JP2018093756A - Improved method for screening enterobacteria - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、核酸増幅による糞便試料中の食中毒原因菌のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a screening method for food poisoning causative bacteria in a stool sample by nucleic acid amplification.
核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化レベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術である。代表的な核酸増幅法は、PCR(Polymerase Chain Reaction)である。PCRは、(1)熱処理によるDNA変性(2本鎖DNAから1本鎖DNAへの解離)、(2)鋳型1本鎖DNAへのプライマーのアニーリング、(3)DNAポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という3ステップを1サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。 The nucleic acid amplification method is a technique for amplifying several copies of a target nucleic acid to a visualization level, that is, several hundred million copies or more. A typical nucleic acid amplification method is PCR (Polymerase Chain Reaction). PCR includes (1) DNA denaturation by heat treatment (dissociation from double-stranded DNA to single-stranded DNA), (2) annealing of primer to template single-stranded DNA, (3) the primer using DNA polymerase This is a method of amplifying a target nucleic acid in a sample by repeating three cycles of three steps of extension as one cycle.
PCR技術を用いた検査は遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、広く利用されている。PCR増幅産物の検出には、電気泳動をすることなく、簡便に微量核酸の検出が可能なリアルタイムPCR法が広く利用されている。 Tests using PCR technology are widely used in the field of forensic medicine such as genetic diagnosis and clinical diagnosis, or microbiological tests in foods and the environment. For the detection of PCR amplification products, a real-time PCR method that can easily detect a small amount of nucleic acid without performing electrophoresis is widely used.
食中毒を予防する上で、食中毒原因菌の保菌者を早期に発見することは重要である。そのため、食品調理従事者に対しては、食中毒原因菌であるサルモネラ、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌の検査が行われている。従来、サルモネラ、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌の検査は、塗沫培養法により行われてきた。具体的には、検体を所定条件下において培養してある程度まで増殖させた後、検出したい細菌類のみが増殖し得るような選択培地中で培養を行い、増殖によってできたコロニーを観察することによって検出するという方法である。 In preventing food poisoning, it is important to find a carrier of a food poisoning germ at an early stage. For this reason, food cooks are inspected for Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella that are food poisoning causative bacteria. Conventionally, Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella have been tested by a smear culture method. Specifically, after culturing the specimen under a predetermined condition and growing to a certain extent, culturing in a selective medium that allows only the bacteria to be detected to grow, and observing the colonies formed by the growth It is a method of detecting.
しかしながら、このような従来の方法では、(1)培養工程を経るため、結果が得られるまでに時間がかかる点、(2)検出感度が低い点、及び(3)コロニーの観察結果に基づいて客観的な判定を下すのは難しいため、検出結果の客観性を担保するのが難しい点等の問題点があった。 However, in such a conventional method, based on (1) the culturing step, it takes time until results are obtained, (2) low detection sensitivity, and (3) colony observation results. Since it is difficult to make an objective determination, there are problems such as difficulty in ensuring the objectivity of the detection result.
そこで、塗沫培養法の問題点を解決するためにPCR法を用いた検出方法が開発されてきた(非特許文献1)。PCR法では、(1)培養工程を経ないため迅速に検出できる、(2)検出感度が高い、(3)検出対象の細菌類の有無を、目的のDNAが増幅したか否かで判定するので、客観性をもって細菌類を検出できる等の利点がある。 In order to solve the problems of the smear culture method, a detection method using the PCR method has been developed (Non-patent Document 1). In the PCR method, (1) it can be detected quickly because it does not go through the culturing step, (2) it has high detection sensitivity, and (3) it is determined whether the target DNA has been amplified by whether or not the target DNA has been amplified. Therefore, there is an advantage that bacteria can be detected objectively.
食中毒原因菌の検便検査は、初めにPCR法にてスクリーニングを行い、陰性検体を除いた後、塗沫培養法により陽性検体の確定検査がされるのが一般的である(非特許文献2)。また、健常人の検便検査では、食中毒原因菌の保菌率は非常に低く、検体の大部分が陰性となる。迅速な判定のため、PCR法によるスクリーニングには、一般的に10検体から50検体程度を1プールとしたプール糞便が用いられる(特許文献1)。プール糞便からPCR法によりスクリーニングを実施後、陽性プールに含まれる各検体を個別に塗抹培養することによって陽性検体を確定する。 The stool test for food poisoning causal bacteria is generally performed by first screening by the PCR method, removing the negative sample, and then performing a definite test for the positive sample by the smear culture method (Non-patent Document 2). . In addition, in the stool test of healthy people, the retention rate of food poisoning causative bacteria is very low, and the majority of specimens are negative. In order to make a rapid determination, pooled stool is generally used for screening by the PCR method, with about 10 to about 50 samples as one pool (Patent Document 1). After screening from the pool stool by PCR, positive specimens are determined by smearing each specimen contained in the positive pool individually.
