JP2018198576A - Method for improving intracellular activity in botryococcene biosynthetic pathway and enzyme mutant obtained by method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、スクアレン合成酵素様（Squalene Synthase-Like、以下、SSLと略称する場合もある。）酵素変異体の作出方法、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及び該スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法の発明に関する。 The present invention relates to a method for producing a squalene synthase-like (hereinafter also abbreviated as SSL) enzyme mutant, a squalene synthase-like (SSL) enzyme variant, and the squalene synthase-like (SSL) ) It relates to an invention of a method for producing botryococcene using enzyme mutants.
真核藻類ボトリオコッカスの一種ボトリオコッカス ブラウニー（Botryococcus braunii）が高濃度に蓄積するトリテルペノイドとして、ボトリオコッセン（Botryococcene）がある。トリテルペノイドはC30の分子骨格を持つイソプレノイドの総称であり、大きく、カロテノイドとステロイドの２つに分類される。 Botryococcene is a triterpenoid that accumulates in a high concentration of Botryococcus braunii, a kind of eukaryotic algae, Botryococcus braunii. Triterpenoids are a general term for isoprenoids having a C30 molecular skeleton, and are broadly classified into carotenoids and steroids.
ボトリオコッセンは、良質な次世代燃料としての利用価値が注目を浴びている。また、ボトリオコッカスのレース（Race）によっては、その末端を部分環化した特殊な構造の炭化水素を蓄積するものも知られており、該特殊な構造に拠る特徴的な物性のボトリオコッセンを発現するボトリオコッカスの存在も期待し得る。 Botryococsen is attracting attention for its value as a high-quality next-generation fuel. In addition, some botryococcus races (Race) are known to accumulate hydrocarbons with a special structure that is partially cyclized at the end, expressing botryococcene with characteristic physical properties based on the special structure. The presence of Botryococcus can also be expected.
ボトリオコッセンの生合成機構は、カロテノイドやスクアレン（Squalene）の生合成機構と類似している。ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレンの生合成機構は、２分子のファルネシル二リン酸（Farnesyl diphosphate、以下、FPPと略すこともある。）を縮合させて、中間体であるプレスクアレン二リン酸（Presqualene diphosphate、以下、PSPPと略すこともある。）を生じる第１反応工程が共通する。ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレンの生合成機構は、第２反応工程の途中のプレスクアレン二リン酸からピロリン酸脱離によって生じたカルボカチオンのクエンチング過程後の反応が相違し、ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレンの最終産物が作り分けられる（図１）。 The biosynthesis mechanism of botryococcene is similar to that of carotenoids and squalene. The biosynthetic mechanism of botryococcene, carotenoid, and squalene is the condensation of two molecules of farnesyl diphosphate (hereinafter sometimes abbreviated as FPP), and the intermediate presqualene diphosphate (Presqualene diphosphate, Hereinafter, the first reaction step for generating PSPP) is also common. The biosynthetic mechanism of botryococcene, carotenoid and squalene is different in the reaction after quenching process of carbocation generated by elimination of pyrophosphate from presqualene diphosphate during the second reaction step. The final product is created separately (Figure 1).
ボトリオコッセン（以下、BOと略すこともある。）の生合成では、２分子のファルネシル二リン酸(FPP)からプレスクアレン二リン酸(PSPP)が生じる第１反応工程をスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）が触媒し、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からボトリオコッセンが生じる第２反応工程をスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）が触媒する（図１）。 In the biosynthesis of botryococcene (hereinafter abbreviated as BO), the first reaction step in which presqualene diphosphate (PSPP) is generated from two molecules of farnesyl diphosphate (FPP) is the squalene synthase-like enzyme 1 ( SSL1) catalyzes, and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) catalyzes the second reaction step in which botryococcene is produced from presqualene diphosphate (PSPP) (FIG. 1).
ボトリオコッカス ブラウニーレースBからスクアレン合成酵素様（SSL）酵素遺伝子が単離され、SSL1及びSSL3の両遺伝子の共発現が効率のよいボトリオコッセン生合成を示すことが報告されている（非特許文献１）。 A squalene synthase-like (SSL) enzyme gene has been isolated from Botryococcus brownie lace B, and it has been reported that co-expression of both SSL1 and SSL3 genes exhibits efficient botryococcene biosynthesis (Non-patent Document 1) ).
プレスクアレン二リン酸(PSPP)からスクアレン（以下、SQと略すこともある。）が合成される反応はスクアレン合成酵素（SQS）が触媒する（図１）。デヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）は、スクアレンを基質としてデヒドロスクアレン（DSQ）を産生する（非特許文献２、図１）。
黄色ブドウ球菌由来のデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）は、スクアレンを色素（ジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）／ジアポリコペン(Diapolycopene)）に直接変換できる（非特許文献３）。
The reaction in which squalene (hereinafter sometimes abbreviated as SQ) is synthesized from presqualene diphosphate (PSPP) is catalyzed by squalene synthase (SQS) (FIG. 1). Dehydrosqualene desaturase (CrtN) produces dehydrosqualene (DSQ) using squalene as a substrate (Non-Patent Document 2, FIG. 1).
Dehydrosqualene desaturase (CrtN) derived from Staphylococcus aureus can directly convert squalene to a pigment (Diaponeurosporene / Diapolycopene) (Non-patent Document 3).
上述のとおり、SSL3は、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からボトリオコッセンが生じる反応工程を触媒する（図１）。ここで、SSL3の２つのアミノ酸置換（N171A及びG207Q；番号はGenBank アクセッション番号: HQ585060.1で特定されるSSL3のアミノ酸配列中のアミノ酸位置を特定するものであり、番号の前後のアルファベットはアミノ酸の１文字表記であり、番号の前に記載のアミノ酸から番号の後に記載のアミノ酸に置換されたものを意味する。）によって、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からスクアレンにほぼ完全に変換できることが報告されている（非特許文献４）。しかしながら、SSL3におけるN171AまたはG207Qのそれぞれの単一のアミノ酸置換では、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からスクアレンへの完全変換は起こらない（非特許文献４）。このように、プレスクアレン二リン酸(PSPP)からスクアレンに変換できるアミノ酸変異を有するSSL酵素変異体を得ることは容易ではない。 As described above, SSL3 catalyzes the reaction process in which botriococcene is produced from presqualene diphosphate (PSPP) (FIG. 1). Here, two amino acid substitutions of SSL3 (N171A and G207Q; the numbers indicate the amino acid positions in the SSL3 amino acid sequence specified by GenBank accession number: HQ585060.1, and the alphabets before and after the numbers are amino acids. Can be converted almost completely from presqualene diphosphate (PSPP) to squalene by the substitution of the amino acid described before the number with the amino acid described after the number. It has been reported (Non-Patent Document 4). However, the single amino acid substitution of N171A or G207Q in SSL3 does not cause complete conversion of presqualene diphosphate (PSPP) to squalene (Non-patent Document 4). Thus, it is not easy to obtain an SSL enzyme mutant having an amino acid mutation that can be converted from presqualene diphosphate (PSPP) to squalene.
ボトリオコッセンは安定な炭化水素化合物であり、有機溶媒抽出でほぼ定量的に細胞からボトリオコッセンを取り出すことができる。しかし、ボトリオコッセンを直接検出・定量するためには、他のトリテルペノイド類と同様に、ガスクロマトグラフィー等を利用した手間のかかる分析操作が必要となる。そのため、ボトリオコッセン合成活性の高いSSL1及びSSL3（以下、SSL1/SSL3ということもある。）を従来のボトリオコッセンの定量を行いつつスクリーニングすること又は作出することは困難である。これが、SSL1/SSL3の活性改良などの試みを阻んできた最大の理由である。 Botryococcene is a stable hydrocarbon compound and can be extracted from cells almost quantitatively by organic solvent extraction. However, in order to directly detect and quantify botryococcene, as with other triterpenoids, a time-consuming analytical operation using gas chromatography or the like is required. Therefore, it is difficult to screen or produce SSL1 and SSL3 (hereinafter sometimes referred to as SSL1 / SSL3) having high botryococcene synthesis activity while quantitatively determining conventional botryococcene. This is the biggest reason that has prevented attempts to improve SSL1 / SSL3 activity.
ボトリオコッセンの結晶構造の取得とそれに立脚した機能改良の努力が世界各国で行われているが、良好な回析像（diffractionイメージ）が取れないなどの理由から、未だにその成功例はない。 Efforts have been made around the world to acquire the crystal structure of botryococcene and to improve its functions. However, there have been no successful examples because of the lack of good diffraction images.
本発明が解決しようとする課題は、ボトリオコッセンの定量による産生物を基としてのボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出方法に代わる、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出方法を提供すること、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及びスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法を提供することである。 The problem to be solved by the present invention is that a squalene synthase-like (SSL) substitute for a screening method or a production method of a squalene synthase-like (SSL) enzyme variant that promotes the ability to synthesize botryococcene based on the product of quantification of botryococcene. It is to provide a screening method or production method of an SSL) enzyme mutant, and to provide a method for producing botriococccene using a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant and a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant. .
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、分析操作に手間がかかるボトリオコッセンの直接定量を行うことなく、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出を行うために、ボトリオコッセン合成経路においてSSL1/SSL3が関わるボトリオコッセン合成工程を幾つかの工程に分けて段階的に改良することにより、本発明を完成させた。 The present inventors have intensively studied to solve the above-mentioned problems, and a screening method for a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant that promotes the ability to synthesize botryococcene without directly quantifying botryococcene, which requires laborious analytical operations. Alternatively, the present invention was completed by stepwise improving the botryococcene synthesis process involving SSL1 / SSL3 in several steps in order to produce the botryococcene synthesis route.
すなわち、本発明は以下からなる：
１． ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（squalene synthase-like、SSL）酵素変異体の作出方法であって、
（１）ボトリオコッセン合成に係わるスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）遺伝子及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）遺伝子を含むプラスミドを構築し、次にSSL3遺伝子に変異を導入した変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）発現プラスミドが導入された宿主細胞に導入し、色素の蓄積を指標として、スクアレン合成能を促進させるSSL3遺伝子変異体を有する宿主細胞（1-gen変異体）を取得する工程、
（２）工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を含むプラスミドを親（出発原材料）として、SSL1/SSL3変異体遺伝子領域に変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された宿主細胞に導入し、1-gen変異体の色素蓄積量との比較で色素蓄積量の増加を指標として、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子を有する宿主細胞（2-gen変異体）を取得する工程、及び
（３）工程（２）で得られた2-gen変異体のSSL1/SSL3変異体遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうち、工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうちボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与していない変異を、野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質の対応するアミノ酸で再置換する変異を導入し、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する宿主細胞（3-gen変異体）を取得する工程、
を含む、方法。
２． （３）の工程が、野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、（２）の工程で得られた2-gen変異体が持つ変異のうち、（１）の工程で得られた1-gen変異体が持たない、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入することにより、3-gen変異体を取得する工程である、前項１に記載の方法。
３． （２）の工程において、ボトリオコッセンに対するスクアレンの産生比率が高まることによって色素蓄積量が増加した宿主細胞を除去する工程をさらに含む、前項１又は２に記載の方法。
４． エラープローンPCR（Error-prone PCR）により変異プラスミド・ライブラリーを作製する、前項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５． 3-gen変異体が野生型のSSL3遺伝子においてSSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に変換されたF137L変異をコードする核酸配列で置換された変異のみを持つSSL3遺伝子を持つ宿主細胞である、前項１に記載の方法。
６． ボトリオコッセン合成能を促進させるSSL酵素変異体の作出方法であって、
（１）ボトリオコッセン合成に係わるSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を含むプラスミドを構築し、次にSSL3遺伝子にエラープローンPCRにより変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された大腸菌に導入し、黄色色素の蓄積を指標として、スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL3遺伝子であって、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異であるSSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異を少なくとも導入されたSSL3遺伝子を有する大腸菌（1-gen変異体）を取得する工程、
（２）工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を含むプラスミドを出発原材料として、SSL1/SSL3変異体遺伝子領域にエラープローンPCRにより変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された大腸菌に導入し、1-gen変異体の黄色色素蓄積量との比較で黄色色素蓄積量の増加を指標として、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子を有する大腸菌（2-gen変異体）を取得する工程、及び
（３）野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、（２）の工程で得られた2-gen変異体が持つ変異のうち、（１）の工程で得られた1-gen変異体が持たない、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入することにより、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する大腸菌（3-gen変異体）を取得する工程、
を含む、方法。
７． 前項１〜６のいずれか１項に記載の方法と組み合わせて、次の工程として3-gen変異体を培養する工程を含む、ボトリオコッセンの製造方法。
８． SSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異のみを持つ、SSL3変異体。
９． 前項８に記載のSSL3変異体を発現する宿主細胞。
１０． 前項９に記載の宿主細胞を培養することを含む、ボトリオコッセンの製造方法。１１． 宿主細胞が大腸菌、枯草菌、酵母、藻類のいずれかである、前項１０に記載の方法。
That is, the present invention comprises:
1. A method for producing a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant that promotes the synthesis of botryococcene,
(1) A plasmid containing a squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) gene and a squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) gene involved in the synthesis of botryococcene is constructed, and then a mutation plasmid library in which mutations are introduced into the SSL3 gene A host having an SSL3 gene variant that is prepared and introduced into a host cell into which a dehydrosqualene desaturase (CrtN) expression plasmid has been introduced, and that promotes squalene synthesis, using pigment accumulation as an indicator Obtaining a cell (1-gen mutant),
(2) SSL1 / SSL3 mutation using as a parent (starting material) a plasmid containing the SSL1 gene of the 1-gen mutant obtained in step (1) and the SSL3 gene into which the mutation has been introduced (SSL1 / SSL3 mutant gene) Mutation is introduced into the somatic gene region, a mutant plasmid library is prepared, the plasmid library is introduced into a host cell into which the CrtN expression plasmid has been introduced, and the amount of dye accumulated is compared with the amount of dye accumulated in the 1-gen mutant. Obtaining a host cell (2-gen mutant) having an SSL1 / SSL3 mutant gene introduced with a mutation that promotes the ability to synthesize botryococcene and squalene, using the increase in accumulation amount as an index; and (3) step (2 Among the amino acid mutations of the protein encoded by the SSL1 / SSL3 mutant gene of the 2-gen mutant obtained in step 1), the amino acid mutation of the protein encoded by the SSL3 gene of the 1-gen mutant obtained in step (1) Out of Introduce a mutation that does not specifically contribute to the promotion of ococsen synthesis ability, and replaces it with the corresponding amino acid of the protein encoded by the wild-type SSL3 gene. Obtaining a host cell (3-gen mutant) having an SSL1 gene and an SSL3 gene into which a mutation to be introduced is introduced,
Including a method.
