JP2018183057A - Genotyping method of type, subtype and the like of pathogen such as virus, bacterium, and parasite - Google Patents

Genotyping method of type, subtype and the like of pathogen such as virus, bacterium, and parasite Download PDF

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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide: a primer set for LAMP to determine the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium and parasite, especially the subtype of an influenza virus; a method for determining the type or subtype using the primer set; and a kit for implementing the method.SOLUTION: The present invention is a gene (RNA or DNA) that serves as a basis for classification of the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium and parasite, where all genes that belong to a type or subtype are divided into several small groups on the basis of the similarity of the base sequence, and the primers are designed so that the genes belonging to each small group can be detected by the smallest number of primers possible. The present invention is also a method for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium and parasite that is the detection target by using primers prepared as described above.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明は、多様な遺伝子（ＲＮＡ、ＤＮＡ）の型別を高精度に行う判定方法に関するものであって、より具体的には、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定に関する遺伝子増幅法（または核酸増幅法）に使用するプライマーの設計方法、該プライマー、該プライマーを用いた遺伝子型別法および該判定のためのキットに関する。   The present invention relates to a determination method for accurately classifying various genes (RNA, DNA), and more specifically, a type of a pathogen such as a DNA virus or RNA virus, a bacterium, a parasite, or the like. The present invention relates to a method for designing a primer used in a gene amplification method (or nucleic acid amplification method) relating to subtype determination, the primer, a genotyping method using the primer, and a kit for the determination.

インフルエンザウイルスはヒトや家畜、家禽に重篤な呼吸器症状を引き起こす、人獣共通感染症の病原体である。
鳥インフルエンザウイルスは、Ａ型のインフルエンザウイルスに属し、自然界においては、野生の水禽類を自然宿主として存在している。水禽類が鳥インフルエンザウイルスに感染しても、一般的には無症状であるが、ニワトリが感染すると高い致死性を示す場合があり、家禽を飼育する農場などにおいては、鳥インフルエンザウイルスの感染に対する対策は必要不可欠である。
一般的には鳥インフルエンザウイルスはヒトには感染しないと考えられてきた。しかし、１９９７年に香港で高病原性のＨ５Ｎ１亜型の鳥インフルエンザウイルスによるヒトの感染が初めて報告され、鳥インフルエンザウイルスの感染によってヒトが高率に死亡することが明らかになった。これ以後、アジアを中心にして高病原性のＨ５Ｎ１亜型ウイルスによる家禽の感染が続いており、畜産業へ多大な経済的被害をもたらすと共に、ヒト感染の継続によって新型インフルエンザの誕生の脅威が続いている。また、２０１３年には中国で、低病原性のＨ７Ｎ９亜型ウイルスによるヒトの致死的感染が起こり、新たな脅威が加わっている。
鳥インフルエンザの対策で重要なことは、早期摘発とそれによるウイルスの撲滅と蔓延防止である。本発明者らは、ウイルスの早期摘発をさらに強化するために、信頼度の高いＬＡＭＰ法の開発を行った。 Influenza virus is a zoonotic pathogen that causes serious respiratory symptoms in humans, livestock and poultry.
Avian influenza viruses belong to type A influenza viruses, and in the natural world, wild waterfowls exist as natural hosts. Infection with avian influenza viruses is generally asymptomatic even if waterfowl is infected, but when infected with chickens, they can be highly lethal. Countermeasures are indispensable.
In general, it has been thought that avian influenza viruses do not infect humans. However, in 1997, the first human infection with a highly pathogenic H5N1 avian influenza virus was reported in Hong Kong, and it was revealed that human infections were caused by a bird influenza virus at a high rate. Since then, poultry infections with highly pathogenic H5N1 subtype viruses have continued, mainly in Asia, resulting in tremendous economic damage to the livestock industry and the ongoing threat of new influenza caused by continued human infection. ing. In 2013, a lethal infection of humans with a low pathogenic H7N9 subtype virus occurred in China, and a new threat has been added.
The key to fighting avian influenza is early detection and the eradication and prevention of the spread of viruses. The present inventors have developed a highly reliable LAMP method in order to further enhance early detection of viruses.

鳥インフルエンザウイルスを含むインフルエンザウイルスの粒子表面には、ヘマグルチニン（ＨＡ；ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ；ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）と称されるスパイクタンパク質が存在している。ＨＡはウイルスが細胞にあるレセプターへ結合する際に必要な蛋白質で、ＮＡはレセプターを破壊する酵素で、細胞で作られた子孫ウイルスがレセプターを破壊して細胞表面からリリースされる際に必要な蛋白質である。Ａ型インフルエンザウイルスの場合、ＨＡは１６種類（Ｈ１〜Ｈ１６）、ＮＡは９種類（Ｎ１〜Ｎ９）に血清学的に分類される。また、インフルエンザウイルスはＨＡとＮＡの組み合わせによって、多くの亜型に分類されている。これら亜型の中で、Ｈ５亜型、Ｈ７亜型のＡ型インフルエンザウイルスによる家禽の感染は国際的に殺処分の対象である。また、これらの亜型のウイルスによるヒトへの感染は、時に高い致死率を招くことが知られており、緊急の対策が求められている。   Spike proteins called hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are present on the surface of influenza virus particles including avian influenza virus. HA is a protein necessary for the virus to bind to a receptor in the cell, NA is an enzyme that destroys the receptor, and a progeny virus produced in the cell destroys the receptor and is released from the cell surface. It is a protein. In the case of influenza A virus, it is serologically classified into 16 types (H1 to H16) of HA and 9 types (N1 to N9) of NA. In addition, influenza viruses are classified into many subtypes depending on the combination of HA and NA. Among these subtypes, infection of poultry with influenza A viruses of the H5 and H7 subtypes is an international target for slaughter. Moreover, it is known that human infection with these subtypes of viruses sometimes causes high mortality, and urgent measures are required.

鳥インフルエンザの迅速な制圧に必要なことは、可能な限り速やかにウイルスの亜型を判定し、殺処分の対象となるウイルスか、人に高致死性を誘発する可能性が高いウイルスかを明らかにすることである。これらが確認されれば、迅速な防疫措置によって、感染の拡大、新型ウイルスの誕生を効果的に防止することが可能になる。
現在、最も信頼度の高い鳥インフルエンザウイルスのＨＡ亜型の判定方法は、リアルタイムＰＣＲ法である（特許文献１）。この方法はＨ５亜型またはＨ７亜型のウイルスを幅広く、漏れなく検出できる利点を有しており、公定法として国内外で広く利用されている。しかし、リアルタイムＰＣＲ法は、検出工程が煩雑で、訓練された技術者と専用の高額機器を必要とするため、検査を実施できる機関が限定される。また、リアルタイムＰＣＲ法は検出に３時間を要するため、迅速性に問題がある。このため、リアルタイムＰＣＲ法は多検体の迅速な診断には不向きで、多くのサンプルが次々と持ち込まれると、個々に対応できず、診断の遅れ、感染の拡大を招くリスクが増大すると指摘されている。また、リアルタイムＰＣＲ法に用いられている、現行の混合塩基を使用したプライマー・プローブプライマーでは、現在においても検出漏れが起こる可能性があり、将来において遺伝子の多様性がさらに拡大すれば、検出漏れによって診断が困難になる可能性が高い。
他方、ＬＡＭＰ法（特許文献２および３）は、検出工程が簡便で、迅速（１時間）にウイルスを検出でき、特殊な機器を有しないため、一般検査室で利用できる利点を有している。鳥インフルエンザにおいても、一部の限定されたウイルスを対象にして、高感度かつ迅速に検出する方法が報告されている（特許文献４および特許文献５）が、その信頼度はリアルタイムＰＣＲ法には及ばない。現行のＬＡＭＰ法は一部のウイルス集団を検出できても、多様なウイルス集団を幅広く検出することはできず、検出漏れが頻繁に起こると指摘されている。 What is necessary for the rapid control of avian influenza is to determine the virus subtype as soon as possible and clarify whether it is a virus to be killed or highly likely to induce high lethality in humans Is to do. If these are confirmed, it will be possible to effectively prevent the spread of infection and the birth of a new virus by quick prevention measures.
Currently, the most reliable method for determining the HA subtype of avian influenza virus is the real-time PCR method (Patent Document 1). This method has the advantage that a wide variety of H5 or H7 subtype viruses can be detected without omission, and is widely used as an official method in Japan and overseas. However, since the real-time PCR method involves a complicated detection process and requires a trained technician and a dedicated high-priced device, the institutions that can perform the inspection are limited. Moreover, since the real-time PCR method requires 3 hours for detection, there is a problem in rapidity. For this reason, it is pointed out that the real-time PCR method is not suitable for rapid diagnosis of many specimens, and if many samples are brought in one after another, it cannot respond individually, increasing the risk of delaying diagnosis and spreading infection. Yes. In addition, in the primer / probe primer using the current mixed base used in the real-time PCR method, there is a possibility of detection failure even now, and if the gene diversity further expands in the future, detection failure will occur. The diagnosis is likely to be difficult.
On the other hand, the LAMP method (Patent Documents 2 and 3) has an advantage that it can be used in a general laboratory because the detection process is simple, the virus can be detected quickly (1 hour), and there is no special equipment. . In the case of avian influenza, a method for detecting a limited virus with high sensitivity and speed has been reported (Patent Document 4 and Patent Document 5). It doesn't reach. Although the current LAMP method can detect a part of the virus population, it cannot be widely detected, and it has been pointed out that detection failures frequently occur.

上述のように、ウイルス、特に鳥インフルエンザウイルスの検出およびその亜型の特定のためには、信頼性の高いＬＡＭＰ法の確立が待たれているところであるが、現在のところ、まだ、そのような方法は確立されていない。   As described above, establishment of a reliable LAMP method is awaited for detection of viruses, particularly avian influenza viruses, and identification of their subtypes. The method has not been established.

特開2010-252659JP2010-252659 WO2000/28082WO2000 / 28082 WO2002/024902WO2002 / 024902 WO2006/049061WO2006 / 049061 特開2011-167207JP2011-167207

上記の事情に鑑み、本発明者らは、簡便かつ迅速に、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体、特にインフルエンザウイルスの亜型を漏れなく検出することを解決課題とし、鋭意研究を進めた。
すなわち、本発明は、インフルエンザウイルスなどのウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を、遺伝子増幅法（または、核酸増幅法、例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法）で判定するためのプライマーの設計方法、該プライマーのセット、該プライマーセットを用いたウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定方法、該方法を実施するためのキットの提供を目的とする。 In view of the above circumstances, the present inventors have made intensive researches with the objective of solving the problem of easily and rapidly detecting pathogens such as viruses, bacteria, and parasites, particularly subtypes of influenza viruses, without omission.
That is, the present invention is a primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus such as an influenza virus, a bacterium, or a parasite by a gene amplification method (or a nucleic acid amplification method such as a LAMP method or a PCR method). It is an object of the present invention to provide a design method, a primer set, a method for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite using the primer set, and a kit for carrying out the method.

発明者らは、インフルエンザウイルス、特に近年家禽への感染による被害の他、ヒトへの感染が懸念されているＡ型ウイルスのＨ５亜型、Ｈ７亜型等に属するインフルエンザウイルスの全てのＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子を漏れ無く検出し、任意のインフルエンザウイルスの亜型を確実に判定できる遺伝子増幅（または核酸増幅）用のプライマーの作製方法を検討した。
任意の亜型に属するＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子のすべてを検出するには、該亜型に属する全てのＨＡ遺伝子またはＮＡ遺伝子を、亜型特異的かつ高感度に増幅し得るプライマーを設計する必要があった。これのみならず、実用性を高めるためには、用いるプライマーの本数をできる限り少数にする必要もあった。
そこで、本発明者らは、ＨＡ遺伝子およびＮＡ遺伝子で、ある特定のＨＡ亜型（例えばＨ５亜型）に注目した。その亜型の母集団に属す全てのＨＡ遺伝子を、塩基配列に基づいていくつかのグループ（ポピュレーションあるいは母集団）に分け、各グループに属するＨ５亜型のＨＡ遺伝子を検出し得るプライマーを、可能な限り少ない数になるように設計する方法を見出し、本発明を完成させた。
ポピュレーションプライマー（Ｐプライマー）とは、本発明によって、初めて示されるプライマーの概念であり、遺伝子の集団を近縁な遺伝子からなる母集団に分け、母集団毎に設計するプライマーのことである。母集団ごとに設計したＰプライマーを混合して使用すれば、多様な遺伝子を漏れなく検出できると考えられる。本発明の実施例においては、この着想を実証するべく、Ｐプライマーの新規設計方法を見出し、Ｐプライマーの有用性について検討した。 The inventors have identified all the HA genes of influenza viruses belonging to the H5 subtype, H7 subtype, etc. of influenza viruses, particularly the A5 viruses that are feared to be infected by humans in addition to the damage caused by infection of poultry in recent years. A method for preparing a primer for gene amplification (or nucleic acid amplification) that can detect the NA gene without omission and reliably determine the subtype of any influenza virus was examined.
In order to detect all HA genes or NA genes belonging to any subtype, it is necessary to design a primer that can amplify all HA genes or NA genes belonging to the subtype in a subtype-specific manner with high sensitivity. there were. In addition to this, in order to improve practicality, it was necessary to use as few primers as possible.
Therefore, the present inventors have focused on a specific HA subtype (for example, H5 subtype) in the HA gene and the NA gene. All the HA genes belonging to the subtype population are divided into several groups (population or population) based on the base sequence, and primers capable of detecting the H5 subtype HA gene belonging to each group, The present invention has been completed by finding a method for designing the number as small as possible.
The population primer (P primer) is a primer concept shown for the first time according to the present invention, and is a primer designed to divide a gene population into populations composed of closely related genes and to design each population. If P primers designed for each population are mixed and used, various genes can be detected without omission. In the examples of the present invention, in order to prove this idea, a novel P primer design method was found and the usefulness of the P primer was examined.

すなわち、本発明は以下の（１）〜（２８）である。
（１）病原体の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
（２）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（１）に記載のフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（３）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（１）または（２）に記載のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーのセット。
（４）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程、
（５）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記工程（ａ）および／または工程（ｅ）が下記の工程であることを特徴とする上記（４）に記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であってコンセンサス配列の塩基と異なる塩基がＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程、
（６）前記Ｆ１領域の５’末端の塩基とＦ２領域の５’末端の塩基との間に、４０塩基〜６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする上記（４）または（５）に記載のＦＩＰプライマーのセット。
（７）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（４）ないし（６）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号１〜配列番号２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１１５〜配列番号１１９および配列番号１５６で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３１〜配列番号１３３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（８）病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（４）ないし（６）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセット。
（９）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（８）に記載のＢＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号４６〜配列番号８２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２２〜配列番号１２８および配列番号１５７で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３４〜配列番号１３６で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（１０）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（４）または（５）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
（１１）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（１０）に記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（４）または（５）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（１２）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、上記（４）または（５）に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦ３プライマーのセット。
（１３）前記Ｆ３領域の３’末端の塩基と前記Ｆ２領域の５’末端の塩基との間に０〜６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ３領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする上記（１０）ないし（１２）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（１４）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（１０）ないし（１３）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号２１〜配列番号３４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３７〜配列番号１３８で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（１５）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、上記（１０）ないし（１３）のいずれかに記載のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセット。
（１６）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（１５）に記載のＢ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号８３〜配列番号９２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２９で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４２で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（１７）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（４）または（５）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
（１８）前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする上記（１７）に記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、上記（４）または（５）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（１９）病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、上記（４）または（５）に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦＬプライマーのセット。
（２０）前記ＦＬ領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする上記（１７）ないし（１９）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（２１）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（１７）ないし（２０）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号３５〜配列番号４５で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３９〜配列番号１４１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（２２）上記（１７）ないし（２０）のいずれかに記載のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセット。
（２３）前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする上記（２２）に記載のＢＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号９３〜配列番号１１４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１３０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（２４）上記（１）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットおよび上記（３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
（２５）上記（４）ないし（７）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセットおよび上記（８）または（９）のいずれかに記載のＢＩＰプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。
（２６）上記（１０）ないし（１４）のいずれかに記載のＦ３プライーのセットおよび上記（１５）または（１６）に記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする上記（２５）に記載の方法。
（２７）上記（１７）ないし（２１）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセットおよび上記（２２）または（２３）に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする上記（２６）に記載の方法。
（２８）上記（１）もしくは（２）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、上記（３）に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、上記（４）ないし（７）のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット、上記（８）もしくは（９）に記載のＢＩＰプライマーのセット、上記（１０）ないし（１４）のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット、上記（１５）もしくは（１６）に記載のＢ３プライマーのセット、上記（１７）ないし（２１）のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット、または、上記（２２）もしくは（２３）に記載のＢＬプライマーのセットの少なくともいずれかのプライマーのセットを含む、病原体の型または亜型を判定するためのキット。 That is, this invention is the following (1)-(28).
(1) An oligonucleotide primer for pathogen type or subtype determination, wherein the following steps (a) to (f) are performed, and a forward primer setting region consensus determined in steps (b) and (e) A set of forward primers consisting of sequences.
(A) Sense sequences or antisense sequences of genes to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region having high homology between the genes to be tested is a forward primer setting region Process to choose as,
(B) a step of determining a consensus sequence for the forward primer setting region;
(C) Comparing the consensus sequence with the bases corresponding to the base sequence of the forward primer region of each test target gene, and among the base sequences of the forward primer setting region of the test target gene, what is the base of the consensus sequence? Counting the number of different bases for each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the forward primer setting region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence for the setting region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;
(2) The forward primer set according to (1) above, wherein the step (a) and / or the step (d) are the following steps.
(A) Sense sequences or antisense sequences of the gene to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are the same. Single base X and / or a mixed base composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C at 80% or more of the bases corresponding to each sequence Selecting a continuous base sequence region containing Y and having a single base X and / or mixed base Y occupying 90% or more as a forward primer setting region;
(D) a step of extracting a test target gene whose number of bases counted in the step (c) is 3 or more,
(3) A set of reverse primers, which are oligonucleotide primers for pathogen type or subtype determination, comprising a complementary sequence of the base sequence of the forward primer described in (1) or (2) above.
(4) An oligonucleotide primer for determining the pathogen type or subtype by the LAMP method, wherein the following steps (a) to (g) are performed and determined in steps (c) and (f): A pair of F2 region and F1 region consensus sequences, and a FIP primer comprising a base sequence having a base sequence of the F2 region on the 3 ′ end side and a complementary sequence of the base sequence of the F1 region on the 5 ′ end side set.
(A) A step of aligning sense sequences or antisense sequences of a gene to be examined, comparing bases at corresponding positions between the sequences, and selecting a region having high homology between the sequences as the F2 region ,
(B) a step of selecting a region that exists 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the F2 region selected in step (a) and that satisfies the same requirements as the F2 region as the F1 region;
(C) The base sequences of the F1 region and the base sequence of the F2 region of each gene to be examined are aligned, and the consensus sequence of each region is determined from the aligned base sequence of the F1 region and the base sequence of the F2 region Selecting as a pair,
(D) The consensus sequence of the F1 region and the bases at positions corresponding to the base sequence of the F1 region of each test target gene, and the bases at the positions corresponding to the consensus sequence of the F2 region and the base sequence of the F2 region of each test target gene A step of counting the number of bases different from the bases of the consensus sequences of each region included in the base sequences of the F1 region and F2 region of each test target gene for each test target gene,
(E) extracting a test target gene whose base number counted in step (d) is a certain number or more,
(F) The F1 region base sequences and F2 region base sequences of the gene to be examined extracted in step (e) are realigned, and the aligned F1 region base sequences and F2 region base sequences are respectively Determining a new consensus sequence for the region of and selecting as a pair;
(G) repeating the steps (d), (e) and (f) until there are no genes to be tested to be extracted;
(5) The FIP according to (4), wherein the primer is an oligonucleotide primer for pathogen type or subtype determination, wherein the step (a) and / or the step (e) are the following steps: A set of primers.
(A) Sense sequences or antisense sequences of the gene to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are the same. Single base X and / or a mixed base composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C at 80% or more of the bases corresponding to each sequence Selecting a continuous base sequence region composed of Y as the F2 region;
(E) a test target gene having 4 or more bases counted in the step (d), and a base having a counted number of 3 different from the base of the consensus sequence is in the F1 region or the F2 region A process of extracting a test target gene biased to one of the following:
(6) There are 40 to 60 bases between the 5 ′ terminal base of the F1 region and the 5 ′ terminal base of the F2 region, and / or the number of bases of the F1 region and F2 region is 10 The set of FIP primers according to (4) or (5) above, wherein the number is from 25 to 25 bases.
(7) The subtype is influenza A virus H5 subtype, and is any primer set shown in the following (a) to (c): (4) to (6) A set of FIP primers according to any one of the above.
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20,
(B) a set consisting of a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119 and SEQ ID NO: 156, or (c) a base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 131 to SEQ ID NO: 133 A set of primers,
(8) A set of BIP primers, which are oligonucleotide primers for pathogen type or subtype determination, comprising a complementary sequence of the base sequence of the FIP primer according to any one of (4) to (6) above.
(9) The BIP primer according to (8) above, wherein the subtype is influenza A virus H5 subtype, and is any primer set shown in the following (a) to (c) Set.
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 82,
(B) a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128 and SEQ ID NO: 157, or (c) a base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 134 to SEQ ID NO: 136 A set of primers,
(10) An oligonucleotide primer for determining the pathogen type or subtype by the LAMP method, wherein the following steps (a) to (f) are performed and determined in steps (b) and (e): A set of F3 primers consisting of a consensus sequence of the F3 region.
(A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein the base sequences existing on the 5 ′ upstream side of the F2 region described in (4) or (5) above are aligned with each other and correspond to each other Comparing the bases at the positions to be selected, and selecting a region having high homology between the genes to be examined as the F3 region,
(B) aligning the base sequences of the F3 region of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned F3 region;
(C) The consensus sequence is compared with the bases corresponding to the base sequence of the F3 region of each test target gene, and the number of bases different from the base of the consensus sequence included in the base sequence of the F3 region of the test target gene is calculated. , The process of counting for each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the F3 region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned F3 region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;
(11) The F3 primer set according to (10) above, wherein the step (a) and / or the step (d) are the following steps.
(A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein the base sequences existing on the 5 ′ upstream side of the F2 region described in (4) or (5) above are aligned with each other and correspond to each other Bases at positions corresponding to each other, a single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are identical, and / or 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences is A, A continuous base sequence comprising a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from T, G, and C, wherein the single base X and / or the mixed base Y accounts for 90% or more Selecting the region as the F3 region;
(D) a step of extracting a test target gene whose number of bases counted in the step (c) is 3 or more,
(12) An oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen by the LAMP method, wherein the F2 region according to (4) or (5) above is a sense sequence or an antisense sequence of a test target gene The base sequences existing 5 ′ upstream of each other are aligned, the bases at the corresponding positions between the sequences are compared, and 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same. And / or 80% or more of the bases at corresponding positions between the sequences include a mixed base Y composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C. A single base X and / or a continuous base sequence region in which mixed base Y occupies 90% or more is selected as the F3 region, and is designed to cover the base sequences of the F3 region of all the test target genes. A set of F3 primers consisting of multiple mixed base primers.
(13) 0 to 60 bases exist between the base at the 3 ′ end of the F3 region and the base at the 5 ′ end of the F2 region, and / or the base number of the F3 region is 10 to 25 bases The F3 primer set according to any one of (10) to (12) above, wherein
(14) Any of (10) to (13) above, wherein the subtype is influenza A virus H5 and is any primer set shown in the following (a) to (c) A set of F3 primers according to claim 1.
(A) a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34,
(B) a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 120, or (c) a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 137 to SEQ ID NO: 138,
(15) An oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen by the LAMP method, comprising B3 comprising a complementary sequence of the base sequence of the F3 primer according to any one of (10) to (13) above A set of primers.
(16) The B3 primer according to (15) above, wherein the subtype is an influenza A virus H5 subtype and is any primer set shown in the following (a) to (c) Set.
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92;
(B) a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 129, or (c) a set comprising a primer of the base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 142,
(17) An oligonucleotide primer for determining the pathogen type or subtype by the LAMP method, wherein the following steps (a) to (f) are performed and determined in steps (b) and (e): A set of FL primers consisting of consensus sequences for the FL region.
(A) Sense sequence or antisense sequence of the gene to be examined, wherein the base sequences existing between the F1 region and the F2 region described in (4) or (5) above are aligned, and each sequence corresponds. Comparing the bases at the positions to be selected, and selecting a region having high homology between each test target gene as the FL region,
(B) aligning the base sequences of the FL region of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned FL region;
(C) The consensus sequence is compared with the bases at the corresponding positions in the base sequence of the FL region of each test target gene, and the number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the FL region of the test target gene is calculated. , The process of counting for each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the FL region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned FL region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;
(18) The set of FL primers according to (17) above, wherein the step (a) and / or the step (d) are the following steps.
(A) Sense sequence or antisense sequence of the gene to be examined, wherein the base sequences existing between the F1 region and the F2 region described in (4) or (5) above are aligned, and each sequence corresponds. Bases at positions corresponding to each other, a single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are identical, and / or 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences is A, A continuous base sequence comprising a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from T, G, and C, wherein the single base X and / or the mixed base Y accounts for 90% or more Selecting the region as the FL region;
(D) a step of extracting a test target gene whose number of bases counted in the step (c) is 3 or more,
(19) An oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen by the LAMP method, wherein the F1 region according to (4) or (5) above is a sense sequence or an antisense sequence of a test target gene And base sequences existing between the F2 regions, comparing bases at corresponding positions between the sequences, and a single base X in which 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same, And / or 80% or more of the bases corresponding to each sequence include a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from A, T, G, and C. A single base X and / or a continuous base sequence region in which mixed base Y accounts for 90% or more is selected as the F3 region, and is designed to cover the base sequences of the F3 region of all the genes to be tested. Set of FL primer comprising a mixed base primer number.
(20) The FL primer set according to any one of (17) to (19) above, wherein the number of bases in the FL region is 10 to 25 bases.
(21) In the above (17) to (20), the subtype is an influenza A virus H5 subtype, and is any primer set shown in the following (a) to (c) A set of FL primers according to any one.
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45,
(B) a set consisting of a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 121, or (c) a set consisting of a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 139 to SEQ ID NO: 141,
(22) A set of BL primers comprising a sequence complementary to the base sequence of the FL primer according to any one of (17) to (20) above.
(23) The BL primer according to (22) above, wherein the subtype is influenza A virus H5 and is any primer set shown in the following (a) to (c) set.
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114,
(B) a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 130, or (c) a set comprising a primer of the base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 143,
(24) Using the set of oligonucleotide primers described in (1) above and the set of oligonucleotide primers described in (3) above, a nucleic acid amplification reaction is performed using a nucleic acid derived from a pathogen gene in a sample as a template. The method of determining the type or subtype of a pathogen in a sample by analyzing the obtained amplified fragment.
(25) A gene of a pathogen in a sample using the FIP primer set according to any of (4) to (7) and the BIP primer set according to any of (8) or (9) above A method of determining the type or subtype of a pathogen in a sample by performing a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method using a nucleic acid derived from the template as a template, and analyzing the obtained amplified fragment.
(26) The F3 ply set according to any one of (10) to (14) above and the B3 primer set according to (15) or (16) above are further used to derive the pathogen gene in the sample. The method according to (25) above, wherein a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method is performed using a nucleic acid as a template, and the obtained amplified fragment is analyzed to determine the type or subtype of the pathogen in the sample.
(27) The FL primer set according to any of (17) to (21) above and the BL primer set according to (22) or (23) above are further used to derive the pathogen gene in the sample. The method according to (26) above, wherein a nucleic acid amplification reaction by the LAMP method is performed using a nucleic acid as a template, and the obtained amplified fragment is analyzed to determine the type or subtype of the pathogen in the sample.
(28) The set of oligonucleotide primers according to (1) or (2) above, the set of oligonucleotide primers according to (3) above, the FIP primer according to any one of (4) to (7) above Set, BIP primer set according to (8) or (9) above, F3 primer set according to any of (10) to (14) above, B3 primer according to (15) or (16) above A set of FL primers according to any of (17) to (21) above, or a set of primers of at least one of the BL primer set according to (22) or (23) above, A kit for determining the type or subtype of a pathogen.

本発明により、所望のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのプライマーのセットを、該型または亜型毎にその分類基準に従って設計することが可能になる。例えば、該プライマーのセットを、インフルエンザウイルスの任意のヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ遺伝子）やノイラミニダーゼ遺伝子（ＮＡ遺伝子）の亜型毎に設計し、使用することにより、検査対象となる亜型に属す遺伝子を、迅速かつ簡便に、漏れなく判定することが可能となる。   The present invention makes it possible to design a set of primers for determining the type or subtype of a pathogen such as a desired virus, bacterium or parasite according to the classification criteria for each type or subtype. For example, by designing and using the primer set for each subtype of influenza virus hemagglutinin gene (HA gene) or neuraminidase gene (NA gene), a gene belonging to the subtype to be examined can be obtained. It is possible to determine quickly and easily without omission.

また、本発明にかかるプライマーのセット、特に、ＬＡＭＰ法用に設計されたプライマーを使用することにより、検査対象のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を、迅速かつ簡便に、漏れなく判定することが可能となる。   In addition, by using a primer set according to the present invention, in particular, a primer designed for the LAMP method, the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite to be tested can be quickly and easily obtained. It becomes possible to judge without omission.