PCR法によるスクリーニングは、糞便試料中からのDNAの抽出作業を省略し、検体懸濁液の熱処理したサンプルをPCRに供することによって、食中毒原因菌の有無を検出する手法がとられている。この際、DNAの抽出を省略することで、糞便試料中には含まれる、多糖類などのPCR反応阻害物質が持ち込まれる。そこで、これらの影響を低減するような種々の工夫がなされている。 Screening by the PCR method is a method of detecting the presence or absence of food poisoning causative bacteria by omitting the DNA extraction operation from the stool sample and subjecting the sample suspension subjected to heat treatment to PCR. At this time, by omitting DNA extraction, a PCR reaction inhibiting substance such as a polysaccharide contained in the stool sample is brought in. Therefore, various ideas have been made to reduce these effects.
サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌を対象にしたPCR法による検便検査のための試薬は、島津製作所製「腸管系病原菌遺伝子検出試薬キット」、タカラバイオ製「TaKaRa腸管系病原細菌遺伝子検出キット」、東洋紡製「腸内細菌遺伝子検出キット―高速蛍光検出―」などが市販されている。 Reagents for stool examination by PCR for Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli, Shigella are “Intestinal pathogen gene detection reagent kit” manufactured by Shimadzu Corporation, “TaKaRa enteropathogenic bacteria gene detection kit” manufactured by Takara Bio. Toyobo's “Intestinal Bacterial Gene Detection Kit—High-Speed Fluorescence Detection” is commercially available.
これらの市販キットは、PCR反応後に融解曲線解析を実施し、融解曲線解析結果のTm値の違いにより陽性菌種を判定する。融解曲線解析では、ある菌種に対応するピークが検出され陽性判定となった場合、検出されなかった菌種が陰性判定であると確定することが不可能である(非特許文献3)。複数の菌種が含まれるプール糞便(共感染プール)において、増幅の優劣により検出できない場合があるためである。そのため、陽性プールに含まれる個々の検体に対して、各菌種検出用培地に塗抹する必要があった。 These commercial kits perform melting curve analysis after the PCR reaction, and determine the positive bacterial species based on the difference in Tm value of the melting curve analysis result. In melting curve analysis, when a peak corresponding to a certain bacterial species is detected and a positive determination is made, it is impossible to determine that a bacterial species that has not been detected is a negative determination (Non-Patent Document 3). This is because, in a pooled stool (co-infected pool) containing a plurality of bacterial species, it may not be detected due to superiority or inferiority of amplification. Therefore, it was necessary to smear each specimen contained in the positive pool on each bacterial species detection medium.
また、これらの市販キットは50検体を1プールとしてスクリーニングが行われる。PCRによるスクリーニング後、陽性となったプールに含まれる各検体を個別に塗抹培養することで陽性検体が確定される。市販キットのPCRキットを用いたスクリーニングによる陽性率はおおよそ10%程度であり、90%程度の陰性検体を確定することが可能である。しかしながら、50検体をプールしているため、陽性プールのみを選抜しても、その中の98%は陰性検体である。そのため、スクリーニング効率を改善し、陰性検体の早期確定と、陽性検体の更なる絞り込みが求められている。 In addition, these commercially available kits are screened using 50 specimens as one pool. After screening by PCR, positive specimens are determined by smearing each specimen contained in the positive pool individually. The positive rate by screening using a commercially available PCR kit is about 10%, and about 90% of negative samples can be determined. However, since 50 samples are pooled, even if only positive pools are selected, 98% of them are negative samples. Therefore, screening efficiency is improved, early determination of negative samples and further narrowing down of positive samples are required.
本発明の目的は、検便検査のスクリーニング効率を改善し、陰性検体の早期確定と、陽性検体を更に絞り込むことを目的とする。 An object of the present invention is to improve screening efficiency of a stool test, to early determine negative samples, and to further narrow down positive samples.
