JP2018510841A - 筋萎縮性側索硬化症を有する対象における糖尿病を治療する方法および／または糖尿病の発症を制限する方法 - Google Patents

筋萎縮性側索硬化症を有する対象における糖尿病を治療する方法および／または糖尿病の発症を制限する方法 Download PDF

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Abstract

糖尿病を発症する危険性のあるＡＬＳ患者を特定する方法のように、対象の血液からＩｇＧを除去すること、該対象においてＩｇＧが電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）を活性化するのをブロックすること、または該対象においてＶＧＣＣをブロックすることのうちの１以上によって、対象の細胞におけるＶＧＣＣのＩｇＧ媒介性活性化を阻害することによって、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象における糖尿病を治療する方法および／または糖尿病の発症を制限する方法について説明する。【選択図】なし

Description

相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年２月９日出願の米国仮特許出願第６２／１１３６６９号の優先権を主張するものである。
序論
代謝エネルギー恒常性の欠陥、すなわち、グルコース不耐性およびインスリン抵抗性が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者およびトランスジェニックマウスモデルの両方で観察されている。ＡＬＳ患者の約３分の２が、糖尿病のような代謝性障害を発症する。したがって、ＡＬＳ患者における糖尿病を治療する方法および糖尿病の発症を制限する方法が必要とされている。
一態様において、本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象における糖尿病を治療する方法および／または糖尿病の発症を制限する方法であって、対象の細胞における電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）のＩｇＧ媒介性活性化を阻害することを含み、該阻害が、
（ｉ）対象の血液からＩｇＧを除去すること；
（ｉｉ）該対象においてＩｇＧがＶＧＣＣを活性化するのをブロックすること；および、
（ｉｉｉ）該対象においてＶＧＣＣをブロックすること
のうちの１以上を含む方法を提供する。
一実施形態において、該阻害は、対象の糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに十分な時間、対象から血清ＩｇＧを除去することを含み、該除去は、吸着剤上へのＩｇＧの吸着を促進するのに適する時間および条件下で、該対象から得られた血液をＩｇＧ吸着剤と接触させることを含む。さらなる実施形態において、ＩｇＧ吸着剤は、抗ヒトＩｇＧ抗体を含むが、これに限定されない。別の実施形態において、該阻害は、ＩｇＧがＶＧＣＣを活性化するのをブロックすることを含み、該ブロッキングは、該対象の糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに有効な量の、ＩｇＧ発現もしくは活性の阻害剤を該対象に投与することを含み、該阻害剤は、抗ＩｇＧ抗体、ＩｇＧブロッキングアプタマー、ＩｇＧ低分子干渉ＲＮＡ、ＩｇＧ低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、ＩｇＧショートヘアピンＲＮＡ、ＩｇＧマイクロＲＮＡ、およびＩｇＧアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されない。さらに別の実施形態において、該阻害は、該対象においてＶＧＣＣをブロックすることを含み、該ブロッキングは、該対象の糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに有効な量の、ＶＧＣＣ発現もしくは活性の阻害剤を該対象に投与することを含み、該阻害剤は、Ｃａ２＋チャネルブロッカー、ＶＧＣＣ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得るが、これらに限定されない。例えば、該阻害剤は、フェニルアルキルアミン類、ベンゾチアゼピン類、およびジヒドロピリジン類を含むが、これらに限定されないＶＧＣＣの阻害剤であり得る。他の実施形態において、ＶＧＣＣの阻害剤は、ニソルジピン（Ｓｕｌａｒ）、ニフェジピン（Ａｄａｌａｔ、Ｐｒｏｃａｒｄｉａ）、ニカルジピン（Ｃａｒｄｅｎｅ）、イスラジピン（Ｄｙｎａｃｉｒｃ）、ニモジピン（Ｎｉｍｏｔｏｐ）、フェロジピン（Ｐｌｅｎｄｉｌ）、アムロジピン（Ｎｏｒｖａｓｃ）、ジルチアゼム（Ｃａｒｄｉｚｅｍ）、ラシジピン、レルカニジピン、およびベラパミル（Ｃａｌａｎ、Ｉｓｏｐｔｉｎ）を含み得るが、これらに限定されない。一実施形態において、本方法は、２型糖尿病を治療するか、または２型糖尿病の発症を制限する。別の実施形態において、本方法は、１型糖尿病の発症を制限する。
別の態様において、本発明は、糖尿病を発症する危険性のあるＡＬＳ患者を特定する方法であって、
ａ）ＡＬＳを有する対象からの血液試料を細胞と接触させること；
ｂ）［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を測定し、測定された周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を対照と比較すること；ならびに
ｃ）対照と比較して［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流が変化している対象を、糖尿病を発症する危険性があるとして特定すること、
を含む方法を提供する。
別の態様において、本発明は、糖尿病を発症する危険性のあるＡＬＳ患者を特定する方法であって、
ａ）ＡＬＳを有する対象から得られた血液試料中のＩｇＧレベルを決定すること；
ｂ）該血液試料中のＩｇＧレベルを対照と比較すること；および
ｃ）該血液試料中のＩｇＧレベルが上昇した対象を、糖尿病を発症する危険性があるとして特定すること、
を含む方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ＡＬＳを有する対象における糖尿病を治療する候補化合物および／または糖尿病の発症を制限する候補化合物を特定する方法であって、
ａ）ＡＬＳおよび糖尿病を有する対象の血液試料を第１の細胞集団および第２の細胞集団と接触させ、さらに、第２の膵臓細胞集団を１以上の試験化合物と接触させること；
ｂ）第１の集団および第２の集団中の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンならびに／または全細胞のＣａ２＋電流を測定すること；ならびに
ｃ）第１の集団に対して第２の集団中の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流の変化を減少させる化合物を、ＡＬＳを有する対象における糖尿病を治療する候補化合物および／または糖尿病の発症を制限する候補化合物として特定すること、
を含む方法を提供する。
これらの態様のいずれかの一実施形態において、細胞、または第１の細胞集団および第２の細胞集団は、膵島細胞、筋細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、および／または神経細胞を含む。さらなる実施形態において、細胞、または第１の細胞集団および第２の細胞集団は、膵臓細胞を含み、該膵臓細胞は、膵島、膵臓β細胞、および／または膵臓α細胞を含む。別の実施形態において、該接触は、刺激性グルコース濃度、刺激性カリウム濃度の存在下で行われ、かつ／または脱分極電圧が、第１の細胞集団および第２の細胞集団に印加される。さらなる実施形態において、該血液試料は、全血、血清、または血漿であり得る。
ＡＬＳ−Ｔｇマウスにおけるグルコース恒常性の阻害および膵島細胞機能のＡＬＳ血清誘導性劣化。（Ａ）７〜８週齢のＡＬＳ−Ｔｇ（ＴＧ）および野生型（ＷＴ）マウスにおける腹腔内グルコース耐性試験。（Ｂ）野生型およびＡＬＳ−Ｔｇマウスから単離し、３.３および１１.１ｍＭのグルコース（Ｇｌｕ）に曝露した膵島からのインスリン分泌。（Ｃ）ＷＴおよびＡＬＳ−Ｔｇマウスからの膵島におけるグルコース誘導性［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターン。合計９５匹の野生型群（上）および合計９８匹のＡＬＳ−Ｔｇ群（下）からの代表的な［Ｃａ２＋］ｉトレース。（Ｄ）ＷＴおよびＡＬＳ−Ｔｇ膵島中のＫ＋脱分極誘導性［Ｃａ２＋］ｉ純増加を示すデルタｆｕｒａ−２ ３４０／３８０比。（Ｅ）正常ウシ胎児血清（ＦＢＳ、上）、糖尿病であるがＡＬＳではない患者からの対照血清（ＣＴＬ、中央）およびヒトＡＬＳ血清（ＡＬＳ、下）と１０時間インキュベートした膵島の形態変化。（Ｆ）５匹のマウスから単離した膵島から得られたＦＢＳ、ＣＴＬおよびＡＬＳ群のそれぞれ合計３３、７２および４０の記録からの代表的な［Ｃａ２＋］ｉトレース。（Ｇ）ＡＬＳ血清（ｎ＝３）およびＣＴＬ血清（ｎ＝２）（ｎは、ＡＬＳ患者およびＣＴＬ患者の数を示す）で１０時間処理し、次いで、３.３および１１.１ｍＭグルコースを３０分間暴露した膵島からのインスリン分泌。（Ｈ）ＡＬＳまたはＣＴＬ患者の血清とのインキュベーションに供した膵島からの正味のインスリン分泌のまとめ。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。＊ｐ＜０.０５。 マウス膵島細胞およびグルカゴン分泌αＴＣ１−６細胞における［Ｃａ２＋］ｉ調節ならびに生存率に対するＡＬＳ血清の影響。（Ａ）糖尿病を有するが、ＡＬＳではない患者から得たＡＬＳ血清（左）およびＣＴＬ血清（右）に暴露したマウス膵島細胞におけるＫ＋脱分極誘導性［Ｃａ２＋］ｉ応答。（Ｂ）ＡＬＳ血清およびＣＴＬ血清とインキュベートしたマウス膵島細胞におけるＫ＋脱分極誘導性［Ｃａ２＋］ｉの平均純増加を示すデルタｆｕｒａ−２ ３４０／３８０比。（Ｃ）ＣＴＬ血清および２種類のＡＬＳ血清とインキュベートした膵島細胞におけるニフェジピン感受性Ｃａ２＋チャネルの平均化した電流−電圧関係。挿入図は、ＡＬＳ血清で処理した細胞（下）および対照血清とインキュベートした細胞（上）における代表的な全細胞のＣａ２＋電流を示す。（Ｄ）ＡＬＳ（ｎ＝４）、ＣＴＬ血清（ｎ＝２）またはＦＢＳに暴露した解離膵島細胞の生存率を示す平均ＷＳＴ−１吸光度。