図１は、第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域（または、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、ＦＬ領域）の選定方法を示した模式図である。FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for selecting a forward primer setting region (or F1, F2, F3, FL region) of the first embodiment. 図２は、第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域（または、Ｆ３、ＦＬ領域）に対するプライマーの設計過程を模式的に示した図である。FIG. 2 is a diagram schematically showing a primer design process for the forward primer setting region (or F3, FL region) of the first embodiment. 図３は、第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーのプライマー設定領域（図中の「プライマー領域」）を、ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法を例として説明した図である。FIG. 3 is a diagram illustrating primer setting regions (“primer regions” in the figure) of the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment, using the PCR method and the real-time PCR method as examples. . 図４は、ＦＩＰ領域（Ｆ１領域およびＦ２領域）に、ＦＩＰプライマーを設計する過程を模式的に示した図である。FIG. 4 is a diagram schematically showing a process of designing FIP primers in the FIP region (F1 region and F2 region). １１４本のＰプライマーセット（バージョン１）の設定位置を模式的に示した図（Ａ）と遺伝子（インフルエンザウイルスＶ１２４株）配列上にその位置を示した図である（Ｂ）。図中のＦ１ｃおよびＢ１ｃは、各々、Ｆ１およびＢ１の配列の相補鎖の配列（配列領域）を示す。FIG. 2A schematically shows the set positions of 114 P primer sets (version 1), and the position on the gene (influenza virus V124 strain) sequence (B). F1c and B1c in the figure indicate the sequences (sequence regions) of the complementary strands of the sequences of F1 and B1, respectively. １６本のＰＭ１６プライマーセットの設定位置を模式的に示した図（Ａ）と遺伝子（インフルエンザウイルスＶ１２４株）配列上にその位置を示した図である（Ｂ）。図中のＦ１ｃおよびＢ１ｃは、各々、Ｆ１およびＢ１の配列の相補鎖の配列（配列領域）を示す。It is the figure (A) which showed typically the setting position of 16 PM16 primer sets, and the figure which showed the position on the gene (influenza virus V124 strain) arrangement | sequence (B). F1c and B1c in the figure indicate the sequences (sequence regions) of the complementary strands of the sequences of F1 and B1, respectively. １１４本のＰプライマーセット（バージョン１）の各プライマー設定領域における各塩基の塩基出現率を示した図である。It is the figure which showed the base appearance rate of each base in each primer setting area | region of 114 P primer sets (version 1). 図８は本実施例で用いた、Ｈ５亜型の鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子について、１５株のＰＣＲテンペレートの塩基配列をアライメントした図である。FIG. 8 is a diagram in which the nucleotide sequences of the PCR template of 15 strains are aligned for the HA gene of the H5 subtype avian influenza virus used in this example. 図９は塩基ミスマッチ解析に使用したプライマーの番号とその組み合わせを示した図である。FIG. 9 is a diagram showing primer numbers and combinations thereof used for base mismatch analysis. 図１０は塩基ミスマッチ解析で使用したプライマーの番号とその塩基配列を示した図である。FIG. 10 is a diagram showing the primer numbers and their base sequences used in the base mismatch analysis.

本発明の方法は、遺伝学的に分類されている遺伝子（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の型別に関係する遺伝子、より具体的にはインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子やＮＡ遺伝子など）の型別に利用することができる。例えば、Ａ型、Ｂ型またはＣ型インフルエンザウイルスのＨＡ亜型およびＮＡ亜型、特に、Ａ型インフルエンザウイルスのＨ５亜型、Ｈ７亜型などについて、好適に実施することができる。
本発明は、核酸増幅法、例えば、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法と称される核酸増幅法などを使用して、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体、特にインフルエンザウイルスの亜型を判定するためのプライマーのセットを提供するものである。また、ＬＡＭＰ法に限定されることなく、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ハイブリダーゼーション法など、広く遺伝子検査に用いるプライマーやプローブプライマー（本発明の実施形態に開示されるプライマーはプローブプライマーとしても利用することができる）の設計に利用することができる。
また、本発明に係る実施例においては、ＬＡＭＰ法で遺伝子を検出する際に、何個の塩基ミスマッチ（使用するプライマーの塩基配列と増幅対象である遺伝子側のプライマー結合領域の塩基配列との間におけるミスマッチ）までならば、遺伝子検出が可能かについて、プライマーの領域毎に検討し、その成績を実施例に示した（詳細については、実施例を参照のこと）。
その成績を参考にすれば、本発明のプライマーを用いることで、鳥インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子に限定されることなく、それ以外のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の多様な遺伝子や、宿主の同一遺伝子ファミリーに属す遺伝子など、多様な遺伝子を、ＬＡＭＰ法等の遺伝子検査によって、正確に型別する際に応用できることが理解できる。
ＬＡＭＰ法は、標的遺伝子（検査対象となる遺伝子）の６つの領域に対して４種類のプライマーを、または、８つの領域に対して６種類のプライマーを設計し、鎖置換型のＤＮＡポリメラーゼにより、恒温条件にて、検査対象遺伝子を増幅する方法である（特許文献１および特許文献２などを参照のこと）。例えば、４種類のプライマーを使用してＬＡＭＰ法を行う場合、検査対象遺伝子のセンス配列（アミノ酸をコードするセンス鎖の塩基配列）の５’側から、Ｆ３領域、Ｆ２領域およびＦ１領域を選択し、これらの領域の塩基配列を有する少なくとも２種類のプライマーのセットと、増幅対象の遺伝子のアンチセンス配列の５’側から、Ｂ３領域、Ｂ２領域およびＢ１領域を選択し、これらの領域の塩基配列を有する少なくとも２種類のプライマーのセットを対として、標的領域の増幅を行う。
また、場合によっては、Ｆ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列の相補鎖の塩基配列を有するプライマー（ＦＬプライマー）と、Ｂ１領域とＢ２領域の間に存在する塩基配列の相補鎖の塩基配列を有するプライマー（ＢＬプライマー）を、上記４種類のプライマーにさらに加えた、６種類のプライマーでＬＡＭＰ法を実施してもよい。 The method of the present invention can be applied to genetically classified genes (for example, genes related to the pathogen type or subtype type of viruses, bacteria, parasites, etc., more specifically, the HA gene of influenza virus, NA gene etc.) can be used for each type. For example, it can be suitably carried out for HA subtype and NA subtype of influenza A virus, influenza B virus, and C virus, particularly H5 subtype and H7 subtype of influenza A virus.
The present invention uses a nucleic acid amplification method, for example, a nucleic acid amplification method called a LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method, etc., to determine the subtypes of pathogens such as viruses, bacteria, and parasites, particularly influenza viruses. A set of primers is provided. In addition, the present invention is not limited to the LAMP method, and primers and probe primers widely used for genetic testing such as PCR method, real-time PCR method, and hybridization method (the primers disclosed in the embodiments of the present invention are also used as probe primers). Can be used for designing).
Further, in the examples according to the present invention, when a gene is detected by the LAMP method, how many base mismatches (between the base sequence of the primer used and the base sequence of the primer binding region on the gene side to be amplified) are detected. In the case of up to (mismatch), the possibility of gene detection was examined for each primer region, and the results are shown in the examples (for details, refer to the examples).
With reference to the results, by using the primer of the present invention, it is not limited to the HA and NA genes of avian influenza virus, but various genes of pathogens such as other viruses, bacteria, parasites, It can be understood that various genes such as genes belonging to the same gene family of the host can be applied when accurately typing by genetic testing such as LAMP method.
In the LAMP method, 4 types of primers are designed for 6 regions of a target gene (gene to be examined) or 6 types of primers are designed for 8 regions, and a strand displacement type DNA polymerase is used. This is a method of amplifying a gene to be examined under constant temperature conditions (see Patent Document 1 and Patent Document 2). For example, when the LAMP method is performed using four types of primers, the F3 region, the F2 region, and the F1 region are selected from the 5 ′ side of the sense sequence of the gene to be examined (the sense strand base sequence encoding the amino acid). The B3 region, the B2 region, and the B1 region are selected from a set of at least two kinds of primers having the base sequences of these regions and the 5 ′ side of the antisense sequence of the gene to be amplified, and the base sequences of these regions A target region is amplified using a pair of at least two types of primers having
In some cases, a primer (FL primer) having a base sequence of a complementary strand of the base sequence existing between the F1 region and the F2 region, and a base of a complementary strand of the base sequence existing between the B1 region and the B2 region The LAMP method may be performed with six types of primers obtained by further adding a primer having a sequence (BL primer) to the above four types of primers.

本発明の第１の実施形態は、遺伝子増幅検査（または核酸増幅検査）（例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法など）および核酸検出法（ＤＮＡチップ法、ＤＮＡハイブリダイゼーション法など）を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、 The first embodiment of the present invention uses a gene amplification test (or nucleic acid amplification test) (for example, LAMP method, PCR method, real-time PCR method, etc.) and a nucleic acid detection method (DNA chip method, DNA hybridization method, etc.). And an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a gene (RNA or DNA) of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite in a sample, and performing the following steps (a) to (f): It is a set of forward primers comprising a consensus sequence of the forward primer setting region determined in (b) and (e).
(A) Sense sequences or antisense sequences of genes to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region having high homology between the genes to be tested is a forward primer setting region Process to choose as,
(B) a step of determining a consensus sequence for the forward primer setting region;
(C) Comparing the consensus sequence with the bases corresponding to the base sequence of the forward primer region of each test target gene, and among the base sequences of the forward primer setting region of the test target gene, what is the base of the consensus sequence? Counting the number of different bases for each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the forward primer setting region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence for the setting region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;

まず、本明細書における「試料」とは、インフルエンザウイルスなどのウイルスの他、細菌、寄生虫等の病原体に感染している可能性がある動物（ヒトまたは非ヒト動物）の生体または排泄物から取得されたものを用いることができ、特に限定はしないが、例えば、血液試料、組織試料、より具体的には、喀痰、鼻汁、血液、唾液、血清、血漿、排泄物（尿、便など）などの他、組織等を洗浄した液（例えば、うがい液、鼻腔洗浄液など）などを挙げることができる。
また、「検査対象遺伝子」とは、試料中のウイルスが、例えば、インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型に属するものかどうかを判定する場合には、インフルエンザウイルスのＨ５亜型に属する全てのヘマグルチニン遺伝子のことである。つまり、試料中のウイルスが属すると予測されるウイルスの型または亜型の分類基準となる遺伝子であって、該型または亜型に属する全ての遺伝子のことである。ここで、「検査対象遺伝子」とは、特に限定はしないが、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型のインフルエンザウイルスの任意のＨＡ亜型またはＮＡ亜型に属する全てのヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ遺伝子）もしくはノイラミニダーゼ遺伝子（ＮＡ遺伝子）などを例示することができる。
また、センス配列とは、データベースなどで、翻訳フレームとして登録されている鎖の遺伝子配列のことを指し、アンチセンス配列とは、センス配列の相補鎖の塩基配列を指す。
検査対象遺伝子の塩基配列情報は、公知のデータベースや論文等から入手することができる。例えば、検査対象のウイルスが、Ａ型、Ｂ型またはＣ型のインフルエンザウイルスである場合、これらのウイルスの任意のＨＡ亜型に属する全てのウイルスのヘマグルチニン遺伝子の塩基配列情報、または任意のＮＡ亜型に属する全てのウイルスのノイラミニダーゼ遺伝子の塩基配列情報をデータベース（例えば、Influenza Sequence Database(http://www.flu.lanl.gov)など）または論文等から入手することができる。 First, the “sample” in the present specification refers to a living organism or excrement of an animal (human or non-human animal) that may be infected with a virus, such as an influenza virus, or a pathogen such as a bacterium or a parasite. Although what was acquired can be used and it does not specifically limit, For example, a blood sample, a tissue sample, More specifically, sputum, nasal discharge, blood, saliva, serum, plasma, excretion (urine, stool, etc.) In addition to the above, a liquid (for example, a gargle liquid, a nasal cavity washing liquid, and the like) that has washed tissue or the like can be used.
In addition, the “test target gene” refers to all hemagglutinin genes belonging to the H5 subtype of influenza virus when determining whether the virus in the sample belongs to, for example, the HA5 subtype of influenza virus. It is. That is, it is a gene that serves as a classification standard for a virus type or subtype to which a virus in a sample is expected to belong, and is all genes belonging to the type or subtype. Here, the “test target gene” is not particularly limited. For example, all hemagglutinin genes (HA genes) belonging to any HA subtype or NA subtype of influenza viruses of type A, type B, and type C Or a neuraminidase gene (NA gene) etc. can be illustrated.
The sense sequence refers to a gene sequence of a chain registered as a translation frame in a database or the like, and the antisense sequence refers to a base sequence of a complementary strand of the sense sequence.
The base sequence information of the gene to be examined can be obtained from a known database or paper. For example, when the virus to be tested is an influenza virus of type A, B or C, the base sequence information of the hemagglutinin gene of all viruses belonging to any HA subtype of these viruses, or any NA subsequence The base sequence information of the neuraminidase gene of all viruses belonging to the type can be obtained from a database (for example, Influenza Sequence Database (http://www.flu.lanl.gov) etc.) or a paper.

本発明の第１の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士のアライメントを行い、相同性が高い塩基が集積する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程である。アライメント（複数の塩基配列を整列させること）するには、公開されているアライメントソフトウェア（例えば、CLUSTAW(http://www.ddbj.nig.ac.jp/)など）や市販のソフトウェア（例えば、ジェネティクス社製など）等を利用して行ってもよい。なお、アライメントした際にギャップが含まれていてもよい。
フォワードプライマー設定領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。フォワードプライマー設定領域の塩基配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度であればよい。 Step (a) of the first embodiment of the present invention is a step of performing alignment between sense sequences or antisense sequences of a gene to be examined and selecting a region where highly homologous bases are accumulated as a forward primer setting region. It is. For alignment (aligning a plurality of base sequences), published alignment software (for example, CLUSTAW (http://www.ddbj.nig.ac.jp/) etc.) or commercially available software (for example, Etc., etc. may be used. Note that a gap may be included when the alignment is performed.
The length of the sequence of the forward primer setting region may be any length that is usually provided by the primer used when amplifying a nucleic acid by the LAMP method or PCR method, and considers the GC content contained in the selected region. To decide. The length of the base sequence of the forward primer setting region is not particularly limited, but is, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases.

ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をフォワードプライマー設定領域として選択する方法を模式的に示した。図１では、任意の亜型に属するウイルス遺伝子が２２０３遺伝子存在すると仮定した。工程（ａ）の「高い相同性を有する領域」は、例えば、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上、好ましくは、９０％以上、より好ましくは９８％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または単一の塩基では出現率が低いが、上位２種類（場合によっては、上位３種類）の塩基の出現率の和が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる混合塩基Ｙから構成され、これらが９０％以上、望ましくは１００％となる、１０〜３０個ほどの塩基が連続する領域のことである。 Here, the “region having high homology” is not particularly limited. For example, “sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined are aligned, and bases at corresponding positions between the sequences are aligned. In comparison, a single base X in which 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same, and / or 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are A, T, G, C “A continuous base sequence region comprising a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from among the single base X and / or mixed base Y occupying 90% or more” Can do.
FIG. 1 schematically shows a method of selecting the above-exemplified “region having high homology” as a forward primer setting region. In FIG. 1, it was assumed that there are 2203 viral genes belonging to any subtype. The “region having high homology” in the step (a) is, for example, aligning sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined, comparing bases at corresponding positions between the sequences, In the single base X in which 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 98% or more of the bases at the corresponding positions are the same, and / or a single base has a low appearance rate, the top two types (In some cases, the top three types) are composed of mixed bases Y having a sum of the appearance rates of bases of 80% or higher, preferably 90% or higher, more preferably 98% or higher. It is a region where about 10 to 30 bases become 100%.

まず、プライマーを作成する対象となる型または亜型に含まれる遺伝子センス配列（検査対象遺伝子のセンス配列）を全てアライメントし、対応する位置（図１では、位置１、位置２・・・のように示す）の塩基を比較して対応する全ての塩基位置について、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率を求める。
図１の位置１、位置４、位置５および位置１４に出現する塩基は、各々の位置において全て同一であり、「対応する位置の塩基の８０％以上が同一」であり、「単一塩基Ｘ」は、各々、Ａ（位置１）、Ｇ（位置４）、Ｇ（位置５）およびＡ（位置１４）である。また、位置２、位置７〜位置１１、位置１３および位置１５については、いずれの位置においても最も多く出現する塩基が９７％以上の割合を占めているため、「対応する位置の塩基の８０％以上が同一」となり、「単一塩基Ｘ」は、各々、Ｃ（位置２）、Ｃ（位置７）、Ｔ（位置８）、Ｃ（位置９）、Ａ（位置１０）、Ｇ（位置１１）、Ａ（位置１３）、Ａ（位置１５）、Ｔ（位置１１）である。さらに、位置３、位置６、位置１２に出現する塩基ついては、出現頻度の高い上位２種類の塩基（位置３ではＴとＣ、位置６ではＡとＧ、位置１２ではＡとＧ）の出現率の和が、全塩基数（図１の場合は、２２０３個）の９０％以上を占めるので、「対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基」であり、「混合塩基Ｙ」は、各々、Ｙ（位置３）、Ｒ（位置６）、Ｒ（位置１２）である。
なお、本明細書において混合塩基の表記は、ＩＵＰＡＣの表記法に基づく。
以上のように、上記「高い相同性を有する領域」をフォワードプライマー設定領域として選択することができる。
なお、後述のＦ１、Ｆ２、Ｆ３およびＦＬ領域における「高い相同性を有する領域」も同様に選択することができる。 First, all the gene sense sequences (sense sequences of the gene to be examined) included in the type or subtype for which the primer is to be prepared are aligned, and the corresponding positions (in FIG. 1, position 1, position 2,... And the appearance rates of A, G, T, and C are obtained for all corresponding base positions.
The bases appearing at position 1, position 4, position 5 and position 14 in FIG. 1 are all the same at each position, and “80% or more of the bases at the corresponding positions are the same”, “single base X Are A (position 1), G (position 4), G (position 5) and A (position 14), respectively. Further, with respect to position 2, position 7 to position 11, position 13 and position 15, since the base that appears most frequently in any position accounts for 97% or more, “80% of the base at the corresponding position” The above is “same”, and “single base X” is C (position 2), C (position 7), T (position 8), C (position 9), A (position 10), G (position 11), respectively. ), A (position 13), A (position 15), and T (position 11). Furthermore, for the bases appearing at position 3, position 6, and position 12, the appearance rates of the top two types of bases with the highest appearance frequency (T and C at position 3, A and G at position 6, and A and G at position 12) Occupies 90% or more of the total number of bases (2203 in the case of FIG. 1), so that “80% or more of the bases at the corresponding positions are selected from A, T, G, and C. Or “mixed base Y” is Y (position 3), R (position 6), and R (position 12), respectively.
In this specification, mixed base notation is based on IUPAC notation.
As described above, the “region having high homology” can be selected as the forward primer setting region.
Note that “regions having high homology” in the F1, F2, F3, and FL regions described later can be selected in the same manner.

本発明の第１の実施形態の工程（ｂ）は、各検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列を決定する工程である。
ここで、コンセンサス配列とは、母集団を構成する検査対象遺伝子をアライメントし、それぞれの塩基位置において出現率が最も高い塩基からなる配列のことである。具体的には、アライメントさせた配列の全ての塩基位置において、４種類の塩基の出現率をそれぞれ求め、塩基出現率が最も高い塩基だけを順番に並べたものがコンセンサス配列である。コンセンサス配列を構成する各塩基の出現率は、「コンセンサス配列の塩基と同一の塩基を持つ検査対象遺伝子数/母集団を構成する全ての検査対象遺伝子数（％）」で示される。塩基出現率が高ければ保存性が高いと判定され、低ければ保存性が低いと判定される。母集団を構成する検査対象遺伝子をより多く検出するには、保存性の高い塩基から構成される領域にプライマーを設計する必要がある。また、母集団を構成する検査対象遺伝子が変われば、コンセンサス配列も異なるため、コンセンサス配列を基に設計するプライマーの塩基配列も異なることになる。 Step (b) of the first embodiment of the present invention is a step of aligning the base sequences of the forward primer setting regions of each test target gene and determining the aligned forward primer setting region consensus sequence.
Here, the consensus sequence is a sequence composed of bases having the highest appearance rate at each base position by aligning the genes to be tested constituting the population. Specifically, the consensus sequence is obtained by determining the appearance rates of four types of bases at all base positions in the aligned sequences and arranging only the bases having the highest base appearance rate in order. The appearance rate of each base constituting the consensus sequence is indicated by “number of test target genes having the same base as the base of the consensus sequence / number of all test target genes constituting the population (%)”. If the base appearance rate is high, it is determined that the preservability is high, and if it is low, it is determined that the preservability is low. In order to detect more genes to be examined constituting the population, it is necessary to design primers in a region composed of highly conserved bases. In addition, since the consensus sequence is different when the test target gene constituting the population is changed, the base sequence of the primer designed based on the consensus sequence is also different.

本発明の第１の実施形態の工程（ｃ）は、工程（ｂ）で決定したコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。
図２Ａを参照しながら説明する。例えば、遺伝子８の領域においては、左から（５’側から）３番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「１」である。また、遺伝子１１の領域においては、左から３番目、６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「３」である。
なお、実施例においては、「コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」を「塩基ミスマッチ数」と記載する（以下、同じ）。 In the step (c) of the first embodiment of the present invention, the consensus sequence determined in the step (b) is compared with the bases at corresponding positions in the base sequence of the forward primer setting region of each test target gene. This is a step of counting the number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the gene forward primer setting region for each gene to be examined.
This will be described with reference to FIG. 2A. For example, in the region of gene 8, since the third base from the left (from the 5 ′ side) is different from the base of the consensus sequence, the number of bases different from the base of the consensus sequence is “1”. In the region of gene 11, since the third, sixth, and fifteenth bases from the left are different from the bases of the consensus sequence, the number of bases different from the bases of the consensus sequence is “3”.
In the examples, “the number of bases different from the bases of the consensus sequence” is described as “the number of base mismatches” (hereinafter the same).

本発明の第１の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。 Step (d) of the first embodiment of the present invention is a step of extracting a gene to be tested whose number of bases counted in step (c) is a certain number or more.
Here, the “certain number” is a limit value of the number of base mismatches that is determined to be incapable of gene amplification by an oligonucleotide primer composed of a consensus sequence. It is a different numerical value and can be easily determined by a person skilled in the art through preliminary experiments or the like.

塩基ミスマッチの限界値は、第１の実施形態のフォワードプライマーと後述の第２の実施形態のリバースプライマーを１組とし、次の様にして求めることができる。
まず、検査対象遺伝子の中から、検査対象遺伝子を一つ選択する。これをテンペレートにして、上述の工程（ａ）で決定されるフォワードプライマー領域と、第２の実施形態の工程（ａ）で決定されるリバースプライマー領域に、一定数の塩基ミスマッチ（例えば、２０塩基のプライマーあたり、０〜３個程度）を導入したプライマーを種々、設計する。それらのプライマーの様々なペアについて、ＰＣＲ等による遺伝子増幅の可否を調べる。これによって、増幅を許容するプライマーまたはプライマーペアあたり、遺伝子増幅を許容できる塩基ミスマッチ数の上限を明らかにできる。本明細書の実施例、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査 対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１〜５の整数、好ましくは、２〜４の整数、より好ましくは、３である。
図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。 The limit value of base mismatch can be determined as follows, with the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment described later as one set.
First, one test target gene is selected from the test target genes. Using this as a template, a certain number of base mismatches (for example, 20) are added to the forward primer region determined in step (a) and the reverse primer region determined in step (a) of the second embodiment. Various primers are introduced in which about 0 to 3 primers are introduced per base primer. The various pairs of these primers are examined for gene amplification by PCR or the like. This makes it possible to clarify the upper limit of the number of base mismatches that can allow gene amplification per primer or primer pair that allows amplification. Examples herein, "Effect of base mismatches on 7. gene amplification" of the material and experimental methods, "8. Base mismatch analysis", and, "Influence of base mismatches on 5 gene amplification" results, See also “6. Estimation of amplification of 2211 H5-HA genes registered in GenBank”.
The “certain number”, that is, the limit of base mismatch varies depending on the gene to be tested. For example, when the gene to be tested is an HA gene belonging to any HA5 subtype of avian influenza virus, , Preferably an integer of 2 to 4, more preferably 3.
When the fixed number is “3” in FIG. 2, the extracted genes are the gene 11, the gene 19, and the gene 20 (FIG. 2B).

本発明の第１の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたフォワードプライマー設定領域に新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行う。この工程（ｃ）〜（ｅ）を抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９の塩基配列となる）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、フォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列が全て決定されることになる。
決定されたフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をフォワードプライマーの配列として決定する。
なお、各実施形態の「セット」とは、最初に決定されるコンセンサス配列およびその後の繰り返し工程で得られるコンセンサス配列（例えば、第１の実施形態であれば、工程（ｂ）および工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返し行って得られる工程（ｅ）のコンセンサス配列）から構成されるプライマーの集団のことである（他の実施形態においても同じ）。 In step (e) of the first embodiment of the present invention, the base sequences in the forward primer setting region of the gene to be examined extracted in step (d) are realigned, and a new consensus sequence is added to the aligned forward primer setting region. Is a step of determining (FIG. 2B).
In step (f), step (c), step (d) and step (e) are performed based on the new consensus sequence determined in step (e). These steps (c) to (e) are repeated until there is no test target gene to be extracted. In FIG. 2C, the gene to be examined extracted the second time is only gene 19 (therefore, the consensus sequence at this stage is the base sequence of gene 19), and there is no gene to be extracted. All sequences will be determined.
The sequence from the 5 ′ side to the 3 ′ side of the consensus sequence of the determined forward primer setting region is determined as the forward primer sequence.
The “set” in each embodiment refers to the consensus sequence determined first and the consensus sequence obtained in the subsequent repetition process (for example, in the case of the first embodiment, the steps (b) and (c) ~ (E) is a group of primers composed of the step (e) consensus sequence obtained repeatedly (the same applies to other embodiments).

本発明の第２の実施形態は、第１の実施形態のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーである。第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーを１組として、核酸増幅法に使用することができる。ただし、第１の実施形態で選択したフォワードプライマー設定領域と第２の実施形態で選択したリバースプライマー設定領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第１の実施形態のフォワードプライマー設定領域が、３’側に第２の実施形態のリバースプライマー設定領域が選択される必要がある。ＰＣＲ法およびリアルタイムＰＣＲ法を例にして、第１の実施形態のフォワードプライマーおよび第２の実施形態のリバースプライマーのプライマー設定領域（図中の「プライマー領域」）を図３に例示したので参照のこと。   The second embodiment of the present invention is a reverse primer comprising a sequence complementary to the base sequence of the forward primer of the first embodiment. The forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment can be used as a set for the nucleic acid amplification method. However, the forward primer setting region selected in the first embodiment and the reverse primer setting region selected in the second embodiment have the forward primer setting region of the first embodiment on the 5 ′ side across the region to be amplified. The reverse primer setting region of the second embodiment needs to be selected on the 3 ′ side. As an example of the PCR method and the real-time PCR method, the primer setting region (“primer region” in the figure) of the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment is illustrated in FIG. about.

リバースプライマーを作製するために第１の実施形態を行う場合には、第１の実施形態に記載した「フォワードプライマー設定領域」を、「リバースプライマー設定領域」と読み替えるものとする。
すなわち、本発明の第２の実施形態は、遺伝子増幅検査（または核酸増幅検査）（例えば、ＬＡＭＰ法、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法など）および核酸検出法（DNAチップ法、DNAハイブリダイゼーション法など）を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の型または亜型の判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるリバースプライマー設定領域のコンセンサス配列の相補配列からなるリバースプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をリバースプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）リバースプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のリバースプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のリバースプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のリバースプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
工程（ｄ）の「一定数」については、第１の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。 When the first embodiment is performed to produce a reverse primer, the “forward primer setting region” described in the first embodiment is read as “reverse primer setting region”.
That is, in the second embodiment of the present invention, gene amplification test (or nucleic acid amplification test) (for example, LAMP method, PCR method, real-time PCR method, etc.) and nucleic acid detection method (DNA chip method, DNA hybridization method, etc.) Is a oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a gene (RNA or DNA) of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite in a sample, comprising the following steps (a) to (f): A reverse primer set consisting of a sequence complementary to the consensus sequence of the reverse primer setting region determined in steps (b) and (e).
(A) Sense sequences of test target genes or antisense sequences are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and regions having high homology between the test target genes are reverse primer setting regions Process to choose as,
(B) a step of determining a consensus sequence for the reverse primer setting region;
(C) Comparing the consensus sequence and the bases corresponding to the base sequence of the reverse primer region of each test target gene, and the base sequence of the reverse primer setting region of the test target gene is the base of the consensus sequence Counting the number of different bases for each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the reverse primer setting region of the test target gene extracted in step (d), and determining a new consensus sequence for the setting region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;
For the “certain number” in the step (d), refer to the explanation of the step (d) in the first embodiment.