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、プール糞便からマルチプレックスPCR法を用いて一次スクリーニングを行った後、陽性プールのみを対象に二次スクリーニングを実施することで、陽性検体の絞り込みが容易に可能であることを見出した。また、一次スクリーニングに、蛍光プローブを用いて各菌種を分離検出できる方法を採用することで、より効率よくスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。 In light of the above circumstances, the present inventors conducted extensive research, and after conducting primary screening using multiplex PCR method from pool feces, by carrying out secondary screening only for positive pools, It was found that it is possible to narrow down positive specimens easily. Further, by adopting a method capable of separating and detecting each bacterial species using a fluorescent probe for primary screening, it has been found that screening can be performed more efficiently, and the present invention has been completed.
すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項1.糞便試料中におけるサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌(EHEC)および赤痢菌の3菌種のうちいずれかの菌種の有無を検査する方法であって、次の(1)から(5)までの工程を含むことを特徴とする検査方法。
(1)X個(Xは10以上の整数を示す。)の便検体懸濁液をプールし、プール糞便を作製する工程
(2)工程(1)にて作製したプール糞便を用いて、前記3菌種をターゲットとするマルチプレックスPCRにて1次スクリーニングを行う工程
(3)工程(2)によって、前記3菌種のいずれかの菌種が陽性となったプール糞便を選抜する工程
(4)工程(3)により選抜されたプール糞便に使用した個々の糞便を用いて、さらにY個(YはXよりも小さい整数を示す。)の便検体懸濁液からなるプール糞便を作成する工程
(5)工程(4)により作製したプール糞便を用いて、前記3菌種のうちいずれか1菌種をターゲットとするPCRにより2次スクリーニングを行う工程
項2.工程(2)のマルチプレックスPCRにおいて、蛍光プローブの蛍光波長の違いを利用することにより、陽性の菌種を特定する項1に記載の検査方法。
項3.1次スクリーニング方法が前記3菌種のうちの2種以上の菌種が存在するプール糞便から各菌種を分離検出する項1または2に記載の検査方法。
項4.前記Xが20以上の整数である項1から3のいずれかに記載の検査方法。
項5.前記Yが30以下の整数である項1から4のいずれかに記載の検査方法。
項6.工程(2)のマルチプレックスPCRに用いる試薬に内部標準遺伝子を含むことを特徴とする項1から5のいずれかに記載の検査方法。
項7.工程(5)のPCRに用いる試薬に内部標準遺伝子を含むことを特徴とする項1から6のいずれかに記載の検査方法。
That is, the present invention has the following configuration.
Item 1. A method for examining the presence or absence of any one of three species of Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella in a stool sample, comprising the following steps (1) to (5) An inspection method characterized by comprising.
(1) Pooling stool specimen suspensions of X pieces (X represents an integer of 10 or more) and producing pooled stool (2) Using the pooled stool prepared in step (1), Step (3) of performing primary screening by multiplex PCR targeting three bacterial species (3) Step of selecting pool feces in which any one of the three bacterial species is positive (4) ) Using the individual stool used for the pool stool selected in step (3), further creating a pool stool comprising Y stool specimen suspensions (Y is an integer smaller than X) (5) A step of performing secondary screening by PCR using one of the three bacterial species as a target, using the pooled stool prepared by the step (4). Item 2. The inspection method according to Item 1, wherein in the multiplex PCR in step (2), a positive bacterial species is identified by utilizing a difference in fluorescence wavelength of the fluorescent probe.
Item 3. The test method according to Item 1 or 2, wherein the primary screening method separates and detects each bacterial species from pooled feces in which two or more of the three bacterial species are present.
Item 4. Item 4. The inspection method according to any one of Items 1 to 3, wherein X is an integer of 20 or more.
Item 5. Item 5. The inspection method according to any one of Items 1 to 4, wherein Y is an integer of 30 or less.
Item 6. Item 6. The test method according to any one of Items 1 to 5, wherein the reagent used for the multiplex PCR in step (2) contains an internal standard gene.
Item 7. Item 7. The inspection method according to any one of Items 1 to 6, wherein the reagent used for PCR in the step (5) contains an internal standard gene.
本発明のスクリーニング方法によって、より多くの陰性検体を早期に確定することができる。また、塗抹培養の枚数を削減することが可能であることから、検査の効率化が可能である。 With the screening method of the present invention, more negative specimens can be determined early. In addition, since the number of smear cultures can be reduced, the efficiency of the inspection can be improved.
