JP2018515135A - 細胞−細胞通信の高解像度画像化のための方法および装置 - Google Patents
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Abstract
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも1つのマイクロピットと、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも1つのマイクロトラップと、を備え、前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記少なくとも1つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも1つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、垂直細胞ペアリング(VCP)システム。【選択図】図17
Description
係属中の先行特許出願
本願は、以下の継続中の特許出願における利益を出願するものである。
(i) 細胞−細胞通信の高解像度画像について、ザ・メソジスト・ホスピタル、及びチャン,ジュン・ヒー等によって2015年5月1日に提出された米国仮特許出願第62/155,762号(代理人整理番号:METHODIST-21 PORV)
(ii) 細胞−細胞通信の高解像度画像について、ザ・メソジスト・ホスピタル、及びチン,リードン等によって2015年10月19日に提出された米国仮特許出願第62/243,257号(代理人整理番号:METHODIST-21 R PORV)
上記に特定した2つの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、以下の継続中の特許出願における利益を出願するものである。
(i) 細胞−細胞通信の高解像度画像について、ザ・メソジスト・ホスピタル、及びチャン,ジュン・ヒー等によって2015年5月1日に提出された米国仮特許出願第62/155,762号(代理人整理番号:METHODIST-21 PORV)
(ii) 細胞−細胞通信の高解像度画像について、ザ・メソジスト・ホスピタル、及びチン,リードン等によって2015年10月19日に提出された米国仮特許出願第62/243,257号(代理人整理番号:METHODIST-21 R PORV)
上記に特定した2つの出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、概して細胞画像化に関し、より詳細には、細胞−細胞通信の高解像度画像化に関する。
細胞が相互に通信する能力は、真核生物における最も重要で基本的な活動の1つである。免疫システムの細胞は、様々な方策によって互いに通信する。これらの中で最も重要なものの1つは、免疫シナプス(IS)として知られる界面構造の形成である。原文から、免疫認識、癒着、活性、及び抑制のような重要な機能を成立させる細胞免疫応答において、ISが重要な役割を果たすことを示す膨大な証拠が蓄積されている。
癌および感染に対する免疫応答におけるISの重要な役割を考えると、実際の細胞−細胞接合においてISの形成、信号、及び機能の基礎となる分子メカニズムを理解することが不可欠である。固定され且つ生細胞の従来の共焦点顕微鏡法は、ISを研究するために利用可能な最も一般的な画像化技術である。伝統的に、免疫細胞は、標的細胞または抗原提示細胞(APC)と混合される。固定後、細胞−細胞接合は共焦点顕微鏡で画像化される。しかしながら、シナプスを画像化する現在の方法はいくつかの限界に直面している。このうち最も明白なことの1つは、側方の細胞−細胞接合(すなわち、2つの細胞が横並びに配置されている)におけるIS画像の低い解像度である。この状況では、細胞対は共焦点顕微鏡の焦点面に平行に伸び、シナプス界面はZ軸(図1A、左)に沿って焦点面に垂直に置かれる。その結果、シナプス界面全体をとらえるために、連続的なZ方向にスタックした画像を撮影する必要がある。しかしながら、従来の共焦点顕微鏡は、典型的にZ軸に沿った分解能が低いため、高分解能のシナプス画像(図1A)を得ることは困難である。これは、幾何学においてシナプスにおける分解能が、入射レーザビームの細長い点拡がり関数(PSF)(図1A、右)によって大幅に減少するためである。画像の解像度は、単に細胞対を回転させ、ISを水平の画像化平面上に配置することによって大幅に改善することができる(図1B)。最近では、IS画像化に理想的な焦点面を実現するために、研究者は光ピンセットを使用して手動で細胞を重ねて配置している。この技術は、シナプスを視覚化することができる解像度を効果的に高めることができた。しかしながら、光ピンセットで手動で細胞を別の細胞の上に置くことは、大きな労働力を要すると共に費用がかかってしまう。
さらに、光ピンセットの効果的な操作は、膨大な訓練を必要とする。加えて、光ピンセットを使用して細胞のスタックが成功した場合であっても、細胞画像化中に細胞(特に生細胞)の側方の運動が起こることがあり、シナプス界面の画像化を妨害する可能性がある。
近年、マイクロピットシステムが開発され、低コストでエフェクタ細胞と標的細胞との間の高分解能IS画像化が達成されている。しかし、マイクロピットシステム単独での細胞の充填効率は低く、約10−15%である。さらに、エフェクタ細胞と標的細胞との間の垂直方向のスタックの頻度も比較的低く、画像化の時間を消費してしまう。
したがって、細胞を垂直スタックするための新規なシステムの開発は、IS形成および細胞−細胞通信の研究を容易にする未だ十分に対処されていない要求を満たすであろう。
本発明は、従来の共焦点顕微鏡法を用いた、高い処理能力、且つ、ISの高解像度画像化を可能にする新しいシステムの提供および使用を含む。マイクロピットと単一細胞トラップを組み合わせたアレイにより、垂直方向に「スタックされた」細胞においてISを視覚化できる新しいマイクロ流体プラットフォームが開発された。この垂直細胞ペアリング(VCP)システムは、抑制性受容体、プログラムされた細胞死(PD−1)および単一細胞レベルでの細胞傷害性シナプスによって成立する抑制性シナプスの動態を調べるために使用されている。技術革新に加えて、ISにおけるF−アクチンおよび細胞溶解性の顆粒の新規分布、ヒトナチュラルキラー(NK)ISにおけるPD−1マイクロクラスタ、及び細胞傷害性の動態を含む、VCPシステムを使用して新規な生物学的所見が実証された。高処理能力で、費用効果が高く、使い易いVCPシステムは、従来の画像化技術と共に、さまざまな分野で多くの重要な生物学的問題に取り組むために使用され得る。
本発明の或る好ましい形態では、垂直細胞ペアリング(VCP)システムが提供される。かかる垂直細胞ペアリング(VCP)システムは、
上面を有する基板と、
前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも1つのマイクロピットと、
前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも1つのマイクロトラップと、を備え、
前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記少なくとも1つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも1つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している。
上面を有する基板と、
前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも1つのマイクロピットと、
前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも1つのマイクロトラップと、を備え、
前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記少なくとも1つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも1つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している。
本発明の別の形態では、細胞を垂直にペアリングする方法が提案される。かかる方法は、
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも1つのマイクロピットと、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも1つのマイクロトラップと、を備え、前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記少なくとも1つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも1つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、垂直細胞ペアリング(VCP)システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも1つのマイクロピット内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第2スラリーを流し、第2細胞を前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットの前記開口に配置させるステップと、を含む。
