JP2018168078A

JP2018168078A - Ｐｄｐｎ遺伝子又はタンパク質の発現促進剤、細胞遊走促進剤

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Publication number: JP2018168078A
Application number: JP2017064680A
Authority: JP
Inventors: 祐介牧; Yusuke Maki; 美穂森田; Yoshio Morita
Original assignee: Naris Cosmetics Co Ltd
Current assignee: Naris Cosmetics Co Ltd
Priority date: 2017-03-29
Filing date: 2017-03-29
Publication date: 2018-11-01
Anticipated expiration: 2037-03-29
Also published as: JP6676005B2

Abstract

【課題】細胞遊走促進効果を有するＰＤＰＮ遺伝子又はタンパク質の発現促進剤、細胞遊走促進剤の提供。
【解決手段】ヒバマタ抽出物を用いた、細胞遊走促進効果を有するＰＤＰＮ遺伝子又はタンパク質の発現促進剤、細胞遊走促進剤。ＰＤＰＮ遺伝子又はそのタンパク質の発現量を高め、線維芽細胞の細胞遊走能を高めることで、細胞遊走能の低下に起因する各種症状の改善が可能となる。創傷治癒の過程では、皮膚線維芽細胞の遊走が重要な働きを有する。
【選択図】図３

Description

本発明は、細胞遊走促進効果を有する物質に関する。具体的には、ポドプラニン（以下、単にＰＤＰＮという場合がある。）遺伝子又はタンパク質の発現促進によって、細胞遊走を促進する物質に関する。

老化したヒトや糖尿病の患者では、怪我や火傷、手術跡の治癒の遅延や床ずれの発生等、いわゆる創傷治癒機能の低下が生じる。この創傷治癒の過程で、皮膚線維芽細胞の遊走が重要な働きを有することが知られており、実際、皮膚線維芽細胞の遊走は若年者よりも老年者をドナーとする細胞を用いた実験で有意に遅いことが報告されている。

従来、ヒト皮膚線維芽細胞の遊走は、増殖因子類やコラーゲンなどの遊走促進因子と、インターフェロンーβのような遊走抑制因子などによって調節されていると考えられている。
そこで、細胞遊走能の向上にあたっては、血行改善剤を用いて遊走促進因子を血中から補充することを試みたり、皮膚湿潤材を外用して細胞の遊走先である皮膚の湿潤状態を維持することにより血管からの浸出物を保持させるなどの対策が講じられている。さらに難治性の場合には、自己の血液を外用して遊走関連因子の補充を行う療法も行われている。しかし、従来の対策では、老化や疾患が原因で創傷治癒の遅延が生じている場合、そもそも自己血の細胞遊走促進機能が十分でないことがあり、また、人工的な増殖因子製剤の外用では、血液ほど多様な増殖因子を含有していないことで、十分な効果が得られないことがあった。したがって、線維芽細胞遊走促進に対する異なる手段の開発が望まれていた。

ところで、ＰＤＰＮは、４４ｋＤａの分子量をもつ細胞膜貫通（膜１回）タンパク質である（非特許文献１）。さらに、このタンパク質は１６２個のアミノ酸から構成され、細胞内ドメインはわずか８個のアミノ酸から構成されている（非特許文献２）。その働きとしては、血小板凝集作用（非特許文献３、４）、細胞接着（非特許文献１）、細胞遊走（非特許文献５、６）が主である。ＰＤＰＮは、リンパ管内皮細胞や表皮細胞の創傷治癒部において発現が亢進し、細胞遊走を促進する働きがあることが報告されている（非特許文献４、７）。また、皮膚の老化を予防する候補化合物をスクリーニングする指標として、真皮乳頭層に発現しているＰＤＰＮをマーカーとして応用する例は過去に報告されていたが（特許文献１）、ＰＤＰＮ遺伝子又はタンパク質の発現を促進することによって細胞遊走を促進する効果を有する物質についてはこれまで見出されていなかった。

