JP2018111079A - Lipid double membrane structure and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書の技術分野は、脂質二重膜構造体とその製造方法に関する。 The technical field of this specification relates to a lipid bilayer membrane structure and a method for producing the same.
生体膜は、脂質とタンパク質と糖質とから構成されている。脂質は、親水部分と疎水部分とを有する。そのため、脂質は、ミセルまたは脂質二重膜といった構造をとる。脂質二重膜は、生体膜を構成する主要な構造体である。そのため、脂質二重膜は、創薬、バイオチップ、バイオセンサー、といった技術分野での利用が期待されている。 Biological membranes are composed of lipids, proteins, and carbohydrates. Lipids have a hydrophilic portion and a hydrophobic portion. Therefore, the lipid has a structure such as a micelle or a lipid bilayer membrane. The lipid bilayer membrane is a main structure constituting a biological membrane. Therefore, lipid bilayer membranes are expected to be used in technical fields such as drug discovery, biochips, and biosensors.
脂質二重膜は、脂質が水中で取り得る最も安定な形状である。このような脂質二重膜のうち球形のリポソームと、平面状の脂質二重膜と、が知られている。例えば、特許文献１には、平面脂質二重膜を形成する技術が開示されている。 Lipid bilayers are the most stable form that lipids can take in water. Among such lipid bilayer membranes, spherical liposomes and planar lipid bilayer membranes are known. For example, Patent Document 1 discloses a technique for forming a planar lipid bilayer membrane.
しかし、球形のリポソームと平面状の脂質二重膜と以外の形状を保持している脂質二重膜構造体はほとんど知られていない。 However, few lipid bilayer structures that retain shapes other than spherical liposomes and planar lipid bilayers are known.
本明細書の技術は、前述した従来の技術が有する問題点を解決するためになされたものである。その課題とは、従来技術では製造することのできなかった形状の脂質二重膜構造体とその製造方法を提供することである。 The technique of this specification has been made to solve the problems of the conventional techniques described above. The problem is to provide a lipid bilayer membrane structure having a shape that could not be produced by the prior art and a method for producing the same.
第１の態様における脂質二重膜構造体の製造方法は、リン脂質が第１の水に分散している懸濁液を準備する懸濁液準備工程と、基材の上に懸濁液を供給する懸濁液供給工程と、基材の上にリン脂質の脂質二重膜を支持させる脂質二重膜支持工程と、脂質二重膜に過酸化水素を供給する過酸化水素供給工程と、を有する。 The method for producing a lipid bilayer structure in the first aspect includes a suspension preparation step of preparing a suspension in which phospholipids are dispersed in a first water, and a suspension on a substrate. A suspension supply step for supplying, a lipid bilayer support step for supporting a lipid bilayer of a phospholipid on a substrate, a hydrogen peroxide supply step for supplying hydrogen peroxide to the lipid bilayer, Have
この脂質二重膜構造体の製造方法においては、基材に支持されている脂質二重膜に過酸化水素を供給することにより、従来にはみられなかった３次元的形状を備える脂質二重膜構造体が得られる。脂質二重膜構造体の形状は、トーラス体形状もしくは円筒形状である。 In this method for producing a lipid bilayer structure, by supplying hydrogen peroxide to a lipid bilayer supported on a base material, a lipid bilayer having a three-dimensional shape that has not been seen in the past is provided. A membrane structure is obtained. The shape of the lipid bilayer structure is a torus shape or a cylindrical shape.
第２の態様における脂質二重膜構造体においては、脂質二重膜が３次元的構造を備えている。つまり、脂質二重膜がトーラス体形状もしくは円筒形状を保持している。 In the lipid bilayer membrane structure in the second embodiment, the lipid bilayer membrane has a three-dimensional structure. That is, the lipid bilayer membrane has a torus body shape or a cylindrical shape.
この脂質二重膜構造体は、例えば、その内部に高分子化合物を収容することができる。これにより、その高分子化合物を輸送する輸送体としての応用が期待される。最近では、リポソームが薬剤を輸送する輸送体として期待されているが、それとともにこの脂質二重膜構造体を輸送体とすることも可能である。 This lipid bilayer membrane structure can accommodate a polymer compound therein, for example. Thereby, application as a transporter for transporting the polymer compound is expected. Recently, liposomes are expected as transporters for transporting drugs, and it is also possible to use this lipid bilayer membrane structure as a transporter.