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも1つのマイクロピットと、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも1つのマイクロトラップと、を備え、前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記少なくとも1つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも1つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、垂直細胞ペアリング(VCP)システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも1つのマイクロピット内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第2スラリーを流し、第2細胞を前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットの前記開口に配置させるステップと、を含む。
本発明の別の形態では、垂直細胞ペアリング(VCP)システムが提供される。かかる垂直細胞ペアリング(VCP)システムは、
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している。
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している。
本発明の別の形態では、細胞を垂直にペアリングする方法が提案される。かかる方法は、
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している、垂直細胞ペアリング(VCP)システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第2スラリーを流し、第2細胞を前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に着座させるステップと、
を含む。
上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している、垂直細胞ペアリング(VCP)システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第2スラリーを流し、第2細胞を前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に着座させるステップと、
を含む。
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、添付の図面とともに考察される本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明によって、十分に開示され、または明白になるであろう。
本発明は、ISを水平方向に高分解能かつ高処理速度で研究するための新規なシステムの提供および使用を含む。
マイクロピットと単一細胞トラップを組み合わせたアレイである、新たな開発のマイクロ流体プラットフォームが、IS画像化における前述した困難性に応じた様々な技術的新規性を提供する。対になった細胞の垂直細胞配向は、ISを水平面内で画像化することを可能にし、固定細胞、及び生細胞画像化の両方について解像度を高める。この垂直細胞ペアリング(VCP)システムは、焦点面での横方向の細胞の漂流を最小限に抑えることができ、接合した細胞を垂直な位置にさせることができる。このシステムはまた、高充填効率で一度に3000以上の接合を捕捉することができる。このVCPシステムを用いて、ヒトナチュラルキラー(NK)細胞ISの構造で「対面式」な型が示される。
従来の細胞−細胞接合と比較して、ISにおけるF−アクチンの構成は、従来の共焦点顕微鏡法を用いた高解像度のVCPシステムではっきりと観察することができる。本発明のVCPシステムは、ISでの低F−アクチン密度の領域にわたってパーフォリン陽性溶解性の顆粒の位置を検出することができ、その詳細は超解像顕微鏡法で以前に報告されているが、従来の手法を用いて画像化することは困難であることが判明している。加えて、細胞溶解性の顆粒から分離された明るいF−アクチンの点紋が、NKシナプスの中心で観察された。これは通常、従来の共焦点顕微鏡法では見分けがつかない。さらに、NKシナプスにおけるPD−1マイクロクラスタの新規な動態、及び実際の細胞−細胞界面でNK細胞によって媒介される標的細胞溶解もVCPシステムで観察された。このように、VCPシステムは、従来の技術の多くの問題に好適に対処できるだけでなく、様々な他の生物学分野において幅広く取り扱うことができる、IS画像化に対する高処理能力、高効率、およびユーザフレンドリなアプローチを提供する。
新規な垂直細胞ペアリング(VCP)システム
まず、図13を参照すると、Biggsらによって開発されたマイクロピットシステムのような従来技術のマイクロピットシステム5が示されている。マイクロピットシステム5は、上部平坦面15を有する基板10と、その内部に形成されたマイクロピット20とによって特徴付けられる。マイクロピット20は、第1細胞タイプの細胞の第1スラリーが上部平坦面15上に流されたときに、その第1細胞タイプの細胞がマイクロピット20内に入ることができるように寸法決めされている。マイクロピット20は、その後に第2細胞タイプの細胞の第2スラリーが上部平坦面15の上に流されたときに、その第2細胞タイプの細胞もマイクロピット20内に入り、第2細胞タイプの細胞が第1細胞タイプの細胞の上に着座することができるように寸法決めされている。図13に示す従来技術のマイクロピットシステム5では、第1及び第2細胞スラリーが連続して通過することができるチャネルを形成するように、基板10の上に離間してカバー(図示せず)が配置されることが理解されよう。
まず、図13を参照すると、Biggsらによって開発されたマイクロピットシステムのような従来技術のマイクロピットシステム5が示されている。マイクロピットシステム5は、上部平坦面15を有する基板10と、その内部に形成されたマイクロピット20とによって特徴付けられる。マイクロピット20は、第1細胞タイプの細胞の第1スラリーが上部平坦面15上に流されたときに、その第1細胞タイプの細胞がマイクロピット20内に入ることができるように寸法決めされている。マイクロピット20は、その後に第2細胞タイプの細胞の第2スラリーが上部平坦面15の上に流されたときに、その第2細胞タイプの細胞もマイクロピット20内に入り、第2細胞タイプの細胞が第1細胞タイプの細胞の上に着座することができるように寸法決めされている。図13に示す従来技術のマイクロピットシステム5では、第1及び第2細胞スラリーが連続して通過することができるチャネルを形成するように、基板10の上に離間してカバー(図示せず)が配置されることが理解されよう。
先行技術のマイクロピットシステム5は、(i)(細胞がマイクロピット20に入るのを誘導することが困難であることによる)低い収率、および(ii)低い細胞収容性(両方の細胞がマイクロピット20に収容されても第2細胞タイプの細胞が第1細胞タイプの細胞と垂直配向から外れ得る)を含む多くの欠点に悩まされている。
図14及び図14Aは、本発明に沿って形成されたマイクロトラップシステム25を示す。マイクロトラップシステム25は、上部平坦面35を有する基板30と、上部平坦面35上に配置されたマイクロトラップ40とによって特徴付けられる。マイクロトラップ40は、垂直な溝50、及び垂直なスロット55によって特徴付けられる本体45を備える。垂直な溝50は、第1細胞タイプの細胞の第1スラリーが上部平坦面35の上に流されたときに、第1細胞タイプの細胞が垂直な溝50内に入ることができるように寸法決めされている。垂直な溝50は、その後に第2細胞タイプの細胞の第2スラリーが上部平坦面35の上に流されたときに、第2細胞タイプの細胞も垂直な溝50の中に入り、第2細胞タイプの細胞が第1細胞タイプの細胞の上に着座することができるように寸法決めされている。好ましい構造においては、第1及び第2細胞スラリーが連続して通過することができるチャネルを形成するように、基板30の上に離間してカバー(図示せず)が配置されることが理解されよう。
マイクロピットシステム25は、(i)(細胞が垂直な溝50に入るのを誘導することが困難であることによる)低い収率、および(ii)2つの異なるタイプの細胞の低いペアリング効率(つまり、大部分のマイクロトラップにおいて同じタイプの細胞が対となる)を含む多くの欠点に悩まされている。
本発明によれば、図15及び図15Aを参照して、垂直細胞ペアリング(VCP)システム100(VCP ver.1)が提供される。垂直細胞ペアリングシステム100は、上部平坦面110を有する基板105と、その内部に形成されたマイクロピット115とによって特徴付けられる。マイクロピット115は、後述するように、第1細胞タイプの細胞を受けることができるように寸法決めされている。垂直細胞ペアリングシステム100はさらに、上部平坦面110上に配置されたマイクロトラップ120(以下、「マイクロピラー」ともいう)を備える。マイクロトラップ120は、垂直なスロット130によって特徴付けられる本体125を備える。垂直スロット130は、細胞スラリーが上部平坦面110の上に流されたときに、細胞が垂直なスロット130の口に到達できるように寸法決めされている。マイクロトラップ120は、垂直スロット130がマイクロピット115と長手方向に整列するように、上部平坦面110上に配置される。
上記の理由から、第1細胞タイプの細胞の第1スラリーが上部平坦面110の上に流されたとき、第1細胞タイプの細胞はマイクロトラップ120の垂直なスロット130によってマイクロピット115の真上に捕捉される。その後、細胞ペアリングシステム100が(例えば、遠心分離機を用いて)遠心力を受けると、マイクロトラップ120によって捕獲された第1細胞タイプの細胞が、マイクロピット15に入り、マイクロピット115内に着座する。次いで、洗浄工程が実施され(例えば、上部平坦面110上にバッファー溶液を流し)、マイクロピット115に入っていない細胞を洗い流してもよい。次に、第2細胞タイプの細胞の第2スラリーが上部平坦面110の上に流され、第2細胞タイプの細胞がマイクロトラップ120によって捕捉される。つまり、第2細胞タイプの細胞が、マイクロピット115によって捕捉された第1細胞タイプの細胞の上に通じて配置される。必要に応じて、細胞ペアリングシステム100は、(マイクロトラップ120によって捕捉された)第2細胞タイプの細胞が、(マイクロピット115によって捕捉された)第1細胞タイプの細胞と安定して接触することが確実となるように、(例えば、遠心分離機を用いて)更に遠心力が加えられてもよい。本発明の好ましい形態では、第1および第2細胞スラリーを連続して通過することができるチャネルを形成するように、基板105の上に離間してカバー(図15では図示せず)が配置される。
