JP2018095599A - Tau protein aggregation inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
ホルボールエステルを有効成分とするタウタンパク質の凝集抑制剤や、かかるタウタンパク質の凝集抑制剤を含有するタウタンパク質の凝集に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬に関する。 The present invention relates to a tau protein aggregation inhibitor containing phorbol ester as an active ingredient, and a medicament for preventing or treating neurodegenerative diseases caused by aggregation of tau protein containing such a tau protein aggregation inhibitor.
認知症患者の増加は先進国を中心とした世界的な医療問題である。日本でも今後の認知症患者の急激な増加が予想されており、２０年以内に３５０万人に達することや、６５歳以上の有病率が１０％以上に上ることが懸念されている。この認知症の患者のうち、およそ７割はアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ‘ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）の患者である。 The increase in patients with dementia is a global medical problem, especially in developed countries. In Japan, the number of dementia patients is expected to increase rapidly in the future, and there are concerns that it will reach 3.5 million within 20 years and that the prevalence rate for those over 65 years old will rise to 10% or more. About 70% of the patients with dementia are Alzheimer's disease patients.
アルツハイマー病に関与するタンパク質として、タウタンパク質とベータアミロイドタンパク質が知られている。タウタンパク質は、神経細胞内に存在し、微小管に結合する５５〜６０ｋＤのタンパク質である。かかるタウタンパク質が異常にリン酸化するとタウタンパク質の凝集体が形成され、神経原繊維変化と称される病変を生じる。一方、ベータアミロイドタンパク質は神経細胞外に存在し、凝集することで老人班と称される病変を生じる。 Tau protein and beta amyloid protein are known as proteins involved in Alzheimer's disease. Tau protein is a 55-60 kD protein that is present in neurons and binds to microtubules. When such tau protein is abnormally phosphorylated, aggregates of tau protein are formed, resulting in lesions called neurofibrillary tangles. On the other hand, beta amyloid protein is present outside the nerve cells and aggregates to cause lesions called senile plaques.
これまでの基礎研究からはベータアミロイド説が主流だったため、ベータアミロイドに対する抗体の樹立に基づくワクチン療法(ＡＮ―１７９２)や、ベータアミロイドを産生する酵素の阻害剤（ガンマ−セクレターゼ阻害剤：Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ）等の開発が進められてきた。しかしながら、老人斑が減少又は消失するにもかかわらず、前者のワクチン療法では認知機能の障害は進行し、後者の酵素阻害剤に至っては認知機能がより低下するという結果になってしまった。 From the basic research so far, the beta amyloid theory has been the mainstream, so vaccine therapy based on the establishment of antibodies against beta amyloid (AN-1792) and inhibitors of enzymes that produce beta amyloid (gamma-secretase inhibitors: Semagacestat) Etc. have been developed. However, despite the decrease or disappearance of senile plaques, cognitive impairment progressed with the former vaccine therapy, and the cognitive function decreased even with the latter enzyme inhibitors.
上記以外にも、これまでに神経変性疾患に対して様々な治療薬が開発されているが、実際に治療に使われているものはすべて対処療法のものであり、根治につながる治療薬の開発に成功していない。神経変性疾患はほぼすべてがアンメット・メディカル・ニーズであり、特に、アルツハイマー病においては、治療満足度、治療に対する薬剤の貢献度がいずれもワースト１の疾患に認定されている（非特許文献１参照）。そこで近年、タウタンパク質をターゲットとした認知症予防薬の開発がより進められている。 In addition to the above, various therapeutic drugs for neurodegenerative diseases have been developed so far, but all the drugs that are actually used for treatment are those for coping therapy, and the development of therapeutic drugs that lead to complete cure Not succeeded. Almost all neurodegenerative diseases are unmet medical needs. In particular, in Alzheimer's disease, treatment satisfaction and the contribution of drugs to treatment are both recognized as the worst disease (see Non-Patent Document 1). ). Therefore, in recent years, development of dementia preventive drugs targeting tau protein has been further promoted.