2. Among the mutations of the 2-gen mutant obtained in the step (2) in the wild-type SSL1 gene and SSL3 gene in the step (3), the 1-gen mutation obtained in the step (1) 2. The method according to item 1 above, which is a step of obtaining a 3-gen mutant by introducing a mutation that specifically does not contribute to the promotion of botryococcene synthesis ability.
3. 3. The method according to item 1 or 2, further comprising the step of removing a host cell having an increased pigment accumulation amount due to an increase in the production ratio of squalene to botryococcene in the step (2).
4). 4. The method according to any one of items 1 to 3, wherein a mutant plasmid library is prepared by error-prone PCR.
5. The 3-gen mutant is a nucleic acid sequence encoding the F137L mutation in which the 137th amino acid shown in the amino acid sequence of SSL3 (SEQ ID NO: 4) in the wild-type SSL3 gene is converted from phenylalanine (F) to leucine (L). 2. The method according to item 1 above, which is a host cell having an SSL3 gene having only a substituted mutation.
6). A method for producing an SSL enzyme mutant that promotes the ability to synthesize botryococcene,
(1) A plasmid containing the SSL1 gene and SSL3 gene involved in the synthesis of botryococcene is constructed, and then mutation is introduced into the SSL3 gene by error-prone PCR to produce a mutant plasmid library. The plasmid library is a CrtN expression plasmid Is an SSL3 gene introduced into Escherichia coli into which is introduced, and a mutation that promotes squalene synthesis ability using the accumulation of yellow pigment as an index, and that promotes botryococcene synthesis ability without promoting squalene synthesis ability Escherichia coli (1-gen mutant) having the SSL3 gene introduced with at least the F137L mutation in which the 137th amino acid shown in the amino acid sequence of SSL3 (SEQ ID NO: 4) is replaced with leucine (L) from phenylalanine (F) Process to acquire,
(2) SSL1 / SSL3 mutant gene region using as a starting material the plasmid containing the SSL1 gene of the 1-gen mutant obtained in step (1) and the SSL3 gene into which the mutation has been introduced (SSL1 / SSL3 mutant gene) A mutation plasmid library was prepared by introducing mutations into error-prone PCR, and the plasmid library was introduced into E. coli into which the CrtN expression plasmid was introduced, and compared with the amount of yellow pigment accumulated in the 1-gen mutant. Obtaining an Escherichia coli (2-gen mutant) having an SSL1 / SSL3 mutant gene introduced with a mutation that promotes the ability to synthesize botryococcene and squalene, using an increase in yellow pigment accumulation as an index, and (3) wild type Among the mutations of the 2-gen mutant obtained in the step (2) in the SSL1 gene and SSL3 gene, the ability to synthesize botryococcene, which the 1-gen mutant obtained in the step (1) does not have Specific to promotion Step of obtaining by introducing contributing mutation, E. coli (3-gen variants) having SSL1 gene and SSL3 gene mutation has been introduced to promote Botoriokossen synthesizing ability without promoting squalene synthesizing ability to,
Including a method.
7). A method for producing botryococcene, comprising the step of culturing a 3-gen mutant as the next step in combination with the method according to any one of items 1 to 6.
8). An SSL3 variant having only the F137L mutation in which the amino acid at position 137 shown in the amino acid sequence of SSL3 (SEQ ID NO: 4) is substituted from phenylalanine (F) to leucine (L).
9. A host cell that expresses the SSL3 variant according to item 8 above.
10. 10. A method for producing botryococcene, comprising culturing the host cell according to item 9 above. 11. 11. The method according to item 10 above, wherein the host cell is any one of Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, and algae.
本発明によれば、分析操作に手間がかかるボトリオコッセンの直接定量を行うことなくボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体をスクリーニングすること又は作出することが可能となり、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及びスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to screen or create a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant that promotes the ability to synthesize botryococcene without directly quantifying botryococcene, which requires laborious analytical operations. A method for producing botryococcene using a squalene synthase-like (SSL) enzyme variant and a squalene synthase-like (SSL) enzyme variant that promotes the ability can be provided.
本発明は、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング方法又は作出方法、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体及びスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を利用したボトリオコッセンの製造方法の発明に関する。 The present invention relates to a method for screening or producing a squalene synthase-like (SSL) enzyme variant, a squalene synthase-like (SSL) enzyme variant, and a method for producing botryococcene using a squalene synthase-like (SSL) enzyme variant. Relates to the invention.
ボトリオコッセンとは、C30の分子骨格を持つイソプレノイドであるトリテルペノイドの一種である。藻類ボトリオコッカスの一種ボトリオコッカスブラウニー（Botryococcus braunii）がボトリオコッセンを生合成し、高濃度にボトリオコッセンを蓄積することが知られている。
トリテルペノイドであるボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレンの生合成機構は、類似しており、２分子のファルネシル二リン酸(FPP)から中間体であるプレスクアレン二リン酸(PSPP)が生じる第１反応工程が共通する。一方、第２反応工程の途中の中間体であるプレスクアレン二リン酸からピロリン酸脱離によって生じたカルボカチオンのクエンチング過程後の反応が相違し、ボトリオコッセン、カロテノイド、スクアレン(SQ)の最終産物が作り分けられる。
「ボトリオコッセンを選択的に蓄積する」とは、トリテルペノイドの生合成において、スクアレン (SQ)の生産が殆どみられず、ボトリオコッセンが生産されていることを意味する。
Botriococcene is a type of triterpenoid, which is an isoprenoid having a C30 molecular skeleton. It is known that Botryococcus braunii, a kind of algae Botryococcus, biosynthesizes Botryococcusen and accumulates Botryococcene at a high concentration.
The biosynthetic mechanisms of triterpenoids botryococcene, carotenoids, and squalene are similar, and they share the same first reaction step in which two molecules of farnesyl diphosphate (FPP) produce an intermediate, presqualene diphosphate (PSPP). To do. On the other hand, the reaction after the quenching process of carbocation produced by elimination of pyrophosphate from presqualene diphosphate, which is an intermediate in the second reaction step, is different, and the final products of botryococcene, carotenoid and squalene (SQ) Are made separately.
“Selectively accumulate botriococcene” means that squalene (SQ) is hardly produced in the biosynthesis of triterpenoids and botriococcene is produced.
ボトリオコッセンの生合成では、２分子のファルネシル二リン酸(FPP)から中間体であるプレスクアレン二リン酸(PSPP)が生じる第１反応工程をスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）が触媒し、中間体であるプレスクアレン二リン酸(PSPP)からボトリオコッセンが生じる第２反応工程をスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）が触媒する。本明細書において、スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）はボトリオコッセン合成酵素ともいう。
スクアレン合成酵素様（squalene synthase-like、SSL）酵素は、ボトリオコッカス ブラウニー（Botryococcus braunii）が保持するスクアレン合成酵素(BSS)に類似した酵素をコードする３つの遺伝子として見出されたものであり、スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）、スクアレン合成酵素様酵素２（SSL2）、及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）からなる（非特許文献１）。
In the biosynthesis of botryococcene, squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) catalyzes the first reaction step in which presqualene diphosphate (PSPP), an intermediate, is formed from two molecules of farnesyl diphosphate (FPP). Squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) catalyzes the second reaction step in which botryococcene is produced from the body presqualene diphosphate (PSPP). In this specification, squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) are also referred to as botryococcene synthase.
The squalene synthase-like (SSL) enzyme was found as three genes encoding enzymes similar to the squalene synthase (BSS) held by Botryococcus braunii. Squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1), squalene synthase-like enzyme 2 (SSL2), and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) (Non-patent Document 1).
本明細書において、「スクアレン合成酵素様（SSL）酵素」の範囲には、ボトリオコッセン生合成の各過程に係わるボトリオコッセン合成酵素のいずれも含まれる。また、ボトリオコッセン合成酵素は、酵素活性等のその基本的な性質が阻害されない限りにおいて、そのアミノ酸配列のＮ末端側やＣ末端側に別のタンパク質等、例えばヒスチジンタグ等のタグペプチドが付加されたものであってもよい。ボトリオコッセン合成酵素は、各種生物内に有している天然の酵素であってもよいし、変異体であってもよい。「（組換え）スクアレン合成酵素様(SSL)酵素変異体」とは、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素がそのタンパク質の一部のアミノ酸残基の置換、欠失、付加等により変異したタンパク質の概念である。
このようなSSL変異体としては、SSL1変異体、SSL3変異体が挙げられ、SSL3変異体の具体例としては、アミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異のみを持つSSL3変異体がある。
In the present specification, the range of “squalene synthase-like (SSL) enzyme” includes any of the botryococcene synthases involved in each process of botryococcene biosynthesis. Botryococcene synthase has another protein added to the N-terminal side or C-terminal side of its amino acid sequence, for example, a tag peptide such as a histidine tag, as long as its basic properties such as enzyme activity are not inhibited. It may be a thing. The botryococcene synthase may be a natural enzyme contained in various organisms or a mutant. “(Recombinant) squalene synthase-like (SSL) enzyme variant” refers to a protein in which squalene synthase-like (SSL) enzyme is mutated by substitution, deletion, addition, etc. of some amino acid residues of the protein. It is a concept.
Examples of such SSL mutants include SSL1 mutants and SSL3 mutants. Specific examples of SSL3 mutants include the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of which amino acid 137 is phenylalanine (F) to leucine. There are SSL3 mutants with only the F137L mutation replaced by (L).
本明細書において、置換変異の起こったアミノ酸残基を「F137L」のように、アミノ酸一文字表記と番号との組み合わせによって表現する。
本明細書において、該番号は配列表の配列番号又はGenBank等のアクセッション番号等で特定されるアミノ酸配列中のアミノ酸位置を特定するものである。番号の前後のアルファベットはアミノ酸の１文字表記であり、番号の前に記載のアミノ酸から番号の後に記載のアミノ酸に置換された変異であることを意味する。
In the present specification, an amino acid residue in which a substitution mutation has occurred is represented by a combination of an amino acid single letter code and a number, such as “F137L”.
In the present specification, the number specifies an amino acid position in an amino acid sequence specified by a sequence number in the sequence listing or an accession number such as GenBank. The alphabet before and after the number is a one-letter code of an amino acid, which means a mutation in which the amino acid described before the number is replaced with the amino acid described after the number.
本明細書では、慣例に従い、以下の通り、各アミノ酸を１文字又は３文字で表記することがある。すなわち、アラニン：A又はAla、アルギニン：R又はArg、アスパラギン：N又はAsn、アスパラギン酸：D又はAsp、システイン：C又はCys、グルタミン酸：E又はGlu、グルタミン：Q又はGln、グリシン：G又はGly、ヒスチジン：H又はHis、イソロイシン：I又はIle、ロイシン：L又はLeu、リジン：K又はLys、メチオニン：M又はMet、フェニルアラニン：F又はPhe、プロリン：P又はPro、セリン：S又はSer、トレオニン：T又はThr、トリプトファン：W又はTrp、チロシン：Y又はTyr、バリン：V又はVal、として表記することがある。 In the present specification, in accordance with common practice, each amino acid may be represented by one letter or three letters as follows. That is, alanine: A or Ala, arginine: R or Arg, asparagine: N or Asn, aspartic acid: D or Asp, cysteine: C or Cys, glutamic acid: E or Glu, glutamine: Q or Gln, glycine: G or Gly , Histidine: H or His, isoleucine: I or Ile, leucine: L or Leu, lysine: K or Lys, methionine: M or Met, phenylalanine: F or Phe, proline: P or Pro, serine: S or Ser, threonine : T or Thr, tryptophan: W or Trp, tyrosine: Y or Tyr, valine: V or Val.
（組換え）SSL酵素変異体には、SSL酵素タンパク質の一部のアミノ酸残基の置換、欠失、付加等による変異によりその酵素活性、基質特異性、および安定性等の性質に変化が生じるものがある。これに対し、変異させていないSSL酵素を野生型のSSL酵素という。 In (recombinant) SSL enzyme mutants, changes in properties such as enzyme activity, substrate specificity, and stability occur due to substitution, deletion, addition, etc. of some amino acid residues of the SSL enzyme protein. There is something. In contrast, an unmutated SSL enzyme is called a wild-type SSL enzyme.