重要なことに、マイクロトラップ120をマイクロピット115と対にすることによって、垂直細胞ペアリングシステム100は、(i)(第1細胞タイプの細胞をマイクロトラップ120によって捕捉し、マイクロピット115に充填することが容易であることと、第2細胞タイプの細胞が第1細胞タイプの細胞に隣接するマイクロトラップ120によって捕捉され易いこととによる)高い収率、および(ii)(マイクロトラップ120の垂直なスロット130がマイクロピット115と整列していることによる)第2細胞タイプの細胞の第1細胞タイプの細胞との確実な位置合わせと、を提供する。
図16、図16A、及び図17は、本発明に沿って形成された別の垂直細胞ペアリングシステム200(VCP ver.2)を示している。垂直細胞ペアリングシステム200は、(i)垂直細胞ペアリングシステム200のマイクロピット215が流れの方向に伸びており、(ii)マイクロトラップ220の本体225がマイクロピット215の一部に着座するように寸法決めされている舌部235を含むことを除いて、上述した垂直細胞ペアリングシステム100と実質的に同一である。これにより、マイクロトラップ220の垂直なスロット230が常にマイクロピット215の長手方向の中心線と整列することが保証される。マイクロトラップ220の本体225上に舌部235を形成することによって、完全な組立体を形成するために互いに「スナップ」する2つのスライド上に垂直細胞ペアリングシステム200を提供することが可能であることを理解されたい。つまり、スライドから離れて延びる舌部235(または複数の舌部235)を有する第1のスライドが、マイクロトラップ220の本体225(または複数のマイクロトラップ220の複数の本体225)を含み、第2のスライドが本体225の舌部235を収容するように配置された基板205及びマイクロピット215(または複数のマイクロピット215)を含む。このように、マイクロトラップ220の舌部235のマイクロピット215との整列は、垂直細胞ペアリングシステム200の組み立てを助けることができる。
図18及び図18Aは、本発明に沿って形成された別の垂直細胞ペアリングシステム300(VCP ver.3)を示す。垂直細胞ペアリングシステム300は、垂直なスロット330の口を画定するマイクロトラップ320の「上流」の表面340が、図16及び図17に示される形状からわずかに「後退」していることを除いて、上述の垂直細胞ペアリングシステム200と実質的に同一である。「後退」は、好ましくは約5度から約35度までの角度で、例えば図10に示す10度の角度である。この「後退」した構成は、マイクロトラップ320の垂直なスロット130と直接に整列した細胞のみがマイクロトラップ320の上流の表面に保持されることを保証にするので、非常に優れている。より詳細には、この「後退」された構成は、垂直なスロット330の口に1つのセルしか捕捉されず、捕捉されたセルがマイクロピット315と直接垂直に整列することを保証する。これにより、マイクロトラップ320の表面340の「後退」された構成は、垂直細胞ペアリングシステム300の充填効率を高めることができる。
材料および方法
1.マイクロ流体VCPシステムの製造
製造手順の概略フローを図9に要約する。酸素プラズマクリーニングされたシリコン(100)ウェハ(厚さ500μm、Silicon Quest International、米国)上にネガティブフォトレジスト(SU-83025、MicroChem、Newton、MA)をコーティングした。フォトレジストを2900rpmで30秒間回転させ、上型用に30μmの厚さをもたらし、4000rpmで60秒間回転させ、下型用に15μmの厚さをもたらした。フォトレジストを95℃で3分間ソフトベークし、フォトマスクを介してUV光に露光させた。フォトレジストを65℃で1分間、95℃で4分間ベークして現像した後、マイクロピットおよびトラップのアレイの型が得られた。型は、大気圧で30分間トリメチルクロロシラン(TMCS)によって被覆された。
1.マイクロ流体VCPシステムの製造
製造手順の概略フローを図9に要約する。酸素プラズマクリーニングされたシリコン(100)ウェハ(厚さ500μm、Silicon Quest International、米国)上にネガティブフォトレジスト(SU-83025、MicroChem、Newton、MA)をコーティングした。フォトレジストを2900rpmで30秒間回転させ、上型用に30μmの厚さをもたらし、4000rpmで60秒間回転させ、下型用に15μmの厚さをもたらした。フォトレジストを95℃で3分間ソフトベークし、フォトマスクを介してUV光に露光させた。フォトレジストを65℃で1分間、95℃で4分間ベークして現像した後、マイクロピットおよびトラップのアレイの型が得られた。型は、大気圧で30分間トリメチルクロロシラン(TMCS)によって被覆された。
ポリジメチルシロキサン(PDMS、Sylgard 184、Dow Corning Corp.)を硬化剤と10:1の比率で混合した。マイクロピットアレイ型(下型)をPDMSに浸漬し、加熱機械的プレス(CH4386、Carver press)によって40ニュートンでナンバー1.5のカバーガラス(厚さ170μm)にプレスした。PDMSを80℃で2時間硬化させ、型を取り除いて下層が得られた。PDMSをトラップアレイ型(上型)に注ぎ、77℃で1時間硬化させた。PDMSを型から持ち上げて上層が得られた。流入孔(直径4mm)及び負圧ポート(直径0.5mm)を上部PDMS層に打ち抜いた(Accu-Punch、Syneo)。少量のメタノールを潤滑に適用し、上層を下層にスナップして2層を組み立てた。
2.細胞培養
K562骨髄性白血病細胞株(American Type Culture Collection、ATCC)をRPMI培地(Gibco、米国)で培養した。KHYG−1ヒトNK細胞株(Dr. David T. Evans、Harvard Medical School提供)を、10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco、米国)、RPMI 1640培地(Gibco、USA)、10mMのHEPES(Gibco、米国)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Cellgro、米国)、2mMのL−グルタミン(Gibco、米国)、及び1%のMEM非必須アミノ酸溶液(Gibco、米国)が加えられたRPMI培地からなるRIO培地中で維持した。さらに、各移行のために、1pg/mlのシクロスポリンA(CsA、Sigma-Aldrich、米国)、50pg/mlのPrimocin、及び10U/mlのインターロイキン−2(IL−2)をR10培地に新たに加えた。使用の1日前に、CD16−KHYG−1細胞の培地をCsAを含まない培地と交換した。ヒト胎児腎臓293T(HEK293T)細胞を、10%のFBS、10mMのHEPES、及び2mMのL−グルタミンを含むDMEM(Gibco、米国)で培養した。
K562骨髄性白血病細胞株(American Type Culture Collection、ATCC)をRPMI培地(Gibco、米国)で培養した。KHYG−1ヒトNK細胞株(Dr. David T. Evans、Harvard Medical School提供)を、10%ウシ胎仔血清(FBS、Gibco、米国)、RPMI 1640培地(Gibco、USA)、10mMのHEPES(Gibco、米国)、1mMのピルビン酸ナトリウム(Cellgro、米国)、2mMのL−グルタミン(Gibco、米国)、及び1%のMEM非必須アミノ酸溶液(Gibco、米国)が加えられたRPMI培地からなるRIO培地中で維持した。さらに、各移行のために、1pg/mlのシクロスポリンA(CsA、Sigma-Aldrich、米国)、50pg/mlのPrimocin、及び10U/mlのインターロイキン−2(IL−2)をR10培地に新たに加えた。使用の1日前に、CD16−KHYG−1細胞の培地をCsAを含まない培地と交換した。ヒト胎児腎臓293T(HEK293T)細胞を、10%のFBS、10mMのHEPES、及び2mMのL−グルタミンを含むDMEM(Gibco、米国)で培養した。
3.CD16−KHYG−1、及びK562細胞株のプラスミドおよび導入
PD−1−GFP構成物を生成するために、プライマ5'-AATCCGGAATTCGCCGCCGCGATCGCCATGC-3 '(フォワード)及び5'-AATCGCGGATCCTTAAACTCTTTCTTCACC-3'(リバース)によってPD−1−GFP融合タンパク質配列(OriGene、MD)の全長を増幅した。EcoRI及びBamHI(Thermo Scientific)で消化されたPCR成果物を、EcoRI及びBamHIで消化されたレンチベクターpCDH(23)と結合した。同様に、C末端mCherry標的化PD−L1構成物を生成するために、プライマ5'-AATCCGGAATTCATGAGGATATTTGCTGTCT-3 '(フォワード)及び5'-AATCGCGGATCCCGTCTCCTCCAAATGTGTA-3'(リバース)によって、PD−L1 cDNA(OriGene、MD)の全長を増幅した。PCR成果物をEcoRI及びBamHIで消化し、mCherry−N1ベクター(Clontech)と結合し、C末端mCherry標的化PD−L1を生成した。次に、PD−L1−mCherry配列をプライマ5'-TAGAGCTAGCGAATTATGAGGATATTTGCTGTCTTTA-3 '(フォワード)および5'-ATTTAAATTCGAATTTCACGCCTTGTACAGCTCGTCC-3'(リバース)によって増幅した。このPCR生成物を、In−fusionクローニングシステム(Clontech)によって、EcoRI消化したpCDHレンチベクターに挿入した。すべてのプラスミドをシークエンス処理によって確認した。