なお、本発明の第１の実施形態は、リアルタイムＰＣＲ法に使用されるプローブプライマーの作製にも用いることができる。すなわち、第１の実施形態における「オリゴヌクレオチドプライマー」と「フォワードプライマー」または第２の実施形態における「リバースプライマー」を「プローブプライマー」に置き換えて、実施することで、リアルタイムＰＣＲ法に使用されるプローブプライマーの作製が可能である。   Note that the first embodiment of the present invention can also be used for the production of probe primers used in the real-time PCR method. That is, the “oligonucleotide primer” and the “forward primer” in the first embodiment or the “reverse primer” in the second embodiment are replaced with the “probe primer” to be used in the real-time PCR method. Probe primers can be prepared.

本発明の第３の実施形態は、ＬＡＭＰ法を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程。
（ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる、各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数が、各領域のコンセンサスの塩基配列とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程、 A third embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite in a sample using the LAMP method, and comprises the following (a): Steps (g) to (g) are performed, a pair of F2 region and F1 region consensus sequences determined in steps (c) and (f) is selected, and the base sequence of the F2 region is placed on the 3 ′ end side, and the F1 region It is a set of FIP primers consisting of a base sequence having a complementary sequence of the base sequence on the 5 ′ end side.
(A) A step of aligning sense sequences or antisense sequences of a gene to be examined, comparing bases at corresponding positions between the sequences, and selecting a region having high homology between the sequences as the F2 region ,
(B) a step of selecting a region that exists 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the F2 region selected in step (a) and that satisfies the same requirements as the F2 region as the F1 region;
(C) The base sequences of the F1 region and the base sequence of the F2 region of each gene to be examined are aligned, and the consensus sequence of each region is determined from the aligned base sequence of the F1 region and the base sequence of the F2 region And selecting them as a pair.
(D) The consensus sequence of the F1 region and the bases at positions corresponding to the base sequence of the F1 region of each test target gene, and the bases at the positions corresponding to the consensus sequence of the F2 region and the base sequence of the F2 region of each test target gene And the number of bases included in the base sequences of the F1 region and F2 region of each gene to be examined, which are different from the bases of the consensus sequence of each region, are different from the base sequences of the consensus of each region, A process of counting for each gene to be tested,
(E) extracting a test target gene whose base number counted in step (d) is a certain number or more,
(F) The F1 region base sequences and F2 region base sequences of the gene to be examined extracted in step (e) are realigned, and the aligned F1 region base sequences and F2 region base sequences are respectively Determining new consensus sequences for the region of and selecting them as a pair;
(G) repeating the steps (d), (e) and (f) until there are no genes to be tested to be extracted;

本発明の第３の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであるＦＩＰプライマーのセットに関するものである。
第３の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士のアライメントを行い、相同性の高い領域をＦ２領域として選択する工程であり、Ｆ２領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ２領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度であればよい。
検査対象遺伝子の情報の入手およびアライメントについては、第１の実施形態の工程（ａ）に関する説明を参照のこと。 The third embodiment of the present invention relates to a set of FIP primers that are oligonucleotide primers for determining the type or subtype of pathogens such as viruses, bacteria, and parasites by the LAMP method.
The step (a) of the third embodiment is a step of aligning sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined and selecting a region having high homology as the F2 region. The length of the sequence of the F2 region The length may be any length that is usually provided by a primer used when amplifying a nucleic acid by the LAMP method, and may be determined in consideration of the GC content contained in the selected region. The length of the F2 region sequence is not particularly limited, but may be, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases.
For obtaining and aligning information on the gene to be examined, see the description relating to step (a) of the first embodiment.

第３の実施形態の工程（ａ）の「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域」を例示することができる。
図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦ２領域として選択する流れを模式的に示した。なお、詳細は、第１の実施形態の工程（ａ）の部分を参照のこと。
Ｆ２領域（およびＦ１領域（後述））は、全ての対応する塩基位置において、塩基出現率が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる条件を満たす単一塩基Ｘ、および／または単一の塩基では出現率が低いが、上位２種類（場合によっては、上位３種類）の塩基の出現率の和が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９８％以上となる混合塩基Ｙから構成される領域で、１０〜３０個ほどの塩基が連続する領域である。
以上のようにして、Ｆ２領域を選択することができる。 The “region having high homology” in the step (a) of the third embodiment is not particularly limited. For example, “alignment between sense sequences or antisense sequences of a gene to be examined and alignment between each sequence The bases at the corresponding positions are compared with each other, and a single base X in which 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same and / or 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences. A continuous base sequence region composed of a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from A, T, G, and C ”can be exemplified.
FIG. 1 schematically shows a flow of selecting the “region having high homology” exemplified above as the F2 region. For details, refer to the step (a) of the first embodiment.
F2 region (and F1 region (described later)) is a single base X satisfying the condition that the base appearance rate is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 98% or more at all corresponding base positions, And / or the appearance rate of a single base is low, but the sum of the appearance rates of the top two types (in some cases, the top three types) of bases is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 98% or more Is a region composed of about 10 to 30 bases.
As described above, the F2 region can be selected.

本発明の第３の実施形態の工程（ｂ）では、Ｆ１領域を選択する工程で、工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流の領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程である。
「Ｆ２領域の３’末端より３’側下流の領域」を選択する場合、Ｆ２領域の３’末端からＦ１領域の５’末端までの距離は、特に限定はしないが、この部分は、ＬＡＭＰ法による核酸の増幅が行われるときに、ループを形成する部分になるため、例えば、Ｆ２領域の５’末端の塩基とＦ１領域の５’末端の塩基との間に、３０〜７０塩基程度、好ましくは、４０〜６０塩基程度存在するとよい。Ｆ１領域の配列の長さは、Ｆ２領域と同様、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよく、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度である。
Ｆ１領域は、さらに、Ｆ２領域の選択を行う場合に満たすべき要件を満たす必要がある。すなわち、Ｆ１領域とは、Ｆ２領域の３’末端より３’側下流の領域であるいう要件に加えて、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域」という要件を満たす必要がある。ここで、「高い相同性を有する領域」とは、例えば、限定はしないが、「検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域」のことである。 In the step (b) of the third embodiment of the present invention, in the step of selecting the F1 region, a region 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the F2 region selected in the step (a), the F2 region In this step, a region that satisfies the same requirements as the region is selected as the F1 region.
When selecting “region 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the F2 region”, the distance from the 3 ′ end of the F2 region to the 5 ′ end of the F1 region is not particularly limited. When a nucleic acid is amplified by the above, it becomes a part that forms a loop. For example, about 30 to 70 bases between the 5 ′ terminal base of the F2 region and the 5 ′ terminal base of the F1 region, preferably Is preferably present in about 40 to 60 bases. The sequence length of the F1 region may be determined in consideration of the GC content and the like contained in the selected region as in the F2 region, and is, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases. .
Further, the F1 area needs to satisfy the requirements to be satisfied when the F2 area is selected. That is, in addition to the requirement that the F1 region is a region 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the F2 region, “the sense sequences or the antisense sequences of the gene to be tested are aligned, and each sequence corresponds. It is necessary to compare the bases at the positions to be satisfied and to satisfy the requirement of “region having high homology between the sequences”. Here, the “region having high homology” is, for example, without limitation, “alignment between sense sequences or antisense sequences of the gene to be examined and comparison of bases at corresponding positions between the sequences. In addition, a single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between sequences are the same, and / or 80% or more of bases at corresponding positions between sequences in A, T, G, or C. Is a continuous base sequence region composed of a mixed base Y composed of any two or three types of bases selected from

本発明の第３の実施形態の工程（ｃ）は、各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定しペアとして選択する工程である。ここで、「ペアとして選択する」のは、工程（ｃ）で決定したＦ１領域のコンセンサス配列とＦ２領域のコンセンサス配列を１組のコンセンサス配列として選択し、この１組のＦ１領域とＦ２領域の塩基配列を最終的にはＦＩＰプライマーの塩基配列とするためである。   In the step (c) of the third embodiment of the present invention, the F1 region base sequences and the F2 region base sequences of each test target gene are aligned, and the aligned F1 region base sequence and F2 region base sequence are aligned. Is a step of determining a consensus sequence of each region (see the explanation of step (b) of the first embodiment) and selecting it as a pair. Here, “select as a pair” means that the consensus sequence of the F1 region and the consensus sequence of the F2 region determined in the step (c) are selected as a set of consensus sequences, and the F1 region and the F2 region This is because the base sequence is finally used as the base sequence of the FIP primer.

本発明の第３の実施形態の工程（ｄ）は、Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列、および、Ｆ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する塩基同士を比較し、Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子のセンス配列毎にカウントする工程である。ここで、「Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数」とは、Ｆ１領域においてコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数と、Ｆ２領域においてコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を合計した数のことである。
図４を参照しながら説明する。例えば、遺伝子１１のＦ２領域においては、左から（５’側から）３番目、６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「３」となり、Ｆ１領域においては、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「０」である。遺伝子１２のＦ２領域においては、左から６番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「１」となり、Ｆ１領域においては、左から６番目、１２番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となる。また、遺伝子１４のＦ２領域においては、左から６番目、１２番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となり、Ｆ１領域においては、左から６番目、１５番目の塩基がコンセンサス配列の塩基とは異なるため、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数は「２」となる。 In the step (d) of the third embodiment of the present invention, the F1 region consensus sequence and the F1 region base sequence of each test target gene, and the F2 region consensus sequence and the F2 region base sequence of each test target gene Are compared with each other, and the number of bases different from the bases of the consensus sequence contained in the base sequences of the F1 region and F2 region is counted for each sense sequence of the gene to be examined. Here, “the number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequences of the F1 region and F2 region” means the number of bases different from the bases of the consensus sequence in the F1 region and the bases of the consensus sequence in the F2 region. This is the total number of different bases.
This will be described with reference to FIG. For example, in the F2 region of gene 11, since the third, sixth, and fifteenth bases from the left (from the 5 ′ side) are different from the bases of the consensus sequence, the number of bases different from the bases of the consensus sequence is “ 3 ”, and in the F1 region, the number of bases different from the bases of the consensus sequence is“ 0 ”. In the F2 region of gene 12, since the sixth base from the left is different from the base of the consensus sequence, the number of bases different from the base of the consensus sequence is “1”, and in the F1 region, the sixth from the left, Since the 12th base is different from the base of the consensus sequence, the number of bases different from the base of the consensus sequence is “2”. In the F2 region of gene 14, since the 6th and 12th bases from the left are different from the bases of the consensus sequence, the number of bases different from the bases of the consensus sequence is “2”, and in the F1 region, Since the sixth and fifteenth bases from the left are different from the bases of the consensus sequence, the number of bases different from the bases of the consensus sequence is “2”.

本発明の第３の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値である。   Step (e) of the third embodiment of the present invention is a step of extracting a gene to be tested whose number of bases counted in step (d) is a certain number or more. Here, the “certain number” is a limit value of the number of base mismatches that is determined to be incapable of gene amplification by an oligonucleotide primer comprising a consensus sequence, and also depends on the length of the primer used and the G and C contents. It is a different number.

遺伝子増幅を許容する塩基ミスマッチ数の限界は、塩基ミスマッチを導入したプライマーを組合せた、様々なプライマーセットを用いて、ある１つの検査対象遺伝子の増幅の可否をＬＡＭＰ法で総当り的に調べれば、明らかにすることができる。用いるプライマーとしては、その標的遺伝子と塩基配列が完全に一致する６本のプライマーと、それらのプライマーに、標的遺伝子に対して一定数の塩基ミスマッチが生ずるように設計した変異プライマーである。
６本のプライマーの中で、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと後述の第４の実施形態のＢＩＰプライマーは、位置的に左右が逆であっても、増幅に果たす役割は同じと考えられる。同様に、後述の第５の実施形態のＦ３プライマーと後述の第６の実施形態のＢ３プライマー、また後述の第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーも、遺伝子増幅において果たす役割は同じと考えられる。この点を考慮した上で、塩基ミスマッチ数の限界を次の様にして求めることができる。
まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を、検査対象遺伝子の中から１つ選択した遺伝子について、各々設計する。また、ここで決定されるプライマーの塩基配列に、検査対象遺伝子の塩基配列とは異なる塩基（例えば、２０塩基あたり、０〜３個程度）を一定数、導入したプライマーから構成されるセットを準備する。この際に、ＦＩＰとＢＩＰ、Ｆ３とＢ３、ＦＬとＢＬが左右対称であることを踏まえて、再現性がある結論が得らえるように、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数を左右対称にする。こうして組み合わせたプライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法による検査対象遺伝子の増幅を調べる。その結果、増幅できたプライマーセットの各領域に含まれる変異ミスマッチ数と、増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異ミスマッチ数を分析して、各プライマー領域当たりの塩基ミスマッチの限界値を決定することができる。（なお、本明細書の実施例、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。）
「一定数」、すなわち、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数の限界値は、原則としてどの領域でも同じと考えられる。もっとも、ＦＩＰとＢＩＰは、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬと比べて２倍程度の長さがあるので、プライマー当たりの塩基ミスマッチ数は２倍になるが、プライマーとテンペレートの結合は、原則として、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数に規定される。したがって、これらのことを踏まえて、ＦＩＰプライマー（ＢＩＰも同様）を設計する際には、合計の塩基ミスマッチ数と、塩基ミスマッチがＦ１（Ｂ１）領域またはＦ２（Ｂ２）領域のいずれか一方に偏らないように配慮することも重要である。あるいは、それぞれの領域に全て塩基ミスマッチがある場合と、一部の領域に塩基ミスマッチがある場合では、遺伝子増幅の難易では異なる。そこで、８領域の合計塩基ミスマッチ数を踏まえて、総合的に増幅を推定する必要がある。同様に、Ｆ１領域（Ｂ１領域も同じ）が塩基ミスマッチによって弱く結合しているところに、Ｆ１領域にある塩基ミスマッチによって、Ｆ１領域がさらに弱く結合するとすれば、単独領域からなるＦ３、ＦＬ（Ｂ３、ＢＬも同じ）プライマーに比べて、遺伝子増幅はより困難になると考えらえる。これらのことを踏まえて、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数の限界値と、全てのプライマー領域の合計ミスマッチ数を実験によって明らかにすることができる。また、実験の再現性が得らえるように、左右対称性を踏まえて、様々なプライマーの組合せについて検討し、塩基ミスマッチ数の限界値を明らかにすることができる。 The limit of the number of base mismatches that allow gene amplification can be determined by using the LAMP method to determine whether or not a single target gene can be amplified using various primer sets in combination with primers introduced with base mismatches. Can be revealed. The primers used are six primers whose base sequences are completely identical to the target gene, and mutation primers designed so that a certain number of base mismatches occur with respect to the target gene.
Among the six primers, the FIP primer according to the third embodiment and the BIP primer according to the fourth embodiment described later are considered to play the same role in amplification even if the positions are opposite to each other. Similarly, the F3 primer of the fifth embodiment described later and the B3 primer of the sixth embodiment described later, the FL primer of the seventh embodiment described later, and the BL primer of the eighth embodiment described later are also genes. The role played in amplification is thought to be the same. In consideration of this point, the limit of the number of base mismatches can be determined as follows.
First, the F1 and F2 regions selected in the third embodiment, the B1 and B2 regions selected in the fourth embodiment, the F3 region selected in the fifth embodiment, and the sixth embodiment selected. A primer sequence that binds to each region of the B3 region, the FL region selected in the seventh embodiment, and the BL region selected in the eighth embodiment from among the genes to be tested, Design each one. In addition, a set consisting of a primer in which a certain number of bases different from the base sequence of the gene to be examined (for example, about 0 to 3 per 20 bases) are introduced into the base sequence of the primer determined here is prepared. To do. At this time, based on the fact that FIP and BIP, F3 and B3, FL and BL are symmetrical, the number of base mismatches per primer region is made symmetrical so that a reproducible conclusion can be obtained. Using the combined primer set, the amplification of the gene to be examined by the LAMP method is examined. As a result, by analyzing the number of mutation mismatches contained in each region of the primer set that was amplified and the number of mutation mismatches contained in each region of the primer set that could not be amplified, the limit value of the base mismatch per each primer region was analyzed. Can be determined. (It should be noted that the Examples herein, "Effect of base mismatches on 7. gene amplification" of the material and experimental methods, "8. Base mismatch analysis", as well as results "5 base mismatches on gene amplification (See also “Effect”, “6. Estimation of amplification of 2211 H5-HA genes registered in GenBank”)
The “fixed number”, that is, the limit value of the number of base mismatches per primer region is considered to be the same in any region in principle. However, since FIP and BIP are about twice as long as F3, B3, FL, and BL, the number of base mismatches per primer is doubled. , Defined as the number of base mismatches per primer region. Therefore, when designing FIP primers (same for BIP) based on these things, the total number of base mismatches and the base mismatches are biased to either the F1 (B1) region or the F2 (B2) region. It is also important to take care not to. Alternatively, it is difficult to amplify a gene when there is a base mismatch in each region and when there is a base mismatch in some regions. Therefore, it is necessary to estimate amplification comprehensively based on the total number of base mismatches in the eight regions. Similarly, if the F1 region (same for the B1 region) is weakly bound by base mismatch and the F1 region is weakly bound by base mismatch in the F1 region, F3, FL (B3 consisting of a single region) , BL is also the same) gene amplification is considered to be more difficult than primer. Based on these facts, the limit value of the number of base mismatches per primer region and the total number of mismatches of all the primer regions can be clarified by experiments. In addition, in order to obtain reproducibility of the experiment, various primer combinations can be studied based on the symmetry, and the limit value of the number of base mismatches can be clarified.

工程（ｅ）を、「工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であって、それがＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程」として実施する場合について、図４を参照しながら説明をする。
例えば、遺伝子１４では、コンセンサス配列と異なる塩基の数はＦ２領域で「２」で、Ｆ１領域では「２」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数」は、「４」となる。従って、遺伝子１４のＦ１領域とＦ２領域は工程（ｅ）において抽出の対象となる。
また、遺伝子１１のＦ２領域では、コンセンサス配列とは異なる塩基の数は「３」であり、Ｆ１領域については「０」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」は、「３」となる。ここで、コンセンサス配列と異なる塩基が、Ｆ１またはＦ２領域に偏っているかどうかを確認すると、コンセンサス配列と異なる塩基は、Ｆ１領域に偏っている。従って、遺伝子１１のＦ１領域とＦ２領域も工程（ｅ）において抽出の対象となる。
次に、遺伝子１２の遺伝子のＦ２領域では、コンセンサス配列と異なる塩基の数は「１個」であり、Ｆ１領域については「２個」であることから、「Ｆ１領域および他のＦ２領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数」は、「３個」となる。しかし、コンセンサス配列とは異なる塩基がＦ１領域とＦ２領域のいずれか一方に偏らないことから、遺伝子１２のＦ１領域とＦ２領域は抽出の対象とはならない（図４Ａを参照）。 In step (e), the test target gene whose number of bases counted in step (d) is 4 or more and the number of bases counted is 3, which is either the F1 region or the F2 region The case where it is carried out as “the process of extracting the gene to be examined biased to“ will be described with reference to FIG. 4.
For example, in the gene 14, the number of bases different from the consensus sequence is “2” in the F2 region and “2” in the F1 region, so that “the consensus sequence contained in the base sequences of the F1 region and other F2 regions The number of bases different from the base is “4”. Therefore, the F1 region and F2 region of the gene 14 are to be extracted in the step (e).
Further, in the F2 region of gene 11, the number of bases different from the consensus sequence is “3”, and the F1 region is “0”, so that it is included in the base sequences of the “F1 region and other F2 regions”. The “number of bases different from the bases of the consensus sequence” is “3”. Here, when it is confirmed whether a base different from the consensus sequence is biased to the F1 or F2 region, a base different from the consensus sequence is biased to the F1 region. Therefore, the F1 region and F2 region of the gene 11 are also extracted in the step (e).
Next, in the F2 region of the gene 12 gene, the number of bases different from the consensus sequence is “1”, and the F1 region is “2”, so the “F1 region and other F2 region bases” The “number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the sequence” is “3”. However, since a base different from the consensus sequence is not biased to either the F1 region or the F2 region, the F1 region and F2 region of the gene 12 are not subject to extraction (see FIG. 4A).

本発明の第３の実施形態の工程（ｆ）は、工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程である。
そして、工程（ｇ）において、工程（ｆ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｄ）、工程（ｅ）および工程（ｆ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）〜（ｆ）を繰り返す。
以上の工程を行った後、決定されたＦ１領域とＦ２領域のコンセンサス配列のペアを全て選択し、各コンセンサス配列のペアにおいて、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の相補鎖の塩基配列（Ｆ１ｃ配列とする）を５’末端側に有する塩基配列をＦＩＰプライマーの塩基配列として決定する。 In step (f) of the third embodiment of the present invention, the F1 region base sequences of the F1 region and the F2 region base sequences of the gene to be examined extracted in step (e) are aligned again, and the aligned F1 region bases are aligned. This is a step of determining a new consensus sequence of each region from the sequence and the base sequence of the F2 region and selecting them as a pair.
Then, in the step (g), based on the new consensus sequence determined in the step (f), the steps (d), (e) and (f) are carried out until there is no test target gene to be extracted. Steps (d) to (f) are repeated.
After performing the above steps, all the consensus sequence pairs of the determined F1 region and F2 region are selected, and in each consensus sequence pair, the base sequence of the F2 region is on the 3 ′ end side and the complementary strand of the F1 region Is determined as the base sequence of FIP primer.

本発明の第３の実施形態は、上記の工程を経て決定されるＦＩＰプライマーのセットである。本実施形態のＦＩＰプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号１〜配列番号２０（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１１５〜配列番号１１９および配列番号１５６（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３１〜１３３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＦＩＰプライマーのセットとして例示することができる。   The third embodiment of the present invention is a set of FIP primers determined through the above steps. Although it does not limit as a set of FIP primer of this embodiment, For example, sequence number 1 which can be used when determining whether the virus contained in the test object sample is influenza A virus H5 subtype A group of primers consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 20 (for Eurasian strain of H5 subtype), represented by SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119 and SEQ ID NO: 156 (for Eurasian strain of H5 subtype and American strain) And a group of primers consisting of a sequence represented by SEQ ID NOs: 131 to 133 (for H5 subtype American strain) can be exemplified as a set of FIP primers.

本発明の第４の実施形態は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーである。第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーを１組として（つまり、順方向プライマーと逆方向プライマーとして）、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に使用することができる。
ただし、第３の実施形態で選択したＦ２領域と第４の実施形態で選択したＢ２領域は、増幅したい領域を挟んで、５’側に第３の実施形態のＦ２領域が、３’側に第４の実施形態のＢ２領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
なお、第４の実施形態のＢＩＰプライマーを作製するために第３の実施形態を実施する場合には、第３の実施形態に記載の「ＦＩＰ」、「Ｆ１」および「Ｆ２」を、各々、「ＢＩＰ」、「Ｂ１」および「Ｂ２」と読み替えるものとする。 The fourth embodiment of the present invention is a BIP primer comprising a complementary sequence of the base sequence of the FIP primer of the third embodiment. The FIP primer of the third embodiment and the BIP primer of the fourth embodiment can be used as a pair (that is, as a forward primer and a reverse primer) and used for nucleic acid amplification by the LAMP method.
However, the F2 region selected in the third embodiment and the B2 region selected in the fourth embodiment sandwich the region to be amplified, and the F2 region of the third embodiment is on the 3 ′ side across the region to be amplified. The B2 area of the fourth embodiment needs to be set. For details, see FIG. 5 or 6A.
In addition, when the third embodiment is carried out to produce the BIP primer of the fourth embodiment, “FIP”, “F1” and “F2” described in the third embodiment are respectively It shall be read as “BIP”, “B1” and “B2”.

すなわち、本発明の第４の実施形態は、ＬＡＭＰ法を用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＢ２領域およびＢ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｂ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｂ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＢ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｂ２領域と同じ要件を満たす領域をＢ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列同士およびＢ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢ１領域の塩基配列およびＢ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程。
（ｄ）Ｂ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＢ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＢ１領域およびＢ２領域の塩基配列に含まれる、各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数が、各領域のコンセンサスの塩基配列とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＢ１領域の塩基配列同士およびＢ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢ１領域の塩基配列およびＢ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定し、それらをペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程、
工程（ｅ）の「一定数」については、第３の実施形態の工程（ｅ）の説明箇所を参照のこと。 That is, the fourth embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacteria, or parasite in a sample using the LAMP method, Steps a) to (g) are carried out, a pair of B2 region and B1 region consensus sequences determined in steps (c) and (f) is selected, and the base sequence of the B2 region is placed on the 3 ′ end side with B1 It is a set of BIP primers comprising a complementary sequence of a base sequence having a sequence complementary to the base sequence of the region on the 5 ′ end side.
(A) A step of aligning sense sequences or antisense sequences of a gene to be examined, comparing bases at corresponding positions between the sequences, and selecting a region having high homology between the sequences as the F2 region ,
(B) a step of selecting a region that exists 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the B2 region selected in step (a) and that satisfies the same requirements as the B2 region as the B1 region;
(C) The base sequences of the B1 region and the base sequences of the B2 region of each gene to be examined are aligned, and the consensus sequence of each region is determined from the aligned base sequences of the B1 region and B2 region. And selecting them as a pair.
(D) The consensus sequence of the B1 region and the bases at the corresponding positions in the base sequence of the B1 region of each test target gene, and the bases at the corresponding positions of the B2 region consensus sequence and the base sequence of the B2 region of each test target gene And the number of bases that are included in the base sequences of the B1 region and B2 region of each gene to be examined and that are different from the bases of the consensus sequence of each region are different from the base sequences of the consensus of each region, A process of counting for each gene to be tested,
(E) extracting a test target gene whose base number counted in step (d) is a certain number or more,
(F) The B1 region base sequences and the B2 region base sequences of the gene to be examined extracted in step (e) are realigned, and the aligned B1 region base sequence and B2 region base sequence are respectively Determining new consensus sequences for the region of and selecting them as a pair;
(G) repeating the steps (d), (e) and (f) until there are no genes to be tested to be extracted;
For the “certain number” in the step (e), refer to the explanation of the step (e) in the third embodiment.

本発明の第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に好適に使用できる配列番号４６〜配列番号８２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２２〜配列番号１２８および配列番号１５７（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）または配列番号１３４〜１３６（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢＩＰプライマーのセットとして例示することができる。   The set of BIP primers of the fourth embodiment of the present invention is not limited. For example, when determining whether the virus contained in the sample to be examined is influenza A virus H5 subtype or not. A population of primers consisting of sequences represented by SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 82 (for Eurasian strains of H5 subtype), SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128 and SEQ ID NO: 157 (H5 subtype Eurasian strains) A group of primers consisting of sequences represented by SEQ ID NOs: 134 to 136 (for American strains of H5 subtype) can be exemplified as a set of BIP primers.

本発明の第５の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、 The fifth embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium or parasite by the LAMP method, and comprises the following (a) to (f): It is a set of F3 primers comprising the consensus sequence of the F3 region determined in steps (b) and (e).
(A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein base sequences existing 5 ′ upstream of the F2 region in the third embodiment are aligned, and bases at corresponding positions between the sequences are aligned. And selecting, as the F3 region, a region having high homology between the genes to be examined,
(B) aligning the base sequences of the F3 region of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned F3 region;
(C) The number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the F3 region of the test target gene by comparing the bases at the corresponding positions of the base sequence of the F3 region of each test target gene with the consensus sequence For each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the F3 region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned F3 region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;

Ｆ３領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ３領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度にしてもよい。
また、Ｆ３領域は、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’末端よりも、５’側に存在する領域に選択される。Ｆ２領域の５’末端の塩基とＦ３領域の３’末端の塩基との間に、例えば、０〜６０塩基程度、好ましくは、５〜４０塩基程度、より好ましくは、１０〜２５塩基程度存在するとよい。 The length of the sequence of the F3 region may be any length that is usually provided by primers used when amplifying nucleic acids by the LAMP method or PCR method, and is determined in consideration of the GC content contained in the selected region. do it. The length of the F3 region sequence is not particularly limited, but may be, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases.
In addition, the F3 region is selected as a region existing on the 5 ′ side from the 5 ′ end of the F2 region in the third embodiment. Between the base at the 5 ′ end of the F2 region and the base at the 3 ′ end of the F3 region, for example, about 0 to 60 bases, preferably about 5 to 40 bases, more preferably about 10 to 25 bases. Good.

本発明の第５の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程である。
ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦ３領域として選択する方法を模式的に示した。詳細な説明は第１の実施形態の工程（ａ）の説明部分を参照のこと。 Step (a) of the fifth embodiment of the present invention is a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, and aligns base sequences existing 5 ′ upstream of the F2 region in the third embodiment. Then, the bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region having high homology between the genes to be examined is selected as the F3 region.
Here, the “region having high homology” is not particularly limited. For example, “a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, which is upstream of the F2 region in the third embodiment”. Base sequences existing in each other are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are the same, and / or each 80% or more of the bases at corresponding positions between the sequences include a mixed base Y composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C, and a single base X and “/ A continuous base sequence region in which the mixed base Y accounts for 90% or more” can be exemplified.
FIG. 1 schematically shows a method of selecting the “region having high homology” exemplified above as the F3 region. For a detailed explanation, see the explanation part of the step (a) of the first embodiment.

