JP2018078917A - Hydrogel fiber for implantation and implantation method using hydrogel fiber - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、体内移植用のハイドロゲルファイバ及びハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法に関するものである。 The present disclosure relates to a hydrogel fiber for body transplantation and a body transplantation method using the hydrogel fiber.
従来、ｉＰＳ細胞は、無限の増殖能と、すべての体細胞に分化し得る能力を有するので、再生医療等に使用される細胞ソースとして期待されており、細胞を培養するために、各種の方法や装置が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。 Conventionally, iPS cells have an infinite proliferative ability and the ability to differentiate into all somatic cells, and thus are expected as a cell source used in regenerative medicine and the like, and various methods for culturing cells. And devices have been proposed (see, for example, Patent Document 1).
しかしながら、前記従来の技術では、培養された細胞を生体内に移植すると免疫細胞による攻撃を受けてしまう、という問題があった。 However, the conventional technique has a problem that when cultured cells are transplanted in vivo, they are attacked by immune cells.
ここでは、前記従来の技術の問題点を解決して、細胞をコアに含むハイドロゲルファイバを作製し、該ハイドロゲルファイバを体内に移植することによって、前記細胞が免疫攻撃を受けることがなく、表面が線維化してしまうことがなく、体外への取出しも可能な体内移植用のハイドロゲルファイバ及びハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法を提供することを目的とする。 Here, by solving the problems of the prior art, producing a hydrogel fiber containing cells in the core, and transplanting the hydrogel fiber in the body, the cells are not subjected to immune attack, An object of the present invention is to provide a hydrogel fiber for in vivo transplantation that can be taken out of the body without causing the surface to become fibrotic, and an in vivo transplantation method using the hydrogel fiber.
そのために、体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、体内移植用のハイドロゲルファイバであって、細胞を含むコアと、ハイドロゲルを含み、前記コアを被覆するシェルとを備え、外径が０．７５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバが体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下である。 For this purpose, the hydrogel fiber for in vivo transplantation is a hydrogel fiber for in vivo implantation, comprising a core containing cells, a shell containing hydrogel and covering the core, and having an outer diameter of 0.1. The ratio of the outer diameter to the maximum diameter of the abdominal circumference of the living body in which the hydrogel fiber is implanted into the body is 7% or less.
他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記シェルは、半透膜として機能する。 In another hydrogel fiber for implantation in a body, the shell functions as a semipermeable membrane.
更に他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記半透膜は、酸素、栄養分及び前記細胞の分泌物質の透過を可能とし、前記細胞並びに前記生体内の免疫細胞及び抗体の透過を不可とする。 In still another hydrogel fiber for transplantation in a body, the semipermeable membrane allows permeation of oxygen, nutrients and secreted substances of the cells, and permeates the cells and immune cells and antibodies in the living body. Impossible.
更に他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記コアは、細胞外マトリックスを更に含む。 In still another hydrogel fiber for transplantation, the core further includes an extracellular matrix.
更に他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記細胞は、分化細胞である。 In still another hydrogel fiber for transplantation, the cell is a differentiated cell.
更に他の体内移植用のハイドロゲルファイバにおいては、さらに、前記外径は、０．７５〜４０．０〔ｍｍ〕である。 In still another hydrogel fiber for transplantation in the body, the outer diameter is 0.75 to 40.0 [mm].
ハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法においては、ハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法であって、細胞を含むコアと、ハイドロゲルを含み、前記コアを被覆するシェルとを備え、外径が０．７５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバが体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下であるハイドロゲルファイバを製造する工程と、前記ハイドロゲルファイバを生体の体内に移植する工程と、を含む。 An in-vivo transplantation method using a hydrogel fiber is an in-vivo transplant method using a hydrogel fiber, comprising a core containing cells, a shell containing hydrogel and covering the core, and having an outer diameter of 0. A step of manufacturing a hydrogel fiber having a ratio of the outer diameter to a maximum diameter of an abdominal circumference of a living body in which the hydrogel fiber is implanted in the body is 7% or less; Transplanting the gel fiber into the body of a living body.
他のハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法においては、さらに、前記ハイドロゲルファイバを前記生体の体内から取り出して回収する工程を更に含む。 The in-vivo transplantation method using another hydrogel fiber further includes a step of taking out and collecting the hydrogel fiber from the body of the living body.
更に他のハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法においては、さらに、前記外径は、０．７５〜４０．０〔ｍｍ〕である。 Furthermore, in the in-vivo transplantation method using another hydrogel fiber, the outer diameter is 0.75 to 40.0 [mm].
更に他のハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法においては、さらに、前記生体は、ヒトを除く生体である。 Furthermore, in the in vivo transplantation method using another hydrogel fiber, the living body is a living body excluding a human.
本開示によれば、免疫攻撃を受けることなく、細胞を体内移植することができ、かつ、体外へ取り出すこともできる。 According to the present disclosure, cells can be transplanted into the body and taken out of the body without being subjected to an immune attack.
以下、本実施の形態について図面を参照しながら詳細に説明する。 Hereinafter, the present embodiment will be described in detail with reference to the drawings.
図１は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ及びその製造方法を示す模式図である。 FIG. 1 is a schematic view showing a hydrogel fiber and a manufacturing method thereof in the present embodiment.
図において、２０は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバであり、１０は該ハイドロゲルファイバ２０を作製するための作製装置である。前記ハイドロゲルファイバ２０は、中央のコア２１と該コア２１を被覆するシェル（被覆）２２とを備える、いわゆるコアシェル型の同心型ファイバであって、例えば、特許文献２に記載されたマイクロファイバと同様のものである。また、前記作製装置１０も、特許文献２に記載されたものと同様である。そして、前記ハイドロゲルファイバ２０は、特許文献２に記載されたマイクロファイバの製造方法に従って製造される。
典型的には、前記コア２１は、マトリゲル、コラーゲンゲル等のゲルや液体培地から成る細胞外マトリックス、すなわち、ＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ）と、該ＥＣＭ内に混入された複数の細胞２３とを含んでいる。なお、ＥＣＭは、省略することもできる。また、前記シェル２２は、アルギン酸ゲル等の高強度ハイドロゲルを含んでいる。さらに、前記細胞２３は、いかなる種類のものであってもよく、例えば、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞であってもよいし、幹細胞を分化することで得られる種々の機能性を有する細胞（分化細胞）であってもよいし、肝臓、膵臓等の臓器の細胞であってもよいし、分化可能な幹細胞由来の膵臓β細胞であってもよい。 Typically, the core 21 includes an extracellular matrix composed of a gel such as matrigel or collagen gel or a liquid medium, that is, an ECM (Extracellular Matrix), and a plurality of cells 23 mixed in the ECM. Yes. The ECM can be omitted. The shell 22 contains a high strength hydrogel such as an alginate gel. Further, the cell 23 may be of any kind, for example, a pluripotent stem cell such as a human ES cell or a human iPS cell, or various functions obtained by differentiating the stem cell. It may be a cell having a sex (differentiated cell), a cell of an organ such as the liver or pancreas, or a pancreatic β cell derived from a differentiable stem cell.