（Ｅ）対照のαＴＣ１−６細胞（左）およびＡＬＳ血清で処理したαＴＣ１−６細胞（右）におけるＫ＋脱分極誘導性［Ｃａ２＋］ｉ応答の代表的な記録。（Ｆ）対照血清で処理した細胞（ｎ＝２）およびＡＬＳ血清曝露αＴＣ１−６細胞（ｎ＝４）（ｎは、ＣＴＬ患者およびＡＬＳ患者の数を示す）における［Ｃａ２＋］ｉの平均純増加を示すデルタｆｕｒａ−２ ３４０／３８０比。（Ｇ）ＡＬＳ血清、ＣＴＬ血清およびＦＢＳへの暴露後のαＴＣ１−６細胞の生存率を示す平均ＷＳＴ−１吸光度。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。＊＊＊Ｐ＜０.０００５、＊＊Ｐ＜０.００５および＊Ｐ＜０.０５。 ヒトＡＬＳ血清から精製したＩｇＧは膵島細胞の機能および生存に干渉する。（Ａ）ＣＴＬ−ＩｇＧまたはＡＬＳ ＩｇＧのいずれかに一晩暴露したマウス膵島細胞におけるＫ＋脱分極への平均［Ｃａ２＋］ｉ応答。（Ｂ）対照ＩｇＧ、ＡＬＳ ＩｇＧまたは煮沸したＡＬＳ ＩｇＧ（ｎ＝２、３、３）（ｎはＣＴＬ患者およびＡＬＳ患者の数を示す）で処理した細胞における平均純増加を示すデルタｆｕｒａ−２ ３４０／３８０比。（Ｃ）２人のＣＴＬ対象および３人のＡＬＳ患者から精製したＩｇＧならびにＦＢＳへの２４時間の曝露後の膵島細胞の生存率を示す平均ＷＳＴ−１吸光度。（Ｄ）沸騰した場合と沸騰しない場合の患者のＩｇＧ（ｎ＝３）で２４時間処理した膵島細胞の生存率を示す平均ＷＳＴ−１吸光度。（Ｅ）ＣＴＬ−ＩｇＧまたはＡＬＳ−ＩｇＧのいずれかと一晩インキュベートした後のαＴＣ１−６細胞におけるＫ＋脱分極への［Ｃａ２＋］ｉ応答の平均変化。（Ｆ）ＣＴＬ−ＩｇＧ、ＡＬＳ ＩｇＧまたは煮沸したＡＬＳ−ＩｇＧ（ｎ＝２、３、２）で一晩処理したαＴＣ１−６細胞における［Ｃａ２＋］ｉの平均純増加を示すデルタｆｕｒａ−２ ３４０／３８０比。（Ｇ）精製したＣＴＬ−ＩｇＧ、ＡＬＳ ＩｇＧまたは煮沸したＡＬＳ−ＩｇＧ（ｎ＝２、３、２；ｎはＣＴＬ患者およびＡＬＳ患者の数を示す）に２４時間曝露したαＴＣ１−６細胞の生存率を示す平均ＷＳＴ−１吸光度。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。＊＊＊Ｐ＜０.０００５、＊＊Ｐ＜０.００５および＊Ｐ＜０.０５。 ＡＬＳ−Ｔｇマウスの膵島およびＡＬＳ血清処理マウスの膵島における［Ｃａ２＋］ｉ調節不全。（Ａ）野生型マウス（上、ｎ＝１４）およびＡＬＳ−Ｔｇマウス（下、ｎ＝１７）の膵島におけるグルコース（１１.１ｍＭ）ならびにＫＣｌ（２５ｍＭ）の刺激前ならびに刺激中に記録した［Ｃａ２＋］ｉトレース。（Ｂ）ＦＢＳ処理（上、ｎ＝３３）、ＣＴＬ血清処理（中央、ｎ＝７２）、およびＡＬＳ血清処理（下、ｎ＝４０）した野生型マウスの膵島におけるグルコース（１１.１ｍＭ）の刺激前ならびに刺激中に取得した［Ｃａ２＋］ｉトレース。 マウス膵島細胞およびαＴＣ１−６細胞におけるＫ＋脱分極誘導性［Ｃａ２＋］ｉ応答ならびに全細胞のＣａ２＋電流に対する特異的Ｃａ２＋チャネルブロッカーであるＡｇＴｘならびにニフェジピンの影響。（Ａ）対照マウスの膵島細胞およびＡｇＴｘまたはニフェジピンで前処理した細胞におけるＫ＋脱分極誘導性［Ｃａ２＋］ｉ応答（左）。対照マウスの膵島細胞およびＡｇＴｘまたはニフェジピンで前処理した細胞におけるＫ＋脱分極によって誘導された［Ｃａ２＋］ｉの平均純増加を示すデルタｆｕｒａ−２ ３４０／３８０比（右）。（Ｂ）ニフェジピンへの暴露前（赤）および暴露中（緑色）ならびに洗浄後（青）のマウス膵島細胞の代表的な全細胞Ｃａ２＋電流（上）。ニフェジピンへの暴露前（赤）および暴露中（緑色）ならびに洗浄後（青）の細胞における平均Ｃａ２＋電流密度（ｎ＝３）（下）。（Ｃ）対照αＴＣ１−６細胞およびＡｇＴｘまたはニフェジピンに予め曝露した細胞におけるＫ＋脱分極への［Ｃａ２＋］ｉ応答（左）。対照αＴＣ１−６細胞およびＡｇＴｘまたはニフェジピンに予め曝露した細胞におけるＫ＋脱分極によって誘導される［Ｃａ２＋］ｉの平均純増加を示すデルタｆｕｒａ−２ ３４０／３８０比（右）。データは、平均値±ＳＥＭとして提示される。＊＊Ｐ＜０.００５および＊Ｐ＜０.０５。 ＩｇＧを、異なる血清から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（６〜１６％）により特定し、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。レーン１：分子量マーカー（分子量範囲１０〜２４５ｋＤａ、Ｓｏｌｇｅｎｔ社）、レーン２：Ｓｉｇｍａ社からのヒトＩｇＧ、レーン３：ＣＴＬ−７ ＩｇＧ、レーン４：ＣＴＬ−７ ＩｇＧ、レーン５：ＡＬＳ−３７４ ＩｇＧおよびレーン６：ＡＬＳ−３７４ ＩｇＧ。レーン４および６に示される製剤は、ＩｇＧおよび非ＩｇＧの成分の両方を含有していた。 時間依存的なＣＴＬ−ＩｇＧおよびＡＬＳ−ＩｇＧ誘導性αＴＣ１−６細胞死。（Ａ）それぞれ、対照ＩｇＧまたはヒトＡＬＳ ＩｇＧに１２、２４および４８時間暴露した細胞において代謝的に活性のある生細胞を反映する平均ＷＳＴ−１吸光度を示すまとめのグラフ。正常ＦＢＳ含有培地において、αＴＣ１−６細胞数は、インキュベーション時間と共に増加した。逆に、αＴＣ１−６細胞数は、ＩｇＧの存在下でインキュベーション時間と共に減少した。αＴＣ１−６細胞を、１００μｇのＩｇＧとインキュベートした場合、１２時間後に生じたＣＴＬ−ＩｇＧとＡＬＳ−ＩｇＧとの間で生存率の差はなかった。したがって、細胞生存率試験について、発明者らは、１００μｇのＩｇＧおよび２４時間のインキュベーション期間を用いた（ｎ＝２）。（Ｂ、Ｃ）細胞外Ｃａ２＋の非存在下および存在下でのαＴＣ１−６細胞におけるＫ＋脱分極への［Ｃａ２＋］ｉ応答。合計１２７の［Ｃａ２＋］ｉトレースを図ＢおよびＣに示す。
引用した全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本出願内で、特記しない限り、利用する技術は、次のようないくつかの周知の参考文献のいずれかに見出すことができる：分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌによって編集された酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１８５巻、１９９１、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、酵素学における方法の中の「タンパク質精製のガイド（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ編（１９９０）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社）；ＰＣＲプロトコル：方法と応用へのガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（Ｉｎｎｉｓら、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、動物細胞の培養：基本技術のマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ社、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、遺伝子導入と発現プロトコル（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）、頁１０９〜１２８、Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社、Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、およびＡｍｂｉｏｎ社１９９８カタログ（Ａｍｂｉｏｎ社、Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）。
文脈が特に明確に指示しない限り、本明細書で使用する単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その」は複数の言及を含む。本明細書で使用する「および」は、別段の記載がないかぎり、「または」と交換可能に使用される。
文脈が特に明確に指示しない限り、本発明の任意の態様の全ての実施形態は、組み合わせて使用することができる。
第１の態様において、本発明は、ＡＬＳを有する対象における糖尿病を治療する方法および／または糖尿病の発症を制限する方法であって、該対象の細胞における電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）のＩｇＧ媒介性活性化を阻害することを含み、該阻害が、
（ｉ）該対象の血液からＩｇＧを除去すること；
（ｉｉ）該対象においてＩｇＧがＶＧＣＣを活性化するのをブロックすること；および
（ｉｉｉ）該対象においてＶＧＣＣをブロックすること
のうちの１以上を含む方法を提供する。
以下の実施例に示すように、本発明者は、ＶＧＣＣのＡＬＳ−ＩｇＧ誘導性過剰活性化によって引き起こされる細胞質ゾル遊離Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）調節の欠陥によって誘導されるベータ細胞不全の結果として減少したインスリン放出に部分的に起因して、ＡＬＳがグルコース恒常性を損なうことを発見した。したがって、ＡＬＳ対象においてＶＧＣＣを活性化するＩｇＧの能力を制限する方法を用いて、ＡＬＳ対象における糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限することができる。
本発明の方法は、ＡＬＳを有する対象にて行われる。ヒトを含むが、これらに限定されないＡＬＳの影響を受けやすい任意の対象は、本発明の方法で治療することができる。
一実施形態において、本方法は、糖尿病を治療するためのものである。この実施形態において、ＡＬＳ対象は、１型または２型糖尿病と診断されている。本明細書で使用する「糖尿病」は、膵臓によるインスリンの不十分な産生または非産生により特徴付けられ、高血糖レベルにつながる。本明細書で使用する場合、「糖尿病を治療すること」は、以下の１以上を達成することを意味する：（ａ）糖尿病または糖尿病合併症の重症度を低下させること；（ｂ）糖尿病合併症の発症を制限または防止すること；（ｃ）糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の悪化を抑制すること；（ｄ）糖尿病合併症または糖尿病に特徴的な症状の再発を制限または防止すること；（ｅ）以前に症状を示した対象における糖尿病合併症もしくは糖尿病に特徴的な症状の再発を制限または防止すること。
