JP2018157830A - Cell image acquisition apparatus, method, and program - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞コロニーにおける注目領域を高倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得する細胞画像取得装置および方法並びにプログラムに関するものである。 The present invention relates to a cell image acquisition apparatus, method, and program for acquiring a high-magnification image obtained by imaging a region of interest in a cell colony at a high magnification.
従来、ES細胞やiPS細胞などの幹細胞や分化誘導された細胞などを顕微鏡などで撮像し、その画像の特徴を捉えることで細胞の培養状態を判定する方法が提案されている。 Conventionally, a method has been proposed in which stem cells such as ES cells and iPS cells, differentiation-induced cells, and the like are imaged with a microscope, and the culture state of the cells is determined by capturing the characteristics of the images.
そして、このように細胞を撮像した画像の特徴に基づいて細胞の培養状態を判定する際には、まず、低倍率で細胞を撮像して低倍率撮像画像を取得し、その後、低倍率撮像画像内において特に注目したい注目領域を特定し、その注目領域を高倍率で撮像して高倍率撮像画像を取得してこれを観察することによって、細胞のより詳細な特徴を認識することが可能である。 When determining the culture state of the cells based on the characteristics of the images obtained by imaging the cells in this way, first, the cells are imaged at a low magnification to obtain a low-magnification captured image, and then the low-magnification captured image. It is possible to recognize more detailed features of cells by identifying a region of interest that is particularly interesting in the image, capturing the region of interest at a high magnification, obtaining a high-magnification captured image, and observing it .
たとえば、特許文献1および特許文献2には、培養される受精胚を高倍率で撮像する方法が提案されている。また、特許文献3および特許文献4には、培養に関する管理データに基づいて、ユーザが指定した容器内の位置を、指定した倍率で撮像することが提案されている。
For example, Patent Literature 1 and
ここで、たとえば幹細胞を培養する場合、幹細胞コロニーの形態は培養期間に応じて変化する。具体的には、たとえば培養初期は、コロニー領域内に未分化細胞が均一に分布している状態であるが、培養が進むとコロニー領域の周辺部は分化が始まって分化細胞が分布することになる。 Here, for example, when stem cells are cultured, the morphology of the stem cell colonies changes according to the culture period. Specifically, for example, in the initial stage of culture, undifferentiated cells are uniformly distributed in the colony region, but as the culture progresses, differentiation begins at the periphery of the colony region and differentiated cells are distributed. Become.
すなわち、培養初期は、コロニー領域内の中央部に注目して観察を行えば良いが、培養が進んだ際には、分化の程度を認識するため、コロニー領域の周辺部に注目する必要がある。 That is, at the initial stage of culture, observation may be made by paying attention to the central part in the colony region, but when culture proceeds, it is necessary to pay attention to the peripheral part of the colony region in order to recognize the degree of differentiation. .
このような幹細胞コロニーの形態変化に応じて、たとえば幹細胞コロニーの全範囲を高倍率で撮像するようにした場合には、幹細胞コロニーの全範囲を分割した複数の領域についてそれぞれ高倍率撮像を行う必要があり、計測時間が非常に長くなってしまう。また、高倍率で撮像された画像のデータ量も膨大なものとなってしまう。 In response to such changes in the shape of the stem cell colony, for example, when the entire range of the stem cell colony is imaged at a high magnification, it is necessary to perform high magnification imaging for each of a plurality of regions obtained by dividing the entire range of the stem cell colony. And the measurement time becomes very long. In addition, the amount of data of an image captured at a high magnification becomes enormous.
特許文献1および特許文献2には、個々の受精胚を撮像することしか提案されておらず、
細胞コロニーの撮像については何も提案されていない。また、特許文献3および特許文献4においても、管理データに基づいて、容器内の所定の観察位置を撮像することしか開示されておらず、上述したような細胞コロニーの形態変化に応じた撮像については何も提案されていない。
Patent Document 1 and
There is no proposal for imaging of cell colonies. Also,
本発明は、上記の問題に鑑み、細胞コロニーの撮像に際して、コロニー領域内において高倍率な撮像を行う注目領域を、コロニー領域の形態変化に応じて適切に限定することができ、処理および保存すべきデータの量を削減することができる細胞画像取得装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。 In view of the above problems, the present invention can appropriately limit a region of interest for performing high-magnification imaging in a colony region according to a change in the shape of the colony region, and process and store the cell colony. It is an object of the present invention to provide a cell image acquisition apparatus, method, and program that can reduce the amount of data to be reduced.
本発明の細胞画像取得装置は、培養される細胞の成熟度に関連する情報を取得する成熟度情報取得部と、細胞を第1の倍率で撮像した細胞画像を取得し、その細胞画像内における細胞のコロニー領域を特定するコロニー領域特定部と、成熟度に関連する情報に基づいて、細胞のコロニー領域における注目領域を決定する注目領域決定部と、注目領域を第1の倍率よりも高い第2の倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得する高倍率画像取得部とを備えたことを特徴とする。 The cell image acquisition device of the present invention acquires a cell image obtained by imaging a cell at a first magnification, and a maturity information acquisition unit that acquires information related to the maturity of a cell to be cultured. A colony region specifying unit for specifying a colony region of cells, an attention region determining unit for determining a region of interest in the cell colony region based on information related to maturity, and a region of interest higher than the first magnification. And a high-magnification image acquisition unit that acquires a high-magnification captured image captured at a magnification of 2.
また、上記本発明の細胞画像取得装置においては、注目領域決定部を、細胞の成熟度の段階によって異なる位置の注目領域を決定するものとできる。 In the cell image acquisition device of the present invention, the attention area determination unit can determine the attention areas at different positions depending on the stage of cell maturity.
また、注目領域決定部を、細胞の成熟によって分化する可能性が高いと推定される領域を注目領域として決定するものとできる。 Further, the attention area determination unit can determine an area that is estimated to be highly likely to be differentiated by cell maturation as the attention area.
また、注目領域決定部を、細胞の成熟度が初期段階である場合には、コロニー領域内の中心部を注目領域として決定し、初期段階よりも進んだ中期段階である場合には、コロニー領域内の周辺部を注目領域として決定するものとできる。 In addition, when the cell maturity is in the initial stage, the attention area determination unit determines the center in the colony area as the attention area, and in the middle stage that is advanced from the initial stage, the colony area It is possible to determine the inner peripheral portion as a region of interest.
また、注目領域決定部を、細胞の成熟度が中期段階よりも進んだ後期段階である場合には、コロニー領域内の中心部を注目領域として決定するものとできる。 In addition, when the attention area determination unit is in the late stage in which the maturity of the cells is advanced from the middle stage, the center part in the colony area can be determined as the attention area.
また、注目領域決定部を、成熟度の段階が予め設定された拡大成長段階である場合には、コロニー領域のエッジを含む領域を注目領域として決定するものとできる。 In addition, when the maturity level is a preset expansion growth stage, the attention area determination unit can determine the area including the edge of the colony area as the attention area.
また、成熟度に関連する情報として、細胞の培養期間の情報を取得することができる。 Moreover, the information of the cell culture period can be acquired as information relating to maturity.
また、成熟度情報取得部を、細胞画像内の細胞のコロニー領域の画像情報を解析することによって成熟度に関連する情報を取得するものとできる。 In addition, the maturity level information acquisition unit can acquire information related to the maturity level by analyzing the image information of the colony region of the cells in the cell image.
また、成熟度に関連する情報として、細胞のコロニー領域の形状または大きさに関する情報を取得することができる。 In addition, information relating to the shape or size of a colony region of cells can be acquired as information related to maturity.