本明細書では、従来技術では製造することのできなかった形状の脂質二重膜構造体とその製造方法が提供されている。 The present specification provides a lipid bilayer structure having a shape that could not be produced by the prior art and a method for producing the same.
以下、具体的な実施形態について、脂質二重膜構造体とその製造方法を例に挙げて図を参照しつつ説明する。 Hereinafter, specific embodiments will be described with reference to the drawings, taking a lipid bilayer membrane structure and a production method thereof as examples.
（第１の実施形態）
１．脂質二重膜構造体
第１の実施形態の脂質二重膜構造体は、所定の３次元的構造を備えている。後述するように、この脂質二重膜構造体は、脂質二重膜に過酸化水素を供給することにより所定の３次元的形状を保持するようになったものである。これらの形状のうち第１の形状はトーラス体形状である。第２の形状は円筒形状である。本実施形態の脂質二重膜構造体は、トーラス体形状と円筒形状とのいずれかの形状を保持している。
(First embodiment)
1. Lipid bilayer structure The lipid bilayer structure of the first embodiment has a predetermined three-dimensional structure. As will be described later, this lipid bilayer structure has a predetermined three-dimensional shape by supplying hydrogen peroxide to the lipid bilayer. Of these shapes, the first shape is a torus body shape. The second shape is a cylindrical shape. The lipid bilayer structure of the present embodiment retains either a torus shape or a cylindrical shape.
１−１．第１の脂質二重膜構造体（トーラス体形状）
図１は、第１の脂質二重膜構造体１００の形状を示す平面図である。図２は、第１の脂質二重膜構造体１００の形状を示す側面図である。第１の脂質二重膜構造体１００は、トーラス体形状を保持している。第１の脂質二重膜構造体１００の外径Ｒｏ１は、３０ｎｍ以上８０ｎｍ以下である。第１の脂質二重膜構造体１００の内径Ｒｉ１は、５ｎｍ以上３５ｎｍ以下である。第１の脂質二重膜構造体１００の幅Ｗ１は、５ｎｍ以上３５ｎｍ以下である。これらの数値範囲は、例示である。そのため、外径Ｒｏ１等は、これらの数値範囲以外の数値であってもよい。
1-1. First lipid bilayer structure (torus shape)
FIG. 1 is a plan view showing the shape of the first lipid bilayer membrane structure 100. FIG. 2 is a side view showing the shape of the first lipid bilayer membrane structure 100. The first lipid bilayer membrane structure 100 maintains a torus body shape. The outer diameter Ro1 of the first lipid bilayer membrane structure 100 is not less than 30 nm and not more than 80 nm. The inner diameter Ri1 of the first lipid bilayer membrane structure 100 is not less than 5 nm and not more than 35 nm. The width W1 of the first lipid bilayer structure 100 is not less than 5 nm and not more than 35 nm. These numerical ranges are exemplary. Therefore, the outer diameter Ro1 or the like may be a numerical value outside these numerical ranges.
図３は、第１の脂質二重膜構造体１００の断面を示す概念図である。図３に示すように、第１の脂質二重膜構造体１００は、内側に疎水基を有するとともに外側に親水基を有する。第１の脂質二重膜構造体１００は、水中で安定に存在する。第１の脂質二重膜構造体１００の外側に親水基を有するためである。 FIG. 3 is a conceptual diagram showing a cross section of the first lipid bilayer membrane structure 100. As shown in FIG. 3, the first lipid bilayer structure 100 has a hydrophobic group on the inside and a hydrophilic group on the outside. The first lipid bilayer membrane structure 100 exists stably in water. This is because the first lipid bilayer structure 100 has a hydrophilic group on the outside.