糖尿病に特徴的な症状には、血中グルコースレベルの上昇、インスリン産生の減少、インスリン抵抗性、頻尿（多尿）、口渇（多渇症）、空腹（多食）および原因不明の体重減少が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法に従って治療することができる糖尿病合併症には、神経における合併症（糖尿病性神経障害など）、タンパク尿、および糸球体クリアランスの障害、ならびに平滑筋細胞調節不全に伴う合併症（限定されないが勃起不全、膀胱機能障害、ならびに限定されないがアテローム性動脈硬化症、脳卒中、および末梢血管疾患を含む血管合併症を含む）が含まれるが、これらに限定されない。これらの症状／合併症の任意の程度の制限は、糖尿病のＡＬＳ対象にとって大きな利点である。
別の実施形態において、本方法は、ＡＬＳ対象における糖尿病の発症を制限するためのものである。この態様では、ＡＬＳ対象は、まだ糖尿病を有していない。一実施形態において、本方法は、該対象における２型糖尿病の発症を制限する。別の実施形態において、本方法は、該対象における１型糖尿病の発症を制限する。これらの実施形態において、「糖尿病の発症を制限すること」は、例えば、高血糖症の進行、インスリン抵抗性、膵臓ベータ細胞死、インスリン産生の減少を制限する／遅らせること、かつ／または該対象の１型もしくは２型糖尿病の臨床診断への進行を制限する／遅らせること、を含み得る。糖尿病の発症の任意の程度の制限は、ＡＬＳ対象にとって大きな利点である。
本明細書で本発明者によって示されるように、ＡＬＳは、ＶＧＣＣのＡＬＳ−ＩｇＧ誘導性過剰活性化によって引き起こされる［Ｃａ２＋］ｉ調節の欠陥によって誘導されるベータ細胞不全の結果として減少したインスリン放出に部分的に起因してグルコース恒常性を損なう。したがって、本発明の方法は、該対象の細胞中のＶＧＣＣのＩｇＧ媒介性活性化を阻害することを伴う。任意のこのような阻害は、該対象における糖尿病を治療し、かつ／または糖尿病の発症を制限するのに役立ち得る。様々な実施形態において、そのような阻害は、該対象の細胞におけるＶＧＣＣのＩｇＧ媒介性活性化の５％、１０％、２５％、５０％、またはそれ以上の減少をもたらす。ＡＬＳ対象内の様々な細胞型において、ＶＧＣＣのＩｇＧ媒介性活性化を阻害することは価値がある。例えば、膵島細胞、血管細胞、筋肉細胞、神経細胞などでのそのような阻害は、該対象における糖尿病を治療し、かつ／または糖尿病の発症を制限するのに役立つ。
一実施形態において、該阻害は、該対象から血清ＩｇＧを除去すること（すなわち、ＩｇＧ枯渇）を含み、該阻害は、該対象における糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに十分な時間、該対象から血清ＩｇＧを除去することを含み、該除去は、吸着剤上へのＩｇＧ吸着を促進するのに適する時間および条件下で、該対象から得られた血液をＩｇＧ吸着剤と接触させることを含む。この実施形態は透析に似ており、血液が対象から除去され、「洗浄され」、ＩｇＧ含量量が減少した状態で該対象に戻される。該血液は、全血を含んでもよく、または血漿および細胞成分に分離されてもよい。該対象から得られた血液試料中の任意の程度のＩｇＧ減少は、該対象における糖尿病を治療し、かつ／または糖尿病の発症を制限するのに有用である。様々な実施形態において、本方法は、ＩｇＧ吸着剤と接触させた対象の血液試料中のＩｇＧの５％、１０％、２５％、５０％、またはそれ以上の吸着をもたらす。固体支持体に固定された抗ヒトＩｇＧ抗体を含むが、これに限定されない任意の適切なＩｇＧ吸着剤（すなわち、カラム免疫吸着）を使用することができる。
例示的な一実施形態において、ＩｇＧ枯渇は、セファロース（商標）ビーズとコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧを含有する免疫吸着カラムの使用を含む。本明細書の教示に基づいて、該対象についての全ての要因に照らして、決められた対象に対してＩｇＧ枯渇を行うのに適切な条件を決定することは、十分に当業者のレベルの範囲内である。
別の実施形態において、該阻害は、ＩｇＧがＶＧＣＣを活性化するのをブロックすることを含み、該ブロッキングは、該対象における糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに有効な量の、ＩｇＧ発現もしくは活性の阻害剤を該対象に投与することを含む。本明細書で使用するＩｇＧの発現および／または活性の「阻害剤」には、ＩｇＧ ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を低下させる化合物、ＩｇＧ ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低下させる化合物、およびＶＧＣＣを活性化するＩｇＧの能力を低下させる化合物が含まれる。そのような阻害は、ＩｇＧの発現および／または活性が低減され、ＶＧＣＣを活性化する能力の低下をもたらすような完全な阻害または部分的な阻害であり得る。様々な非限定的な実施形態において、該阻害剤には、抗ＩｇＧ抗体、ＩｇＧブロッキングアプタマー、ＩｇＧ低分子干渉ＲＮＡ、ＩｇＧ低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、ＩｇＧショートヘアピンＲＮＡ、ＩｇＧマイクロＲＮＡ、ＩｇＧアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＩｇＧの任意の他の阻害剤（低分子阻害剤など）が含まれ得るが、これらに限定されない。
別の実施形態において、該阻害は、該対象においてＶＧＣＣをブロックすることを含み、該ブロッキングは、該対象における糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに有効な量の、ＶＧＣＣ発現もしくは活性の阻害剤を該対象に投与することを含む。本明細書で使用するＶＧＣＣの発現および／または活性の「阻害剤」には、ＶＧＣＣ ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を低下させる化合物、ＶＧＣＣ ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を低下させる化合物、およびＶＧＣＣの活性を低下させる化合物が含まれる。そのような阻害は、ＶＧＣＣの発現および／または活性が低減されるような完全な阻害または部分的な阻害であり得る。様々な実施形態において、該阻害剤には、Ｃａ２＋チャンネルブロック薬、ＶＧＣＣ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、該阻害剤は、フェニルアルキルアミン類、ベンゾチアゼピン類、およびジヒドロピリジン類を含むが、これらに限定されないＶＧＣＣの阻害剤である。ＶＧＣＣブロック薬の３つのクラス、すなわち、ジヒドロピリジン類、ベンゾチアゼピン類およびフェニルアルキルアミン類がある。ジヒドロピリジン類は、血管Ｌ型カルシウムチャネルの高い選択性を有し、フェニルアルキルアミン類は、心臓のＬ型カルシウムチャネルに対して比較的選択的であり、ベンゾチアゼピン類は中間型であり、心臓と血管の両方のＬ型カルシウムチャネルに作用する。例示的なＶＧＣＣブロック薬には、ニソルジピン（ＳＵＬＡＲ（登録商標））、ニフェジピン（ＡＤＡＬＡＴ（登録商標）、ＰＲＯＣＡＲＤＩＡＬ（登録商標））、ニカルジピン（ＣＡＲＤＥＮＥ（登録商標））、イスラジピン（ＤＹＮＡＣＩＲＣ（登録商標））、ニモジピン（ＮＩＭＯＴＯＰ（登録商標））、フェロジピン（ＰＬＥＮＤＩＬ（登録商標））、アムロジピン（ＮＯＲＶＡＳＣ（登録商標））、ジルチアゼム（ＣＡＲＤＩＺＥＭ（登録商標））、ラシジピン、レルカニジピン、およびベラパミル（ＣＡＬＡＮ（登録商標）、ＩＳＯＰＴＩＮ（登録商標））が含まれるが、これらに限定されない。
Figure 2018510841
これらの実施形態の各々において、該治療薬は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与単位製剤で、経口、局所、非経口、鼻腔内、肺または直腸を含むが、これらに限定されない任意の適切な経路によって投与することができる。本明細書で使用される非経口という用語は、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、もしくは髄腔内注射または注入技術などを含む。加えて、本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬製剤が提供される。該治療薬は、１以上の非毒性の薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバント、ならびに必要に応じて、他の活性成分と関連して存在してもよい。該治療薬は、経口使用に適した形態、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬もしくは軟カプセル、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤などであり得る。
別の実施形態において、該治療薬はまた、本発明の組成物がその上に吸収またはカプセル化されている膜、スポンジ、または他の適切な材料の移植を介して局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される場合、該デバイスは、膵臓などの所望の場所に移植することができ、所望の分子の送達は、拡散、徐放ボーラス、または連続投与を介するものであり得る。
投与量範囲は、化合物の選択、投与経路、製剤の性質、対象の状態、および担当医師の判断に依存する。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。当技術分野で十分に理解されるように、これらの投与量レベルの変動は、最適化のための標準的な経験的ルーチンを用いて調整することができる。