ヒバマタは、褐藻類ヒバマタ科ヒバマタ属に分類される海藻の一つである。従来、ヒバマタは、エラスターゼ活性抑制剤（特許文献２）、ヒアルロニダーゼ阻害剤（特許文献３）、弾性線維形成促進剤（特許文献４）、ランゲルハンス細胞の遊走抑制剤（特許文献５）として提案されてきた。しかし、ヒバマタのＰＤＰＮ遺伝子発現又はタンパク質を促進する作用および線維芽細胞の遊走を促進する作用に関してはこれまで確認されていなかった。

上記背景の中、我々は、ＰＤＰＮの皮膚における細胞遊走の働きに着目し、細胞遊走の機能が低下した線維芽細胞のＰＤＰＮ機能を高めることができれば、必ずしも血液由来の増殖因子の種類や量に依存しない、新たな細胞遊走促進法を確立できるのではないかと考えた。
そこで、ＰＤＰＮに起因する細胞遊走に関し、鋭意精鋭検討した結果、加齢によって細胞遊走能が低下した細胞であっても、ＰＤＰＮの発現量を増加させる物質として見出したヒバマタエキスと共存させると、細胞遊走の促進に繋がることを確認し、本発明を完成させるに至った。

ＪｉｌｌｉａｎＬ．Ａｓｔａｒｉｔａｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２８３（３），１−１１，２０１２Ａｔｓｕｍｉ，Ｎｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ．３７３（１），３６−４１，２００８Ｙｕｋｉｎａｒｉ，Ｋｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２７８（５１），５１５９９−５１６０５，２００３Ｓａｔｏｓｈｉ，Ｈ，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｈｅＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＪａｐａｎ．１３２（２），２１１−２１４，２０１２Ｋａｗａｓｅ，Ａｅｔａｌ．，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ．１２３（５），１０５３−１０５９，２００８ＨａｒｉｎｉＫｒｉｓｈｎａｎｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２８８，１２２１５−１２２２１，２０１３Ｍａｓａｒｕ，Ｈｅｔａｌ．，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ．６５，１３４−１４０，２０１２

特表２０１４−５３３９５９号特開２０００−５３５７８号特願平８−１５４４６８号特許５９４６２５３号特開２００１−６４１９２号

本発明は、細胞遊走促進効果を有するＰＤＰＮ遺伝子又はタンパク質の発現促進剤、細胞遊走促進剤の提供を課題とする。

本発明者らは上述の課題解決のために鋭意研究した結果、ヒバマタ抽出物を用いることで上記課題を解決した。

本発明によれば、ＰＤＰＮ遺伝子又はそのタンパク質の発現量を高め、線維芽細胞の細胞遊走能を高めることで、細胞遊走能の低下に起因する各種症状の改善が可能となる。

ＰＤＰＮ遺伝子発現量の加齢変化加齢により低下したＰＤＰＮ遺伝子発現量を促進させる物質の探索ヒバマタエキスの細胞遊走促進効果

本発明は、真皮における線維芽細胞のＰＤＰＮ遺伝子発現量を増加させ、細胞の遊走を促進させる物質を提供する。

本発明に用いるヒバマタは、褐藻類ヒバマタ科ヒバマタ属に分類される海藻であり、部位などは特に限定されないが、全草を用いるのが好ましい。

ヒバマタ抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば種々の適当な有機溶媒を用いて、低温下から加温下で抽出される。抽出溶媒としては、例えば、水；メチルアルコール、エチルアルコール等の低級１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等の液状多価アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン；酢酸エチルなどのアルキルエステル；ベンゼン、ヘキサン等の炭化水素；ジエチルエーテル等のエーテル類；ジクロルメタン、クロロホルム等のハロゲン化アルカン等の１種または２種以上を用いることができる。就中、水、エチルアルコール、１，３−ブチレングリコールの１種または２種以上の混合溶媒が特に好適である。

ヒバマタ抽出物の抽出方法は特に限定されないが、例えば乾燥したものであれば質量比で１〜１０００倍量、特に１０〜１００倍量の溶媒を用い、０℃以上、特に２０℃〜４０℃で１時間以上、特に３〜７日間行うのが好ましい。また、６０〜１００℃で１時間、加熱抽出しても良い。

以上のような条件で得られるヒバマタ抽出物は、抽出された溶液のまま用いても良いが、さらに必要により、濾過等の処理をして、濃縮、粉末化したものを適宜使い分けて用いることができる。

