JP2018509923A - 生物学的試料の取り扱い - Google Patents
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Abstract
Description
[0003]本明細書における文書、デバイス、行為または知識のいかなる考察も、本発明の背景を説明するために含まれることが認識されるものとする。さらに、本明細書全体の考察は、本発明者の認識および/または本発明者による特定の関連技術の問題の同定によって生じる。さらに、本明細書における文書、デバイス、行為または知識などの素材のいかなる考察も、本発明者らの知識および経験に関して、本発明の背景を説明するために含まれ、そしてしたがって、いかなるこうした考察も、本明細書の開示および請求項の優先日またはそれ以前に、オーストラリアまたは別の地域の関連する業において、素材のいずれかが先行技術の基礎または共通する一般的な知識の一部を形成するという承認と解釈されてはならない。
1. 大気および空気伝染病原体から培地小滴を分離する物理的バリアを提供し:
2. ガス拡散を遅延させ、したがって、培地のpH、温度、モル浸透圧濃度および酸素濃度を定常レベルに維持し、胚をその微小環境における重大な変動から守り;
3. 蒸発を防止して、加湿されていないインキュベーターの使用を可能にし;アンモニアを含む代謝副産物の自由な拡散を防止し;
4. 液体可溶性生体異物を除去する
と認識される。
[0011]上記の利点にも関わらず、胚培養のためのミネラルオイルの使用に関連するいくつかの注目される問題がある。極端な場合、ミネラルオイル重層の使用は、IVFに意図される油がその目的に不適切であると証明された際、製品リコールを生じうる4。問題のいくつかには:i)複雑な化学薬品混合物としてしばしば提示される、不純物を含む、ミネラルオイルの定義されない組成物;ii)内因性構成要素、例えば多環芳香族炭化水素、(ポリ)不飽和有機物、ヘテロ芳香族物質、および日光、空気/酸素に曝露された産物の両方に関連する毒性(限定されるわけではないが;精製不足および/または不適切な品質管理によって引き起こされる毒性;ならびに輸送および/または保管中に獲得された毒性)が含まれる5。特に、ヒト血清アルブミン(HSA)および/または関連添加剤は、おそらく、反応酸素種の形成を安定化させ、そして増加させることによって、過酸化油の毒性効果をさらに増加させることが注目されてきている6。シリコンオイルは、ミネラルオイルおよび特にパラフィンオイル両方の代替物として導入されてきているが、おそらくZn不純物のため、胚にいくぶん毒性であると報告された7。いくつかのグループが、胚発生に関して、他のミネラルオイルと異なるパラフィンオイルの優れた性能を報告してきている8。
i)生物学的および/または医学的使用に適する、ミネラルおよび/またはパラフィンオイルの標準化、厳格に管理された精製、およびさらに精製プロトコルの一般的な欠如。これらは、毒性化学基の最初からの存在、あるいは輸送および/または保管中に油が毒性を獲得する能力につながりうる。
iii)パラフィン/ミネラルオイルの複雑な化学組成は、油の多様な生物物理学、化学特性、胚生存性および発生結果を潜在的に生じうる15。
・慣用的な分析技術、例えばNMR、HPLC、LCMSおよび他のものによって、検出限界内で記載されるような、そしてi)よく定義された化学的および/または生物物理学的特性を持つ、厳格に管理されたポリマー(単数または複数)、ii)小分子(単数または複数)、iii)空気より重い不活性ガス(単数または複数)によって例示されるような、よく定義された化学的化合物または化合物の混合物。Arのような不活性ガスは、生物学的試料を被包する不活性媒体の例である。
・任意のUV/UV可視/IR光吸収/発光技術および/または生物物理学的方法によって例示されるような、慣用的検出技術を通じて、スクリーニング培地の監視を可能にする、化学的化合物または化合物の混合物を含む、透明な被包物質。この意味で、スクリーニング培地は、胚培養、酵素アッセイ、細胞/組織/損なわれていない生物に基づく検出技術に適用可能でありうる。
・ビタミン、ホルモン、増殖因子、栄養素、保護剤、酸化還元トラップ、アミノ酸およびその誘導体、ペプトイド、ペプチド、タンパク質、抗体および適切な誘導体、断片、および全長オリゴヌクレオチドならびにその合成誘導体を含有する補充供給源として用いられるよう適応した化学的化合物または化合物混合物。
[0017]重層被包物質の使用に際し、細胞培養は、培地中に1またはそれより多い細胞を含むことも可能である。好ましくは、1またはそれより多い細胞は:
卵子;
接合子;
胚;
動物/ヒト由来胚性幹細胞(単数または複数);
適切な多能性誘導体(単数または複数)および/または分化した子孫;
損なわれていない(intact)または分散した組織および/または損なわれていない生物
の少なくとも1または組み合わせを含む。
各々特定の化学的、生物物理学的および分光学的特性を示す、
合成モノマー(単数または複数);
オリゴマーまたはポリマー;
ポリアルファオレフィンの化学的誘導体および/またはコポリマー
の1または組み合わせを含む、合成小分子組成物である。
[0020]態様のさらなる側面において、合成化合物は、長鎖、短鎖および環状炭化水素の1または組み合わせを含む。これに関連して、合成化合物は、それぞれ、45%長鎖、38%短鎖および17%環状の混合で、長鎖、短鎖および環状炭化水素の組み合わせを含むことも可能である。
合成化合物を含む、in vitro、ex vivoおよび/またはin vivo操作で利用する操作および/またはスクリーニング培地を重層する
工程を含む、前記方法を提供する。好ましくは、合成化合物は合成油である。
i)よく定義された化学的および/または生物物理学的特性を持つ厳格に管理されたポリマー、
ii)小分子、
iii)空気より重い不活性ガス
の1つによって例示される、前記重層被包物質を提供する。
pH、
アンモニア濃度、
モル浸透圧濃度、
反応酸素種の存在、および
不揮発性有機化合物の存在
の1または組み合わせを含むことも可能である。
ビタミン、
ホルモン、
増殖因子、
栄養素、
保護剤、
酸化還元トラップ、
アミノ酸およびその誘導体、
ペプトイド、
ペプチド、
タンパク質、
抗体および適切な誘導体、断片および全長オリゴヌクレオチドならびにその合成誘導体
の1または組み合わせを含む補充供給源として用いられるよう適応している、合成化合物を含むin vitro細胞培養のための重層被包物質を提供する。
元素感受性タンパク質、
細胞または細胞培養、
多起源組織または組織培養、および
損なわれていない生物
の1またはそれより多くを伴うスクリーニングまたは生物学的操作に用いられるよう適応している、合成化合物を含むin vitro細胞培養のための重層被包物質を提供する。
各々特定の化学的、生物物理学的および分光学的特性を示す、
合成モノマー(単数または複数);
オリゴマー/ポリマー;
ポリアルファオレフィンの化学誘導体および/またはコポリマー
の1または組み合わせを含む、合成小分子(モノマー、独立型化合物)、オリゴマーまたはポリマーを含む、完全合成油である、合成油である合成化合物を含む。
検出限界内で、慣用的な分析技術、例えばNMR、HPLC、LCMSおよび他のものによって記載されるような、そしてi)よく定義された化学的および/または生物物理学的特性を持つ、厳格に管理されたポリマー、ii)小分子、iii)空気より重い不活性ガスによって例示されるような、よく定義された化学組成媒体。好ましくは、不活性ガスの形で、Arは排除される。
任意のUV/UV可視/IR光吸収/発光技術および/または生物物理学的方法によって例示されるような、慣用的検出技術を通じて、スクリーニング培地の監視を可能にする、化学組成媒体を含む、透明な被包物質。この意味で、スクリーニング培地は、胚培養、酵素アッセイ、細胞/組織/損なわれていない生物に基づく検出技術に適用可能でありうる。
[0029]他の側面および好ましい型は、明細書に開示され、そして/または付随する請求項に定義され、本発明の説明の一部を形成する。
1.臨床/cGMP環境へのプロトコルの容易な適応を可能にする,合成化合物のよく定義された一貫した化学組成;
2.提唱される適用の再現性、一貫性、実現可能性;
3.化学的不活性、すなわち日光、温度、空気/酸素、特殊培地構成要素に対する耐性を提供する、「活性反応物質」の非存在;
4.より優れた胚微小環境制御/被包、補充剤アクセスおよび毒性代謝物質の除去を可能にする、油(単数または複数)の最適化された(生物)物理学的および(生物)化学的特性
が含まれる。
・食品等級合成油ISO 220,55 Gal(http://www.grainger.com/product/CRC−Food−Grade−Synthetic−Oil−ISO−12G564)
・食品等級シリコンスプレー(Weston BrandTM、http://www.schaefferoil.com/276−food−grade−lube.html)
・Summit SyngearTM食品等級(FG)完全合成潤滑剤(http://www.klsummit.com/products/lubricant/syngear−fg−series)