本明細書において、SSL1及びSSL3をコードする遺伝子をそれぞれSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子という。「SSL1遺伝子及びSSL3遺伝子の変異体」とは、SSL1遺伝子及びSSL3遺伝子のＤＮＡがその一部のヌクレオチドの置換、欠失、付加等により変異した遺伝子の概念である。自然界で生じた変異でもよいし、人工的になされた変異でもよい。また、SSL1遺伝子及びSSL3遺伝子は、その機能、例えばコードするタンパク質の発現や、発現されたタンパク質の機能が阻害されない限りにおいて、そのＤＮＡの５’末端側や３’末端側に、別のタンパク質をコードする遺伝子、例えばヒスチジンタグ等のタグペプチドをコードする遺伝子が付加されたものであってもよい。 In the present specification, genes encoding SSL1 and SSL3 are referred to as SSL1 gene and SSL3 gene, respectively. The “variant of SSL1 gene and SSL3 gene” is a concept of a gene in which DNA of SSL1 gene and SSL3 gene is mutated by substitution, deletion, addition or the like of a part of its nucleotides. It may be a naturally occurring mutation or an artificially made mutation. In addition, the SSL1 gene and the SSL3 gene have different functions on the 5 ′ end side and 3 ′ end side of the DNA as long as the functions thereof, for example, the expression of the encoded protein and the function of the expressed protein are not inhibited. An encoding gene, for example, a gene encoding a tag peptide such as a histidine tag may be added.
SSL酵素変異体は、変異を導入する目的のSSL酵素遺伝子が挿入された変異プラスミド・ライブラリーを構築するライブラリ化を行い、該プラスミド・ライブラリーから、宿主細胞において酵素活性、発現量または安定性が高い変異体を選択することにより取得できる。SSL酵素変異体の作製および変異プラスミド・ライブラリーの構築は、公知の遺伝子工学的手法を用いて実施することができる。
例えば、変異プラスミド・ライブラリーの構築はエラープローンPCR（Error-prone PCR）を用いてランダム変異を導入することにより行うことができる。エラープローンＰＣＲのプロトコールとしてはSaviranta et al. 1998が挙げられる。
The SSL enzyme mutant is a library for constructing a mutant plasmid library into which the target SSL enzyme gene for introducing the mutation is inserted. From the plasmid library, the enzyme activity, expression level or stability is determined in the host cell. Can be obtained by selecting a mutant having a high value. Preparation of SSL enzyme mutants and construction of mutant plasmid libraries can be performed using known genetic engineering techniques.
For example, the construction of a mutant plasmid library can be carried out by introducing random mutations using error-prone PCR. Saviranta et al. 1998 is a protocol for error-prone PCR.
野生型のSSL1遺伝子とは、配列番号1に示される核酸配列からなる遺伝子をいう。野生型のSSL1遺伝子がコードするタンパク質とは、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。 The wild type SSL1 gene refers to a gene consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The protein encoded by the wild-type SSL1 gene refers to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
野生型のSSL3遺伝子とは、配列番号3に示される核酸配列からなる遺伝子をいう。野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質とは、配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をいう。
SSL3遺伝子は、SSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異が部位特異的に導入されたものであってもよい。
The wild type SSL3 gene refers to a gene consisting of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. The protein encoded by the wild-type SSL3 gene refers to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
SSL3 gene is a site-specifically introduced F137L mutation in which the 137th amino acid shown in the amino acid sequence of the protein encoded by SSL3 gene (SEQ ID NO: 4) is replaced by phenylalanine (F) to leucine (L) It may be.
「野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質の対応するアミノ酸で再置換する変異を導入」するとは、例えば、野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示す配列番号4の２７番目のアミノ酸リジン（K）が、突然変異の導入によりアミノ酸アルギニン（R）に置換されている突然変異が導入されたSSL3遺伝子がコードするタンパク質の場合、当該突然変異が導入されたSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列の２７番目の突然変異アルギニン（R）を野生型の対応する２７番目のアミノ酸リジン（K）で再度置換する変異を導入することを意味する。
また、野生型のアミノ酸配列と突然変異型のアミノ酸配列を決定し、同一又は類似のアミノ酸が同じ位置になるようにそれぞれのアミノ酸配列を並べるアライメントを行い、野生型のアミノ酸と対応する突然変異型のアミノ酸を決定することができる。
“Introducing a mutation for resubstitution with the corresponding amino acid of the protein encoded by the wild-type SSL3 gene” means, for example, the 27th amino acid lysine of SEQ ID NO: 4 showing the amino acid sequence of the protein encoded by the wild-type SSL3 gene When (K) is a protein encoded by the SSL3 gene into which a mutation that has been substituted with the amino acid arginine (R) is introduced by introducing a mutation, the amino acid of the protein encoded by the SSL3 gene into which the mutation has been introduced It means introducing a mutation that replaces the 27th mutant arginine (R) of the sequence with the corresponding 27th amino acid lysine (K) of the wild type.
In addition, the amino acid sequence of the wild type and the amino acid sequence of the mutant type are determined, alignment is performed so that the same or similar amino acids are aligned at the same position, and the mutant type corresponding to the wild type amino acid. The amino acid can be determined.
「対応するアミノ酸」とは、２つ以上のタンパク質のアミノ酸配列又は構造的類似性に基づきアミノ酸配列を整列させたときに、タンパク質における類似の位置を占有するアミノ酸をいう。タンパク質のアミノ酸配列又は構造的類似性に基づきアミノ酸配列を整列させるアライメントツールは当業者に既知である。例えばＣｌｕｓｔａｌＷ（www.ebi.ac.uk/clustalw）又はＡｌｉｇｎ（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）を利用することができる。満足なアライメントを生成するために、いずれかの配列にギャップを導入することができることは当業者によく知られている。 “Corresponding amino acid” refers to an amino acid that occupies a similar position in a protein when the amino acid sequences are aligned based on the amino acid sequence or structural similarity of two or more proteins. Alignment tools that align amino acid sequences based on protein amino acid sequences or structural similarities are known to those skilled in the art. For example, ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) or Align (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) can be used. It is well known to those skilled in the art that gaps can be introduced in either sequence to produce a satisfactory alignment.
「類似のアミノ酸」は、類似の特性、例えば極性、溶解性、親水性、疎水性、電荷又はサイズを有する。類似のアミノ酸は、好ましくは、ロイシン、イソロイシン及びバリン；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン；リジン、アルギニン及びヒスチジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；グリシン、アラニン及びセリン；トレオニン、アスパラギン、グルタミン及びメチオニンである。当業者は、例えば配列類似性検索ツール（www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html）を利用することができる。 “Similar amino acids” have similar properties, such as polarity, solubility, hydrophilicity, hydrophobicity, charge or size. Similar amino acids are preferably leucine, isoleucine and valine; phenylalanine, tryptophan and tyrosine; lysine, arginine and histidine; glutamic acid and aspartic acid; glycine, alanine and serine; threonine, asparagine, glutamine and methionine. A person skilled in the art can use, for example, a sequence similarity search tool (www.ebi.ac.uk/Tools/similarity.html).
スクアレン合成酵素（SQS）は、２分子のファルネシル二リン酸(FPP)から中間体であるプレスクアレン二リン酸(PSPP)が生じる第１反応工程、中間体であるPSPPから最終産物であるスクアレンが生成される第２反応工程の２段階の工程で触媒として機能する。ボトリオコッカスブラウニー（Botryococcus braunii）から単離されたスクアレン合成酵素（BSS）は、スクアレン合成に機能するものの、ボトリオコッセンの合成には機能しない。
本明細書において、サーモシネココッカス(Thermosynechococcus elongatus)由来のスクアレン合成酵素(SQS)をtSQSと称する。
Squalene synthase (SQS) is a first reaction step in which presqualene diphosphate (PSPP), which is an intermediate, is produced from two molecules of farnesyl diphosphate (FPP). The final product, squalene, is produced from PSPP, which is an intermediate. It functions as a catalyst in a two-stage process of the generated second reaction process. Squalene synthase (BSS) isolated from Botryococcus braunii functions in squalene synthesis but not in the synthesis of botryococcene.
In this specification, squalene synthase (SQS) derived from Thermosynechococcus elongatus is referred to as tSQS.
本発明で用いられるベクターは、好ましくは発現ベクターである。ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。具体的には、大腸菌では、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ、およびｐＡＣＹＣ１８４等を、枯草菌ではｐＹＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＣ１９４、ｐＨＹ３００ＰＬＫ ＤＮＡ等を、酵母では、ｐＲＳ３０３、ＹＥｐ２１３、ＴＯｐ２６０９等を挙げることができる。ベクターには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を有する核酸を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を例示できる。ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を有する核酸を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を有する核酸を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的遺伝子配列を有する核酸に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。 The vector used in the present invention is preferably an expression vector. The vector DNA is not particularly limited as long as it can replicate in the host, and is appropriately selected depending on the type of host and intended use. The vector DNA may be one in which a part of the DNA other than the part necessary for replication is missing, in addition to one extracted from a naturally occurring one. Representative examples include plasmid, bacteriophage and virus-derived vector DNA. Examples of plasmid DNA include E. coli-derived plasmids, Bacillus subtilis-derived plasmids, yeast-derived plasmids, and the like. Specific examples include pUC18, pUC19, pET, and pACYC184 in Escherichia coli, pYB110, pE194, pC194, pHY300PLK DNA, and the like in Bacillus subtilis, and pRS303, YEp213, and TOp2609 in yeast. It is necessary to incorporate the gene into the vector so that the function of the target gene is exhibited, and at least the target gene sequence and the promoter are constituent elements. In addition to these elements, a gene sequence carrying information on replication and control, if desired, for example, a ribosome binding sequence, a terminator, a signal sequence, a cis element such as an enhancer, a splicing signal, a selection marker, and the like. Alternatively, nucleic acids having a plurality of gene sequences can be combined into a vector DNA by a method known per se. Examples of selection markers include dihydrofolate reductase gene, ampicillin resistance gene, neomycin resistance gene and the like. As a method for incorporating a nucleic acid having a target gene sequence into vector DNA, a method known per se can be applied. For example, a method is used in which a nucleic acid having a target gene sequence is treated with an appropriate restriction enzyme, cleaved at a specific site, then mixed with a similarly treated vector DNA, and religated by ligase. Alternatively, a desired recombinant vector can also be obtained by ligating a suitable linker to a nucleic acid having the gene sequence of interest and inserting it into a multicloning site of a vector suitable for the purpose.
本発明で用いられる色素は、スクアレン合成経路を経由して生合成される色素およびその誘導体であり、色素合成に関与する酵素の基質がスクアレン合成酵素の基質と共通する色素であれば制限されない。例えば、色素は、カロテノイドの１種であるジアポニューロスポレン（黄色）及びジアポリコペン（赤色）が挙げられる。色素合成量の増加による色の変化の視認性が良い色素が好ましい。色素合成に関与する酵素の変異体により生成された色素も好ましい。ジアポニューロスポレン（黄色）及び／又はジアポリコペン（赤色）の色素が宿主細胞で生成され、色素蓄積量の増加により目視又は視認される。 The dye used in the present invention is a dye that is biosynthesized via a squalene synthesis pathway and its derivatives, and is not limited as long as the substrate of the enzyme involved in the dye synthesis is the same as the substrate of the squalene synthase. For example, examples of the pigment include diaponurosporene (yellow) and diapolicopene (red), which are one type of carotenoid. A dye having good visibility of color change due to an increase in the amount of dye synthesized is preferred. Also preferred are dyes produced by mutants of enzymes involved in dye synthesis. Diaponeurosporene (yellow) and / or diapolicopene (red) pigments are produced in host cells and are visually or visually recognized by increasing pigment accumulation.
ジアポフィトエン脱水素酵素（CrtN）は、ジアポフィトエンを基質として、ジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）を合成する。黄色ブドウ球菌由来のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子は黄色ブドウ球菌 S.aureus (ATCC 35556) ゲノムから入手することができ、遺伝子の置換は種々の部位特異的変異法により行うことができる。野生型のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）は黄色の色素ジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）を主に合成するが（Raisig, A. et al.; Biochim Biophys Acta1533, 164-170 (2001)）、CrtN変異体は、赤色のジアポリコペン(Diapolycopene)を合成する。 Diapophytoene dehydrogenase (CrtN) synthesizes diaponeurosporene using diapophytoene as a substrate. The diapophytoene desaturase (CrtN) gene from Staphylococcus aureus can be obtained from the S. aureus (ATCC 35556) genome and can be replaced by various site-specific mutation methods it can. Wild-type diapophytoene desaturase (CrtN) mainly synthesizes the yellow pigment Diaponeurosporene (Raisig, A. et al .; Biochim Biophys Acta1533, 164-170 (2001) ), CrtN mutants synthesize red diapolycopene.
デヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）発現プラスミドとは、CrtN遺伝子を発現するプラスミドを意味する。CrtN発現プラスミドは、CrtN遺伝子に加え、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子を発現するように組み合わせてもよい。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）はイソペンテニル二リン酸（IPP）をジメチルアリル二リン酸（DMAPP）に異性化する酵素である。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）を導入した場合は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）を導入していない場合に比べて、カロテノイドの生産量が増加する。
CrtN発現プラスミドには、例えば、pAC-CrtN-idiが用いられる。pAC-CrtN-idi は、CrtN遺伝子及びidi遺伝子を含む大腸菌発現用プラスミドである。具体的には、土壌細菌（Pantoeaananatis, DSM30080）のゲノムから CrtN遺伝子をPCR増幅し、lacP/O下流において大腸菌用発現プラスミド（pAmod）に組み込み pAC-CrtNを得た。このpAC-CrtNに大腸菌ゲノムからPCR増幅したidiをlacP/O下流において組み込み 、pAC-CrtN-idiを得た。
A dehydrosqualene desaturase (CrtN) expression plasmid means a plasmid that expresses a CrtN gene. CrtN expression plasmids may be combined to express the isopentenyl diphosphate isomerase (idi) gene in addition to the CrtN gene. Isopentenyl diphosphate isomerase (idi) is an enzyme that isomerizes isopentenyl diphosphate (IPP) to dimethylallyl diphosphate (DMAPP). When isopentenyl diphosphate isomerase (idi) is introduced, the amount of carotenoid produced increases as compared to the case where isopentenyl diphosphate isomerase (idi) is not introduced.