本実施の形態における実験例では、細胞２３としてラットの膵島（Ｉｓｌｅｔ）が選択され、ＥＣＭとしてコラーゲンが選択された。そして、図に示されるように、作製装置１０の同軸マイクロ流路に、ＥＣＭとしてコラーゲンと細胞２３としてラットの初代膵島細胞との混合流体がコア流体として供給された。また、Ｇ／Ｍ比が０．６より大きい高純度アルギン酸ナトリウム（Ｎａ−Ａｌｇ）水溶液がシェル流体として供給された。なお、Ｇ／Ｍ比は、アルギン酸中のマンヌロン酸（Ｍ）とグルロン酸（Ｇ）との比である。さらに、塩化バリウム（ＢａＣｌ2 ）水溶液がシース流体として供給された。 In the experimental example of the present embodiment, rat islets were selected as the cells 23, and collagen was selected as the ECM. Then, as shown in the figure, a mixed fluid of collagen as an ECM and primary rat islet cells as a cell 23 was supplied as a core fluid to the coaxial microchannel of the production apparatus 10. Further, a high-purity sodium alginate (Na-Alg) aqueous solution having a G / M ratio larger than 0.6 was supplied as a shell fluid. The G / M ratio is a ratio of mannuronic acid (M) and guluronic acid (G) in alginic acid. Further, a barium chloride (BaCl 2 ) aqueous solution was supplied as a sheath fluid.
これにより、シェルとシースとの界面でゲル化が誘起され、図に示されるようなハイドロゲルファイバ２０が作製された。該ハイドロゲルファイバ２０のシェル２２は、アルギン酸バリウム（Ｂａ−Ａｌｇ）のゲルから成り、半透膜として機能する。また、コア２１は、細胞２３としてのラットの初代膵島細胞を内包する膵島懸濁液である。 As a result, gelation was induced at the interface between the shell and the sheath, and a hydrogel fiber 20 as shown in the figure was produced. The shell 22 of the hydrogel fiber 20 is made of a barium alginate (Ba-Alg) gel and functions as a semipermeable membrane. The core 21 is an islet suspension containing rat primary islet cells as the cells 23.
本実施の形態における実験例では、外径が相違する６種類のハイドロゲルファイバ２０が作製されて使用された。前記外径は、０．３５〔ｍｍ〕、０．５０〔ｍｍ〕、０．７５〔ｍｍ〕、１．０〔ｍｍ〕、１．５〔ｍｍ〕及び２．０〔ｍｍ〕である。なお、前記外径の数値は、不可避的な公差を含むものであり、例えば、１．０〔ｍｍ〕は、公差を考慮して表現すれば、１．０±０．０９〔ｍｍ〕である。また、ハイドロゲルファイバ２０の長さは、正規化されてすべて同一であり、１０〔ｃｍ〕である。 In the experimental example in the present embodiment, six types of hydrogel fibers 20 having different outer diameters were produced and used. The outer diameters are 0.35 [mm], 0.50 [mm], 0.75 [mm], 1.0 [mm], 1.5 [mm] and 2.0 [mm]. The numerical value of the outer diameter includes inevitable tolerances. For example, 1.0 [mm] is 1.0 ± 0.09 [mm] when expressed in consideration of the tolerances. . The lengths of the hydrogel fibers 20 are normalized and all are the same, and are 10 [cm].
次に、前記ハイドロゲルファイバ２０の体内移植方法について説明する。 Next, a method for implanting the hydrogel fiber 20 in the body will be described.
図２は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの体内移植方法を示す模式図である。 FIG. 2 is a schematic diagram showing a method for implanting a hydrogel fiber in the present embodiment.
図において、３０は、ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体としてのマウスである。前記ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体は、いかなる種類の動物であってもよく、例えば、ヒト、ペット、家畜等であってもよいが、ここでは、マウスであるものとして説明する。 In the figure, 30 is a mouse as a living body to which the hydrogel fiber 20 is implanted. The living body into which the hydrogel fiber 20 is implanted may be any kind of animal, for example, a human, a pet, a domestic animal, or the like, but here it will be described as a mouse.
本実施の形態における実験例では、マウス３０として、免疫機能を有する糖尿病モデルマウス（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｍｏｕｓｅ）であって、化学物質ＳＴＺ（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）で誘起されたＣ５７ＢＬ／６型糖尿病モデルマウスが選択された。具体的には、該糖尿病モデルマウスは、三協ラボサービス株式会社が販売するものである。そして、前述のように、コア２１にラットの初代膵島細胞を内包する（Ｉｓｌｅｔ−ｌａｄｅｎ）ハイドロゲルファイバ２０が、マウス３０の腹腔内へ移植（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）された。 In the experimental example in the present embodiment, as a mouse 30, a C57BL / 6 type diabetes model mouse induced by the chemical substance STZ (Streptozotocin), which is a diabetes model mouse having an immune function (Immunocomponent Diabetic Mouse), was selected. . Specifically, the diabetes model mouse is sold by Sankyo Lab Service Co., Ltd. Then, as described above, the hydrogel fiber 20 encapsulating rat primary islet cells (Islet-laden) in the core 21 was transplanted into the abdominal cavity of the mouse 30 (Transplantation).
前述のように、ハイドロゲルファイバ２０のシェル２２が半透膜として機能するので、膵島細胞である細胞２３が生成するインシュリン（Ｉｎｓｕｌｉｎ）は、シェル２２を透過してマウス３０の腹腔内に供給されるが、マウス３０の腹腔内の免疫細胞（Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌｓ）は、シェル２２を透過することができず、コア２１内に進入することがない。なお、酸素（Ｏ2 ）及び栄養分（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ）は、シェル２２を透過することができ、コア２１内の細胞２３に供給される。 As described above, since the shell 22 of the hydrogel fiber 20 functions as a semipermeable membrane, the insulin (insulin) produced by the cells 23 that are islet cells is supplied to the abdominal cavity of the mouse 30 through the shell 22. However, immune cells (Immune Cells) in the abdominal cavity of the mouse 30 cannot penetrate the shell 22 and do not enter the core 21. Note that oxygen (O 2 ) and nutrients (nutrient) can permeate the shell 22 and are supplied to the cells 23 in the core 21.
また、移植されたハイドロゲルファイバ２０は、必要に応じて、いつでも、マウス３０の腹腔内からの取出し（Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）が可能である。 Further, the implanted hydrogel fiber 20 can be taken out from the abdominal cavity of the mouse 30 at any time as necessary.
次に、本実施の形態における実験例について詳細に説明する。 Next, an experimental example in the present embodiment will be described in detail.