ところで、ホルボールエステルは、ジテルペンのチグリアンファミリーの天然の植物由来有機化合物であり、東南アジア原産のトウダイグサ科の葉状灌木であるクロトンチグリウム（Ｃｒｏｔｏｎ ｔｉｇｌｉｕｍ）の種に由来するクロトン油の加水分解生成物として、１９３４年に初めて単離されたものである。ホルボールの中で、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）は、複数の細胞系及び初代細胞における分化及び／又はアポトーシスの誘発因子と考えられており、悪性腫瘍や白血病、ＨＩＶ、パーキンソン病等の治療剤として用いることが開示されている（特許文献１、２参照）。しかしながら、かかるホルボールエステルとタウタンパク質の凝集との関係はこれまで知られていなかった。 By the way, phorbol ester is a natural plant-derived organic compound of the tiglian family of diterpenes, and hydrolyzed production of croton oil derived from Croton tiglium, a leafy shrub of Euphorbiaceae native to Southeast Asia. As a product, it was first isolated in 1934. Among phorbols, phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) is considered to be an inducer of differentiation and / or apoptosis in a plurality of cell lines and primary cells, and is considered to be a malignant tumor, leukemia, HIV, Parkinson It is disclosed that it is used as a therapeutic agent for diseases (see Patent Documents 1 and 2). However, the relationship between the phorbol ester and tau protein aggregation has not been known so far.
上述のように、これまでに神経変性疾患に対して様々な治療薬が開発されているが、実際に治療に使われているものはすべて対処療法のものであり、根治につながる治療薬の開発に成功していない。そこで本発明の課題は、アルツハイマー病や前頭側頭型認知症の原因とるタウタンパク質の凝集を抑制する剤を提供することにある。 As mentioned above, various therapeutic agents have been developed for neurodegenerative diseases so far, but what is actually used for treatment is for coping therapy, and development of therapeutic agents that lead to complete cure. Not succeeded. Then, the subject of this invention is providing the agent which suppresses the aggregation of the tau protein which causes Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.
本発明者は、まず認知機能障害の研究を進める中で、熱ショック転写因子Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １（ＨＳＦ１）がタウタンパク質の凝集に関与することを見出した。そこでさらに研究を進め、ＨＳＦ１の活性化に関与する物質を発明者らの経験と勘に基づき網羅的に調べたところ、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタートによりタウタンパク質の凝集を抑制可能であることを見出し、本発明を完成した。 The present inventor first found out that heat shock transcription factor Heat Shock Transcription Factor 1 (HSF1) is involved in tau protein aggregation during research on cognitive dysfunction. Therefore, further research was conducted, and the substances involved in the activation of HSF1 were comprehensively investigated based on the experiences and intuition of the inventors. As a result, phorbol 12-myristate 13-acetate can suppress tau protein aggregation. The present invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下に示すとおりのものである。
（１）ホルボールエステルを有効成分とするタウタンパク質の凝集抑制剤。
（２）ホルボールエステルが、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタートであることを特徴とする上記（１）記載のタウタンパク質の凝集抑制剤。
（３）上記（１）又は（２）記載のタウタンパク質の凝集抑制剤を含有するタウタンパク質の凝集に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬。
（４）神経変性疾患が、前頭側頭型認知症又はアルツハイマー病であることを特徴とする上記（３）記載の予防又は治療用医薬。
That is, the present invention is as follows.
(1) A tau protein aggregation inhibitor containing phorbol ester as an active ingredient.
(2) The tau protein aggregation inhibitor according to (1) above, wherein the phorbol ester is phorbol 12-myristate 13-acetate.
(3) A pharmaceutical for prevention or treatment of a neurodegenerative disease caused by aggregation of tau protein comprising the tau protein aggregation inhibitor according to (1) or (2).
(4) The preventive or therapeutic drug according to (3) above, wherein the neurodegenerative disease is frontotemporal dementia or Alzheimer's disease.
本発明により、タウタンパク質の凝集を抑制することが可能となる。また、タウタンパク質の凝集を抑制することにより、タウタンパク質の凝集に起因する神経変性疾患の予防又は治療を行うことが可能となる。 According to the present invention, aggregation of tau protein can be suppressed. Further, by suppressing aggregation of tau protein, it becomes possible to prevent or treat neurodegenerative diseases caused by aggregation of tau protein.