PD−1−GFP構成物を生成するために、プライマ5'-AATCCGGAATTCGCCGCCGCGATCGCCATGC-3 '(フォワード)及び5'-AATCGCGGATCCTTAAACTCTTTCTTCACC-3'(リバース)によってPD−1−GFP融合タンパク質配列(OriGene、MD)の全長を増幅した。EcoRI及びBamHI(Thermo Scientific)で消化されたPCR成果物を、EcoRI及びBamHIで消化されたレンチベクターpCDH(23)と結合した。同様に、C末端mCherry標的化PD−L1構成物を生成するために、プライマ5'-AATCCGGAATTCATGAGGATATTTGCTGTCT-3 '(フォワード)及び5'-AATCGCGGATCCCGTCTCCTCCAAATGTGTA-3'(リバース)によって、PD−L1 cDNA(OriGene、MD)の全長を増幅した。PCR成果物をEcoRI及びBamHIで消化し、mCherry−N1ベクター(Clontech)と結合し、C末端mCherry標的化PD−L1を生成した。次に、PD−L1−mCherry配列をプライマ5'-TAGAGCTAGCGAATTATGAGGATATTTGCTGTCTTTA-3 '(フォワード)および5'-ATTTAAATTCGAATTTCACGCCTTGTACAGCTCGTCC-3'(リバース)によって増幅した。このPCR生成物を、In−fusionクローニングシステム(Clontech)によって、EcoRI消化したpCDHレンチベクターに挿入した。すべてのプラスミドをシークエンス処理によって確認した。
PD−1−GFP+ CD16−KHYG−1、及びPD−L1−mCherry+ K652細胞配列を生成するために、CD16−KHYG−1及びK562細胞配列の両方に、pCDH cDNAクローニング及び発現レンチウイルスシステムを導入した(SBI、System Biosciences)。レンチウイルスは、リポフェクタミン試薬(Invitrogen)によって、PD−1−GFP又はPD−L1−mCherryを含むレンチウイルスベクターおよび3つのパッケージングプラスミド(pMLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.g)をヒト胚性腎臓293T(HEK293T)細胞と共同移入することによって生成された。簡潔には、すべてで0.8pgのDNA(0.128pgのpCDH、0.32pgのpMLg・pRRE、0.16pgのpRSV−Rev、0.192pgのpMD2.g)が4μlのリポフェクタミンと混合され、6ウェルプレートで約90%の集密で培養した293T細胞の1つのウェルへ加えられた。48時間の移入後、ウイルス粒子を採取し、0.45μmフィルタ(GE)でろ過した。次に、4μlのR10培地に加えられた2×105個のCD−KHYG−1又はK562細胞を4μlのウイルス上清に感染させた。移入した細胞を8μg/mlのポリブレンの存在下で24時間培養し、続いてAria II細胞選別機(BD)で選別した。PD−1−GFP及びPD−L1−mCherryの発現を流動細胞分析(BD LSR Fortessa)によって確認した。
4.細胞充填
作製したVCPマイクロ流体システムを真空乾燥機に15分間置いた。チューブを介してポートに1mlシリンジを接続して負圧を生じさせ、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)における2%ウシ血清アルブミン(BSA)を注入口に導入した。VCPシステムを37℃で30分間培養した。次いで、R10培地を使用してVCPシステムのBSA溶液を置換した。106−107細胞/mlの濃度範囲を有する10μlの第1細胞懸濁液を注入口に加えた。15μl/分の流速を使用して、シリンジポンプを用いた細胞を播種した。30秒の播種後、残りの細胞懸濁液をPBSで3回洗浄した。マイクロ流体VCPシステムをシリンジから切り離し、2000rpm(700×g)で10分間遠心分離し(Sorvall Legend X1R、Thermo scientific)、マイクロピットアレイに細胞を遠心沈殿させた。遠心分離後、シリンジを再接続し、第2の細胞懸濁液を注入口に加えた。第2細胞懸濁液を播種するためのパラメータは、第1細胞懸濁液のためのパラメータと同一である。
作製したVCPマイクロ流体システムを真空乾燥機に15分間置いた。チューブを介してポートに1mlシリンジを接続して負圧を生じさせ、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)における2%ウシ血清アルブミン(BSA)を注入口に導入した。VCPシステムを37℃で30分間培養した。次いで、R10培地を使用してVCPシステムのBSA溶液を置換した。106−107細胞/mlの濃度範囲を有する10μlの第1細胞懸濁液を注入口に加えた。15μl/分の流速を使用して、シリンジポンプを用いた細胞を播種した。30秒の播種後、残りの細胞懸濁液をPBSで3回洗浄した。マイクロ流体VCPシステムをシリンジから切り離し、2000rpm(700×g)で10分間遠心分離し(Sorvall Legend X1R、Thermo scientific)、マイクロピットアレイに細胞を遠心沈殿させた。遠心分離後、シリンジを再接続し、第2の細胞懸濁液を注入口に加えた。第2細胞懸濁液を播種するためのパラメータは、第1細胞懸濁液のためのパラメータと同一である。
生細胞画像化のために、PD−L1mCherryを安定に発現するK562細胞を、まずVCPシステムに注入した。VCPシステムを倒立蛍光顕微鏡台に設置した。単一のセルに、63倍の油浸対物レンズで焦点を当てた。次いで、PD−1−GFPを発現するCD16−KHYG−1細胞を注入した。エフェクタ細胞を標的細胞の上に固定した後、入口の細胞懸濁液を25mMのHEPES緩衝液を含む新しい細胞培地と交換した。30秒ごとに10分間シナプス面で生細胞の画像化を行った。生細胞の画像化中、流速を0.5μl/分に維持した。固定細胞の画像化のために、CD16KHYG−1細胞を最初に注入した。VCPシステムを37度で1時間培養した。細胞−細胞接合体をPBS中の4%ホルムアルデヒド溶液で15分間固定し、次いでPBSで5分間洗浄した。PBS中に5%の正常ロバ血清(NSDS)及び0.5%のトリトンX−100を含む透過処理緩衝液をVCPシステムに添加した。VCPシステムを4℃で一晩培養した。透過処理緩衝液をPBSで5分間洗浄した。次に、PBS中の3%のNDS及び0.5%のトリトンX−100を含有する抗体緩衝液中のα−チューブリン(Abeam)に対する一次抗体をVCPシステム内に圧送した。VCPシステムを4℃で一晩培養した。抗体緩衝液をPBSで5分間洗浄した。細胞を蛍光標識した二次抗体(Life Technologies)で染色した。抗体緩衝液をPBSで5分間洗浄し、最後に、少量のProLong Gold(登録商標)退色防止試薬封入剤培地(Life Technologies)をVCPシステムに加えた。
5.共焦点顕微鏡
高解像度画像は、63倍油浸対物レンズ(NA 1.47、Leica Microsystem)を備えた共焦点蛍光顕微鏡(Leica TCS SP8、Leica Microsystem)で捕捉された。固定細胞画像では、チューブリン、パーフォリン、及びアクチンのZ方向スタックが連続して捕捉された。高解像度の生細胞画像は37℃で実施された。生細胞内での動きを説明するために、ISを中心とした4.5μmのZ方向スタックを取得した。PD−1−GFP、PD−L1−mCherry、及び明視野像からの蛍光が同時に検出された。画像は、LAS AFソフトウェア(Leica)によって取得され、ImageJ及びImaris(Bitplane)ソフトウェアで分析された。
高解像度画像は、63倍油浸対物レンズ(NA 1.47、Leica Microsystem)を備えた共焦点蛍光顕微鏡(Leica TCS SP8、Leica Microsystem)で捕捉された。固定細胞画像では、チューブリン、パーフォリン、及びアクチンのZ方向スタックが連続して捕捉された。高解像度の生細胞画像は37℃で実施された。生細胞内での動きを説明するために、ISを中心とした4.5μmのZ方向スタックを取得した。PD−1−GFP、PD−L1−mCherry、及び明視野像からの蛍光が同時に検出された。画像は、LAS AFソフトウェア(Leica)によって取得され、ImageJ及びImaris(Bitplane)ソフトウェアで分析された。
結果
1.垂直細胞ペアリングマイクロ流体システムの設計最適化
VCPシステム設計の開発および最適化プロセスを図8に要約する。単一層のマイクロピットとマイクロトラップの設計が以前にテストされており、最適な充填条件で異種細胞対の30%までが達成できた(図8)。マイクロピラー(マイクロトラップ)とマイクロピットを組み合わせることで、ペアリング効率は55%まで(VCP ver.1)に増加した。しかしながら、マイクロスケールで2つの層を整列させることは、時間がかかり、大きな労働力を要する。さらに、硬化プロセス中のPDMS収縮によって、全領域にわたって完全な整列を行うことはほとんど不可能である。したがって、VCPシステムはスナップイン構造(VCP ver.2)で設計された。上層のトラップ構造をワンクリック整列で下層の貫通孔とスナップすることにより2つの層を整列させ、下層のマイクロピットが上層のマイクロトラップと整列する(図9)。この方法は、特別な道具を必要とせずにすべての微細構造を正確に整列させることができる。また、この方法は、上記2つの層の設計において生じる、整列ずれの問題、及びPDMS収縮率の不一致を防止する。マイクロピットアレイの15μmの高さは、マイクロトラップアレイの30μmの高さによって覆われ、2つのPDMS層間に15μmの高い流路が形成される。マイクロピラー(マイクロトラップ)(VCP ver.3)にスイープ角を加えることによって、設計の更なる最適化が行われた。スイープ角は約5から約35度が好ましい。本発明の1つの好ましい形態では、スイープ角は約10度である。マイクロピラー(マイクロトラップ)の10度のスイープ角は、70%を超えた改善された充填効率を有する、より良い1対1の細胞対を提供する。VCP ver.3システムの詳細な寸法は図10に示される。