For example, pAC-CrtN-idi is used as the CrtN expression plasmid. pAC-CrtN-idi is an E. coli expression plasmid containing the CrtN gene and the idi gene. Specifically, the CrtN gene was PCR amplified from the genome of a soil bacterium (Pantoeaananatis, DSM30080) and incorporated into an expression plasmid for E. coli (pAmod) downstream of lacP / O to obtain pAC-CrtN. PAC-CrtN-idi was obtained by incorporating idi obtained by PCR amplification from the Escherichia coli genome into pAC-CrtN downstream of lacP / O.
本明細書において、「1-gen変異体」とは、スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する宿主細胞、特に大腸菌をいう。スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子は、スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたものであればよく、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異がさらに導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を含んでもよい。1-gen変異体は、SSL3の生産物特異性がスクアレンにシフトした変異体であり、CrtNの活性によって、色素を蓄積する。1-gen変異体は、SSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を有している。1-gen変異体の具体例としては、実施例に記載の1gen-m2(1gM2)、1gen-m8(1gM8)、1gen-m12(1gM12)が挙げられる。 In the present specification, the “1-gen mutant” refers to a host cell having an SSL1 gene and an SSL3 gene into which a mutation for promoting squalene synthesis ability is introduced, particularly E. coli. The SSL1 gene and SSL3 gene into which a mutation that promotes squalene synthesis ability is introduced may be any gene that has been introduced with a mutation that promotes squalene synthesis ability, and there is a mutation that promotes botriococcene synthesis ability without promoting squalene synthesis ability. Furthermore, the introduced SSL1 gene and SSL3 gene may be included. The 1-gen mutant is a mutant in which the product specificity of SSL3 is shifted to squalene, and accumulates a dye by the activity of CrtN. The 1-gen mutant has the SSL1 gene and the SSL3 gene into which the mutation has been introduced (SSL1 / SSL3 mutant gene). Specific examples of the 1-gen mutant include 1gen-m2 (1 gM2), 1gen-m8 (1 gM8), and 1gen-m12 (1 gM12) described in the Examples.
本明細書において、「2-gen変異体」とは、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子（1-gen変異体が有するSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子）を有する宿主細胞、特に大腸菌をいう。2-gen変異体は、全体活性（BO+SQ＋それ以外）の促進したSSL1/SSL3、安定性や異種発現性の促進したSSL1/SSL3を有するものであることが期待される。2-gen変異体の具体例としては、実施例に記載の2gen-m1(2gM1)、2gen-m2(2gM2)、2gen-m3(2gM3)、2gen-m4(2gM4)、2gen-m5(2gM5)、2gen-m6(2gM6)が挙げられる。 In this specification, “2-gen mutant” refers to an SSL1 / SSL3 mutant gene into which a mutation that promotes the ability to synthesize botryococcene and squalene (the SSL1 gene and mutation of the 1-gen mutant have been introduced) A host cell having SSL3 gene), particularly E. coli. The 2-gen mutant is expected to have SSL1 / SSL3 with enhanced overall activity (BO + SQ + other) and SSL1 / SSL3 with enhanced stability and heterogeneity. Specific examples of the 2-gen mutant include 2gen-m1 (2gM1), 2gen-m2 (2gM2), 2gen-m3 (2gM3), 2gen-m4 (2gM4), and 2gen-m5 (2gM5) described in the Examples. 2gen-m6 (2 gM6).
1-gen変異体が持つSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異は、例えば、図６に示すものが挙げられる。 Examples of the amino acid mutation of the protein encoded by the SSL3 gene possessed by the 1-gen mutant include those shown in FIG.
2-gen変異体が持つ変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異は、例えば、図９に示すものが挙げられる。 Examples of the amino acid mutation of the protein encoded by the SSL1 / SSL3 mutant gene into which the mutation of the 2-gen mutant is introduced include those shown in FIG.
本明細書において、「3-gen変異体」とは、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する宿主細胞、特に大腸菌をいう。3-gen変異体は、2-gen変異体のSSL1/SSL3変異体遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうち、1-gen変異体のSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうちボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与していない変異を、野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質の対応するアミノ酸で再置換する変異を導入されたものである。
酵素の安定性や全体活性が促進せずとも、生産物のボトリオコッセンに対するスクアレンの産生比率が高まることによっても、黄色コロニーが得られることから、このような黄色コロニーを除去することによって、3-gen変異体を得ることが好ましい。
また、3-gen変異体は、野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、2-gen変異体が持つ変異のうち、1-gen変異体が持たない変異である、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入されたものであってもよい。
3-gen変異体は、2-gen変異体が持つ変異のうち、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入されたものであることから、ボトリオコッセンの生産量が純粋に高まることが期待される。
3-gen変異体の具体例としては、実施例に記載の野生型のSSL3遺伝子にF137Lアミノ酸変異を導入することにより作製した変異体が挙げられる。
In the present specification, the “3-gen mutant” refers to a host cell having an SSL1 gene and an SSL3 gene into which a mutation that does not promote squalene synthesis ability but promotes botryococcene synthesis ability is introduced, particularly E. coli. The 3-gen mutant is the amino acid mutation of the protein encoded by the SSL1 / SSL3 mutant gene of the 2-gen mutant, of the amino acid mutation of the protein encoded by the SSL3 gene of the 1-gen mutant. A mutation that introduces a mutation that does not specifically contribute to the promotion and is replaced with the corresponding amino acid of the protein encoded by the wild-type SSL3 gene.
Even if the stability and overall activity of the enzyme are not promoted, yellow colonies can be obtained by increasing the production ratio of squalene to botryococcene of the product. It is preferred to obtain mutants.
In addition, the 3-gen mutant is specific for promoting the ability to synthesize botryococcene, which is a mutation that the 2-gen mutant does not have in the wild-type SSL1 gene and SSL3 gene. It may be introduced with a mutation that contributes to.
The 3-gen mutant has a mutation that specifically contributes to the promotion of botryococcene synthesis among the mutations of the 2-gen mutant, so that the production of botryococcene increases purely. Be expected.
Specific examples of 3-gen mutants include mutants produced by introducing F137L amino acid mutations into the wild-type SSL3 gene described in the Examples.
本発明で用いられる、宿主細胞は、色素合成可能なものであり、上記色素合成に関与する酵素により色素を生合成することができる宿主細胞であれば制限されない。天然の細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、藻類など）でも、遺伝子組換えにより形質転換されている細胞でもよい。遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換えの操作に簡便な細胞である、大腸菌、枯草菌、酵母などが挙げられる。
好適な大腸菌としては、Escherichia coli XL1-Blue（大腸菌株（XL1BLUE）ともいう）のようなクローニングに用いられる株、HB101やBL21などの遺伝子発現に用いられる株が挙げられる。
藻類には、真核藻類、ボトリオコッカスが含まれ、特にボトリオコッセンを天然に合成することで知られるボトリオコッカス ブラウニー（Botryococcus braunii）が好ましい。
The host cell used in the present invention can be dye-synthesized, and is not limited as long as it is a host cell capable of biosynthesizing a dye by the enzyme involved in the dye synthesis. It may be a natural cell (for example, E. coli, Bacillus subtilis, yeast, algae, etc.) or a cell transformed by genetic recombination. Examples of the genetically modified cells include Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast, which are cells that are simple for genetic engineering.
Suitable Escherichia coli includes strains used for cloning such as Escherichia coli XL1-Blue (also referred to as Escherichia coli strain (XL1BLUE)) and strains used for gene expression such as HB101 and BL21.
Algae includes eukaryotic algae and Botryococcus, and Botryococcus braunii, which is known by naturally synthesizing botryococcene, is preferred.
本発明で用いられる好ましい宿主細胞は、色素合成に関与する酵素遺伝子若しくはその変異体により形質転換されているか、又は該遺伝子若しくはその変異体を天然に発現する細胞である。黄色ブドウ球菌由来のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子が発現するように形質転換された大腸菌が好ましい。また、さらにイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子が発現するように形質転換され、イソプレノイド経路が強化された大腸菌が好ましい。CrtN遺伝子とidi遺伝子またはそれらの変異体は、同一のベクターに組み込まれていてもよいし、別のベクターに組み込まれていてもよい。 A preferred host cell used in the present invention is a cell that has been transformed with an enzyme gene involved in pigment synthesis or a variant thereof, or that naturally expresses the gene or variant thereof. Escherichia coli transformed to express the diapophytoene desaturase (CrtN) gene derived from Staphylococcus aureus is preferred. Furthermore, Escherichia coli that is further transformed to express the isopentenyl diphosphate isomerase (idi) gene and has an enhanced isoprenoid pathway is preferred. The CrtN gene and the idi gene or mutants thereof may be incorporated into the same vector or may be incorporated into different vectors.
ベクターの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。 For introduction of the vector into the host cell, means known per se can be applied. For example, the standard method described in the book (Sambrook et al., “Molecular Cloning, Laboratory Manual Second Edition”, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory). Specific methods include calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, microinjection, cationic lipid mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic introduction and infection. Etc.
細菌を宿主細胞として用いる場合、プロモーターとして、大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが例示できる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。好ましくは例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を例示できる。 When bacteria are used as host cells, any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli. For example, promoters derived from Escherichia coli or phage, such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, and PR promoter can be exemplified. An artificially designed and modified promoter such as a tac promoter may be used. The method for introducing a recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into bacteria. Preferable examples include a method using calcium ions and an electroporation method.
酵母を宿主細胞として用いる場合、プロモーターとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを用いてもよい。例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が例示できる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を例示できる。 When yeast is used as a host cell, any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast. For example, gal1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFα1 promoter, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, AOX1 promoter and the like can be exemplified. The method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method for introducing DNA into yeast, and preferred examples thereof include an electroporation method, a spheroplast method, and a lithium acetate method.
動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等を用いることができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を例示できる。 When animal cells are used as host cells, it is preferable that the recombinant vector is autonomously replicable in the cells and at the same time is composed of a promoter, an RNA splice site, a target gene, a polyadenylation site, and a transcription termination sequence. . Moreover, the replication origin may be included if desired. As the promoter, SRα promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter or the like can be used, and a cytomegalovirus early gene promoter or the like may be used. Preferred examples of the method for introducing a recombinant vector into animal cells include the electroporation method, the calcium phosphate method, and the lipofection method.
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 When a prokaryotic organism is used as a host cell, the recombinant vector is preferably capable of autonomous replication in the bacterium and at the same time composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a target gene, and a transcription termination sequence. Moreover, the gene which controls a promoter may be contained.
宿主細胞の培養については、宿主細胞に適した公知の培地や条件下で培養する。例えば、大腸菌等の細菌であれば、固体培地においてコロニーを形成する条件下で培養を行う。
培地は、宿主細胞の培養に一般的に用いられるような成分が含まれるものでよい。
培養時の温度は特に限定されないが、大腸菌であれば、30〜37℃とするのが好ましい。培養時間も特に限定されないが、大腸菌であれば、形質転換により導入した遺伝子の発現から12〜72時間培養することが好ましく、24〜48時間培養することがさらに好ましい。
As for the culture of the host cell, it is cultured under a known medium and conditions suitable for the host cell. For example, in the case of bacteria such as Escherichia coli, culturing is performed under conditions that form colonies in a solid medium.
The medium may contain components generally used for host cell culture.
Although the temperature at the time of culture is not particularly limited, it is preferably 30 to 37 ° C. for Escherichia coli. Although the culture time is not particularly limited, in the case of Escherichia coli, it is preferably cultured for 12 to 72 hours, more preferably 24 to 48 hours from the expression of the gene introduced by transformation.
藻類の培養に必要な環境要因として、光、温度、栄養分、二酸化炭素が挙げられる。光の強度は目的生産物が効率よく産生される条件であればよい。藻類の培養液としては、藻類の培養に用いることができるものであればよく、Ｃ培地、ＡＦ-６培地などの藻類用の液体培地の他、液肥などを用いることもできる。 Environmental factors necessary for algae culture include light, temperature, nutrients, and carbon dioxide. The intensity of light should just be the conditions from which a target product is produced efficiently. The algae culture solution is not particularly limited as long as it can be used for algae culture, and liquid fertilizer and the like can be used in addition to a liquid medium for algae such as C medium and AF-6 medium.
本発明の一態様は、３段階に分けたボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）変異体の作出方法である（図２）。 One embodiment of the present invention is a method for producing squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) mutants that promote the ability to synthesize botryococcene in three stages (FIG. 2).
１．ボトリオコッセン合成酵素であるスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の活性改良
スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の２つの酵素遺伝子を大腸菌で共発現するプラスミドを構築した。当該構築されたプラスミドを大腸菌に導入したところ、ボトリオコッセンだけを選択的に蓄積していた（図２の(A)）。当該プラスミドコンストラクトを持つ大腸菌を親（出発原材料）として、以下に示すとおり、大きく３つの段階に分けてスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の活性改良を行った。
1. Activity improvement of squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3), which are the botryococcene synthases Two enzymes, squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) A plasmid was constructed to co-express the gene in E. coli. When the constructed plasmid was introduced into E. coli, only botryococcene was selectively accumulated ((A) in FIG. 2). Escherichia coli with the plasmid construct is the parent (starting material), and as shown below, the activity of squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) is improved in three stages. It was.