図３は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの外径と細胞の付着及び線維化との関係を示す図である。なお、図において、（ａ）は細胞が付着した各種外径のハイドロゲルファイバの顕微鏡写真、（ｂ）はハイドロゲルファイバに付着した細胞のカウント数をハイドロゲルファイバの外径毎に示すグラフ、（ｃ）はハイドロゲルファイバに付着した細胞のカウント数を、移植動物の腹囲の最大直径に対するハイドロゲルファイバの外径の比率毎に示すグラフである。 FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the outer diameter of the hydrogel fiber and the adhesion and fibrosis of cells in the present embodiment. In the figure, (a) is a photomicrograph of various outer diameter hydrogel fibers to which cells are attached, (b) is a graph showing the count of cells attached to the hydrogel fibers for each outer diameter of the hydrogel fibers, (C) is a graph showing the count number of cells attached to the hydrogel fiber for each ratio of the outer diameter of the hydrogel fiber to the maximum diameter of the abdominal circumference of the transplanted animal.
前述のように、長さはすべて１０〔ｃｍ〕であるが、外径が、それぞれ、０．３５〔ｍｍ〕、０．５０〔ｍｍ〕、０．７５〔ｍｍ〕、１．０〔ｍｍ〕、１．５〔ｍｍ〕及び２．０〔ｍｍ〕である６種類のハイドロゲルファイバ２０が、前記作製装置１０によって作製された。いずれのハイドロゲルファイバ２０も、シェル２２がアルギン酸バリウムのゲルから成り、コア２１にラットの初代膵島細胞を内包する。 As described above, all the lengths are 10 [cm], but the outer diameters are 0.35 [mm], 0.50 [mm], 0.75 [mm], and 1.0 [mm], respectively. 6 types of hydrogel fibers 20 of 1.5 [mm] and 2.0 [mm] were produced by the production apparatus 10. In any of the hydrogel fibers 20, the shell 22 is made of a gel of barium alginate, and the core 21 encapsulates rat primary islet cells.
そして、６種類のハイドロゲルファイバ２０は、ピンセットを使用して、免疫機能を有する健常な（糖尿病でない）Ｃ５７ＢＬ／６型マウスの腹腔内に、それぞれ、移植され、１４日間経過した後、前記腹腔内から取り出された。なお、１４日間という期間は、移植された組織に対する異物反応（ＦＢＲ：Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｂｏｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を観察するのに適した期間とされている。 Then, the six types of hydrogel fibers 20 were each transplanted into the abdominal cavity of a healthy (non-diabetic) C57BL / 6 mouse having an immune function using tweezers, and after 14 days, It was taken out from inside. The period of 14 days is a period suitable for observing a foreign body reaction (FBR) to the transplanted tissue.
前記腹腔内から取り出して回収されたハイドロゲルファイバ２０の表面を観察すると、図３（ａ）に示されるように、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０への細胞付着（線維化）が少ないことが分かった。なお、図３（ａ）には、左から順に、外径が０．３５〔ｍｍ〕、０．５０〔ｍｍ〕、０．７５〔ｍｍ〕、１．０〔ｍｍ〕、１．５〔ｍｍ〕及び２．０〔ｍｍ〕である前記腹腔内から取り出されたハイドロゲルファイバ２０の顕微鏡写真が示されている。 When the surface of the hydrogel fiber 20 taken out from the abdominal cavity and collected is observed, as shown in FIG. 3A, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.75 to 1.5 [mm] is obtained. It was found that there was little cell attachment (fibrosis). In FIG. 3A, the outer diameters are 0.35 [mm], 0.50 [mm], 0.75 [mm], 1.0 [mm], and 1.5 [mm] in order from the left. ] And 2.0 [mm] are shown micrographs of the hydrogel fiber 20 taken out from the abdominal cavity.
また、図３（ｂ）には、前記腹腔内から取り出して回収されたハイドロゲルファイバ２０の表面に付着している細胞の数をカウントした結果を、ハイドロゲルファイバ２０の外径毎にまとめた結果が示されている。なお、図３（ｂ）に示される結果は、その縦軸に記載されているように、細胞数を各ハイドロゲルファイバ２０の断面積で除した値（Ｃｅｌｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ）を示している。 FIG. 3B shows the results of counting the number of cells attached to the surface of the hydrogel fiber 20 taken out from the abdominal cavity and collected for each outer diameter of the hydrogel fiber 20. Results are shown. In addition, the result shown by FIG.3 (b) has shown the value (Cell Density) which remove | divided the cell number by the cross-sectional area of each hydrogel fiber 20, as it is described in the vertical axis | shaft.
さらに、図３（ｂ）には、前記腹腔内から取り出して回収されたハイドロゲルファイバ２０の表面に付着している細胞の数をカウントした結果を、ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体である移植動物の腹囲の最大直径に対するハイドロゲルファイバ２０の外径の比率毎にまとめた結果が示されている。ここでは、移植動物であるマウスの腹囲の最大直径が３〔ｃｍ〕であるものとした。なお、図３（ｃ）において、縦軸は、細胞数を各ハイドロゲルファイバ２０の断面積で除した値を示し、横軸は、ハイドロゲルファイバ２０の直径をマウスの腹囲の最大直径で除した値を示している。 Further, FIG. 3B shows the result of counting the number of cells attached to the surface of the hydrogel fiber 20 taken out from the abdominal cavity and collected, and the living body in which the hydrogel fiber 20 is transplanted into the body. The results summarized for each ratio of the outer diameter of the hydrogel fiber 20 to the maximum diameter of the abdominal circumference of the transplanted animal are shown. Here, the maximum diameter of the abdominal circumference of the mouse which is a transplanted animal was assumed to be 3 [cm]. In FIG. 3C, the vertical axis indicates the value obtained by dividing the number of cells by the cross-sectional area of each hydrogel fiber 20, and the horizontal axis indicates the diameter of the hydrogel fiber 20 divided by the maximum diameter of the abdominal circumference of the mouse. Shows the value.
図３に示される結果から、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０への細胞付着は少ないが、外径が０．７５〔ｍｍ〕未満及び１．５〔ｍｍ〕を超えるハイドロゲルファイバ２０への細胞付着が多いことが分かる。また、外径が０．７５〔ｍｍ〕未満のハイドロゲルファイバ２０は、絡み合って大きく凝集することが分かる。 From the results shown in FIG. 3, cell adhesion to the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.75 to 1.5 [mm] is small, but the outer diameter is less than 0.75 [mm] and 1.5 [mm]. It can be seen that there are many cell attachments to the hydrogel fiber 20 exceeding. Moreover, it turns out that the hydrogel fiber 20 whose outer diameter is less than 0.75 [mm] is entangled and largely aggregated.
なお、外径が２．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されたマウスのうちの何匹かは、移植して１日経過した後、死んでしまった。 In addition, some of the mice transplanted with the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 2.0 [mm] died after one day after transplantation.