許容される製剤材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。該治療薬は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透性を変更、維持、または保持するための製剤材料を含有することができる。適切な製剤材料には、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または水素ナトリウムの亜硫酸塩など）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル類；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０などのポリソルベート類；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）、浸透圧増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム）またはマンニトール・ソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント（例えば、任意の目的のために参照により本明細書に組み込まれるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ １９９０）、および同書のその後の版を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
以下の実施例に示すように、本発明者は、ＶＧＣＣのＡＬＳ−ＩｇＧ誘導性過剰活性化によって引き起こされる［Ｃａ２＋］ｉ調節の欠陥によって誘導されるベータ細胞不全の結果として減少したインスリン放出に部分的に起因して、ＡＬＳがグルコース恒常性を損なうことを発見した。生じた異常には、対照と比較して変化している［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流が含まれ、したがって、これが糖尿病を発症する危険性があるＡＬＳ対象を特定する方法を可能にし、本発明の方法に従って治療する（すなわち、糖尿病の発症を制限する）ことができる。
したがって、別の態様において、本発明は、糖尿病を発症する危険性があるＡＬＳ対象を特定するための方法であって、
ａ）ＡＬＳを有する対象からの血液試料と細胞を接触させること；
ｂ）［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を測定し、測定された周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を対照と比較すること；ならびに
ｃ）対照と比較して［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流が変化している対象を、糖尿病を発症する危険性があるとして特定すること、
を含む方法を提供する。
血液試料は、ＡＬＳ対象からの循環ＩｇＧが存在し得る全血、血清、血漿、または任意の他の適切な血液試料であり得る。例えば、血液試料は血漿試料であり得る。本明細書で使用する「血漿試料」は、血漿、血液の液体成分を意味し、例えば、血液細胞を除去するために、全血の遠心分離によって調製される。本明細書で使用する血漿試料は、血液凝固因子が除去された血清試料も含む。
本発明の方法において、膵島細胞、筋細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞などを含むが、これらに限定されない任意の適切な細胞を使用することができる。一実施形態において、該細胞は膵島を含む。該血液試料と該細胞の接触は、インビトロまたはインビボで（例えば、実験動物モデルにおいて）行うことができる。一実施形態において、該接触はインビトロで起こる。任意の適切な条件を、本発明の方法を実施するために使用することができる。一実施形態において、該細胞を、刺激性グルコース濃度下で該血液試料と接触させる。そのような刺激性グルコース濃度は、６ｍＭ〜２０ｍＭのグルコース、あるいは、６ｍＭ〜１５ｍＭのグルコース、１０〜１２ｍＭのグルコース、または約１１ｍＭのグルコースであり得る。別の実施形態において、該接触は、該細胞中のカルシウムチャネルを開くのに適する条件下で行われる。例えば、脱分極電圧（−５０〜５０ｍＶ）を該細胞に印加することができる。あるいは（または組み合わせて）、該細胞を、該細胞中のカルシウムチャネルを開くのに十分なカリウム濃度下で血液試料と接触させる。そのような刺激性カリウム濃度は、２５ｍＭ〜５０ｍＭのカリウム、あるいは、２５ｍＭ〜４０ｍＭのカリウム、２５〜３０ｍＭのカリウム、または約２５ｍＭのカリウムであり得る。
さらなる実施形態において、該細胞は、約室温で［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を測定する前に、約３７℃（好ましくは、５％ＣＯ２などの加湿インキュベーター中で）培養される。細胞の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を測定する技術、（当技術分野で周知の［Ｃａ２＋］ｉ、単一チャネルおよび全細胞パッチクランプ測定（セルアタッチパッチクランプ技術および穿孔全細胞パッチクランプ技術）などによる）、ならびに本発明の方法を実行するための他の適切なアッセイ条件は、本明細書の教示に基づいて、十分に当業者のレベルの範囲内である。
ＡＬＳ対象の血液試料と接触させること以外は同一条件下（例えば、対照細胞を、（ｉ）非ＡＬＳ対象からの血液試料と接触させるか、または（ｉｉ）別の対照試料と接触させる）、または所定の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流閾値で処理した細胞を含むが、これらに限定されない任意の適切な対照を使用することができ、その結果、該閾値とは異なる［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流（すなわち、より迅速な周期的変動パターンおよび／またはより高い全細胞のＣａ２＋電流閾値）は糖尿病を発症する危険性を示す。ＡＬＳ対象において糖尿病を発症する危険性を示す対照との差異は、１０％、２５％、５０％、１００％、またはそれ以上の差異であり得る。一実施形態において、該差異は、標準的な統計分析によって判断されるような統計学的に有意な増加である。
一実施形態において、該ＡＬＳ対象は、１型糖尿病の危険性がある。別の実施形態において、該ＡＬＳ対象は２型糖尿病の危険性がある。
別の態様において、本発明は、糖尿病を発症する危険性のあるＡＬＳ患者を特定する方法であって、
ａ）ＡＬＳを有する対象から得られた血液試料中のＩｇＧレベルを決定すること；
ｂ）血液試料中のＩｇＧレベルを対照と比較すること；および
ｃ）血液試料中のＩｇＧレベルが上昇した対象を、糖尿病を発症する危険性があるとして特定すること、
を含む方法を提供する。
本発明者は、ＩｇＧが、糖尿病の発症につながるＡＬＳ患者におけるＶＧＣＣの過剰活性化を誘導することを以下の実施例に示した。したがって、糖尿病を発症する危険性のあるＡＬＳ対象は、血液試料中のＩｇＧレベルの上昇を検出することによって特定することができる。該血液試料は、ＡＬＳ対象からの循環ＩｇＧが存在し得る全血、血清、血漿、または任意の他の適切な血液試料であり得る。例えば、該血液試料は血漿試料であり得る。
ＡＬＳ対象の血液試料と接触させること以外は同一条件下（例えば、対照細胞を、（ｉ）非ＡＬＳ対象からの血液試料と接触させるか、もしくは（ｉｉ）別の対照試料と接触させる）、または所定ＩｇＧ閾値で処理した細胞を含むが、これらに限定されない任意の適切な対照を使用することができ、その結果、該閾値を超えるＩｇＧレベルは糖尿病を発症する危険性を示す。ＡＬＳ対象において糖尿病を発症する危険性を示す対照との差異は、１０％、２５％、５０％、１００％、またはそれ以上の差異であり得る。一実施形態において、該差異は、標準的な統計分析によって判断されるような統計学的に有意な増加である。血液試料中のＩｇＧのレベルを決定するための技術は当業者によく知られている。
一実施形態において、該ＡＬＳ対象は、１型糖尿病の危険性がある。別の実施形態において、該ＡＬＳ対象は２型糖尿病の危険性がある。
別の態様において、本発明は、ＡＬＳを有する対象における糖尿病を治療する候補化合物および／または糖尿病の発症を制限する候補化合物を特定する方法であって、
ａ）ＡＬＳおよび糖尿病を有する対象からの血液試料を第１の細胞集団および第２の細胞集団と接触させ、さらに、第２の膵臓細胞集団を１以上の試験化合物と接触させること；
ｂ）第１の集団および第２の集団中の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンならびに／または全細胞のＣａ２＋電流を測定すること；ならびに
ｃ）第１の集団に対して第２の集団中の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流の変化を減少させる化合物を、ＡＬＳを有する対象における糖尿病を治療する候補化合物および／または糖尿病の発症を制限する候補化合物として特定すること、
を含む方法を提供する。
以下の実施例に示すように、本発明者は、ＶＧＣＣのＡＬＳ−ＩｇＧ誘導性過剰活性化によって促進される［Ｃａ２＋］ｉ調節の欠陥によって誘導されるベータ細胞不全の結果として減少したインスリン放出に部分的に起因して、ＡＬＳがグルコース恒常性を損なうことを発見した。生じた異常には、対照と比較して変化している［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流が含まれ、したがって、これが糖尿病を治療する方法および／または糖尿病の発症を制限する候補化合物を特定する方法を可能にする。
該血液試料は、ＡＬＳ対象からの循環ＩｇＧが存在し得る全血、血清、血漿、または任意の他の適切な血液試料であり得る。例えば、該血液試料は血漿試料であり得る。
本発明の方法において、膵島細胞、筋細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、神経細胞などを含むが、これらに限定されない任意の適切な細胞を使用することができる。一実施形態において、該細胞は膵島を含む。該血液試料と該細胞の接触は、インビトロまたはインビボで（例えば、実験動物モデルにおいて）行うことができる。一実施形態において、該接触はインビトロで起こる。任意の適切な条件を、本発明の方法を実施するために使用することができる。一実施形態において、該細胞を、刺激性グルコース濃度下で該血液試料と接触させる。そのような刺激性グルコース濃度は、６ｍＭ〜２０ｍＭのグルコース、あるいは、６ｍＭ〜１５ｍＭのグルコース、１０〜１２ｍＭのグルコース、または約１１ｍＭのグルコースであり得る。別の実施形態において、該接触は、該細胞中のカルシウムチャネルを開くのに適する条件下で行われる。例えば、脱分極電圧（−５０〜５０ｍＶ）を該細胞に印加することができる。あるいは（または組み合わせて）、該細胞を、該細胞中のカルシウムチャネルを開くのに十分なカリウム濃度下で該血液試料と接触させる。そのような刺激性カリウム濃度は、２５ｍＭ〜５０ｍＭのカリウム、あるいは、２５ｍＭ〜４０ｍＭのカリウム、２５〜３０ｍＭのカリウム、または約２５ｍＭのカリウムであり得る。