１−２．第２の脂質二重膜構造体（円筒形状）
図４は、第２の脂質二重膜構造体２００の形状を示す平面図である。図５は、第２の脂質二重膜構造体２００の形状を示す側面図である。第２の脂質二重膜構造体２００は、円筒形状を保持している。第２の脂質二重膜構造体２００の外径Ｒｏ２は、３０ｎｍ以上８０ｎｍ以下である。第２の脂質二重膜構造体２００の内径Ｒｉ２は、５ｎｍ以上３５ｎｍ以下である。第２の脂質二重膜構造体２００の幅Ｗ２は、５ｎｍ以上３５ｎｍ以下である。第２の脂質二重膜構造体２００の高さＨ２は、５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下である。これらの数値範囲は、例示である。そのため、外径Ｒｏ２等は、これらの数値範囲以外の数値であってもよい。
1-2. Second lipid bilayer structure (cylindrical shape)
FIG. 4 is a plan view showing the shape of the second lipid bilayer membrane structure 200. FIG. 5 is a side view showing the shape of the second lipid bilayer membrane structure 200. The second lipid bilayer structure 200 has a cylindrical shape. The outer diameter Ro2 of the second lipid bilayer structure 200 is not less than 30 nm and not more than 80 nm. The inner diameter Ri2 of the second lipid bilayer structure 200 is not less than 5 nm and not more than 35 nm. The width W2 of the second lipid bilayer structure 200 is not less than 5 nm and not more than 35 nm. The height H2 of the second lipid bilayer structure 200 is not less than 50 nm and not more than 500 nm. These numerical ranges are exemplary. Therefore, the outer diameter Ro2 or the like may be a numerical value outside these numerical ranges.
また、第２の脂質二重膜構造体２００の断面も図３のようになっている。そのため、第２の脂質二重膜構造体２００は、内側に疎水基を有するとともに外側に親水基を有する。第２の脂質二重膜構造体２００は、水中で安定に存在する。第２の脂質二重膜構造体２００の外側に親水基を有するためである。 The cross section of the second lipid bilayer structure 200 is also as shown in FIG. Therefore, the second lipid bilayer structure 200 has a hydrophobic group on the inside and a hydrophilic group on the outside. The second lipid bilayer membrane structure 200 exists stably in water. This is because the second lipid bilayer structure 200 has a hydrophilic group outside.
２．脂質二重膜構造体の製造方法
２−１．懸濁液準備工程
ここで、リン脂質が第１の水に分散している懸濁液を準備する。
2. 2. Method for producing lipid bilayer membrane structure 2-1. Suspension preparation step Here, a suspension in which phospholipids are dispersed in the first water is prepared.
２−１−１．脂質準備工程
まず単離したリン脂質を準備する。リン脂質は、クロロホルム溶液の内部で保存されていることが多い。そのため、クロロホルム溶液とリン脂質との混合物からクロロホルムを蒸発させる。これにより、リン脂質が得られる。リン脂質として例えば、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを用いる。
2-1-1. Lipid preparation step First, an isolated phospholipid is prepared. Phospholipids are often stored inside a chloroform solution. Therefore, chloroform is evaporated from the mixture of chloroform solution and phospholipid. Thereby, a phospholipid is obtained. For example, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine is used as the phospholipid.
２−１−２．混合分散工程
次に、リン脂質と第１の水とを混合する。これにより、リン脂質と第１の水との混合物が作製される。ここで、第１の水は、純水である。次に、混合物を撹拌する。そして、リン脂質を第１の水の内部に十分に拡散させる。これにより、リン脂質が第１の水の内部に十分に分散している懸濁液が作製される。この段階で、懸濁液中にリン脂質のベシクルが生成されると考えられる。
2-1-2. Next, the phospholipid and the first water are mixed. Thereby, the mixture of phospholipid and 1st water is produced. Here, the first water is pure water. The mixture is then stirred. Then, the phospholipid is sufficiently diffused into the first water. As a result, a suspension in which the phospholipid is sufficiently dispersed inside the first water is produced. At this stage, it is believed that phospholipid vesicles are produced in the suspension.
２−２．懸濁液供給工程
次に、基材の上に懸濁液を供給する。この状態では、ベシクルが懸濁液中に分散している状態にある。ここで基材は、種々の基板である。基材として例えば、マイカ基板が挙げられる。または、基材は、固体であれば、その他の材質であってもよい。
2-2. Suspension supply process Next, a suspension is supplied on a base material. In this state, the vesicle is dispersed in the suspension. Here, the base material is various substrates. An example of the substrate is a mica substrate. Alternatively, the base material may be other materials as long as it is solid.
２−３．脂質二重膜支持工程（静置工程）
次に、基材の上で懸濁液を静置する。これにより、図６に示すように、懸濁液中のベシクルが基材の上に沈殿する。そして、ベシクルは、基材の上に沈殿する際に展開すると考えられる。つまり、基材の上にリン脂質の脂質二重膜を支持させるのである。
2-3. Lipid bilayer support process (stationary process)
Next, the suspension is allowed to stand on the substrate. Thereby, as shown in FIG. 6, the vesicle in suspension settles on a base material. And it is thought that a vesicle expand | deploys when it precipitates on a base material. That is, the lipid bilayer of phospholipid is supported on the base material.