これらの結果から、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０では、表面への細胞付着及びその結果としての線維化が低減される、と言える。特に、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、生体から確実に取り出すことができ、かつ、異物反応を著しく緩和するものである、と言える。 From these results, it can be said that the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.75 to 1.5 [mm] reduces cell adhesion to the surface and the resulting fibrosis. In particular, it can be said that the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] can be reliably taken out from the living body and remarkably relieve the foreign body reaction.
次に、実験例で使用したハイドロゲルファイバ２０の物理化学的性質について説明する。 Next, the physicochemical properties of the hydrogel fiber 20 used in the experimental example will be described.
図４は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの物性評価結果を示す図、図５は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバのインシュリン分泌を示す図である。なお、図４において、（ａ）は応力−ひずみ曲線を示すグラフ、（ｂ）は破断荷重を示すグラフ、（ｃ）は透過性を示す写真及びグラフであり、図５において、（ａ）は外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバを示す写真、（ｂ）は（ａ）に示されるハイドロゲルファイバのインシュリン分泌を示すグラフ、（ｃ）は外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバを示す写真、（ｄ）は（ｃ）に示されるハイドロゲルファイバのインシュリン分泌を示すグラフである。 FIG. 4 is a diagram showing the physical property evaluation results of the hydrogel fiber in the present embodiment, and FIG. 5 is a diagram showing insulin secretion of the hydrogel fiber in the present embodiment. In FIG. 4, (a) is a graph showing a stress-strain curve, (b) is a graph showing a breaking load, (c) is a photograph and a graph showing permeability, and in FIG. A photograph showing a hydrogel fiber having an outer diameter of 1.0 [mm], (b) is a graph showing insulin secretion of the hydrogel fiber shown in (a), and (c) is an outer diameter of 0.35 [mm]. (D) is a graph showing insulin secretion of the hydrogel fiber shown in (c).
ハイドロゲルファイバ２０の機械的性質は、操作の取扱い適正及び生体内での安定性と強く結び付いている。そこで、異なる太さのハイドロゲルファイバ２０の機械的性質を評価するために、外径が０．５０〔ｍｍ〕及び１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が作製装置１０によって作製され、引っ張り試験により、それらの引っ張り応力及びひずみと破断荷重とが計測された。その結果は、図４（ａ）及び（ｂ）に示されている。 The mechanical properties of the hydrogel fiber 20 are strongly associated with the handling of the operation and the in vivo stability. Therefore, in order to evaluate the mechanical properties of the hydrogel fibers 20 having different thicknesses, the hydrogel fibers 20 having outer diameters of 0.50 [mm] and 1.0 [mm] are produced by the production apparatus 10 and pulled. The tensile stress and strain and breaking load were measured by the test. The results are shown in FIGS. 4 (a) and (b).
図４（ａ）に示される結果から、外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、引っ張り応力が７７〔ｋＰａ〕及びひずみが１．２となると破断したこと、外径０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、引っ張り応力が７４〔ｋＰａ〕及びひずみが１．１９となると破断したことが分かる。一方、図４（ｂ）に示される結果から、外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の破断荷重、すなわち、耐荷重性は、外径０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の３倍であることが分かる。これらの結果から、ハイドロゲルファイバ２０の外径が大きいほど耐荷重性が大きい、と言える。 From the results shown in FIG. 4A, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] was broken when the tensile stress was 77 [kPa] and the strain was 1.2, and the outer diameter was 0.35. It can be seen that the [mm] hydrogel fiber 20 was broken when the tensile stress was 74 [kPa] and the strain was 1.19. On the other hand, from the results shown in FIG. 4B, the breaking load of the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm], that is, the load resistance, is the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.35 [mm]. It turns out that it is 3 times. From these results, it can be said that the greater the outer diameter of the hydrogel fiber 20, the greater the load resistance.
細胞治療用の材料の包含にハイドロゲルファイバ２０を適用するためには、シェル２２は、材料の良好な分散と、栄養分及び酸素の透過とが可能でありながら、免疫細胞及び抗体の進入を防止する半透膜として機能することが求められる。そこで、外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で、半透膜としての性質を示すか否かの評価が行われた。具体的には、用意された外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）で標識されたこととなる分子量（１０〔ｋＤａ〕、１５０〔ｋＤａ〕及び５００〔ｋＤａ〕）のデキストランであってシェル２２の半透膜性を調査するための蛍光マーカとして機能するデキストランを含有する食塩水中に浸漬された。 In order to apply the hydrogel fiber 20 to the inclusion of cell therapy material, the shell 22 prevents the entry of immune cells and antibodies while allowing good dispersion of the material and the permeation of nutrients and oxygen. It is required to function as a semipermeable membrane. Accordingly, it was evaluated whether or not the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] exhibits properties as a semipermeable membrane in vitro. Specifically, the prepared hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] is labeled with FITC (Fluorescein Isothiocyanate) and has molecular weights (10 [kDa], 150 [kDa], and 500 [kDa]. ]) And was immersed in saline containing dextran that functions as a fluorescent marker for investigating the semipermeable membrane of the shell 22.
図４（ｃ）の共焦点の顕微鏡写真は、ＦＩＴＣで標識されたデキストランが付加されてから０時間後及び２４時間後の食塩水中のハイドロゲルファイバ２０の写真であって、ＦＩＴＣで標識された分子量１０〔ｋＤａ〕のデキストランが、実験開始後数分間以内に、ハイドロゲルファイバ２０内で急速に増加したことを示している。なお、顕微鏡写真内のスケールバーは、１００〔μｍ〕を表している。ＦＩＴＣで標識されたデキストランの分子量が１５０〔ｋＤａ〕の場合、ＦＩＴＣで標識されたデキストランが付加されてから０時間後では、ハイドロゲルファイバ２０の蛍光強度が変化しなかった。ＦＩＴＣで標識されたデキストランの分子量が５００〔ｋＤａ〕の場合、ＦＩＴＣで標識されたデキストランが付加されてから２４時間後でも、ハイドロゲルファイバ２０の蛍光強度が変化しなかった。これらの結果から、グルコース、インシュリン及び酸素を含む分子量１０〔ｋＤａ〕未満の小さな分子は、アルギン酸バリウムのゲルから成る膜であるシェル２２を透過して分散するのに対して、分子量５００〔ｋＤａ〕近傍の大きな分子及びミクロンサイズの免疫細胞はハイドロゲルファイバ２０内に進入することが困難である、と言える。 The confocal photomicrograph in FIG. 4 (c) is a photograph of the hydrogel fiber 20 in saline at 0 and 24 hours after the addition of FITC-labeled dextran and labeled with FITC. It shows that dextran having a molecular weight of 10 [kDa] rapidly increased in the hydrogel fiber 20 within several minutes after the start of the experiment. The scale bar in the micrograph represents 100 [μm]. When the molecular weight of the dextran labeled with FITC was 150 [kDa], the fluorescence intensity of the hydrogel fiber 20 did not change after 0 hours from the addition of the dextran labeled with FITC. When the molecular weight of dextran labeled with FITC was 500 [kDa], the fluorescence intensity of the hydrogel fiber 20 did not change even 24 hours after the addition of dextran labeled with FITC. From these results, small molecules having a molecular weight of less than 10 [kDa] containing glucose, insulin and oxygen permeate and disperse through the shell 22, which is a film made of a barium alginate gel, whereas a molecular weight of 500 [kDa]. It can be said that nearby large molecules and micron-sized immune cells have difficulty entering the hydrogel fiber 20.