本発明の第５の実施形態の工程（ｂ）は、Ｆ３領域同士をアライメントし、アライメントした各Ｆ３領域からコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定する工程である。
本発明の第５の実施形態の工程（ｃ）は、Ｆ３領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列について、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。「コンセンサス配列と異なる塩基の数」については、第１の実施形態の工程（ｃ）の説明箇所を参照のこと。
本発明の第５の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。 In the step (b) of the fifth embodiment of the present invention, the F3 regions are aligned with each other, and a consensus sequence is obtained from the aligned F3 regions (see the explanation of the step (b) of the first embodiment). It is a step of determining.
In step (c) of the fifth embodiment of the present invention, the bases in the F3 region of the test target gene are compared by comparing the consensus sequence of the F3 region with the bases at the corresponding positions in the base sequence of the F3 region of each test target gene. In this step, the number of bases different from the bases of the consensus sequence is counted for each gene to be examined. For the “number of bases different from the consensus sequence”, refer to the explanation of step (c) in the first embodiment.
Step (d) of the fifth embodiment of the present invention is a step of extracting a test target gene whose number of bases counted in step (c) is a certain number or more.
Here, the “certain number” is a limit value of the number of base mismatches that is determined to be incapable of gene amplification by an oligonucleotide primer composed of a consensus sequence. It is a different numerical value and can be easily determined by a person skilled in the art through preliminary experiments or the like.

塩基ミスマッチの限界値は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのペア、第５の実施形態のＦ３プライマーと後述の第６の実施形態のＢ３プライマーのペア、必要な場合には、後述第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーのペアを１セットとして、次の様にして求めることができる。
まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を各々決定する。ここで決定されたプライマーの塩基配列に対し、一定数の変異（例えば、２０塩基あたり、０〜５または０〜３個程度の変異）を導入したプライマーペア（すなわち、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーとＢＬプライマーのペア）を、各々、複数ペア設計し、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーおよびＢＬプライマーのペアからなるプライマーのセットを複数セット準備する。準備したプライマーセットを用いて、検査対象遺伝子の中から、１つの遺伝子を選択し、この遺伝子をテンペレートとして、ＬＡＭＰ法を実施する。その結果、増幅することができたプライマーセットの各領域に含まれる変異の数と増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異の数を調べ、各プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、各プライマー領域の合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などの点に基づいて、塩基ミスマッチ数の限界値を決定することができる。本明細書の実施例、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査 対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１〜５の整数、好ましくは、２〜４の整数、より好ましくは、３である。
図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。 The limit value of the base mismatch is a pair of the FIP primer of the third embodiment and the BIP primer of the fourth embodiment, a pair of the F3 primer of the fifth embodiment and the B3 primer of the sixth embodiment described later, and necessary. In such a case, a pair of a FL primer according to the seventh embodiment described later and a BL primer according to the eighth embodiment described later can be obtained as one set as follows.
First, the F1 and F2 regions selected in the third embodiment, the B1 and B2 regions selected in the fourth embodiment, the F3 region selected in the fifth embodiment, and the sixth embodiment selected. Primer sequences that bind to the B3 region, the FL region selected in the seventh embodiment, and the BL region selected in the eighth embodiment are determined. A primer pair in which a certain number of mutations (for example, about 0 to 5 or 0 to 3 mutations per 20 bases) are introduced into the base sequence of the primer determined here (that is, a pair of FIP primer and BIP primer) , F3 primer and B3 primer pair, FL primer and BL primer pair), each designed in pairs, from FIP primer and BIP primer pair, F3 primer and B3 primer pair, FL primer and BL primer pair Prepare multiple sets of primers. Using the prepared primer set, one gene is selected from the genes to be examined, and the LAMP method is performed using this gene as a template. As a result, the number of mutations contained in each region of the primer set that could be amplified and the number of mutations contained in each region of the primer set that could not be amplified were examined. Based on the number of base mismatches, such as whether gene amplification occurs, how many base mismatches are in total for each primer region, and whether there are primer regions that are susceptible to base mismatches. A limit value can be determined. Examples herein, "Effect of base mismatches on 7. gene amplification" of the material and experimental methods, "8. Base mismatch analysis", and, "Influence of base mismatches on 5 gene amplification" results, See also “6. Estimation of amplification of 2211 H5-HA genes registered in GenBank”.
The “certain number”, that is, the limit of base mismatch varies depending on the gene to be tested. For example, when the gene to be tested is an HA gene belonging to any HA5 subtype of avian influenza virus, , Preferably an integer of 2 to 4, more preferably 3.
When the fixed number is “3” in FIG. 2, the extracted genes are the gene 11, the gene 19, and the gene 20 (FIG. 2B).

本発明の第５の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９のＦ３領域の塩基配列である）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、Ｆ３領域のコンセンサス配列を全て決定されることになる。
決定されたＦ３領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をＦ３プライマーの配列として決定する。 In the step (e) of the fifth embodiment of the present invention, the base sequences of the F3 region of the gene to be examined extracted in the step (d) are aligned again, and a new consensus sequence of the aligned F3 region is determined. (FIG. 2B).
Then, in the step (f), based on the new consensus sequence determined in the step (e), the steps (c), (d) and (e) are performed, and until there is no test target gene to be extracted, Steps (c) to (e) are repeated. In FIG. 2C, the gene to be examined extracted the second time is only gene 19 (therefore, the consensus sequence at this stage is the base sequence of the F3 region of gene 19), and there is no gene to be extracted. All consensus sequences will be determined.
The sequence from the 5 ′ side to the 3 ′ side of the determined consensus sequence of the F3 region is determined as the sequence of the F3 primer.

本発明の第５の実施形態に係るＦ３プライマーは、上記工程（ａ）により決定されたＦ３領域について、工程（ｂ）〜（ｅ）を行わずに、あるいは、工程（ｂ）〜（ｅ）を行った上で、全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦ３領域の塩基配列を網羅する（全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦ３領域の塩基配列を含む）ように混合塩基を含む混合塩基プライマーを調製し、Ｆ３プライマーとしてもよい。なお、混合塩基プライマーを作製する場合は、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。   The F3 primer which concerns on the 5th Embodiment of this invention does not perform process (b)-(e) about F3 area | region determined by the said process (a), or process (b)-(e) In addition, the mixed base primer containing the mixed base so as to cover the base sequence of the F3 region of the sense sequence of all the test target genes (including the base sequence of the F3 region of the sense sequence of all the test target genes) It is good also as F3 primer. When preparing a mixed base primer, the number of mixed bases is desirably 5 or less per 20 base primer.

本発明の第５の実施形態のＦ３プライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号２１〜配列番号３４（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２０（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統の統合用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３７、１３８で表される配列（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）からなるプライマーの集団をＦ３プライマーのセットとして例示することができる。   Although it does not limit as a set of F3 primer of the 5th Embodiment of this invention, For example, it uses when determining whether the virus contained in the sample to be examined is influenza A virus type H5 A group of primers consisting of sequences represented by SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34 (for Eurasian strains of H5 subtype), sequence represented by SEQ ID NO: 120 (for integration of Eurasian strains of H5 subtype and American strains) And a group of primers consisting of the sequences represented by SEQ ID NOs: 137 and 138 (for H5 subtype American strains) can be exemplified as the F3 primer set.

本発明の第６の実施形態は、第５の実施形態のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーである。第５の実施形態のＦ３プライマーと第６の実施形態のＢ３プライマーを１組として（つまり、順方向プライマーと逆方向プライマーとして）、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に使用することができる。
ただし、第５の実施形態で選択したＦ３領域と第６の実施形態で選択したＢ３領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第５の実施形態のＦ３領域が、３’側に第６の実施形態のＢ３領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
なお、第６の実施形態のＢ３プライマーを作製するために第５の実施形態を実施する場合には、第３の実施形態に記載の「Ｆ２」および「Ｆ３」を、各々、「Ｂ２」および「Ｂ３」と読み替えるものとする。 The sixth embodiment of the present invention is a B3 primer comprising a sequence complementary to the base sequence of the F3 primer of the fifth embodiment. The F3 primer of the fifth embodiment and the B3 primer of the sixth embodiment can be used as a pair (that is, as a forward primer and a reverse primer) and used for nucleic acid amplification by the LAMP method.
However, the F3 region selected in the fifth embodiment and the B3 region selected in the sixth embodiment have the F3 region of the fifth embodiment on the 3 ′ side on the 5 ′ side across the region to be amplified. The B3 area of the sixth embodiment needs to be set. For details, see FIG. 5 or 6A.
When the fifth embodiment is carried out in order to produce the B3 primer of the sixth embodiment, “F2” and “F3” described in the third embodiment are respectively replaced with “B2” and It shall be read as “B3”.

すなわち、本発明の第６の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＢ３領域のコンセンサス配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第４の実施形態におけるＢ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＢ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＢ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
工程（ｄ）の「一定数」については、第５の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。 That is, the sixth embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of pathogens such as viruses, bacteria, and parasites by the LAMP method, and the following (a) to (f) ) And a B3 primer set consisting of a complementary sequence of the consensus sequence of the B3 region determined in steps (b) and (e).
(A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein base sequences existing on the 5 ′ upstream side of the B2 region in the fourth embodiment are aligned, and bases at corresponding positions between the sequences are aligned. And selecting a region having high homology between the genes to be examined as a B3 region,
(B) aligning the base sequences of the B3 region of each test target gene, and determining a consensus sequence of the aligned B3 region;
(C) The number of bases that are different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the B3 region of the test target gene by comparing the bases at the corresponding positions of the base sequence of the B3 region of each test target gene with the consensus sequence For each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the B3 region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned B3 region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;
For the “certain number” in the step (d), refer to the explanation of the step (d) in the fifth embodiment.

本発明の第６の実施形態のＢ３プライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるインフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号８３〜配列番号９２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２９（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１４２（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢ３プライマーのセットとして例示することができる。   Although it does not limit as a set of B3 primer of the 6th Embodiment of this invention, For example, it is determined whether the influenza virus contained in the sample to be examined is HA5 subtype of influenza A virus. A group of primers consisting of a sequence represented by SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92 (for Eurasian strain of H5 subtype), which can be used in some cases, represented by SEQ ID NO: 129 (for Eurasian strain of H5 subtype and American strain) A group of primers composed of sequences and a group of primers composed of sequences represented by SEQ ID NO: 142 (for American strain of H5 subtype) can be exemplified as a set of B3 primers.

本発明の第７の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、 The seventh embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of pathogens such as viruses, bacteria, and parasites by the LAMP method, and includes the following (a) to (f): This is a set of FL primers comprising the consensus sequence of the FL region determined in steps (b) and (e).
(A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein the base sequences existing between the F1 region and the F2 region in the third embodiment are aligned, and the bases at corresponding positions between the sequences And selecting a region having high homology between the genes to be examined as an FL region,
(B) aligning the base sequences of the FL region of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned FL region;
(C) The number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the FL region of the test target gene by comparing the bases at the corresponding positions of the base sequence of the FL region of each test target gene with the consensus sequence For each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the FL region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned FL region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;

ＦＬ領域の配列の長さは、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法で核酸を増幅するときに使用するプライマーが通常備えている長さであればよく、選択した領域に含まれるＧＣ含量などを考慮して決定すればよい。Ｆ３領域の配列の長さは、特に限定はしないが、例えば、１０〜２５塩基程度、好ましくは、１５〜２０塩基程度にしてもよい。
また、ＦＬ領域は、上記Ｆ１領域とＦ２領域の間に選択される。ＦＬ領域とＦ１領域またはＦ２領域との距離は特に限定されない。 The length of the FL region sequence may be any length that is usually provided by primers used when amplifying nucleic acids by the LAMP method or PCR method, and is determined in consideration of the GC content contained in the selected region. do it. The length of the F3 region sequence is not particularly limited, but may be, for example, about 10 to 25 bases, preferably about 15 to 20 bases.
The FL region is selected between the F1 region and the F2 region. The distance between the FL region and the F1 region or F2 region is not particularly limited.

本発明の第７の実施形態の工程（ａ）は、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程である。
ここで、「高い相同性を有する領域」とは、特に限定はしないが、例えば、「検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第３の実施形態におけるＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域」を例示することができる。
図１には、上記例示した「高い相同性を有する領域」をＦＬ領域として選択する方法を模式的に示した。詳細な説明は第１の実施形態の工程（ａ）の説明部分を参照のこと。 Step (a) of the seventh embodiment of the present invention is a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, and aligns base sequences present between the F1 region and the F2 region in the third embodiment. Then, the bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region having high homology between the genes to be examined is selected as the F3 region.
Here, the “region having high homology” is not particularly limited. For example, “a sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, which is between the F1 region and the F2 region in the third embodiment. Base sequences existing in each other are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are the same, and / or each 80% or more of the bases at corresponding positions between the sequences include a mixed base Y composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C, and a single base X and “/ A continuous base sequence region in which the mixed base Y accounts for 90% or more” can be exemplified.
FIG. 1 schematically shows a method of selecting the “region having high homology” exemplified above as the FL region. For a detailed explanation, see the explanation part of the step (a) of the first embodiment.

本発明の第７の実施形態の工程（ｂ）は、ＦＬ領域同士をアライメントし、アライメントした各ＦＬ領域からコンセンサス配列（第１の実施形態の工程（ｂ）の説明箇所を参照のこと）を決定する工程である。
本発明の第７の実施形態の工程（ｃ）は、ＦＬ領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程である。「コンセンサス配列と異なる塩基の数」については、第１の実施形態の工程（ｃ）の説明箇所を参照のこと。
本発明の第７の実施形態の工程（ｄ）は、工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程である。
ここで、「一定数」とは、コンセンサス配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーによって、遺伝子増幅ができないと判断される塩基ミスマッチ数の限界値のことで、使用するプライマーの長さや、Ｇ、Ｃ含量によっても異なる数値であり、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる数値である。 In the step (b) of the seventh embodiment of the present invention, the FL regions are aligned with each other, and a consensus sequence is obtained from each aligned FL region (see the explanation of the step (b) of the first embodiment). It is a step of determining.
In the step (c) of the seventh embodiment of the present invention, the consensus sequence of the FL region is compared with the bases at the corresponding positions in the base sequence of the FL region of each test target gene, and the base of the FL region of the test target gene is compared. In this step, the number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the sequence is counted for each gene to be examined. For the “number of bases different from the consensus sequence”, refer to the explanation of step (c) in the first embodiment.
Step (d) of the seventh embodiment of the present invention is a step of extracting a gene to be tested whose number of bases counted in step (c) is a certain number or more.
Here, the “certain number” is a limit value of the number of base mismatches that is determined to be incapable of gene amplification by an oligonucleotide primer composed of a consensus sequence. It is a different numerical value and can be easily determined by a person skilled in the art through preliminary experiments or the like.

塩基ミスマッチの限界値は、第３の実施形態のＦＩＰプライマーと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのペア、第５の実施形態のＦ３プライマーと第６の実施形態のＢ３プライマーのペア、第７の実施形態のＦＬプライマーと後述の第８の実施形態のＢＬプライマーのペアを１セットとして、次の様にして求めることができる。
まず、第３の実施形態で選択されるＦ１およびＦ２領域、第４の実施形態で選択されるＢ１およびＢ２領域、第５の実施形態で選択されるＦ３領域、第６の実施形態で選択されるＢ３領域、第７の実施形態で選択されるＦＬ領域および第８の実施形態で選択されるＢＬ領域の各領域に結合するプライマー配列を各々決定する。ここで決定されたプライマーの塩基配列に対し、一定数の変異（例えば、２０塩基あたり、０〜５または０〜３個程度の変異）を導入したプライマーペア（すなわち、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーとＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーとＢＬプライマーのペア）を、各々、複数ペア設計し、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーのペア、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーのペア、ＦＬプライマーおよびＢＬプライマーのペアからなるプライマーのセットを複数セット準備する。準備したプライマーセットを用いて、検査対象遺伝子の中から、１つの遺伝子を選択し、この遺伝子をテンペレートとして、ＬＡＭＰ法を実施する。その結果、増幅することができたプライマーセットの各領域に含まれる変異の数と増幅できなかったプライマーセットの各領域に含まれる変異の数を調べ、各プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、各プライマー領域の合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などの点に基づいて、塩基ミスマッチ数の限界値を決定することができる。本明細書の実施例、材料および実験方法の「７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「８．塩基ミスマッチ解析」、並びに、結果の「５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響」、「６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定」の箇所も併せて参照のこと。
「一定数」、すなわち、塩基ミスマッチの限界は、検査対象遺伝子によって異なるが、例えば、検査 対象遺伝子が、例えば、鳥インフルエンザウイルスの任意のＨＡ５亜型に属するＨＡ遺伝子の場合には、１〜５の整数、好ましくは、２〜４の整数、より好ましくは、３である。
図２において一定数が「３」の場合には、抽出される遺伝子は、遺伝子１１、遺伝子１９および遺伝子２０となる（図２Ｂ）。 The limit value of the base mismatch is the pair of the FIP primer of the third embodiment and the BIP primer of the fourth embodiment, the pair of the F3 primer of the fifth embodiment and the B3 primer of the sixth embodiment, the seventh A pair of the FL primer of the embodiment and the BL primer of the eighth embodiment to be described later can be obtained as follows.
First, the F1 and F2 regions selected in the third embodiment, the B1 and B2 regions selected in the fourth embodiment, the F3 region selected in the fifth embodiment, and the sixth embodiment selected. Primer sequences that bind to the B3 region, the FL region selected in the seventh embodiment, and the BL region selected in the eighth embodiment are determined. A primer pair in which a certain number of mutations (for example, about 0 to 5 or 0 to 3 mutations per 20 bases) are introduced into the base sequence of the primer determined here (that is, a pair of FIP primer and BIP primer) , F3 primer and B3 primer pair, FL primer and BL primer pair), each designed in pairs, from FIP primer and BIP primer pair, F3 primer and B3 primer pair, FL primer and BL primer pair Prepare multiple sets of primers. Using the prepared primer set, one gene is selected from the genes to be examined, and the LAMP method is performed using this gene as a template. As a result, the number of mutations contained in each region of the primer set that could be amplified and the number of mutations contained in each region of the primer set that could not be amplified were examined. Based on the number of base mismatches, such as whether gene amplification occurs, how many base mismatches are in total for each primer region, and whether there are primer regions that are susceptible to base mismatches. A limit value can be determined. Examples herein, "Effect of base mismatches on 7. gene amplification" of the material and experimental methods, "8. Base mismatch analysis", and, "Influence of base mismatches on 5 gene amplification" results, See also “6. Estimation of amplification of 2211 H5-HA genes registered in GenBank”.
The “certain number”, that is, the limit of base mismatch varies depending on the gene to be tested. For example, when the gene to be tested is an HA gene belonging to any HA5 subtype of avian influenza virus, , Preferably an integer of 2 to 4, more preferably 3.
When the fixed number is “3” in FIG. 2, the extracted genes are the gene 11, the gene 19, and the gene 20 (FIG. 2B).

本発明の第７の実施形態の工程（ｅ）は、工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程である（図２Ｂ）。
そして、工程（ｆ）において、工程（ｅ）で決定した新たなコンセンサス配列に基づいて、工程（ｃ）、工程（ｄ）および工程（ｅ）を行い、抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで、工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返す。図２Ｃでは、２回目に抽出した検査対象遺伝子が遺伝子１９のみとなり（従って、この段階におけるコンセンサス配列は遺伝子１９のＦ３領域の塩基配列である）、さらに抽出する遺伝子は存在しないので、ＦＬ領域のコンセンサス配列を全て決定されることになる。
決定されたＦＬ領域のコンセンサス配列の５’側から３’側に向かう配列をＦＬプライマーの配列として決定する。 In step (e) of the seventh embodiment of the present invention, the base sequences of the FL regions of the gene to be examined extracted in step (d) are aligned again, and a new consensus sequence of the aligned FL region is determined. (FIG. 2B).
Then, in the step (f), based on the new consensus sequence determined in the step (e), the steps (c), (d) and (e) are performed, and until there is no test target gene to be extracted, Steps (c) to (e) are repeated. In FIG. 2C, the gene to be examined extracted the second time is only gene 19 (therefore, the consensus sequence at this stage is the base sequence of the F3 region of gene 19), and there is no gene to be extracted. All consensus sequences will be determined.
The sequence from the 5 ′ side to the 3 ′ side of the consensus sequence of the determined FL region is determined as the sequence of the FL primer.

本発明の第７の実施形態に係るＦＬプライマーは、上記工程（ａ）により決定されたＦＬ領域について、工程（ｂ）〜（ｅ）を行わずに、あるいは、工程（ｂ）〜（ｅ）を行った上で、全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦＬ領域の塩基配列を網羅する（全ての検査対象遺伝子のセンス配列のＦＬ領域の塩基配列を含む）ように混合塩基を含む混合塩基プライマーを調製し、ＦＬプライマーとしてもよい。なお、混合塩基プライマーを作成する場合は、２０塩基のプライマー当たり、混合塩基の数は５個以下であることが望ましい。   The FL primer according to the seventh embodiment of the present invention does not perform the steps (b) to (e) or the steps (b) to (e) for the FL region determined by the step (a). In addition, a mixed base primer containing mixed bases to cover the base sequences of the FL regions of the sense sequences of all the test target genes (including the base sequences of the FL regions of the sense sequences of all the test target genes) It is good also as FL primer. When preparing a mixed base primer, the number of mixed bases is desirably 5 or less per 20 base primer.

本発明の第７の実施形態のＦＬプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ５亜型であるかどうかを判定する場合に使用できる配列番号３５〜配列番号４５（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１２１（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統の統合用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１３９〜１４１で表される配列（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）からなるプライマーの集団をＦＬプライマーのセットとして例示することができる。   The FL primer set according to the seventh embodiment of the present invention is not limited, but, for example, it is determined whether or not the virus contained in the sample to be examined is HA5 subtype of influenza A virus. A group of primers consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45 (for Eurasian strain of H5 subtype), and represented by SEQ ID NO: 121 (for integration of Eurasian strain of H5 subtype and American strain) And a group of primers consisting of the sequences represented by SEQ ID NOs: 139 to 141 (for the H5 subtype American strain) can be exemplified as a set of FL primers.

本発明の第８の実施形態は、第７の実施形態のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーである。第７の実施形態のＦＬプライマーと第８の実施形態のＢＬプライマーを加えることで、ＬＡＭＰ法による核酸の検出時間を短縮するのに有効である。
ただし、第７の実施形態で選択したＦＬ領域と第８の実施形態で選択したＢＬ領域は、増幅したい領域を挟んで５’側に第７の実施形態のＦＬ領域が、３’側に第８の実施形態のＢＬ領域が設定される必要がある。詳細は、図５または図６のＡを参照のこと。
なお、第８の実施形態のＢＬプライマーを作製するために第７の実施形態を実施する場合には、第７の実施形態に記載の「Ｆ１」、「Ｆ２」および「ＦＬ」を、各々、「Ｂ１」、「Ｆ２」および「ＦＬ」と読み替えるものとする。 The eighth embodiment of the present invention is a BL primer comprising a sequence complementary to the base sequence of the FL primer of the seventh embodiment. The addition of the FL primer of the seventh embodiment and the BL primer of the eighth embodiment is effective for shortening the nucleic acid detection time by the LAMP method.
However, the FL region selected in the seventh embodiment and the BL region selected in the eighth embodiment have the FL region of the seventh embodiment on the 5 ′ side and the third region on the 3 ′ side across the region to be amplified. The BL area of the eighth embodiment needs to be set. For details, see FIG. 5 or 6A.
When the seventh embodiment is carried out in order to produce the BL primer of the eighth embodiment, “F1”, “F2” and “FL” described in the seventh embodiment are It shall be read as “B1”, “F2” and “FL”.

すなわち、本発明の第８の実施形態は、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＢＬ領域のコンセンサス配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセットである。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、第４の実施形態におけるＢ１領域とＢ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＢＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＢＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＢＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＢＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、
工程（ｄ）の「一定数」については、第７の実施形態の工程（ｄ）の説明箇所を参照のこと。 That is, the eighth embodiment of the present invention is an oligonucleotide primer for determining the type or subtype of pathogens such as viruses, bacteria, and parasites by the LAMP method, and includes the following (a) to (f) ) And a BL primer set consisting of a sequence complementary to the consensus sequence of the BL region determined in steps (b) and (e).
(A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein the base sequences existing between the B1 region and the B2 region in the fourth embodiment are aligned, and bases at corresponding positions between the sequences And selecting a region having high homology between each test target gene as a BL region,
(B) aligning the base sequences of the BL regions of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned BL regions;
(C) The number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the BL region of the test target gene by comparing the bases at the corresponding positions of the base sequence of the BL region of each test target gene with the consensus sequence For each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the BL region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned BL region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted;
For the “certain number” in the step (d), refer to the explanation of the step (d) in the seventh embodiment.

本発明の第８の実施形態のＢＬプライマーのセットとしては、限定はしないが、例えば、検査対象の試料中に含まれるウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であるかどうかを判定する場合に好適に使用可能な、配列番号９３〜配列番号１１４（Ｈ５亜型のユーラシア系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、配列番号１３０（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団、並びに、配列番号１４３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）で表される配列からなるプライマーの集団をＢＬプライマーのセットとして例示することができる。   The BL primer set according to the eighth embodiment of the present invention is not limited. For example, when determining whether or not the virus contained in the sample to be tested is influenza A virus H5 subtype. A suitably usable primer group consisting of the sequences represented by SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114 (for Eurasian strains of H5 subtype), represented by SEQ ID NO: 130 (for Eurasian strains of H5 subtype and American strains) And a group of primers consisting of the sequence represented by SEQ ID NO: 143 (for American strain of H5 subtype) can be exemplified as a set of BL primers.

本発明の第１〜第８の実施形態のプライマーは、オリゴヌクレオチドの合成法として当該分野において公知の方法（例えば、ホスホジエステル法など）により、ＤＮＡ自動合成装置などを用いて合成してもよく、あるいは、受託合成を行う機関等に委託して合成してもよい。   The primers of the first to eighth embodiments of the present invention may be synthesized by a method known in the art as an oligonucleotide synthesis method (for example, a phosphodiester method) using an automatic DNA synthesizer or the like. Alternatively, it may be synthesized by entrusting to an organization that performs commissioned synthesis.

本発明の第９の実施形態は、少なくとも本発明の第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて、試料中のウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法である。少なくとも本発明の第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて核酸増幅反応を行い、増幅断片が得られた場合（または、得られた断片の長さ等を確認して想定される長さであった場合）、想定される型または亜型由来の遺伝子由来であると判定することができる。
第１の実施形態のフォワードプライマーと第２の実施形態のリバースプライマーのセットは、従来のＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−リアルタイムＰＣＲなどの他、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法など、核酸増幅のためのプライマーペアを使用して、目的の核酸領域を増幅する方法全てに使用することができる。
また、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットは、核酸増幅法全般に使用してもよいが、特に、ＬＡＭＰ法による核酸増幅法に好適に使用することができる。ＦＩＰプライマーのセットとＢＩＰプライマーのセットに加えて、さらに、本発明の第５の実施形態のＦ３プライマーのセットと本発明の第６の実施形態のＢ３プライマーのセット、および／または本発明の第７の実施形態のＦＬプライマーのセットと本発明の第８の実施形態のＢＬプライマーのセットを用いて、ＬＡＭＰ法を行ってもよい。 The ninth embodiment of the present invention is a pair of at least the forward primer set of the first embodiment of the present invention and the reverse primer set of the second embodiment, or the set of the FIP primer of the third embodiment. And a pair of BIP primer sets of the fourth embodiment, a nucleic acid amplification reaction is performed using a nucleic acid derived from a gene of a pathogen such as a virus, bacteria, parasite, etc. in a sample as a template, and the obtained amplified fragment is It is a method of analyzing and determining the type or subtype of a pathogen in a sample. At least a pair of the forward primer set of the first embodiment and the reverse primer set of the second embodiment of the present invention, or the set of the FIP primer of the third embodiment and the BIP primer of the fourth embodiment When a nucleic acid amplification reaction is performed using a pair of sets and an amplified fragment is obtained (or when the length of the obtained fragment is confirmed and the expected length), the expected type or It can be determined that the gene is derived from a subtype.
The set of the forward primer of the first embodiment and the reverse primer of the second embodiment includes a conventional PCR method, an RT-PCR method, a real-time PCR method, an RT-real-time PCR, and a TMA (Transcription Mediated Amplification) method. , NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method, LAMP method, RT-LAMP method, etc., can be used for all methods for amplifying a target nucleic acid region using primer pairs for nucleic acid amplification.
In addition, the FIP primer set of the third embodiment and the BIP primer set of the fourth embodiment may be used for the entire nucleic acid amplification method, but are particularly preferably used for the nucleic acid amplification method by the LAMP method. be able to. In addition to the FIP primer set and BIP primer set, the F3 primer set of the fifth embodiment of the present invention and the B3 primer set of the sixth embodiment of the present invention, and / or the The LAMP method may be performed using the set of FL primers of the seventh embodiment and the set of BL primers of the eighth embodiment of the present invention.