本発明のタウタンパク質の凝集抑制剤としては、ホルボールエステルを有効成分として含有していれば特に制限されず、ここで、タウタンパク質とは、神経細胞内に存在し、微小管に結合する５５〜６０ｋＤのタンパク質である。かかるタウタンパク質が異常にリン酸化することによってタウタンパク質の凝集体が形成される。 The tau protein aggregation inhibitor of the present invention is not particularly limited as long as it contains phorbol ester as an active ingredient. Here, tau protein is present in nerve cells and binds to microtubules. A protein of ˜60 kD. When such tau protein is abnormally phosphorylated, an aggregate of tau protein is formed.
本発明の他の態様としては、（１）ホルボールエステルを対象に投与することを特徴とするタウタンパク質の凝集抑制方法や、（２）タウタンパク質の凝集抑制剤として使用するための、ホルボールエステルや、（３）ホルボールエステルの、タウタンパク質の凝集抑制剤の調製における使用を挙げることができる。 As other aspects of the present invention, (1) a method for inhibiting aggregation of tau protein characterized by administering phorbol ester to a subject, and (2) phorbol for use as an aggregation inhibitor of tau protein Mention may be made of the use of esters and (3) phorbol esters in the preparation of tau protein aggregation inhibitors.
本発明において、ホルボールエステルとは、ホルボールの酸エステルであれば特に制限されず、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ）、ホルボール１２，１３−ジブチレート、ホルボール１２，１３−ジデカノエート、ホルボール１３−ブチレート、ホルボール１２−デカノエート、ホルボール１３−デカノエート、ホルボール１２，１３−ジアセタート、ホルボール１３，２０−ジアセタート、ホルボール１２，１３−ジベンゾアート、ホルボール１２，１３−ジヘキサノエート、ホルボール１２，１３−ジプロピオネート、ホルボール１２−ミリステート、ホルボール１３−ミリステート、ホルボール１２，１３，２０−トリアセタート、１２−デオキシホルボール１３−アンゲレート、１２−デオキシホルボール１３−アンゲレート２０‐アセタート、１２−デオキシホルボール１３−イソブチレート、１２−デオキシホルボール１３−イソブチレート２０−アセタート、１２−デオキシホルボール１３−フェニルアセタート、１２−デオキシホルボール１３−フェニルアセタート２０−アセタート、１２−デオキシホルボール１３−テトラデカノエート、ホルボール１２−チグリエート１３−デカノエート、１２−デオキシホルボール１３−アセタート、ホルボール１２−アセタート、ホルボール１３−アセタート等を挙げることができ、ＰＭＡを好適に挙げることができる。ＰＭＡはクロトン油などの天然植物から調製することや、化学的に合成することや、市販品を購入することによって得ることが可能である。 In the present invention, the phorbol ester is not particularly limited as long as it is an acid ester of phorbol, and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), phorbol 12,13-dibutyrate, phorbol 12,13-didecanoate, phorbol. 13-butyrate, phorbol 12-decanoate, phorbol 13-decanoate, phorbol 12,13-diacetate, phorbol 13,20-diacetate, phorbol 12,13-dibenzoate, phorbol 12,13-dihexanoate, phorbol 12,13-dipropionate, Phorbol 12-myristate, phorbol 13-myristate, phorbol 12,13,20-triacetate, 12-deoxyphorbol 13-angelate, 12-deoxyphorbol 3-angelate 20-acetate, 12-deoxyphorbol 13-isobutyrate, 12-deoxyphorbol 13-isobutyrate 20-acetate, 12-deoxyphorbol 13-phenylacetate, 12-deoxyphorbol 13-phenylacetate 20 -Acetate, 12-deoxyphorbol 13-tetradecanoate, phorbol 12-tiglyte 13-decanoate, 12-deoxyphorbol 13-acetate, phorbol 12-acetate, phorbol 13-acetate, etc. Preferably, it can be mentioned. PMA can be obtained from natural plants such as croton oil, chemically synthesized, or purchased commercially.
