載されているいくつかの回路株を、37℃のインキュベーター内で、0.2%グルコースと共に、カナマイシンおよびクロラムフェニコールをそれぞれ50μgml-1および34μgml-1含むLB培地で培養した。哺乳類細胞を、10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(CellGro30−002−CI)を補充したDMEM培地で培養し、37℃で5%CO2を維持した組織培養インキュベーター内
に置いた。プラスミドを、クローニングのCPEC法を用いて、または標準的な制限消化/ライゲーションクローニングを用いて構築した(Quan, J. & Tian, J. Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways.PloS One 4, e6441
(2009))。我々のグループの以前の研究では、アクチベータープラスミド(Kan,C
olE1)を使用したが、ePopプラスミドから溶解遺伝子EをPCRで取り出し、LuxIプロモーターの制御下でこれをベクター(Chlor、p15A)にクローニングすることにより溶解プラスミドを構築した(Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012; Marguet, P., Tanouchi, Y., Spitz, E., Smith, C. & You, L. Oscillations by minimal bacterial suicide circuits reveal hidden facets of host-circuit physiology.PloS One 5, e11909, 2010)。MG1655のゲノムDNAからhlyE遺伝子をPCRにより得、mCCL2
1(マウスCCL21)およびCDD−iRGDを合成した。これらの遺伝子を、ptacプロモーターまたはpLuxIプロモーターのいずれかの制御下で、溶解プラスミドにクローン化した(De Boer, H. A., Comstock, L. J. & Vasser, M. The tac promoter: a
functional hybrid derived from the trp and lac promoters.Proceedings of the National Academy of Sciences 80, 21-25, 1983)。共培養は、HeLa細胞および運動性
または非運動性のサルモネラ(S. typhimurium)、SL1344で行った。完全な株およびプラスミドの情報については、補足情報も参照されたい。
み合わせることによりPCR反応によって構築し、luxRを除く全ての回路要素を、迅速分解のためにカルボキシ末端ssrAタグ(AANDENYALAA)(Keiler, K. C., Waller, P. & Sauer, R. Role of a peptide tagging system in degradation of proteins synthesized from damaged messenger RNA.Science 271, 990-993 (1996))を用いてPCRによりタグ付けした。1つのベクター(IRAP2、Kan、およびColE1)上にアクチベーターおよびレポート要素(LuxI、CFP、およびYFP)を、第2のベクター(IRAP3、Amp、およびp15A)上に抑制要素(AiiAおよびLacI)を配置した。Thr−Ser(TS)コンストラクトを、CFPとLAAタグとの間に種々のTSリピートインサートを付加することによって構築した。例えば、2つのTSについて、分解タグ「AANDENYALAA」の直前にアミノ酸配列「TSTS」を挿入した。AAVコンストラクトを、分解タグの「LAA」部分を「AAV」で置換することによって構築した。
この研究で使用されたマイクロ流体デバイスおよび実験準備プロトコルは、以前に我々のグループから報告されたものと同様である(Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44, 2012)。細菌グロースチャンバは、面積が100×100μm、高さが約1.4μmであった。チップ上での共培養実験では、最初にHeLa細胞の浮遊培養物を非常に低い流速でデバイス培地チャネルにロードして接着させた後、組織培養インキュベーター中で0.5〜2日間インキュベートして増殖させた(Kolnik, M., Tsimring, L. S. & Hasty, J. Vacuum-assisted cell loading enables shear-free mammalian microfluidic culture.Lab On a Chip 12, 4732-4737, 2012)。実験の日に、デバイスを顕微鏡に移し、回路を含む細菌をイメージング前にグロースチャンバにロードした。画像の取得は、Photometrics CoolSnap冷却CCDカ
メラを用いるNikon TI2で行った。スコープおよび付属品を、Nikon Elementsソフトウェ