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail while showing embodiments of the present invention.
本発明の検査方法は、以下のような工程(1)から(5)までを含むことを特徴とする。その結果、糞便試料中におけるサルモネラ菌、腸管出血性大腸菌(EHEC)および赤痢菌の3菌種のうちいずれかの菌種の有無を効率的に検査することが可能となる。
(1)X個(Xは10以上の整数を示す。)の便検体懸濁液をプールし、プール糞便を作製する工程
(2)工程(1)にて作製したプール糞便を用いて、前記3菌種をターゲットとするマルチプレックスPCRにて1次スクリーニングを行う工程
(3)工程(2)によって、前記3菌種のいずれかの菌種が陽性となったプール糞便を選抜する工程
(4)工程(3)により選抜されたプール糞便に使用した個々の糞便を用いて、さらにY個(YはXよりも小さい整数を示す。)の便検体懸濁液からなるプール糞便を作成する工程
(5)工程(4)により作製したプール糞便を用いて、前記3菌種のうちいずれか1菌種をターゲットとするPCRにより2次スクリーニングを行う工程
The inspection method of the present invention includes the following steps (1) to (5). As a result, the presence or absence of any one of the three bacterial species of Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella in the stool sample can be efficiently examined.
(1) Pooling stool specimen suspensions of X pieces (X represents an integer of 10 or more) and producing pooled stool (2) Using the pooled stool prepared in step (1), Step (3) of performing primary screening by multiplex PCR targeting three bacterial species (3) Step of selecting pool feces in which any one of the three bacterial species is positive (4) ) Using the individual stool used for the pool stool selected in step (3), further creating a pool stool comprising Y stool specimen suspensions (Y is an integer smaller than X) (5) A step of performing secondary screening by PCR targeting any one of the three bacterial species using the pool feces prepared in step (4)
PCR反応液に供する検体として、検便検査等の糞便試料から、75℃から100℃、より好ましくは85℃から95℃で30秒から20分、さらに好ましくは3分から10分の熱処理を行い食中毒原因菌を不活化させた検体が挙げられるが、特に限定はされない。 As a sample to be used in the PCR reaction solution, a food poisoning cause is obtained by performing a heat treatment from a stool sample such as a stool test at 75 ° C. to 100 ° C., more preferably 85 ° C. to 95 ° C. for 30 seconds to 20 minutes, more preferably 3 minutes to 10 minutes. Although the sample which inactivated the microbe is mentioned, it does not specifically limit.
さらに、多検体の検査が必要な場合は、複数の検体をプールしたプール糞便が用いられる。PCRに用いる検便検体の添加割合は、適切にPCRが行うことができればよく、特に限定されないが、例えば、1〜20v/v%の範囲内で適宜調整することができる。本発明において、プール糞便とは、1〜20v/v%で水に懸濁されたA種(Aは2以上の整数を示す。)の便懸濁液からなるものである。 Furthermore, when multiple specimens need to be examined, a pooled stool in which a plurality of specimens are pooled is used. The addition ratio of the stool test sample used for PCR is not particularly limited as long as PCR can be appropriately performed. For example, it can be appropriately adjusted within a range of 1 to 20 v / v%. In the present invention, the pooled stool comprises a stool suspension of type A (A represents an integer of 2 or more) suspended in water at 1 to 20 v / v%.
ここでA種の便とは、A種の個体が排泄したそれぞれの便であってもよいし、同一個体が排泄したA種の便であってもよい。Aについては、特に限定されないが、Aが10以上、好ましくはAが20以上、より好ましくは30以上である。 Here, the A-type stool may be each stool excreted by the A-type individual or A-type stool excreted by the same individual. Although it does not specifically limit about A, A is 10 or more, Preferably A is 20 or more, More preferably, it is 30 or more.
本発明における工程(2)および(5)のPCRは同一の温度サイクル条件で実施することが好ましい。好ましいPCR反応時間は、1時間以内、好ましくは50分以内、さらに好ましくは40分以内である。 In the present invention, the PCRs in steps (2) and (5) are preferably performed under the same temperature cycle conditions. The preferred PCR reaction time is within 1 hour, preferably within 50 minutes, more preferably within 40 minutes.