２．スクアレン合成を行うSSL3の変異体を含む１−ｇｅｎ変異体の取得（工程１）
SSL3遺伝子全域にエラープローンPCRを用いてランダム変異を導入（ランダム化）した。ライブラリ化されたプラスミド（pUC-SSL1-[SSL3]mut：ブラケットで囲んだ[SSL3]部分がランダム化されていることを示す）を、CrtN発現プラスミドを先に導入した大腸菌株（XL1BLUE）に追加導入した。得られた形質転換体それぞれにコロニーを形成させた。SSL3の生産物特異性がスクアレン（SQ）にシフトした変異体は、CrtNの活性によって、黄色色素（ジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）（DNEU））を蓄積した（図２の(B)）。黄色コロニーは、スクアレン（SQ）合成能が促進したSSL3変異体をコードするプラスミドを持つ１−ｇｅｎ変異体であることが期待される。
2. Acquisition of 1-gen mutants including SSL3 mutants for squalene synthesis (step 1)
Random mutations were introduced (randomized) using error-prone PCR throughout the SSL3 gene. The library plasmid (pUC-SSL1- [SSL3] mut: indicates that the [SSL3] part surrounded by brackets is randomized) was added to the E. coli strain (XL1BLUE) into which the CrtN expression plasmid was introduced previously Introduced. Colonies were formed on each of the obtained transformants. Mutants in which the product specificity of SSL3 was shifted to squalene (SQ) accumulated a yellow pigment (Diaponeurosporene (DNEU)) due to the activity of CrtN (FIG. 2 (B)). The yellow colony is expected to be a 1-gen mutant having a plasmid encoding the SSL3 mutant promoted by squalene (SQ) synthesis ability.
３．スクアレン合成活性が促進したSSL1/SSL3の変異体を有する２−ｇｅｎ変異体の取得（工程２）
上記工程１で得られた１−ｇｅｎ変異体（第１世代）は、ボトリオコッセンに加えて、スクアレンを合成する。そして、合成されたスクアレンの蓄積量は色素量として視認することができる。そこで、この１−ｇｅｎ変異体を親（出発原材料）として使用し、SSL1-SSL3(mut)の２遺伝子全域にエラープローンPCRを実施して、ランダム変異を導入した。こうしてライブラリ化されたプラスミド（pUC-[SSL1-SSL3(1-gen)]mut：ブラケットで囲んだ[SSL1-SSL3(1-gen)]部分がランダム化されていることを示す）を、CrtN発現プラスミドを先に導入した大腸菌株（XL1BLUE）に再び導入し、親（出発原材料）の１−ｇｅｎ変異体よりも黄色のより強いコロニーを探索した（図２の(C)）。色素蓄積量の促進した変異体クローンは、全体生産物（BO+SQ＋それ以外の生産物）の生産活性が促進したSSL1/SSL3変異体、安定性や異種発現性の促進したSSL1/SSL3変異体を含むプラスミドを持つ２−ｇｅｎ変異体であることが期待される。ここで、酵素の安定性や全体生産物の生産活性が促進してないにもかかわらず、生産物のSQ/BO比率が高まることによって、黄色のより強いコロニーが出現し得る。そこで、得られた２−ｇｅｎ変異体クローンの生産物のそれぞれに対してHPLC解析を行い、生産物のSQ/BO比率が高まることによって黄色がより強くなったコロニーを色素蓄積量の促進した変異体クローンから除外した。
3. Acquisition of 2-gen mutant having SSL1 / SSL3 mutant promoted by squalene synthesis activity (step 2)
The 1-gen mutant (first generation) obtained in Step 1 above synthesizes squalene in addition to botryococcene. The accumulated amount of synthesized squalene can be visually recognized as the amount of pigment. Therefore, this 1-gen mutant was used as a parent (starting raw material), and error-prone PCR was performed over the entire two genes SSL1-SSL3 (mut) to introduce random mutations. CrtN expression of the library thus created (pUC- [SSL1-SSL3 (1-gen)] mut: indicates that the [SSL1-SSL3 (1-gen)] part surrounded by brackets is randomized) The plasmid was reintroduced into the previously introduced E. coli strain (XL1BLUE) to search for a stronger colony that was yellower than the parent (starting material) 1-gen mutant (FIG. 2 (C)). Mutant clones with increased pigment accumulation are SSL1 / SSL3 mutants with enhanced overall product (BO + SQ + other products) production activity, SSL1 / SSL3 mutants with enhanced stability and heterogeneity It is expected to be a 2-gen mutant with a plasmid containing Here, even though the stability of the enzyme and the production activity of the whole product are not promoted, a stronger yellow colony can appear by increasing the SQ / BO ratio of the product. Therefore, HPLC analysis was performed on each product of the obtained 2-gen mutant clones, and a colony whose yellow color became stronger due to an increase in the SQ / BO ratio of the product was detected as a mutation that promoted pigment accumulation. Excluded from body clones.
４．ボトリオコッセン生産量が促進したSSL1/SSL3の変異体を有する３−ｇｅｎ変異体株の取得（工程３）
上記工程２で得られた２−ｇｅｎ変異体（第２世代）から、１−ｇｅｎ変異体で導入された生産物特異性がスクアレン（SQ）にシフトした特異性変換に関わる変異を除去し、すなわち、スクアレン（SQ）を合成しない野生型のアミノ酸に再置換し、３−ｇｅｎ変異体（第３世代）とした（図２の(D)）。工程１で得られた１−ｇｅｎ変異体（第１世代）の変異が、全体活性に影響を与えず特異性のみを変更するものであれば、当該変異を除去して得られた３−ｇｅｎ変異体は、２−ｇｅｎ変異体で得られた活性変異のみを持つものであり、ボトリオコッセンの生産量が純粋に高まっているものであること期待される。
あるいは、この３−ｇｅｎ変異体（第３世代）は、野生型のSSL1/SSL3に、２−ｇｅｎ変異体株で見いだされた活性変異を導入したものとして作出してもよい。複数の活性促進変異が見いだされる場合、それらを組み合わせた変異を導入することにより、更なる活性の促進が期待し得る。
4). Acquisition of 3-gen mutant strains with SSL1 / SSL3 mutants promoted by Botryococcene production (Step 3)
From the 2-gen mutant (second generation) obtained in step 2 above, the mutation involved in specificity conversion in which the product specificity introduced in the 1-gen mutant is shifted to squalene (SQ) is removed, That is, squalene (SQ) was re-substituted with a non-synthesized wild-type amino acid to obtain a 3-gen mutant (third generation) ((D) in FIG. 2). If the mutation of the 1-gen mutant (first generation) obtained in step 1 changes only the specificity without affecting the overall activity, the 3-gen obtained by removing the mutation The mutant has only the active mutation obtained with the 2-gen mutant, and is expected to have a purely increased production of botryococcene.
Alternatively, this 3-gen mutant (third generation) may be produced by introducing an active mutation found in the 2-gen mutant strain into wild-type SSL1 / SSL3. When a plurality of activity-promoting mutations are found, further activity promotion can be expected by introducing a combination of these mutations.
本発明の一態様は、ボトリオコッセン合成酵素を持つ宿主細胞を培養することにより、宿主細胞にボトリオコッセン生合成を行なわせ、ボトリオコッセンを製造する方法に関する。ボトリオコッセン合成酵素を持つ宿主細胞には、例えば、SSL3変異体を発現する宿主細胞が用いられる。宿主細胞は、好ましくは大腸菌を使用することができる。SSL3変異体を発現するボトリオコッカスブラウニー（Botryococcus braunii）を使用してもよい。 One embodiment of the present invention relates to a method for producing botryococcene by causing a host cell to perform biosynthesis of botryococcene by culturing a host cell having botryococcene synthase. As the host cell having botryococcene synthase, for example, a host cell that expresses an SSL3 mutant is used. E. coli can be preferably used as the host cell. Botryococcus braunii expressing SSL3 mutant may be used.
本発明の一態様であるスクリーニング方法では、ジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子が発現するように形質転換された宿主細胞（例えば大腸菌）において、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体の機能により、野生型のスクアレン合成酵素様（SSL）酵素を持つ宿主細胞の色素蓄積量と比較したスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体による色素蓄積量の増加を指標として、目視又は視認によりボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を持つ宿主細胞をスクリーニングし取得することができる。 In the screening method according to one embodiment of the present invention, a squalene synthase-like enzyme that promotes the ability to synthesize botryococcene in a host cell (for example, E. coli) transformed to express a diapophytoene desaturase (CrtN) gene ( The function of the SSL) enzyme variant is based on the increase in the amount of pigment accumulated by the squalene synthase-like (SSL) enzyme variant compared to the amount of pigment accumulated in the host cell with the wild-type squalene synthase-like (SSL) enzyme. It is possible to screen and obtain a host cell having a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant that promotes the ability to synthesize botryococcene visually or visually.
本発明の一態様は、ボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体のスクリーニング用キットに関する。
本発明の一態様であるキットは、黄色ブドウ球菌由来のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子が発現するように形質転換された細胞を含むものであり得る。当該細胞は、冷凍保存してバイアル内に封入したものが好適である。あるいは、本発明に係るキットは、所望の細胞を色素合成可能な細胞に形質転換するための黄色ブドウ球菌由来のジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子発現ベクターを構成要素として含むものであり得る。
さらに、上記本発明に係るキットは、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素遺伝子を発現するベクター、ジアポフィトエン不飽和化酵素（CrtN）遺伝子発現ベクター、クローニング酵素セット、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素遺伝子を増幅するためのプライマーセット、スクアレン合成酵素様（SSL）酵素遺伝子に変異を導入した変異プラスミド・ライブラリー、マイクロプレート、スクアレン合成経路及び／又はイソプレノイド経路の強化された菌株、培地や添加剤などのスクリーニングに有用な物質や器具（画像スキャナや測色光度計、色見本、コロニピッカー）などをキットの構成要素として加えることができる。
One embodiment of the present invention relates to a screening kit for a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant that promotes the ability to synthesize botryococcene.
The kit which is one aspect | mode of this invention may contain the cell transformed so that the diapophytoene desaturase (CrtN) gene derived from Staphylococcus aureus may be expressed. The cell is preferably stored frozen and enclosed in a vial. Alternatively, the kit according to the present invention comprises a diapophytoene desaturase (CrtN) gene expression vector derived from Staphylococcus aureus for transforming desired cells into cells capable of pigment synthesis. obtain.
Furthermore, the kit according to the present invention includes a vector for expressing a squalene synthase-like (SSL) enzyme gene, a diapophytoene desaturase (CrtN) gene expression vector, a cloning enzyme set, a squalene synthase-like (SSL) enzyme. Primer sets to amplify genes, mutant plasmid libraries in which mutations are introduced into squalene synthase-like (SSL) enzyme genes, microplates, strains with enhanced squalene synthesis and / or isoprenoid pathways, media and additives Materials and instruments useful for screening, such as image scanners, colorimetric photometers, color samples, and colony pickers can be added as components of the kit.
本発明の理解を深めるために、以下の実施例により更に詳細に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 In order to deepen the understanding of the present invention, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）およびスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）遺伝子は株式会社デンソーにより取得された。スクアレン合成酵素様酵素変異体の作出は千葉大学により行われた。 The squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) genes were obtained from Denso Corporation. The creation of a squalene synthase-like enzyme mutant was performed by Chiba University.
１．スクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）およびスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）遺伝子の抽出
池から採集しAF-6培地で1か月培養したボトリオコッカスブラウニー（Botryococcus braunii）株の中で、容器内で水面上に浮いた細胞をピペットで単離した。
単離したボトリオコッカス ブラウニー（Botryococcus braunii）株を1%CO2、蛍光灯の環境下においてAF-6培地中で培養し、増殖させた。増殖した藻体に抽出溶媒としてヘキサンを添加し、オイル成分を抽出した。GC-MSにて抽出したオイルを定性分析し、ボトリオコッセンを生産する株を選抜し、MH1株と名付けた。
MH1株は、1%CO2、25℃室温、光量150μmol photons/m2/secの環境下において1Lガラス培養瓶を用いてAF-6培地中で3週間培養した。培養開始から14日目の培養液を80mL回収しRNA抽出に用いた。
1. Extraction of squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) genes In a Botryococcus braunii strain collected from a pond and cultured in AF-6 medium for 1 month The cells floating on the surface of the water were isolated with a pipette.
The isolated Botryococcus braunii strain was cultured and grown in AF-6 medium in an environment of 1% CO 2 and fluorescent light. Hexane was added as an extraction solvent to the grown alga bodies to extract oil components. The oil extracted by GC-MS was qualitatively analyzed, and a strain producing botryococcene was selected and named MH1 strain.
The MH1 strain was cultured in AF-6 medium for 3 weeks using a 1 L glass culture bottle in an environment of 1% CO 2 , room temperature at 25 ° C. and light intensity of 150 μmol photons / m 2 / sec. 80 mL of the culture solution on the 14th day from the start of the culture was recovered and used for RNA extraction.
回収した培養液から細胞を集め、RNA抽出キット（QIAGEN社製のRNeasy Plant Mini Kit）を使用して、キットに付属のプロトコールに従ってRNA抽出を実施した。得られたRNAを用いて、シーケンスライブラリーキット（イルミナ社製TruSeq Small RNA Sample Prep Kit及びTruSeq RNA Sample Preparation Kit v2）を使用して、キットに付属のプロトコールに従ってシーケンスライブラリーを作製した。作製したシーケンスライブラリーを用いて、鋳型ＤＮＡの塩基配列を取得した。 Cells were collected from the collected culture medium, and RNA extraction was performed using an RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit manufactured by QIAGEN) according to the protocol attached to the kit. Using the obtained RNA, a sequence library kit (Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kit and TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2) was used to prepare a sequence library according to the protocol attached to the kit. Using the prepared sequence library, the base sequence of the template DNA was obtained.
シーケンスデータの解析により、リード数102,018,468個、解析鎖長10,201,846,800bpの塩基配列情報を得た。
シーケンスデータの解析には、イルミナ社のマニュアル（クラスター形成：cBot User GuideRev.J、TruSeq PE Cluster Kit v3 Reagent Preparation GuideRev.B；シークエンス解析：HiSeq 2000 User Guide Rev.M、TruSeq SBS Kit v3(200 Cycles) Reagent Preparation Guide Rev.B；データ処理：CASAVA v1.8 User Guide Rev.D）を参考に、イルミナ社の機器、試薬、ソフトウェア(クラスター形成：cBot、TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS；シークエンス解析：HiSeq 2000、TruSeq SBS Kit v3-HS(200 Cycles)；データ処理：HiSeq Control Software (HCS) v2.0.12、Real Time Analysis (RTA)v1.17.21、Consensus Assessment of Sequence And Veriation(CASAVA) v1.8.2)を使用した。
By analyzing the sequence data, base sequence information with 102,018,468 reads and an analysis chain length of 10,201,846,800 bp was obtained.