さらなる実施形態において、該細胞は、約室温で［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を測定する前に、約３７℃（好ましくは、５％ＣＯ２などの加湿インキュベーター中で）培養される。細胞の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を測定する技術（当技術分野で周知の［Ｃａ２＋］ｉ、単一チャネルおよび全細胞パッチクランプ測定（セルアタッチパッチクランプ技術および穿孔全細胞パッチクランプ技術）などによる）、ならびに本発明の方法を実行するための他の適切なアッセイ条件は、本明細書の教示に基づいて、十分に当業者のレベルの範囲内である。
試験化合物がＡＬＳを治療する候補化合物および／またはＡＬＳの発症を制限する候補化合物であることを示す対照との差異は、細胞の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流における１０％、２５％、５０％、１００％、またはそれ以上の低下であり得る。一実施形態において、該差異は、標準的な統計分析によって判断されるような統計学的に有意な増加である。細胞の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を測定する技術（当技術分野で周知の［Ｃａ２＋］ｉ、単一チャネルおよび全細胞パッチクランプ測定（セルアタッチパッチクランプ技術および穿孔全細胞パッチクランプ技術）などによる）
一実施形態において、該候補化合物は、１型糖尿病の発症を制限するための候補化合物および／または１型糖尿病を治療するための候補化合物である。別の実施形態において、該候補化合物は、２型糖尿病の発症を制限するための候補化合物および／または２型糖尿病を治療するための候補化合物である。本発明は、さらに、上記のスクリーニング方法によって特定された化合物、およびそれを必要とする対象を治療するためのそれらの使用を提供する。
該試験化合物がポリペプチド配列を含む場合、そのようなポリペプチドは、化学的に合成するか、または組換え発現させることができる。上記に開示されたように、組換え発現は、当技術分野における標準的な方法を用いて達成することができる。そのような発現ベクターは、細菌またはウイルス発現ベクターを含むことができ、そのような宿主細胞は原核生物または真核生物であり得る。固相、液相、もしくはペプチド縮合技術、またはそれらの任意の組み合わせの周知の技術を用いて調製された合成ポリペプチドは、天然および非天然アミノ酸を含むことができる。ペプチド合成に使用されるアミノ酸は、標準的な脱保護、中和、カップリングおよび洗浄プロトコルを用いる標準的なＢｏｃ（Ｎα−アミノ保護Ｎα−ｔ−ブチルオキシカルボニル）アミノ酸樹脂、または標準的な塩基不安定性Ｎα−アミノ保護９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸であり得る。ＦｍｏｃとＢｏｃの両方のＮα−アミノ保護アミノ酸は、Ｓｉｇｍａ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社、または当業者に周知の他の化学会社から入手することができる。加えて、該ポリペプチドは、当業者に周知の他のＮα−保護基を用いて合成することができる。固相ペプチド合成は、当業者に周知の技術によって達成され、自動合成装置などを使用することによって提供され得る。
該試験化合物が抗体を含む場合、そのような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。該抗体は、抗体のヒト化、完全ヒト、またはマウスの形態であり得る。そのような抗体は、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）などに記載の周知の方法によって作製することができる。
該試験化合物が核酸配列を含む場合、そのような核酸は、同様に化学的に合成するか、または組換え発現させることができる。組換え発現技術は、当業者によく知られている（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。該核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得る。同様に、そのような核酸は、当技術分野で標準的な技術を用いて、手動もしくは自動の反応により化学的または酵素的に合成することができる。化学的に合成するか、またはインビトロ酵素合成により合成した場合、該核酸は、細胞への導入前に精製してもよい。例えば、該核酸は、溶媒または樹脂、沈殿、電気泳動、クロマトグラフィー、またはそれらの組合せで抽出することにより混合物から精製することができる。あるいは、該核酸は、試料処理による損失を避けるために、全く精製しないか、または精製を最小限に抑えて使用され得る。
該試験化合物がポリペプチド、抗体、または核酸以外の化合物を含む場合、そのような化合物は、有機化学合成を行うための当技術分野における任意の様々な方法によって作製することができる。
実施例
要約
神経変性疾患の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する患者は、グルコース恒常性の障害などの２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の特徴を示す場合が多い。この重要な関係にもかかわらず、ＡＬＳとＴ２ＤＭとの間の因果関係は謎のままである。発明者らは、ここで、ＡＬＳがベータ細胞機能および生存の変化から生じるインスリン放出の減少に部分的に起因して、グルコース恒常性の障害と関連していることを実証する。後者は、電位依存性Ｃａ２＋チャネルのＡＬＳ−ＩｇＧ誘導性過剰活性化により引き起こされるサイトゾル遊離Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）調節の欠陥によって誘導された。［Ｃａ２＋］ｉおよび細胞生存に対するＡＬＳ−ＩｇＧの同様の影響が、αＴＣ１−６細胞において確立された。したがって、発明者らの発見は、これらの深刻な病気の組み合わせを患っている患者のための新たな薬理治療戦略のための基礎を築くことができる、ＡＬＳと糖尿病との間の機構的関連を示す。
序論
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、壊滅的な神経変性疾患である。罹患した個体は、進行性の機能障害ならびに脳幹および脊髄の運動ニューロンの変性を示す。２〜５年内に進行型の筋力低下、麻痺および死を示すＡＬＳおよび臨床的ＡＬＳ患者が明確に利用可能な治療薬はない（１）。ＡＬＳの病因は未知であるが、電位依存性Ｃａ２＋チャネル（ＶＧＣＣ）の調節不全、それによるサイトゾル遊離Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）ならびにシナプス可塑性が提唱されている（２、３）。また、免疫系は、ＡＬＳの病因に寄与し得る。ＡＬＳ患者からの精製済み免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）で処置した齧歯類において、神経の組織および細胞におけるＣａ２＋蓄積による超微細構造異常ならびに運動ニューロンにおける伝達物質放出の増加について説明されている（４）。［Ｃａ２＋］ｉの増加は、ミトコンドリア機能不全、フリーラジカル損傷および細胞傷害につながる可能性がある（５〜７）。ＡＬＳのような神経変性疾患の多くは、グルコース恒常性の障害などの２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の特徴と関連していることが知られているが、因果関係は知られていない（８〜１０）。膵島は、血中グルコース恒常性の調節において中心的な役割を有する。本研究では、発明者らは、ＡＬＳと関連する糖尿病が膵島細胞の機能および生存に負の影響を与える循環要因によって引き起こされるという仮説を試験した。
ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）の家族歴のある患者の約２０％は、Ｃｕ２＋／Ｚｎ２＋スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子に変異を有する（１１）。最近の研究により、９番染色体のオープンリーディングフレーム（Ｃ９ｏｒｆ７２）遺伝子反復増幅が、西洋諸国におけるｆＡＬＳの最も一般的な遺伝的原因であり、ＴＤＰ４３、ＦＵＳ、ＯＰＴＮ、ＵＢＱＬＮ２、及びＮＥＦＨ遺伝子を含む様々な遺伝的変異もｆＡＬＳの責任ある原因に関与していることが実証された（１２）。ＡＬＳの様々なトランスジェニック動物モデルのうち、ＳＯＤ１−変異（ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ）マウスは、ＡＬＳ患者における病理学的所見によって明らかにされたものと類似している免疫炎症性の側面に特に焦点が当てられている細胞死機構の信頼性のあるモデルである（１３、１４）。
結果と考察
発明者らは、７〜８週齢のＳＯＤ１Ｇ９３Ａトランスジェニック（ＡＬＳ−Ｔｇ）マウスおよび週齢を合わせた対照を用いて、膵島機能の様々な側面を調べた。腹腔内グルコース耐性試験を行った（図１Ａ）。ＡＬＳ−Ｔｇマウスは、野生型同腹仔と比較して、血液からの効率の低いグルコースクリアランスによって示される効率の低いグルコース恒常性を実証した。ＡＬＳ−Ｔｇマウスの膵島は、野生型マウスの膵島と比較して、かなり低いグルコース刺激性インスリン放出を示した（図１Ｂ）。グルコース刺激性インスリン分泌は、ＶＧＣＣを介するベータ細胞のＣａ２＋流入の増加、およびそれによる［Ｃａ２＋］ｉの増加から生じる。グルコースは、β細胞および膵島において［Ｃａ２＋］ｉを増加させるだけでなく、数秒〜数分におよぶ範囲で［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンを引き起こす（１５〜１９）。これらの［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンのタイプは、β細胞の機能および生存に重要であり、β細胞の健康であることの特徴としても役立つ。したがって、次に、発明者らは、高グルコース刺激後の［Ｃａ２＋］ｉの変化を調べた。野生型マウスの膵島とＡＬＳ−Ｔｇマウスの膵島との間で［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンの分布に注目すべき違いがあった（図１Ｃ、Ｄおよび図４Ａ）。野生型の膵島とは対照的に、ＡＬＳ−Ｔｇマウスの膵島は、高頻度タイプの［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンの有意な損失を示した（図１Ｃ、Ｄおよび補足図１Ａ）。また、［Ｃａ２＋］ｉのＫ＋誘導性増加は、ＡＬＳ−Ｔｇ膵島と対照膵島との間で有意に異なっており、前者がより顕著であった（図１Ｃ、Ｄおよび図４Ａ）。