本発明のタウタンパク質の凝集に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬としては、上記本発明のタウタンパク質の凝集抑制剤を含んでいれば特に制限されず、ここで、タウタンパク質の凝集に起因する神経変性疾患とは、神経細胞内においてタウタンパク質の凝集によって認知機能が低下する疾患を意味する。かかる神経変性疾患としては、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（ＦＴＤｔｅｎｆｒｏｎｔｏｔｅｍｐｏｒａｌ ｌｏｂａｒ ｄｅｎｇｅｒａｔｉｏｎ）、ダウン症候群を挙げることができ、アルツハイマー病又は前頭側頭型認知症を好適に挙げることができる。前頭側頭型認知症（ＦＴＤＬ）は、臨床病型として主にＦＴＬＤ−ｔａｕ、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ、及びＦＴＬＤ−ＦＵＳに分類され、ＦＴＬＤ−Ｔｔａｕにはピック病、ＦＴＬＤ−１７、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、嗜銀顆粒性認知症（ＡＧＤ）、神経原線維変化型老年認知症（ＳＤ−ＮＦＴ）、ＭＳＴＤ、ＷＭＴ−ＧＧＩが含まれ、ＦＴＬＤ−ＴＤＰにはＦＴＤ−ＭＮＤ、ＦＴＤ−ＴＤＰが含まれ、ＦＴＬＤ−ＦＵＳにはａｔｙｐｉｃａｌ ＦＴＬＤ−Ｕ、ＢＩＢＤ、ＮＩＦＩＤが含まれる。 The medicament for preventing or treating neurodegenerative diseases caused by aggregation of tau protein of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described tau protein aggregation inhibitor of the present invention. The resulting neurodegenerative disease means a disease in which cognitive function is reduced by aggregation of tau protein in nerve cells. Examples of such neurodegenerative diseases include Alzheimer's disease, frontotemporal dementia (FTD) and down syndrome, and preferably include Alzheimer's disease or frontotemporal dementia. Frontotemporal dementia (FTDL) is mainly classified into FTLD-tau, FTLD-TDP, and FTLD-FUS as clinical disease types, and FTLD-Ttau includes Pick disease, FTLD-17, cortical basal ganglia degeneration. (CBD), progressive supranuclear palsy (PSP), taste-granular dementia (AGD), neurofibrillary tangle dementia (SD-NFT), MSTD, WMT-GGI, FTLD-TDP Includes FTD-MND and FTD-TDP, and FTLD-FUS includes typical FTLD-U, BIBD, and NIFID.
本発明のタウタンパク質の凝集抑制剤や、本発明のタウタンパク質の凝集に起因する神経変性疾患の予防又は治療用医薬には、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を含んでいてもよい。製剤の剤型としては散剤、顆粒剤等の固形製剤であってもよい。 The tau protein aggregation inhibitor of the present invention and the pharmaceutical agent for prevention or treatment of neurodegenerative diseases caused by aggregation of the tau protein of the present invention are usually used for formulation and pharmaceutically acceptable excipients. , Binders, lubricants, disintegrants, preservatives, isotonic agents, stabilizers, dispersants, antioxidants, colorants, flavoring agents, buffering agents, and the like. The dosage form of the preparation may be a solid preparation such as a powder or granule.