1.垂直細胞ペアリングマイクロ流体システムの設計最適化
VCPシステム設計の開発および最適化プロセスを図8に要約する。単一層のマイクロピットとマイクロトラップの設計が以前にテストされており、最適な充填条件で異種細胞対の30%までが達成できた(図8)。マイクロピラー(マイクロトラップ)とマイクロピットを組み合わせることで、ペアリング効率は55%まで(VCP ver.1)に増加した。しかしながら、マイクロスケールで2つの層を整列させることは、時間がかかり、大きな労働力を要する。さらに、硬化プロセス中のPDMS収縮によって、全領域にわたって完全な整列を行うことはほとんど不可能である。したがって、VCPシステムはスナップイン構造(VCP ver.2)で設計された。上層のトラップ構造をワンクリック整列で下層の貫通孔とスナップすることにより2つの層を整列させ、下層のマイクロピットが上層のマイクロトラップと整列する(図9)。この方法は、特別な道具を必要とせずにすべての微細構造を正確に整列させることができる。また、この方法は、上記2つの層の設計において生じる、整列ずれの問題、及びPDMS収縮率の不一致を防止する。マイクロピットアレイの15μmの高さは、マイクロトラップアレイの30μmの高さによって覆われ、2つのPDMS層間に15μmの高い流路が形成される。マイクロピラー(マイクロトラップ)(VCP ver.3)にスイープ角を加えることによって、設計の更なる最適化が行われた。スイープ角は約5から約35度が好ましい。本発明の1つの好ましい形態では、スイープ角は約10度である。マイクロピラー(マイクロトラップ)の10度のスイープ角は、70%を超えた改善された充填効率を有する、より良い1対1の細胞対を提供する。VCP ver.3システムの詳細な寸法は図10に示される。
製造方法は、上記した材料および方法のセクションでより詳細に記載されている。簡潔には、4000個の個々のマイクロピットを含むポリジメチルシロキサン(PDMS)プレポリマー被覆型の下層のモールドを、No. 1.5、厚さ170μmののカバーガラス上に直接打ち抜いた。マイクロトラップアレイを含む上層は、標準的なフォトリソグラフィ手順によって用意した。
マイクロ流体VCPシステムは、流速および方向を制御するために、流入量、負圧ポート、区域1、及び区域2を含む4つの領域を備える(図1C)。培地および細胞懸濁液が注入口から注入される。負圧ポートに接続された1mlシリンジによって流圧が生成される。区域1は、細胞クラスタを分解し、培地および懸濁された細胞の流れを区域2に均等に分配するためのマイクロチャンネルからなる。ゾーン2は、細胞を捕捉するマイクロトラップアレイを含んでいる。細胞充填機構を管理するための2つの経路が存在している(図1C)。水平経路(それぞれ経路1及び経路2と表示される)は、マイクロトラップ構造の周りを流れ、トラップ間の3μmの隙間を通過する。細胞懸濁液が入口を介して注入されると、細胞は、高い流速のために優先的に経路1をとる。複数の細胞が同じ経路をとっているときには流れが妨げられ、経路2をとることによって単一の細胞をトラップの間に固定することができる。トラップ間の3μmの隙間に細胞が割り込むと、トラップされた細胞による閉塞のため、トラップの周囲の流れ分布が変化する。したがって、後続の細胞は経路1をとり、微細構造に捕捉された単一細胞を残し、側方の細胞の動きを抑制する。詳細な流速分布を図2に示す。図2Bの低流速領域は、細胞をマイクロピラー(マイクロトラップ)の間にトラップした後に大きくなり、このことは、流れ抵抗を減少させるのに寄与する(図2C)。このため、後続の細胞は、優先的にマイクロピラー(マイクロトラップ)を迂回する。注目すべきは、以前の研究は、層流下の空洞が全体的な流れ特性に影響を与えない一方で、層流が空洞内に渦を導くことを示している。したがって、マイクロトラップ構造は流れ分布を示すために省略される。このシステムでは、細胞をマイクロピットに引き下げる重力(図1Cの赤い矢印)は無視できる程度である。マイクロピットは、初めに細胞懸濁培地で満たされる。培地のおよその密度は、製造業者によれば1.0g/mlであり、血球の密度は1.1g/mlである。このため、細胞をマイクロトラップに固定する水平流れは、細胞に作用する重力を容易に圧倒する。しかし、遠心分離によって人工的に重力を増加させることにより、細胞がマイクロピットに容易に降下させられる。この後、第2の細胞懸濁液を同じ機構によって第1の細胞の上に注入して固定した(図1C及びD)。
VCPシステムの充填効率を試験するために、図1に示すように、各ステップにおける捕捉細胞の割合を測定した。まず、CD16(CD16−KHYG−1;図1Dの緑色)を発現するNK細胞株KHYG−1を、92.8±1.1%の捕捉効率でVCPシステムに注入した。捕捉された細胞の割合は、遠心分離後に92.2±5.9%に維持された。標的K562(ヒトの不死化骨髄性白血病細胞)細胞(図1Dの赤色)の連続した注入は、81.3±2.7%の捕捉効率を達成した。最後に、KHYG−1及びK562細胞の両方を捕捉する微細構造の割合は、73.7±4.4%であった(図1E)。充填効率(流速および細胞充填密度など)に影響を及ぼす要因を独立して評価した。流速については、細胞へのせん断応力を最小にするために、細胞充填については15μl/分、生細胞画像化については00.5μl/分を使用した。充填効率は、細胞充填密度の関数として増加した(図9B及び9C)。実験を通して、50μlの培地に懸濁された約106個の細胞を使用し、60〜70%の効率で細胞対を画像化することができた。これらの結果は、垂直に「スタックした」標的細胞およびエフェクタ細胞を高処理能力、高効率の方法で同時捕捉することができるVCPシステムを好適に製造できることを実証する。
2.VCPシステムによる固定細胞上のISの高分解能画像化細胞内構造
このVCPシステムを好適に開発した後、ほとんどの研究機関で一般的な機器である従来の共焦点顕微鏡にて高解像度画像化が可能になるかどうかを決定するために、さらなるテストが行われた。CD16−KHYG−1細胞をエフェクタ細胞として使用し、K562細胞株を感受性標的細胞として使用した。CD16−KHYG−1エフェクタ細胞をVCPシステムに充填し、続いて標的細胞を充填した。固定後、細胞−細胞接合をF−アクチン、パーフォリン、およびチューブリンについて染色した。対照として、従来の顕微鏡スライドガラスを前述のように同時に調製した。各蛍光チャネルで3次元(3D)画像を取得した。3Dスタックの再構成後、2つのセル間の界面のZ方向投影が示された(図3)。
このVCPシステムを好適に開発した後、ほとんどの研究機関で一般的な機器である従来の共焦点顕微鏡にて高解像度画像化が可能になるかどうかを決定するために、さらなるテストが行われた。CD16−KHYG−1細胞をエフェクタ細胞として使用し、K562細胞株を感受性標的細胞として使用した。CD16−KHYG−1エフェクタ細胞をVCPシステムに充填し、続いて標的細胞を充填した。固定後、細胞−細胞接合をF−アクチン、パーフォリン、およびチューブリンについて染色した。対照として、従来の顕微鏡スライドガラスを前述のように同時に調製した。各蛍光チャネルで3次元(3D)画像を取得した。3Dスタックの再構成後、2つのセル間の界面のZ方向投影が示された(図3)。
VCPシステムによって得られた代表的な画像は、従来の方法によって得られた画像のものよりも、2つの点で著しい改善を示している。第1に、本システムは、ISの変形を防止する。従来の方法では、細胞は、原形質膜とポリリジン被膜されたカバースリップとの間の相互作用のために広がっている(図3A)。対照的に、VCPシステムは歪みのない自然な形でISを維持した(図3B)。第2に、VCPシステムは、従来の方法に比べて優れた空間分解能を提供する。従来のカバーガラス(図3C)およびVCPシステム(図3D)の両方によって取得された3D共焦点画像から得られた拡大領域を比較した。パーフォリン陽性細胞溶解顆粒の丸い形状は、VCPシステムによって測定された画像において容易に識別されたが、細胞溶解性顆粒は、従来の方法によって取得された画像において伸長しているように見えた。さらに、VCPシステム(図3D)によって得られた画像における細かいF−アクチンの網目状構造の詳細は、従来の手法によって取得された画像のものよりも優れていた。パーフォリン陽性細胞溶解性顆粒は、F−アクチンの低密度領域上に位置して観察され(図3E)、以前の観察と一致した。分解能の向上を定量化するために、細胞溶解性顆粒の蛍光線強度プロファイルの半値全幅(FWHM、顆粒サイズの指標)を測定した。VCPシステムで測定された細胞溶解性顆粒のFWHMは、従来のアプローチを用いて測定されたものよりも明らかに小さかった(図3E)。
IS中のパーフォリン陽性細胞溶解性顆粒からよく分離されていると思われるF−アクチンの点紋の独特の特徴をさらに定量化するために、共局在分析を行い、VCPシステムおよびVCPシステムを用いて得られた画像についてピアソンの相関係数(Pearson's r)を算出した(図3及び図11)。F−アクチンはISの中心に多数の天紋を形成し、パーフォリン陽性細胞溶解性顆粒はこれらのF−アクチンの天紋によってよく分離され(従来の方法を用いた側面視では認められなかった現象である)、これはF−アクチンがシナプスの中心で取り除かれているという以前の観察とは異なる。これらの観察をさらに定量化するために、3Dおよび2D共局在分析からのピアソンのrを、それぞれImaris(Bitplane)およびImageJソフトウェアによって計算した(図3G及びH)。NK細胞シナプスにおけるパーフォリンとF−アクチンとの間の顕著な負の相関関係が、従来型および現在のVCP画像法の両方を使用することによって観察されている。どちらの方法がより信頼性の高い分析法を提供するのかを定量的に決定するために、2D共局在分析からp値を抽出した(図31)。従来の方法は平均50%の信頼水準を示しているが、VCPシステムによって得られたp値の大部分は100%に近い信頼水準を示している。