β細胞の［Ｃａ２＋］ｉ調節に影響を与える可能性があるＴ２ＤＭを有するＡＬＳ患者の循環因子があるかどうかを明確にするために、発明者らは、１１ｍＭグルコースによって刺激したマウスの膵島の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動に対するＡＬＳ患者からの血清の影響を調べた。発明者らは、本研究において、Ｔ２ＤＭを有する孤発例からのＡＬＳ血清のみを用いた。対照血清または正常ＦＢＳ含有培地と比較して、ＡＬＳ血清に暴露された膵島は、膵島形状の初期の形態学的変化に対応する［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンの著しい変化を示した（図１Ｅ、Ｆおよび図４Ｂ）。代表的な［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動トレースおよび異なる膵島からの組み合わせた［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動トレースの平均値が各実験条件について示されている（図１Ｆおよび図４Ｂ）。発明者らはまた、ＡＬＳ血清、対照血清またはＦＢＳに暴露されたインタクトな膵島からのインスリン分泌を調べた。対照血清または正常ＦＢＳ中でインキュベートした膵島からのグルコース誘導性インスリン分泌に差異は無かったが、ＡＬＳ血清中でインキュベートした膵島は、グルコース応答の点で分泌できなかった（図１Ｇ、Ｈ）。これらのデータは、インビボでのベータ細胞の機能および生存に負の影響を及ぼす、ＡＬＳならびにＴ２ＤＭを有する患者からの血清中の循環因子と一致している。
ＡＬＳに関連する［Ｃａ２＋］ｉ調節における観察された変化に関与する分子機構へのさらなる洞察を得るために、分離したマウス膵島細胞を、ＡＬＳを含む場合と、含まない場合とでＴ２ＤＭ患者からの血清と一晩インキュベートした。細胞を２５ｍＭのＫＣｌで脱分極した場合、１２人のＡＬＳ患者からの血清は、８人の対照患者からの血清と比較して、［Ｃａ２＋］ｉの有意に高い一過性の増加を誘導し、ＶＧＣＣのオープニングをもたらした（図２Ａ、Ｂ）。［Ｃａ２＋］ｉのＡＬＳ血清誘導性過負荷は、Ｃａ２＋依存性β細胞破壊をもたらし得る。細胞生存率アッセイにより、対照血清または正常ＦＢＳに一晩暴露したものよりも、ＡＬＳ患者血清に曝露した膵島細胞集団においてより高い細胞毒性があることが確認された（図２Ｄ）。［Ｃａ２＋］ｉの一過性の増加に関与するＶＧＣＣを特定するために、発明者らは、特定のＣａ２＋チャネルブロッカーを適用した。図５Ａおよび図５Ｂは、Ｌ型ＶＧＣＣ（ニフェジピン感受性）が分離したマウス膵島細胞における［Ｃａ２＋］ｉの増加に関与する主要なチャネルであることを示す。それぞれの特定ブロッカーの代表的なトレースおよびまとめた棒グラフを示す（図５Ａ、Ｂ）。次に、ニフェジピン感受性ＶＧＣＣの活性を、全細胞パッチクランプ構成を用いて検討した（図２Ｃ）。ＡＬＳ患者からの血清で処理した膵島細胞は、対照血清で処理した膵島細胞よりもより高いＣａ２＋電流を示した。電流を、−７０ｍＶの保持電位から−６０〜４０ｍＶの間で３００ミリ秒の電圧ステップによって生じさせた（図２Ｃ）。図２Ｃは、２人のＡＬＳ患者および１人の対照患者からの血清とインキュベートした膵島細胞におけるニフェジピン感受性ＶＧＣＣの電流−電圧（Ｉ−Ｖ）関係を示す。ＡＬＳ血清とのインキュベーションは、対照細胞およびＡＬＳ血清で処理した細胞から得られた代表的な全細胞のＣａ２＋電流トレースによって明らかであるように、全細胞のＣａ２＋電流を劇的に増加させた（図２Ｃ）。コンパイルデータは、ＡＬＳ血清が、−２０ｍＶの脱分極で測定される全細胞のＣａ２＋電流密度を、対照血清と比較して有意に上昇させたことを示す（図２Ｃ）。
ＡＬＳ血清の影響がインスリン分泌膵臓β細胞に対してどの程度特異的であるか、または膵島細胞に対するより一般的な影響をどの程度有しているかを明らかにするために、発明者らはグルカゴン分泌マウス膵臓アルファ細胞株であるαＴＣ１−６細胞を試験した。また、これらの細胞において、ＡＬＳ血清は、Ｋ＋誘導性脱分極後に［Ｃａ２＋］ｉの増加を誘導し、これは、該細胞を対照血清に暴露した場合に得られる増加よりもより顕著であった（図２Ｅ、Ｆ）。αＴＣ１−６細胞において、ニフェジピン感受性ＶＧＣＣが、［Ｃａ２＋］ｉの増加を媒介するのに関与する最も豊富なＣａ２＋チャネルであった（補足図２Ｃおよび図６Ｂ、Ｃ）。しかしながら、αＴＣ１−６細胞はまた、ω−アガトキシンＴＫ（ＡｇＴｘ）感受性Ｃａ２＋チャネル、すなわち、Ｐ／Ｑ型ＶＧＣＣを相当数有しているので、これらも［Ｃａ２＋］ｉに対する影響を媒介するのに関与し得る。さらに、細胞毒性は、対照患者からの血清と比較して、ＡＬＳ患者からの血清で処理したαＴＣ１−６細胞において優勢である（図２Ｇおよび図７Ａ）。したがって、Ｔ２ＤＭを有するＡＬＳ患者から採取した血清は、インスリン分泌β細胞だけでなく、グルカゴン分泌α細胞に影響を与えるので、内分泌膵臓におけるホルモン分泌とのより広い干渉を示す。インスリンとグルカゴンの両方がグルコース恒常性に重要な役割を有しているので、これらの障害は、糖尿病の発症において主要な役割を果たしている可能性がある。
ＡＬＳ血清中での膵島細胞の［Ｃａ２＋］ｉ調節への影響を媒介する循環成分を探すために、発明者らは、ＩｇＧへ関心を向けた。この免疫グロブリンを、ＡＬＳ血清および対照血清から精製した（図６、レーン３および５）。シグマ社のヒトＩｇＧを陽性対照として使用した。血清ＩｇＧおよびシグマ社のＩｇＧの全ての調製物は、電気泳動で２つの主なバンドを示し、一方は５５ｋＤａの重鎖であり、もう一方は２６ｋＤａの軽鎖であった。それぞれの精製した血清ＩｇＧ試料を濃縮するために凍結乾燥し、分離した膵島細胞およびαＴＣ１−６細胞を１００μｇのＩｇＧ／ｍｌの濃度で処理するのに使用した。ＡＬＳ−ＩｇＧの存在下では、対照ＩｇＧと比較して、分離した膵島細胞（図３Ａ、Ｂ）とαＴＣ１−６細胞（図３Ｅ、Ｆ）の両方において、高いＫ＋暴露後により顕著な一過性の［Ｃａ２＋］ｉ増加があった。ＡＬＳ−ＩｇＧを９６℃で３０分間煮沸した場合、［Ｃａ２＋］ｉに対する影響は減衰した。さらに、発明者らはまた、ＡＬＳ−ＩｇＧの細胞毒性を調べた（図３Ｃ、Ｄ、Ｇ）。ＡＬＳ−ＩｇＧに曝露した細胞は、対照ＩｇＧに曝露した細胞と比較して、より低い生存を示した（図３Ｃ、Ｄ、Ｇ）。
したがって、発明者らの知見は、ＡＬＳ患者で報告されたグルコース恒常性異常（１０、２９、３０）が、ＶＣＣＳのＩｇＧ媒介性活性化に起因する膵島細胞［Ｃａ２＋］ｉ調節における機能不全、それによる膵島細胞死によって説明することができることを示す。
方法
膵島単離および膵島細胞培養
膵島を、標準コラゲナーゼ消化により単離し、その後、ＲＰＭＩ １６４０培地中で、実体顕微鏡下で厳選した。単一細胞を、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ）と共にＣａ２＋フリー培地中の膵島を振盪することにより得て、カバーガラス上に播種した。膵島および単一細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養し、空気中５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で、３７℃で維持した。
患者の登録
１２人の孤発性ＡＬＳおよびＴ２ＤＭを有する患者ならびにＡＬＳではないがＴ２ＤＭを有する患者を無作為に選択した。患者からの血清を使用するための倫理的承認を韓国ソウルの漢陽大学病院から入手した（ＨＹＵＨ ２００６−０４−００１−００４）。血液試料を、書面によるインフォームドコンセントを得た後に採取した。実際の患者には、神経筋の疾患または消耗の既知の家族歴はなかった。Ｔ２ＤＭと診断された全ての対象を、血糖降下剤でうまく調節した。
血清の調製およびＩｇＧ精製
Ｔ２ＤＭを有するＡＬＳ患者からの血清およびＡＬＳではないがＴ２ＤＭを有する対照対象からの血清を採取し、同様に滅菌処理し、使用するまで−２０℃で保存した。これらの血清を３０分間５６℃でインキュベーションすることにより熱不活化した。細胞を、実際の血清の１０％を補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で一晩インキュベートした。血清ＩｇＧを、特定ゲルベースのスピンカラム精製を用いて精製した（ＩｇＧ精製樹脂；Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。ＩｇＧ精製キットは、ＩｇＧのみが通過できる商標リガンドを含有する樹脂に基づく。カラムサポートを用いて、非抗体血清タンパク質を除去し、血清ＩｇＧを単離した。簡単に説明すると、５００μｌの希釈した血清を、製造業者の指示に従って調製したミニスピンカラムに添加し、３０００Ｇで遠心分離してＩｇＧを溶出した。細胞上で使用する前に、溶出画分を凍結乾燥によって濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって試験した。
［Ｃａ２＋］ｉの測定
カバーガラスに付着した膵島細胞および単一細胞を、異なる患者の血清で前処理し、次いで、（ｍＭで）１２５のＮａＣｌ、５．９のＫＣｌ、２.５６のＣａＣｌ２、１.２のＭｇＣｌ２、２５のＨＥＰＥＳ、および３のグルコース（ｐＨ７.４）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝溶液中で、３７℃で３０分間、２μΜのＦｕｒａ−２／ＡＭを添加した。１１ｍＭのグルコース濃度を、膵島刺激のために使用した。添加後に、カバーガラス上の膵島および細胞を、３７℃で維持したオープン灌流チャンバーに移し、［Ｃａ２＋］ｉを３４０／３８０ｎｍの比として測定した。光源は、キセノンアークランプおよび統合シャッター（ラムダＤＧ−４、Ｓｕｔｔｅｒ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｃｏｍｐａｎｙ）を備えており、液体ライトガイドを介して顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ ｉＸ ７１）に連結されていた。１×１のビニングの１６ビットのグレースケール画像を、冷却ＥＭ−ＣＣＤカメラ（ＩｍａｇＥＭ Ｘ２、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）を用いて１秒ごとに（１００〜３００ミリ秒の範囲の露光時間で）キャプチャーした。カメラおよびシャッターは、ＭＥＴＡＦＬＵＯＲ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）ソフトウェアによって制御され、これも分析に使用した。明るい［Ｃａ２＋］ｉシグナルを有する細胞は、興味の領域（関心領域）を定義した。背景雑音シグナルを減算することによって、ＲＯＩシグナルを計算した。