ハイドロゲルファイバ２０に内包された膵島細胞のインシュリン分泌をインビトロで評価するために、ラットの初代膵島細胞をコア２１に内包するハイドロゲルファイバ２０が作製装置１０で作製されて用意された。前記ハイドロゲルファイバ２０では、図１に示されるように、ハイドロゲルのシェル２２によって周囲が完全に覆われたコア２１内に、細胞２３としてのラットの初代膵島細胞とＥＣＭとが内包されている。なお、作製装置１０の同軸マイクロ流路には、コア流体として、ラットの初代膵島細胞を含む天然のコラーゲン溶液が３〔ｍｇ／ｍＬ〕で供給され、シェル流体として、１．８〔％〕のアルギン酸ナトリウムが供給され、シース流体として、２５０〔ｍＭ〕のＤ−マニトール及び２５〔ｍＭ〕のＨＥＰＥＳを含む２０〔ｍＭ〕の塩化バリウム水溶液が供給された。 In order to evaluate insulin secretion of islet cells encapsulated in hydrogel fiber 20 in vitro, hydrogel fiber 20 encapsulating rat primary islet cells in core 21 was prepared with preparation apparatus 10 and prepared. In the hydrogel fiber 20, as shown in FIG. 1, rat primary islet cells and ECM as cells 23 are encapsulated in a core 21 whose periphery is completely covered by a hydrogel shell 22. . In addition, a natural collagen solution containing rat primary pancreatic islet cells is supplied at 3 [mg / mL] as a core fluid to the coaxial microchannel of the production apparatus 10 and 1.8 [%] as a shell fluid. Sodium alginate was supplied, and 20 [mM] barium chloride aqueous solution containing 250 [mM] D-mannitol and 25 [mM] HEPES was supplied as the sheath fluid.
図５（ａ）及び（ｃ）の顕微鏡写真は、ラットの初代膵島細胞を内包するハイドロゲルファイバ２０の写真である。なお、顕微鏡写真内のスケールバーは、２００〔μｍ〕を表している。図５（ａ）は、６７０の膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の写真であり、図５（ｂ）は、該ハイドロゲルファイバ２０のグルコース刺激性インシュリン分泌（ＧＳＩＳ：Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）を示すグラフであって、周囲のグルコース濃度が異なる３つのサンプルの平均値をそれぞれ示すものである。また、図５（ｃ）は、１０００の膵島細胞を内包する外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の写真であり、図５（ｄ）は、該ハイドロゲルファイバ２０のグルコース刺激性インシュリン分泌を示すグラフであって、周囲のグルコース濃度が異なる３つのサンプルの平均値をそれぞれ示すものである。これらの結果から、ハイドロゲルファイバ２０のシェル２２は、十分な量の栄養分及び膵島細胞から分泌されたインシュリンの透過を可能としながら、膵島細胞の漏出を防止することができる、と言える。 The micrographs of FIGS. 5 (a) and 5 (c) are photographs of the hydrogel fiber 20 encapsulating rat primary islet cells. The scale bar in the micrograph represents 200 [μm]. 5A is a photograph of the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] containing 670 islet cells, and FIG. 5B is a glucose-stimulated insulin of the hydrogel fiber 20. It is a graph which shows secretion (GSIS: Glucose Stimulated Insulin Secretion), Comprising: The average value of three samples from which the surrounding glucose concentration differs is each shown. FIG. 5C is a photograph of the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.35 [mm] containing 1000 islet cells, and FIG. 5D is a glucose stimulus of the hydrogel fiber 20. It is a graph which shows sex insulin secretion, Comprising: The average value of three samples from which the surrounding glucose concentration differs is each shown. From these results, it can be said that the shell 22 of the hydrogel fiber 20 can prevent leakage of islet cells while allowing a sufficient amount of nutrients and permeation of insulin secreted from the islet cells.
次に、免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの生体内に移植されたラットの初代膵島細胞を内包するハイドロゲルファイバ２０について説明する。 Next, the hydrogel fiber 20 containing the rat primary islet cells transplanted in the living body of a diabetes model mouse having an immune function will be described.
図６は本実施の形態における生体内への移植前後のハイドロゲルファイバを示す図、図７は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの長期移植による血糖値の変化を示すグラフ、図８は本実施の形態におけるハイドロゲルファイバの移植後に行われた経口ブドウ糖負荷試験の結果を示すグラフ、図９は本実施の形態におけるコアにＥＣＭを含まないハイドロゲルファイバを移植した結果を示す図である。なお、図６において、（ａ）〜（ｃ）は外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバの移植前、生体内及び回収後の状態をそれぞれ示す写真、（ｄ）〜（ｆ）は外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバの移植前、生体内及び回収後の状態をそれぞれ示す写真、（ｇ）はハイドロゲルファイバが移植されたマウスの血中グルコース濃度の変化を示すグラフ、（ｈ）はピンセットを使用した外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバの取出しプロセスを示す写真であり、図９において、（ａ）はハイドロゲルファイバが移植されたマウスの血糖濃度の変化を示すグラフ、（ｂ）はハイドロゲルファイバの移植後に行われた経口ブドウ糖負荷試験の結果を示すグラフ、（ｃ）は回収後のハイドロゲルファイバの状態を示す写真である。 FIG. 6 is a diagram showing a hydrogel fiber before and after implantation in a living body in the present embodiment, FIG. 7 is a graph showing a change in blood glucose level due to long-term implantation of the hydrogel fiber in the present embodiment, and FIG. The graph which shows the result of the oral glucose tolerance test performed after the transplant of the hydrogel fiber in the form of FIG. 9, FIG. 9 is a figure which shows the result of transplanting the hydrogel fiber which does not contain ECM in the core in this Embodiment. In FIG. 6, (a) to (c) are photographs showing the state before implantation, in vivo and after collection of a hydrogel fiber having an outer diameter of 1.0 [mm], and (d) to (f). Is a photograph showing the state of the hydrogel fiber having an outer diameter of 0.35 [mm] before transplantation, in vivo and after recovery, and (g) shows the change in blood glucose concentration of the mouse implanted with the hydrogel fiber. Graph (h) is a photograph showing the extraction process of a hydrogel fiber having an outer diameter of 1.0 [mm] using tweezers, and in FIG. 9, (a) is a mouse of a hydrogel fiber transplanted. The graph which shows the change of a blood glucose concentration, (b) is a graph which shows the result of the oral glucose tolerance test done after the transplant of hydrogel fiber, (c) is a photograph which shows the state of the hydrogel fiber after collection | recovery.