本発明に用いられるPCR反応液には、緩衝剤、適当な塩、マグネシウム塩又はマンガン塩、デオキシヌクレオチド三リン酸、検出対象の食中毒細菌の検出対象領域および内部標準遺伝子に対応するプライマーセット及び蛍光プローブ、さらに必要に応じて添加剤を含んでいてもよい。 The PCR reaction solution used in the present invention includes a buffer, an appropriate salt, a magnesium salt or a manganese salt, deoxynucleotide triphosphate, a detection target region of a food poisoning bacterium to be detected, and a primer set and fluorescence corresponding to the internal standard gene. A probe and, if necessary, an additive may be contained.
本発明の検査方法で使用されるPCR試薬では偽陰性発生を防止させるために、工程(2)および(5)のPCRにおいて、インターナルコントロール(内部標準)を含むことがより好ましい。陰性の場合、インターナルコントロール(内部標準)の増幅のみが認められ、PCRが成功したことを確認することができる。一方、PCRの阻害や試薬の添加忘れが発生した場合は、インターナルコントロール(内部標準)の増幅が認められないため、PCRが失敗したことが確認できる。 In the PCR reagent used in the test method of the present invention, it is more preferable to include an internal control (internal standard) in the PCRs of steps (2) and (5) in order to prevent the occurrence of false negatives. In the negative case, only the amplification of the internal control (internal standard) is observed, and it can be confirmed that the PCR was successful. On the other hand, when PCR inhibition or forgetting to add a reagent occurs, amplification of the internal control (internal standard) is not recognized, so it can be confirmed that PCR has failed.
インターナルコントロール(内部標準)としては、検査対象に含まれないターゲットとそのターゲットを増幅するためのプライマーセットを用いればよい。また、インターナルコントロール用にプライマーを別に添加せず、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌増幅用プライマーを用いて増幅した場合に3菌種とは異なる増幅領域を持つテンプレートのみを添加し、インターナルコントロール(内部標準)としてもよい。 As an internal control (internal standard), a target not included in the test target and a primer set for amplifying the target may be used. In addition, only a template having an amplification region different from the three bacterial species when amplified using primers for amplification of Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Shigella, is not added for internal control. However, internal control (internal standard) may be used.
本発明に用いられるプライマーは、特に限定されないが、15塩基から30塩基、好ましくは18塩基から25塩基のプライマーを用いるのが好ましい。必要であれば、配列表記載の塩基配列の相補鎖を用いてもよい。また、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プライマーを含んでもよい。 The primer used in the present invention is not particularly limited, but a primer having 15 to 30 bases, preferably 18 to 25 bases, is preferably used. If necessary, a complementary strand of the base sequence described in the sequence listing may be used. Moreover, when the target nucleic acid consists of subtypes, a degenerate primer may be included.
本発明に用いられる蛍光プローブは、特に限定されない。本発明には15塩基から30塩基、好ましくは18塩基から25塩基の蛍光プローブを用いるのが好ましい。また、ターゲットとする核酸が亜型からなる場合、縮重プローブを含んでもよい。 The fluorescent probe used in the present invention is not particularly limited. In the present invention, it is preferable to use a fluorescent probe of 15 to 30 bases, preferably 18 to 25 bases. Moreover, when the target nucleic acid consists of subtypes, a degenerate probe may be included.
蛍光プローブとして用いられる蛍光色素としては、特に限定されないが、例えば、TaqMan(登録商標)加水分解プローブ(米国特許第5,210,015号公報、米国特許第5,538,848号公報、米国特許第5,487,972号公報、米国特許第5,804,375号公報)が挙げられる。 The fluorescent dye used as the fluorescent probe is not particularly limited. For example, TaqMan (registered trademark) hydrolysis probe (US Pat. No. 5,210,015, US Pat. No. 5,538,848, US Pat. No. 5,487,972 and US Pat. No. 5,804,375).
本発明における一次スクリーニングとは、X個の糞便検体のプール糞便から、PCRを用いてスクリーニングする工程を指す。ここでXについては、10以上であれば特に限定されないが、好ましくは30以上、より好ましくは40以上である。Xの上限値としては、特に限定されるものではないが、100程度が好ましい。 The primary screening in the present invention refers to a step of screening using PCR from a pooled stool of X stool specimens. X is not particularly limited as long as it is 10 or more, but is preferably 30 or more, more preferably 40 or more. The upper limit value of X is not particularly limited, but is preferably about 100.