本発明の神経変性疾患の予防又は治療医薬の投与方法としては、所望の神経変性疾患の予防又は治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、経鼻投与、経肺投与等を挙げることができる。また、本発明の神経変性疾患の予防又は治療医薬の投与量は特に制限されず、被検者や被検動物の体調、病状、体重、年齢、性別等によって適宜調整することができる。１日あたりの投与量は、上記の投与方法のうちいずれを用いるかによって異なるが、感受性の違いを踏まえ、１０〜５００μｇ、好ましくは２０〜１００μｇ、より好ましくは４０〜６０μｇを挙げることができる。さらに、本発明の神経変性疾患の予防又は治療医薬を他の神経変性疾患の予防又は治療医薬と併用してもよい。本発明の神経変性疾患の予防又は治療医薬の投与回数や投与期間等も特に制限されず、１日あたりの投与量を１日１回又は数回に分けて投与することもできる。また投与対象の細胞、組織の由来や生体は特に制限されず、好ましくは哺乳類であり、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター等を例示することができ、好ましくはヒトを例示することができる。なお、ＰＭＡはすでに白血病、特に急性骨髄性白血病の治療に用いられており、例えば白血病の治療においては、患者から取り出した白血球をＰＭＡ２０μＭ及びイオノマイシンで処理したのち、患者の体内に戻す治療が定着している。 The method for administering the pharmaceutical agent for preventing or treating neurodegenerative disease of the present invention is not particularly limited as long as the desired effect of preventing or treating neurodegenerative disease is obtained, and is intravenous, oral, intramuscular, subcutaneous, Examples include transdermal administration, nasal administration, and pulmonary administration. Further, the dose of the pharmaceutical agent for preventing or treating neurodegenerative diseases of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately adjusted according to the physical condition, medical condition, body weight, age, sex, etc. of the subject or the subject animal. Although the daily dose varies depending on which of the above administration methods is used, it can be 10 to 500 μg, preferably 20 to 100 μg, more preferably 40 to 60 μg based on the difference in sensitivity. Furthermore, the preventive or therapeutic drug for neurodegenerative diseases of the present invention may be used in combination with another preventive or therapeutic drug for neurodegenerative diseases. There are no particular restrictions on the number of administrations or administration periods of the preventive or therapeutic drug for the neurodegenerative disease of the present invention, and the dose per day can be divided into once or several times per day. The origin of the cells and tissues to be administered and the living body are not particularly limited and are preferably mammals, and examples thereof include humans, monkeys, cows, horses, sheep, pigs, dogs, cats, rats, mice, hamsters and the like. Preferably, a human can be exemplified. PMA has already been used for the treatment of leukemia, particularly acute myeloid leukemia. For example, in the treatment of leukemia, the treatment of returning leukocytes extracted from a patient with PMA 20 μM and ionomycin and returning it to the patient's body has become established. ing.
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention more concretely, the technical scope of this invention is not limited to these illustrations.
＜１．変異型タウタンパク質導入細胞の作製＞
タウタンパク質の凝集抑制効果を解析するために、まずはタウタンパク質が凝集するモデル（細胞）を作製した。
<1. Production of Mutant Tau Protein-Introduced Cells>
In order to analyze the aggregation inhibitory effect of tau protein, a model (cell) in which tau protein aggregates was first prepared.
（タウ遺伝子クローニング）
ＤＭＥＭ培地（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）１０％及び抗生物質のペニシリンとストレプトマイシンを含む）で培養したヒト子宮頸がん細胞株のＨｅＬａ細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法によってヒトのタウタンパク質をコードするｃＤＮＡを得た。ＰＣＲに用いたフォワードプライマーの塩基配列を配列番号１に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号２に、得られたｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。得られたｃＤＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ法を用いて、タウタンパク質の４０６番目のアミノ酸であるアルギニンがトリプトファンに置き換わるように塩基の置換を行い、ヒトの変異型タウタンパク質をコードするｃＤＮＡを得た。置換のためのＰＣＲに用いたフォワードプライマーの塩基配列を配列番号４に、リバースプライマーの塩基配列を配列番号５に示す。ＰＣＲ産物は、ｃＤＮＡの塩基配列を調べて正しく変異が入っていることを確認した。