第１の実施形態のフォワードプライマーのセットと第２の実施形態のリバースプライマーのセットのペア（リアルタイムＰＣＲ法の場合はプローブプライマーを加えた３種類のプライマーセット）、あるいは、第３の実施形態のＦＩＰプライマーのセットと第４の実施形態のＢＩＰプライマーのセットのペアを用いて、核酸増幅法を実施すると、フォワードプライマーとリバースプライマー（リアルタイムＰＣＲ法の場合はプローブプライマーを加えた３種類のプライマーセット）、あるいは、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーで挟まれる遺伝子領域を含む領域が増幅される（例えば、図３、図５および図６のＡを参照のこと）。従って、フォワードプライマーとリバースプライマー、あるいは、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーによって挟まれる領域が、核酸合成酵素によって増幅可能な距離となるように、Ｆ２領域およびＢ２領域を選択する必要がある。ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーで挟まれる距離は、特に限定はしないが、例えば、５０ベース〜３００ベース程度、好ましくは、１００ベース〜２００ベース程度である。
なお、本発明の第１〜第８の実施形態のプライマーのセットのいずれかを使用し、ペアとなる他方のプライマーは、本発明にかかるプライマー以外のプライマーを使用して、核酸増幅法を実施することは可能であるから、本発明の第１〜第８の実施形態のプライマーのいずれか１つを使用した場合も、本発明の実施にあたることは言うまでもない。 Pair of forward primer set of the first embodiment and reverse primer set of the second embodiment (in the case of real-time PCR method, three types of primer sets including probe primers), or of the third embodiment When the nucleic acid amplification method is performed using a pair of the FIP primer set and the BIP primer set of the fourth embodiment, a forward primer and a reverse primer (in the case of the real-time PCR method, three types of primer sets including a probe primer) Or a region including a gene region sandwiched between the FIP primer and the BIP primer is amplified (see, for example, FIGS. 3, 5 and 6A). Therefore, it is necessary to select the F2 region and the B2 region so that the region sandwiched between the forward primer and the reverse primer, or the FIP primer and the BIP primer is a distance that can be amplified by the nucleic acid synthase. The distance between the FIP primer and the BIP primer is not particularly limited, but is, for example, about 50 bases to 300 bases, and preferably about 100 bases to 200 bases.
In addition, the nucleic acid amplification method was performed using any one of the primer sets of the first to eighth embodiments of the present invention and using the primer other than the primer according to the present invention as the other primer to be paired. Needless to say, even when any one of the primers of the first to eighth embodiments of the present invention is used, the present invention can be implemented.

本発明の第９の実施形態に係る亜型の判定方法において、判定対象が鳥インフルエンザウイルスのＨ５亜型である場合、ＬＡＭＰ法を実施するためのプライマーセット（ＦＩＰ、Ｆ３、ＦＬ、ＢＩＰ、Ｂ３およびＢＬプライマーからなるセット）に含まれるプライマーの塩基配列を、以下に配列番号で例示する。
（１）プライマーセット（Ｈ５亜型のユーラシア系統用「バージョン１」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１〜配列番号２０
Ｆ３プライマーのセット；配列番号２１〜配列番号３４
ＦＬプライマーのセット；配列番号３５〜配列番号４５
ＢＩＰプライマーのセット；配列番４６〜配列番号８２
Ｂ３プライマーのセット；配列番号８３〜配列番号９２
ＢＬプライマーのセット；配列番号９３〜配列番号１１４
（２）プライマーセット２（Ｈ５亜型のユーラシア系統用「ＰＭ１６プライマーセット」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１１５〜配列番号１１９
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１２０
ＦＬプライマーのセット；配列番号１２１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番１２２〜配列番号１２８
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１２９
ＢＬプライマーのセット；配列番号１３０
（３）プライマーセット３（Ｈ５亜型のアメリカ系統用）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１３１〜配列番号１３３
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１３７〜配列番号１３８
ＦＬプライマーのセット；配列番号１３９〜配列番号１４１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番号１３４〜配列番号１３６
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１４２
ＢＬプライマーのセット；配列番号１４３
（４）プライマーセット４（Ｈ５亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統用「ＰＭ１８プライマーセット」）
ＦＩＰプライマーのセット；配列番号１１５〜配列番号１１９および配列番号１５６
Ｆ３プライマーのセット；配列番号１２０
ＦＬプライマーのセット；配列番号１２１
ＢＩＰプライマーのセット；配列番１２２〜配列番号１２８および配列番号１５７
Ｂ３プライマーのセット；配列番号１２９
ＢＬプライマーのセット；配列番号１３０ In the subtype determination method according to the ninth embodiment of the present invention, when the determination target is the H5 subtype of avian influenza virus, a primer set (FIP, F3, FL, BIP, B3) for performing the LAMP method The base sequences of the primers included in the set consisting of BL primer and BL primer are exemplified by SEQ ID NOs.
(1) Primer set ("Version 1" for Eurasian strains of H5 subtype)
FIP primer set; SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20
F3 primer set; SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34
Set of FL primers; SEQ ID NO: 35-SEQ ID NO: 45
BIP primer set; SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 82
B3 primer set; SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92
Set of BL primers; SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114
(2) Primer set 2 ("PM16 primer set" for H5 subtype Eurasian strain)
Set of FIP primers; SEQ ID NO: 115-SEQ ID 119
F3 primer set; SEQ ID NO: 120
Set of FL primers; SEQ ID NO: 121
BIP primer set; SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128
B3 primer set; SEQ ID NO: 129
BL primer set; SEQ ID NO: 130
(3) Primer set 3 (for H5 subtype American strains)
Set of FIP primers; SEQ ID NO: 131 to SEQ ID NO: 133
F3 primer set; SEQ ID NO: 137 to SEQ ID NO: 138
Set of FL primers; SEQ ID NO: 139 to SEQ ID NO: 141
BIP primer set; SEQ ID NO: 134 to SEQ ID NO: 136
Set of B3 primers; SEQ ID NO: 142
BL primer set; SEQ ID NO: 143
(4) Primer set 4 (“PM18 primer set” for H5 subtype Eurasian and American strains)
Set of FIP primers; SEQ ID NO: 115-SEQ ID 119 and SEQ ID NO: 156
F3 primer set; SEQ ID NO: 120
Set of FL primers; SEQ ID NO: 121
Set of BIP primers; SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128 and SEQ ID NO: 157
B3 primer set; SEQ ID NO: 129
BL primer set; SEQ ID NO: 130

ここで、ウイルスの遺伝子の抽出あるいはｃＤＮＡの調製は、常法に従って行うことができる。例えば、判定対象のウイルスがインフルエンザウイルスである場合、インフルエンザウイルスはＲＮＡウイルスであるため、試料からインフルエンザウイルス遺伝子であるＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型にして、ＬＡＭＰ法を行ってもよい。あるいは、ＬＡＭＰ法の核酸増幅反応を行う反応液中に逆転写酵素を添加し、核酸増幅反応を行ってもよい。ＬＡＭＰ法による核酸増幅を行うために使用するＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有する鎖型依存性核酸合成酵素であれば、特に限定されない。このような酵素としては、Bst DNAポリメラーゼ、Bct(exo-)DNAポリメラーゼ、Csa DNAポリメラーゼなどが挙げられる。   Here, extraction of a viral gene or preparation of cDNA can be performed according to a conventional method. For example, if the virus to be judged is an influenza virus, the influenza virus is an RNA virus, so RNA from the influenza virus gene is extracted from the sample, cDNA is synthesized by reverse transcription, and the synthesized cDNA is used as a template. The LAMP method may be performed. Or you may add a reverse transcriptase in the reaction liquid which performs the nucleic acid amplification reaction of LAMP method, and may perform a nucleic acid amplification reaction. The DNA polymerase used for performing nucleic acid amplification by the LAMP method is not particularly limited as long as it is a chain-type-dependent nucleic acid synthase having strand displacement activity. Examples of such enzymes include Bst DNA polymerase, Bct (exo-) DNA polymerase, Csa DNA polymerase and the like.

また、本実施形態で使用される逆転写酵素は、ＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する活性を持つ酵素であればいかなる酵素であってもよく限定はされないが、あえて例示するなら、例えば、M-MVL（Moloney Murine Leukemia Virus）やAMV（Avian Myeloblastosis Virus）などのレトロウイル由来の逆転写酵素、好熱性真正細菌Thermus thermophilusHB8由来の逆転写酵素などを挙げることができる。   Further, the reverse transcriptase used in the present embodiment is not limited as long as it is an enzyme having an activity of synthesizing cDNA using RNA as a template, but for example, for example, M- Examples include a retrovirus-derived reverse transcriptase such as MVL (Moloney Murine Leukemia Virus) and AMV (Avian Myeloblastosis Virus), a reverse transcriptase derived from the thermophilic eubacteria Thermus thermophilus HB8, and the like.

ＬＡＭＰ法による増幅産物の検出は公知の方法によって行うことができる。例えば、増幅反応の過程で生じるピロリン酸マグネシウムの量が増大すると反応液が白濁するため、目視により増幅産物の存在を確認することができる。また、反応液中にカルセインを添加しておくと、反応前はマンガンイオンと結合して消光しているカルセインが、増幅反応の過程において生成するピロリン酸イオンによってマンガンイオンが奪われることにより、蛍光を発すようになり、増幅産物の存在を確認することができる。あるいは、増幅産物をアガロース電気泳動によって分離するとラーダー上のバンドが複数生じるため、このバンドを検出することで増幅産物の存在を確認してもよい。   Detection of an amplification product by the LAMP method can be performed by a known method. For example, when the amount of magnesium pyrophosphate generated in the course of the amplification reaction increases, the reaction solution becomes cloudy, so the presence of the amplification product can be confirmed visually. In addition, when calcein is added to the reaction solution, calcein that has been quenched by binding to manganese ions before the reaction is depleted by pyrophosphoric acid ions generated during the amplification reaction. The presence of the amplification product can be confirmed. Alternatively, when amplification products are separated by agarose electrophoresis, a plurality of bands on the ladder are generated. Therefore, the presence of the amplification products may be confirmed by detecting these bands.

本発明の第１０の実施形態は、本発明の第１〜第８の実施形態のプライマーのセットの少なくともいずれか１セットを含む、ウイルス、細菌、寄生虫等の病原体の型または亜型を判定するためのキットである。また、本発明の実施形態に係るキットには、ＲＮＡを抽出するための試薬、核酸増幅法（ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＲＴ−リアルタイムＰＣＲ法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法など）による核酸増幅に必要なバッファーや試薬等のほか、使用説明書等を含んでいてもよい。   The tenth embodiment of the present invention determines the type or subtype of a pathogen such as a virus, bacterium, parasite or the like, comprising at least one set of the primer sets of the first to eighth embodiments of the present invention. It is a kit to do. Further, the kit according to the embodiment includes a reagent for extracting RNA, a nucleic acid amplification method (PCR method, RT-PCR method, real-time PCR method, RT-real-time PCR method, TMA method, NASBA method, LAMP). In addition to buffers and reagents necessary for nucleic acid amplification by the method, RT-LAMP method, etc., instructions for use may be included.

以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により何ら限定されるものではない。   Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.

材料および実験方法
１．プライマーデータベース
鳥インフルエンザウイルス、ユーラシア系統のＨ５亜型に属する２２１１個のＨＡ遺伝子の塩基配列は、 “Influenza Virus Resource” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)より取得し、取得した全てのＨＡ遺伝子をアライメントした。アライメントした遺伝子配列をExcelシートに転載し、プライマー用のデータベースを作成した。このプライマー用データベースを用いて、２２１１個のＨＡ遺伝子について、全ての塩基位置における、Ａ、Ｇ、ＴまたはＣの出現率（％）を求めた。
ＨＡ遺伝子上の各プライマー（ＦＩＰ、ＢＩＰ、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬ）の位置は、ＨＡ開裂部位の近傍に設定した（図４Ａおよび図５Ａ）。また、後述する３種類のプライマーセット（Ｓプライマーセット、ＭプライマーセットおよびＰプライマーセット）は、有効性を正しく比較できるように、全てを同じ領域に設定した。 Materials and Experimental Methods Primer database The base sequence of 2211 HA genes belonging to the H5 subtype of avian influenza virus, Eurasian strains is “Influenza Virus Resource” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU. html), and all the acquired HA genes were aligned. The aligned gene sequences were reprinted on an Excel sheet to create a primer database. Using this primer database, the appearance rate (%) of A, G, T, or C at all base positions was determined for 2211 HA genes.
The position of each primer (FIP, BIP, F3, B3, FL and BL) on the HA gene was set in the vicinity of the HA cleavage site (FIGS. 4A and 5A). In addition, all of the three types of primer sets (S primer set, M primer set, and P primer set) described later were set in the same region so that the effectiveness could be correctly compared.

２．プライマーの設計
ウイルス株の遺伝子に特異的なプライマー（Ｓプライマー）
Ｓプライマーは、A/duck/Tsukuba/9/2005 (H5N2)（Ｖ１２４株と略す） のＨＡ遺伝子（アクセッション番号； BAJ23243)を標的に設計されたもので、現在、一般的に使用されているＬＡＭＰ法用のプライマーの例として用いたものである。
混合塩基を含むプライマー（Ｍプライマー）
Ｍプライマーは、多様なＨＡ遺伝子をＰＣＲ法を用いて幅広く検出するために必須のプライマーである（Tsukamotoら, J Clin Microbiol 48:4275-4278, 2010.）。そこで本実施例では、ＭプライマーがＬＡＭＰ法によるＨＡ遺伝子の広範な検出にどの程度有用かを検討した。ＨＡ遺伝子の各塩基位置において、単一の塩基（Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ）では、使用した２２１１個の遺伝子の９８％以上をカバーできない塩基がある場合には、遺伝子のカバー率を高めるために混合塩基を用いて、Ｍプライマーを設計した。プライマー当たりの混合塩基の数は原則として５個以下としたが、それでも塩基カバー率が低い塩基位置がある場合には６個以上の混合塩基を用いても良いとした。 2. Primer design
Primer specific to the virus strain gene (S primer)
The S primer is designed to target the HA gene (accession number; BAJ23243) of A / duck / Tsukuba / 9/2005 (H5N2) (abbreviated as V124 strain) and is currently in common use. This is used as an example of a primer for the LAMP method.
Primer containing mixed base (M primer)
The M primer is an essential primer for widely detecting various HA genes using PCR (Tsukamoto et al., J Clin Microbiol 48: 4275-4278, 2010.). Therefore, in this example, the usefulness of the M primer for the broad detection of the HA gene by the LAMP method was examined. To increase the gene coverage when there is a base that cannot cover 98% or more of the 2211 genes used with a single base (A, G, T or C) at each base position of the HA gene M primers were designed using mixed bases. In principle, the number of mixed bases per primer was set to 5 or less, but when there were still base positions with low base coverage, 6 or more mixed bases could be used.

ポピュレーションプライマー（Ｐプライマー）
Ｐプライマーは、ＬＡＭＰ法によって多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出するために、本発明者らが初めて開発したプライマーである。Ｐプライマーのセットは、プライマー領域において、塩基配列が近縁なＨＡ遺伝子の集団毎にプライマーを設計し、それらを集めたプライマーのセットである。
本研究において（後述）、Ｐプライマーの塩基配列と遺伝子側の塩基配列の間に塩基ミスマッチが２個以内の場合は、該Ｐプライマーで遺伝子増幅が可能であった。これに対して、塩基ミスマッチが３個以上ある遺伝子は、該Ｐプライマーで増幅に６０分以上を必要とするか、増幅されない場合があり、安定した遺伝子検出が困難であった。そこで、各プライマー領域において、塩基ミスマッチ数が２個以下になるようにＰプライマーを設計し、３個以上の遺伝子については、その遺伝子集団を構成する遺伝子をなるべく多くカバーするように、これらのコンセンサス配列からなる新規Ｐプライマーを設計した。新規Ｐプライマーでもカバーできない遺伝子の集団については、新らたな新新規Ｐプライマーを設計した。これを繰り返すことによって、２２１１個の全ての遺伝子に対して、塩基ミスマッチ数が２個以下になるような、Ｐプライマーのセットが設計された。以下にＰプライマーの設計方法を詳述する。 Population primer (P primer)
The P primer is a primer developed by the present inventors for the first time in order to widely detect various HA genes by the LAMP method. The set of P primers is a set of primers in which primers are designed and collected for each group of HA genes having similar base sequences in the primer region.
In this study (described later), gene amplification was possible with the P primer when there were no more than 2 base mismatches between the base sequence of the P primer and the base sequence on the gene side. In contrast, genes with 3 or more base mismatches require 60 minutes or more for amplification with the P primer, or may not be amplified, and stable gene detection is difficult. Therefore, in each primer region, P primers are designed so that the number of base mismatches is 2 or less, and for 3 or more genes, these consensuses are applied so as to cover as many genes constituting the gene population as possible. A new P primer consisting of a sequence was designed. For a population of genes that could not be covered by the new P primer, a new new P primer was designed. By repeating this, a set of P primers was designed so that the number of base mismatches was 2 or less for all 2211 genes. The method for designing the P primer is described in detail below.

（１）プライマー領域の設定
多くの報告では、プライマーセットの設計には、栄研化学株式会社がウェブ上に公開している、ＬＡＭP法専用のプライマー設計ソフトウェアである「Primer Explorer」が使用されている。しかし、多様性がある鳥インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子を標的にした場合、Primer Explorerで設計したプライマー領域は、保存性の低い領域に設定される場合が多く、スペクトルの狭いプライマーになり、野外遺伝子を幅広く検出することができない。
この問題を克服するには、多様なＨＡ遺伝子に広く保存されている領域にプライマー領域に選定しなければならない。そこで、遺伝子バンクからダウンロードした２２１１株のＨ５−ＨＡ遺伝子の全ての塩基位置（約１８００塩基）について、センス配列をアライメントしたプライマー専用データベースを構築し、それを用いて保存性の高い領域を探した。具体的には其々の塩基位置毎に、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率をそれぞれ求め、最も出現率が高い塩基だけを順番に配列したコンセンサス配列を構築した（図７）。このコンセンサス配列を構成する各塩基が遺伝子の何％をカバーするかを求めて、これを其々の塩基位置の塩基カバー率とした。
プライマー領域は、塩基カバー率が高い、良く保存された塩基が２０個程度連続する領域でなければならない。具体的には、プライマー領域の塩基出現率が８０％以上（望ましくは９０％以上、より望ましくは９８％以上）となる単一塩基、または、単一塩基の出現率は８０％未満であっても、塩基出現率が高い上位２種類の塩基の出現率の和が８０％以上（望ましくは９０％以上、より望ましくは９８％以上）となる混合塩基が、２０個程度連続する領域をプライマー領域の候補とした。
これらの候補領域について、ウイルス株Ｖ１２４株の人工Ｈ５−ＨＡ遺伝子（Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子）と完全に塩基配列が一致するプライマーを設計した。それらのプライマーの組合せの中から、実際に実験によってＶ１２４株の遺伝子を３０分以内に増幅できるプライマーのセットとした。このプライマーセットはある株に特異的なプライマーセット（Strain-specific primer set）との意味を込めて、Ｓプライマーセットと命名した。なお、Ｓプライマーセットは現在、一般に利用されている鳥インフルエンザウイルスのプライマーと同等であることから、本研究ではこれを現行のランプ法のプライマーの例として使用した。 (1) Primer region setting In many reports, “Primer Explorer”, a primer design software dedicated to the LAMP method, published on the web by Eiken Chemical Co., Ltd., is used to design primer sets. Yes. However, when targeting the HA and NA genes of diverse avian influenza viruses, the primer region designed by Primer Explorer is often set to a region with low conservation, resulting in a primer with a narrow spectrum. The gene cannot be detected widely.
In order to overcome this problem, it is necessary to select a primer region in a region widely conserved in various HA genes. Therefore, a primer-specific database in which sense sequences were aligned for all base positions (about 1800 bases) of the 2211 strain H5-HA gene downloaded from the gene bank was constructed, and a highly conserved region was searched using the database. . Specifically, the appearance rates of A, G, T, and C were obtained for each base position, and a consensus sequence was constructed in which only the bases having the highest appearance rate were arranged in order (FIG. 7). It calculated | required what% of each gene covers each base which comprises this consensus arrangement | sequence, and made this into the base coverage of each base position.
The primer region must have a high base coverage and a region in which about 20 well-preserved bases are continuous. Specifically, the base appearance rate of the primer region is 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 98% or more), or the appearance rate of a single base is less than 80%. In addition, a region where about 20 consecutive mixed bases with a sum of the appearance rates of the top two types of bases having a high base appearance rate of 80% or more (preferably 90% or more, more preferably 98% or more) is a primer region. As a candidate.
For these candidate regions, primers were designed that completely matched the base sequence with the artificial H5-HA gene (H5 subtype HA gene) of the virus strain V124. Out of these primer combinations, a primer set capable of amplifying the gene of the V124 strain within 30 minutes was actually obtained by experiments. This primer set was named S primer set in the meaning of a strain-specific primer set for a certain strain. Since the S primer set is equivalent to the commonly used avian influenza virus primer, it was used as an example of the current ramp method primer in this study.

（２）Ｐプライマーの設計
決定されたプライマー領域に個々のＰプライマーを設計する手順について説明する。ＬＡＭＰ法では、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーが遺伝子増幅に最も重要な役割を果たしている。ＦＩＰプライマーの長さはＦ３プライマーやＦＬプライマーの２倍ほどあるため、ＦＩＰプライマーにおいて、多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出することは特に難しい。ＦＩＰプライマーを設計する際には、プライマー領域の塩基配列が類似した、特定の遺伝子ポピュレーション毎に、プライマーを設計することが重要と考えられる。そこで先ず、ＦＩＰプライマーの設計手順を説明する。
（ｉ）コンセンサス配列の設計：
アライメントしたプライマー用データベースを用いて、其々の塩基位置毎にＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの出現率を求め、最も高い塩基出現率を示す塩基だけを順番に配列させたのがコンセンサス配列となる。
２２１１株のＨ５−ＨＡ遺伝子からなる母集団に対して、Ｆ２領域とＦ１領域をセットにしたコンセンサス配列を構築した（図５を参照）。
（ｉｉ）塩基ミスマッチ数のカウント：
Ｆ２領域とＦ１領域に対するコンセンサス配列と、其々のＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基を比較して、両者の種類が一致しない数（「塩基ミスマッチ数」と呼ぶ。）をＨＡ遺伝子毎に、また領域毎にカウントした。
（ｉｉｉ）増幅判定：
Ｆ２領域またはＦ１領域のコンセンサス配列と、其々のＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基配列を比較して、何れか一方の領域における塩基ミスマッチ数が３個以上となるＨＡ遺伝子、およびＦ２領域とＦ１領域の塩基ミスマッチ数が共に２個以上（計４以上）となるＨＡ遺伝子は、上記コンセンサス配列を基に設計するPプライマーでは増幅困難と判定した。
（ｉｖ）新規母集団の編成：
増幅困難と判定されたＨＡ遺伝子を抽出し、新規母集団を編成した。
（ｖ）新規コンセンサス配列の設計：
新規母集団を編成する遺伝子に対して、工程（ｉ）にしたがって、Ｆ２領域とＦ１領域をセットにした新規コンセンサス配列を設計した。
（ｖｉ）検出困難と判定されるＨＡ遺伝子が存在しなくなるまで上記の工程（ｉ）〜（ｖ）を繰り返すことによって、Ｆ２領域とＦ１領域をペアにした、複数のコンセンサス配列のセットを設計した。これによって、全てのＨＡ遺伝子が、Ｆ２領域またはＦ１領域の塩基ミスマッチ数がそれぞれ２個以下で、且つ合計でも３個以下となるコンセンサス配列でカバーされることになる。
（Ｖｉｉ）ＦＩＰプライマーの設計：
得られたコンセンサス配列の各セットにおいて、Ｆ１領域の相補鎖のコンセンサス配列を５末端に、Ｆ２領域のコンセンサス配列を３末端にした融合したＦＩＰプライマーを設計する（配列番号１〜配列番号２０）。これによって、ＦＩＰ領域に対するＰプライマーのセットが設計される。
ＦＩＰプライマー領域の長さはＦ２領域とＦ１領域ともに２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。最初に設計したＦＩＰプライマー（Ｌｏｎｇ ＦＩＰプライマー）の本数は２０本であったが、Ｆ２領域を２０塩基から１６塩基へ、Ｆ１領域を２０塩基から１４塩基へ短縮させたＳｈｏｒｔ ＦＩＰプライマーにしたところ、本数を計５本にまで減らすことができた（配列番号１１５〜配列番号１１９）。なお、このセットは８種類のプライマー分子の混合物であるが、当該技術分野においては、混合塩基を含めて合成すれば５本のプライマーとして扱われるため、本明細書においては５本と表記する。
ＦＩＰプライマーの位置は、鳥インフルエンザウイルスのＶ１２４株を基準にした場合、Ｌｏｎｇ ＦＩＰプライマーのＦ２領域は塩基番号９５０〜９６９、Ｆ１（Ｆ１ｃ）領域は塩基番号９９８〜１０１７に（図５）、Ｓｈｏｒｔ ＦＩＰプライマーのＦ２領域は塩基番号９５４〜９６９に、Ｆ１（Ｆ１ｃ）領域は塩基番号１００４〜１０１７であった（図６）。 (2) P primer design The procedure for designing individual P primers in the determined primer region will be described. In the LAMP method, the FIP primer and the BIP primer play the most important role in gene amplification. Since the length of the FIP primer is about twice that of the F3 primer or FL primer, it is particularly difficult to detect a wide variety of HA genes in the FIP primer. When designing an FIP primer, it is considered important to design a primer for each specific gene population having a similar base region in the primer region. First, the design procedure of the FIP primer will be described.
(I) Consensus sequence design:
Using the aligned primer database, the appearance rate of A, G, T, and C is determined for each base position, and only the bases that show the highest base appearance rate are arranged in order to form a consensus sequence. .
A consensus sequence comprising the F2 region and the F1 region as a set was constructed for a population consisting of 2211 strain H5-HA genes (see FIG. 5).
(Ii) Counting the number of base mismatches:
The consensus sequence for the F2 region and F1 region is compared with the base at the corresponding position of each HA gene, and the number of types that do not match (referred to as the “base mismatch number”) for each HA gene, Counted for each region.
(Iii) Amplification determination:
Comparing the consensus sequence of the F2 region or F1 region with the base sequence at the corresponding position of each HA gene, the HA gene having 3 or more base mismatches in any one region, and the F2 region and F1 It was determined that it was difficult to amplify the HA gene in which the number of base mismatches in the region was 2 or more (total 4 or more) using the P primer designed based on the consensus sequence.
(Iv) Formation of a new population:
HA genes that were determined to be difficult to amplify were extracted and a new population was organized.
(V) Designing a new consensus sequence:
A novel consensus sequence in which the F2 region and the F1 region are set as a set was designed according to the step (i) for the genes that compose the new population.
(Vi) By repeating the above steps (i) to (v) until there is no HA gene determined to be difficult to detect, a set of multiple consensus sequences in which the F2 region and the F1 region are paired was designed. . As a result, all the HA genes are covered with a consensus sequence in which the number of base mismatches in the F2 region or F1 region is 2 or less and 3 or less in total.
(Vii) FIP primer design:
In each set of the obtained consensus sequences, a fused FIP primer is designed (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20) with the consensus sequence of the complementary strand of the F1 region at the 5 end and the consensus sequence of the F2 region at the 3 end. This designs a set of P primers for the FIP region.
The length of the FIP primer region is preferably about 20 bases for both the F2 region and the F1 region, but may be shorter if the gene can be amplified. The number of FIP primers designed at first (Long FIP primer) was 20, but when the F2 region was shortened from 20 bases to 16 bases and the F1 region was shortened from 20 bases to 14 bases, Short FIP primers were used. The number could be reduced to a total of 5 (SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119). This set is a mixture of eight types of primer molecules. However, in this technical field, if they are synthesized including a mixed base, they are handled as five primers.
When the position of the FIP primer is based on the V124 strain of avian influenza virus, the F2 region of the Long FIP primer is at base numbers 950 to 969, the F1 (F1c) region is at base numbers 998 to 1017 (FIG. 5), Short FIP The F2 region of the primer was base numbers 954 to 969, and the F1 (F1c) region was base numbers 1004 to 1017 (FIG. 6).

（ｖｉｉｉ）ＢＩＰプライマーの設計：
ＢＩＰプライマーはＢ２領域とＢ１領域から構成され、５’末端にはＢ１領域の相補鎖の配列を、３末端にはＢ２領域を融合したプライマーである。ＢＩＰプライマーの設計方法はＦＩＰプライマーの設計と同様である。プライマー領域の塩基配列が類似する、遺伝子ポピュレーション毎にＢＩＰプライマーを設計する。具体的には工程（ｉ）〜工程（ｖｉｉ）を経て、ＢＩＰ領域に対するＰプライマーセットを設計した。
ＢＩＰプライマー領域の長さはＢ１領域とＢ２領域ともに２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できればそれより短くても良い。最初に設計したＢＩＰプライマーの本数は３７本（配列番号４６〜配列番号８２）であったが、Ｂ１領域を１７塩基から１１／１２塩基へ、Ｂ２領域を１９塩基から１７塩基へ短縮させたＳｈｏｒｔ ＢＩＰプライマーでは、合計７本（配列番号１２２〜配列番号１２８）まで本数を減らすことができた。なお、このセットは１０種類のプライマー分子の混合物であるが、当該技術分野では混合塩基を含めて合成すれば７本のプライマーとして扱われるため、本明細書では７本と表記する。
ＢＩＰプライマーの位置は、Ｖ１２４株を基準にした場合、Ｌｏｎｇ ＢＩＰプライマーのＢ２領域は塩基番号１０７１〜１０８９、Ｂ１（Ｂ１ｃ）領域は塩基番号１０２４〜１０４０に（図５）、Ｓｈｏｒｔ ＦＩＰプライマーのＢ２領域は塩基番号１０７３〜１０８９に、Ｂ１（Ｂ１ｃ）領域は塩基番号１０２２〜１０３３であった（図６）。 (Viii) BIP primer design :
The BIP primer is composed of a B2 region and a B1 region, and is a primer in which the sequence of the complementary strand of the B1 region is fused at the 5 ′ end and the B2 region is fused at the 3 end. The design method of the BIP primer is the same as the design of the FIP primer. A BIP primer is designed for each gene population whose primer region has a similar base sequence. Specifically, a P primer set for the BIP region was designed through steps (i) to (vii).
The length of the BIP primer region is preferably about 20 bases for both the B1 region and the B2 region, but may be shorter if the gene can be amplified. The number of BIP primers designed first was 37 (SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 82), but the B1 region was shortened from 17 bases to 11/12 bases, and the B2 region was shortened from 19 bases to 17 bases. With BIP primers, the number could be reduced to a total of 7 (SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128). This set is a mixture of 10 types of primer molecules. However, in this technical field, if it is synthesized including a mixed base, it will be treated as 7 primers, so it is described as 7 in this specification.
When the BIP primer is based on the V124 strain, the B2 region of the Long BIP primer has base numbers 1071 to 1089, the B1 (B1c) region has base numbers 1024 to 1040 (FIG. 5), and the B2 region of the Short FIP primer. Were base numbers 1073 to 1089, and the B1 (B1c) region was base numbers 1022 to 1033 (FIG. 6).