アを使用してプログラミングした。マイクロ流体工学および顕微鏡検査に関するさらなる詳細は、補足情報で見ることができる。
して画像を取得した。2つの異なる培地源を混合または切り替えることができるマイクロ流体デバイスの内部で細胞をイメージングした。実験の日に、50mlの一晩培養物を50μlのLysogeny Broth(Difco)および抗生物質で希釈した。細胞が0.1のD600nmに達したとき、細胞を遠心沈殿させ、5mlの新鮮培地に再懸濁し、デバイスにロードした。様々なサイズの集団:小規模コロニー(100細胞)(Ferry, M. S., Razinkov, I. &
Hasty, J. Microfluidics for synthetic biology from design to execution.、Method
s Enzymol.497, 295-372)、大きなコロニー(5,000細胞)(Danino, T., Mondrago´n-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010))、および複数の大きなコロニー(5,000細胞の5
00コロニー)(Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic
‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012))を研究するために3つのデバイスを使用した。
単一細胞および個々のトラップの蛍光軌跡を、我々がこれまでに開発したアルゴリズム(Prindle, A. et al.A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’.Nature 481, 39-44 (2012); Ferry, M. S., Razinkov, I. & Hasty, J. Microfluidics for synthetic biology from design to execution.Methods Enzymol.497, 295-372)およ
び組み込みMATLAB関数を使用して、経時画像から得た。これらの軌跡からピークおよびトラフを特定し、これらの値を使用して周期および振幅を計算した。図10Aの結合遅延および図10Aのオフセット時間を計算するために、軌跡対の10%振幅点間の差を測定した。誘発時間を、誘発開始時間から誘発されたモジュールの10%振幅まで測定した。時系列データから両方の周波数を抽出するために、Lomb-Scargleアルゴリズムを用いてフーリエ変換を行った。2つの逐次変換を使用して、各要素を別々に分離した。まず、バンドパスフィルタ(5〜25分)を使用して、速い細胞内クロック要素を抽出した。次に、第2のバンドパスフィルタ(75〜150分)を使用してこれらの速い周波数を通さないようにして、より遅いクオラムクロック要素を抽出した。最後に、2つのパワースペクトルをオーバーレイし、ピークの相対的な振幅を保存する。
追加の方法、拡張データ表示項目、およびソースデータは、論文のオンライン版で入手でき、これらのセクションに固有の参考文献は、オンライン・ペーパーにのみ掲載されている。
分解タグの実験
モジュール分解の位相シフトに対する可変長リンカー(TSリピート)の影響を調べることに加えて(図14A〜F)、十分に特徴付けられたAAV分解タグ(Andersen, J. B.
et al.New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.Applied and Environmental Microbiology 64, 2240-2246, 1998)を試験した。Andersenらにおいて、GFP−AAVは、GFP−LAAより
50%高い半減期を有することが示された。この研究では、下流モジュール(CFP−AAV)は、2つのTS−リンカー配列の分解の遅延と同様であるドライバーモジュール(GFP−LAA)に対する分解の遅延を示した(図14B下部)。さらなる特徴付けが、SspB結合領域の前の可変長TSリンカー配列とAAV分解タグとの間の作用機序の相違を決定するために必要とされる。CFPからGFPへのブリードオーバーは、GFPからCFPへのブリードオーバーよりも有意であるが、CFPからGFPへのブリードオーバーは、誘発タンパク質(GFP)が結合タンパク質(CFP)のタンパク質レベルを駆動する図10Aの実験とは無関係である。したがって、CFPフルオロフォアを欠く株で10nMのAHLを用いて、活性化sfGFPによるsfGFPからCFP蛍光チャネルへのブリードの可能性を試験する実験を行った。sfGFPは予想通りに増加したが、CFP蛍光は変化しないことが分かった(図14B上部パネル)。