かかるヒトの変異型タウタンパク質をコードするｃＤＮＡをｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターに組み込み、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６Ｗベクターを作製し、前記ｃＤＮＡのＣ末端側に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｃＤＮＡをつなげ、ＧＦＰの蛍光によって可視化出来るタウタンパク質が発現するようにした。さらに上記ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６ＷベクターをｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＣＭＶベクター、次いでＡｄ−Ｅａｓｙベクターに組み込み、ＨＥＫ２９３細胞で発現させ、上清及び細胞を回収してｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６Ｗアデノウイルスベクターを作製した。なお、配列番号３における１２４０番目の塩基は正常型では「ｃ」であるが、これが「ｔ」に変わることによってタウタンパク質の４０６番目のアミノ酸のアルギニン（Ｒ）がトリプトファン（Ｗ）に変化し（Ｒ４０６Ｗ：タウタンパク質はアイソフォームが６種類知られており、慣例によりアミノ酸番号は４４１アミノ酸型最長アイソフォームに準じる）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤＬ）の原因となる。
(Tau gene cloning)
Genomic DNA is extracted from HeLa cells of a human cervical cancer cell line cultured in DMEM medium (containing fetal bovine serum (FBS) 10% and antibiotics penicillin and streptomycin), and human tau protein is encoded by PCR. CDNA was obtained. The base sequence of the forward primer used for PCR is shown in SEQ ID NO: 1, the base sequence of the reverse primer is shown in SEQ ID NO: 2, and the base sequence of the obtained cDNA is shown in SEQ ID NO: 3. Using the obtained cDNA as a template, base substitution was performed using PCR to replace arginine, which is the 406th amino acid of tau protein, with tryptophan to obtain cDNA encoding human mutant tau protein. The base sequence of the forward primer used for PCR for substitution is shown in SEQ ID NO: 4, and the base sequence of the reverse primer is shown in SEQ ID NO: 5. The PCR product was confirmed to be correctly mutated by examining the base sequence of the cDNA. A cDNA encoding such a human mutant tau protein is incorporated into the pEGFP-N1 vector to prepare a pEGFP-N1-tauR406W vector, and the cDNA of green fluorescent protein (GFP) is connected to the C-terminal side of the cDNA, and the fluorescence of GFP The tau protein that can be visualized by is expressed. Furthermore, the pEGFP-N1-tauR406W vector was incorporated into the pShuttle-CMV vector and then the Ad-Easy vector, expressed in HEK293 cells, and the supernatant and cells were collected to prepare a pEGFP-N1-tauR406W adenovirus vector. In addition, although the 1240th base in SEQ ID NO: 3 is “c” in the normal type, arginine (R) of the 406th amino acid of tau protein changes to tryptophan (W) by changing this to “t” ( R406W: Tau protein has 6 known isoforms, and by convention, the amino acid number conforms to the 441 amino acid type longest isoform), which causes frontotemporal dementia (FTDL).
（細胞培養）
直径６ｃｍの培養皿に上記ＤＭＥＭ培地４ｍＬとマウス神経芽細胞Ｎｅｕｒｏ−２ａ細胞１×１０６個を入れ、一晩培養した。
(Cell culture)
In a culture dish having a diameter of 6 cm, 4 mL of the above DMEM medium and 1 × 10 6 mouse neuroblast Neuro-2a cells were placed and cultured overnight.
（Ｎｅｕｒｏ−２ａの分化）
細胞を入れて２４時間培養したＮｅｕｒｏ−２ａの培養液を２％のＦＢＳと２０μＭのレチノイン酸を含む培地に交換し、７２時間培養した。
(Differentiation of Neuro-2a)
The culture solution of Neuro-2a that had been cultured for 24 hours after putting the cells was replaced with a medium containing 2% FBS and 20 μM retinoic acid, and cultured for 72 hours.
＜２．変異型タウタンパク質の凝集体形成＞
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６Ｗアデノウイルスベクターを、分化したＮｅｕｒｏ−２ａの培地に加えて６時間感染させた。得られた変異型タウタンパク質導入細胞の蛍光顕微鏡写真を図１に示す。
<2. Aggregate formation of mutant tau protein>
The pEGFP-N1-tauR406W adenoviral vector was added to the differentiated Neuro-2a medium and infected for 6 hours. A fluorescence micrograph of the obtained mutant tau protein-introduced cell is shown in FIG.
図１に示すように、変異型タウタンパク質は培養神経芽細胞において凝集体を形成することが明らかとなった。 As shown in FIG. 1, it was revealed that the mutant tau protein forms an aggregate in cultured neuroblasts.