また、注目領域決定部を、成熟度に関連する情報と細胞の培養条件とに基づいて、細胞のコロニー領域における注目領域を決定するものとできる。 Further, the attention area determination unit can determine the attention area in the colony area of the cell based on the information related to the maturity and the culture condition of the cell.
本発明の細胞画像取得方法は、培養される細胞の成熟度に関連する情報を取得し、細胞を第1の倍率で撮像した細胞画像を取得し、その細胞画像内における細胞のコロニー領域を特定し、成熟度に関連する情報に基づいて、細胞のコロニー領域内における注目領域を決定し、注目領域を第1の倍率よりも高い第2の倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得することを特徴とする。 The cell image acquisition method of the present invention acquires information related to the maturity of a cell to be cultured, acquires a cell image obtained by imaging the cell at a first magnification, and specifies a cell colony region in the cell image And determining a region of interest in the colony region of the cell based on the information related to the maturity level, and acquiring a high-magnification captured image obtained by imaging the region of interest at a second magnification higher than the first magnification. Features.
本発明の細胞画像取得プログラムは、コンピュータを、培養される細胞の成熟度に関連する情報を取得する成熟度情報取得部と、細胞を第1の倍率で撮像した細胞画像を取得し、その細胞画像内における細胞のコロニー領域を特定するコロニー領域特定部と、成熟度に関連する情報に基づいて、細胞のコロニー領域内における注目領域を決定する注目領域決定部と、注目領域を第1の倍率よりも高い第2の倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得する高倍率画像取得部として機能させることを特徴とする。 The cell image acquisition program of the present invention acquires a cell image obtained by imaging a cell at a first magnification, a maturity information acquisition unit that acquires information related to the maturity of a cell to be cultured, and the cell A colony region specifying unit that specifies a colony region of cells in the image; an attention region determining unit that determines a region of interest in the colony region of cells based on information related to maturity; It is made to function as a high-magnification image acquisition part which acquires a high-magnification picked-up image imaged with higher 2nd magnification.
本発明の細胞画像取得装置および方法並びにプログラムによれば、培養される細胞の成熟度に関連する情報を取得し、その成熟度に関連する情報に基づいて、細胞のコロニー領域における注目領域を決定し、その決定した注目領域を高倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得するようにしたので、注目領域をコロニー領域の形態変化に応じて適切に限定することができ、処理および保存すべきデータの量を削減することができる。 According to the cell image acquisition apparatus, method, and program of the present invention, information related to the maturity level of a cell to be cultured is acquired, and a region of interest in the colony area of the cell is determined based on the information related to the maturity level. Since the high-magnification captured image obtained by imaging the determined attention area at a high magnification is acquired, the attention area can be appropriately limited according to the form change of the colony area, and data to be processed and stored The amount of can be reduced.
以下、本発明の細胞画像取得装置および方法並びにプログラムの一実施形態を用いた細胞培養観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図1は、細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図である。 Hereinafter, a cell culture observation system using an embodiment of a cell image acquisition apparatus and method and a program of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a cell culture observation system.
細胞培養観察システムは、図1に示すように、細胞培養装置1と、細胞画像取得装置2と、位相差顕微鏡3と、ディスプレイ4と、入力装置5とを備えている。
As shown in FIG. 1, the cell culture observation system includes a cell culture device 1, a cell
細胞培養装置1は、細胞の培養を行うための装置である。培養対象の細胞としては、たとえばiPS細胞やES細胞やSTAP細胞といった多能性幹細胞や、幹細胞から分化誘導された神経や皮膚や肝臓などの細胞や、がん細胞などがある。細胞培養装置1内には、培養対象の細胞を培地に播種した培養容器が複数収容されている。そして、細胞培養装置1は、ステージ10と搬送部11と制御部12とを備えている。
The cell culture device 1 is a device for culturing cells. Examples of cells to be cultured include pluripotent stem cells such as iPS cells, ES cells, and STAP cells, cells such as nerves, skin, and liver induced by differentiation from stem cells, and cancer cells. In the cell culture apparatus 1, a plurality of culture containers in which cells to be cultured are seeded in a medium are accommodated. The cell culture device 1 includes a
ステージ10は、位相差顕微鏡3による撮影対象の培養容器が設置されるものである。また、搬送部11は、細胞培養装置1内の所定位置に収容されている複数の培養容器の中から撮像対象の培養容器を選択し、その選択した培養容器をステージ10まで搬送するものでる。また、制御部12は、細胞培養装置1全体を制御するものであり、上述したステージ10や搬送部11の動作以外に、細胞培養装置1内の温度、湿度およびCO2濃度などの環境条件を制御するものである。なお、温度、湿度およびCO2濃度を調整するための構成については、公知な構成を用いることができる。
The
位相差顕微鏡3は、ステージ10上に設置された培養容器内の細胞の位相画像を撮像するものである。図2は、位相差顕微鏡3の概略構成を示す図である。位相差顕微鏡3は、図2に示すように、白色光を出射する白色光源31と、リング形状のスリットを有し、白色光源31から出射された白色光が入射されてリング状照明光を出射するスリット板32と、スリット板32から射出されたリング状照明光が入射され、その入射されたリング状照明光をステージ10上に設置された培養容器15内の細胞に対して照射する対物レンズ33とを備えている。
The phase-
そして、ステージ10に対して白色光源31とは反対側に、位相差レンズ34と、結像レンズ37と、撮像素子38とが設けられている。
A
位相差レンズ34は、対物レンズ35と、位相板36とを備えたものである。位相板36は、リング状照明光の波長に対して透明な透明板に対して位相リングを形成したものである。なお、上述したスリット板32のスリットの大きさは、この位相リングと共役な関係にある。
The
位相リングは、入射された光の位相を1/4波長ずらす位相膜と、入射された光を減光する減光フィルタとがリング状に形成されたものである。位相差レンズ34に入射された直接光は対物レンズ35によって集光され、位相リングを通過することによって位相が1/4波長ずれるとともに、その明るさが弱められる。一方、培養容器15内の細胞によって回折された回折光は大部分が位相板の透明板を通過し、その位相および明るさは変化しない。
In the phase ring, a phase film that shifts the phase of incident light by ¼ wavelength and a neutral density filter that attenuates incident light are formed in a ring shape. The direct light incident on the
位相差レンズ34は、図示省略した駆動機構によって図2に示す矢印A方向に移動するものであり、このように位相差レンズ34が移動することによってフォーカス位置が変更されてフォーカス制御が行われる。駆動機構は、細胞画像取得装置2の撮像制御部26から出力されたフォーカス制御信号に基づいて位相差レンズ34を移動させるものである。
The
また、本実施形態の位相差顕微鏡3は、倍率の異なる複数の位相差レンズ34を交換可能に構成されている。位相差レンズ34の交換については、ユーザからの指示入力に応じて自動的に行う構成としてもよいし、ユーザが手動で交換するようにしてもよい。
Further, the
本実施形態においては、マクロ観察のための低倍率撮像と詳細観察のための高倍率撮像とが行われるが、低倍率撮像の際には1倍〜4倍の位相差レンズ34が用いられ、高倍率撮像の際には10倍〜20倍の位相差レンズ34が用いられる。ただし、低倍率撮像と高倍率撮像とは相対的に倍率が異なっていればよく、これらの倍率に限定されるものではない。
In the present embodiment, low-magnification imaging for macro observation and high-magnification imaging for detailed observation are performed. In low-magnification imaging, a