パルス間(待機)時間は、1ピークの10%ダウンスロープ点と、次のピークの10%アップスロープ点との間の時間として定義した(図14A)。平均QSパルス間時間は、結合系にIPTG(0.5mM)を添加すると減少したが、各パルスの時間は一定のままであった。さらに、結合オシレータ系からのQS軌跡は、0.5mMのIPTGと比較して、IPTGなしで有意に低い変動性を示した(図16A〜B)。これらの結果は、より高いNFBタンパク質産生に関連するより強いNFB(0mM IPTG)(Stricker, J. et al.A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator.Nature 456, 516-519
(2008))が、結合系において、より短くよりロバストなパルス間挙動をもたらすことを示
唆する。大きなバイオピクセル(biopixel)デバイスでは、よりロバスト性が低いコロニーレベル発振は、H2O2が隣接するピクセルを効率的に結合することを防止し、非同期QS発振をもたらす(図16CではNFBなし)。NFBは、パルス間持続時間ノイズを低減し、このことは、H2O2が、バイオピクセルデバイス内の隣接するコロニーでQS発振を同期させることを可能にする(図16Cの0.1mM IPTG)。さらにNFB強度を増加させる。
H2O2同期化クオラムクロック軌跡の解析では、発振の周期の減少および振幅の増大が示された(図13B上部)。H2O2同期化は、これらの軌跡における分解時間の明らかな減少をもたらす(図17A)。周期の減少の重要な要因の1つは、ピーク時間から10%ダウンスロープ時間までのCFP蛍光の減少率として定量化した、ClpXP標的化タンパク質の活性の増加である。図17Bは、H2O2結合によるClpXP分解速度の有意な増加(3倍)を示す。
QSオシレータ
非結合QSオシレータの動的挙動を説明するために、(Danino, T., Mondragon-Palomino, O., Tsimring, L. & Hasty, J. A synchronized quorum of genetic clocks.Nature 463, 326-330 (2010))で発表されている遅延微分方程式モデルを進展させた。LuxI
(I)、AiiA(A)、内部AHL(Hi)、外部AHL(He)の式に加えて、アシル−ACPおよびS−アデノシルメチオニン(SAM)からなるAHL基質(S)を含めて(Parsek, M. R. & Greenberg, E. P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in gram-negative bacteria: a signaling mechanism involved in associations with higher organisms.Proceedings of the National Academy of Sciences 97, 8789-8793 (2000))、Hiの産生が減速する一方でLuxI分子の数が依然として増加していることを説明した。タンパク質の転写、翻訳、および成熟速度をまとめて単一の時間遅延パラメータτHにする。LuxRおよびAHL複合体(各LuxR分子およびAHL分子の2つ)によ
る転写活性化は、内部AHLの過去の濃度Hi(t−τH)に依存する遅延産生期間P(
τH)を生じる。LuxRは、速い分解のためにタグ付けされておらず、プラスミド上に
多量の遺伝子コピーを有するので(colE1上に2回、p15A上に1回)、一定レベルのLuxRを想定した。(Muller, J., Kuttler, C., Hense, B. A., Rothballer, M. & Hartmann, A. Cell-cell communication by quorum sensing and dimension-reduction.Journal of Mathematical Biology 53, 672-702 (2006))に基づいてヒル係数4を用い
て、AHL−LuxR重合におそらく起因するAHLの高い協同作用を説明した。細胞膜を通したAHLの拡散を、Dに比例する項によって説明し、外部AHLの希釈を、μに比例する項によって説明する。細胞密度パラメータdを系に組み込み、総細胞容積および培地容積の差を説明した。γIおよびγAに比例する酵素分解の項は、ミカエリスメンテン速度式を通じてLuxIおよびAiiAの酵素分解をそれぞれ説明する。kIおよびkAの異なる値は、LuxIおよびAiiAのClpXPへの異なる優先的結合動態を表す。
NFBオシレータの動的挙動を説明するために、(Mather, W., Bennett, M. R., Hasty, J. & Tsimring, L. S. Delay-induced degrade-and-fire oscillations in small genetic circuits.Physical Review Letters 102, 068105 (2009))に基づいてLacI(L)の単一の遅延微分方程式を使用した。タンパク質の転写、翻訳、および成熟を、時間遅延パラメータτLに一緒にまとめて扱う。LacIの転写不活性化は、LacIの過去の
濃度L(t−τL)に依存する遅延産生項Q(τL)を与える。LacIの酵素分解は、
ミカエリスンテン反応速度式を通じてγLに比例する項によって説明される。産生式Qに