２−４．過酸化水素供給工程
次に、基材の上の脂質二重膜に過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）を供給する。具体的には、基材の上に静置した懸濁液に過酸化水素を添加する。これにより、基材の上に展開している脂質二重膜の一部が、基材から剥がれるとともに円環状にまとまりだす。そして、脂質二重膜の一部が、トーラス体形状の第１の脂質二重膜構造体１００または円筒形状の第２の脂質二重膜構造体２００になる。
2-4. Hydrogen peroxide supply step Next, hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) is supplied to the lipid bilayer on the substrate. Specifically, hydrogen peroxide is added to the suspension that is allowed to stand on the substrate. As a result, a part of the lipid bilayer spread on the base material is peeled off from the base material and starts to form an annular shape. A part of the lipid bilayer becomes the torus body-shaped first lipid bilayer structure 100 or the cylindrical second lipid bilayer structure 200.
トーラス体形状の第１の脂質二重膜構造体１００と円筒形状の第２の脂質二重膜構造体２００とのどちらが生成されるかについては、基材から剥がれる面積や形状に依存すると考えられる。 Which of the torus body-shaped first lipid bilayer structure 100 and the cylindrical second lipid bilayer structure 200 is generated is considered to depend on the area and shape to be peeled from the base material. .
３．変形例
３−１．リン脂質の種類
本実施形態では、リン脂質として１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを用いている。しかし、これ以外のリン脂質を用いてもよい。例えば、ホスフィチジルコリン、ホスフィチジルセリン、ホスフィチジルエタノールアミン、ホスフィチジル酸、ホスフィチジルイノシトール、スフィンゴミエリン等が挙げられる。
3. Modification 3-1. Type of phospholipid In this embodiment, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine is used as the phospholipid. However, other phospholipids may be used. Examples include phosphitidylcholine, phosphitidylserine, phosphitidylethanolamine, phosphitidylic acid, phosphitidylinositol, sphingomyelin and the like.
３−２．脂質二重膜支持工程
本実施形態では、基材に供給した懸濁液を静置することにより脂質二重膜を基材に支持させる。しかし、帯電させた脂質二重膜またはベシクルの中心部に帯電粒子を有するものを用いる場合には、懸濁液に電界をかけることにより、リン脂質を基材の上に支持させることもできる。また、ベシクルを１箇所に集中させることもできる。
3-2. Lipid bilayer support step In this embodiment, the lipid bilayer membrane is supported on the base material by allowing the suspension supplied to the base material to stand. However, when using a charged lipid bilayer membrane or one having charged particles at the center of a vesicle, the phospholipid can be supported on the substrate by applying an electric field to the suspension. Also, vesicles can be concentrated in one place.
３−３．基材の洗浄
脂質二重膜支持工程の後に、懸濁液の上澄みを緩衝液等で洗浄してもよい。
3-3. Washing of Substrate After the lipid bilayer membrane supporting step, the supernatant of the suspension may be washed with a buffer solution or the like.
３−４．組み合わせ
これらの変形例等を自由に組み合わせてもよい。
3-4. Combination These modifications and the like may be freely combined.
４．本実施形態のまとめ
本実施形態の脂質二重膜構造体は、基材に支持されている脂質二重膜に過酸化水素を供給することにより得られる。第１の脂質二重膜構造体１００の形状はトーラス体形状である。第２の脂質二重膜構造体２００の形状は円筒形状である。そのため、例えば、これらを何らかの高分子化合物の輸送体として用いることができる。
4). Summary of this embodiment The lipid bilayer membrane structure of this embodiment is obtained by supplying hydrogen peroxide to a lipid bilayer membrane supported by a substrate. The shape of the first lipid bilayer membrane structure 100 is a torus body shape. The shape of the second lipid bilayer structure 200 is a cylindrical shape. Therefore, for example, these can be used as a transporter for some polymer compound.
（第２の実施形態）
第２の実施形態について説明する。第２の実施形態では、過酸化水素供給工程が第１の実施形態と異なっている。そのため、その異なる点について説明する。
(Second Embodiment)
A second embodiment will be described. In the second embodiment, the hydrogen peroxide supply step is different from that of the first embodiment. Therefore, the different points will be described.