結像レンズ37は、位相差レンズ34を通過した直接光および回折光が入射され、これらの光を撮像素子38に結像するものである。撮像素子38は、結像レンズ37によって結像された像を光電変換することによって細胞の位相画像を撮像するものである。撮像素子38としては、CCD(charge-coupled device)イメージセンサやCMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor)イメージセンサなどが用いられる。
The
なお、本実施形態においては、撮像装置として位相差顕微鏡3を用いるようにしたが、その他の光学倍率が変更可能な顕微鏡を用いるようにしてもよく、たとえば微分干渉顕微鏡などを用いるようにしてもよい。
In the present embodiment, the phase-
図1に戻り、細胞画像取得装置2は、低倍率画像取得部20と、コロニー領域特定部21と、成熟度情報取得部22と、注目領域決定部23と、高倍率画像取得部24と、制御部25とを備えている。制御部25は、撮像制御部26と表示制御部27とを備えている。
Returning to FIG. 1, the cell
細胞画像取得装置2は、コンピュータに対して本発明の細胞画像取得プログラムの一実施形態がインストールされたものである。
The cell
細胞画像取得装置2は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに細胞画像取得プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置によって実行されることによって、図1に示すような、低倍率画像取得部20、コロニー領域特定部21、成熟度情報取得部22、注目領域決定部23、高倍率画像取得部24、撮像制御部26および表示制御部27が動作する。
The cell
低倍率画像取得部20は、位相差顕微鏡3によって上述した低倍率撮像により撮像された細胞画像を取得するものである。低倍率画像取得部20によって取得される低倍率撮像画像は、1つの細胞コロニーを撮像した1枚の画像でもよいし、1つの細胞コロニーを矩形の複数の分割領域で分割した複数の画像群でもよい。また、1枚の画像内に複数の細胞コロニーが含まれていてもよい。
The low-magnification
低倍率画像取得部20は、細胞コロニーを識別するための識別情報と低倍率撮像画像とを対応づけて記憶するものである。たとえば、1つの細胞コロニーを1枚の低倍率撮像画像で撮像した場合には、その細胞コロニーの識別情報と低倍率撮像画像とが1対1で対応づけられて記憶される。また、1つの細胞コロニーを複数の分割領域の低倍率撮像画像で撮像した場合には、その細胞コロニーの識別情報と複数の分割領域の低倍率撮像画像群とが対応づけられて記憶される。また、複数の細胞コロニーを1枚の低倍率撮像画像で撮像した場合には、その各細胞コロニーの識別情報と1枚の低倍率撮像画像とが対応づけられて記憶される。
The low-magnification
このように細胞コロニーの識別情報と低倍率撮像画像とを対応づけて記憶して管理することによって、たとえばユーザが入力装置5から細胞コロニーの識別情報を入力した際、その識別情報に対応づけられた低倍率撮像画像を即座に読み出して表示等することができる。
Thus, by storing and managing the identification information of the cell colony and the low-magnification captured image in association with each other, for example, when the user inputs the identification information of the cell colony from the
コロニー領域特定部21は、低倍率画像取得部20によって取得された低倍率撮像画像内における細胞コロニー領域の位置を特定するものである。細胞コロニー領域を特定する方法としては、たとえば低倍率撮像画像を2値化画像に変換した後、テンプレートマッチングなどによって細胞コロニー領域を自動的に抽出することによって位置を特定するようにすればよい。また、細胞コロニー領域の自動抽出については、上述した方法に限らず、その他の公知な方法を用いるようにしてもよい。
The colony
また、自動抽出に限らず、表示制御部27によってディスプレイ4に低倍率撮像画像を表示させ、ユーザが入力装置5を用いて低倍率撮像画像内における細胞コロニー領域を指定し、その指定された座標などの位置情報をコロニー領域特定部21が取得するようにしてもよい。
In addition to automatic extraction, the
成熟度情報取得部22は、細胞の成熟度に関連する情報を取得するものである。成熟度情報取得部22によって取得された成熟度に関連する情報は、注目領域決定部23において、細胞コロニー領域における注目領域を決定する際に用いられるものである。この注目領域が、上述した高倍率撮像の撮像対象領域となる。
The maturity
本実施形態においては、細胞の成熟度を培養初期、培養中期および培養後期の3段階に区分し、成熟度情報取得部22によって細胞の成熟度に関連する情報を取得することによって、撮像対象の細胞の成熟度が属する段階を取得するものである。
In the present embodiment, the cell maturity is divided into three stages, ie, the initial stage of culture, the middle stage of culture, and the late stage of culture, and information related to the maturity level of the cell is acquired by the maturity level
細胞の成熟度を培養初期、培養中期および培養後期と区分するのは、これらのそれぞれの段階によって細胞コロニーの形態が異なっており、その形態に応じて注目領域を設定することが望ましいからである。 The cell maturity is divided into the early stage, middle stage of culture and late stage of culture because the morphology of the cell colony differs depending on each stage, and it is desirable to set the attention area according to the form. .
具体的には、たとえば幹細胞コロニーの場合、培養初期は、図3に示すようにコロニー領域内に未分化細胞が均一に分布している。そして、培養中期になると、図3に示すようにコロニー領域の中心部は未分化細胞が密集して分布し、周辺部は分化が始まって分化細胞が分布することになる。 Specifically, for example, in the case of a stem cell colony, undifferentiated cells are uniformly distributed in the colony region at the initial stage of culture as shown in FIG. In the middle of the culture, as shown in FIG. 3, undifferentiated cells are densely distributed in the central part of the colony region, and differentiated cells are distributed in the peripheral part.
さらに、培養後期になると、図3に示すようにコロニー領域の中心部において分化が起こり易くなり、いわゆるホールと呼ばれる現象が起こることがある。これによりコロニー領域の中心部と周辺部には分化細胞が分布し、中心部と周辺部との間の中間部に分化細胞が分布することになる。 Furthermore, at the later stage of the culture, as shown in FIG. 3, differentiation is likely to occur in the central part of the colony region, and a so-called hole phenomenon may occur. As a result, differentiated cells are distributed in the central portion and the peripheral portion of the colony region, and differentiated cells are distributed in an intermediate portion between the central portion and the peripheral portion.
上述したように、培養初期と培養中期と培養後期とで細胞コロニー領域の形態が変化するので、本実施形態においては、この形態変化に応じて注目領域を設定する。すなわち、高倍率で撮像を行う領域を決定する。 As described above, since the form of the cell colony region changes in the initial stage of culture, the middle stage of culture, and the late stage of culture, in this embodiment, the region of interest is set according to this form change. That is, an area for imaging at a high magnification is determined.
成熟度情報取得部22によって取得される細胞の成熟度に関連する情報は、細胞の成熟度の段階を示す情報であれば如何なる情報でもよく、たとえばタイマなどによって計測された培養期間を成熟度に関連する情報として取得することができる。また、培養期間に限らず、たとえば低倍率撮像画像内の細胞コロニー領域の画像情報を解析し、細胞コロニーの大きさや、幹細胞コロニー内の細胞数または幹細胞コロニーよりも小さい単位面積当たりの細胞数を計測し、その計測した細胞数が多いほど成熟度が進んでいるものとして成熟度に関連する情報として取得するようにしてもよい。細胞コロニーの大きさとしては、細胞コロニーの面積、周囲長、最大径などを取得することができる。なお、細胞コロニー領域の画像情報については、コロニー領域特定部21によって特定された細胞コロニーの位置情報に基づいて取得するようにすればよい。また、細胞コロニー内の細胞数の計測については、たとえば個々の細胞または細胞内の核や核小体をパターンマッチングなどによって検出し、その検出した個々の細胞の数をカウントするようにすればよい。
The information related to the maturity level of the cell acquired by the maturity level
また、たとえば細胞コロニー領域の画像の輝度や、均一性や粗さなどのテクスチャを成熟度に関連する情報として取得するようにしてもよい。たとえば撮像対象の細胞が幹細胞である場合には、その成熟度が進行すると幹細胞の密集度が高くなり、さらに幹細胞が積層されて、画像の輝度が次第に高くなる。したがって、輝度が高いほど成熟度が進行しているといえる。 Further, for example, the brightness of the image of the cell colony region, texture such as uniformity and roughness may be acquired as information related to maturity. For example, when the cell to be imaged is a stem cell, the degree of maturity advances and the density of the stem cells increases, and the stem cells are further stacked to gradually increase the luminance of the image. Therefore, it can be said that the higher the brightness is, the more mature the progress is.