おけるパラメータCは、LacI抑制の強度に対するIPTGの効果を表す。
)および成熟YFP(γm)のための式を有するレポーター動態を含める必要があった。
これらの追加の方程式は、結合系におけるQS動態を説明するためには必要ない。これに関するさらなる情報は、例えば、本出願の「モデルパラメータ値」のセクションで見られる。
2つのオシレータの結合は、CplXP分解による効果的な「キューイング」効果を増加させることによって達成された(Cookson, N. A. et al.Queueing up for enzymatic processing: correlated signaling through coupled degradation.Mol.Syst.Biol.7, 561
(2011))。結合されていない場合、2つのオシレータ要素の分解は独立しており、
結果の多くを再現した。
QSパルス活性化の多細胞動態を理解するために、外部AHL(He)を共有する2つ
の同一細胞を有するモデルを構築した。最初に、AiiAとLuxIのわずかに異なる構成的産生を有する2つの細胞からなるQSのみの系を検討した。この系では、より遅い細胞がより速い細胞に結合し、このことは、QSパルスが最初に発火する細胞が、AHL細胞間コミュニケーションを介して近くの細胞においてQSパルス活性化を引き起こすことを示唆する(図15A)。次に、2細胞系の細胞1にNFBを加え、その細胞の周期を短くした。結果として、2つの細胞が外部AHLを介して連結された場合、より遅い細胞2(NFBなし)は、より速い細胞1に結合した(図15B)。結果として、NFBが異なる細胞で位相がずれていても、より速い細胞におけるQSパルスの開始は、近傍領域の残りの細胞中をQSパルスが伝播するのを開始することができる。この効果はさらに、細胞間のQS変動性を低下させ、これは20細胞モデルにおける周期変動性の減少から見られる(図15D)。20個の細胞のそれぞれのAiiAタンパク質およびLuxIタンパク質の構成的産生にノイズを加え(α0=0.6±0.1)、同期細胞対非同期細胞におけ
る周期変動性の低下を示した(図15E)。
LuxI蛍光レポーター発現中に産生されたH2O2(ViおよびVe)に応答するQSオシレータの動的挙動を説明するために、H2O2の産生および分解を説明する微分方程式を、QSオシレータ遅延−微分方程式モデルに追加した。H2O2の産生が、CFP蛍光タンパク質と同じプロモーター下にあるLuxIの濃度に依存すると仮定した。カタラーゼによるH2O2の分解は、その濃度に比例する。H2O2は、2つの特徴的な方法でQSオシレータに影響を与える。第1に、正常条件下であるArcAは、Luxプロモーターを部分的に抑制し、H2O2によって引き起こされる酸化条件下で不活性化され、Lux抑制を緩
和し、LuxIおよびAiiA産生を増加させる。この現象を、H2O2濃度に依存する産生項に乗数を加えることによってモデル化する。第二に、H2O2は、ClpXPロードを減少させ、AiiAおよびLuxI分解の速度を増加させることが示されている。ここでも、H2O2濃度に依存する分解項の前に乗数を加えることによって、この挙動をモデル化する。最後に、H2O2は、細胞膜を自由に拡散することができ、拡散パラメータDVによ
って特徴付けられる拡散項を記述する。細胞外H2O2(Ve)は、さらに、その濃度に比
例した速度で系を離れることができる。
前に述べたように、パルス間持続時間の短縮は、ノイズに起因する周期変動を減少させる。我々のモデル(上記参照)にQSオシレータに対するH2O2の効果を組み込むと、QS軌跡にいくつかの大きな変化が生じる。第1に、予想通りに、H2O2の添加によりQSの振幅およびQSのダウンスロープ時間が減少する(図17C)。また、これらの2つの効果の結果として、パルス間持続時間が短くなり、よりロバストなQS発振がもたらされる(図17D)。周期CV計算のための50以上の周期測定値を得るためにモデルをシミュレートした。ノイズを、遅延産生項にノイズ生成項(α0=±0.1)を追加すること
によってモデルに導入した。
O2の影響は、互いの変動性を相殺して、よりロバストなQS発振を生じさせるように見
える。
実験からのNFB周期データをフィッティングするために、LacI産生項のための以下のパラメータスケーリング機能を使用して、
CA=1(AiiAコピー数);CI=4(LuxIコピー数);γA=8(AiiAの
ClpXP分解);γI=8(LuxIのClpXP分解);KA=1(ClpXPに対するAiiA結合親和性);KI=0.2(ClpXPに対するLuxI結合親和性);α0=0.6(Luxプロモーター基礎産生);αH=3(LuxプロモーターAHL誘発産
生);h0=0.1(AHLプロモーター結合親和性);τH=1(LuxIおよびAiiA産生の遅延);b=1(LuxIによるAHL合成速度);kS=25(LuxIに対
するAHL基質結合親和性);S0=50(基礎AHL基質産生);γH=1(AiiAによるAHL分解速度);kH=0.1(AIIAに対するAHL結合親和性);D=0.