１．脂質二重膜構造体の製造方法
１−１．脂質二重膜支持工程まで
第１の実施形態の脂質二重膜支持工程までを実施する。
1. 1. Production method of lipid bilayer membrane structure 1-1. Up to the lipid bilayer membrane supporting step The steps up to the lipid bilayer membrane supporting step of the first embodiment are carried out.
１−２．プラズマ照射水作製工程
第２の水に非平衡大気圧プラズマを照射することによりプラズマ照射水を作製する。第２の水は純水である。非平衡大気圧プラズマのプラズマガスは、例えばＡｒガスである。またはその他の希ガスであってもよい。プラズマガスは、希ガスの他にその他のガスを含んでいてもよい。大気圧プラズマは、大気中で窒素や酸素に由来する原子や分子、ラジカル等を発生させる。例えば、酸素に由来するラジカルが第２の水の内部に供給されることにより、第２の水の内部で過酸化水素が発生する。
1-2. Plasma irradiation water production process Plasma irradiation water is produced by irradiating the second water with non-equilibrium atmospheric pressure plasma. The second water is pure water. The plasma gas of non-equilibrium atmospheric pressure plasma is, for example, Ar gas. Or other rare gas may be sufficient. The plasma gas may contain other gases in addition to the rare gas. Atmospheric pressure plasma generates atoms, molecules, radicals and the like derived from nitrogen and oxygen in the atmosphere. For example, hydrogen radicals are generated inside the second water by supplying radicals derived from oxygen into the second water.
１−３．過酸化水素供給工程
次に、基板の上の懸濁液を静置したものにプラズマ照射水を添加する。前述のように、このプラズマ照射水は過酸化水素を含んでいる。したがって、第１の実施形態と同様に第１の脂質二重膜構造体１００または第２の脂質二重膜構造体２００が作製される。
1-3. Hydrogen peroxide supply process Next, plasma irradiation water is added to the suspension on the substrate. As described above, this plasma irradiation water contains hydrogen peroxide. Therefore, the first lipid bilayer structure 100 or the second lipid bilayer structure 200 is produced as in the first embodiment.
２．変形例
２−１．過酸化水素供給工程
懸濁液にプラズマ照射水を添加する代わりに、懸濁液に大気圧プラズマを直接照射してもよい。その場合であっても、懸濁液の内部に過酸化水素が発生するからである。
2. Modification 2-1. Hydrogen peroxide supply step Instead of adding plasma irradiation water to the suspension, the suspension may be directly irradiated with atmospheric pressure plasma. This is because even in that case, hydrogen peroxide is generated inside the suspension.
１．懸濁液の作製方法
まず、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを含んでいるクロロホルム溶液をガラスバイアルに入れた。次に、ガラスバイアルに窒素ブローした。これは、クロロホルムを蒸発させるためである。そして、ガラスバイアルの蓋を空けた状態でデシケーターに入れた。次にその状態でデシケーターを真空引きした。真空引きする時間は３０分であった。この真空引きによりクロロホルムはほとんど蒸発しきる。すなわち、純粋な１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅが得られる。
1. First, a chloroform solution containing 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine was placed in a glass vial. The glass vial was then blown with nitrogen. This is to evaporate chloroform. And it put into the desiccator in the state which opened the lid | cover of the glass vial. Next, the desiccator was evacuated in that state. The time for evacuation was 30 minutes. By this evacuation, chloroform is almost completely evaporated. That is, pure 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine is obtained.
次に、上記のガラスバイアルに超純水としてｍｉｌｌｉＱ水を入れた。これにより、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅと超純水との混合溶液が作製された。そして、チップソニケーターを用いて、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅを超純水中に分散させた。これにより、白濁していた混合溶液が透明になった。透明な混合溶液（懸濁液）では、１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅが十分に超純水中に分散している。 Next, milliQ water was added as ultrapure water to the glass vial. As a result, a mixed solution of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine and ultrapure water was produced. Then, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine was dispersed in ultrapure water using a chip sonicator. Thereby, the mixed solution which became cloudy became transparent. In the transparent mixed solution (suspension), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine is sufficiently dispersed in ultrapure water.