一次スクリーニングに使用されるPCR試薬は特に限定されないが、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌の3菌種をマルチプレックスにて同時検出可能な試薬であることが好ましい。好ましい様態として、内部標準遺伝子検出用蛍光プローブの蛍光波長と、食中毒原因菌検出用蛍光プローブの蛍光波長が重ならず、別なチャンネルで検出できることである。さらに好ましくは、内部標準遺伝子検出用蛍光プローブの蛍光波長と、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌の各検出用蛍光プローブの蛍光波長が重ならないよう蛍光色素を選択する。 The PCR reagent used for the primary screening is not particularly limited, but is preferably a reagent that can simultaneously detect three species of Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella in a multiplex. As a preferred mode, the fluorescence wavelength of the fluorescent probe for detecting the internal standard gene and the fluorescence wavelength of the fluorescent probe for detecting food poisoning cause bacteria do not overlap, and the detection can be performed by another channel. More preferably, the fluorescent dye is selected so that the fluorescence wavelength of the fluorescent probe for detecting the internal standard gene and the fluorescence wavelength of each of the fluorescent probes for detecting Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli, and Shigella are not overlapped.
一次スクリーニングにおけるマルチプレックスPCRは、蛍光プローブの蛍光波長の違いを利用することにより、陽性の菌種を特定する方法であることが好ましい。また、1次スクリーニング方法が前記3菌種のうちの2種以上の菌種が存在するプール糞便から各菌種を分離検出する方法。であってもよい。 The multiplex PCR in the primary screening is preferably a method for identifying positive bacterial species by utilizing the difference in fluorescence wavelength of the fluorescent probe. Moreover, the primary screening method isolate | separates and detects each bacterial species from the pool feces in which 2 or more types of bacterial species among the said 3 bacterial species exist. It may be.
本発明における二次スクリーニングとは、Y個の糞便検体のプール糞便から、PCRを用いてスクリーニングする工程を指す。ここで選択されるY個の糞便検体は、一次スクリーニングにて陽性となったプールに含まれる糞便検体から選択される。YはXより小さな整数であり、特に限定されないが、Yが30以下であることが好ましい。より好ましくは20以下、さらに好ましくは10以下である。さらには、Yが1であってもよく、個別スクリーニングに適用することも可能である。一次スクリーニングにて陽性となったプールに含まれる糞便検体から陽性検体を更に絞り込むことを目的に実施される。 The secondary screening in the present invention refers to a step of screening using PCR from a pooled stool of Y stool specimens. The Y stool specimens selected here are selected from the stool specimens included in the pool that became positive in the primary screening. Y is an integer smaller than X and is not particularly limited, but Y is preferably 30 or less. More preferably, it is 20 or less, More preferably, it is 10 or less. Furthermore, Y may be 1, and can be applied to individual screening. It is performed for the purpose of further narrowing down positive samples from stool samples contained in the pool that became positive in the primary screening.
二次スクリーニングに使用されるPCR試薬は特に限定されない。好ましくは、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌(EHEC)および赤痢菌から選択されるいずれか1種類の菌種を検出できる試薬構成を有していれば、特に限定されない。 The PCR reagent used for the secondary screening is not particularly limited. Preferably, there is no particular limitation as long as it has a reagent configuration capable of detecting any one species selected from Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella.
以下、実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例1.共感染プールモデルの分離検出例
(1) 市販されている融解曲線解析タイプの食中毒原因菌の検出キットである腸内細菌遺伝子検出キット-高速蛍光検出-(TOYOBO)を用いて、共感染プールモデルの検出を実施した。推奨プロトコールに従い、各食中毒原因菌DNAの検出を実施した。共感染プールのモデルとして、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌から選ばれる2種類の菌種のDNAをそれぞれ10000コピーおよび10コピー添加し、両食中毒原因菌DNAの検出を行った。
Example 1. Separation and detection example of co-infection pool model (1) Using enterobacterial gene detection kit-high-speed fluorescence detection- (TOYOBO), which is a commercially available melting curve analysis type food poisoning causative detection kit, Detection of a co-infection pool model was performed. According to the recommended protocol, each food poisoning causal bacteria DNA was detected. As a model of the co-infection pool, 10000 copies and 10 copies of DNA of two species selected from Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli, and Shigella were added, respectively, and both food poisoning causative bacteria DNA were detected.
(2) 結果
増幅曲線を図1に示す。どの食中毒原因菌DNA組み合わせの共感染プールモデルにおいても、10コピーの遺伝子を検出することが不可能であった。
(2) Results An amplification curve is shown in FIG. In any co-infection pool model of any food poisoning causative DNA combination, it was impossible to detect 10 copies of the gene.