＜活性型ＨＳＦ１による凝集抑制＞
分化したＮｅｕｒｏ−２ａ培養培地に上記変異型タウタンパク質導入細胞を培養してから６時間後に、発明者らが作製したアデノウイルスで発現する活性化型ＨＳＦ１（Ａｄ−ＨＳＦ１ ＲＤＴ：Nakai et al., EMBO J 19:1545-1554(2000)）をそれぞれ０、２．０、８．０、２０．０×１０６ｐｆｕ／ｍＬの濃度となるように加えて２４時間培養した。さらに、培養後の細胞を遠心分離にて回収してペレットにしたのち、ＮＰ４０（ナカライ社製）を含む緩衝液で破砕し、変異タウタンパク質溶液を作製した後、発明者らが作製した抗ＨＳＦ１抗体ＨＳＦ１ｊ（Fujimoto et al., Molecular Cell 48:182-194(2012)）、抗ＧＦＰ抗体（ナカライ社製）、及び抗ベータアクチン抗体（Sigma-aldrich社製）を用いて可溶性のタウタンパク質及び不溶化して細胞内に沈殿したタウタンパク質の量を検出した。さらに、これらの細胞を回収し、同時に、ウェスタンブロットをそれぞれの細胞を用いて行い、可溶性のタウタンパク質及び不溶化して細胞内に沈殿したタウタンパク質の量を比較した。結果を図２に示す。
<Inhibition of aggregation by active HSF1>
Six hours after culturing the above-mentioned mutant tau protein-introduced cells in a differentiated Neuro-2a culture medium, activated HSF1 expressed by the inventors (Ad-HSF1 RDT: Nakai et al., EMBO J 19: 1545-1554 (2000)) was added at concentrations of 0, 2.0, 8.0 and 20.0 × 10 6 pfu / mL, respectively, and cultured for 24 hours. Furthermore, after the cultured cells were collected by centrifugation and pelleted, they were crushed with a buffer containing NP40 (manufactured by Nacalai) to prepare a mutant tau protein solution, and then the anti-HSF1 prepared by the inventors. Soluble tau protein and insolubilization using antibody HSF1j (Fujimoto et al., Molecular Cell 48: 182-194 (2012)), anti-GFP antibody (Nacalai), and anti-beta actin antibody (Sigma-aldrich) Thus, the amount of tau protein precipitated in the cells was detected. Furthermore, these cells were collected, and at the same time, Western blotting was performed using each cell, and the amounts of soluble tau protein and insoluble and precipitated tau protein were compared. The results are shown in FIG.
図２（ａ）は、培養後の凝集体を有する細胞の割合を調べた結果であり、図２（ｂ）はウェスタンブロット解析の結果である。図２（ａ）の結果により、活性型ＨＳＦ１の濃度が高まるにつれて、細胞内のヒト変異タウタンパク質の凝集が抑制されることが、図２（ｂ）の結果により、活性型ＨＳＦ１の濃度が高まるにつれて不溶性のヒト変異タウタンパク質が減少していることが明らかとなった。 FIG. 2 (a) shows the results of examining the proportion of cells having aggregates after culture, and FIG. 2 (b) shows the results of Western blot analysis. From the result of FIG. 2 (a), as the concentration of active HSF1 increases, the aggregation of intracellular human mutant tau protein is suppressed. The result of FIG. 2 (b) increases the concentration of active HSF1. It became clear that insoluble human mutant tau protein decreased with time.
＜ＰＭＡによる凝集抑制＞
上記図２の結果より、活性型ＨＳＦ１がヒト変異タウタンパク質の凝集と関与することが明らかとなった。そこで本発明者は、ＨＳＦ１の上流又は下流の経路に関与する膨大な因子の中にタウタンパク質の凝集を抑制する物質があるのではないかと考え、発明者の長年の経験と勘に基づき化合物を絞り込み、ＰＭＡがヒトタウタンパク質の凝集と関与するのではないかと考え、ＰＭＡによる凝集抑制効果を調べた。
<Inhibition of aggregation by PMA>
From the results of FIG. 2 above, it was revealed that active HSF1 is involved in the aggregation of human mutant tau protein. Therefore, the present inventor considered that there is a substance that suppresses aggregation of tau protein among the enormous factors involved in the upstream or downstream pathway of HSF1, and based on the inventor's many years of experience and intuition Narrowing down and considering that PMA might be involved in the aggregation of human tau protein, the aggregation inhibitory effect of PMA was investigated.
（ＰＭＡの添加）
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解したＰＭＡ（Sigma-Aldrich社製）を終濃度２０μＭになるように、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６Ｗアデノウイルスベクター添加と同時に、又は、ベクター添加から６時間後に分化したＮｅｕｒｏ−２ａ培養培地へ加えた。ＰＭＡを加えないコントロールとして、体積が同量となるようにＤＭＳＯを加えた。
(Addition of PMA)
Neuro-2a differentiated at the same time as pEGFP-N1-tauR406W adenovirus vector addition or 6 hours after addition of PMA (Sigma-Aldrich) dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) to a final concentration of 20 μM. Added to the culture medium. As a control without adding PMA, DMSO was added so that the volume was the same.