次に、十分に分散している懸濁液を小分けにして冷凍保存した。そして、実験に用いる分量だけ冷凍状態の懸濁液を溶解した。その際に、０．１０ｍｇ／ｍｌになるよう３８．４ｍＭの塩化マグネシウム水溶液で希釈した。そして、チップソニケーターを用いて１分間だけ超音波処理した。このようにして分散の十分な懸濁液（ベシクル懸濁液）が作製された。なお、この段階では、懸濁液に過酸化水素は添加されていない。 Next, the sufficiently dispersed suspension was aliquoted and stored frozen. Then, the frozen suspension was dissolved by an amount used for the experiment. In that case, it diluted with 38.4 mM magnesium chloride aqueous solution so that it might become 0.10 mg / ml. And it ultrasonicated only for 1 minute using the chip sonicator. In this way, a sufficiently dispersed suspension (vesicle suspension) was prepared. At this stage, hydrogen peroxide is not added to the suspension.
２．高速ＡＦＭ装置による観察方法
次に、高速ＡＦＭ装置（株式会社生体分子計測研究所製）を用いて脂質二重膜構造体を観察した。そのために、図７に示すような試料台を作製した。まず、マイカ基板をガラス台に接着剤を用いて接着した。接着剤が乾燥した後に、マイカ基板を劈開した。そして、ガラス台を高速ＡＦＭ装置のピエゾステージに接着した。次に、０．１０ｍｇ／ｍｌの懸濁液をマイカ基板の上に１．５μＬ滴下した。そして、常温で５分間だけ混合溶液を静置した。この段階で、リン脂質からなるベシクルがマイカ基板の上に展開したと考えられる。そして、緩衝液でマイカ基板の表面を洗浄した。ここで、緩衝液は、ＮａＯＨとＮａＣｌとを添加した５０ｍＭのＨＥＰＥＳであった。これにより、懸濁液の上澄みが除去された。この段階では、マイカ基板の上には脂質二重膜が残留していると考えられる。また、この段階では、脂質二重膜は平面形状であると考えられる。
2. Observation Method Using High-Speed AFM Apparatus Next, the lipid bilayer membrane structure was observed using a high-speed AFM apparatus (manufactured by Biomolecules Measurement Laboratory Co., Ltd.). For this purpose, a sample stage as shown in FIG. 7 was produced. First, the mica substrate was bonded to a glass table using an adhesive. After the adhesive was dried, the mica substrate was cleaved. The glass table was bonded to the piezo stage of the high-speed AFM apparatus. Next, 1.5 μL of a 0.10 mg / ml suspension was dropped onto the mica substrate. And the mixed solution was left still only for 5 minutes at normal temperature. At this stage, vesicles made of phospholipid are considered to have spread on the mica substrate. Then, the surface of the mica substrate was washed with a buffer solution. Here, the buffer was 50 mM HEPES to which NaOH and NaCl were added. This removed the supernatant of the suspension. At this stage, it is considered that the lipid bilayer remains on the mica substrate. At this stage, the lipid bilayer membrane is considered to have a planar shape.
次に、図８に示すような高速ＡＦＭ装置により脂質二重膜を観察した。観察溶液は、上記の緩衝液であった。そして、観察を開始するとともに観察溶液に過酸化水素（Ｈ2 Ｏ2 ）を添加した。これにより、マイカ基板の上の脂質二重膜に過酸化水素が供給されると考えられる。そして、脂質二重膜は、トーラス体形状もしくは円筒形状に変形した。 Next, the lipid bilayer was observed with a high-speed AFM apparatus as shown in FIG. The observation solution was the above buffer. Then, observation was started and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) was added to the observation solution. Thereby, it is thought that hydrogen peroxide is supplied to the lipid bilayer on the mica substrate. Then, the lipid bilayer membrane was deformed into a torus body shape or a cylindrical shape.
３．観察結果
３−１．過酸化水素添加前（平面形状）
図９は、基板上に展開している脂質二重膜のＡＦＭ画像（その１）である。図９の上段に、脂質二重膜の表面画像を示す。図９の下段に、上段の線に沿って測定された高さを示すグラフを示す。これ以降の図において、上段の表面画像と下段のグラフとの関係は、図９と同様である。図９に示すように、平面形状の脂質二重膜の膜厚は５ｎｍ程度である。
3. Observation result 3-1. Before adding hydrogen peroxide (planar shape)
FIG. 9 is an AFM image (part 1) of the lipid bilayer developed on the substrate. The upper part of FIG. 9 shows a surface image of the lipid bilayer membrane. A graph showing the height measured along the upper line is shown in the lower part of FIG. In the subsequent figures, the relationship between the upper surface image and the lower graph is the same as in FIG. As shown in FIG. 9, the thickness of the planar lipid bilayer membrane is about 5 nm.