3.VCPシステムによる生細胞上のPD−1マイクロクラスタの動態の高分解能画像化
ライブ画像化は、固定細胞の画像からは得られない抑制性ISの動態に関する前例のない情報を提供する。VCPシステムによって可能にされたISの高分解能画像化を好適に実証した後、VCPシステムをさらに試験して、VCPシステムがISの生細胞画像化を可能にするか否かを判断した。ここでは、抑制性シナプスの動態を研究するためのモードとして、リンパ球に発現する重要な抑制性受容体である、蛍光標識されたプログラム細胞死―1(PD−1)を使用した。VCPシステムがPD−1の動態をISで視覚化することができるかどうかを試験するために、PD−1配位子(PD−L1)−mCherry(図12)を発現する感受性K562標的細胞とともに、PD−1−GFPを発現するCD16−KHYG−1細胞を使用した。生細胞画像化は、PD−1及びPD−L1マイクロクラスタがNK ISにおいて3つの異なるパターンを形成することを明らかにした。3つの異なるパターンをさらに定量化するために、22個の生細胞対をそれぞれに画像化した(図4−6)。IS形成の初期段階を捕捉するために、まずPD−1−GFP+ CD−16KHYG−1細胞をVCPシステムに充填した。VCPシステムを顕微鏡に搭載した後、PD−L1−mCherry+ K562標的細胞をVCPシステムに加えた。22個の細胞対は、NK ISにおけるPD−1マイクロクラスタの動きに基づいて、3つの異なるパターンに分類された。接合の大部分(68.2%、22のうち15)は、PD−1/PD−L1クラスタが、早期段階(相互作用後5分未満)でISの中心で合体し、その後、後期段階でISの周りに分散することを示した(図4)。シナプスにおけるこの動的PD−1/PD−L1運動は、図4に示すように、「分散→集中→分散」(「D→C→D」と略記する)と呼ぶこともできる。すべての接合の大部分(68.2%)で観察されるパターンである、IS形成の初期段階(1−2分以内)にISの中心に移動するという、PD−1/PD−L1マイクロクラスタが合体したPD−1/PD−L1クラスタの動的移動のモデルが提案される(図4B)。その後、これら一時的に集中したクラスタは互いに解離し、シナプス全体にランダムな動きで分散する。
ライブ画像化は、固定細胞の画像からは得られない抑制性ISの動態に関する前例のない情報を提供する。VCPシステムによって可能にされたISの高分解能画像化を好適に実証した後、VCPシステムをさらに試験して、VCPシステムがISの生細胞画像化を可能にするか否かを判断した。ここでは、抑制性シナプスの動態を研究するためのモードとして、リンパ球に発現する重要な抑制性受容体である、蛍光標識されたプログラム細胞死―1(PD−1)を使用した。VCPシステムがPD−1の動態をISで視覚化することができるかどうかを試験するために、PD−1配位子(PD−L1)−mCherry(図12)を発現する感受性K562標的細胞とともに、PD−1−GFPを発現するCD16−KHYG−1細胞を使用した。生細胞画像化は、PD−1及びPD−L1マイクロクラスタがNK ISにおいて3つの異なるパターンを形成することを明らかにした。3つの異なるパターンをさらに定量化するために、22個の生細胞対をそれぞれに画像化した(図4−6)。IS形成の初期段階を捕捉するために、まずPD−1−GFP+ CD−16KHYG−1細胞をVCPシステムに充填した。VCPシステムを顕微鏡に搭載した後、PD−L1−mCherry+ K562標的細胞をVCPシステムに加えた。22個の細胞対は、NK ISにおけるPD−1マイクロクラスタの動きに基づいて、3つの異なるパターンに分類された。接合の大部分(68.2%、22のうち15)は、PD−1/PD−L1クラスタが、早期段階(相互作用後5分未満)でISの中心で合体し、その後、後期段階でISの周りに分散することを示した(図4)。シナプスにおけるこの動的PD−1/PD−L1運動は、図4に示すように、「分散→集中→分散」(「D→C→D」と略記する)と呼ぶこともできる。すべての接合の大部分(68.2%)で観察されるパターンである、IS形成の初期段階(1−2分以内)にISの中心に移動するという、PD−1/PD−L1マイクロクラスタが合体したPD−1/PD−L1クラスタの動的移動のモデルが提案される(図4B)。その後、これら一時的に集中したクラスタは互いに解離し、シナプス全体にランダムな動きで分散する。
PD−1/PD−L1が10分間の時間経過の画像収集中に集中クラスタを形成しない、シナプス内のPD−1/PD−L1マイクロクラスタ運動の第2パターンも観察された(図5)。これらのPD−1/PD−L1マイクロクラスタ(22.7%、22の接合のうち5)は、取得中に分散したままである(図5)。このパターンは、図5に示すように、「分散したまま」(「sD」と略記する)と呼ぶことができる。
「D→C→D」および「sD」パターンに加えて、少数のPD−1/PD−L1マイクロクラスタ(9.1%、22の接合のうち2)が、ISの周囲に形成されてシナプスの中心に合流し、そこで群れたままとなることも観察された(図6A)。このシナプスにおけるPD−1/PD−L1の動態の運動は、「分散→中央集中」(「D→ C」と略記する)と呼ぶことができる。以前の観察と一致して、PD−1マイクロクラスタは、SLBとヒト初代NK細胞との間に形成されるHLA−Eクラスタと類似していた。PD−1及びPD−L1マイクロクラスタの時間に対する運動を定量化するために、個々のマイクロクラスタの軌跡を経時的に追跡した。図6Bに示すように、9つのマイクロクラスタがシナプスの中心に急速に蓄積した。各軌道の平均速度を計算した(19±5nm/s、n=9)。VCPシステムで垂直に配向したNK及びK562細胞上の安定した抑制性シナプス形成を確認するために、0.5μl/分の一定な流速で画像化中に培地を連続的に流した。流れが除去されたら、画像化されているCD16−KHYG−1細胞(緑色、上部)を単一細胞トラップの上層から放出させたが、K562細胞の上部に残ったままであった(赤色、下部、図6C)。
これらの観察から、生細胞における抑制性シナプスマイクロクラスタの動態は、VCPシステムにおいて容易に観察され得ると結論付けられた。これは、高分解能を有する実際の細胞−細胞接合体におけるISでの単一のマイクロクラスタ動態の最初の観察であると考えられる。一方、IS中のPD−1/PD−L1マイクロクラスタの明確なパターンは、PD−1陽性NK細胞とPD−L1陽性標的細胞との間に形成される抑制性シナプスの顕著な特徴である。
4.VCPシステムによって検出された生NK細胞傷害活性の動態
次に、VCPシステムを試験して、細胞溶解殺傷が生細胞のVCPシステムによって観測できるかどうかを調べた。これを試験するために、K562細胞にカルセインAM緑色生存性色素を充填した。硬化細胞を標的細胞から区別するために、CD16−KHYG−1細胞をCellTracker redで標識した。細胞−細胞接合体を、広視野蛍光顕微鏡検査によって画像化した(図7)。カルセインAM緑色蛍光信号の消失を、標的細胞の事実上の死滅のための読み出しとして使用した。CD16−KHYG−1エフェクタ細胞と共培養したK562細胞では、緑色蛍光信号の明らかな減少が観察された(図7A)。細胞−細胞複合体において、赤色信号の比較的な安定、及び緑色信号の突然の減少が観察された。VCPシステムにおける細胞傷害性の動態を定量化するために、204個のエフェクタ細胞−標的細胞対を分析した。カルセインAM緑色で標識したK562細胞からの蛍光強度を10分ごとに測定した(図7B)。NK細胞によって誘発された細胞毒性の動態は、K562細胞の蛍光強度プロファイルによって分類された。ここで、カルセインAMの完全な消失を、細胞死のための読み取り値として使用した。NK細胞との6時間の接合後、約45.6%のK562細胞(204の接合体のうち93)が蛍光を発したままであり、これらのK562細胞が生きたままであることが示唆された(図7C)。この蛍光プロファイルは、「低速減衰」と呼ぶことができる。K562細胞の平均蛍光減衰プロファイルは、非接合化K562細胞のものと同様であった(図7Bの緑色の線)。
次に、VCPシステムを試験して、細胞溶解殺傷が生細胞のVCPシステムによって観測できるかどうかを調べた。これを試験するために、K562細胞にカルセインAM緑色生存性色素を充填した。硬化細胞を標的細胞から区別するために、CD16−KHYG−1細胞をCellTracker redで標識した。細胞−細胞接合体を、広視野蛍光顕微鏡検査によって画像化した(図7)。カルセインAM緑色蛍光信号の消失を、標的細胞の事実上の死滅のための読み出しとして使用した。CD16−KHYG−1エフェクタ細胞と共培養したK562細胞では、緑色蛍光信号の明らかな減少が観察された(図7A)。細胞−細胞複合体において、赤色信号の比較的な安定、及び緑色信号の突然の減少が観察された。VCPシステムにおける細胞傷害性の動態を定量化するために、204個のエフェクタ細胞−標的細胞対を分析した。カルセインAM緑色で標識したK562細胞からの蛍光強度を10分ごとに測定した(図7B)。NK細胞によって誘発された細胞毒性の動態は、K562細胞の蛍光強度プロファイルによって分類された。ここで、カルセインAMの完全な消失を、細胞死のための読み取り値として使用した。NK細胞との6時間の接合後、約45.6%のK562細胞(204の接合体のうち93)が蛍光を発したままであり、これらのK562細胞が生きたままであることが示唆された(図7C)。この蛍光プロファイルは、「低速減衰」と呼ぶことができる。K562細胞の平均蛍光減衰プロファイルは、非接合化K562細胞のものと同様であった(図7Bの緑色の線)。