また、成熟度が進行して上述したように幹細胞が増殖して積層された状態となった場合、画像の均一性が高くなり、また凹凸の少ない滑らかな画像となる。したがって、画像の均一性が高い、または画像が滑らかであるほど成熟度が進行しているといえる。画像の均一性や滑らかさの特徴量の取得方法については、既に公知な手法を用いることができる。 Further, when the maturity progresses and the stem cells proliferate and are stacked as described above, the uniformity of the image is increased and a smooth image with less unevenness is obtained. Therefore, it can be said that the degree of maturity progresses as the uniformity of the image is higher or the image is smoother. As a method for acquiring image uniformity and smoothness feature quantities, a known method can be used.
また、成熟度に関連する情報として、幹細胞コロニーの形状の特徴量を取得するようにしてもよい。幹細胞の成熟度が進行すると幹細胞コロニーの形状は次第に円形に近づいた後、周辺部分の分化が進行してエッジの複雑度が大きくなる。したがって、このような幹細胞コロニーの形状の変化の特徴量を成熟度に関連する特徴量として取得することができる。 Moreover, you may make it acquire the feature-value of the shape of a stem cell colony as information relevant to a maturity degree. As the maturity of the stem cells progresses, the shape of the stem cell colony gradually approaches a circular shape, and then the differentiation of the peripheral portion proceeds and the complexity of the edge increases. Therefore, the feature amount of the change in the shape of the stem cell colony can be acquired as the feature amount related to the maturity.
また、成熟度に関連する情報として、幹細胞コロニーの厚さの特徴量を取得するようにしてもよい。幹細胞の成熟度が進行すると幹細胞コロニーは次第に厚くなっていく。したがって、このような幹細胞コロニーの厚さの特徴量を成熟度に関連する特徴量として取得することができる。幹細胞コロニーの厚さについては、たとえば別途設けられた計測装置によって計測するようにすればよい。 Moreover, you may make it acquire the feature-value of the thickness of a stem cell colony as information relevant to a maturity degree. As the maturity of stem cells progresses, the stem cell colonies gradually become thicker. Therefore, such a feature quantity of the thickness of the stem cell colony can be acquired as a feature quantity related to maturity. The thickness of the stem cell colony may be measured by, for example, a separately provided measuring device.
また、上述した成熟度に関連する情報は、ユーザが入力装置5を用いて設定入力するようにしてもよく、上述した培養期間や細胞コロニーの大きさなどだけでなく、細胞の継代数を成熟度に関連する情報としてユーザが入力するようにしてもよい。
The information related to the maturity described above may be set and input by the user using the
なお、本実施形態においては、細胞の成熟度を3段階に区分するようにしたが、3段階に限らず、2段階や4段階以上に区分してもよい。また、各段階の間隔についても、培養条件などに応じて種々の間隔を設定することができる。 In the present embodiment, the cell maturity is divided into three stages, but is not limited to three stages, and may be divided into two stages or four or more stages. In addition, various intervals can be set for the intervals of each stage according to the culture conditions and the like.
注目領域決定部23は、成熟度情報取得部22において取得された成熟度に関連する情報とコロニー領域特定部21によって特定されたコロニー領域の位置とに基づいて、細胞コロニーにおける注目領域を決定するものである。
The attention
本実施形態の注目領域決定部23は、具体的には、図4に示すような培養期間と注目領域とを対応づけたテーブルを有しており、このテーブルを参照して注目領域を決定する。また、本実施形態においては、注目領域決定部23は、培養期間の他に培養条件も取得し、その取得した培養条件と培養期間とに基づいて、図4に示すテーブルを参照して注目領域を決定するものである。
Specifically, the attention
培養条件としては、足場や培地の種類や、培養対象の細胞とは異なる種類の異種細胞(フィーダー細胞)を使用しているか否かの条件などがある。同じ培養期間であっても、これらの培養条件によって成熟度の段階が異なることになるので、本実施形態では、培養条件も考慮して注目領域を決定する。 Examples of the culture conditions include the type of scaffold and medium, and whether or not different types of heterogeneous cells (feeder cells) are used. Even in the same culture period, the stage of maturity varies depending on these culture conditions. In this embodiment, the region of interest is determined in consideration of the culture conditions.
また、培養条件は、上記に挙げたものに限らず、細胞の成長速度に影響する条件であれば如何なる条件でもよく、たとえば温度、湿度またはCO2濃度などの培養の環境条件なども含めるようにしてもよい。なお、培養条件の情報は、たとえばユーザによって入力装置5を用いて設定入力されるが、上述したような温度や湿度などは温度計や湿度計で計測した条件を用いるようにしてもよい。
In addition, the culture conditions are not limited to those described above, and any conditions that affect the cell growth rate may be used. For example, culture conditions such as temperature, humidity, or CO 2 concentration may be included. May be. Note that the culture condition information is set and input by the user using the
注目領域決定部23は、具体的には、たとえば培養条件が条件Aであり、培養期間が培養初期である場合には、未分化細胞の状態を中心に観察するため、図5に示すように注目領域(太線で示される矩形領域)を中心部に設定し、培養期間が培養中期である場合には、未分化細胞の分化がどの程度進んでいるかを観察するため、図5に示すように注目領域を周辺部に設定し、培養期間が培養後期である場合には、上述したホールの範囲を観察するため、再び注目領域を中心部に決定する。なお、注目領域の範囲としては、たとえば図5に示すように低倍率撮像画像の撮像領域を複数の矩形状の領域で分割した分割領域の範囲とすればよい。
Specifically, for example, when the culture condition is condition A and the culture period is the initial culture period, the attention
また、たとえば培養条件が条件Bである場合には、条件Aの場合とは異なり、培養期間が培養後期である場合には、未分化細胞の分化がどの程度進んでいるかを観察するため、注目領域を周辺部に決定する。 For example, when the culture condition is condition B, unlike the case of condition A, when the culture period is the late stage of culture, the degree of differentiation of the undifferentiated cells is observed. The area is determined as the peripheral part.
上述したように注目領域決定部23は、成熟度の段階によって異なる位置の注目領域を決定するものであるが、どの段階でどの位置に注目領域を決定するかについては、ユーザが観察したい細胞や細胞コロニーの状態などによって適宜設定されるものである。
As described above, the attention
上記説明では、培養初期では中心部、培養中期では周辺部、培養後期では中心部を観察領域とすることによって、細胞の成熟によって分化する可能性が高いと推定される領域を注目領域として決定するようにしたが、分化する可能性が高いと推定される領域は、上記のような中央部や周辺部だけでなく、たとえば細胞コロニー領域の左半分は未分化性を保ったまま成熟して右半分だけが分化してしまう場合などもあり、細胞の種類や成熟度によって分化する可能性が高いと推定される領域は異なる。 In the above description, an area that is estimated to be highly differentiated by cell maturation is determined as an attention area by using the central area in the early stage of culture, the peripheral area in the middle stage of culture, and the central area in the late stage of culture as the observation area. However, not only the central part and the peripheral part as described above, but also the left half of the cell colony area is matured while remaining undifferentiated. There are cases where only half of the cells are differentiated, and the regions that are likely to be differentiated differ depending on the cell type and maturity.