8(膜を通るAHL拡散);d=0.1(細胞密度);μ=0.5(流速);αL=1(
LacI/YFP産生速度);C=0.0025(LacIプロモーター結合親和性);τL=0.7(LacI/YFP産生の遅延);kL=0.001(ClpXPに対するLacI/YFP結合親和性);γL=0.05(LacI/YFPのClpXP分解);
δ=1(QSフルオロフォアによるH2O2産生);CI=2(ミカエリス定数);fp=1.3(LuxIプロモーターのH2O2活性化の強度);DV=8(膜を通るH2O2拡散
);μV=0(細胞外H2O2希釈)。
全ての動物実験は、動物実験委員会(MIT、protocol 0414-022-17)によって承認され
た。皮下腫瘍モデル:移植されたマウス結腸癌細胞系(MC26, Tanabe lab, Massachusetts General Hospital)由来の両側皮下後部側腹腫瘍を有する6週齢のメスBALB/cマウス(Taconic Biosciences, Inc.)で動物実験を行った。腫瘍細胞を、DMEM(フェ
ノールレッドなし)中に1e8細胞ml-1の濃度で移植用に調製した。次いで、細胞を側腹当り100μLの容量で皮下に1e7細胞からなる各移植片で移植した。腫瘍は直径が4〜10mmに達するまで約2週間増殖した。
実験用転移モデルを、ルシフェラーゼ産生マウス癌細胞を免疫適合性マウスの外科的に外面化させた脾臓に注射することによって得た。腫瘍細胞を90秒間肝臓に播種した後、異所的腫瘍増殖を防ぐために脾臓を除去した。MC26−LucF細胞系(Tanabe Lab, MGH)を用い、6週齢のメスBalb/cマウス(Taconic Biosciences, Inc.)の脾臓に5×104細胞/100μLのPBSで注射した。
インビトロ実験と同様に、適切な抗生物質および0.2%グルコースを含むLB培地中で細菌株を一晩増殖させた。抗生物質を含む新鮮な培地で1/100倍希釈を注射の日に開始し、細菌がクオラム閾値に達するのを防ぐためにOD<0.1まで増殖させた(特にSLCの場合)。細菌を遠心沈殿させ、マウスに注射する前に滅菌PBSで2〜3回洗浄した。細菌の腫瘍内注射は、腫瘍当り10〜20μLの注射総容積でPBS中5e7細胞ml-1の濃度で行い、一方、静脈内注射を100μLの総容積で行った。SLC−3株注射では、この最終容積を、示された密度で3つの株間で等しく分割した。肝臓転移実験では、適切な抗生物質および0.2%グルコースを含むLB培地で0.05のODに達するまで細菌を増殖させた後、1〜5e9細菌/mLに濃縮し、経口強制栄養により送達した。
発光シグナルを、細菌注射後、IVIS Spectrum in vivo imaging systemで測定した。測定値を、注射前の値と比較して、動態を追跡した。皮下腫瘍容積は、イメージング過程を通じて、カリパスを用いて各腫瘍の長さ、幅、および高さを測定して定量した(V=L×W×H)。容積を注射前の値と比較して、物理的な腫瘍増殖を追跡した。腫瘍を、通常、皮下実験では平均300mm3まで増殖させ、肝臓転移モデルの実験の前に5〜7日間増
殖させた。マウスの生存は、安楽死を必要とする認可された特徴に基づいて追跡した。
統計的検定は、Microsoft Excel(スチューデントのt検定)またはGraphPad Prism 5.0(ボンフェローニ事後検定、ログランク検定を用いる分散分析)のいずれかで計算した
。実施された統計検定の詳細は、各図の凡例に示されている。データがほぼ正規分布していた場合、単一変数ではスチューデントt検定もしくは1元配置分散分析、または2変数では2元配置分散分析を使用して値を比較した。実験前に、マウスを異なるグループで無作為化した。
の範囲および精神から逸脱することなく様々な修正がなされ得ることが理解される。したがって、本明細書に開示された様々な実施形態は限定することを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲によって真の範囲および精神が示されている。
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)中のステルス送達回路(SDC)の60倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、(回路遺伝子のクオラム活性化を示す)細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖したことを示す。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを8回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約3時間であった。100×100μmのチャンバの底部で2分ごとに画像を撮った。
)中のSDCの60倍の倍率での経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、溶解周期が長いと、LuxIでの分解効率が高いことを示す。(回路遺伝子のクオラム活性化を示す)細胞が蛍光を発するクオラム閾値に達し、一部分の集団が溶解するまで、マイクロ流体チャンバ内で細菌のコロニーが増殖した。生存細菌は、再集合化し、再び閾値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを6回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約6時間であった。チャンバのサイズは100×100μmであり、2分ごとに画像を撮った。
値に達するまで増殖し、過程を繰り返した。ビデオはコロニーを6回の溶解サイクルで追跡し、この株の溶解周期は約3時間であった。チャンバのサイズは100×100μmであり、2分ごとに画像を撮った。
経時的蛍光顕微鏡検査を示すビデオを撮った。このビデオは、実験の最初の部分において、200nMのAHLを含む培地を使用し、細菌が一定の溶解状態になるのを見ることができることを示している。このデバイスでは、蛍光色素(赤色チャネル)で示されている。その後、培地を蛍光色素が存在しないAHLなしの別の源に切り替え、細菌は発振状態に戻り、コロニーはイメージング終了前に4回の溶解サイクルの間持続した。チャンバのサイズは100×100μmであり、2分ごとに画像を撮った。
ロースチャンバにロードされたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のHeLa細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を3分ごとに撮った。
スチャンバにロードされたことを示す。細菌が、クオラム閾値に達し溶解するまで、そのチャンバ内で増殖するのを見ることができた。溶解すると、チャネル中のHeLa細胞が、細胞死を起こしているのを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を3分ごとに撮った。
yEを有するSDC)を、単層HeLa細胞とウェルに入れたことを示している。細菌が増殖した後、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によってクオラム事象を可視化した。まもなくHeLa細胞が細胞死を呈することを見ることができた。経時的蛍光顕微鏡画像を1分ごとに撮った。
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Claims (91)
- 遺伝子操作された細胞であって、前記細胞の集団が所望の密度に達したときにポリペプチドを放出するように遺伝子操作された前記細胞。
- 前記細胞が細菌細胞である、請求項1に記載の細胞。
- 前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項1〜2のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害するポリペプチドである、請求項3に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、請求項3に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドが、T細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、請求項3に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、請求項3に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペプチド
である、請求項3に記載の細胞。 - 前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、請求項8に記載の細胞。
- 前記細胞の前記集団が前記所望の密度に達したときに前記細胞が溶解する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が腫瘍内で増殖することができる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が腫瘍の壊死領域において増殖することができる、請求項1〜10のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が嫌気性細胞である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞の前記集団が前記所望の密度に達したときに前記細胞を溶解するポリペプチドを産生するように前記細胞が遺伝子操作されている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、φX174E溶解ポリペプチド、コリシン産生細菌由来のE7溶解ポリペプチド、またはラムダファージ溶解ポリペプチドを含んでなる、請求項14に記載の細胞。
- 前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、φX174E溶解ポリペプチドを含んでなる、請求項15に記載の細胞。
- 前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、調節可能なプロモーターの制御下にある、請
求項14〜16のいずれか一項に記載の細胞。 - 前記細胞が、前記調節可能なプロモーターの強度を増加させる拡散性誘発因子を産生する、請求項15に記載の細胞。
- 前記調節可能なプロモーターが、luxIプロモーターまたはその機能性断片を含んでなる、請求項17〜18のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記拡散性誘発因子がアシルホモセリンラクトン(AHL)を含んでなる、請求項18に記載の細胞。
- 前記アシルホモセリンラクトンが、luxIタンパク質の作用によって産生される、請求項20に記載の細胞。
- 前記luxIタンパク質の発現がluxIプロモーターの制御下にある、請求項21に記載の細胞。
- 前記アシルホモセリンラクトンが、luxRタンパク質に結合し、前記luxRタンパク質が前記luxIプロモーターからの転写を活性化する、請求項20〜22のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞中のアシルホモセリンラクトンのレベルが、前記細胞中のAiiAタンパク質のレベルによって制御される、請求項20〜23のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記AiiAタンパク質の発現が、調節可能なプロモーターの制御下にある、請求項24に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドが、前記細胞内のプラスミドによってコードされる、請求項3〜25のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞内のプラスミドによってコードされる、請求項14〜26のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドが、前記細胞内の第1のプラスミドによってコードされ、前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞内の第2のプラスミドによってコードされる、請求項14〜27のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドおよび前記細胞を溶解する前記ポリペプチドが、前記細胞中の同じプラスミドによってコードされる、請求項14〜27のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞集団が前記所望の密度にあるときに、前記集団中の細胞の全てが溶解されるわけではなく、それによって溶解後の前記細胞の再増殖を可能にし、前記治療用ポリペプチドのパルス放出を促進する、請求項10〜29のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記誘発因子のレベルが、前記細胞を溶解する前記ポリペプチドと同じ調節可能なプロモーターによって制御される、請求項18〜30のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記治療用ポリペプチドが、溶血素Eを含んでなる、請求項3〜31のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞が、腫瘍の壊死領域内に優先的に局在する、請求項1〜32のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記ポリペプチドの放出のタイミングが、遺伝子回路の活性に直接的または間接的に連動している、請求項1〜33のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記遺伝子回路が、ClpXPプロテアーゼの活性を制御する遺伝子回路を含んでなる、請求項34に記載の細胞。
- 前記放出されたポリペプチドがLAAタグを含んでなる、請求項35に記載の細胞。
- 前記放出されたポリペプチドでの前記ClpXPプロテアーゼの活性レベルが、過酸化水素のレベルによって制御される、請求項35〜36のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞の溶解のタイミングが、遺伝子回路の活性に直接的または間接的に連動している、請求項10〜37のいずれか一項に記載の細胞。
- 前記細胞の溶解のタイミングに連動する前記遺伝子回路が、前記ClpXPプロテアーゼの活性を制御する遺伝子回路を含んでなる、請求項38に記載の細胞。
- 前記細胞を溶解するポリペプチドが、LAAタグを含んでなる、請求項39に記載の細胞。
- 前記細胞を溶解する前記ポリペプチドでの前記ClpXPプロテアーゼの活性レベルが、過酸化水素のレベルによって制御される、請求項39〜40のいずれか一項に記載の細胞。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物であって、前記株が前記所望の密度に達したときに、各株が異なるポリペプチドを放出する、前記回収物。
- 前記複数の株中の各株が異なる抗生物質に対して耐性である、請求項42に記載の回収物。
- 前記複数の菌株中の各株が、前記回収物中の他の株に作用するバクテリオシンを産生する、請求項42に記載の回収物。
- 前記複数の株の1つ以上の株が、前記回収物中の1つ以上の他の株の放出頻度とは異なる頻度でポリペプチドを放出する、請求項42に記載の回収物。
- 個体にポリペプチドを与える方法であって、請求項1〜41のいずれか一項に記載の細胞を、前記個体における前記細胞による前記ポリペプチドの放出を促進する条件下で、前記個体に投与することを含んでなる、前記方法。
- 個体の健康状態を治療する方法であって、請求項1〜41のいずれか一項に記載の細胞を前記個体に投与することを含んでなり、前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、前記方法。
- 前記ポリペプチドが、腫瘍の増殖を殺すか、または阻害するポリペプチドであり、前記腫瘍に前記細胞を送達する様式で前記細胞を投与する、請求項46〜47のいずれか一項
に記載の方法。 - 前記ポリペプチドがパルス様式で前記個体において放出される、請求項46〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体に第2の治療剤を投与することをさらに含んでなる、請求項46〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのと同時に、前記第2の治療剤を前記個体に投与する、請求項50に記載の方法。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのとは異なる時に、前記第2の治療剤を前記個体に投与する、請求項50に記載の方法。
- 前記第2の治療剤が、化学療法剤または生物学的治療剤である、請求項50に記載の方法。
- 前記第2の治療剤が5−フルオロウラシルを含んでなる、請求項53に記載の方法。
- 複数のポリペプチドを個体に与える方法であって、請求項42〜45のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物を、前記複数の株による前記異なるポリペプチドのそれぞれの放出を前記個体において促進する条件下で、前記個体に投与することを含んでなる前記方法。
- 前記異なるポリペプチドの1つ以上が、腫瘍の増殖を殺すかまたは阻害する治療用ポリペプチドであり、前記細胞の前記複数の株を含んでなる前記回収物を、前記細胞の前記複数の株を前記腫瘍に送達する様式で投与する、請求項55に記載の方法。
- 前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、請求項56に記載の方法。
- 前記治療用ポリペプチドが、T細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、請求項56に記載の方法。
- 前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、請求項56に記載の方法。
- 前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペプチド
である、請求項56に記載の方法。 - 前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、請求項60に記載の方法。
- 前記異なるポリペプチドの各々が、パルス様式で前記個体において放出される、請求項55〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の株中の第1の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、続いて前記複数の株中の第2の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、前記第2の株の投与の結果として、前記第1の株の増殖が防止または阻害される、請求項55〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の株が第1の抗生物質に耐性であり、第2の抗生物質に感受性であり、前記第2の株が前記第2の抗生物質に耐性であり、前記第1の抗生物質に感受性であり、前記第1の株の増殖が求められる場合には、前記第1の抗生物質を前記個体に投与し、前記第2の株の増殖が求められる場合には、前記第2の抗生物質を前記個体に投与する、請求項63に記載の方法。
- 前記第1の株が、第2の株の増殖を殺すか、または阻害する第1のバクテリオシンを産生し、前記第2の株が、前記第1の株の増殖を殺すか、または阻害するバクテリオシンを産生する、請求項63に記載の方法。
- 前記複数の株中の前記株のそれぞれを、前記個体に周期的に投与する、請求項55〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体における前記複数の株のうちの1つのみの増殖を、前記複数の株中の他の株の増殖が防止または阻害されている間に一時促進する、請求項55〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞から個体に放出されるポリペプチドを与えるための請求項1〜41のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- 個体の健康状態を治療する個体における健康状態を治療するための請求項1〜41のいずれか一項に記載の細胞の使用。
- 個体に複数のポリペプチドを与えるための請求項1〜41のいずれか一項に記載の細胞の複数の株を含んでなる回収物の使用。
- 前記ポリペプチドが治療用ポリペプチドである、請求項68〜70のいずれか一項に記載の使用。
- 前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞を殺すか、または腫瘍細胞の増殖を阻害するポリペプチドである、請求項71に記載の使用。
- 前記治療用ポリペプチドが、腫瘍細胞に対する免疫応答を誘発するポリペプチドである、請求項71に記載の使用。
- 前記治療用ポリペプチドが、T細胞または樹状細胞を動員するポリペプチドである、請求項71に記載の使用。
- 前記治療用ポリペプチドが、アポトーシスを引き起こすか、または促進するポリペプチドである、請求項71に記載の使用。
- 前記治療用ポリペプチドが、抗癌剤の放出および/または効能を増強するポリペプチド
である、請求項71に記載の使用。 - 前記抗癌剤がリポソーム抗癌剤である、請求項76に記載の使用。
- 前記ポリペプチドがパルス様式で前記個体において放出される、請求項68〜77のいずれか一項に記載の使用。
- 前記個体に第2の治療剤を投与することをさらに含んでなる、請求項68〜78のいず
れか一項に記載の使用。 - 請求項1〜41のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのと同時に、前記第2の治療剤を前記個体に投与する、請求項79に記載の使用。
- 請求項1〜41のいずれか一項に記載の前記細胞を前記個体に投与するのとは異なる時に、前記第2の治療剤を前記個体に投与する、請求項79に記載の使用。
- 前記第2の治療剤が、化学療法剤または生物学的治療剤である、請求項79に記載の使用。
- 前記第2の治療剤が5−フルオロウラシルを含んでなる、請求項81に記載の使用。
- 前記複数の株中の第1の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、続いて前記複数の株中の第2の株を前記個体に投与し、所望の期間増殖させ、前記第2の株の投与の結果として、前記第1の株の増殖が防止または阻害される、請求項70に記載の使用。
- 前記第1の株が第1の抗生物質に耐性であり、第2の抗生物質に感受性であり、前記第2の株が前記第2の抗生物質に耐性であり、前記第1の抗生物質に感受性であり、前記第1の株の増殖が求められる場合には、前記第1の抗生物質を前記個体に投与し、前記第2の株の増殖が求められる場合には、前記第2の抗生物質を前記個体に投与する、請求項84に記載の使用。
- 前記第1の株が、第2の株の増殖を殺すか、または阻害する第1のバクテリオシンを産生し、前記第2の株が、前記第1の株の増殖を殺すか、または阻害するバクテリオシンを産生する、請求項84に記載の使用。
- 前記複数の株中の前記株のそれぞれを、前記個体に周期的に投与する、請求項70〜86のいずれか一項に記載の使用。
- 前記個体における前記複数の株のうちの1つのみの増殖を、前記複数の株中の他の株の増殖が防止または阻害されている間に一時促進する、請求項70〜87のいずれか一項に記載の使用。
- 前記放出されるポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入することを含んでなる、請求項1〜41のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法。
- 前記細胞を溶解する前記ポリペプチドをコードする核酸を前記細胞に導入することを含んでなる、請求項14〜41のいずれか一項に記載の細胞を作製する方法。
- 前記核酸の導入を、細菌接合を介して実施する、請求項89〜90のいずれか一項に記載の方法。
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