電気生理学的記録
異なる処理後のマウス膵島細胞を、ＥＰＣ−１０パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ社、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ／Ｐｆａｌｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、従来の全細胞パッチクランプ解析に供した。細胞を、以下の外部溶液（ｍＭで）：１３８のＮａＣｌ、１０のＴＥＡＣｌ、１０のＣａＣｌ２、５.６のＫＣｌ、１.２のＭｇＣｌ２、５のＨＥＰＥＳ、および３のグルコース（ｐＨ７.４）に浸した。ピペット溶液は、（ｍＭで）１５０のＮ−メチル−Ｄ−グルカミン、１２５のＨＣｌ、１０のＥＧＴＡ、１.２のＭｇＣｌ２、３のＭｇ−ＡＴＰ、および５のＨＥＰＥＳ（ｐＨ７.１５）を含有していた。ホウケイ酸ガラス電極（１.２ｍｍの外径、Ｗａｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）は、垂直ピペットプーラー（ＰＣ−１０、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ）により引っ張られ、ピペット溶液で満たされたときに、２〜３ΜΩの範囲の先端抵抗を有していた。全ての記録は室温で行った。全細胞のＣａ２＋電流の振幅をセル容量によって正規化した。データの取得および解析を、ソフトウェアプログラムＰＡＴＣＨＭ ＡＳＴＥＲ（登録商標）（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ社）を用いて行った。化学物質のほとんどはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から注文し、ニフェジピンおよびω−アガトキシンＴＫはＴｏｃｒｉｓ社から注文した。
グルコース負荷試験およびインスリン放出
グルコース負荷試験のために、マウスを一晩絶食させた後に、Ｄ−グルコース溶液（２ｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射した。グルコース注入後、血液を１５、３０、６０、および１２０分の時点で尾静脈から採取し、次いで、血糖値をグルコメーター（ＡＣＣＵ−ＣＨＥＣＫ ＡＣＴＩＶＥ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用して決定した。
グルコース誘導性インスリン分泌の測定を、一晩培養した分離膵島を用いて行った。１０個の膵島をバッチにプールし、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＢＳＡを補充した、（ｍＭで）１２５のＮａＣｌ、５．９のＫＣｌ、１.２のＭｇＣｌ２、２.５６のＣａＣｌ２、および３または１１のグルコースを含有するＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７.４）中で、３７℃で３０分間インキュベートした。上清を注意深く吸引し、膵島からの静的インスリン分泌を、マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ）を用いてアッセイした。
ＷＳＴ−１アッセイ
細胞生存率を、プレミックス水溶性テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）細胞増殖アッセイシステム（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）を使用して、異なる実験条件下で評価した。細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種し、血清ＩｇＧおよび精製ＩｇＧを用いる実験で、それぞれ１２時間および２４時間培養した。その後、培地を、新鮮な培養培地とＷＳＴ−１試薬の１０：１溶液と置換した。マイクロプレートを３７℃で４時間インキュベートし、次いで、代謝活性のある生細胞をマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を測定することによって定量した。
参考文献
１. Ｂｒｏｏｋｓ ＢＲ. Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＡＬＳ: ｓｙｍｐｔｏｍｓ, ｓｔｒｅｎｇｔｈ, ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎ, ａｎｄ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ. Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ. １９９６；４７（４ Ｓｕｐｐｌ ２）：Ｓ７１−８１．
２. Ｓｍｉｔｈ ＲＧ, Ａｌｅｘｉａｎｕ ＭＥ, Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｇ, Ｎｙｏｒｍｏｉ O, Ｓｔｅｆａｎｉ Ｅ, Ａｐｐｅｌ ＳＨ. Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｆｒｏｍ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｏｎ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ. Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ. １９９４；９１（８）：３３９３−３３９７.
３. Ｔｒａｎ ＬＴ, Ｇｅｎｔｉｌ ＢＪ, Ｓｕｌｌｉｖａｎ ＫＥ, Ｄｕｒｈａｍ ＨＤ. Ｔｈｅ ｖｏｌｔａｇｅ-ｇａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ ｌｏｍｅｒｉｚｉｎｅ ｉｓ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ＳＯＤ１, ｂｕｔ ｎｏｔ ＴＤＰ-４３. Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ. ２０１４；１３０（３）：４５５−４６６．
４. Ｐｕｌｌｅｎ ＡＨ, Ｄｅｍｅｓｔｒｅ Ｍ,Ｈｏｗａｒｄ ＲＳ,Ｏｒｒｅｌｌ ＲＷ. Ｐａｓｓｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ＩｇＧ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｔｏ ｍｉｃｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄ ｂｙ Ｃａ２+ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ. Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ． ２００４；１０７（１）：３５−４６．
５. Ｂｉｌｌｕｐｓ Ｂ， Ｆｏｒｓｙｔｈｅ ａｉｄｈｉ． Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｓｙｎａｐｓｅｓ. Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２００２；２２（１４）：５８４０−５８４７．
６. Ｓｈｉ Ｐ， Ｇａｌ Ｊ， Ｋｗｉｎｔｅｒ ＤＭ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｚｈｕ Ｈ． Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． ２０１０；１８０２（１）：４５−５１．
７. Ｂａｒｂｅｒ ＳＣ， Ｓｈａｗ ＰＪ． Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ＡＬＳ： ｋｅｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｍｏｔｏｒ ｎｅｕｒｏｎ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ． Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ． ２０１０；４８（５）：６２９−６４１．
８. Ｃｒａｆｔ Ｓ， Ｗａｔｓｏｎ ＧＳ． Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ： ｓｈａｒｅｄ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌ． ２００４；３（３）：１６９−１７８．
９. Ｐａｒｋ ＳＡ． Ａ ｃｏｍｍｏｎ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｌｉｎｋｉｎｇ ｔｙｐe−２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｎｄ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ ｄｉｓｅａｓｅ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１１；７（１）：１０−１８．
１０. Ｐｒａｄａｔ ＰＦ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐａｉｒｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒ． ２０１０；１１（１−２）：１６６−１７１．
１１. Ｒｏｓｅｎ ＤＲ， ｅｔ ａｌ． Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｕ／Ｚｎ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ ｇｅｎｅ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｎａｔｕｒｅ． １９９３；３６２（６４１５）：５９−６２.