したがって、細胞の種類や成熟度を考慮し、分化する可能性が高いと推定される領域を注目領域として適宜設定するようにすればよい。分化する可能性が高いと推定される領域は、上述したようなテーブルに対してユーザが予め設定入力してもよいし、細胞コロニー領域の画像を解析することによって自動的に決定するようにしてもよい。たとえば、細胞コロニー領域内の各分割領域について細胞の密集度を算出し、その密集度が所定の閾値以下または閾値以上の領域を、分化する可能性が高いと推定される領域としてもよい。なお、細胞の密集度については、上述したように個々の細胞または細胞内の核や核小体をパターンマッチングなどによって検出することによって算出するようにすればよい。 Therefore, in consideration of the cell type and maturity, an area estimated to have a high possibility of differentiation may be appropriately set as the attention area. The region estimated to have a high possibility of differentiation may be set in advance by the user with respect to the table as described above, or automatically determined by analyzing the image of the cell colony region. Also good. For example, the density of cells may be calculated for each divided area in the cell colony area, and an area where the density is less than or equal to a predetermined threshold or greater than the threshold may be an area that is estimated to have a high possibility of differentiation. Note that the density of cells may be calculated by detecting individual cells or nuclei and nucleoli in the cells by pattern matching as described above.
また、密集度に限らず、個々の細胞間で発生するハロを検出し、そのハロの面積が所定の閾値以上の領域を、分化する可能性が高いと推定される領域としてもよい。ハロとは、細胞間を通過した回折光に起因して発生する高輝度のアーチファクトのことである。 In addition to the density, a halo generated between individual cells may be detected, and a region in which the area of the halo is equal to or greater than a predetermined threshold may be a region that is estimated to have a high possibility of differentiation. Halo is a high-luminance artifact that occurs due to diffracted light that has passed between cells.
また、注目領域の位置については、上述したようなコロニー領域の中心部や周辺部だけでなく、たとえば中心部と周辺部との間の中間部を設定し、その中間部に注目領域を決定するようにしてもよい。 As for the position of the attention area, not only the central part and the peripheral part of the colony area as described above, but also an intermediate part between the central part and the peripheral part is set, and the attention area is determined at the intermediate part. You may do it.
また、たとえば細胞コロニーの成熟度が進行し、図6に示すように低倍率撮像画像の撮像領域内に細胞コロニー領域が収まらないような場合には、細胞コロニー領域のエッジを検出し、そのエッジを含む領域を注目領域として決定するようにすればよい。図6の上段の図は、細胞コロニー領域のエッジが低倍率撮像画像の撮像領域内の右上隅に存在する場合における注目領域の位置の一例を示すものであり、図6の下段の図は、細胞コロニー領域のエッジが低倍率撮像画像の撮像領域の中央辺りに存在する場合における注目領域の位置の一例を示すものである。 For example, when the maturity of a cell colony progresses and the cell colony region does not fit within the imaging region of the low-magnification captured image as shown in FIG. 6, the edge of the cell colony region is detected, and the edge It is sufficient to determine the region including the region of interest. The upper diagram of FIG. 6 shows an example of the position of the region of interest when the edge of the cell colony region exists at the upper right corner in the imaging region of the low-magnification captured image. The lower diagram of FIG. It shows an example of the position of the region of interest when the edge of the cell colony region exists around the center of the imaging region of the low-magnification captured image.
具体的には、たとえば、図4に示すテーブルの条件Cの場合のように拡大成長期の段階を設定し、培養期間がこの段階である場合には、細胞コロニー領域のエッジを検出し、そのエッジを含む領域を注目領域として決定するようにすればよい。なお、拡大成長期の段階であることは、上述したように培養期間から決定するようにしてもよいし、低倍率撮像画像から多数の細胞からなる円形領域が抽出されないことを検出することによって決定するようにしてもよい。 Specifically, for example, the stage of the expansion growth period is set as in the case of the condition C of the table shown in FIG. 4, and when the culture period is at this stage, the edge of the cell colony region is detected, A region including an edge may be determined as a region of interest. Note that the stage of the expansion growth phase may be determined from the culture period as described above, or by detecting that a circular region composed of a large number of cells is not extracted from the low-magnification captured image. You may make it do.
図1に戻り、撮像制御部26は、注目領域決定部23によって決定された注目領域に基づいて、細胞培養装置1の制御部12に制御信号を出力し、細胞コロニー内の注目領域が高倍率撮像されるようにステージ10のX−Y方向の移動を制御するものである。また、撮像制御部26は、位相差顕微鏡3が、位相差レンズ34の倍率を自動的に変更可能に構成されたものである場合には、低倍率の位相差レンズ34から高倍率の位相差レンズ34に変更されるように制御信号を出力するものである。なお、位相差顕微鏡3が、位相差レンズ34の倍率を手動で変更するものである場合には、高倍率撮像の際には、ユーザが高倍率の位相差レンズ34に変更するようにすればよい。
Returning to FIG. 1, the
そして、撮像制御部26によって培養容器15のX−Y方向の位置が調整され、位相差レンズ34の倍率が高倍率に変更された状態で高倍率撮像が行われ、注目領域の高倍率撮像画像が撮像される。
Then, the
高倍率画像取得部24は、上述したようにして位相差顕微鏡3によって撮像された高倍率撮像画像を取得し、これを記憶するものである。
The high-magnification
表示制御部27は、低倍率撮像画像や高倍率撮像画像をディスプレイ4に表示させるものである。
The
入力装置5は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる操作入力を受け付けるものである。たとえば、入力装置5は、低倍率画像を撮像する際の倍率や高倍率画像を撮像する際の設定入力を受け付け可能なものである。また、入力装置5は、上述した培養条件、培養期間などの設定入力を受け付けるものである。
The
次に、上述した細胞培養観察システムの作用について、図7に示すフローチャートを参照しながら説明する。 Next, the operation of the above-described cell culture observation system will be described with reference to the flowchart shown in FIG.
まず、細胞培養装置1において、搬送部11によって、収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養が選択され、その選択された培養容器15がステージ10に設置される(S10)。
First, in the cell culture apparatus 1, the culture to be photographed is selected from the plurality of accommodated culture containers by the
そして、位相差顕微鏡3の位相差レンズ34の倍率が低倍率に設定されて低倍率撮像画像が撮像され、その撮像された低倍率撮像画像が低倍率画像取得部20によって取得される(S12)。低倍率画像取得部20によって取得された低倍率撮像画像は表示制御部27に出力され、表示制御部27によってディスプレイ4に表示される。
Then, the magnification of the
また、低倍率画像取得部20によって取得された低倍率撮像画像は、コロニー領域特定部21に出力され、コロニー領域特定部21は、入力された低倍率撮像画像に基づいて、その低倍率撮像画像内におけるコロニー領域の位置を特定する(S14)。
Moreover, the low-magnification captured image acquired by the low-magnification
一方、ユーザによる設定入力などによって成熟度情報取得部22は、細胞の成熟度に関連する情報としての培養期間の情報と、培養条件の情報とを取得する(S16)。
On the other hand, the maturity level
そして、成熟度情報取得部22によって取得された培養期間および培養条件の情報は、注目領域決定部23に出力され、注目領域決定部23は、培養期間および培養条件の情報とコロニー領域の位置とに基づいて、位相差顕微鏡3における高倍率撮像の撮像対象である注目領域を決定し、撮像制御部26に出力する(S18)。
Then, the information on the culture period and the culture condition acquired by the maturity
撮像制御部26は、注目領域決定部23によって決定された注目領域の位置情報に基づいて、その注目領域が高倍率撮像されるようにステージ10をX−Y方向に移動させる(S20)。また、このとき位相差顕微鏡3における位相差レンズ34は高倍率撮像の位相差レンズ34に変更される。
Based on the position information of the attention area determined by the attention
そして、位相差顕微鏡3において、フォーカス位置が調整された状態で詳細観察用の高倍率撮像画像が撮像される。位相差顕微鏡3によって撮像された高倍率撮像画像は細胞画像取得装置2の高倍率画像取得部24によって取得され、表示制御部27に出力される(S22)。表示制御部27は、入力された詳細観察用の高倍率撮像画像をディスプレイ4に表示させる(S24)。
Then, the phase-
上記実施形態の細胞培養観察システムによれば、成熟度に関連する情報に基づいて、細胞のコロニー領域における注目領域を決定し、その注目領域を高倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得するようにしたので、注目領域をコロニー領域の形態変化に応じて適切に限定することができ、処理および保存すべきデータの量を削減することができる。 According to the cell culture observation system of the above embodiment, the attention area in the colony area of the cell is determined based on the information related to the maturity level, and a high-magnification image obtained by imaging the attention area at a high magnification is acquired. As a result, the region of interest can be appropriately limited according to the shape change of the colony region, and the amount of data to be processed and stored can be reduced.