外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０との比較において、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の生体からの取出し適正を評価するために、図６（ａ）及び（ｄ）にそれぞれ示されるように、１０００のラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕及び０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が作製装置１０によって作製されて用意された。これらのハイドロゲルファイバ２０は、免疫機能を有するＣ５７ＢＬ／６型糖尿病モデルマウスの腹腔内に移植された。 In order to evaluate the appropriateness of taking out the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] in comparison with the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.35 [mm], FIG. And (d), hydrogel fibers 20 having outer diameters of 1.0 [mm] and 0.35 [mm] enclosing 1000 rat islet cells are prepared by the manufacturing apparatus 10 and prepared. It was done. These hydrogel fibers 20 were implanted into the abdominal cavity of C57BL / 6 type diabetes model mouse having immune function.
そして、移植後には、生体内での構造変化を解析するために、移植されたハイドロゲルファイバ２０が生体内から取り出されて回収された。図６（ｂ）及び（ｅ）には、移植して３６日経過後及び２１日経過後における腹腔内のハイドロゲルファイバ２０の構造が示されている。図６（ｂ）及び（ｅ）から、移植されたハイドロゲルファイバ２０は、ばらばらに分解することなく、移植された部位に留まっていることが分かった。しかし、図６（ｅ）に示されるように、外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、移植して２１日経過後には、厚い線維化した組織によって覆われた大きな凝集体を形成し、宿主の脂肪組織に付着していた。 Then, after the transplantation, the transplanted hydrogel fiber 20 was taken out from the living body and collected in order to analyze the structural change in the living body. FIGS. 6B and 6E show the structure of the hydrogel fiber 20 in the abdominal cavity after 36 days and 21 days have passed after transplantation. 6 (b) and 6 (e), it was found that the implanted hydrogel fiber 20 remained at the implanted site without breaking apart. However, as shown in FIG. 6 (e), the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.35 [mm] is a large aggregate covered with thick fibrotic tissue after 21 days from implantation. And attached to the adipose tissue of the host.
また、図６（ｃ）及び（ｆ）には、移植して３６日経過後及び２１日経過後に腹腔内から取り出されて回収されたハイドロゲルファイバ２０のＨＥ（ヘマトキシリン−エオジン：Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−Ｅｏｓｉｎ）染色された組織断面が示されている。図６（ｆ）に示されるように、外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０の場合、凝集体の裂け目が線維化し、内包された膵島細胞の核が失われていた。これは、移植が失敗したことを示している。 6 (c) and 6 (f), HE (hematoxylin-eosin) staining of hydrogel fiber 20 taken out from the abdominal cavity and collected after the lapse of 36 days and 21 days after transplantation. A cross-section of the resulting tissue is shown. As shown in FIG. 6 (f), in the case of the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.35 [mm], the fissures of the aggregates were fibrillated, and the nuclei of the encapsulated islet cells were lost. This indicates that the transplant failed.
これに対して、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、図６（ｂ）に示されるように、移植して３６日経過後でも、凝集体を形成することなく、元の形状を保持しており、図６（ｈ）に示されるように、腹腔内から容易に取り出されて回収された。また、図６（ｃ）に示されるように、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０のＨＥ染色された組織断面は、内包された膵島細胞の核が生きていた。 On the other hand, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] does not form an aggregate even after 36 days have passed since implantation, as shown in FIG. The shape was retained, and as shown in FIG. 6 (h), it was easily removed from the abdominal cavity and collected. In addition, as shown in FIG. 6C, in the HE-stained tissue section of the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm], the nucleus of the encapsulated islet cells was alive.
移植後のハイドロゲルファイバ２０の機能性を評価するために、移植処置が行われた糖尿病モデルマウスの非空腹時の血糖濃度の測定が、少なくとも１日１回、行われた。なお、血糖濃度が２００〔ｍｇ／ｍＬ〕以下のマウスは、正常血糖と定義された。図６（ｇ）に示されるように、ハイドロゲルファイバ２０移植後の数日は、すべての糖尿病モデルマウスが正常血糖であった。しかし、外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されたマウスは、１０日間正常血糖を維持することができなかった。一方、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植された糖尿病モデルマウスのすべて（ｎ＝３）は、ハイドロゲルファイバ２０の回収までの３６日間、血糖制御の回復が可能であった。 In order to evaluate the functionality of the hydrogel fiber 20 after transplantation, the blood glucose concentration during non-fasting of a diabetic model mouse subjected to transplantation treatment was measured at least once a day. Mice with a blood glucose concentration of 200 mg / mL or less were defined as normoglycemia. As shown in FIG. 6 (g), all the diabetic model mice were normoglycemic for several days after the hydrogel fiber 20 transplantation. However, mice transplanted with hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.35 [mm] were unable to maintain normoglycemia for 10 days. On the other hand, all of the diabetes model mice (n = 3) transplanted with the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 mm can recover blood glucose control for 36 days until the recovery of the hydrogel fiber 20. there were.
外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、移植して３６日経過後に糖尿病モデルマウスの腹腔内から取り出されて回収された。ハイドロゲルファイバ２０が回収された糖尿病モデルマウスのすべてにおいて、高血糖（血糖濃度が２００〔ｍｇ／ｍＬ〕より高い）の再現が確認された。このことは、移植された外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０に内包された膵島細胞が糖尿病モデルマウスの血糖濃度を制御していることを示している。 The hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] was taken out from the abdominal cavity of a diabetic model mouse and collected 36 days after transplantation. In all of the diabetic model mice from which the hydrogel fiber 20 was recovered, reproduction of hyperglycemia (blood glucose concentration higher than 200 [mg / mL]) was confirmed. This indicates that the islet cells encapsulated in the transplanted hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] control the blood glucose concentration of the diabetes model mouse.
これらの結果から、膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０と比較して、回収性及び移植機能が高い、と言える。 From these results, the hydrogel fiber 20 with an outer diameter of 1.0 [mm] encapsulating the islet cells is more recoverable and transplantable than the hydrogel fiber 20 with an outer diameter of 0.35 [mm]. Can be said to be expensive.