（ｉｘ）Ｆ３プライマーの設計：
２２１１株のＨ５−ＨＡ遺伝子を用いて構築したプライマー専用データベースから、Ｆ３領域を切り出した。次に、Ｆ３領域のコンセンサス配列（図７を参照）と、個々のＨＡ遺伝子のＦ３領域の塩基配列を比較して、一致しない塩基数（塩基ミスマッチ数）をカウントした。Ｆ３領域において塩基ミスマッチが３以上となるＨＡ遺伝子は、コンセンサス配列を基に設計するプライマーでは増幅困難と判定し、これらを抽出して新規母集団を編成した。新規母集団に対して新規コンセンサス配列を設計し、新規コンセンサス配列と新規母集団に属す各ＨＡ遺伝子の配列を比較して、ＨＡ遺伝子当たりの塩基ミスマッチ数をカウントした。塩基ミスマッチ数が３以上となるＨＡ遺伝子は、新規コンセンサス配列を基に設計するプライマーでは増幅困難と判定し、これらの増幅困難遺伝子を抽出して次の母集団を編成した。この工程を増幅困難な遺伝子がなくなるまで繰り返すことによって、Ｆ３領域に対して、２２１１株のＨ５−ＨＡ遺伝子の其々に対して、塩基ミスマッチ数が２個以下となるＰプライマーのセットが設計される。
Ｆ３プライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。Ｆ３領域のＰプライマーの本数は１４本であった（配列番号２１〜配列番号３４）。
Ｆ３プライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号９１７〜９３６に設定された（図５および図６）。
なお、Ｆ３領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることも可能であった（配列番号１２０）。 (Ix) F3 primer design :
The F3 region was excised from a primer-only database constructed using the 2211 strain H5-HA gene. Next, the consensus sequence of the F3 region (see FIG. 7) was compared with the base sequence of the F3 region of each HA gene, and the number of mismatched bases (base mismatch number) was counted. The HA gene having a base mismatch of 3 or more in the F3 region was determined to be difficult to amplify with primers designed based on the consensus sequence, and these were extracted to organize a new population. A new consensus sequence was designed for a new population, and the number of base mismatches per HA gene was counted by comparing the new consensus sequence with the sequence of each HA gene belonging to the new population. An HA gene having a base mismatch number of 3 or more was determined to be difficult to amplify with a primer designed based on a novel consensus sequence, and the next population was organized by extracting these difficult amplification genes. By repeating this process until there are no more difficult-to-amplify genes, a set of P primers with a base mismatch number of 2 or less for each of the H5-HA genes of 2211 strains is designed for the F3 region. The
The length of the F3 primer is preferably about 20 bases, but may be shorter if the gene can be amplified. The number of P primers in the F3 region was 14 (SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34).
The position of the F3 primer was set to base numbers 917 to 936 for the V124 strain (FIGS. 5 and 6).
In addition, even if F3 area | region was not P primer, it was also possible to use a mixed base primer (sequence number 120).

（ｘ）ＦＬプライマーの設計：
プライマー専用データベースから、ＦＬ領域を切り出し、この情報を基に工程（ｉｘ）に準じてＦＬ領域に対するＰプライマーのセットを設計した。
ＦＬプライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。ＦＬ領域のＰプライマーの本数は１１本であった（配列番号３５〜配列番号４５）。
ＦＬプライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号９７４〜９９３に設定された（図５および図６）。
なお、ＦＬ領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１２１）。 (X) FL primer design :
The FL region was cut out from the primer-dedicated database, and a set of P primers for the FL region was designed according to step (ix) based on this information.
The length of the FL primer is preferably about 20 bases, but may be shorter if the gene can be amplified. The number of P primers in the FL region was 11 (SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45).
The position of the FL primer was set to base numbers 974 to 993 for the V124 strain (FIGS. 5 and 6).
The FL region can be a mixed base primer (SEQ ID NO: 121) even if it is not a P primer.

（ｘｉ）Ｂ３プライマーの設計：
プライマー専用データベースから、Ｂ３領域を切り出し、この情報を基に、工程（ｉｘ）に準じてＢ３領域に対するＰプライマーセットを設計した。
Ｂ３プライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。Ｂ３領域のＰプライマーの本数は１０本であった（配列番号８３〜配列番号９２）。
Ｂ３プライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号１０９２〜１１１０に設定された（図５および図６）。
なお、Ｂ３領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１２９）。 (Xi) B3 primer design :
The B3 region was cut out from the primer-dedicated database, and based on this information, a P primer set for the B3 region was designed according to step (ix).
The length of the B3 primer is preferably about 20 bases, but may be shorter if the gene can be amplified. The number of P primers in the B3 region was 10 (SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92).
The position of the B3 primer was set to base numbers 1092 to 1110 for the V124 strain (FIGS. 5 and 6).
Note that a mixed base primer can be used for the B3 region, not a P primer (SEQ ID NO: 129).

（ｘｉｉ）ＢＬプライマーの設計：
プライマー専用データベースから、ＢＬ領域を切り出し、この情報を基に、工程（ｉｘ）に準じてＢＬ領域に対するＰプライマーセットを設計した。
ＢＬプライマーの長さは２０塩基程度が望ましいが、遺伝子が増幅できれば、それより短くても良い。ＢＬ領域のＰプライマーの本数は２２本であった（配列番号９３〜配列番号１１４）。
ＢＬプライマーの位置は、Ｖ１２４株に対しては塩基番号１０４９〜１０６８または塩基番号１０５２〜１０７１（混合塩基プライマーの場合）に設定された（図５および図６）。
なお、ＢＬ領域はＰプライマーでなくても、混合塩基プライマーを用いることができる（配列番号１３０）。 (Xii) BL primer design :
A BL region was cut out from the primer-dedicated database, and based on this information, a P primer set for the BL region was designed according to step (ix).
The length of the BL primer is preferably about 20 bases, but may be shorter if the gene can be amplified. The number of P primers in the BL region was 22 (SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114).
The position of the BL primer was set to base numbers 1049 to 1068 or base numbers 1052 to 1071 (in the case of mixed base primers) for the V124 strain (FIGS. 5 and 6).
The BL region can be a mixed base primer (SEQ ID NO: 130) even if it is not a P primer.

８ヶ所のプライマー領域について、それぞれＰプライマーを設計したところ、合計で１１４本からなるＰプライマーセット（バージョン１）が得られた。   When P primers were designed for each of the eight primer regions, a total of 114 P primer sets (version 1) were obtained.

３．テンペレートの調整
（１）ＰＣＲテンペレート
インフルエンザウイルス（ｃＤＮＡを含む）を入手することは困難なことから、本研究では、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子の増幅部位を、遺伝子バンク情報を基にして、ＰＣＲによって人工合成したテンペレートを用いた。人工合成したＤＮＡテンペレートの大きさは２７０塩基で、遺伝学的に異なる１５株のＨ５亜型の鳥インフルエンザウイルスを選んだ。それらの塩基配列をアライメントしたものを図８に示す。
これら１５株の遺伝子のうち、７株は１９７６年〜２００９年の間に日本において水鳥の渡り鳥から単離したＬＰＡＩウイルスに由来し、８株は２００３年〜２０１３年の間にAsian H5N1 subtype HPAIのＨ５亜型ＨＡ遺伝子に由来している。これらのＨＡ遺伝子テンペレートは、５本の７０塩基長のオリゴヌクレオチドペアを用いて、２段階のＰＣＲにより合成した。使用したオリゴヌクレオチドは以下の通りである（塩基配列は配列番号で示す）。 3. Adjustment of temperate (1) PCR temperate Since it is difficult to obtain influenza virus (including cDNA), in this study, the amplification site of HA gene of H5 subtype was determined based on gene bank information. Temperates artificially synthesized by PCR were used. The size of the artificially synthesized DNA template was 270 bases, and 15 genetically different H5 subtype avian influenza viruses were selected. The alignment of these base sequences is shown in FIG.
Among these 15 strains, 7 strains are derived from LPAI virus isolated from migratory waterbirds in Japan between 1976 and 2009, and 8 strains of Asian H5N1 subtype HPAI between 2003 and 2013 It is derived from the H5 subtype HA gene. These HA gene templates were synthesized by two-step PCR using five 70-base oligonucleotide pairs. The oligonucleotides used are as follows (base sequence is indicated by SEQ ID NO).

Bangladesh 2009株
Forward Primer（プラス鎖、以下同じ）：配列番号１５８、配列番号１５９
Reverse Primer（マイナス鎖）、以下同じ：配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２
Bangladesh 2012株
Forward Primer：配列番号１６３、配列番号１６４
Reverse Primer：配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７
Dk Egypt 2013株
Forward Primer：配列番号１６８、配列番号１７２
Reverse Primer：配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１
Dk VN 2012株
Forward Primer：配列番号１７３、配列番号１７４
Reverse Primer：配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７
Falcon HK 2009株
Forward Primer：配列番号１７８、配列番号１７９
Reverse Primer：配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２
V124株
Forward Primer：配列番号１８３、配列番号１８４
Reverse Primer：配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７
V177株
Forward Primer：配列番号１９３、配列番号１９４
Reverse Primer：配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７
V265株
Forward Primer：配列番号１９８、配列番号１９９
Reverse Primer：配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２
V372株
Forward Primer：配列番号２０３、配列番号２０４
Reverse Primer：配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７
V382株
Forward Primer：配列番号２０８、配列番号２０９
Reverse Primer：配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１２
V44株
Forward Primer：配列番号２１３、配列番号２１４
Reverse Primer：配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７
V463株
Forward Primer：配列番号２１８、配列番号２１９
Reverse Primer：配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２
V77株
Forward Primer：配列番号２２３、配列番号２２４
Reverse Primer：配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７
V80株
Forward Primer：配列番号２２８、配列番号２２９
Reverse Primer：配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２ Bangladesh 2009 shares
Forward Primer (plus strand, the same applies hereinafter): SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 159
Reverse Primer (minus strand), the same below: SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162
Bangladesh 2012 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164
Reverse Primer: SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167
Dk Egypt 2013 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 172
Reverse Primer: SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 171
Dk VN 2012 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174
Reverse Primer: SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177
Falcon HK 2009 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179
Reverse Primer: SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182
V124 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 184
Reverse Primer: SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 187
V177 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194
Reverse Primer: SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197
V265 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 199
Reverse Primer: SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202
V372 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 204
Reverse Primer: SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 207
V382 stock
Forward Primer: SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209
Reverse Primer: SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212
V44 stock
Forward Primer: SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214
Reverse Primer: SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217
V463 shares
Forward Primer: SEQ ID NO: 218, SEQ ID NO: 219
Reverse Primer: SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222
V77 stock
Forward Primer: SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224
Reverse Primer: SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227
V80 stock
Forward Primer: SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229
Reverse Primer: SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232

７０塩基長のオリゴヌクレオチドペアは、隣接するオリゴヌクレオチドの両末端部分と２０塩基がオーバーラップするようにデザインしてある。最初のＰＣＲでは、Ex Taq（Takara, Shiga, Japan）を含む各チューブに、プライマー１（プラス鎖）および２（マイナス鎖）と、プライマー３（プラス鎖）及び４（マイナス鎖）の２組の組合せで、１５サイクルのＰＣＲ反応を行い、それぞれ１２０塩基のＤＮＡを増幅した。その合成ＤＮＡを１００倍に希釈し、両端の７０塩基長の２つのプライマー（プライマー１（プラス鎖）および５（マイナス鎖））を用いて、３０サイクルのＰＣＲ反応を行って、２７０塩基長のＤＮＡをＰＣＲテンペレートＤＮＡとした。塩基配列解析により、これらの合成ＤＮＡの塩基配列が正しいことを確認してから実験に用いた。
ＰＣＲテンペレートＤＮＡをＬＡＭＰ法に使用する場合、ＰＣＲ増幅産物の１，０００倍希釈液を使用したが、この希釈液には１０６乗分子のテンペレートが含まれている。この濃度は尿膜腔液由来のウイルス液から調製したｃＤＮＡの１０倍希釈液に相当する分子を含んでいる。 The 70 base long oligonucleotide pair is designed so that 20 bases overlap with both terminal portions of adjacent oligonucleotides. In the first PCR, in each tube containing Ex Taq (Takara, Shiga, Japan), two sets of primers 1 (plus strand) and 2 (minus strand) and primers 3 (plus strand) and 4 (minus strand) In combination, 15 cycles of PCR reaction were performed to amplify 120-base DNA each. The synthetic DNA was diluted 100-fold, and 30 cycles of PCR reaction were performed using two primers (primer 1 (plus strand) and 5 (minus strand)) at both ends. The DNA was designated as PCR template DNA. After confirming that the base sequences of these synthetic DNAs were correct by base sequence analysis, they were used in experiments.
When PCR temperate DNA was used in the LAMP method, a 1,000-fold diluted solution of the PCR amplification product was used, and this diluted solution contains 10 6 molecules of temperate. This concentration contains molecules corresponding to a 10-fold dilution of cDNA prepared from allantoic fluid-derived virus fluid.

（２）ウイルスｃＤＮＡテンペレート
鳥インフルエンザウイルス（Ｈ１〜Ｈ４亜型、Ｈ６亜型、Ｈ８〜Ｈ１２亜型）、鶏伝染性気管支炎ウイルス（Infectious bronchitis virus、IBV）およびニューキャッスル病ウイルス（Newcastle disease virus、NDV）のウイルスゲノムRNAは、感染発育鶏卵の尿膜腔液からViral RNA Purification Kit (Qiagen)を用いて精製した。次に、これを鋳型にしてSuperScript III reverse transcriptase (Takara, Shiga, Japan)を用いて、ウイルスゲノムＲＮＡからウイルスｃＤＮＡを合成した（Tsukamotoら, J Clin Microbiol 48:4275-4278, 2010.）。ＬＡＭＰ法およびリアルタイムＰＣＲには、得られたｃＤＮＡを１０倍に希釈した液を使用した。 (2) viral cDNA temperate: avian influenza virus (H1-H4 subtype, H6 subtype, H8-H12 subtype), chicken infectious bronchitis virus (IBV) and Newcastle disease virus (Newcastle disease virus) , NDV) was purified from the allantoic fluid of infected chicken eggs using the Viral RNA Purification Kit (Qiagen). Next, using this as a template, viral cDNA was synthesized from viral genomic RNA using SuperScript III reverse transcriptase (Takara, Shiga, Japan) (Tsukamoto et al., J Clin Microbiol 48: 4275-4278, 2010.). For the LAMP method and real-time PCR, a solution obtained by diluting the obtained cDNA 10-fold was used.

４．ＬＡＭＰ法
ＰＣＲテンペレートＤＮＡ（１，０００倍希釈）１μＬ、８０ｐｍｏｌのＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマー溶液を各々０．５μＬ、４０ｐｍｏｌのＦＬプライマーおよびＢＬプライマー溶液を各々０．５μＬ、５ｐｍｏｌのＦ３プライマーおよびＢ３プライマー溶液を各々０．５μＬ、（ｘ２）酵素反応液を５．０μＬ、Bst DNA polymerase（New England BioLabs, Tokyo）を０．５μＬ、蛍光検出試薬（Eiken Chemical, Tokyo, Japan）を０．５μＬ含む、ＬＡＭＰ法の反応溶液を用いて、総量１０μＬの系で反応させた。（ｘ１）?酵素反応液の組成は、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、８ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４、０．８ｍｍｏｌ／Ｌ ベタイン（Sigma, USA）および１．４ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰｓ（Promega, USA）とした。
テンペレートを含む反応液を６０℃で６０分間反応させた後、９５℃で２分間の処理によって反応を停止させた。その反応チューブにＵＶを照射し、緑色蛍光の有無から遺伝子増幅の有無を判定した。緑色発光した場合はＨ５亜型のＨＡ遺伝子が陽性と判定した。 4). LAMP method PCR template DNA (1,000-fold dilution) 1 μL, 80 pmol FIP primer and BIP primer solution 0.5 μL each, 40 pmol FL primer and BL primer solutions 0.5 μL each, 5 pmol F3 primer and B3 primer 0.5 μL of each solution, 5.0 μL of (x2) enzyme reaction solution, 0.5 μL of Bst DNA polymerase (New England BioLabs, Tokyo), 0.5 μL of fluorescence detection reagent (Eiken Chemical, Tokyo, Japan) Using the reaction solution of the LAMP method, the reaction was carried out in a system with a total volume of 10 μL. (X1)? The composition of the enzyme reaction solution was 20 mmol / L Tris-HCl (pH 8.8), 10 mmol / L KCl, 10 mmol / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% Triton X-100, 8 mmol / L MgSO 4 , 0.8 mmol / L betaine (Sigma, USA) and 1.4 mmol / L dNTPs (Promega, USA).
The reaction solution containing temperate was reacted at 60 ° C. for 60 minutes, and then the reaction was stopped by treatment at 95 ° C. for 2 minutes. The reaction tube was irradiated with UV, and the presence or absence of gene amplification was determined from the presence or absence of green fluorescence. When green light was emitted, it was determined that the H5 subtype HA gene was positive.

５．特異性の検討
Ｈ５亜型の 鳥インフルエンザウイルスを検出するＬＡＭＰ法の反応特異性の検討は、１２種類のＨＡ亜型の鳥インフルエンザウイルスと、鳥インフルエンザウイルス以外の２種類の鶏ウイルスを用いて行った。
反応特異性の検討に使用するテンペレートとしては、鳥インフルエンザウイルスのＨ５亜型およびＨ７亜型については、７０塩基長のプライマーを用いて、人工合成したＰＣＲテンペレートを１，０００倍希釈して用いた。それら以外のＨＡ亜型（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１およびＨ１２亜型）の鳥インフルエンザウイルス、ＮＤＶ（Ｂ１株）およびＩＢＶ（Ｈ１２０株）については、ウイルスｃＤＮＡの１０倍希釈液を反応特異性の検討に使用した。
ＬＡＭＰ法の増幅反応は上記５と同様に、６０℃で６０分間の培養後に反応を停止させてから、紫外線照射によって判定したが、非特異反応の有無は、より厳格に確認するために、増幅反応時間は１２０分まで延長した。 5. Examination of specificity Examination of reaction specificity of LAMP method for detecting avian influenza virus of H5 subtype was performed using 12 types of HA subtype avian influenza viruses and 2 types of chicken viruses other than avian influenza viruses. It was.
As a template used for the examination of reaction specificity, for the H5 and H7 subtypes of avian influenza virus, the artificially synthesized PCR template was diluted 1,000 times with a 70-base primer. Using. For other HA subtypes (H1, H2, H3, H4, H6, H8, H9, H10, H11 and H12 subtypes) avian influenza virus, NDV (B1 strain) and IBV (H120 strain) A 10-fold dilution of was used to examine reaction specificity.
The amplification reaction of the LAMP method was determined by ultraviolet irradiation after stopping the reaction after 60 minutes of incubation at 60 ° C., as in 5 above, but in order to more strictly confirm the presence or absence of nonspecific reaction, amplification The reaction time was extended to 120 minutes.

６．感度の検討
ＬＡＭＰ法の標的となるＨ５亜型のＨＡ遺伝子の断片（A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)株由来）の人工合成ＤＮＡ（４００塩基長、１０１０コピー／μｌ）を挿入したプラスミドテンペレートを１０倍階段希釈して、テンペレートの分子数を１０６コピー／μＬ〜１コピー／μＬの範囲に調製して、プラスミドテンペレートの階段希釈液を準備した。
またＰＣＲで増幅した、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子（A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)株由来）のＰＣＲテンペレート（２７０塩基長、１０９コピー／μＬ）（上述）を１０倍階段希釈して、テンペレートの分子数を１０６コピー／μＬ〜１コピー／μＬの範囲に調製したＰＣＲテンペレートの希釈液を準備した。
これらの希釈液を用いて、Ｈ５亜型のＬＡＭＰ法の検出限界を調べた。ＬＡＭＰ法の増幅条件は、上記５と同様であるが、増幅時間は１２０分間とした。 6). Examination of sensitivity Insert artificially synthesized DNA (400 base length, 10 10 copies / μl) of H5 subtype HA gene fragment (derived from A / duck / Tsukuba / 9/2005 (H5N2) strain) which is the target of LAMP method The plasmid temperate was serially diluted 10 times to adjust the number of molecules of the temperate in the range of 10 6 copies / μL to 1 copy / μL to prepare a serial dilution of plasmid temperate.
It was also amplified by PCR, HA gene of H5 subtype PCR temperate of (A / duck / Tsukuba / 9 /2005 (H5N2) strain derived) (270 bases in length, 10 9 copies / [mu] L) (above) the 10-fold serial A diluted solution of PCR template was prepared by diluting and preparing the number of molecules of template in the range of 10 6 copies / μL to 1 copy / μL.
Using these dilutions, the detection limit of the H5 subtype LAMP method was examined. The amplification conditions of the LAMP method were the same as those in 5 above, but the amplification time was 120 minutes.

７．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響
鳥インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子のような多様な遺伝子を標的とした場合、プライマーと標的遺伝子の塩基配列の間には、多数の塩基ミスマッチが起こると考えられる。塩基ミスマッチ数はウイルス株によって大きく異なると推察され、その数が少なければ遺伝子は容易に増幅されるが、多ければ増幅は困難となる。しかし、実際にどの程度の塩基ミスマッチ数を許容できるのかについては解明されておらず、プライマー設計の指針を構築する際の障害となっていた。
本研究では、ＰＣＲテンペレートとして、A/w. swan/Akita/1/2008 (H5N1)のＨ５−ＨＡ遺伝子を用いて、上記２（２）で設定した６種類、８領域のプライマー領域について、人工的に０〜３個の塩基ミスマッチを導入した各種プライマーを設計した。それらのプライマーを組み合わせてＬＡＭＰ法を行うことによって、プライマー領域当たり何個の塩基ミスマッチまでなら遺伝子増幅が起こるのか、合計で何個の塩基ミスマッチ数なら遺伝子増幅はされるのか、塩基ミスマッチの影響を受けやすいプライマー領域はあるのか、などについて調べた。調べた組合せ（全部で４６セット）を図９に示し、使用したプライマーの塩基配列を図１０に示した。なお、ＬＡＭＰ法の増幅と判定は上記４と同様の方法で行った。 7). Effect of base mismatch on gene amplification When targeting various genes such as HA gene of avian influenza virus, it is considered that many base mismatches occur between the primer and the base sequence of the target gene. The number of base mismatches is presumed to vary greatly depending on the virus strain, and if the number is small, the gene is easily amplified, but if it is large, the amplification becomes difficult. However, the actual number of base mismatches that can be tolerated has not been elucidated, which has been an obstacle to the construction of primer design guidelines.
In this study, using the H5-HA gene of A / w. Swan / Akita / 1/2008 (H5N1) as the PCR template, the six types and eight regions of the primer region set in 2 (2) above were Various primers were artificially introduced with 0 to 3 base mismatches. By performing the LAMP method by combining these primers, the number of base mismatches per primer region can be amplified, and the total number of base mismatches can be amplified. We investigated whether there was a primer region that could be easily received. The investigated combinations (46 sets in total) are shown in FIG. 9, and the base sequences of the primers used are shown in FIG. Note that amplification and determination in the LAMP method were performed in the same manner as described above.

８．塩基ミスマッチ解析
８−１．塩基ミスマッチ数の算出方法
プライマーとして、ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーの領域にはＰプライマー（ＦＩＰ；配列番号１１５〜配列番号１１９、ＢＩＰ；配列番号１２２〜配列番号１２８）を用い、他の４つのプライマー領域（Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬ）にはＭプライマー（ＦＬ；配列番号１２１、ＢＬ；配列番号１３０、Ｆ３；配列番号１２０、Ｂ３；配列番号１２９）を用いて、塩基ミスマッチ解析をおこなった。
ＦＩＰプライマーに対して、プライマーデータベースに登録された２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数を算出する方法について説明する。
データベースにある２２１１個のＨＡ遺伝子の塩基配列のうち、ＦＩＰプライマーのＦ１とＦ２の２領域の塩基配列を取りだし、それらをＥｘｃｅｌ上で連結させ、一体の遺伝子としてデータベースを構築する。次に、上記２（２）の「Ｐプライマーの設計」で説明したように、あるＦＩＰプライマーとＨＡ遺伝子との間にある塩基ミスマッチ数を、全てのＨＡ遺伝子について求める。ただし、ＦＩＰプライマーは最終的に５本の短いＰプライマーが設計されているので、それぞれのプライマーに対して、全てのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数を算出することになる。具体的な例で説明する。
例えば、５本のＦＩＰ−Ｐプライマーのそれぞれに対して、あるＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数が（Ｆ１，Ｆ２，Ｆ１＋Ｆ２）の順番で表記したとして、１本目（０，１，１）、２本目（１，１，２）、３本目（０，０，０）、４本目（２，１，３）、５本目（２，３，５）となったと仮定する。この場合、塩基ミスマッチ数が最少となる３本目のプライマー（０，０，０）であり、これが遺伝子増幅に関係することから、本ＦＩＰ−Ｐプライマーセットに対するこのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数は（０，０，０）と算出される。
ＢＩＰ-Ｐプライマーの塩基ミスマッチについても、ＦＩＰ−Ｐプライマーの方法に準じて、全てのＨＡ遺伝子についてＢ１領域、Ｂ２領域、Ｂ１＋Ｂ２領域毎に塩基ミスマッチ数を、７本のＰプライマーのそれぞれについて求めた。その中で、最少となる塩基ミスマッチ数をそのＨＡ遺伝子の塩基ミスマッチ数として、全てのＨＡ遺伝子について算出した。
Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬのプライマー領域は、いずれも混合塩基を含むＭプライマーである。基本的にはＦＩＰプライマーと同様の方法で、各プライマーに対する塩基ミスマッチ数を全てのＨＡ遺伝子について算出した。その際に混合塩基の取扱いについては、以下の方法で行った。例えば、混合塩基Ｒは塩基Ａまたは塩基Ｇのいずれでも良いので、プライマーの配列が混合塩基Ｒの場合は、ＨＡ遺伝子の相当する位置の塩基配列は塩基Ａと塩基Ｇは合致するとし、それ以外の塩基（Ｃ，Ｔ）は塩基ミスマッチとして算出した。 8). Base mismatch analysis 8-1. Method of calculating the number of base mismatches As primers, P primers (FIP; SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119, BIP; SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128) are used in the FIP primer and BIP primer regions, and the other four primer regions Base mismatch analysis was performed using M primers (FL; SEQ ID NO: 121, BL; SEQ ID NO: 130, F3; SEQ ID NO: 120, B3; SEQ ID NO: 129) for (F3, B3, FL, BL).
A method for calculating the number of base mismatches of 2211 H5-HA genes registered in the primer database for FIP primers will be described.
From the 2211 HA gene base sequences in the database, the base sequences of the FIP primers F1 and F2 are extracted and linked on Excel to construct a database as an integrated gene. Next, as described in “Design of P primer” in 2 (2) above, the number of base mismatches between a certain FIP primer and the HA gene is determined for all the HA genes. However, since five short P primers are finally designed as FIP primers, the number of base mismatches of all HA genes is calculated for each primer. A specific example will be described.
For example, assuming that the number of base mismatches of a certain HA gene is expressed in the order of (F1, F2, F1 + F2) for each of five FIP-P primers, the first (0, 1, 1), second ( 1, 2, 3) (0, 0, 0), 4 (2, 1, 3), 5 (2, 3, 5). In this case, the third primer (0, 0, 0) that minimizes the number of base mismatches, which is related to gene amplification, the base mismatch number of this HA gene for this FIP-P primer set is (0 , 0, 0).
Regarding the base mismatch of the BIP-P primer, the number of base mismatches was determined for each of the seven P primers for each of the B1, B2, and B1 + B2 regions for all HA genes in accordance with the FIP-P primer method. . Among them, the minimum number of base mismatches was calculated for all HA genes as the number of base mismatches of the HA gene.
The primer regions of F3, B3, FL, and BL are all M primers containing mixed bases. Basically, the number of base mismatches for each primer was calculated for all HA genes by the same method as for FIP primers. At that time, the mixed base was handled by the following method. For example, the mixed base R may be either the base A or the base G. Therefore, when the primer sequence is the mixed base R, the base sequence at the corresponding position of the HA gene is assumed to match the base A and the base G. The base (C, T) was calculated as a base mismatch.