なお、上記実施形態の細胞培養観察システムにおいては、細胞の成熟度に関連する情報と培養条件とに基づいて注目領域を決定するようにしたが、細胞の種類によってもその成長の仕方や形態の変化は異なるため、さらに細胞の種類も考慮して注目領域を決定するようにしてもよい。 In the cell culture observation system of the above embodiment, the region of interest is determined based on information related to cell maturity and the culture conditions. Since the change is different, the region of interest may be determined in consideration of the cell type.
具体的には、たとえば図4に示すようなテーブルを細胞の種類毎に設定しておき、注目領域決定部23が、細胞の種類の情報も取得して注目領域を決定するようにすればよい。細胞の種類の情報としては、上述したようなiPS細胞やES細胞やSTAP細胞といった多能性幹細胞や、幹細胞から分化誘導された神経や皮膚や肝臓などの細胞や、がん細胞などがある。細胞の種類の情報は、たとえばユーザが入力装置5を用いて設定入力するようにすればよい。
Specifically, for example, a table as shown in FIG. 4 may be set for each cell type, and the attention
具体的には、たとえば心筋細胞コロニーや皮膚細胞コロニーにおける血管の先端位置は、培養期間によって異なると考えられる。したがって、培養期間に応じた血管の先端位置を含む領域を注目領域として設定するようにすればよい。 Specifically, for example, the tip position of a blood vessel in a cardiomyocyte colony or a skin cell colony is considered to vary depending on the culture period. Therefore, an area including the tip position of the blood vessel corresponding to the culture period may be set as the attention area.
また、上記実施形態の細胞培養観察システムにおいては、細胞の成熟度に関連する情報に基づいて細胞コロニーにおける注目領域の位置を決定するようにしたが、さらに、その決定した注目領域の位置によって、Z方向についてのフォーカス制御におけるフォーカスパラメータを変更するようにしてもよい。 Further, in the cell culture observation system of the above embodiment, the position of the attention area in the cell colony is determined based on the information related to the maturity of the cell. You may make it change the focus parameter in the focus control about Z direction.
上述したように、たとえば幹細胞コロニーの場合、培養初期は、図3に示すようにコロニー領域内に未分化細胞が均一に分布しているため、コロニー領域の中心部の幹細胞の核の高さhcenterと周辺部の幹細胞の核の高さhedgeは同じである。 As described above, for example, in the case of a stem cell colony, since the undifferentiated cells are uniformly distributed in the colony region as shown in FIG. 3 at the initial stage of culture, the height h of the stem cell nucleus at the center of the colony region The height hedge of the nucleus of the center and the peripheral stem cells is the same.
そして、培養中期になると、図3に示すようにコロニー領域の中心部は未分化細胞が密集して分布し、周辺部は分化が始まって分化細胞が分布することになる。図8は、未分化細胞と分化細胞の平面図(上段の図)と立面図(下段の図)とを示したものであるが、分化細胞は未分化細胞よりも核/細胞質の比が低下するので核の高さが低くなる。したがって、図3に示すように、コロニー領域の中心部の幹細胞の核の高さhcenterは、周辺部の幹細胞の核の高さhedgeよりもΔhだけ高くなる。 In the middle of the culture, as shown in FIG. 3, undifferentiated cells are densely distributed in the central part of the colony region, and differentiated cells are distributed in the peripheral part. FIG. 8 shows a plan view (upper view) and an elevation view (lower view) of undifferentiated cells and differentiated cells. Differentiated cells have a nucleus / cytoplasm ratio higher than that of undifferentiated cells. Since it decreases, the height of the nucleus decreases. Therefore, as shown in FIG. 3, the height h center of the stem cell nucleus in the center of the colony region is higher by Δh than the height h edge of the stem cell nucleus in the peripheral portion.
さらに、培養後期になると、図3に示すようにコロニー領域の中心部において分化が起こり易くなり、いわゆるホールと呼ばれる現象が起こることがある。したがって、コロニー領域の中心部の幹細胞の核の高さhcenterと周辺部の幹細胞の核の高さhedgeとは同じになるが、中心部と周辺部との間の中間部の幹細胞の核の高さhmiddleはΔhだけ高くなる。 Furthermore, at the later stage of the culture, as shown in FIG. 3, differentiation is likely to occur in the central part of the colony region, and a so-called hole phenomenon may occur. Therefore, the height h center of the stem cell nucleus in the central part of the colony region is the same as the height h edge of the stem cell nucleus in the peripheral part, but the nucleus of the intermediate stem cell between the central part and the peripheral part is the same. The height h middle is increased by Δh.
上述したように、培養初期と培養中期と培養後期とで細胞コロニー領域の形態が変化し、これによりX−Y方向の位置によって核の高さが異なることになるので、注目領域の位置に応じてオートフォーカスのフォーカス探索初期位置を設定することが望ましい。 As described above, the shape of the cell colony region changes in the initial culture period, the intermediate culture period, and the late culture period, and the height of the nucleus differs depending on the position in the XY direction. It is desirable to set the initial focus search position for autofocus.
したがって、図9に示すように、フォーカスパラメータ決定部28をさらに設け、このフォーカスパラメータ決定部28において、注目領域の位置に応じてフォーカス探索初期位置を決定し、その決定したフォーカス探索初期位置に基づいて、撮像制御部26が、位相差顕微鏡3におけるオートフォーカスを制御するようにしてもよい。
Therefore, as shown in FIG. 9, a focus
具体的には、フォーカスパラメータ決定部28には、たとえば図10に示すようなテーブルが予め設定されている。図10に示すテーブルは、細胞の種類、培養条件、培養期間および注目位置と、オートフォーカスのフォーカス探索初期位置とを対応づけたテーブルである。すなわち、フォーカスパラメータ決定部28は、注目領域の位置の他に、細胞の種類、培養条件および培養期間も考慮してフォーカス探索初期位置を決定するものである。なお、図10に示すテーブルにおいては、フォーカス探索初期位置として培養容器15の底面からのオフセット量(距離)の相対的な関係を示しているが、実際にはオフセット量の絶対値が取得され、そのオフセット量がフォーカス探索初期位置として決定される。また、図5に示すテーブルにおいてES細胞のオフセット量については実際には設定されているが図示省略している。
Specifically, for example, a table as shown in FIG. 10 is preset in the focus
そして、たとえば細胞の種類情報がiPS細胞であり、培養条件の情報が条件Aであり、注目領域が細胞コロニー領域の中心部である場合には、培養期間が培養初期の段階である場合と培養後期の段階である場合に、フォーカス探索初期位置のオフセット量を相対的に小さくし(細胞の設置面側に近くする)、培養期間が培養中期の段階である場合に、フォーカス探索初期位置のオフセット量を相対的に大きくする(細胞の設置面から遠くする)ようにすればよい。 For example, when the cell type information is iPS cells, the culture condition information is condition A, and the region of interest is the center of the cell colony region, the culture period is the initial stage of culture and the culture If the focus search initial position offset is relatively small (closer to the cell installation surface side) in the later stage, and the focus search initial position offset is in the middle culture stage The amount may be relatively large (away from the cell installation surface).