ヒバマタ抽出物の各剤への配合量は、効果を奏する範囲であれば特に限定されない。所望する効果の程度に応じて配合すれば良いが、各剤の組成物全体に対して、好ましくは、０．０００１〜１００質量％、より好ましくは０．００１〜２０質量％、更に好ましくは０．０１〜１０質量％である。

本発明における各剤の剤形は特に制限されない。例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水−油二層系、水−油−粉末三層系、軟膏、ゲル、エアゾール等、任意の剤型が適用される。

本発明における各剤は、本発明の効果を阻害しない範囲で、例えば酸化防止剤、油分、紫外線防御剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色材、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

以下、本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。また、特記しない限り配合量は質量％で示す。

―被験物質―
以下に示す遺伝子発現試験、細胞遊走試験において用いた被験物質は、市場に流通しているサガラメエキス（一丸ファルコス株式会社）、スサビノリエキス（一丸ファルコス株式会社）、ヒバマタエキス（丸善製薬株式会社）を使用した。

皮膚の加齢とＰＤＰＮ遺伝子発現量変化との関連を明らかにするために、若齢細胞、老齢細胞をそれぞれ培養し、ＰＤＰＮ遺伝子発現量の違いを確認した。

−遺伝子発現試験−
＜加齢によるＰＤＰＮ遺伝子発現量変化の確認時＞
ヒト由来正常真皮線維芽細胞（２８歳、６３歳のヒトをドナーとする細胞）を、５．０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ、以下同じ。）に懸濁し、２４ウェル細胞培養プレートに５００μＬずつ播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で７２時間培養後、線維芽細胞のＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。
尚、ヒト由来正常真皮線維芽細胞（６３歳のヒトをドナーとする細胞）群をコントロールとした。
＜加齢により低下した細胞のＰＤＰＮ遺伝子発現量を促進させる物質の探索時＞
ヒト由来正常真皮線維芽細胞（６３歳のヒトをドナーとする細胞）を、５．０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、２４ウェル細胞培養プレート（ＴｒｕｅＬｉｎｅ）に５００μＬずつ播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養後、被験物質を最終濃度１００ｐｐｍとなるように、培地に添加した。３７℃、５％ＣＯ_２条件下でさらに７２時間培養後、線維芽細胞のＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。尚、被験物質非添加群をコントロールとした。

上記の方法で抽出したＴｏｔａｌＲＮＡに対してＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴＰＣＲＫＩＴ（ＴａＫａＲａ）を用いて逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、ＰＤＰＮ、ＧＡＰＤＨの発現量を以下のプライマー及び酵素を用いて、リアルタイムＰＣＲ（７５００ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて測定した。

プライマーは、ＰＤＰＮ用センスプライマー（５‘−ＣＣＡＣＧＧＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＡ−３’）、アンチセンスプライマー（５‘−ＧＣＴＡＧＴＡＡＧＡＣＣＣＣＡＡＣＴＡＴＧＡＴＴＣＣ−３’）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ハウスキーピング遺伝子として使用）用センスプライマー（５‘−ＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴ−３’）、アンチセンスプライマー（５‘−ＴＧＡＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡ−３’）を用いた。ＰＣＲの反応にはＳＹＢＲＳｅｌｅｃｔＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、遺伝子発現の解析は比較ＣＴ法にて行った。結果は図1、図２に示す。

ＰＤＰＮ遺伝子発現量は、老齢細胞では、若齢細胞の１／４程度しか発現していなかった。この結果から、皮膚の加齢よってＰＤＰＮ遺伝子発現量は減少することが示された。

図２は、老齢細胞を用いてＰＤＰＮ遺伝子発現量を促進させる効果を調査した結果である。ヒバマタエキス添加群は、コントロール群の約４倍の発現量となっていることが分かった。この発現量は、図１における若齢細胞に匹敵する発現量であると言える。尚、同じ海藻類のエキスであるサガラメエキス、スサビノリエキスにおけるＰＤＰＮの発現量は、コントロールより劣った。このことから、海藻エキスの中でも、特にヒバマタエキスに高いＰＤＰＮ遺伝子発現量を促進させる効果があることが分かった。