カルセインAM緑からの「低速減衰」蛍光プロファイルに加えて、K562細胞におけるカルセインAM緑の消失の3つの異なる動態も観察された。カルセインAMの第2パターン(33.8%、204の接合のうち69)は、NK細胞によるK562細胞の溶解を示す「単純減少」プロファイルを示した(図7D)。以前の観察と一致して、NK媒介細胞毒性の平均時間は、注射後約222.2分(SD=84.3分)であった(図7D)。
カルセインAMの第3の蛍光プロファイル(11.3%、204の接合体のうち23)を「急速減衰」と呼ぶ(図7E)。「急速減衰」動態では、カルセインAM緑のレベルは最終的に接合後6時間以内に検出されなくなり、NK細胞によって誘発される異なる細胞毒性機構を示唆している。
特に、カルセインAM蛍光(9.3%、204の接合体のうち19)における経時的な複数の段階的減少(「多段減少」プロフィール)も観察され、これは、NK細胞からの複数の細胞溶解性ヒットを有するモデル機構が示唆される。この分集団における平均細胞死亡時間は、293.2分(SD=49.1分)であると判定された。
総じて、これらのデータは、経時的な細胞傷害性の動態が、高処理能力、及び単一細胞レベルの精製において、VCPシステムによって容易に検出できる。これは、特定の期間後の培養物全体にわたる殺傷活性のブランケット測定値を提供するだけであり、個々の細胞溶解性および非細胞溶解性の細胞対形成を区別することができない従来の4時間51Cr放出アッセイによっては不可能であった。
総じて、これらのデータは、経時的な細胞傷害性の動態が、高処理能力、及び単一細胞レベルの精製において、VCPシステムによって容易に検出できる。これは、特定の期間後の培養物全体にわたる殺傷活性のブランケット測定値を提供するだけであり、個々の細胞溶解性および非細胞溶解性の細胞対形成を区別することができない従来の4時間51Cr放出アッセイによっては不可能であった。
討論
免疫学的シナプスは、適応免疫システムおよび自然免疫システムの両方において有効な免疫応答を媒介するための重要なプラットフォームである。シナプス幾何学に関する現在の研究は、抗体被覆されたカバーガラス、又はガラス支持された平面脂質二重層システムのような人工システムに限定されている。本発明は、実際の細胞−細胞通信設定においてISを研究するための新規な高処理能力のVCPマイクロ流体システムを提供する。このシステムを製造するための詳細な実施要綱は、本明細書で示されています。このシステムを使用して、エフェクタ細胞と標的細胞との間に形成されるISの高解像度画像が従来の共焦点顕微鏡法で達成された。また、このシステムの潜在的な適用は、ISにおけるPD−1/PD−L1マイクロクラスタ形成の動態を調べることによって実証されており、垂直方向の実際の細胞−細胞接合体におけるISでのマイクロクラスタの初めての観察を、単一細胞レベルでの死滅動態と共に提供した。本発明は、ユーザフレンドリなVCPシステムを提供し、様々な分野における細胞−細胞通信を研究するための新規技術の実現可能性および適用を実証する。さらに、このVCPシステムを使用することにより、いくつかの重大な生物学的問題についての洞察を提供することができる。
免疫学的シナプスは、適応免疫システムおよび自然免疫システムの両方において有効な免疫応答を媒介するための重要なプラットフォームである。シナプス幾何学に関する現在の研究は、抗体被覆されたカバーガラス、又はガラス支持された平面脂質二重層システムのような人工システムに限定されている。本発明は、実際の細胞−細胞通信設定においてISを研究するための新規な高処理能力のVCPマイクロ流体システムを提供する。このシステムを製造するための詳細な実施要綱は、本明細書で示されています。このシステムを使用して、エフェクタ細胞と標的細胞との間に形成されるISの高解像度画像が従来の共焦点顕微鏡法で達成された。また、このシステムの潜在的な適用は、ISにおけるPD−1/PD−L1マイクロクラスタ形成の動態を調べることによって実証されており、垂直方向の実際の細胞−細胞接合体におけるISでのマイクロクラスタの初めての観察を、単一細胞レベルでの死滅動態と共に提供した。本発明は、ユーザフレンドリなVCPシステムを提供し、様々な分野における細胞−細胞通信を研究するための新規技術の実現可能性および適用を実証する。さらに、このVCPシステムを使用することにより、いくつかの重大な生物学的問題についての洞察を提供することができる。
Biggsらによって開発されたマイクロピットシステムと比較して、VCPシステムは2つの顕著な利点を有する。好適な垂直接合体の割合は、マイクロピットシステムと、細胞をピットに効率的に導く単一細胞トラップアレイとの新規な組み合わせにより、VCPシステムで著しく高かった。第2に、VCPシステムは、充填効率(すなわち、単一のピットに入る2つの細胞対の成功率)と垂直配向との間に避けがたいトレードオフがあった従来のマイクロピットシステムの大きな困難の1つに対処する。マイクロピットシステムでは、ピットの直径が大きくなるほど充填効率が向上するが、マイクロピットにおける細胞の周囲面積が大きいため、しばしば上方の細胞が下方の細胞の上部に完全に位置合わせされない。逆に、狭いピット直径は充填効率を著しく低下させる。単一細胞トラップアレイによって細胞を狭いマイクロピットに誘導することにより、VCPシステムは充填効率を損なうことなく垂直配向を維持することができる。
革新的な設計の結果として、VCPシステムは多くの重大な問題に取り組んだ。細胞傷害性免疫学的シナプスにおけるF−アクチンの構成は、依然として非常に議論の余地がある。T細胞ISにおいて、F−アクチンはシナプスの中心から完全に除去され、ISの中心で脱顆粒事象を引き起こすことが示されている。しかし、この現象はNK細胞シナプスでは異なる。 高解像の誘導放出制御(STED)と構造化照明顕微鏡(SIM)を用いて、2つの独立した研究グループが、F−アクチンがISの中心で完全に除去されていないことを示した。代わりに、中断された低密度のF−アクチン網目構造がNK細胞シナプスの中心に観察されており、パーフォリン陽性細胞溶解性顆粒がF−アクチンの天紋によってよく分離されている。これらの観察結果と一致して、パーフォリン陽性細胞溶解性顆粒は、従来の共焦点顕微鏡法では通常見分けられない極めて細部であるVCPシステムの低密度F−アクチン領域に位置していることが見られる。VCPシステムを使用して、初めて、超解像度画像化技術を必要とせずに、NK細胞と標的細胞との間に形成されるISの中心の低密度F−アクチン領域の間にパーフォリン陽性細胞溶解性顆粒が位置することがきれいに観察された。したがって、VCPシステムで得られた結果は、ヒトNK細胞においてF−アクチン「低密度」がISの中心に存在し、細胞溶解性顆粒がそこで収束するという現象を証拠立てる。
固定された細胞の画像化から得られた情報に加えて、VCPシステムによるライブ画像化は、固定されたNK細胞の以前の研究から得られない抑制性免疫学的シナプスの動態に関する更なる重要な情報を提供する。プログラムされた細胞死タンパク質1(PD−1)は、慢性ウイルス感染および腫瘍形成時にT細胞、B細胞、及びNK細胞において明らかに増加して出現する免疫チェックポイントタンパク質である。KIRおよびCD94/NKG2Aなどの他の抑制性受容体と同様に、PD−1の細胞内ドメインは、NK細胞抑制に重要な役割を果たす免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含む。PD−1とPD−L1との結合は、CD16−KHYGI細胞によるK562標的細胞の細胞傷害性殺傷を抑制し、抑制性シナプスの発生を示す。しかし、NK細胞が安定な抑制性シナプスを形成できるか否かはまだ議論の余地がある。以前の研究は、NK細胞が抑制性受容体の存在下で安定したシナプスを形成しないことを示した。VCPプラットフォームを用いて、ISにおけるPD−1及びPD−L1のマイクロクラスタが、シナプスにおいて中心クラスタに接合することが観察された。このパターンは、ヒト初代NK細胞が、抑制性受容体CD94/NKG2Aの配位子であるHLA−Eを保有する脂質二重層上で安定な抑制性シナプスを形成することを示す以前の研究を連想させる。さらに、この新規なVCPシステムによって得られた結果は、NK ISにおける3つの異なるPD−1/PD−L1マイクロクラスタパターンを示し、高価な超解像画像化システムを必要とすることなく、高分解能で実際の細胞−細胞複合体におけるPD−1マイクロクラスタの動態を初めて説明した。
ISの安定性を支配する力の理解は、その機能を特定するために不可欠である。ISの最も重要な機能の1つは、標的細胞に対して依存性細胞傷害をもたらすことである。明らかな放射線安全合意を伴うCr放出アッセイのようなNK細胞の細胞傷害を観察する典型的な方法は、高価であると共に時間がかかる。本明細書で説明したVCPプラットフォームは、NK細胞の細胞傷害をリアルタイムで観察するための、迅速で定量的で高処理能力で機能的な測定を可能にする。単一のピット内の標的細胞における色素の消失は、単一細胞レベルでの細胞死についての明確な読み取りを提供し、他のエフェクタ細胞−標的細胞対の存在によって遮られず、オープンウェル型システムにおいて大きな成果となり得る。したがって、ISの研究の強化のためのプラットフォームを提供することに加えて、VCPシステムは、IS媒介性細胞傷害を研究するための代替方法を提供する。
このように、固定され且つ生細胞の画像化のための細胞−細胞通信を研究するための新規で高処理能力のVCPシステムが開発されていることが分かる。このVCPシステムの実現可能性と潜在的な適用が首尾よく実証された。この高処理能力でユーザフレンドリなVCPシステムは、単一細胞分析、細胞融合、細胞−細胞通信、及び細胞表面配位子可動性などの免疫学および細胞生物学において多くの重大な問題に取り組むために使用できる強力な新しい画像化プラットフォームを提供する。
好ましい実施形態の変形
本発明の性質を説明するために本明細書に記載され説明された細部、材料、ステップ、及び部品の配置の多くの追加的な変更が当業者にとってなされ得るが、それらは本発明の原理および範囲に含まれるものである。