また、同様に、細胞の種類情報がiPS細胞であり、培養条件の情報が条件Aであっても、注目領域が細胞コロニー領域の周辺部である場合には、培養期間に応じてオフセット量を変更することなく、相対的に小さいオフセット量を決定するようにすればよい。 Similarly, even if the cell type information is iPS cells and the culture condition information is condition A, if the region of interest is the periphery of the cell colony region, the offset amount is set according to the culture period. A relatively small offset amount may be determined without changing.
このように図10に示すテーブルを参照してオフセット量を取得することによって、注目領域の位置に応じた適切なフォーカス探索初期位置を決定することができる。 Thus, by acquiring the offset amount with reference to the table shown in FIG. 10, it is possible to determine an appropriate focus search initial position according to the position of the region of interest.
また、さらに培養容器15の底部のX−Y面内の位置毎の厚さや、足場のX−Y面内の位置毎の厚さ情報などを取得し、これらも考慮してフォーカス探索初期位置を決定するようにしてもよい。
Further, the thickness information for each position in the XY plane of the bottom of the
また、上記説明では、オートフォーカスにおけるフォーカス探索初期位置を決定する方法について説明したが、フォーカスパラメータ決定部28は、フォーカス探索範囲、フォーカス探索幅、フォーカス探索順、フォーカス動作回数なども決定する。
In the above description, the method of determining the focus search initial position in autofocus has been described, but the focus
フォーカス探索範囲は、オートフォーカス制御におけるフォーカス位置の変更範囲であり、下限値と上限値とを有するものである。フォーカス探索範囲については、たとえば細胞の種類とフォーカス探索範囲とを対応づけたテーブルを予め設定しておき、細胞のサイズが大きいほど広いフォーカス探索範囲を決定するようにすればよい。 The focus search range is a change range of the focus position in autofocus control, and has a lower limit value and an upper limit value. For the focus search range, for example, a table in which cell types and focus search ranges are associated with each other may be set in advance, and a wider focus search range may be determined as the cell size increases.
また、細胞コロニー領域内の注目領域とフォーカス探索範囲とを対応づけたテーブルを予め設定し、注目領域の位置に応じたフォーカス探索範囲を決定するようにしてもよい。この場合、たとえば注目領域が中央部である場合には、相対的に広いフォーカス探索範囲とし、注目領域が周辺部である場合には、相対的に狭いフォーカス探索範囲を決定するようにすればよい。 In addition, a table in which a region of interest in a cell colony region and a focus search range are associated with each other may be set in advance, and a focus search range corresponding to the position of the region of interest may be determined. In this case, for example, when the attention area is the central part, a relatively wide focus search range may be set, and when the attention area is the peripheral part, a relatively narrow focus search range may be determined. .
また、培養期間とフォーカス探索範囲とを対応づけたテーブルを予め設定するようにしてもよい。この場合、たとえば培養期間が長くなるほどフォーカス探索範囲を広げるようにすればよい。 A table in which the culture period and the focus search range are associated with each other may be set in advance. In this case, for example, the focus search range may be expanded as the culture period becomes longer.
また、細胞の種類、注目領域の位置および培養期間の組み合わせ毎にフォーカス探索範囲を決定するようにしてもよい。 Further, the focus search range may be determined for each combination of the cell type, the position of the region of interest, and the culture period.
フォーカス探索幅とは、オートフォーカス制御における1回のフォーカス位置の変更の際の変更幅のことである。培養が進み細胞コロニーが拡大してくると、場所に応じて細胞の密集度にばらつきが生じることが考えられる。したがって、細胞の密集度のばらつきが小さい培養初期に合わせて設定したフォーカス探索幅では、細胞核がフォーカス探索範囲を外れる確率が上がる可能性がある。 The focus search width is a change width when the focus position is changed once in autofocus control. As culture progresses and cell colonies expand, it is considered that the density of cells varies depending on the location. Therefore, there is a possibility that the probability that the cell nucleus is out of the focus search range is increased with the focus search width set in accordance with the initial stage of the culture in which the variation in cell density is small.
したがって、たとえば培養期間とフォーカス探索幅とを対応づけたテーブルを予め設定しておき、培養期間が長くなるほどフォーカス探索幅を広くするようにしてもよい。 Therefore, for example, a table in which the culture period and the focus search width are associated with each other may be set in advance, and the focus search width may be increased as the culture period becomes longer.
また、細胞コロニー領域の周辺ほど個々の細胞が周りの細胞から受ける外力が小さくなって動きやすくなり、よりばらつきが大きくなる。したがって、細胞コロニー領域内の注目領域の位置とフォーカス探索幅とを対応づけたテーブルを予め設定しておき、細胞コロニー領域の周辺ほどフォーカス探索幅を広くするようにしてもよい。 In addition, the external force received by the individual cells from the surrounding cells becomes smaller as the area around the cell colony region becomes easier to move, and the variation becomes larger. Therefore, a table in which the position of the region of interest in the cell colony region is associated with the focus search width may be set in advance, and the focus search width may be increased toward the periphery of the cell colony region.
また、細胞コロニー内の注目領域の位置および培養期間の組み合わせ毎にフォーカス探索幅を決定するようにしてもよい。 Further, the focus search width may be determined for each combination of the position of the region of interest in the cell colony and the culture period.
フォーカス探索順としては、培養容器15の底面を基準として高い位置から低い位置にフォーカス位置を順次変更してオートフォーカス制御を行う場合と、低い位置から高い位置にフォーカス位置を順次変更してオートフォーカス制御を行う場合と、培養容器15の底面に近づいていく方向へのフォーカス位置の変更と離れていく方向へのフォーカス位置の変更とを交互に繰り返してオートフォーカス制御を行う場合とがある。
As the focus search order, when the auto focus control is performed by sequentially changing the focus position from the high position to the low position with reference to the bottom surface of the
分化細胞や、コロニー周辺の細胞は培養容器15の底面に這うように分布していることが多いため、培養容器15の底面側(低い位置)からフォーカス位置を探索する方が効率的である。一方、未分化細胞や細胞コロニー中心付近の細胞は立っていることが多いので、培養容器15の底面から離れた位置からフォーカス位置を探索する方が効率的である。
Differentiated cells and cells in the vicinity of the colony are often distributed so as to reach the bottom surface of the
したがって、細胞コロニー領域内の注目領域の位置とフォーカス探索順とを対応づけたテーブルを予め設定しておき、細胞コロニー領域の中心部については低い位置から高い位置に向かってフォーカス位置を探索し、細胞コロニーの周辺部について高い位置から低い位置に向かってフォーカス位置を探索するようにしてもよい。 Therefore, a table in which the position of the region of interest in the cell colony region is associated with the focus search order is set in advance, and the center of the cell colony region is searched for the focus position from the low position to the high position, You may make it search a focus position toward the low position from the high position about the peripheral part of a cell colony.