−細胞遊走試験−
ヒト由来正常真皮線維芽細胞（２８歳、６３歳のヒトをドナーとする細胞）を、５．０×１０^４ｃｅｌｌ／ｍＬになるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に懸濁し、１２ウェル細胞培養プレートに１０００μＬずつ播種した。その後、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で２４時間培養した。２４時間後、ヒバマタエキスを終濃度１００ｐｐｍ（原料の溶液分）になるように添加した。更に２４時間後、培地を除去し、観察したい所定の細胞に対して、緑色の蛍光試薬（Ｃａｌｃｅｉｎ、ＣＢＩ）又は赤色の蛍光試薬（ＣｅｌｌＥｘｐｌｏｒｅｒＬｉｖｅＣｅｌｌＴｒａｃｋｉｎｇＫｉｔのＴｒａｃｋＩｔＲｅｄ）を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下で３０分間インキュベートすることで細胞を前調整した。３０分間後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、７．５×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬとなるように１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に分散し、Ｃｕｌｔｕｒｅ−Ｉｎｓｅｒｔｉｎ μ−Ｄｉｓｈ３５ｍｍ, ｈｉｇｈ（Ｗｉｄｅｏｆｃｅｌｌ−ｆｒｅｅｇａｐ５００μｍ±５０μｍ、ｉｂｉｄｉ社製）の左側の区画に赤色の蛍光試薬で染色した細胞を、右側の区画に緑色の蛍光試薬で染色した細胞を７０μＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ_２下で４時間インキュベート後、Ｉｎｓｅｒｔを外し１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２ｍＬ加え、４０時間後蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、ＫＥＹＥＮＣＥ、位相差１０倍レンズ）を用いて、細胞遊走の様子を観察した。細胞遊走能は、隔離して配置した細胞群の内、赤色に染色した細胞群から、他方の細胞群で緑色に染色した細胞群の当初配置されたエリア内へ遊走してきた赤色の細胞の数をカウントすることで、評価した。

具体的には、図３上段左列の図は、左側の区画に若齢細胞（２８歳のヒトをドナーとする細胞）を赤色に染めたものを播種し、右側の区画に老齢細胞（６３歳のヒトをドナーとする細胞）を緑色に染めたものを播種して実験を行った旨のイメージ図（上段）、０時間における細胞遊走状態の写真（中段）、４０時間後の細胞遊走状態の写真（下段）である。
図３上段中央列の図は、左側の区画に老齢細胞を赤色に染めたものを播種し、右側の区画に老齢細胞を緑色に染めたものを播種して実験を行った旨のイメージ図（上段）、０時間における細胞遊走状態の写真（中段）、４０時間後の細胞遊走状態の写真（下段）である。
図３上段の右列の図は、左側の区画に老齢細胞にヒバマタエキスを添加した後に赤色に染めたものを播種し、右側の区画に老齢細胞（ヒバマタエキス非添加）を緑色に染めたものを播種して実験を行った旨のイメージ図（上段）、０時間における細胞遊走状態の写真（中段）、４０時間後の細胞遊走状態の写真（下段）である。

図３より、若齢細胞は老齢細胞配置エリアにまで細胞遊走したが（図３左列）、老齢細胞は隔離して配置したもう一方の老齢細胞配置エリアにまで細胞遊走する様子は見られなかった（図３中央列）。一方、ヒバマタエキスを添加した老齢細胞は、ヒバマタエキス無添加の老齢細胞配置エリアにまで、若齢細胞と同等以上に活発に細胞遊走をすることが確認された（図３右列）。このことより、ＰＤＰＮ遺伝子の発現促進がＰＤＰＮタンパク質の発現促進につながり、延いては細胞遊走の促進に至ることが示された。

本発明によれば、加齢によって機能が低下した細胞の遊走を促進することができ、これにより、細胞遊走機能の低下に起因する各種症状を改善することができる。

Claims

褐藻類ヒバマタ科ヒバマタ属に属するヒバマタの抽出物を含有するＰＤＰＮ遺伝子又はタンパク質の発現促進剤。
褐藻類ヒバマタ科ヒバマタ属に属するヒバマタの抽出物を含有する細胞遊走促進剤。