図１０は、基板上に展開している脂質二重膜のＡＦＭ画像（その２）である。図１０の下段に示すように、脂質二重膜の表面は、非常に平坦である。 FIG. 10 is an AFM image (part 2) of the lipid bilayer developed on the substrate. As shown in the lower part of FIG. 10, the surface of the lipid bilayer membrane is very flat.
このように、観察溶液（緩衝液）を脂質二重膜に供給した段階では、脂質二重膜は平坦な形状のままである。つまり、緩衝液は脂質二重膜の形状変化に寄与しない。 Thus, at the stage where the observation solution (buffer solution) is supplied to the lipid bilayer membrane, the lipid bilayer membrane remains flat. That is, the buffer solution does not contribute to the shape change of the lipid bilayer membrane.
３−２．過酸化水素添加後の脂質二重膜構造体（トーラス体形状）
図１１は、トーラス体形状の脂質二重膜構造体を示すＡＦＭ画像である。図１１は、観察溶液に過酸化水素を添加した後の脂質二重膜を示している。図１１の上段および下段に示すように、脂質二重膜構造体がトーラス体形状であることが確認された。
3-2. Lipid bilayer structure after addition of hydrogen peroxide (torus shape)
FIG. 11 is an AFM image showing a toroidal lipid bilayer structure. FIG. 11 shows the lipid bilayer after addition of hydrogen peroxide to the observation solution. As shown in the upper and lower parts of FIG. 11, it was confirmed that the lipid bilayer structure has a torus body shape.
図１２は、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の外径をプロットしたグラフである。図１２の横軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体の外径（ｎｍ）である。図１２の縦軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体のサンプル数である。図１２に示すように、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の外径の平均値は４３．１ｎｍであった。 FIG. 12 is a graph plotting the outer diameter of a toroidal lipid bilayer membrane structure. The horizontal axis in FIG. 12 is the outer diameter (nm) of the toroidal lipid bilayer structure. The vertical axis in FIG. 12 represents the number of samples of the torus body-shaped lipid bilayer structure. As shown in FIG. 12, the average outer diameter of the toroidal lipid bilayer membrane structure was 43.1 nm.
図１３は、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の内径をプロットしたグラフである。図１３の横軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体の内径（ｎｍ）である。図１３の縦軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体のサンプル数である。図１３に示すように、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の内径の平均値は１３．８ｎｍであった。 FIG. 13 is a graph plotting the inner diameter of a toroidal lipid bilayer membrane structure. The horizontal axis in FIG. 13 is the inner diameter (nm) of the toroidal lipid bilayer structure. The vertical axis in FIG. 13 represents the number of samples of the torus body-shaped lipid bilayer structure. As shown in FIG. 13, the average inner diameter of the toroidal lipid bilayer structure was 13.8 nm.
図１４は、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の幅をプロットしたグラフである。図１４の横軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体の幅（ｎｍ）である。図１４の縦軸はトーラス体形状の脂質二重膜構造体のサンプル数である。図１４に示すように、トーラス体形状の脂質二重膜構造体の幅の平均値は１５．１ｎｍであった。 FIG. 14 is a graph plotting the width of a toroidal lipid bilayer structure. The horizontal axis of FIG. 14 is the width (nm) of the toroidal lipid bilayer structure. The vertical axis in FIG. 14 represents the number of samples of the toroidal lipid bilayer structure. As shown in FIG. 14, the average value of the width of the torus body-shaped lipid bilayer structure was 15.1 nm.
３−３．過酸化水素添加後の脂質二重膜構造体（円筒形状）
図１５は、円筒形状の脂質二重膜構造体を示すＡＦＭ画像である。図１５は、観察溶液に過酸化水素を添加した後の脂質二重膜を示している。円筒形状の脂質二重膜構造体の外径の平均値は４１．２ｎｍであった。図１５に示すように、円筒形状の脂質二重膜構造体の高さは、およそ２００ｎｍ程度であった。
3-3. Lipid bilayer structure after addition of hydrogen peroxide (cylindrical shape)
FIG. 15 is an AFM image showing a cylindrical lipid bilayer membrane structure. FIG. 15 shows the lipid bilayer after addition of hydrogen peroxide to the observation solution. The average outer diameter of the cylindrical lipid bilayer membrane structure was 41.2 nm. As shown in FIG. 15, the height of the cylindrical lipid bilayer structure was about 200 nm.