糖尿病モデルマウスにおける長期の血糖制御のため、免疫機能を有する糖尿病モデルマウス（化学物質ＳＴＺで誘起されたＣ５７ＢＬ／６型糖尿病モデルマウス）の腹腔内にラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０（マウス１匹当たり１５００のラットの初代膵島細胞を内包する長さ２０〔ｃｍ〕、外径１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０）が３月間移植された。また、比較のために、膵島細胞を内包しないハイドロゲルファイバ２０の移植も行われた。図７に示されるように、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植された後、９１日経過後にハイドロゲルファイバ２０が回収されるまで、糖尿病モデルマウスのすべてにおいて、拒絶反応を示すことなく、血糖制御が回復された。９１日経過後であっても、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、糖尿病モデルマウスの臓器に付着することなく、腹腔内から取り出されて回収された。なお、回収後には、血糖濃度が高血糖に戻った。これらの結果から、ハイドロゲルファイバ２０に内包されていない膵島細胞及び膵島細胞を内包する外径が０．３５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０と比較して、膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、回収可能な移植片として機能し、かつ、生体内での膵島細胞の機能性を向上させるものである、と言える。 In order to control blood glucose for a long period of time in a diabetes model mouse, the outer diameter of the islet cell of the rat is 1. Hydrogel fiber 20 of 0 [mm] (length 20 [cm] enclosing 1500 rat primary islet cells per mouse, hydrogel fiber 20 of outer diameter 1.0 [mm]) was transplanted for 3 months It was. For comparison, a hydrogel fiber 20 that does not encapsulate islet cells was also transplanted. As shown in FIG. 7, after the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] is implanted, all of the diabetes model mice are rejected until the hydrogel fiber 20 is recovered after 91 days. Blood glucose control was restored with no response. Even after the passage of 91 days, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] was removed from the abdominal cavity and collected without adhering to the organ of the diabetes model mouse. After collection, the blood glucose concentration returned to hyperglycemia. From these results, compared to the islet cells not encapsulated in the hydrogel fiber 20 and the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.35 [mm] encapsulating the islet cells, the outer diameter encapsulating the islet cells is 1 It can be said that the hydrogel fiber 20 of 0.0 [mm] functions as a recoverable graft and improves the functionality of islet cells in vivo.
図６（ａ）に示されるような外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されてから２８日経過後に、経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ：Ｏｒａｌ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ Ｔｅｓｔ）が行われた。図８には、当該経口ブドウ糖負荷試験の遂行中におけるマウスの空腹時の血糖濃度の変化が示されている。この結果から、ハイドロゲルファイバ２０が移植された糖尿病モデルマウスは、健常なマウスと同程度に、血糖濃度が正常に変化する、と言える。 Oral glucose tolerance test (OGTT: Oral Glucose Tolerance Test) was performed 28 days after the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] as shown in FIG. . FIG. 8 shows changes in fasting blood glucose concentration of mice during the oral glucose tolerance test. From this result, it can be said that the blood glucose concentration of the diabetes model mouse transplanted with the hydrogel fiber 20 changes to the same level as that of a healthy mouse.
ハイドロゲルファイバ２０のコア２１内におけるＥＣＭの存在が糖尿病モデルマウスに移植されたラットの膵島細胞の持続性に影響するか否かを確認するために、コア２１にＥＣＭを含むことなく５００のラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が、免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの腹腔内に移植された。図９（ａ）に示されるように、コア２１にＥＣＭを含むことなくラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されたマウスのすべてにおいて、血糖濃度は、正常血糖になり、当該実験を終了するためにハイドロゲルファイバ２０を回収するまでの１０５日間維持された。図９（ｂ）には、コア２１にＥＣＭを含むことなくラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されてから１０２日経過後に行われた経口ブドウ糖負荷試験の結果が示されている。図９（ｂ）に示されるように、コア２１にＥＣＭが含まれていない場合でも、ハイドロゲルファイバ２０が移植された糖尿病モデルマウスの空腹時の血糖濃度の変化は、健常なマウスと同程度であって、正常であった。また、図９（ｃ）の写真に示されるように、コア２１にＥＣＭが含まれていない場合でも、ハイドロゲルファイバ２０は、移植から１０５日後に腹腔内から容易に取り出されて回収することができ、しかも、凝集体を形成することなく、元の形状を保持していた。なお、写真内のスケールバーは、５〔ｍｍ〕を表している。これらの結果から、コア２１内におけるＥＣＭの存在は、ハイドロゲルファイバ２０によるラットの膵島細胞に必ずしも必要でない、と言える。 In order to confirm whether the presence of ECM in the core 21 of the hydrogel fiber 20 affects the persistence of the islet cells of rats transplanted into a diabetic model mouse, 500 rats without containing ECM in the core 21. The hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] encapsulating the pancreatic islet cells was implanted into the abdominal cavity of a diabetes model mouse having an immune function. As shown in FIG. 9 (a), in all of the mice in which the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] encapsulating rat islet cells without containing ECM in the core 21 was implanted, The concentration was maintained for 105 days until normal blood glucose was reached and the hydrogel fiber 20 was collected to end the experiment. FIG. 9 (b) shows an oral treatment performed 102 days after the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] encapsulating rat islet cells without containing ECM in the core 21. The results of the glucose tolerance test are shown. As shown in FIG. 9B, even when the core 21 does not contain an ECM, the change in fasting blood glucose concentration of the diabetes model mouse implanted with the hydrogel fiber 20 is comparable to that of a healthy mouse. And it was normal. Further, as shown in the photograph of FIG. 9C, even when the core 21 does not contain ECM, the hydrogel fiber 20 can be easily taken out from the abdominal cavity and collected 105 days after the implantation. In addition, the original shape was maintained without forming aggregates. The scale bar in the photograph represents 5 [mm]. From these results, it can be said that the presence of ECM in the core 21 is not necessarily required for rat islet cells by the hydrogel fiber 20.
このように、本実施の形態における実験例の結果から、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、外径がより小さいもの又はより大きいものよりも、著しく生体親和性が高い、と言える。特に、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、表面への細胞付着及び線維化が最小限になる。外径が０．７５〔ｍｍ〕未満のハイドロゲルファイバ２０は、生体内に移植されると、２週間以内に凝集体を形成する傾向がある。凝集体の形成は、マウスの腹腔内における物理的応力に対する機械的強度が低いことに起因する、と考えられる。凝集体の表面粗さ及びファイバの湾曲は、細胞付着及びコラーゲン吸着を容易にし、線維化を増進し、移植片であるハイドロゲルファイバ２０の機能不全を引き起こす、と考えられる。一方、外径が１．５〔ｍｍ〕を超えるハイドロゲルファイバ２０は、ファイバの湾曲が比較的小さく、細胞付着が低減されるものの、ファイバの体積がマウスの腹腔内空間に対して大きすぎるので、応力が大きくなり、炎症反応を引き起こして線維化が生じる、と考えられる。それに対し、外径が０．７５〜１．５〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、凝集体の形成を防止し得る程度に機械的強度が高く、細胞付着を低減する程度に湾曲しているので、ＦＢＲを効果的に低減することができるとともに、多量の移植及び回収を可能にする、と考えられる。 Thus, from the result of the experimental example in the present embodiment, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.75 to 1.5 [mm] is significantly more biological than the one having a smaller or larger outer diameter. It can be said that the affinity is high. In particular, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] minimizes cell attachment and fibrosis on the surface. The hydrogel fiber 20 having an outer diameter of less than 0.75 [mm] tends to form an aggregate within 2 weeks when implanted in a living body. Aggregate formation is thought to be due to low mechanical strength against physical stress in the peritoneal cavity of mice. Aggregate surface roughness and fiber curvature are believed to facilitate cell attachment and collagen adsorption, promote fibrosis, and cause malfunction of the hydrogel fiber 20, the graft. On the other hand, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter exceeding 1.5 [mm] has a relatively small fiber curvature and reduced cell adhesion, but the fiber volume is too large for the intraperitoneal space of the mouse. It is thought that the stress increases, causing an inflammatory reaction and fibrosis. On the other hand, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 0.75 to 1.5 [mm] has a high mechanical strength that can prevent the formation of aggregates and is curved to a degree that reduces cell adhesion. Therefore, it is considered that FBR can be effectively reduced and a large amount of transplantation and recovery are possible.