（ＰＭＡの効果の判定）
蛍光を指標にして変異型タウタンパク質を発現した細胞を数え、次いで、その内、細胞内に凝集体を生じている細胞の数を数えた。さらに、ＰＭＡを添加していない細胞と添加した細胞の両方で、凝集体を生じた細胞の割合を比較した。ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６Ｗアデノウイルスベクター添加と同時にＰＭＡをＮｅｕｒｏ−２ａ培養培地に加えた場合の結果を図３に、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６Ｗアデノウイルスベクター添加から６時間後にＰＭＡを培地に加えた場合の結果を図４に示す。
(Determination of PMA effect)
Cells that expressed the mutant tau protein were counted using fluorescence as an index, and then the number of cells that produced aggregates in the cells was counted. Furthermore, the proportion of cells that produced aggregates was compared in both the cells to which PMA was not added and the cells to which PMA was added. The results when PMA was added to the Neuro-2a culture medium simultaneously with the addition of the pEGFP-N1-tauR406W adenoviral vector are shown in FIG. 3, and when PMA was added to the medium 6 hours after the addition of the pEGFP-N1-tauR406W adenoviral vector. The results are shown in FIG.
図３に示すように、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６Ｗアデノウイルスベクター添加と同時にＰＭＡを培地に加えた場合も、図４に示すようにｐＥＧＦＰ−Ｎ１−ｔａｕＲ４０６Ｗアデノウイルスベクター添加から６時間後にＰＭＡを培地に加えた場合にも、凝集体を生じた細胞の割合が減少していた。したがって、ＰＭＡにより、タウタンパク質の凝集を抑制することや、タウタンパク質の凝集を分解することが可能であることが明らかとなった。なお、通常ＰＭＡはイオノマイシンと併用して特定のタンパク質を刺激する場合に用いられていたが、図３、４の結果から、イオノマイシンと併用せずにＰＭＡ単独であってもタウタンパク質の凝集抑制効果があることが明らかとなった。 As shown in FIG. 3, when PMA was added to the medium simultaneously with the addition of the pEGFP-N1-tauR406W adenoviral vector, PMA was added to the medium 6 hours after the addition of the pEGFP-N1-tauR406W adenoviral vector as shown in FIG. When added, the proportion of cells that produced aggregates was also reduced. Therefore, it became clear that PMA can suppress aggregation of tau protein and can decompose aggregation of tau protein. In addition, PMA was usually used when stimulating a specific protein in combination with ionomycin. From the results shown in FIGS. 3 and 4, the effect of inhibiting the aggregation of tau protein even when PMA alone is not used in combination with ionomycin. It became clear that there was.
タウタンパク質が凝集すると、神経原線維変化と呼ばれる構造物を形成し、これが神経細胞死を引き起こし、この神経細胞死が、アルツハイマー病や前頭側頭型認知症に代表される神経変性疾患および認知症を引き起こすことが多くの研究から示されている。上記図３、４の結果より、ＰＭＡを用いれば、タウタンパク質の凝集の抑制だけでなく分解も可能である。したがって、本発明のＰＭＡを用いることにより、アルツハイマー病等の神経変性疾患の予防又は治療、好ましくは予防及び治療をすることが可能となる。 Aggregation of tau proteins forms structures called neurofibrillary tangles that cause neuronal cell death, which is a neurodegenerative disease and dementia typified by Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Many studies have shown that it can cause From the results shown in FIGS. 3 and 4, when PMA is used, not only suppression of aggregation of tau protein but also decomposition can be performed. Therefore, by using the PMA of the present invention, it becomes possible to prevent or treat neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, preferably prevention and treatment.
本発明は、アルツハイマー病や前頭側頭型認知症等の神経変性疾患の治療又は予防分野で利用可能である。 The present invention can be used in the field of treatment or prevention of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.
Claims (4)
The preventive or therapeutic drug according to claim 3, wherein the neurodegenerative disease is frontotemporal dementia or Alzheimer's disease.
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