また、培養が進むと、上述したようにフォーカス位置のばらつきが大きくなることから、どちらか一方からフォーカス位置を探索するよりも、高い位置と低い位置とからで挟んで探索した方が細胞コロニー全体での探索回数が減らせてトータルで効率的となる場合があると考えられる。 In addition, as the culture progresses, the variation in the focus position increases as described above. Therefore, it is better to search between the high and low positions than to search for the focus position from either one. It can be considered that there are cases where the number of searches in can be reduced and the total becomes efficient.
したがって、たとえば培養期間とフォーカス探索順とを対応づけたテーブルを予め設定しておき、培養初期や培養中期は、上述したように低い位置から高い位置に向かって、または高い位置から低い位置に向かってフォーカス位置を探索し、培養後期は、高い位置からと低い位置からとを交互に繰り返して挟んでフォーカス位置を探索するようにしてもよい。 Therefore, for example, a table in which the culture period and the focus search order are associated with each other is set in advance, and in the initial culture period or the intermediate culture period, as described above, from a low position to a high position, or from a high position to a low position. The focus position may be searched for, and in the later stage of culture, the focus position may be searched by alternately sandwiching from a high position and a low position.
また、細胞コロニー内の注目領域の位置および培養期間の組み合わせ毎にフォーカス探索順を決定するようにしてもよい。 Further, the focus search order may be determined for each combination of the position of the region of interest in the cell colony and the culture period.
フォーカス動作回数とは、オートフォーカス制御におけるフォーカス位置の変更回数の上限である。培養初期〜培養中期において、細胞核やそれに準ずる組織(たとえば核小体)の形態を厳密に認識・評価するためには、厳密なフォーカス精度が必要であるといえる。一方、培養が進んでくると細胞の分化や積層により細胞核やそれに準ずる組織が視認しづらくなってくる傾向にあり、その場合は厳密なフォーカス精度が必要でなくなると考えられる。 The number of focus operations is the upper limit of the number of changes in focus position in autofocus control. It can be said that strict focus accuracy is required in order to strictly recognize and evaluate the morphology of the cell nucleus and the tissue (for example, nucleolus) corresponding to the cell nucleus in the early stage to the middle stage of the culture. On the other hand, as the culture progresses, cell nuclei and tissues corresponding thereto tend to be difficult to visually recognize due to cell differentiation and lamination, and in this case, it is considered that strict focus accuracy is not necessary.
したがって、たとえば培養期間とフォーカス動作回数とを対応づけたテーブルを予め設定しておき、培養が進むほどフォーカス動作回数を少なくするようにしてもよい。また、逆に、培養が進むにつれて発現する性状(核内のクロマチン凝集)を評価したい場合もあり、このような場合には、培養が進むほどフォーカス動作回数を増やしてフォーカス精度を上げるようにしてもよい。 Therefore, for example, a table in which the culture period is associated with the number of focus operations may be set in advance, and the number of focus operations may be reduced as the culture progresses. On the other hand, in some cases, it may be desirable to evaluate the properties (chromatin aggregation in the nucleus) that develop as the culture progresses. In such cases, increase the number of focusing operations as the culture progresses to increase the focus accuracy. Also good.
また、細胞コロニー領域内の注目領域の位置とフォーカス動作回数とを対応づけたテーブルを予め設定しておき、細胞コロニー領域の周辺部よりも中央部ほどフォーカス動作回数を多くすることによって、中央部のフォーカス精度を上げるようにしてもよい。また、逆に細胞コロニー領域の周辺部を重点的に観察したい場合には、細胞コロニー領域の中央部よりも周辺部ほどフォーカス動作回数を多くすることによって、周辺部のフォーカス精度を上げるようにしてもよい。 In addition, a table in which the position of the region of interest in the cell colony region is associated with the number of focus operations is set in advance, and the central portion is increased by increasing the number of focus operations toward the center rather than the periphery of the cell colony region. The focus accuracy may be increased. On the other hand, if you want to focus on the periphery of the cell colony area, increase the number of focusing operations in the periphery rather than the center of the cell colony area to increase the focus accuracy of the periphery. Also good.
また、細胞コロニー内の注目領域の位置および培養期間の組み合わせ毎にフォーカス動作回数を決定するようにしてもよい。 Alternatively, the number of focus operations may be determined for each combination of the position of the region of interest in the cell colony and the culture period.
1 細胞培養装置
2 細胞画像取得装置
3 位相差顕微鏡
4 ディスプレイ
5 入力装置
10 ステージ
11 搬送部
12 制御部
15 培養容器
20 低倍率画像取得部
21 コロニー領域特定部
22 成熟度情報取得部
23 注目領域決定部
24 高倍率画像取得部
25 制御部
26 撮像制御部
27 表示制御部
28 フォーカスパラメータ決定部
31 白色光源
32 スリット板
33 対物レンズ
34 位相差レンズ
35 対物レンズ
36 位相板
37 結像レンズ
38 撮像素子
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1
Claims (13)
前記細胞を第1の倍率で撮像した細胞画像を取得し、該細胞画像内における前記細胞のコロニー領域を特定するコロニー領域特定部と、
前記細胞の種類毎の前記成熟度に関連する情報に基づいて、前記細胞のコロニー領域における一部の注目領域を決定する注目領域決定部と、
前記一部の注目領域のみを前記第1の倍率よりも高い第2の倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得する高倍率画像取得部とを備えたことを特徴とする細胞画像取得装置。 A maturity information acquisition unit for acquiring information related to the maturity of cells to be cultured;
A cell image obtained by imaging the cell at a first magnification is obtained, and a colony region specifying unit that specifies a colony region of the cell in the cell image;
Based on information related to the maturity for each cell type, a region of interest determination unit that determines a portion of the region of interest in the colony region of the cell;
A cell image acquisition apparatus, comprising: a high-magnification image acquisition unit that acquires a high-magnification captured image obtained by imaging only the part of the region of interest at a second magnification higher than the first magnification.
細胞画像取得装置。 5. The cell image according to claim 2, wherein the region of interest determination unit determines a central portion in the colony region as the region of interest when the maturity of the cell is in a late stage. Acquisition device.
前記細胞を第1の倍率で撮像した細胞画像を取得し、該細胞画像内における前記細胞のコロニー領域を特定し、
前記細胞の種類毎の前記成熟度に関連する情報に基づいて、前記細胞のコロニー領域における一部の注目領域を決定し、
前記一部の注目領域のみを前記第1の倍率よりも高い第2の倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得することを特徴とする細胞画像取得方法。 Obtain information related to the maturity of the cells being cultured,
Obtaining a cell image of the cell imaged at a first magnification, identifying a colony region of the cell in the cell image;
Based on information related to the maturity for each cell type, determine a region of interest in the colony region of the cell,
A cell image acquisition method, comprising: acquiring a high-magnification captured image obtained by imaging only a part of the region of interest at a second magnification higher than the first magnification.
前記細胞を第1の倍率で撮像した細胞画像を取得し、該細胞画像内における前記細胞のコロニー領域を特定するコロニー領域特定部と、
前記細胞の種類毎の前記成熟度に関連する情報に基づいて、前記細胞のコロニー領域における一部の注目領域を決定する注目領域決定部と、
前記一部の注目領域のみを前記第1の倍率よりも高い第2の倍率で撮像した高倍率撮像画像を取得する高倍率画像取得部として機能させることを特徴とする細胞画像取得プログラム。 A maturity level information acquisition unit for acquiring information related to the maturity level of cells to be cultured;
A cell image obtained by imaging the cell at a first magnification is obtained, and a colony region specifying unit that specifies a colony region of the cell in the cell image;
Based on information related to the maturity for each cell type, a region of interest determination unit that determines a portion of the region of interest in the colony region of the cell;
A cell image acquisition program that functions as a high-magnification image acquisition unit that acquires a high-magnification captured image obtained by imaging only a part of the region of interest at a second magnification higher than the first magnification.
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