実施例2. 蛍光プローブ法を使用した共感染プールモデルの分離検出例
(1) 市販されている蛍光プローブによる食中毒原因菌の検出キットである腸内細菌遺伝子検出キット-プローブ検出-(TOYOBO)を用いて、共感染プールモデルの検出を実施した。推奨プロトコールに従い、各食中毒原因菌DNAの検出を実施した。共感染プールのモデルとして、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌から選ばれる2種類の菌種をそれぞれ10000コピーおよび10コピー添加し、両食中毒原因菌DNAの検出を行った。
Example 2. Separation and detection example of co-infection pool model using fluorescent probe method (1) Enterobacteriaceae gene detection kit-probe detection- (TOYOBO), which is a detection kit of food poisoning causal bacteria using a commercially available fluorescent probe The detection of the co-infection pool model was performed. According to the recommended protocol, each food poisoning causal bacteria DNA was detected. As a co-infection pool model, two types of bacterial species selected from Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli, and Shigella were added in an amount of 10,000 copies and 10 copies, respectively.
(2) 結果
増幅曲線を図2に示す。どの食中毒原因菌DNA組み合わせの共感染プールモデルにおいても、10000コピーと10コピーの両遺伝子を分離して同時検出することができた。融解曲線解析タイプの検出キットと比較して、蛍光プローブ法を用いた検出キットでは、共感染検体の分離検出能が高いことが示された。
(2) Results An amplification curve is shown in FIG. In any co-infection pool model of any combination of food poisoning causal bacteria, both 10000 and 10 copies of the gene could be isolated and detected simultaneously. Compared with the melting curve analysis type detection kit, it was shown that the detection kit using the fluorescent probe method has a higher ability to separate and detect co-infected specimens.
実施例3.プール糞便熱処理検体を用いた一次スクリーニング
(1)プール糞便熱処理検体の作製
ヒト糞便検体9,000検体を用いて、プール糞便熱処理検体を作製した。10%(重量%)となるように懸濁した検体を、等量ずつ50検体混合し、95℃で10分間熱処理し、12,000rpmで5分間遠心し、プール糞便熱処理検体を180プール作製した。
Example 3 FIG. Primary screening using pooled stool samples (1) Preparation of pooled stool samples
A pooled stool heat treatment specimen was prepared using 9,000 human stool specimens. Samples suspended at 10% (weight%) were mixed in 50 equal amounts, heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes, centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes, and 180 pool fecal heat-treated samples were prepared. .
(2)反応
腸内細菌遺伝子検出キット―プローブ検出―を用い、推奨プロトコールに従って、サルモネラ菌、腸管出血性大腸菌、赤痢菌をターゲットとするマルチプレックスPCR法にて1次スクリーニングを実施した。
(2) Reaction The primary screening was performed by the multiplex PCR method targeting Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli, and Shigella using the enterobacterial gene detection kit-probe detection- according to the recommended protocol.
(3)結果
増幅結果を図3に示す。180プールのうち、15プールが陽性と判定され、陽性率は8.3%であった。15プールのうち、6検体はサルモネラ菌陽性、9プールは腸管出血性大腸菌陽性と判定された。9,000検体のうち、一次スクリーニングにより91.7%の陰性検体が確定された。
(3) Results The amplification results are shown in FIG. Of the 180 pools, 15 pools were determined to be positive, and the positive rate was 8.3%. Of the 15 pools, 6 specimens were positive for Salmonella and 9 pools were positive for enterohemorrhagic E. coli. Of 9,000 samples, 91.7% negative samples were confirmed by primary screening.
実施例4.プール糞便熱処理検体を用いた二次スクリーニング
(1)プール糞便熱処理検体の作製
実施例1にてサルモネラ菌陽性と判定された6プールに含まれている300検体から、10検体ずつ再プールし、30個のサルモネラ菌陽性疑いプールを作製した。また、同様に腸管出血性大腸菌陽性と判定された9プールに含まれている450検体から、10検体ずつ再プールし、45個の腸管出血性大腸菌陽性疑いプールを作製した。
Example 4 Secondary screening using pooled fecal samples (1) Preparation of pooled fecal samples
Ten samples were re-pooled from 300 samples contained in 6 pools determined to be positive for Salmonella in Example 1 to produce 30 Salmonella positive suspected pools. Similarly, 10 specimens were re-pooled from 450 specimens contained in 9 pools determined to be positive for enterohemorrhagic Escherichia coli to prepare 45 enterohemorrhagic Escherichia coli positive pools.