８−２．Ｈ５−ＨＡ遺伝子増幅の推定
塩基ミスマッチ数が算出されたプライマー領域が、その遺伝子の増幅を可能にするか否かの判定は、上記２（２）「Ｐプライマーの設計」の（ｉｉｉ）「増幅判定」の基準に従って行った。
ＢＩＰ-Ｐプライマーの増幅の可否は、上記２（２）「Ｐプライマーの設計」の（ｉｉｉ）「増幅判定」の基準にしたがって、ＢＩＰプライマー領域単独として判定した。
また、個々のプライマー領域にある塩基ミスマッチ解析だけでなく、８ヶ所のプライマー領域の合計塩基ミスマッチ数からも、遺伝子増幅の可否を判定した。これによって、今回開発したＰＭ１６プライマーを用いた場合について、２２１１株のＨＡ遺伝子毎に、８ヶ所のプライマー領域の塩基ミスマッチのパターンを明らかにした。
ＬＡＭＰ法による増幅の判定基準は、表３の成績を参考にして行った。即ち、プライマー領域当たりの最大塩基ミスマッチ数が２以下で、かつ合計ミスマッチ数が１０個以下のＨＡ遺伝子は増幅可能と判定した。 8-2. Estimation of H5-HA gene amplification Whether or not the primer region for which the number of base mismatches has been calculated enables amplification of the gene is determined by (iii) “ Amplification ” in 2 (2) “P primer design” above. The determination was made according to the criteria.
Whether or not the BIP-P primer can be amplified was determined as the BIP primer region alone according to the criteria of (iii) “ Amplification determination ” in 2 (2) “P primer design”.
Further, not only the base mismatch analysis in each primer region but also the possibility of gene amplification was determined from the total number of base mismatches in the eight primer regions. As a result, in the case of using the PM16 primer developed this time, the base mismatch pattern of the 8 primer regions was clarified for each HA gene of 2211 strains.
The criteria for amplification by the LAMP method were performed with reference to the results in Table 3. That is, it was determined that an HA gene having a maximum number of base mismatches per primer region of 2 or less and a total number of mismatches of 10 or less can be amplified.

結果
１．プライマー領域の設定
ユーラシア系統のＨ５−ＨＡ遺伝子に関し、A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨ５−ＨＡ遺伝子に対するＳプライマーは、ＨＡ（ヘマグルチニン）の開裂部位を跨ぐように設定した。Ｆ３、Ｆ２およびＦＬは、ＨＡ１領域に、Ｆ１、Ｂ１、ＢＬ、Ｂ２およびＢ３は、ＨＡ２領域に設定した。ＨＡ開裂部位を挟むように設定したのは、ＨＡ１領域がＨ５亜型に特異的であり、ＨＡ２領域が遺伝子間で保存性が高い領域であるからである。こうすることで、少ない本数のプライマーでＨ５亜型に属する全てのＨＡ遺伝子を検出できるようになった。なお、ＨＡ１領域は病原性、抗原性、多様性に関係する領域であり、ＨＡ２領域はウイルス外被に突き刺さったＨＡ２蛋白質で、ＨＡ１のスパイク蛋白質をウイルス粒子表面に提示する働きがある。
上記プライマーセットを用いて、プラスミドテンペレートに含まれるA/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨ５−ＨＡ遺伝子をＬＡＭＰ法で検出できるかを調べたところ、２０分で検出することができた。 Result 1. Setting of primer region With respect to the H5-HA gene of the Eurasian lineage, the S primer for the H5-HA gene of A / duck / Tsukuba / 9/2005 (H5N2) was set so as to straddle the cleavage site of HA (hemagglutinin). F3, F2 and FL were set in the HA1 region, and F1, B1, BL, B2 and B3 were set in the HA2 region. The reason why the HA cleavage site is sandwiched is that the HA1 region is specific to the H5 subtype and the HA2 region is a highly conserved region between genes. By doing so, it became possible to detect all HA genes belonging to the H5 subtype with a small number of primers. The HA1 region is a region related to pathogenicity, antigenicity, and diversity, and the HA2 region is an HA2 protein that has pierced the viral envelope and serves to present the HA1 spike protein on the surface of the virus particle.
Using the above primer set, whether the H5-HA gene of A / duck / Tsukuba / 9/2005 (H5N2) contained in the plasmid template can be detected by the LAMP method can be detected in 20 minutes. It was.

２．Ｐプライマーの有用性の検討
Ｓプライマーセットは、現在、報告されているＬＡＭＰ法用のプライマーとして利用されているプライマーと同等のものである。これを用いて、遺伝学的に多様性の高い１０株のＨ５−ＨＡ遺伝子の検出スペクトルを調べた。なお、テンペレートとしては、長いプライマーを用いたＰＣＲ法により合成したＰＣＲテンペレートを使用した（表１）。 2. Examination of usefulness of P primer The S primer set is equivalent to a primer currently used as a primer for the LAMP method that has been reported. Using this, the detection spectra of 10 genetically highly diverse H5-HA genes were examined. As a template, a PCR template synthesized by a PCR method using a long primer was used (Table 1).

その結果、Ｓプライマーを使用した場合は、１０株のＨＡ遺伝子のうち、４遺伝子しか検出することができなかった。Ｓプライマーセットは以下の通りである。
Ｓプライマーセット
ＦＩＰ；配列番号１４４
ＢＩＰ；配列番号１４５
ＦＬ ；配列番号１４６
ＢＬ ；配列番号１４７
Ｆ３ ；配列番号１４８
Ｂ３ ；配列番号１４９
また、Ｍプライマー（混合塩基を含むプライマー）は、多様性の高いＨ５亜型のＨＡ遺伝子を幅広くＰＣＲで検出するためには欠かせないプライマーであるが、ＬＡＭＰ法で使用した場合、どの程度有効であるかは不明であった。そこで、幅広く遺伝子を検出できるように、プライマーデータベースを参考にして、Ｓプライマーの設定領域と同じ領域にＭプライマーを設計し、その遺伝子検出率を調べた。その結果、ＰＣＲ法における有効性とは異なり、ＬＡＭＰ法においてＭプライマーを使用したとしても、１０のＨＡ遺伝子のうち、６遺伝子のみが検出できたに過ぎなかった。
このことから、ＭプライマーはＳプライマーセットより広い検出スペクトルを有するものの、多様な遺伝子を幅広く検出することはできなかった。
以上の結果から、ＬＡＭＰ法で多様なＨＡ遺伝子を幅広く検出するためには、新たなプライマーのセットが必要であることが明らかにされた。Ｍプライマーセットは以下の通りである。
Ｍプライマーセット
ＦＩＰ；配列番号１５０
ＢＩＰ；配列番号１５１
ＦＬ ；配列番号１５２
ＢＬ ；配列番号１５３
Ｆ３ ；配列番号１５４
Ｂ３ ；配列番号１５５ As a result, when S primer was used, only 4 genes could be detected among 10 HA genes. The S primer set is as follows.
S primer set FIP; SEQ ID NO: 144
BIP; SEQ ID NO: 145
FL; SEQ ID NO: 146
BL; SEQ ID NO: 147
F3; SEQ ID NO: 148
B3; SEQ ID NO: 149
The M primer (a primer containing mixed bases) is an indispensable primer for detecting a wide variety of H5 subtype HA genes by PCR, but how effective is it when used in the LAMP method It was unknown whether it was. Therefore, M primers were designed in the same region as the S primer set region with reference to the primer database so that genes can be detected widely, and the gene detection rate was examined. As a result, unlike the effectiveness in the PCR method, even when the M primer was used in the LAMP method, only 6 genes out of 10 HA genes could be detected.
Therefore, although the M primer has a broader detection spectrum than the S primer set, various genes could not be detected widely.
From the above results, it has been clarified that a new set of primers is necessary in order to widely detect various HA genes by the LAMP method. The M primer set is as follows.
M primer set FIP; SEQ ID NO: 150
BIP; SEQ ID NO: 151
FL; SEQ ID NO: 152
BL; SEQ ID NO: 153
F3; SEQ ID NO: 154
B3: SEQ ID NO: 155

そこで、発明者らは、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子を網羅的に検出するために、以下のＰプライマーセットを上述のプライマー設計方法に基づいて作製した。
基本的には、ＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーはＰプライマーであるが、その他のＦ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬプライマーは、混合塩基を含むプライマーとしても実施可能であった。このようにＰプライマーとＭプライマーを併用するプライマーセットは、ＰＭプライマーと称する。
（３）Ｐプライマーセット（ユーラシア系統用）
ＦＩＰ；配列番号１〜配列番号２０
ＢＩＰ；配列番号４６〜配列番号８２
ＦＬ ；配列番号３５〜配列番号４５
ＢＬ ；配列番号９３〜配列番号１１４
Ｆ３ ；配列番号２１〜配列番号３４
Ｂ３ ；配列番号８３〜配列番号９２
（４）ＰＭプライマーセット（ＰプライマーとＭプライマーを併用したプライマーセット）
（４）−１．ユーラシア系統用（「ＰＭ１６プライマーセット」）
ＦＩＰ；配列番号１１５〜配列番号１１９
ＢＩＰ；配列番号１２２〜配列番号１２８
ＦＬ ；配列番号１２１
ＢＬ ；配列番号１３０
Ｆ３ ；配列番号１２０
Ｂ３ ；配列番号１２９
（４）−２．アメリカ系統用
ＦＩＰ；配列番号１３１〜配列番号１３３
ＢＩＰ；配列番号１３４〜配列番号１３６
ＦＬ ；配列番号１３９〜配列番号１４１
ＢＬ ；配列番号１４３
Ｆ３ ；配列番号１３７〜配列番号１３８
Ｂ３ ；配列番号１４２
ユーラシア系統のＨ５亜型ＨＡ遺伝子に対する１１４本のプライマー（ＦＩＰ；配列番号１〜配列番号２０、ＢＩＰ；配列番号４６〜配列番号８２、ＦＬ；配列番号３５〜配列番号４５、ＢＬ；配列番号９３〜配列番号１１４、Ｆ３；配列番号２１〜配列番号３４、Ｂ３；配列番号８３〜配列番号９２）から構成されるＰプライマーセットを上述の方法により設計した。 Therefore, the inventors prepared the following P primer set based on the above-described primer design method in order to comprehensively detect the H5 subtype HA gene.
Basically, the FIP primer and the BIP primer are P primers, but the other F3, B3, FL, and BL primers can also be implemented as primers containing mixed bases. Thus, the primer set which uses P primer and M primer together is called PM primer.
(3) P primer set (for Eurasian line)
FIP; SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20
BIP; SEQ ID NO: 46-SEQ ID NO: 82
FL; SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45
BL; SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114
F3: SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34
B3: SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92
(4) PM primer set (primer set using both P primer and M primer)
(4) -1. For Eurasian systems ("PM16 primer set")
FIP; SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119
BIP; SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128
FL; SEQ ID NO: 121
BL; SEQ ID NO: 130
F3; SEQ ID NO: 120
B3: SEQ ID NO: 129
(4) -2. FIP for American systems; SEQ ID NO: 131 to SEQ ID NO: 133
BIP; SEQ ID NO: 134 to SEQ ID NO: 136
FL; SEQ ID NO: 139 to SEQ ID NO: 141
BL; SEQ ID NO: 143
F3; SEQ ID NO: 137 to SEQ ID NO: 138
B3; SEQ ID NO: 142
114 primers (HIP; SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20, BIP; SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 82, FL; SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45, BL; SEQ ID NO: 93 to the H5 subtype HA gene of the Eurasian strain A P primer set composed of SEQ ID NO: 114, F3; SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34, B3; SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92) was designed by the method described above.

１１４本のＰプライマーを用いてＬＡＭＰ法を行ってみたところ、驚くべきことに、１０種類のＨＡ遺伝子の全てが６０分以内に増幅されることが分かった（表１）。このことから、ＬＡＭＰ法で多様な遺伝子を幅広く検出するには、Ｐプライマーが必須であることが明らかになった。
しかし、Ｐプライマーの総数は１１４本と多いため、その数を減らすために、ＰプライマーをＭプライマーと置き換えることが可能かについて検討した。まず、Ｆ３およびＢ３のプライマーサイトをＭプライマーで置き換えたところ、プライマー数を８６本に減らすことができ、１０種類全てのＨＡ遺伝子が増幅できた。また、ＦＬおよびＢＬのプライマーサイトをＭプライマーで置き換えたところ、プライマー数を７６本に減らすことができ、１０種類全てのＨＡ遺伝子が増幅できた（表１）。さらに、４つの領域（Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬ）のＰプライマーをＭプライマーに置き換えた場合、プライマーの総数は５６本ともっとも減らすことができ、かつ１０種類全てのＨＡ遺伝子を増幅できた。他方、ＦＩＰおよびＢＩＰのプライマーをＭプライマーに置き換えると、１株ではあったが検出漏れが生じることが分かった（表１）。
以上の結果から、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬの領域にはＭプライマー、ＦＩＰとＢＩＰの領域にはＰプライマーを用いれば、検出スペクトルの広さとプライマー数の減少を兼ねた実用的なＬＡＭＰ法を構築できることが明らかになった。 When the LAMP method was performed using 114 P primers, it was surprisingly found that all 10 types of HA genes were amplified within 60 minutes (Table 1). From this, it became clear that the P primer is essential in order to detect a wide variety of genes by the LAMP method.
However, since the total number of P primers is as large as 114, it was examined whether the P primer could be replaced with an M primer in order to reduce the number. First, when the primer sites of F3 and B3 were replaced with M primers, the number of primers could be reduced to 86, and all 10 types of HA genes could be amplified. When the primer sites of FL and BL were replaced with M primers, the number of primers could be reduced to 76, and all 10 types of HA genes could be amplified (Table 1). Furthermore, when the P primers in the four regions (F3, B3, FL and BL) were replaced with M primers, the total number of primers could be reduced to 56, and all 10 types of HA genes could be amplified. On the other hand, when the FIP and BIP primers were replaced with M primers, it was found that the detection omission occurred although it was one strain (Table 1).
From the above results, if M primer is used for the F3, B3, FL and BL regions, and P primer is used for the FIP and BIP regions, a practical LAMP method that has both a broad detection spectrum and a reduced number of primers can be obtained. It became clear that it could be constructed.

３．ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの長さの検討
鳥インフルエンザウイルスの診断にＬＡＭＰ法を普及させるためには、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーの数をさらに少なくすることが望ましい。Ｐプライマーの設計を何度もやり直したが、プライマーの数を減らすことはできなかった。プライマーの本数が増える原因は、多様性がある領域を広くカバーしようとすることに起因していたので、プライマーの長さを短くして、多様性を確保することを検討した。その結果、１１４本のＰプライマーセット（「バージョン１」とする）のＦＩＰプライマーとＢＩＰプライマーは、各々、４０ベースと３６ベースであったが、ＦＩＰプライマーを３０ベース（配列番号１１５〜配列番号１１９）に、ＢＩＰプライマーを２８ベース（配列番号１２２〜１２８）に調製した結果、プライマーの総数を１６本にすることができた（バージョン２、ＦＩＰ；配列番号１１５〜配列番号１１９、ＢＩＰ；配列番号１２２〜配列番号１２８、ＦＬ；配列番号１２１、ＢＬ；配列番号１３０、Ｆ３；配列番号１２０、Ｂ３；配列番号１２９；「ＰＭ１６プライマーセット」）。
ＰＭ１６プライマーセットを用いて、前述の１０種類のＨ５−ＨＡ遺伝子に対する検出スペクトルを調べた。その結果、表２に示すように、１０種類のＨ５−ＨＡ遺伝子の全てを、ＰＭ１６プライマーセットで検出することができ、検出時間は平均４４分で、１１４本のＰプライマーを使用した場合の検出時間（平均４５分）と同等であった。 3. Examination of length of FIP and BIP primers In order to spread the LAMP method for the diagnosis of avian influenza virus, it is desirable to further reduce the number of FIP and BIP primers. The design of the P primer was repeated many times, but the number of primers could not be reduced. The cause of the increase in the number of primers was due to the fact that they were trying to cover a wide range of diverse regions. Therefore, it was examined to ensure the diversity by shortening the length of the primers. As a result, the FIP primer and BIP primer of 114 P primer sets (referred to as “version 1”) were 40 bases and 36 bases, respectively, but 30 bases (SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119). ), The BIP primer was prepared in 28 bases (SEQ ID NOs: 122 to 128). As a result, the total number of primers could be 16 (version 2, FIP; SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119, BIP; SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128, FL; SEQ ID NO: 121, BL; SEQ ID NO: 130, F3; SEQ ID NO: 120, B3; SEQ ID NO: 129; “PM16 primer set”).
Using the PM16 primer set, the detection spectra for the 10 types of H5-HA genes described above were examined. As a result, as shown in Table 2, all 10 types of H5-HA genes can be detected with the PM16 primer set, the average detection time is 44 minutes, and detection is performed when 114 P primers are used. It was equivalent to time (average 45 minutes).

バージョン２のＰＭ１６プライマーセットについて、プライマー濃度を２倍に濃くしたところ、検出時間は平均３５分で、バージョン１のＰプライマーセットを使用した場合の検出時間よりも約１０分に短縮された。この実験には、最近、アジアで流行しているH5N1亜型ウイルスのＨＡ遺伝子５株のＰＣＲテンペレートを追加した。表２に示すように、１５種類のユーラシア系統のＨ５−ＨＡ遺伝子は、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によって全て検出された。
以上の結果から、ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーをより短くし、使用濃度を濃くすると、プライマー数を顕著に減らせ、多様なインフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子を幅広く、迅速に検出することが可能になった。
When the primer concentration of the version 2 PM16 primer set was doubled, the average detection time was 35 minutes, which was about 10 minutes shorter than the detection time when the version 1 P primer set was used. In this experiment, PCR template of HA gene 5 strain of H5N1 subtype virus which is recently prevalent in Asia was added. As shown in Table 2, all 15 types of Eurasian H5-HA genes were detected by the LAMP method using PM16 primer set.
From the above results, when the FIP and BIP primers were made shorter and the concentration used was increased, the number of primers could be significantly reduced, and a wide variety of HA genes of various influenza viruses could be detected quickly.

４．参照株の塩基ミスマッチ解析
本実施例で使用した１５種のＰＣＲテンペレートのヌクレオチド配列と、ＰＭ１６プライマーセットのプライマーとの塩基ミスマッチ解析を行い、その結果を表３にまとめた。ＰプライマーのＦＩＰとＢＩＰは、塩基ミスマッチ数が２以下となるように設計したため、実際の塩基ミスマッチ数は、予想通り２以下であった。他方、混合塩基プライマーであるＦ３、Ｂ３、ＦＬおよびＢＬの領域では、塩基ミスマッチ数が０〜３であり、塩基ミスマッチは、Ｆ３およびＢ３プライマーの結合サイトに比較的多く存在していた。以上の結果から、プライマーの塩基配列とテンペレートとの塩基ミスマッチ数が、プライマー領域当たり１〜２個であれば、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の支障にはならないことが示唆された。
また、１株当たりの塩基ミスマッチ数０〜７個で、この範囲内であれば、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の障害にはならないことが示唆された。
4). Base mismatch analysis of reference strains Base mismatch analysis was performed between the nucleotide sequences of the 15 types of PCR templates used in this example and the primers of the PM16 primer set, and the results are summarized in Table 3. Since the P primers FIP and BIP were designed so that the number of base mismatches was 2 or less, the actual number of base mismatches was 2 or less as expected. On the other hand, in the region of F3, B3, FL and BL, which are mixed base primers, the number of base mismatches was 0 to 3, and there were relatively many base mismatches at the binding sites of F3 and B3 primers. From the above results, it was suggested that if the number of base mismatches between the base sequence of the primer and the temperate is 1 to 2 per primer region, it will not hinder gene amplification by the LAMP method.
Moreover, it was suggested that the number of base mismatches per strain was 0 to 7 and within this range, it would not hinder gene amplification by the LAMP method.

５．遺伝子増幅に及ぼす塩基ミスマッチの影響
プライマーの塩基配列とプライマーの結合領域との間の塩基ミスマッチ数が、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅にどの程度影響を及ぼすかは明らかにされていない。そこで、プライマーとテンペレートの間に塩基ミスマッチ生じるように作製したプライマー使用してＬＡＭＰ法を行い、遺伝子増幅がどう影響を受けるか調べた。実験では、テンペレートとして、A/w. swan/Akita/1/2008(H5N1) 由来のＨＡ遺伝子のＰＣＲテンペレートを用い、それぞれのプライマー領域には０〜３個の塩基ミスマッチを導入し、遺伝子が６０分以内に増幅されるか否かを調べた。調べたプライマーの組合せは図９に示したとおり、合計で４６通りに及んだ。また、用いたプライマー配列を図１０（図１０のプライマーIDが図９の「プライマーの組み合わせ」に表示されている）に示す。
その結果、表４に示すように、４６通り中４１通りにおいて、６０分以内にＨＡ遺伝子を増幅することができた。ミスマッチ数合計が１２個以内であれば、６０分以内にＨＡ遺伝子を検出することが可能であった。ただし、この場合であっても、プライマー領域当たりの塩基ミスマッチ数は２個以内であることが確認された。６０分以内にＨＡ遺伝子を増幅できなかった５個のＨＡ遺伝子について、塩基ミスマッチ数の合計が１４〜１６個の範囲では、ＨＡ遺伝子の増幅に７５分を要し、１６個以上、あるいはプライマー領域当たり３個の塩基ミスマッチがあると、遺伝子増幅は困難であった。
これらの結果から、プライマー当たりの塩基ミスマッチ数が２個以内で、８領域の塩基ミスマッチ数の合計が１０個以内であれば、ＬＡＭＰ法によりＨＡ遺伝子を増幅できることが明らかになった。また、多様なＨ５亜型のＨＡ遺伝子をＬＡＭＰ法で幅広く検出するには、ＰＭ１６プライマーセットは必須であることが明らかになった。
5. Effect of base mismatch on gene amplification It has not been clarified how much the number of base mismatches between the base sequence of a primer and the primer binding region affects gene amplification by the LAMP method. Therefore, the LAMP method was performed using a primer prepared so that a base mismatch occurred between the primer and the temperate, and the influence of gene amplification was examined. In the experiment, A / w. Swan / Akita / 1/2008 (H5N1) -derived HA gene PCR template was used as a template, and 0 to 3 nucleotide mismatches were introduced into each primer region. Was amplified within 60 minutes. As shown in FIG. 9, the total number of primer combinations examined was 46. In addition, the primer sequences used are shown in FIG. 10 (the primer ID of FIG. 10 is displayed in “primer combination” of FIG. 9).
As a result, as shown in Table 4, the HA gene could be amplified within 60 minutes in 41 out of 46. If the total number of mismatches was 12 or less, the HA gene could be detected within 60 minutes. However, even in this case, it was confirmed that the number of base mismatches per primer region was 2 or less. For the 5 HA genes that could not be amplified within 60 minutes, if the total number of base mismatches is in the range of 14 to 16, it takes 75 minutes to amplify the HA gene, 16 or more, or the primer region If there were 3 base mismatches per gene, gene amplification was difficult.
From these results, it was revealed that the HA gene can be amplified by the LAMP method when the number of base mismatches per primer is 2 or less and the total number of base mismatches in 8 regions is 10 or less. In addition, it was revealed that the PM16 primer set is essential for widely detecting various H5 subtype HA genes by the LAMP method.

６．GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子の増幅推定
表４の塩基ミスマッチ解析の成績から、本実施例で開発したＰＭ１６プライマーセットは、多様な遺伝子を幅広く検出できる可能性が示唆された。そこで、GenBankに登録されている２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子（ユーラシア系統）を用いて、ＰＭ１６プライマーセットを用いた場合のＬＡＭＰ法の遺伝子検出率の推定を行った。個々のＨＡ遺伝子の増幅は、ＰＭ１６プライマーセットと個々のＨＡ遺伝子との塩基ミスマッチ数を基に推定した。
塩基ミスマッチ数は、ＦＩＰ領域（Ｆ１＋Ｆ２）、ＢＩＰ領域（Ｂ１＋Ｂ２）、他の４領域（Ｆ３，Ｂ３，ＦＬ，ＢＬ）の３つに分けて、グループ毎に塩基ミスマッチとＨＡ遺伝子数を調べ、表５にまとめた。
6). Amplification estimation of 2211 H5-HA genes registered in GenBank The results of the base mismatch analysis in Table 4 suggested that the PM16 primer set developed in this example could detect a wide variety of genes. . Therefore, the LAMP method gene detection rate was estimated using the PM16 primer set using 2211 H5-HA genes (Eurasian lineage) registered in GenBank. Amplification of each HA gene was estimated based on the number of base mismatches between the PM16 primer set and each HA gene.
The number of base mismatches is divided into three parts: FIP region (F1 + F2), BIP region (B1 + B2), and other 4 regions (F3, B3, FL, BL). It was summarized in 5.

ＦＩＰプライマー領域に関して、ＨＡ遺伝子の９５％（２０１７遺伝子）が、ＢＩＰプライマー領域に関しては９７％（２１４４遺伝子）が、塩基ミスマッチが０または１個であった。表４の成績から、これらの塩基ミスマッチは遺伝子増幅の障害にはならないと考えられるため、これらの遺伝子は増幅可能と判定された。
表４の結果から、ＦＩＰプラマーおよびＢＩＰプライマーの塩基ミスマッチ数が３個であっても、Ｆ１領域とＦ２領域のいずれか、Ｂ１領域とＢ２領域のいずれかに偏ってなければ、増幅可能と判断することができた。
一方、表５から、ＦＩＰまたはＢＩＰのプライマー領域に２個または３個以上の塩基ミスマッチを持つＨＡ遺伝子は、ＦＩＰ領域でそれぞれ１００個、４個、ＢＩＰ領域では６２個、５個、他の４領域では４個、４個であった。これらのＨＡ遺伝子については、１つのプライマー領域にある塩基ミスマッチ数だけでなく、他のプライマー領域にある塩基ミスマッチの影響を強く受ける可能性が高い。そこでこれらについては、全てのプライマー領域（Ｆ１、Ｂ１、Ｆ２、Ｂ２、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬの８サイト）の塩基ミスマッチパターンから、遺伝子増幅の可否を判定した。 Regarding the FIP primer region, 95% (2017 gene) of the HA gene and 97% (2144 gene) of the BIP primer region had 0 or 1 base mismatch. From the results in Table 4, since these base mismatches are not considered to interfere with gene amplification, it was determined that these genes can be amplified.
From the results of Table 4, even if the number of base mismatches of the FIP plummer and BIP primer is 3, if it is not biased to either the F1 region or the F2 region, or to either the B1 region or the B2 region, it can be determined that amplification is possible. We were able to.
On the other hand, from Table 5, 100 or 4 HA genes having 2 or 3 or more base mismatches in the FIP or BIP primer region, 62 in the BIP region, 5 in the BIP region, and the other 4 genes, respectively. There were 4 and 4 in the area. These HA genes are highly likely to be strongly influenced not only by the number of base mismatches in one primer region but also by base mismatches in other primer regions. Thus, for these, the possibility of gene amplification was determined from the base mismatch pattern of all primer regions (F1, B1, F2, B2, F3, B3, FL, and BL sites).

表６には、８つのプライマー領域の塩基ミスマッチパターンに基づいて、遺伝子増幅を判定することになった２３個のＨＡ遺伝子とその塩基ミスマッチパターンを示した。同一遺伝子が複数のプライマー領域で抽出された場合は一方にまとめた。
これらについて、表４の基準にしたがって遺伝子増幅を推定したところ、増幅困難と判定された遺伝子は、A/duck/Taiwan/DV30-2/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子（CY110933）とA/chicken/Egypt/34-2/2008(H5N1) のＨＡ遺伝子（CY062604）だけであった。それら以外の２１個のＨＡ遺伝子は、合計の塩基ミスマッチ数は２〜７個で、プライマー領域にある塩基ミスマッチの偏りもなかった。なお、A/duck/Tsukuba/168/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子は、表２で実際に増幅できた遺伝子であり、これと同等の塩基ミスマッチパターンを持つ、A/duck/Korea/GJ54/2004(H5N2)由来のＨＡ遺伝子も増幅可能と判定された。
これらの成績から、GenBankに登録されているＥＵ系統の２２１１個のＨ５−ＨＡ遺伝子のうち、２２０９個のＨＡ遺伝子は、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法で増幅可能と判定された。
Table 6 shows 23 HA genes whose base amplifications were determined based on the base mismatch patterns of the eight primer regions and their base mismatch patterns. When the same gene was extracted in a plurality of primer regions, they were collected in one.
When gene amplification was estimated according to the criteria in Table 4, the genes that were determined to be difficult to amplify were the A / duck / Taiwan / DV30-2 / 2005 (H5N2) HA gene (CY110933) and A / chicken / Only the HA gene (CY062604) of Egypt / 34-2 / 2008 (H5N1). For the other 21 HA genes, the total number of base mismatches was 2 to 7, and there was no bias of base mismatches in the primer region. The HA gene of A / duck / Tsukuba / 168/2005 (H5N2) is the gene that was actually amplified in Table 2 and has a base mismatch pattern equivalent to this, A / duck / Korea / GJ54 / 2004 It was determined that the HA gene derived from (H5N2) can also be amplified.
From these results, it was determined that 2209 HA genes among the 2211 H5-HA genes of EU strains registered in GenBank can be amplified by the LAMP method using PM16 primer set.