For sequence data analysis, Illumina manual (cluster formation: cBot User Guide Rev. J, TruSeq PE Cluster Kit v3 Reagent Preparation Guide Rev. B; sequence analysis: HiSeq 2000 User Guide Rev. M, TruSeq SBS Kit v3 (200 Cycles ) Reagent Preparation Guide Rev.B; Data Processing: CASAVA v1.8 User Guide Rev.D), Illumina equipment, reagents and software (cluster formation: cBot, TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS; sequence) Analysis: HiSeq 2000, TruSeq SBS Kit v3-HS (200 Cycles); Data processing: HiSeq Control Software (HCS) v2.0.12, Real Time Analysis (RTA) v1.17.21, Consensus Assessment of Sequence And Veriation (CASAVA) v1. 8.2) was used.
De novoアセンブリをソフトウェア（株式会社CLCバイオジャパン社製 CLC Genomics Workbench 6.5.1）を用いて行った。De novoアセンブリの条件は以下のとおりである：Ambiguous trim =Yes、Ambiguous limit = 0、Quality trim = Yes、Quality limit = 0.00035、Create report = Yes、Save discarded sequences= No、Remove 5' terminal nucleotides = No、Maximum number of nucleotides in reads = 1,000、Minimum number of nucleotides in reads = 97、Discard short reads = Yes、Remove 3' terminal nucleotides = No、Discard long reads = Yes、Save broken pairs=No De novo assembly was performed using software (CLC Genomics Workbench 6.5.1 manufactured by CLC Bio Japan Co., Ltd.). De novo assembly conditions are as follows: Ambiguous trim = Yes, Ambiguous limit = 0, Quality trim = Yes, Quality limit = 0.00035, Create report = Yes, Save discarded sequences = No, Remove 5 'terminal nucleotides = No , Maximum number of nucleotides in reads = 1,000, Minimum number of nucleotides in reads = 97, Discard short reads = Yes, Remove 3 'terminal nucleotides = No, Discard long reads = Yes, Save broken pairs = No
得られたコンティグをもとにBLAST Databaseを構築し、既知のshowa株由来のSSL1遺伝子（Genbankアクセッション番号:HQ585058.1）及びSSL3遺伝子（Genbankアクセッション番号:HQ585060.1）をクエリー配列とし、TBLASTXを用いた相同遺伝子検索を行った。その結果、それぞれの全長ORFとそれぞれ89％、87％の相同性を持つ、MHSSL-1（配列番号1）、MHSSL-3（配列番号3）の配列を得た。本明細書において、野生型のスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の２つの酵素遺伝子は、それぞれ配列番号1及び配列番号3に示される配列を有するものである。 Based on the obtained contig, BLAST Database was constructed, and the SSL1 gene (Genbank accession number: HQ585058.1) and SSL3 gene (Genbank accession number: HQ585060.1) from the known showa strain were used as query sequences, Homologous gene search using TBLASTX was performed. As a result, sequences of MHSSL-1 (SEQ ID NO: 1) and MHSSL-3 (SEQ ID NO: 3) having 89% and 87% homology with the respective full length ORFs were obtained. In this specification, two enzyme genes, wild-type squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3), have the sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively. is there.
２．１−ｇｅｎ変異体（第１世代）の作出（図２(B)）
野生型のスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）の２つの酵素遺伝子を大腸菌（XL1BLUE）で共発現するプラスミドコンストラクトを作製した。当該プラスミドコンストラクトを発現する大腸菌（XL1BLUE）を図１２において野生型（WT）として示す。
当該プラスミドコンストラクトの作製において、SSL1及びSSL3の２つの酵素遺伝子のC末端にHis-tag配列を挿入したものをpUC18Nmベクターにあるlacプロモーターの後ろにオペロンの状態で挿入した。SSL1はXbaI/XhoIサイトの間にSD配列（AGGAGG）の後ろにSSL1の配列をつけた状態で配置した。SSL3は、SD配列（AGGAGG）の後ろにあるSpeI/ApaIサイトの間に配置し挿入した。
2.1 Generation of 1-gen mutant (first generation) (Fig. 2 (B))
A plasmid construct was prepared in which two enzyme genes, wild-type squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) and squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3), were co-expressed in Escherichia coli (XL1BLUE). E. coli (XL1BLUE) expressing the plasmid construct is shown as wild type (WT) in FIG.
In the construction of the plasmid construct, the one in which the His-tag sequence was inserted at the C-terminus of the two enzyme genes SSL1 and SSL3 was inserted in the operon state behind the lac promoter in the pUC18Nm vector. SSL1 was placed between the XbaI / XhoI sites with the SSL1 sequence after the SD sequence (AGGAGG). SSL3 was placed and inserted between SpeI / ApaI sites behind the SD sequence (AGGAGG).
使用したプラスミド
SSL3遺伝子(His-tag含まない塩基長1158 bp)にMn2+を用いたエラープローンPCR法によって遺伝子変異を導入した。
エラープローンPCRは以下の条件で行った。
His-tagを付加したSSL3遺伝子をpUC18発現ベクターで発現するように組み込んだpUC18m- MHSSL3hisを鋳型として用いた。
PCR反応には、NEB社のTaq polymerase 5 units、鋳型（pUC18m- MHSSL3his）15 ngを使用した。反応条件はdNTP濃度 0.2 mM、バッファ組成（1×Thermol pol. buffer：20 mM Tris-HCl（25℃でpH8.8）、10 mM (NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、0.1% Triton（登録商標）X-100）、MnCl2の濃度は10μMおよび50μMであった。
増幅サイクルは、95℃で5分→（95℃で15秒、52℃で15秒、72℃で1分30秒）を25サイクル→72℃で10分とした。増幅率は1000倍であった。
使用したプライマーセットは、
Slic-MHSSL3-F：5'-CATCATCATCATtaaCTCGAGAGGAGGATTACAACTAGTATGAAACTGCGTGAAGTGCTGC-3'（配列番号5）
Slic-MHSSL3-R：5'-CCCGCCATCATCATCATCATCATtaaGGGCCCGGCGCCTGATGCGGT-3'（配列番号6）
である。
エラープローンPCR法において、Mn2+の最終濃度を10μM にしたものをSSL3-10、 Mn2+の最終濃度を50 μMにしたものをSSL3-50とした。CrtN遺伝子及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（idi）遺伝子を発現するプラスミド(pAC-CrtN-idi)を予め導入した大腸菌（XL1BLUE ）に、エラープローンPCR法によって得られたPCR産物をpUC18NmベクターのSpeI/ApaIサイトに挿入したライゲーション産物を形質転換し、１プレートあたり300〜500コロニー程度となるように、ニトロセルロース膜をのせたLB（carb. cm.）固体培地に散布した。
A gene mutation was introduced into the SSL3 gene (base length 1158 bp not including His-tag) by error-prone PCR using Mn 2+ .
Error-prone PCR was performed under the following conditions.
PUC18m-MHSSL3his into which the SSL3 gene to which the His-tag was added was incorporated so as to be expressed by the pUC18 expression vector was used as a template.
In the PCR reaction, NEB Taq polymerase 5 units and template (pUC18m-MHSSL3his) 15 ng were used. Reaction conditions are dNTP concentration 0.2 mM, buffer composition (1 × Thermol pol. Buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO 4 , 0.1% Triton® X-100), MnCl 2 concentrations were 10 μM and 50 μM.
The amplification cycle was 95 ° C. for 5 minutes → (95 ° C. for 15 seconds, 52 ° C. for 15 seconds, 72 ° C. for 1 minute 30 seconds) and 25 cycles → 72 ° C. for 10 minutes. The amplification factor was 1000 times.
The primer set used was
Slic-MHSSL3-F: 5'-CATCATCATCATtaaCTCGAGAGGAGGATTACAACTAGTATGAAACTGCGTGAAGTGCTGC-3 '(SEQ ID NO: 5)
Slic-MHSSL3-R: 5'-CCCGCCATCATCATCATCATCATtaaGGGCCCGGCGCCTGATGCGGT-3 '(SEQ ID NO: 6)
It is.
In the error-prone PCR method, the final concentration of Mn 2+ at 10 μM was SSL3-10, and the final concentration of Mn 2+ at 50 μM was SSL3-50. A PCR product obtained by the error-prone PCR method was introduced into Escherichia coli (XL1BLUE) into which a plasmid (pAC-CrtN-idi) expressing the CrtN gene and isopentenyl diphosphate isomerase (idi) gene had been introduced in advance. The ligation product inserted into the ApaI site was transformed and sprayed onto an LB (carb. Cm.) Solid medium on which a nitrocellulose membrane was placed so as to obtain about 300 to 500 colonies per plate.
SSL3ライブラリおよびスクリーニングサイズ
上記コロニーを37℃で20 時間静置培養後、室温（約25 ℃）でさらに24 時間静置した。SSL3-10ライブラリおよびSSL3-50ライブラリから、それぞれ約5000個および約6000個のコロニーをスクリーニングした（表２）。色素の蓄積がみられるようになったコロニーが12個（SSL3-10ライブラリから10個、SSL3-50ライブラリから2個）得られた（図３(b)）。色素の蓄積がみられるようになったコロニーをピックアップし、48 deep well plateを用いて、2 mL LB(carb. cm.) 液体培地中で37℃にて一晩培養後、プラスミドを抽出した。 The colony was allowed to stand at 37 ° C. for 20 hours and then allowed to stand at room temperature (about 25 ° C.) for another 24 hours. About 5000 and about 6000 colonies were screened from the SSL3-10 library and the SSL3-50 library, respectively (Table 2). Twelve colonies (10 from the SSL3-10 library and 2 from the SSL3-50 library) in which accumulation of dye was observed were obtained (FIG. 3 (b)). A colony having accumulated pigment was picked up and cultured in a 2 mL LB (carb. Cm.) Liquid medium overnight at 37 ° C. using a 48 deep well plate, and then the plasmid was extracted.
野生型のSSL3とCrtNを発現する大腸菌株（SSL3wt-CrtN）は色素の吸収スペクトルを有しないのに対して、得られた12個の１−ｇｅｎ変異体全てが、スクアレン合成酵素とCrtNを発現する大腸菌株（tSQS-CrtN）を用いた場合と同じような色素のスペクトルを示した（図３(c)）。これらの色素の蓄積量は、tSQS-CrtNと比較して約1/5程度であった（図４）。この比率は、野生型のSSL1及びSSL3を大腸菌内で単独発現させた場合のボトリオコッセンの合成量（〜0.7 mg/L）がtSQSを単独発現させた場合のスクアレン合成量（約3.4 mg/L）の約1/5であること（図５）と合致しており、野生型のSSL1及びSSL3の細胞活性は、十分改善の余地があることが示唆された。 E. coli strains that express wild-type SSL3 and CrtN (SSL3wt-CrtN) do not have a dye absorption spectrum, whereas all the 12 1-gen mutants obtained express squalene synthase and CrtN. The spectrum of the dye was the same as when using the Escherichia coli strain (tSQS-CrtN) (Fig. 3 (c)). The accumulated amount of these dyes was about 1/5 compared with tSQS-CrtN (FIG. 4). This ratio indicates that the amount of botryococcene synthesis (˜0.7 mg / L) when wild-type SSL1 and SSL3 are expressed alone in E. coli is the amount of squalene synthesis (about 3.4 mg / L) when tSQS is expressed alone. The cell activity of wild-type SSL1 and SSL3 was suggested to have sufficient room for improvement.
得られた12個の１−ｇｅｎ変異体（M1〜M12）の、SSL3部分の遺伝型を決定した。Chappellらは、構造モデルをもとに、反応特異性に影響を与えそうな２つのアミノ酸残基の置換によって（N171A、G207Q）、SSL3の反応特異性をスクアレン(SQ)合成活性に変換することを示した（非特許文献４）。一方、本発明者らは、スクリーニングベースで、先入観なくスクアレン(SQ)合成能の促進した変異体をランダムサーチし、ボトリオコッセン合成酵素にスクアレン(SQ)合成能を賦与するアミノ酸置換があることを見出した。このアミノ酸変異はChappellらが標的にしていない新たな13個のスクアレン合成活性にシフトした変異を含むものである（図６、V50A、Y49C、Y49H、V151A、K154I、N171Y、F168L、A175V、F182C、N210D、I226L、F283L、P289L）。 The genotypes of the SSL3 part of the obtained 12 1-gen mutants (M1 to M12) were determined. Chappell et al. Convert the reaction specificity of SSL3 to squalene (SQ) synthesis activity by substituting two amino acid residues that are likely to affect reaction specificity (N171A, G207Q) based on the structural model. (Non-Patent Document 4). On the other hand, the present inventors randomly screened mutants that promoted squalene (SQ) synthesis ability on a screening basis, and found that there is an amino acid substitution that imparts squalene (SQ) synthesis ability to botryococcene synthase. It was. These amino acid mutations include mutations shifted to 13 new squalene synthesis activities not targeted by Chappell et al. (FIG. 6, V50A, Y49C, Y49H, V151A, K154I, N171Y, F168L, A175V, F182C, N210D, I226L, F283L, P289L).