３−４．脂質二重膜構造体の成長過程
図１６は、脂質二重膜の時間的変化を示すＡＦＭ画像である。測定の都合上、所定の時刻（観察の開始時刻）を０秒とした。図１６に示すように、０秒の段階では、画像中の中央付近と右下付近にトーラス体形状の脂質二重膜構造体が存在している。そして、時間の経過とともに、中央付近のトーラス体形状の脂質二重膜構造体の右隣の位置に新たなトーラス体形状の脂質二重膜構造体が成長している様子が観察された。図１６に示すように、数秒という短い時間でトーラス体形状の脂質二重膜構造体が形成された。
3-4. Growth Process of Lipid Bilayer Structure FIG. 16 is an AFM image showing the temporal change of the lipid bilayer. For convenience of measurement, a predetermined time (observation start time) was set to 0 seconds. As shown in FIG. 16, at the 0 second stage, a torus body-shaped lipid bilayer structure exists near the center and near the lower right in the image. Then, with the passage of time, it was observed that a new torus-shaped lipid bilayer structure was growing at a position to the right of the torus-shaped lipid bilayer structure near the center. As shown in FIG. 16, a torus body-shaped lipid bilayer membrane structure was formed in a short time of several seconds.
１００…第１の脂質二重膜構造体
２００…第２の脂質二重膜構造体
DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 ... 1st lipid bilayer structure 200 ... 2nd lipid bilayer structure
Claims (7)
基材の上に前記懸濁液を供給する懸濁液供給工程と、
前記基材の上に前記リン脂質の脂質二重膜を支持させる脂質二重膜支持工程と、
前記脂質二重膜に過酸化水素を供給する過酸化水素供給工程と、
を有すること
を特徴とする脂質二重膜構造体の製造方法。 A suspension preparation step of preparing a suspension in which phospholipid is dispersed in the first water;
A suspension supplying step of supplying the suspension onto a substrate;
A lipid bilayer support step for supporting the lipid bilayer of the phospholipid on the substrate;
A hydrogen peroxide supply step of supplying hydrogen peroxide to the lipid bilayer;
A method for producing a lipid bilayer membrane structure, comprising:
前記過酸化水素供給工程では、
前記リン脂質をトーラス体形状もしくは円筒形状の脂質二重膜構造体とすること
を特徴とする脂質二重膜構造体の製造方法。 In the manufacturing method of the lipid bilayer structure of Claim 1,
In the hydrogen peroxide supply step,
A method for producing a lipid bilayer membrane structure, characterized in that the phospholipid is a torus body-shaped or cylindrical lipid bilayer membrane structure.
第２の水に大気圧プラズマを照射してプラズマ照射水を作製するプラズマ照射水作製工程を有し、
前記過酸化水素供給工程では、
前記懸濁液に前記プラズマ照射水を添加すること
を特徴とする脂質二重膜構造体の製造方法。 In the manufacturing method of the lipid bilayer membrane structure of Claim 1 or Claim 2,
Having a plasma irradiation water preparation step of generating plasma irradiation water by irradiating the second water with atmospheric pressure plasma,
In the hydrogen peroxide supply step,
A method for producing a lipid bilayer structure comprising adding the plasma irradiation water to the suspension.
前記過酸化水素供給工程では、
前記懸濁液に大気圧プラズマを直接照射すること
を特徴とする脂質二重膜構造体の製造方法。 In the manufacturing method of the lipid bilayer membrane structure of Claim 1 or Claim 2,
In the hydrogen peroxide supply step,
A method for producing a lipid bilayer structure, wherein the suspension is directly irradiated with atmospheric pressure plasma.
前記脂質二重膜がトーラス体形状もしくは円筒形状を保持していること
を特徴とする脂質二重膜構造体。 In a lipid bilayer structure in which the lipid bilayer has a three-dimensional structure,
The lipid bilayer membrane has a torus body shape or a cylindrical shape.
内径が５ｎｍ以上３５ｎｍ以下であること
を特徴とする脂質二重膜構造体。 In the lipid bilayer structure according to claim 5,
A lipid bilayer membrane structure having an inner diameter of 5 nm to 35 nm.
外径が３０ｎｍ以上８０ｎｍ以下であること
を特徴とする脂質二重膜構造体。 In the lipid bilayer membrane structure according to claim 5 or 6,
A lipid bilayer structure having an outer diameter of 30 nm to 80 nm.
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