・SprayonTM LU209食品等級合成油(http://www.sprayon.com/product−categories/industrial−lubricants/food−grade−synthetic−oil−aerosol−lu209)
・LubriplateTM NSF H1登録食品機械潤滑剤(https://www.lubriplate.com/Products/NSF−H−1−Registered−Food−Machinery−Lubricants.aspx)
[0038]態様に関して、重要な選択基準には、以下が含まれる:
1. 仮の分子量MW<5,000Dを持つ真の有機小分子油。好ましい候補は、限定されるわけではないが、長鎖アルカン、シクロアルカン、長鎖脂肪族アルコール、エーテル、エステル、アミド、ラクトン、ラクタム等を含む、例示されるようなよく特徴付けされた「不活性」モノマーまたはポリマーである。
3. 一般的に安全と認識される、すなわちGRASである、合成またはよく定義された天然起源油;
4. 有機および無機物質の両方を含む、よく定義された化学組成および(微量)不純物;
5. 例えば日光、空気/酸素および温度などに対する、化学的安定性および不活性性。生物学的安定性/不活性性、胚および/または適切なオリゴヌクレオチド、タンパク質、細胞、組織、損なわれていない生物単離/被包潜在能力;
6. 選択基準5に定義される目的と適合する物理学的特性。これらは、揮発性、融点、沸点、独立型安全性、引火点、分子量、粘性範囲、表面張力、気体/液体拡散/混和性潜在能力等を含む;
7. 化合物の蒸発防止を可能にする、したがってモル浸透圧濃度、温度およびpH変動を防止するため、培地の重層として使用されることを可能にする、物理学的特性;
8. 好ましい添加剤でのアクセス、修飾、相乗潜在能力の実現可能性、および使用/操作の容易さ;
9. 商業的実現可能性。
−i)空気/酸素、UV光感受性、モル浸透圧濃度、pHタンパク質のin vitro操作(保管、分配、スクリーニング)。例えば、サイトカインおよびケモカインタンパク質ファミリーによって例示されるような、多数のSHおよび/またはS−S結合を含む生体分子;限定されるわけではないがヒストン脱アセチル化酵素、ヒストン脱メチル化酵素、ヒストンアセチラーゼ、メタロプロテイナーゼ、ヒドロラーゼ等を含むエピジェネティックターゲットによって例示されるような、限定されるわけではないが、Zn、Mg、Mn、Cu、Feを含む、配位金属(単数または複数)を特徴とするタンパク質/酵素;
−ii)q−PCR、トランスフェクションおよび遺伝子編集技術によって例示されるような、限定されるわけではないが、内因性、損なわれていない、断片化、化学修飾DNA、mRNA、shRNA、siRNA、miRNAを含む、任意のヌクレオチド配列のin vitro操作;
−iii)限定されるわけではないが、ヒト/動物由来の胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、これらの直接または進行(分化)派生物、幹細胞の遺伝子操作派生物等によって例示されるような幹細胞(単数または複数)またはその適切な派生物(単数または複数)の任意の操作を含む、細胞に基づくスクリーニング;
−iv)限定されるわけではないが、マイクロタイター、ミディまたはマクロプレート、微量流体デバイス、静置、懸濁液滴、流動システムまたは類似のものを含む、適切な処理容器中の任意の細胞培養。これらの細胞培養には、限定されるわけではないが、ヒト/動物胚/細胞、臓器/組織由来ニューロン、心筋細胞、線維芽細胞、肝細胞、腎臓細胞によって例示されるような、特定の分化したヒト/動物細胞;幹細胞/初代細胞/癌細胞/他の不死化細胞、遺伝子改変/操作された細胞、安定および/または一過性トランスフェクション細胞、蛍光、放射能、ラジカルおよび/または他の検出機能で標識された細胞等が含まれる。
−vi)ウニ胚、ゼブラフィッシュによって例示されるような、関心対象のおよび/または損なわれていない生物の、損なわれていないまたは懸濁された組織を用いた、スクリーニング(例えばマトリジェルに基づくクローン原性アッセイ(単数または複数))、および恒常性の維持が非常に重要である他のin vivoアッセイ(単数または複数)。
[0045]本発明の態様に伴う本発明者らが実施した試験の実験結果は以下の通りである:
目的
[0046]細胞および胚培養において、3つの合成化合物の実現可能性に関する予備的試験を実行すること。
1.1. 実験法
[0047]材料:
[0048]試験化合物:
・化合物1
・化合物2
・化合物3
[0049]製造者より入手可能なパンフレットにしたがって、選択した試験化合物は、パラフィン性合成油と高純度炭化水素に基づく油圧(hydraulic)および潤滑化合物である。これらは基油(basic oil)および添加剤の組み合わせであり、食品加工産業で使用可能である。特に、化合物1は、短鎖、長鎖および分岐、完全飽和炭化水素の混合物であり、芳香族群は存在しない。化合物1の範囲に属するであろう、適切な候補の例は、情報源:「TURMOSYNTHTM VGシリーズ技術情報」に見られ、そして技術情報を以下の表1に提示する。
[0050]3つの選択した化合物の合成のための製造プロセスは、混合容器内での特定の原材料の組み合わせを含む。これは、天然産物(未精製油)の分留および精製を伴い、最終産物に到達するミネラルオイルプロセスとは異なる。
・手動で継代、マウス線維芽細胞フィーダー層上で培養
・Nunc IVF 1ウェルプレート上、KnockOutTM血清置換16(「KSR」)培地中、37℃、6%CO2、5%O2および89%N2の巨大インキュベーター中で細胞を培養
[0052]用いたhESC株は、手動で継代したヒト胚性幹細胞株であった。実験用のプレートは、以前の継代後、8日目のhESCコロニーを手動で切り出しそして除去した後に残ったプレートであった。残ったコロニーはなお培養可能であるが、最終的に分化し始め、そして多能性を失い、そして適切にフィードされない場合は変性すらする。各プレートは異なる細胞株および継代数由来の細胞を含有した。
[0056]すべての試験化合物下でhESCは増殖し続け、そして第7日に多能性を示した。図1〜4は、それぞれ、SageTM IVFオイル、化合物1、化合物2および化合物3の重層下で培養した培養7日後の細胞を示す。化合物3の重層下で培養した細胞の発生は、SageTM IVFオイル(対照)の重層下で培養したものと非常に類似である。化合物1および化合物2の重層下で培養した細胞は、完全な単層は形成しなかったが、単に変性したわけではなく、そしてしたがって化合物1および化合物2は、直ちに細胞傷害性ではなかった。しかし、これらは、化合物3またはSageTM IVFオイルほど適切に、細胞増殖のための環境を提供しない可能性もある。
[0058]この実験で用いた細胞は、単細胞ではなく、コロニーとして維持され、そして継代されたhESC株であった。この培養法は、なお、ヒト胚から新規株を最初に得る際に用いられる方法であり、そしてまた初期継代にも用いられ、幹細胞株の完全性を最適に維持し、そして特に単細胞として酵素的に継代した場合に、より後の継代で生じうるような染色体変動を回避する。
[0060]幹細胞は、すべての化合物の重層を適用した際、生存し、そして増殖した。化合物3の重層下で培養した細胞は、対照(SageTM IVFオイル)と類似の増殖を示した。化合物1および化合物2の重層下で培養した細胞は、化合物3およびSageTM IVFオイル下の細胞に関して見られうるような完全な単層を形成しなかったが、なお、増殖を示し、そして培養7日後も死ななかった。したがって、いずれの化合物も細胞傷害性ではなく、そしてすべて細胞増殖を可能にしたことが明らかである。さらに、試料各々における3つの多能性マーカーすべての蛍光を示す画像から、hESCが、すべての試験および対照化合物下で7日間培養した後、その多能性を維持したことが見てとれる。
2.1. 実験法
[0061]材料:
[0062]試験化合物:
・化合物1
・化合物2
・化合物3
[0063]SageTM IVFオイル(対照)
[0064]Single−Stepヒト胚培養培地
[0065]Falcon(登録商標)60mmプレート
[0066]2PN段階のマウス胚
[0067]60mm Falcon(登録商標)ペトリ皿を、マウス胚のルーチンの培養の通りに、Single−Stepヒト胚培地およびSageTM IVFオイル(対照化合物)、化合物1、化合物2または化合物3(試験化合物)とともに調製した。簡潔には、9x20μlの液滴を、6mlの対照または試験化合物下に調製し、そしてCook MINCTMインキュベーター17中、+37℃、6%CO2、5%O2および89%N2で一晩平衡化させた。翌日(第1日)、卵丘細胞を取り除いた後、2PN段階にあると分類された胚を液滴中に入れた。各液滴には10を超えない胚を入れた。次いで、第2、5、6および7日、ルーチンのマウス胚アッセイ(MEA)プロトコルにしたがって、発生に関して胚を評価した。