７．本実施例のプライマーを使用したＬＡＭＰ法の反応特異性
本実施例のプライマー（ＰＭ１６プライマーセット）を使用したＨ５亜型のＬＡＭＰ法の反応特異性について、Ｈ１〜Ｈ１２亜型の鳥インフルエンザウイルス遺伝子、ＮＤＶ（Ｂ１株）およびＩＢＶ（Ｈ１２０株）を用いて検討した。
その結果、ＰＭ１６プライマーセットを使用したＨ５亜型のＬＡＭＰ法では、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子のみが検出され、他のＨＡ亜型及び鶏病ウイルスは検出されなかった。なお、コントロール実験として行ったリアルタイムＰＣＲによっても、Ｈ５亜型のテンペレートのみが検出された。
この結果から、本実施例のプライマーを使用したＬＡＭＰ法は、Ｈ５亜型のＨＡ遺伝子を特異的に検出することが確認できた。 7). Reaction Specificity of LAMP Method Using Primer of This Example Regarding the reaction specificity of LAMP method of H5 subtype using the primer (PM16 primer set) of this example, avian influenza virus gene of H1 to H12 subtype, Examination was performed using NDV (B1 strain) and IBV (H120 strain).
As a result, in the H5 subtype LAMP method using the PM16 primer set, only the H5 subtype HA gene was detected, and other HA subtypes and chicken disease virus were not detected. Only the H5 subtype template was detected by real-time PCR performed as a control experiment.
From this result, it was confirmed that the LAMP method using the primer of this example specifically detected the H5 subtype HA gene.

８．ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法の検出感度
A/duck/Tsukuba/9/2005(H5N2)のＨＡ遺伝子に由来するＰＣＲテンペレートを希釈して、１ウエル当たりの分子数として１０６〜１となるようにして調整した。これをテンペレートにしてＬＡＭＰ法の検出感度を調べた。６０℃、６０分間の培養後、増幅を確認したところ、プラスミドテンペレートとＰＣＲテンペレートのいずれにおいても、検出限界は１ウエル当たり１，０００分子であった。また、A/whooper swan/Akita/1/2008 (H5N1)のＰＣＲテンペレートを用いた場合の検出限界も同様であった。
これらの結果から、本発明に係るＰＭ１６プライマーセットを使用したＬＡＭＰ法の感度は、Ｈ５−ＨＡ遺伝子を臨床サンプルからウイルス遺伝子を直接検出するのに十分に高感度であることが確認できた。 8). Detection sensitivity of LAMP method using PM16 primer set
A PCR template derived from the HA gene of A / duck / Tsukuba / 9/2005 (H5N2) was diluted and adjusted so that the number of molecules per well was 10 6 to 1. Using this as a template, the detection sensitivity of the LAMP method was examined. Amplification was confirmed after culturing at 60 ° C. for 60 minutes. As a result, the detection limit was 1,000 molecules per well in both the plasmid template and the PCR template. The detection limit was also the same when the PCR template of A / whooper swan / Akita / 1/2008 (H5N1) was used.
From these results, it was confirmed that the sensitivity of the LAMP method using the PM16 primer set according to the present invention was sufficiently sensitive to directly detect the viral gene from the clinical sample of the H5-HA gene.

また、ユーラシア系統用の「ＰＭ１６プライマーセット」は、ユーラシア系統のＨ５亜型ＨＡ遺伝子を広く検出できたことから、アメリカ系統のＨ５亜型-ＨＡ遺伝子をどの程度、検出可能かについて検討した。
アメリカ系統のＨ５−ＨＡ遺伝子３８６個の塩基配列を”Influenza Virus Resource”からダウンロードし、アメリカ系統Ｈ５プライマーデータベースを作製した。このデータベースを使用して、ＰＭ１６プライマーセットによる検出の可否を調べた。以下の判定基準（表７）を満たすＨＡ遺伝子は検出可能と判定した。 In addition, since the “PM16 primer set” for the Eurasian line was able to widely detect the H5 subtype HA gene of the Eurasian lineage, the extent to which the H5 subtype-HA gene of the American line could be detected was examined.
The base sequence of 386 H5-HA genes of the American strain was downloaded from “Influenza Virus Resource” to create an American strain H5 primer database. Using this database, the possibility of detection by PM16 primer set was examined. It was determined that an HA gene satisfying the following criteria (Table 7) can be detected.

その結果、３５３個のアメリカ系統のＨ５−ＨＡ遺伝子は検出できると判断された。残りの３３個のＨＡ遺伝子は８領域全ての塩基ミスマッチパターンを調べ、表８にまとめた。Ｆ１、Ｂ１またはＢ２の領域に３個の塩基ミスマッチを４個持つ遺伝子（１，５，６，９）が認められた。このうち２個は同一パターン（５，６）だったので、３個の遺伝子についてＰＣＲテンペレートを合成し、ＰＭ１６プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法による遺伝子増幅の可否を調べた。その結果、３個の遺伝子（１，５，９）は何れも増幅された。また残りの遺伝子は、ＢＩＰに４個の塩基ミスマッチを持つ３個の遺伝子と、Ｆ３、Ｂ３、ＦＬ、ＢＬのいずれかに２個の塩基ミスマッチを持つ６個の遺伝子（表８）であることが解った。表４の成績を参考にして、これら9遺伝子の検出の可否を推定した。その結果、これらの９遺伝子は全て増幅可能と判定された。以上の結果から、ＰＭ１６プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法によって、アメリカ系統のＨ５−ＨＡ遺伝子（３８６個株）は全て増幅可能と判定された。
 As a result, it was judged that 353 American H5-HA genes could be detected. The remaining 33 HA genes were examined for base mismatch patterns in all 8 regions and summarized in Table 8. Genes (1, 5, 6, 9) having 4 3 base mismatches in the F1, B1, or B2 region were observed. Since two of them had the same pattern (5, 6), PCR templates were synthesized for three genes, and the possibility of gene amplification by the LAMP method was examined using the PM16 primer set. As a result, all three genes (1, 5, 9) were amplified. The remaining genes are 3 genes with 4 base mismatches in BIP and 6 genes with 2 base mismatches in any of F3, B3, FL and BL (Table 8). I understand. With reference to the results in Table 4, the possibility of detection of these 9 genes was estimated. As a result, it was determined that all these 9 genes could be amplified. From the above results, it was determined that all H5-HA genes of the American strain (386 strains) could be amplified by the LAMP method using the PM16 primer set.

また、上記１３個のＨＡ遺伝子を確実に検出するために、これらに特化したＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーを設計した。
ＦＩＰプライマー：GCAAGRACCAGTTTATGTTCATCCTCTTAC（配列番号１５６）
ＢＩＰプライマー：GGACTAAGAAACCCTTCTATRAATCCTGC（配列番号１５７）
これらのプライマーをＰＭ１６プライマーセットに加えた、ＰＭ１８プライマーセットは、上記１３個のＨＡ遺伝子に対して塩基ミスマッチ数が少ないことから、アメリカ系統のＨＡ遺伝子をより確実に増幅可能と期待される。
以上の結果から、ＰＭ１８プライマーセットを用いたＬＡＭＰ法は、ＨＡ亜型のユーラシア系統およびアメリカ系統のＨ５−ＨＡ遺伝子を確実に検出できると判定された。 In addition, in order to reliably detect the 13 HA genes, FIP primers and BIP primers specialized for these genes were designed.
FIP primer: GCAAGRACCAGTTTATGTTCATCCTCTTAC (SEQ ID NO: 156)
BIP primer: GGACTAAGAAACCCTTCTATRAATCCTGC (SEQ ID NO: 157)
The PM18 primer set obtained by adding these primers to the PM16 primer set has a small number of base mismatches with respect to the 13 HA genes described above, and therefore, it is expected that the HA gene of the American strain can be amplified more reliably.
From the above results, it was determined that the LAMP method using the PM18 primer set can reliably detect the H5-HA gene of HA subtype Eurasian strain and American strain.

本発明は、インフルエンザウイルスの多様なＨＡまたはＮＡ遺伝子を幅広く検出し、ＨＡ及びＮＡ亜型を判定する、精度の高いＬＡＭＰ法用プライマーおよび判定方法に関するものである。本方法は従来法と比較すると、標的遺伝子の検出漏れを顕著に改善し、ＨＡまたはＮＡの遺伝子を亜型特異的且つ網羅的に検出することを可能にしたもので、迅速、簡便なＬＡＭＰ法の実用性を著しく向上させることができる。本法は、変異し易く、多様な病原体によって引き起こされる感染症に対する遺伝子診断法の信頼度を高める技術として、その活用が多いに期待されるものである。   The present invention relates to a highly accurate primer for LAMP and a determination method for detecting various HA or NA genes of influenza virus widely and determining HA and NA subtypes. Compared with the conventional method, this method significantly improves the detection omission of the target gene and enables subtype-specific and comprehensive detection of HA or NA genes. Can be significantly improved. This method is expected to be widely used as a technique that is easy to mutate and increases the reliability of the genetic diagnosis method for infectious diseases caused by various pathogens.

Claims (28)

病原体の型または亜型判定用オリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるフォワードプライマー設定領域のコンセンサス配列からなるフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｂ）フォワードプライマー設定領域について、コンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のフォワードプライマー領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列の中で、コンセンサス配列の塩基とは異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出された検査対象遺伝子のフォワードプライマー設定領域の塩基配列同士を再度アライメントし、その設定領域について新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、 An oligonucleotide primer for pathogen type or subtype determination, comprising the following steps (a) to (f) and comprising a consensus sequence of a forward primer setting region determined in steps (b) and (e) A set of forward primers.
(A) Sense sequences or antisense sequences of genes to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and a region having high homology between the genes to be tested is a forward primer setting region Process to choose as,
(B) a step of determining a consensus sequence for the forward primer setting region;
(C) Comparing the consensus sequence with the bases corresponding to the base sequence of the forward primer region of each test target gene, and among the base sequences of the forward primer setting region of the test target gene, what is the base of the consensus sequence? Counting the number of different bases for each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the forward primer setting region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence for the setting region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted; 前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項１に記載のフォワードプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をフォワードプライマー設定領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、 The forward primer set according to claim 1, wherein the step (a) and / or the step (d) is the following step.
(A) Sense sequences or antisense sequences of the gene to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are the same. Single base X and / or a mixed base composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C at 80% or more of the bases corresponding to each sequence Selecting a continuous base sequence region containing Y and having a single base X and / or mixed base Y occupying 90% or more as a forward primer setting region;
(D) a step of extracting a test target gene whose number of bases counted in the step (c) is 3 or more, 病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項１または２に記載のフォワードプライマーの塩基配列の相補配列からなるリバースプライマーのセット。   A set of reverse primers, which are oligonucleotide primers for pathogen type or subtype determination, comprising a complementary sequence of the base sequence of the forward primer according to claim 1 or 2. 病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｇ）の工程を行い、工程（ｃ）および（ｆ）で決定されるＦ２領域およびＦ１領域のコンセンサス配列のペアを選択し、Ｆ２領域の塩基配列を３’末端側に、Ｆ１領域の塩基配列の相補的配列を５’末端側に有する塩基配列からなるＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で高い相同性を有する領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｂ）工程（ａ）で選択されるＦ２領域の３’末端より３’側下流に存在する領域であって、前記Ｆ２領域と同じ要件を満たす領域をＦ１領域として選択する工程、
（ｃ）各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域のコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｄ）Ｆ１領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士およびＦ２領域のコンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ２領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子のＦ１領域およびＦ２領域の塩基配列に含まれる各領域のコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｅ）工程（ｄ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｆ）工程（ｅ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ１領域の塩基配列同士およびＦ２領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ１領域の塩基配列およびＦ２領域の塩基配列の中から、各々の領域の新たなコンセンサス配列を決定しペアとして選択する工程、
（ｇ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）を繰り返す工程、 An oligonucleotide primer for performing pathogen type or subtype determination by the LAMP method, wherein the following steps (a) to (g) are performed, and the F2 region determined in steps (c) and (f) And a pair of FIP region consensus sequences, and a FIP primer set comprising a base sequence having a base sequence of the F2 region on the 3 ′ end side and a complementary sequence of the base sequence of the F1 region on the 5 ′ end side.
(A) A step of aligning sense sequences or antisense sequences of a gene to be examined, comparing bases at corresponding positions between the sequences, and selecting a region having high homology between the sequences as the F2 region ,
(B) a step of selecting a region that exists 3 ′ downstream from the 3 ′ end of the F2 region selected in step (a) and that satisfies the same requirements as the F2 region as the F1 region;
(C) The base sequences of the F1 region and the base sequence of the F2 region of each gene to be examined are aligned, and the consensus sequence of each region is determined from the aligned base sequence of the F1 region and the base sequence of the F2 region Selecting as a pair,
(D) The consensus sequence of the F1 region and the bases at positions corresponding to the base sequence of the F1 region of each test target gene, and the bases at the positions corresponding to the consensus sequence of the F2 region and the base sequence of the F2 region of each test target gene A step of counting the number of bases different from the bases of the consensus sequences of each region included in the base sequences of the F1 region and F2 region of each test target gene for each test target gene,
(E) extracting a test target gene whose base number counted in step (d) is a certain number or more,
(F) The F1 region base sequences and F2 region base sequences of the gene to be examined extracted in step (e) are realigned, and the aligned F1 region base sequences and F2 region base sequences are respectively Determining a new consensus sequence for the region of and selecting as a pair;
(G) repeating the steps (d), (e) and (f) until there are no genes to be tested to be extracted; 病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記工程（ａ）および／または工程（ｅ）が下記の工程であることを特徴とする請求項４に記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列同士またはアンチセンス配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙから構成される連続する塩基配列領域をＦ２領域として選択する工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）でカウントされた塩基数が４以上である検査対象遺伝子、および、カウントされた塩基の数が３であってコンセンサス配列の塩基と異なる塩基がＦ１領域またはＦ２領域のいずれかに偏っている検査対象遺伝子を抽出する工程、 The oligonucleotide primer for pathogen type or subtype determination, wherein the step (a) and / or the step (e) are the following steps.
(A) Sense sequences or antisense sequences of the gene to be tested are aligned, bases at corresponding positions between the sequences are compared, and 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are the same. Single base X and / or a mixed base composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C at 80% or more of the bases corresponding to each sequence Selecting a continuous base sequence region composed of Y as the F2 region;
(E) a test target gene having 4 or more bases counted in the step (d), and a base having a counted number of 3 different from the base of the consensus sequence is in the F1 region or the F2 region A process of extracting a test target gene biased to one of the following: 前記Ｆ１領域の５’末端の塩基とＦ２領域の５’末端の塩基との間に、４０塩基〜６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ１領域およびＦ２領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする請求項４または５に記載のＦＩＰプライマーのセット。   There are 40 to 60 bases between the 5 ′ terminal base of the F1 region and the 5 ′ terminal base of the F2 region, and / or the base number of the F1 region and F2 region is 10 bases to 25 The set of FIP primers according to claim 4 or 5, which is a base. 前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項４ないし６のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号１〜配列番号２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１１５〜配列番号１１９および配列番号１５６で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３１〜配列番号１３３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、 The FIP according to any one of claims 4 to 6, wherein the subtype is an influenza A virus H5 subtype and is any primer set shown in the following (a) to (c): A set of primers.
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 20,
(B) a set consisting of a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 115 to SEQ ID NO: 119 and SEQ ID NO: 156, or (c) a base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 131 to SEQ ID NO: 133 A set of primers, 病原体の型または亜型判定用のオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項４ないし６のいずれかに記載のＦＩＰプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＩＰプライマーのセット。   A set of BIP primers, which are oligonucleotide primers for pathogen type or subtype determination, comprising a complementary sequence of the base sequence of the FIP primer according to any one of claims 4 to 6. 前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項８に記載のＢＩＰプライマーのセット。
（ａ）配列番号４６〜配列番号８２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２２〜配列番号１２８および配列番号１５７で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３４〜配列番号１３６で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、 9. The BIP primer set according to claim 8, wherein the subtype is an influenza A virus H5 subtype, and is any of the primer sets shown in the following (a) to (c).
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 to SEQ ID NO: 82,
(B) a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 122 to SEQ ID NO: 128 and SEQ ID NO: 157, or (c) a base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 134 to SEQ ID NO: 136 A set of primers, 病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦ３領域のコンセンサス配列からなるＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項４または請求項５に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦ３領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦ３領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、 An oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen by the LAMP method, wherein the following steps (a) to (f) are performed, and the F3 region determined in steps (b) and (e) A set of F3 primers consisting of the consensus sequence.
(A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein the base sequences existing 5 ′ upstream of the F2 region according to claim 4 or 5 are aligned, and each sequence corresponds to each other. A step of comparing bases at positions and selecting a region having high homology between the genes to be examined as an F3 region,
(B) aligning the base sequences of the F3 region of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned F3 region;
(C) The consensus sequence is compared with the bases corresponding to the base sequence of the F3 region of each test target gene, and the number of bases different from the base of the consensus sequence included in the base sequence of the F3 region of the test target gene is calculated. , The process of counting for each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the F3 region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned F3 region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted; 前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項１０に記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項４または請求項５に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、 The set of F3 primers according to claim 10, wherein the step (a) and / or the step (d) are the following steps.
(A) A sense sequence or an antisense sequence of a gene to be examined, wherein the base sequences existing 5 ′ upstream of the F2 region according to claim 4 or 5 are aligned, and each sequence corresponds to each other. The bases at positions are compared, and a single base X in which 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same and / or 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are A, T , G, and C, including a mixed base Y composed of any two or three kinds of bases, and a single base X and / or a continuous base sequence region in which the mixed base Y accounts for 90% or more Selecting as the F3 region,
(D) a step of extracting a test target gene whose number of bases counted in the step (c) is 3 or more, 病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、請求項４または請求項５に記載のＦ２領域の５’側上流に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦ３プライマーのセット。   An oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen by the LAMP method, which is 5 ′ of the F2 region according to claim 4 or 5 of the sense sequence or antisense sequence of the gene to be tested Aligning base sequences existing upstream, comparing bases at corresponding positions between the sequences, a single base X in which 80% or more of bases at corresponding positions between the sequences are the same, and / or 80% or more of bases at corresponding positions between sequences include a mixed base Y composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C, and a single base X And / or a continuous base sequence region in which the mixed base Y accounts for 90% or more is selected as the F3 region, and is designed to cover the base sequences of the F3 region of all the genes to be tested. Set of F3 primer consisting of a case-base primer. 前記Ｆ３領域の３’末端の塩基と前記Ｆ２領域の５’末端の塩基との間に０〜６０塩基が存在し、および／または、前記Ｆ３領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする請求項１０ないし請求項１２のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。   0 to 60 bases exist between the base at the 3 ′ end of the F3 region and the base at the 5 ′ end of the F2 region, and / or the number of bases in the F3 region is 10 to 25 bases The set of F3 primers according to any one of claims 10 to 12, wherein 前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項１０ないし１３のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号２１〜配列番号３４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３７〜配列番号１３８で表される塩基配列のプライマーからなるセット、 The F3 primer according to any one of claims 10 to 13, wherein the subtype is influenza A virus type H5, and is any primer set shown in the following (a) to (c): Set.
(A) a set comprising primers of the base sequences represented by SEQ ID NO: 21 to SEQ ID NO: 34,
(B) a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 120, or (c) a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 137 to SEQ ID NO: 138, 病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、請求項１０ないし１３のいずれかに記載のＦ３プライマーの塩基配列の相補配列からなるＢ３プライマーのセット。   A set of B3 primers, which are oligonucleotide primers for determining the type or subtype of a pathogen by the LAMP method and comprising a complementary sequence of the base sequence of the F3 primer according to any one of claims 10 to 13. 前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項１５に記載のＢ３プライマーのセット。
（ａ）配列番号８３〜配列番号９２で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２９で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４２で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、 The set of B3 primers according to claim 15, wherein the subtype is influenza A virus H5 subtype, and is any primer set shown in the following (a) to (c).
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 83 to SEQ ID NO: 92;
(B) a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 129, or (c) a set comprising a primer of the base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 142, 病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、以下の（ａ）〜（ｆ）の工程を行い、工程（ｂ）および（ｅ）で決定されるＦＬ領域のコンセンサス配列からなるＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項４または請求項５に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各検査対象遺伝子間で高い相同性を有する領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｂ）各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士をアライメントし、アライメントしたＦＬ領域のコンセンサス配列を決定する工程、
（ｃ）該コンセンサス配列と各検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列の対応する位置の塩基同士を比較し、検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列に含まれるコンセンサス配列の塩基と異なる塩基の数を、検査対象遺伝子毎にカウントする工程、
（ｄ）工程（ｃ）でカウントされた塩基数が一定数以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）で抽出した検査対象遺伝子のＦＬ領域の塩基配列同士を再度アライメントし、アライメントしたＦＬ領域の新たなコンセンサス配列を決定する工程、
（ｆ）抽出される検査対象遺伝子がなくなるまで工程（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を繰り返す工程、 An oligonucleotide primer for performing pathogen type or subtype determination by the LAMP method, wherein the following steps (a) to (f) are performed, and the FL region determined in steps (b) and (e) A set of FL primers consisting of a consensus sequence.
(A) Sense sequence or antisense sequence of a gene to be examined, wherein the base sequences existing between the F1 region and the F2 region according to claim 4 or 5 are aligned, and each sequence corresponds to each other A step of comparing bases at positions and selecting a region having high homology between the genes to be examined as an FL region,
(B) aligning the base sequences of the FL region of each gene to be examined, and determining a consensus sequence of the aligned FL region;
(C) The consensus sequence is compared with the bases at the corresponding positions in the base sequence of the FL region of each test target gene, and the number of bases different from the bases of the consensus sequence included in the base sequence of the FL region of the test target gene is calculated. , The process of counting for each gene to be tested,
(D) extracting the test target gene whose base number counted in step (c) is a certain number or more,
(E) re-aligning the base sequences of the FL region of the gene to be examined extracted in step (d), and determining a new consensus sequence of the aligned FL region;
(F) repeating steps (c), (d) and (e) until there are no genes to be extracted to be extracted; 前記工程（ａ）および／または工程（ｄ）が下記の工程であることを特徴とする請求項１７に記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列であって、請求項４または請求項５に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列同士をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦＬ領域として選択する工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）でカウントされた塩基数が３以上である検査対象遺伝子を抽出する工程、 The set of FL primers according to claim 17, wherein the step (a) and / or the step (d) are the following steps.
(A) Sense sequence or antisense sequence of a gene to be examined, wherein the base sequences existing between the F1 region and the F2 region according to claim 4 or 5 are aligned, and each sequence corresponds to each other The bases at positions are compared, and a single base X in which 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same and / or 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are A, T , G, and C, including a mixed base Y composed of any two or three kinds of bases, and a single base X and / or a continuous base sequence region in which the mixed base Y accounts for 90% or more Selecting as the FL region,
(D) a step of extracting a test target gene whose number of bases counted in the step (c) is 3 or more, 病原体の型または亜型の判定をＬＡＭＰ法で行うためのオリゴヌクレオチドプライマーであって、検査対象遺伝子のセンス配列またはアンチセンス配列の、請求項４または請求項５に記載のＦ１領域とＦ２領域の間に存在する塩基配列をアライメントし、各配列間で対応する位置の塩基同士を比較し、各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上が同一である単一塩基Ｘ、および／または各配列間で対応する位置の塩基の８０％以上がＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの中から選択されるいずれか２種類または３種類の塩基で構成される混合塩基Ｙを含み、単一塩基Ｘおよび／または混合塩基Ｙが９０％以上を占める連続する塩基配列領域をＦ３領域として選択し、全ての検査対象遺伝子のＦ３領域の塩基配列を網羅するように設計した、単一または複数の混合塩基プライマーからなるＦＬプライマーのセット。   An oligonucleotide primer for determining the type or subtype of a pathogen by the LAMP method, wherein the F1 region and the F2 region of the sense sequence or the antisense sequence of the gene to be tested are as follows: The base sequences existing between them are aligned, the bases at the corresponding positions between the sequences are compared, the single base X in which 80% or more of the bases at the corresponding positions between the sequences are the same, and / or each 80% or more of the bases at corresponding positions between the sequences include a mixed base Y composed of any two or three kinds of bases selected from A, T, G, and C, and a single base X and A continuous base sequence region in which the mixed base Y accounts for 90% or more is selected as the F3 region, and a single or a plurality of mixed bases designed to cover the base sequences of the F3 region of all the genes to be examined Set of FL primer consisting of the base primer. 前記ＦＬ領域の塩基数が１０塩基〜２５塩基であることを特徴とする請求項１７ないし１９のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。   The FL primer set according to any one of claims 17 to 19, wherein the number of bases in the FL region is 10 to 25 bases. 前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５亜型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項１７ないし２０のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号３５〜配列番号４５で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１２１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１３９〜配列番号１４１で表される塩基配列のプライマーからなるセット、 The FL according to any one of claims 17 to 20, wherein the subtype is an influenza A virus H5 subtype and is any primer set shown in the following (a) to (c): A set of primers.
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35 to SEQ ID NO: 45,
(B) a set consisting of a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 121, or (c) a set consisting of a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 139 to SEQ ID NO: 141, 請求項１７ないし２０のいずれかに記載のＦＬプライマーの塩基配列の相補配列からなるＢＬプライマーのセット。   A set of BL primers comprising a sequence complementary to the base sequence of the FL primer according to any one of claims 17 to 20. 前記亜型がＡ型インフルエンザウイルスＨ５型であり、以下の（ａ）〜（ｃ）に示されるいずれかのプライマーセットであることを特徴とする請求項２２に記載のＢＬプライマーのセット。
（ａ）配列番号９３〜配列番号１１４で表される塩基配列のプライマーからなるセット、
（ｂ）配列番号１３０で表される塩基配列のプライマーからなるセット、または
（ｃ）配列番号１４３で表される塩基配列で表される塩基配列のプライマーからなるセット、 23. The BL primer set according to claim 22, wherein the subtype is influenza A virus type H5, and is any primer set shown in the following (a) to (c).
(A) a set comprising primers of the base sequence represented by SEQ ID NO: 93 to SEQ ID NO: 114,
(B) a set comprising a primer of the base sequence represented by SEQ ID NO: 130, or (c) a set comprising a primer of the base sequence represented by the base sequence represented by SEQ ID NO: 143, 請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットおよび請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。   Using the oligonucleotide primer set according to claim 1 and the oligonucleotide primer set according to claim 3, a nucleic acid amplification reaction is performed using a nucleic acid derived from a pathogen gene in a sample as a template, and the amplification obtained A method of determining the type or subtype of a pathogen in a sample by analyzing fragments. 請求項４ないし７のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセットおよび請求項８または９のいずれかに記載のＢＩＰプライマーのセットを用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定する方法。   A LAMP method using the FIP primer set according to any one of claims 4 to 7 and the BIP primer set according to any one of claims 8 or 9 as a template using a nucleic acid derived from a gene of a pathogen in a sample as a template. A method of determining the type or subtype of a pathogen in a sample by performing a nucleic acid amplification reaction according to, and analyzing the obtained amplified fragment. 請求項１０ないし１４のいずれかに記載のＦ３プライーのセットおよび請求項１５または１６に記載のＢ３プライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする請求項２５に記載の方法。   A nucleic acid obtained by the LAMP method using the F3 ply set according to any one of claims 10 to 14 and the B3 primer set according to claim 15 or 16 as a template, and a nucleic acid derived from a pathogen gene in a sample as a template. The method according to claim 25, wherein an amplification reaction is performed and the obtained amplified fragment is analyzed to determine the type or subtype of the pathogen in the sample. 請求項１７ないし２１のいずれかに記載のＦＬプライマーのセットおよび請求項２２または２３に記載のＢＬプライマーのセットをさらに用いて、試料中の病原体の遺伝子由来の核酸を鋳型として、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を行い、得られた増幅断片を解析して、試料中の病原体の型または亜型を判定することを特徴とする請求項２６に記載の方法。   A nucleic acid obtained by the LAMP method using the FL primer set according to any one of claims 17 to 21 and the BL primer set according to claim 22 or 23 as a template, and a nucleic acid derived from a pathogen gene in a sample as a template. 27. The method according to claim 26, wherein an amplification reaction is performed and the obtained amplified fragment is analyzed to determine the type or subtype of the pathogen in the sample. 請求項１もしくは２に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、請求項３に記載のオリゴヌクレオチドプライマーのセット、請求項４ないし７のいずれかに記載のＦＩＰプライマーのセット、請求項８もしくは９に記載のＢＩＰプライマーのセット、請求項１０ないし１４のいずれかに記載のＦ３プライマーのセット、請求項１５もしくは１６に記載のＢ３プライマーのセット、請求項１７ないし２１のいずれかに記載のＦＬプライマーのセット、または、請求項２２もしくは２３に記載のＢＬプライマーのセットの少なくともいずれかのプライマーのセットを含む、病原体の型または亜型を判定するためのキット。   The set of oligonucleotide primers according to claim 1 or 2, the set of oligonucleotide primers according to claim 3, the set of FIP primers according to any one of claims 4 to 7, and the set according to claims 8 or 9. A set of BIP primers, a set of F3 primers according to any of claims 10 to 14, a set of B3 primers according to claim 15 or 16, a set of FL primers according to any of claims 17 to 21, Alternatively, a kit for determining the type or subtype of a pathogen, comprising at least one primer set of the BL primer set according to claim 22 or 23.
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