３．２−ｇｅｎ変異体（第２世代）の作出（図２(C)）
上記得られた12個の１−ｇｅｎ変異体（M1〜M12）のプラスミド（pUC-lacP-SSL1wt-[SSL3]1g）を等モルずつプールしたものを親（出発原材料）とし、SSL1遺伝子及びSSL3変異体遺伝子の全領域にエラープローンPCRをかけた。
１−ｇｅｎ変異体（第１世代）の変異体から得られたプラスミドを等モルで混ぜたものを鋳型として、エラープローンPCRは以下の条件で行った。
PCR反応には、NEB社のTaq polymerase 5 units、鋳型10 ngを使用した。反応条件はdNTP濃度 0.2 mM、バッファ組成（1×Thermol pol. buffer：20 mM Tris-HCl（25℃でpH 8.8）、10 mM(NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、0.1% Triton（登録商標）X-100）、MnCl2の濃度は10 μMおよび50 μMであった。
増幅サイクルは、95℃で5分→（95℃で15秒、52℃で15秒、72℃で1分30秒）を25サイクル→72℃で10分とした。PCR増幅率は1000倍であった。
使用したプライマーセットは、
inF：5'-CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC-3'（配列番号7）
Slic-MHSSL3-R：5'-CCCGCCATCATCATCATCATCATtaaGGGCCCGGCGCCTGATGCGGT-3'（配列番号6）
である。
作製されたプラスミド・ライブラリーpUC-[SSL1his-SSL3his_1g]libをCrtN発現プラスミド(pAC-CrtN-idi)が予め導入された大腸菌（XL1BLUE）に形質転換し、LB培地上でコロニーを形成させた。形成させたコロニーから、プラスミド（pUC-lacP-SSL1wt-[SSL3]1g）を発現する親（出発原材料）（１ｇＭ１２）よりも色素の蓄積量が多くなるコロニーをスクリーニングした（図７（ａ））。約3000個のコロニーをスクリーニングした（表３）。
3.2 Creation of 2-gen mutant (2nd generation) (Fig. 2 (C))
A pool of equimolar pools of the above-obtained 12 1-gen mutant (M1 to M12) plasmids (pUC-lacP-SSL1wt- [SSL3] 1g) was used as a parent (starting material), and the SSL1 gene and SSL3 Error-prone PCR was applied to the entire region of the mutant gene.
Error-prone PCR was performed under the following conditions using a plasmid obtained from a 1-gen mutant (first generation) mutant mixed in equimolar amounts as a template.
For the PCR reaction, NEB Taq polymerase 5 units and 10 ng template were used. The reaction conditions are dNTP concentration 0.2 mM, buffer composition (1 × Thermol pol. Buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 10 mM KCl, 2 mM MgSO 4 , 0.1% Triton® X-100), the concentration of MnCl 2 was 10 μM and 50 μM.
The amplification cycle was 95 ° C. for 5 minutes → (95 ° C. for 15 seconds, 52 ° C. for 15 seconds, 72 ° C. for 1 minute 30 seconds) and 25 cycles → 72 ° C. for 10 minutes. The PCR amplification rate was 1000 times.
The primer set used was
inF: 5'-CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC-3 '(SEQ ID NO: 7)
Slic-MHSSL3-R: 5'-CCCGCCATCATCATCATCATCATtaaGGGCCCGGCGCCTGATGCGGT-3 '(SEQ ID NO: 6)
It is.
The prepared plasmid library pUC- [SSL1his-SSL3his_1g] lib was transformed into Escherichia coli (XL1BLUE) into which a CrtN expression plasmid (pAC-CrtN-idi) had been previously introduced, and colonies were formed on the LB medium. From the formed colonies, a colony in which the amount of accumulated pigment was larger than that of the parent (starting raw material) (1 gM12) expressing the plasmid (pUC-lacP-SSL1wt- [SSL3] 1g) was screened (FIG. 7 (a)). . About 3000 colonies were screened (Table 3).
第２世代ライブラリ
結果、より色素の蓄積量が多いコロニーを６つ取得した（２ｇＭ１、２ｇＭ２、２ｇＭ３、２ｇＭ４、２ｇＭ５、２ｇＭ６、図７（ｂ））。これらを液体培地内で震蘯培養し、アセトン抽出画分をHPLC-PDA解析してジアポニューロスポレン（Diaponeurosporene）の極大吸収波長（470 nm）での吸光度を用いてカロテノイド生産量を決定した（図８）。 As a result, six colonies with more accumulated pigment were obtained (2 gM1, 2 gM2, 2 gM3, 2 gM4, 2 gM5, 2 gM6, FIG. 7B). These were shaken in liquid medium, and acetone-extracted fractions were analyzed by HPLC-PDA to determine the amount of carotenoid production using the absorbance of Diaponeurosporene at the maximum absorption wavelength (470 nm). (FIG. 8).
得られた６つの２−ｇｅｎ変異体を遺伝子解析した結果、親（出発原材料）とした１−ｇｅｎ変異体と得られた２−ｇｅｎ変異体の関係は、1gM2を親（出発原材料）とした変異体が３つ（2gM1、2gM2、2gM5）、1gM8を親（出発原材料）とした変異体が３つ（2gM3、2gM4、2gM6）であった。 As a result of genetic analysis of the obtained 6-gen mutants, the relationship between the 1-gen mutant as a parent (starting raw material) and the obtained 2-gen mutant was 1 gM2 as the parent (starting raw material). There were 3 mutants (2 gM1, 2 gM2, 2 gM5) and 3 mutants (2 gM3, 2 gM4, 2 gM6) with 1 gM8 as the parent (starting material).
得られた６つの２−ｇｅｎ変異体を遺伝子解析した結果、２−ｇｅｎ変異体で新たに追加された変異は６つすべてにおいてSSL1内部又はSSL1の翻訳開始配列に見つかった（図９）。この結果は、（１）SSL1がボトリオコッセン合成活性の律速になっていること、（２）SSL1にはSSL1遺伝子発現タンパクの翻訳量や発現タンパクの安定性（可溶性あるいはフォールディング効率）に改良の余地があること、（３）SSL1のC末端部位への変異導入によって比較的簡単にその安定性は向上し得ることを意味している。 As a result of genetic analysis of the obtained 6-gen mutants, all 6 mutations newly added in the 2-gen mutant were found in the SSL1 internal or SSL1 translation initiation sequence (FIG. 9). As a result, (1) SSL1 is the rate-determining activity of botryococcene synthesis, and (2) SSL1 has room for improvement in the translation amount of SSL1 gene expression protein and the stability (solubility or folding efficiency) of the expressed protein. (3) It means that the stability can be improved relatively easily by introducing a mutation into the C-terminal site of SSL1.
このことを確認するために、実際に、SSL1wtとSSL3wtを、さまざまな効率の翻訳開始配列の下に配置し、それらを形質転換した大腸菌株のウェスタンブロッティングを行ったところ、SSL1の全画分と可溶性画分がSSL3より明らかに少なかった（図１０）。 In order to confirm this, SSL1wt and SSL3wt were actually placed under translation initiation sequences with various efficiencies, and Western blotting of E. coli strains transformed with them was performed. The soluble fraction was clearly less than SSL3 (Figure 10).
総合すると、６つの２−ｇｅｎ変異体の殆どが、ボトリオコッセン合成活性の律速となっているSSL1のC末端の可溶性や発現量の向上させる変異によって、又は、SSL1の翻訳開始効率の向上によって、全体のボトリオコッセン生産量が向上したと推察される。なお、2gM3、2gM4、2gM5、2gM6に見られたRBS（ribosomalbinding site）の変異によって、RBS カリキュレータにより計算された翻訳開始効率（RBS score）に変化が見られなかったが、実際の発現量は上方制御されているものと思われる。 Taken together, most of the 6 2-gen mutants are either completely modified by the SSL1 C-terminal solubility, which is the rate-limiting factor for botryococcene synthesis activity, or by mutations that increase the expression level, or by improving the SSL1 translation initiation efficiency. The production of Botryococcene is estimated to have improved. The RBS (ribosomal binding site) mutation found in 2gM3, 2gM4, 2gM5, and 2gM6 did not change the translation initiation efficiency (RBS score) calculated by the RBS calculator, but the actual expression level was higher. It seems to be controlled.
４．３−ｇｅｎ変異体（第３世代）の作出（図２(D)）
2gM3ではSSL3においてF137Lのアミノ酸変異が見いだされた。2gM3の持つSSL3におけるアミノ酸変異は、F137Lを除いて2gM4、2gM6の持つアミノ酸変異と同一であった。遺伝子解析の結果、2gM3、2gM4、2gM6はいずれも1gM8を親（出発原材料）とした変異体であった。
CrtN-idi共存条件下におけるカロテノイドの蓄積量が、2gM3＞2gM4 ＝ 2gM6となっていることから、SSL3のF137Lアミノ酸変異がカロテノイド蓄積量の差の原因と考えた。
SSL3のF137Lアミノ酸変異を、結晶構造が明らかになっているヒトスクアレン合成酵素(hSQS)の結晶構造上にマッピングした（図１１、使用したソフトはPymolである）。SSL3のF137Lアミノ酸変異は、hSQS結晶構造上の基質ポケット（黒色部分）と直接相互作用するヘリックス上には位置しないが、１世代目で導入されたと考えられるSSL3のスクアレン合成活性変異（A175V）アミノ酸が位置するヘリックスと隣り合うヘリックス上に位置し、Chappellら（非特許文献４）が示唆しているボトリオコッカス ブラウニースクアレン合成酵素のSSL3反応に関わるアミノ酸A177と隣り合うことが分かった。
4. Creation of 3-gen mutant (3rd generation) (Fig. 2 (D))
In 2gM3, an amino acid mutation of F137L was found in SSL3. The amino acid mutation in SSL3 possessed by 2gM3 was identical to the amino acid mutation possessed by 2gM4 and 2gM6 except for F137L. As a result of gene analysis, 2gM3, 2gM4, and 2gM6 were all mutants having 1gM8 as a parent (starting material).
Since the amount of accumulated carotenoids under the conditions of CrtN-idi coexistence was 2gM3> 2gM4 = 2gM6, the F137L amino acid mutation of SSL3 was considered to be the cause of the difference in accumulated amounts of carotenoids.
The F137L amino acid mutation of SSL3 was mapped onto the crystal structure of human squalene synthase (hSQS) whose crystal structure has been clarified (FIG. 11, the software used is Pymol). The SSL3 F137L amino acid mutation is not located on the helix that directly interacts with the substrate pocket (black part) on the hSQS crystal structure, but the SSL3 squalene synthesis activity mutation (A175V) amino acid thought to have been introduced in the first generation It was found to be adjacent to the amino acid A177 involved in the SSL3 reaction of Botryococcus brownie squalene synthase suggested by Chappell et al. (Non-patent Document 4).
１−ｇｅｎ変異体、２−ｇｅｎ変異体の生産物解析結果を図１２に示す。
2gM2、2gM5は親（出発原材料）の１−ｇｅｎ変異体(1gM2)と比較してスクアレン合成量は多くなってないものの、2gM2、2gM5では、デヒドロスクアレン（DSQ）の生産が確認された（図１２）。デヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）にとってデヒドロスクアレン（DSQ）は天然基質である（図１）。このデヒドロスクアレン（DSQ）の生産量の違いが、親（出発原材料）の１−ｇｅｎ変異体(1gM2)よりも2gM2、2gM5が色の濃いコロニーとなった理由と推察された。
2gM3、2gM4、2gM6はいずれも、それらの親（出発原材料）の１−ｇｅｎ変異体(1gM8)よりボトリオコッセン、スクアレン(SQ)ともに生産量が増加していた。全体としての活性があがったものと思われる。その主な要因は、SSL1の翻訳開始効率の向上によるものであると推察されるが、特にF137L変異を持つ2gM3はデヒドロスクアレン（DSQ）／スクアレン(SQ)の増加が最も顕著であり、この変異は更なる活性促進をもたらしている要素である可能性が示唆される。
The product analysis results of the 1-gen mutant and the 2-gen mutant are shown in FIG.
Although 2gM2 and 2gM5 did not increase the amount of squalene synthesized compared to the parent (starting raw material) 1-gen mutant (1gM2), production of dehydrosqualene (DSQ) was confirmed in 2gM2 and 2gM5 (Fig. 12). Dehydrosqualene (DSQ) is a natural substrate for dehydrosqualene desaturase (CrtN) (FIG. 1). This difference in production amount of dehydrosqualene (DSQ) was presumed to be the reason why 2gM2 and 2gM5 became darker colonies than the parent (starting material) 1-gen mutant (1gM2).
Both 2gM3, 2gM4, and 2gM6 had increased production of both botryococcene and squalene (SQ) compared to their parent (starting material) 1-gen mutant (1gM8). It seems that the activity as a whole increased. The main cause is presumed to be due to the improvement of SSL1 translation initiation efficiency. In particular, 2gM3 with F137L mutation has the most significant increase in dehydrosqualene (DSQ) / squalene (SQ). It is suggested that may be an element that further promotes activity.