[0068]胚発生および品質は、評価のすべての段階で、対照および化合物3の間で匹敵した。培地を化合物1または化合物2で重層した際、胚は最初の細胞分裂前に変性した。したがって、化合物1および化合物2は幹細胞に対して毒性ではないが、これらはどちらも胚に対しては明らかに毒性である。
[0069]化合物3での培地の重層は、胚が胚盤胞段階に完全に発生することを可能にした。発生した胚の量およびその品質は、対照および試験群間で統計的に異ならなかった。化合物1または化合物2での培地の重層は、ほぼ即時の胚変性を引き起こした。
Claims (18)
- 合成化合物を含むin vitro細胞培養のための重層被包物質(encapsulant)。
- 細胞培養が、培地中に1またはそれより多い細胞を含む、請求項1記載の重層被包物質。
- 1またはそれより多い細胞が:
卵子;
接合子;
胚;
動物/ヒト由来胚性幹細胞(単数または複数);
適切な多能性誘導体(単数または複数)および/または分化した子孫;
損なわれていない(intact)または分散した組織および/または損なわれていない生物
の少なくとも1または組み合わせを含む、請求項2記載の重層被包物質。 - 合成化合物が、検出限界内で、慣用的な分析技術を通じて同定されるような、明確な化学組成を示し、そして:
各々特定の化学的、生物物理学的および分光学的特性を示す、
合成モノマー(単数または複数);
オリゴマーまたはポリマー;
ポリアルファオレフィンの化学誘導体および/またはコポリマー
の1または組み合わせを含む、合成小分子組成物である、請求項1、2または3記載の重層被包物質。 - 合成化合物が少なくとも1つの炭化水素を含む、請求項1または4記載の重層被包物質。
- 合成化合物が修飾炭化水素を含む、請求項1、4または5記載の重層被包物質。
- 修飾炭化水素がフッ素化炭化水素を含む、請求項6記載の重層被包物質。
- 合成化合物が、長鎖、短鎖および環状炭化水素の1または組み合わせを含む、請求項1、4または5記載の重層被包物質。
- 合成化合物が、それぞれ、45%長鎖、38%短鎖および17%環状の混合で、長鎖、短鎖および環状炭化水素の組み合わせを含む、請求項8記載の重層被包物質。
- 合成化合物を細胞培養に重層する工程を含む、in vitro細胞培養の一時的被包のための方法。
- in vitro、ex vivoおよび/またはin vivo操作のための、タンパク質(単数または複数)、DNA、RNA配列(単数または複数)、適切な構築物(単数または複数)および/または誘導体(単数または複数)、その化学的修飾または派生類似体の少なくとも1つの一時的被包のための方法であって:
合成化合物を含む、in vitro、ex vivoおよび/またはin vivo操作で利用する操作および/またはスクリーニング培地を重層する
工程を含む、前記方法。 - 検出限界内で、NMR、HPLC、LCMSの1つを含む慣用的な分析技術によって記載されるような、よく定義された化学的化合物である合成化合物を含むin vitro細胞培養のための重層被包物質であって、化合物が:
i)よく定義された化学的および/または生物物理学的特性を持つ厳格に管理されたポリマー、
ii)小分子、
iii)空気より重い不活性ガス
の1つによって例示される、前記重層被包物質。 - 合成化合物を含み、そしてそれによって被包される培地の特性および組成の変動を監視するよう適応した、in vitro細胞培養のための重層被包物質。
- 被包された培地の監視される特性および組成が:
pH、
アンモニア濃度、
モル浸透圧濃度、
反応酸素種の存在、および
不揮発性有機化合物の存在
の1または組み合わせを含む、請求項13記載の重層被包物質。 - 重層被包物質が:
ビタミン、
ホルモン、
増殖因子、
栄養素、
保護剤、
酸化還元トラップ、
アミノ酸およびその誘導体、
ペプトイド、
ペプチド、
タンパク質、
抗体および適切な誘導体、断片および全長オリゴヌクレオチドならびにその合成誘導体
の1または組み合わせを含む補充供給源として用いられるよう適応している、合成化合物を含むin vitro細胞培養のための重層被包物質。 - 重層被包物質が:
元素感受性タンパク質、
細胞または細胞培養、
多起源組織または組織培養、および
損なわれていない生物
の1またはそれより多くを伴うスクリーニングまたは生物学的操作に用いられるよう適応している、合成化合物を含むin vitro細胞培養のための重層被包物質。 - 本明細書に開示するような被包物質、化合物または製品。
- 本明細書に開示するような方法またはプロトコル。
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