本発明の性質を説明するために本明細書に記載され説明された細部、材料、ステップ、及び部品の配置の多くの追加的な変更が当業者にとってなされ得るが、それらは本発明の原理および範囲に含まれるものである。
Claims (33)
- 上面を有する基板と、
前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも1つのマイクロピットと、
前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも1つのマイクロトラップと、を備え、
前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記少なくとも1つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも1つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、
垂直細胞ペアリング(VCP)システム。 - 前記垂直なスロットの前記開口は、前記少なくとも1つのマイクロピットの一端部に実質的に整列している、請求項1に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- カバー、及び一対の側壁を更に備え、前記カバーと前記一対の側壁とがそれらの間に流体通路を画定する、請求項1に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記基板に固定されている、請求項3に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記カバーに固定されている、請求項3に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 前記垂直なスロットの前記開口は、前記少なくとも1つのマイクロピットの一部の上に重なっている、請求項1に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記本体は、前記少なくとも1つのマイクロピット内に着座するように寸法決めされた舌部を備える、請求項6に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットが、前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記舌部内に延在する、請求項7に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- カバー、及び一対の側壁を更に備え、前記基板と前記カバーと前記一対の側壁とがそれらの間に流体通路を画定する、請求項6に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップが前記基板に固定されている、請求項9に記載の垂直セルペアリング(VCP)システム。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップが前記カバーに固定されている、請求項9に記載の垂直セルペアリング(VCP)システム。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記本体は、前記垂直なスロットの前記開口に隣接して配置された1対の表面を備え、前記1対の表面が、前記垂直なスロットの前記開口に対して後方に延びている、請求項6に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 前記1対の表面は、前記垂直なスロットの前記開口に対して約5度以上約35度以下の角度で後方に延びている、請求項12に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 前記1対の表面は、約10度の角度で後方に延びている、請求項13に記載の垂直細胞ペアリング(VCP)システム。
- 上面を有する基板と、前記基板の前記上面に形成された少なくとも1つのマイクロピットであって、細胞を着座させるように寸法決めされた少なくとも1つのマイクロピットと、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直なスロットを有する本体を備え、前記垂直なスロットが開口および出口を有し、前記垂直なスロットが、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされている、少なくとも1つのマイクロトラップと、を備え、前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記少なくとも1つのマイクロピットに対して配置され、前記少なくとも1つのマイクロピットに着座した細胞が、前記垂直なスロットの前記開口に配置された細胞と細胞−細胞通信している、垂直細胞ペアリング(VCP)システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも1つのマイクロピット内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第2スラリーを流し、第2細胞を前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットの前記開口に配置させるステップと、
を含む、細胞を垂直にペアリングする方法。 - 前記第1細胞が前記少なくとも1つのマイクロピットに整列または着座するように細胞の前記第1スラリーを流し、その後に、前記第1細胞が前記少なくとも1つのマイクロピットに着座することが確実になるように前記垂直細胞ペアリング(VCP)システムを遠心分離することによって、前記少なくとも1つのマイクロピット内に前記第1細胞が着座する、請求項15に記載の方法。
- 前記第2細胞が前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットの前記開口に配置された後に、前記第2細胞が前記第1細胞と細胞−細胞通信することが確実になるように前記垂直細胞ペアリング(VCP)システムを遠心分離する、請求項15に記載の方法。
- 前記第1細胞と前記第2細胞とが異なる細胞タイプである、請求項15に記載の方法。
- 前記垂直なスロットの前記開口は、前記少なくとも1つのマイクロピットの一端部と実質的に整列している、請求項15に記載の方法。
- 前記垂直細胞ペアリング(VCP)システムは、カバー、及び一対の側壁を更に備え、前記カバーと前記一対の側壁とがそれらの間に流体通路を画定する、請求項15に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記基板に固定されている、請求項20に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップは、前記カバーに固定されている、請求項20に記載の方法。
- 前記垂直なスロットの前記開口は、前記少なくとも1つのマイクロピットの一部の上に重なっている、請求項15に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記本体は、前記少なくとも1つのマイクロピット内に着座するように寸法決めされた舌部を備える、請求項23に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直なスロットが、前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記舌部内に延在する、請求項24に記載の方法。
- カバー、及び一対の側壁を更に備え、前記基板と前記カバーと前記一対の側壁とがそれらの間に流体通路を画定する、請求項23に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップが前記基板に固定されている、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップが前記カバーに固定されている、請求項26に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記本体は、前記垂直なスロットの前記開口に隣接して配置された1対の表面を備え、前記1対の表面が、前記垂直なスロットの前記開口に対して後方に延びている、請求項23に記載の方法。
- 前記1対の表面は、前記垂直なスロットの前記開口に対して約5度以上約35度以下の角度で後方に延びている、請求項29に記載の方法。
- 前記1対の表面は、約10度の角度で後方に延びている、請求項30に記載の方法。
- 上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している、
垂直細胞ペアリング(VCP)システム。 - 上面を有する基板と、前記基板の前記上面に隣接して配置された少なくとも1つのマイクロトラップであって、垂直な溝と垂直なスロットとを有する本体を備え、前記垂直な溝は開口と出口とを有し、前記垂直な溝は、一対の細胞が垂直に整列しているときに前記一対の細胞が着座するように寸法決めされており、前記垂直なスロットは開口と出口とを有し、前記垂直なスロットは、流体を通過させるが細胞が通過するのを防ぐように寸法決めされており、前記垂直な溝の前記出口が前記垂直なスロットの前記開口と流体連通している、垂直細胞ペアリング(VCP)システムを用意するステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第1スラリーを流し、前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に第1セルを着座させるステップと、
前記基板の前記上面上に細胞の第2スラリーを流し、第2細胞を前記少なくとも1つのマイクロトラップの前記垂直な溝内に着座させるステップと、
を含む、細胞を垂直にペアリングする方法。
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