そこで、2gM3のSSL3に存在する３つのアミノ酸変異（K27R、F137L、A175V）について、それぞれの効果を調べるために、図１２に示すように点変異を有する#1〜#5 の変異体を作製し、それぞれのSSL3に存在するアミノ酸変異の効果を評価した。
各変異体は以下のとおりPCRにより点変異を導入することにより作製した。
#1は鋳型である2gM3のA175Vを野生型のアミノ酸に置換させたものである。
#2は鋳型である1gM8にF137Lのアミノ酸置換変異を導入したものである。
#3は野生型のSSL3遺伝子の鋳型（pUC18m-MHSSL3his）にF137Lのアミノ酸置換変異を導入したものである。
#4は鋳型である2gM3のK27R 及びA175Vを野生型のアミノ酸に置換させたものである。
#5は鋳型である2gM3のK27Rを野生型のアミノ酸に置換させたものである。
PCR反応の組成は以下のとおりである：
KOD Plus neo TYB、KOD-401、使用量 1 U
反応条件はdNTP濃度0.2 mM、10 × KOD Plus neo bufferの組成は、60mM (NH4)2SO4、100mM KCl、1.2M Tris-HCl (25℃でpH 8.8)、1% Triton（登録商標）X-100、0.01% BSA、1.5mMMgSO4
増幅サイクルは、94℃で2min →（98℃で10秒 、68℃で2 min 30秒）を25サイクル → 68℃で10分とした。PCR増幅率は45倍であった（鋳型：100 ng、 最終収率： 4500 ng）。
上記各変異導入のためExSite-PCR法で以下の適切なプライマーセットを使用して増幅させ、Slic方法（Jeong 2013 AEM）を用いてクローニングを行った。
ssl3-R27-F：5'-ATGGCATTTCGTCGCAAACGTCGC-3' （配列番号8）
ssl3-R27-R：5'-GCGACGAAATGCCATCAGCATCATTTG-3'（配列番号9）
ssl3-V175-F：5'-TCACCAACAATGGTCCGGTGGCCAT-3'（配列番号10）
ssl3-V175-R：5'-GACCATTGTTGGTGAACGCGTACAG-3'（配列番号11）
ssl3-F137L-F：5'-CTGTCCAAACAGGACCAAGAACTTATC-3'（配列番号12）
ssl3-F137L-R：5'-GTCCTGTTTGGACAGTTTCAGAAATTCTTC-3'（配列番号13）
ssl3-A151-F：5'-GTATGAAACTGGGCAAAGAAATGACCGTGT-3'（配列番号14）
ssl3-A151-R：5'-TGCCCAGTTTCATACACATATCCGTGATAA-3'（配列番号15）
ssl3-L289-F：5'-TGTCTTTAAATTCTGCGCGGTGCCG-3'（配列番号16）
ssl3-L289-R：5'-CAGAATTTAAAGACACCTTCATCCCAAACCAG-3'（配列番号17）
Therefore, in order to examine the effects of each of the three amino acid mutations (K27R, F137L, A175V) present in 2gM3 SSL3, mutants # 1 to # 5 having point mutations as shown in FIG. 12 were prepared. The effect of amino acid mutations present in each SSL3 was evaluated.
Each mutant was prepared by introducing a point mutation by PCR as follows.
# 1 is a template in which A175V of 2gM3 as a template is replaced with a wild-type amino acid.
# 2 is obtained by introducing an amino acid substitution mutation of F137L into 1gM8 as a template.
# 3 is obtained by introducing an amino acid substitution mutation of F137L into a wild-type SSL3 gene template (pUC18m-MHSSL3his).
# 4 is obtained by substituting K27R and A175V of 2gM3, which are templates, with wild-type amino acids.
# 5 is obtained by substituting K27R of 2gM3 as a template with a wild type amino acid.
The composition of the PCR reaction is as follows:
KOD Plus neo TYB, KOD-401, usage 1 U
Reaction conditions are dNTP concentration 0.2 mM, composition of 10 × KOD Plus neo buffer is 60 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 100 mM KCl, 1.2 M Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C.), 1% Triton (registered trademark) X-100, 0.01% BSA, 1.5 mM MgSO 4
The amplification cycle was 94 ° C. for 2 minutes → (98 ° C. for 10 seconds, 68 ° C. for 2 minutes 30 seconds), 25 cycles → 68 ° C. for 10 minutes. The PCR amplification rate was 45 times (template: 100 ng, final yield: 4500 ng).
In order to introduce each of the above mutations, amplification was performed using the following appropriate primer set by the ExSite-PCR method, and cloning was performed using the Slic method (Jeong 2013 AEM).
ssl3-R27-F: 5'-ATGGCATTTCGTCGCCAAACGTCGC-3 '(SEQ ID NO: 8)
ssl3-R27-R: 5'-GCGACGAAATGCCATCAGCATCATTTG-3 '(SEQ ID NO: 9)
ssl3-V175-F: 5'-TCACCAACAATGGTCCGGTGGCCAT-3 '(SEQ ID NO: 10)
ssl3-V175-R: 5'-GACCATTGTTGGTGAACGCGTACAG-3 '(SEQ ID NO: 11)
ssl3-F137L-F: 5'-CTGTCCAAACAGGACCAAGAACTTATC-3 '(SEQ ID NO: 12)
ssl3-F137L-R: 5'-GTCCTGTTTGGACAGTTTCAGAAATTCTTC-3 '(SEQ ID NO: 13)
ssl3-A151-F: 5'-GTATGAAACTGGGCAAAGAAATGACCGTGT-3 '(SEQ ID NO: 14)
ssl3-A151-R: 5'-TGCCCAGTTTCATACACATATCCGTGATAA-3 '(SEQ ID NO: 15)
ssl3-L289-F: 5'-TGTCTTTAAATTCTGCGCGGTGCCG-3 '(SEQ ID NO: 16)
ssl3-L289-R: 5'-CAGAATTTAAAGACACCTTCATCCCAAACCAG-3 '(SEQ ID NO: 17)
３−ｇｅｎ変異体の生産物解析結果を図１２に示す
図１２の#3は、野生型のSSL3遺伝子に２−ｇｅｎ変異体において導入されたアミノ酸変異F137Lを導入することにより作製した３−ｇｅｎ変異体である。野生型と比較して、#3の３−ｇｅｎ変異体ではボトリオコッセン合成活性が増加した。そしてスクアレン(SQ)の蓄積は確認されなかった。
The product analysis result of the 3-gen mutant is shown in FIG. 12. # 3 in FIG. 12 is a 3-gen prepared by introducing the amino acid mutation F137L introduced in the 2-gen mutant into the wild-type SSL3 gene. It is a mutant. Compared to the wild type, the # 3 3-gen mutant increased the activity of synthesizing botryococcene. And accumulation of squalene (SQ) was not confirmed.
図１２の#2は、１−ｇｅｎ変異体(1gM8)にアミノ酸変異F137Lを導入した変異体である。当該変異体#2において、１−ｇｅｎ変異体(1gM8)に比べてスクアレン(SQ)、ボトリオコッセンの合成活性がともに増加した。この異なるアミノ酸変異を持つ両者においてアミノ酸変異F137Lは、単独で細胞活性を促進する変異であることが分かった。 # 2 in FIG. 12 is a mutant in which the amino acid mutation F137L is introduced into the 1-gen mutant (1 gM8). In the mutant # 2, both the synthesis activities of squalene (SQ) and botryococcene were increased compared to the 1-gen mutant (1 gM8). In both of these different amino acid mutations, the amino acid mutation F137L alone was found to be a mutation that promotes cell activity.
本発明の方法によれば、ボトリオコッセンの定量を行うことなくボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を作出することができる。本発明の方法により作出されるボトリオコッセン合成能を促進させるスクアレン合成酵素様（SSL）酵素変異体を発現する宿主細胞は、ボトリオコッセンを効率よく合成するのに有用である。すなわち、本発明により、良質な次世代燃料としてその利用価値が注目されるボトリオコッセンを効率よく合成することが可能となる。 According to the method of the present invention, it is possible to produce a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant that promotes the ability to synthesize botriococcene without quantifying botryococcene. A host cell expressing a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant that promotes the ability to synthesize botryococcene produced by the method of the present invention is useful for efficiently synthesizing botryococcene. That is, according to the present invention, it is possible to efficiently synthesize botryococcene, which has attracted attention as a high-quality next-generation fuel.
Claims (11)
（１）ボトリオコッセン合成に係わるスクアレン合成酵素様酵素１（SSL1）遺伝子及びスクアレン合成酵素様酵素３（SSL3）遺伝子を含むプラスミドを構築し、次にSSL3遺伝子に変異を導入した変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをデヒドロスクアレン不飽和化酵素（CrtN）発現プラスミドが導入された宿主細胞に導入し、色素の蓄積を指標として、スクアレン合成能を促進させるSSL3遺伝子変異体を有する宿主細胞（1-gen変異体）を取得する工程、
（２）工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を含むプラスミドを親（出発原材料）として、SSL1/SSL3変異体遺伝子領域に変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された宿主細胞に導入し、1-gen変異体の色素蓄積量との比較で色素蓄積量の増加を指標として、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子を有する宿主細胞（2-gen変異体）を取得する工程、及び
（３）工程（２）で得られた2-gen変異体のSSL1/SSL3変異体遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうち、工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL3遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸変異のうちボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与していない変異を、野生型のSSL3遺伝子がコードするタンパク質の対応するアミノ酸で再置換する変異を導入し、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する宿主細胞（3-gen変異体）を取得する工程、
を含む、方法。 A method for producing a squalene synthase-like (SSL) enzyme mutant that promotes the synthesis of botryococcene,
(1) A plasmid containing a squalene synthase-like enzyme 1 (SSL1) gene and a squalene synthase-like enzyme 3 (SSL3) gene involved in the synthesis of botryococcene is constructed, and then a mutation plasmid library in which mutations are introduced into the SSL3 gene A host having an SSL3 gene variant that is prepared and introduced into a host cell into which a dehydrosqualene desaturase (CrtN) expression plasmid has been introduced, and that promotes squalene synthesis, using pigment accumulation as an indicator Obtaining a cell (1-gen mutant),
(2) SSL1 / SSL3 mutation using as a parent (starting material) a plasmid containing the SSL1 gene of the 1-gen mutant obtained in step (1) and the SSL3 gene into which the mutation has been introduced (SSL1 / SSL3 mutant gene) Mutation is introduced into the somatic gene region, a mutant plasmid library is prepared, the plasmid library is introduced into a host cell into which the CrtN expression plasmid has been introduced, and the amount of dye accumulated is compared with the amount of dye accumulated in the 1-gen mutant. Obtaining a host cell (2-gen mutant) having an SSL1 / SSL3 mutant gene introduced with a mutation that promotes the ability to synthesize botryococcene and squalene, using the increase in accumulation amount as an index; and (3) step (2 Among the amino acid mutations of the protein encoded by the SSL1 / SSL3 mutant gene of the 2-gen mutant obtained in step 1), the amino acid mutation of the protein encoded by the SSL3 gene of the 1-gen mutant obtained in step (1) Out of Introduce a mutation that does not specifically contribute to the promotion of ococsen synthesis ability, and replaces it with the corresponding amino acid of the protein encoded by the wild-type SSL3 gene. Obtaining a host cell (3-gen mutant) having an SSL1 gene and an SSL3 gene into which a mutation to be introduced is introduced,
Including a method.
（１）ボトリオコッセン合成に係わるSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を含むプラスミドを構築し、次にSSL3遺伝子にエラープローンPCRにより変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された大腸菌に導入し、黄色色素の蓄積を指標として、スクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL3遺伝子であって、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異であるSSL3のアミノ酸配列（配列番号4）に示される137番目のアミノ酸がフェニルアラニン（F）からロイシン（L）に置換されたF137L変異を少なくとも導入されたSSL3遺伝子を有する大腸菌（1-gen変異体）を取得する工程、
（２）工程（１）で得られた1-gen変異体のSSL1遺伝子及び変異が導入されたSSL3遺伝子（SSL1/SSL3変異体遺伝子）を含むプラスミドを出発原材料として、SSL1/SSL3変異体遺伝子領域にエラープローンPCRにより変異を導入し変異プラスミド・ライブラリーを作製し、該プラスミド・ライブラリーをCrtN発現プラスミドが導入された大腸菌に導入し、1-gen変異体の黄色色素蓄積量との比較で黄色色素蓄積量の増加を指標として、ボトリオコッセン及びスクアレン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1/SSL3変異体遺伝子を有する大腸菌（2-gen変異体）を取得する工程、及び
（３）野生型のSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子に、（２）の工程で得られた2-gen変異体が持つ変異のうち、（１）の工程で得られた1-gen変異体が持たない、ボトリオコッセン合成能の促進に特異的に寄与する変異を導入することにより、スクアレン合成能を促進させずボトリオコッセン合成能を促進させる変異が導入されたSSL1遺伝子及びSSL3遺伝子を有する大腸菌（3-gen変異体）を取得する工程、
を含む、方法。 A method for producing an SSL enzyme mutant that promotes the ability to synthesize botryococcene,
(1) A plasmid containing the SSL1 gene and SSL3 gene involved in the synthesis of botryococcene is constructed, and then mutation is introduced into the SSL3 gene by error-prone PCR to produce a mutant plasmid library. The plasmid library is a CrtN expression plasmid. Is an SSL3 gene introduced into Escherichia coli into which is introduced, and a mutation that promotes squalene synthesis ability using the accumulation of yellow pigment as an index, and that promotes botryococcene synthesis ability without promoting squalene synthesis ability Escherichia coli (1-gen mutant) having the SSL3 gene introduced with at least the F137L mutation in which the 137th amino acid shown in the amino acid sequence of SSL3 (SEQ ID NO: 4) is replaced with leucine (L) from phenylalanine (F) Process to acquire,
(2) SSL1 / SSL3 mutant gene region using as a starting material the plasmid containing the SSL1 gene of the 1-gen mutant obtained in step (1) and the SSL3 gene into which the mutation has been introduced (SSL1 / SSL3 mutant gene) A mutation plasmid library was prepared by introducing mutations into error-prone PCR, and the plasmid library was introduced into E. coli into which the CrtN expression plasmid was introduced, and compared with the amount of yellow pigment accumulated in the 1-gen mutant. Obtaining an Escherichia coli (2-gen mutant) having an SSL1 / SSL3 mutant gene introduced with a mutation that promotes the ability to synthesize botryococcene and squalene, using an increase in yellow pigment accumulation as an index, and (3) wild type Among the mutations of the 2-gen mutant obtained in the step (2) in the SSL1 gene and SSL3 gene, the ability to synthesize botryococcene, which the 1-gen mutant obtained in the step (1) does not have Specific to promotion Step of obtaining by introducing contributing mutation, E. coli (3-gen variants) having SSL1 gene and SSL3 gene mutation has been introduced to promote Botoriokossen synthesizing ability without promoting squalene synthesizing ability to,
Including a method.
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