(2−1)反応液の調製
以下に示す組成のPCR反応液を作成し、サルモネラ菌および腸管出血性大腸菌の検出を行った。サルモネラ菌陽性疑いプールにはサルモネラ菌検出用プライマー・プローブ液を、腸管出血性大腸菌陽性疑いプールには腸管出血性大腸菌検出用プライマー・プローブ液をそれぞれ使用した。
1xBuffer (Blend Taq(登録商標)添付バッファー(東洋紡))
3mg/ml BSA
各0.2mM dATP,dGTP,dCTP,dTTP
1%ゼラチン
0.1unit/μl rTth DNA polymerase(東洋紡)
0.02μg/μl 抗Tth抗体
サルモネラ菌検出用プライマー・プローブ液 (表1)
腸管出血性大腸菌検出用プローブ・プローブ液 (表2)
(2-1) Preparation of reaction solution A PCR reaction solution having the following composition was prepared, and Salmonella and enterohemorrhagic Escherichia coli were detected. A primer / probe solution for detecting Salmonella was used for the Salmonella positive suspected pool, and a primer / probe solution for detecting enterohemorrhagic Escherichia coli was used for the enterohemorrhagic Escherichia coli positive suspected pool.
1xBuffer (Blend Taq (registered trademark) attachment buffer (Toyobo))
3mg / ml BSA
Each 0.2 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP
1% gelatin 0.1 unit / μl rTth DNA polymerase (Toyobo)
0.02 μg / μl Anti-Tth antibody Salmonella detection primer / probe solution (Table 1)
Probe / probe solution for detecting enterohemorrhagic Escherichia coli (Table 2)
(3)結果
増幅結果を図4に示す。75個の陽性疑いプールのうち、18プールが陽性判定となり、陽性率は36%であった。8プールがサルモネラ陽性、10プールが腸管出血性大腸菌陽性判定となった。
実施例3および実施例4の結果から、9,000検体の内、陽性疑い検体を一次スクリーニングと二次スクリーニング合わせて180検体まで絞り込むことができ、98%の検体が陰性となった。
(3) Result Amplification results are shown in FIG. Of the 75 suspected positive pools, 18 were positive and the positive rate was 36%. Eight pools were positive for Salmonella and 10 were positive for enterohemorrhagic E. coli.
From the results of Example 3 and Example 4, out of 9,000 samples, the suspected positive samples could be narrowed down to 180 samples by combining the primary screening and the secondary screening, and 98% of the samples were negative.
本発明は、遺伝子診断、臨床診断といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、特に多数のサンプルを迅速に検査することが求められている分野において非常に有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is very useful in the field of forensic medicine such as genetic diagnosis and clinical diagnosis, or in a field in which a large number of samples are required to be examined quickly, such as in microbial tests in foods and the environment.
Claims (7)
(1)X個(Xは10以上の整数を示す。)の便検体懸濁液をプールし、プール糞便を作製する工程
(2)工程(1)にて作製したプール糞便を用いて、前記3菌種をターゲットとするマルチプレックスPCRにて1次スクリーニングを行う工程
(3)工程(2)によって、前記3菌種のいずれかの菌種が陽性となったプール糞便を選抜する工程
(4)工程(3)により選抜されたプール糞便に使用した個々の糞便を用いて、さらにY個(YはXよりも小さい整数を示す。)の便検体懸濁液からなるプール糞便を作成する工程
(5)工程(4)により作製したプール糞便を用いて、前記3菌種のうちいずれか1菌種をターゲットとするPCRにより2次スクリーニングを行う工程 A method for examining the presence or absence of any one of three species of Salmonella, Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) and Shigella in a stool sample, comprising the following steps (1) to (5) An inspection method characterized by comprising.
(1) Pooling stool specimen suspensions of X pieces (X represents an integer of 10 or more) and producing pooled stool (2) Using the pooled stool prepared in step (1), Step (3) of performing primary screening by multiplex PCR targeting three bacterial species (3) Step of selecting pool feces in which any one of the three bacterial species is positive (4) ) Using the individual stool used for the pool stool selected in step (3), further creating a pool stool comprising Y stool specimen suspensions (Y is an integer smaller than X) (5) A step of performing secondary screening by PCR targeting any one of the three bacterial species using the pool feces prepared in step (4)
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