１２. Ｒｅｎｔｏｎ ＡＥ， Ｃｈｉｏ Ａ， Ｔｒａｙｎｏｒ ＢＪ． Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｐｌａｙ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１４；１７（１）：１７−２３．
１３. Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈｔ Ｗ， Ｐｈｉｌｉｐｓ Ｔ． Ｔｈｅ ｃｈａｎｇｉｎｇ ｓｃｅｎｅ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１３；１４（４）：２４８−２６４．
１４. Ａｐｐｅｌ ＳＨ， Ｚｈａｏ Ｗ， Ｂｅｅｒｓ ＤＲ， Ｈｅｎｋｅｌ ＪＳ． Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｇｌｉａｌ−ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ ｄｉａｌｏｇｕｅ ｉｎ ＡＬＳ． Ａｃｔａ Ｍｙｏｌ． ２０１１；３０（１）：４−８．
１５. Ｂｅｒｇｇｒｅｎ ＰＯ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ ｂ３ ｓｕｂｕｎｉｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｃａ２＋ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ． Ｃｅｌｌ． ２００４；１１９（２）：２７３−２８４．
１６. Ｆｒｉｄｌｙａｎｄ ＬＥ， Ｔａｍａｒｉｎａ Ｎ， Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ ＬＨ． Ｂｕｒｓｔｉｎｇ ａｎｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ： ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｃｅｍａｋｅｒｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ． Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１０；２９９（４）：Ｅ５１７−５３２．
１７. Ｒｏｒｓｍａｎ Ｐ， Ｂｒａｕｎ Ｍ， Ｚｈａｎｇ Ｑ． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ａ− ａｎｄ ｂ−ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ. Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ． ２０１２；５１（３−４）：３００−３０８．
１８. Ｙａｎｇ ＳＮ， Ｂｅｒｇｇｒｅｎ ＰＯ． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂ−ｃｅｌｌ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ． ２００６；２７（６）：６２１−６７６．
１９. Ｙａｎｇ ＳＮ， Ｓｈｉ Ｙ， Ｙａｎｇ Ｇ， Ｌｉ Ｙ， Ｙｕ Ｊ， Ｂｅｒｇｇｒｅｎ ＰＯ． Ｉｏｎｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ２０１４；７１（２１）：４１４９−４１７７．
２０. Ｓｍｉｔｈ ＲＧ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｌ−ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． １９９２；３２７（２４）：１７２１−１７２８．
２１. Ｋｉｍｕｒａ Ｆ， ｅｔ ａｌ． Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｌａｂｅｌ Ｃａ２＋ ｃｈａｎｎｅｌ ａｌｐｈａ １ ｓｕｂｕｎｉｔ. Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． １９９４；３５（２）：１６４−１７１．
２２. Ｆｒａｔａｎｔｏｎｉ ＳＡ， Ｗｅｉｓｚ Ｇ， Ｐａｒｄａｌ ＡＭ， Ｒｅｉｓｉｎ ＲＣ， Ｕｃｈｉｔｅｌ ＯＤ． Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ＩｇＧ−ｔｒｅａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｄｅｖｅｌｏｐ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ Ｌ−ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｂｌｏｃｋｅｒ． Ｍｕｓｃｌｅ Ｎｅｒｖｅ． ２０００；２３（４）：５４３−５５０．
２３. Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＬＥ， ｅｔ ａｌ． Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ−ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｐ／Ｑ−ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２０１１；１１９（４）：８２６−８３８.
２４. Ｍｉｌｏｓｅｖｉｃ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ Ｇ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｏｒａｄｉｃ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ａｆｆｅｃｔｓ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ Ｃａ２＋ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｒａｔ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ． Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ． ２０１３；５４（１）：１７−２５．
２５. Ｌｌｉｎａｓ Ｒ， ｅｔ ａｌ． ＩｇＧ ｆｒｏｍ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｃｕｒｒｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｐ−ｔｙｐｅ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９３；９０（２４）：１１７４３−１１７４７．
２６. Ｍｏｓｉｅｒ ＤＲ， ｅｔ ａｌ． Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｃａ２＋ ｃｕｒｒｅｎｔｓ ｉｎ ａ ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ． １９９５；３７（１）：１０２−１０９．
２７. Ｌｏｓａｖｉｏ Ａ， Ｍｕｃｈｎｉｋ Ｓ． Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ． １９９７；２７３（６ Ｐｔ １）：Ｃ１８３５−１８４１．
２８. Ｍｕｃｈｎｉｋ Ｓ， Ｌｏｓａｖｉｏ Ａ， Ｄｅ Ｌｏｒｅｎｚｏ Ｓ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｓｅｒｕｍ ｏｎ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ． Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ． ２００２；１１３（７）：１０６６−１０７１．
２９. Ｄｕｐｕｉｓ Ｌ， Ｏｕｄａｒｔ Ｈ， Ｒｅｎｅ Ｆ， Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｄｅ Ａｇｕｉｌａｒ ＪＬ, Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ＪＰ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｅｎｅｒｇｙ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ： ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ−ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｅｔ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２００４；１０１（３０）：１１１５９−１１１６４．
３０. Ｊａｗａｉｄ Ａ， ｅｔ ａｌ． ＡＬＳ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｎｓｅｔ ｍａｙ ｏｃｃｕｒ ｌａｔｅｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｒｅ−ｍｏｒｂｉｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ． ２０１０；１７（５）：７３３−７３９．

Claims (19)

  1. 筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象における糖尿病を治療する方法および／または糖尿病の発症を制限する方法であって、前記対象の細胞における電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）のＩｇＧ媒介性活性化を阻害することを含み、前記阻害が、
    （ｉ）前記対象の血液からＩｇＧを除去すること；
    （ｉｉ）前記対象においてＩｇＧがＶＧＣＣを活性化するのをブロックすること；および、
    （ｉｉｉ）前記対象においてＶＧＣＣをブロックすること
    のうちの１以上を含む方法。
  2. 前記阻害が、前記対象の糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに十分な時間、前記対象から血清ＩｇＧを除去することを含み、前記除去が、吸着剤上へのＩｇＧの吸着を促進するのに適する時間および条件下で、前記対象から得られた血液を前記ＩｇＧ吸着剤と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＩｇＧ吸着剤が、抗ヒトＩｇＧ抗体を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記阻害が、ＩｇＧがＶＧＣＣを活性化するのをブロックすることを含み、前記ブロッキングが、前記対象の糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに有効な量の、ＩｇＧ発現もしくは活性の阻害剤を前記対象に投与することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ＩｇＧ発現または活性の阻害剤が、抗ＩｇＧ抗体、ＩｇＧブロッキングアプタマー、ＩｇＧ低分子干渉ＲＮＡ、ＩｇＧ低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、ＩｇＧショートヘアピンＲＮＡ、ＩｇＧマイクロＲＮＡ、およびＩｇＧアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
  6. 前記阻害が、前記対象においてＶＧＣＣをブロックすることを含み、前記ブロッキングが、前記対象の糖尿病を治療するか、または糖尿病の発症を制限するのに有効な量の、ＶＧＣＣ発現もしくは活性の阻害剤を前記対象に投与することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記ＶＧＣＣ発現もしくは活性の阻害剤が、Ｃａ２＋チャネルブロッカーおよびＶＧＣＣ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ＶＧＣＣの阻害剤が、フェニルアルキルアミン類、ベンゾチアゼピン類、およびジヒドロピリジン類、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
  9. 前記ＶＧＣＣの阻害剤が、ニソルジピン、ニフェジピン、ニカルジピン、イスラジピン、ニモジピン、フェロジピン、アムロジピン、ジルチアゼム、ラシジピン、レルカニジピン、およびベラパミル、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記方法が、２型糖尿病を治療するか、または２型糖尿病の発症を制限する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記方法が１型糖尿病の発症を制限する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 糖尿病を発症する危険性のあるＡＬＳ患者を特定する方法であって、
    ａ）ＡＬＳを有する対象からの血液試料を細胞と接触させること；
    ｂ）［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を測定し、測定された周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流を対照と比較すること；ならびに
    ｃ）対照と比較して［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流が変化している対象を、糖尿病を発症する危険性があるとして特定すること、
    を含む方法。
  13. 糖尿病を発症する危険性のあるＡＬＳ患者を特定する方法であって、
    ａ）ＡＬＳを有する対象から得られた血液試料中のＩｇＧレベルを決定すること；
    ｂ）前記血液試料中のＩｇＧレベルを対照と比較すること；および
    ｃ）前記血液試料中のＩｇＧレベルが上昇した対象を、糖尿病を発症する危険性があるとして特定すること、
    を含む方法。
  14. ＡＬＳを有する対象における糖尿病を治療する候補化合物および／または糖尿病の発症を制限する候補化合物を特定する方法であって、
    ａ）ＡＬＳおよび糖尿病を有する対象からの血液試料を第１の細胞集団および第２の細胞集団と接触させ、さらに、前記第２の膵臓細胞集団を１以上の試験化合物と接触させること；
    ｂ）前記第１の集団および前記第２の集団中の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンならびに／または全細胞のＣａ２＋電流を測定すること；ならびに
    ｃ）前記第１の集団に対して前記第２の集団中の［Ｃａ２＋］ｉ周期的変動パターンおよび／または全細胞のＣａ２＋電流の変化を減少させる化合物を、ＡＬＳを有する対象における糖尿病を治療する候補化合物および／または糖尿病の発症を制限する候補化合物として特定すること、
    を含む方法。
  15. 前記細胞、または前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団が、膵島細胞、筋細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、および／または神経細胞を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記細胞、または前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団が膵臓細胞を含み、前記膵臓細胞が、膵島、膵臓β細胞、および／または膵臓α細胞を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記接触が、刺激性グルコース濃度、刺激性カリウム濃度の存在下で行われ、かつ／または脱分極電圧が、前記第１の細胞集団および前記第２の細胞集団に印加される、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記血液試料が、全血、血清、または血漿からなる群から選択される、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記血液試料が血清である、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
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US8747890B2 (en) * 2009-11-19 2014-06-10 Signpath Pharma Inc. Intravenous infusion of curcumin and a calcium channel blocker
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. NEUROCHEM., (2011), 119, [4], P.826-838, JPN6019030420, ISSN: 0004091474 *
仙台市立病院医誌, (1999), 19, P.99-103, JPN6019030419, ISSN: 0004091473 *

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