また、本実施の形態における実験例の結果から、ラットの膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、化学物質ＳＴＺで誘起された免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの血糖濃度の調整機能による治療能力を備えることが分かる。膵島細胞を内包する外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０が移植されることによって、糖尿病モデルマウスの血糖濃度が、ハイドロゲルファイバ２０が回収されるまでの３月間に亘り、拒絶反応を起こすことなく、正常化された。最適な直径のファイバ状の移植片である外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０は、細胞付着及び線維化を最小限にし、生体内での長期の生き残り及び移植後の回収の容易化を可能とした。なお、コア２１内に膵島細胞とともにＥＣＭが存在することによって膵島細胞の機能性が高まると考えられたが、外径が１．０〔ｍｍ〕のハイドロゲルファイバ２０のコア２１内におけるＥＣＭの存在は、化学物質ＳＴＺで誘起された免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの血糖濃度の調整機能の回復には、わずかな効果しか発揮しないことが分かった。これは、単離された膵島細胞の高い品質と、該膵島細胞自体によってＥＣＭプロテインの分泌に依るものである可能性がある。分化可能な幹細胞由来の膵臓β細胞又は細胞系を移植する場合、細胞とともに内包されるＥＣＭプロテインは、生体内で細胞の機能性を維持可能なものであることが望ましい。 Further, from the result of the experimental example in the present embodiment, the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] enclosing rat islet cells is a diabetes model mouse having an immune function induced by the chemical substance STZ. It can be seen that it has a therapeutic ability by adjusting the blood glucose concentration. By transplanting the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm] containing the islet cells, the blood glucose concentration of the diabetes model mouse is rejected for three months until the hydrogel fiber 20 is recovered. Normalized without reaction. Hydrogel fiber 20 with an outer diameter of 1.0 mm, which is an optimal diameter fiber-like graft, minimizes cell attachment and fibrosis and provides long-term survival in vivo and post-implant recovery. Simplification was possible. Although it was thought that the presence of ECM in the core 21 together with the islet cells enhances the functionality of the islet cells, the presence of ECM in the core 21 of the hydrogel fiber 20 having an outer diameter of 1.0 [mm]. Was found to exert only a slight effect on the recovery of the blood glucose concentration regulating function of the diabetes model mouse having an immune function induced by the chemical substance STZ. This may be due to the high quality of the isolated islet cells and the secretion of ECM protein by the islet cells themselves. When transplanting pancreatic β cells or cell lines derived from differentiable stem cells, it is desirable that the ECM protein encapsulated with the cells is capable of maintaining the functionality of the cells in vivo.
また、ハイドロゲルファイバ２０では、内包された膵島細胞の損失及びはみ出しが発生しない。さらに、外径が数値範囲内であってラットの膵島細胞を内包するハイドロゲルファイバ２０を免疫機能を有する糖尿病モデルマウスの生体内に移植することによって、免疫抑制なしに、長期間に亘る当該モデルマウスの血糖濃度制御が可能となる。 Moreover, in the hydrogel fiber 20, loss of the pancreatic islet cells and protrusion do not occur. Further, by transplanting the hydrogel fiber 20 having an outer diameter within a numerical range and encapsulating rat islet cells into a living body of a diabetic model mouse having an immune function, the model for a long period of time without immunosuppression. The blood glucose concentration of the mouse can be controlled.
このように、本実施の形態における体内移植用のハイドロゲルファイバ２０は、細胞２３を含むコア２１と、ハイドロゲルを含み、コア２１を被覆するシェル２２とを備え、外径が０．７５〔ｍｍ〕以上であり、ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下である。これにより、免疫攻撃を受けることなく、細胞２３を生体の体内に移植することができ、体外へ取り出すこともできる。そして、ハイドロゲルファイバ２０は、表面が線維化してしまうことがなく、凝集してしまうこともなく、体外へ容易に取り出して回収することができる。 Thus, the hydrogel fiber 20 for in-vivo transplantation in this Embodiment is equipped with the core 21 containing the cell 23, the shell 22 which contains the hydrogel and coat | covers the core 21, and an outer diameter is 0.75 [ mm] or more, and the ratio of the outer diameter to the maximum diameter of the abdominal circumference of the living body into which the hydrogel fiber 20 is implanted into the body is 7% or less. Thereby, the cell 23 can be transplanted into the body of a living body without being subjected to an immune attack, and can be taken out of the body. The hydrogel fiber 20 can be easily taken out and collected outside the body without causing the surface to be fibrillated and aggregated.
また、シェル２２は、半透膜として機能し、かかる半透膜は、酸素、栄養分及び細胞の分泌物質の透過を可能とし、細胞２３並びに生体内の免疫細胞及び抗体の透過を不可とする。さらに、コアは、細胞外マトリックスを更に含んでいる。さらに、細胞２３は、分化細胞である。これにより、移植された生体内で細胞２３はその機能性を維持することができる。 Moreover, the shell 22 functions as a semipermeable membrane, and the semipermeable membrane allows permeation of oxygen, nutrients, and secreted substances of cells, and imposes permeation of cells 23 and immune cells and antibodies in vivo. In addition, the core further includes an extracellular matrix. Furthermore, the cell 23 is a differentiated cell. Thereby, the function of the cell 23 can be maintained in the transplanted living body.
さらに、ハイドロゲルファイバ２０の外径は、０．７５〜４０．０〔ｍｍ〕であることが望ましい。この場合、生体の体内への移植に最適である。なお、ハイドロゲルファイバ２０の外径は、０．７５〜２．０〔ｍｍ〕であることがより望ましく、１．０±０．０９〔ｍｍ〕であることがさらに望ましい。 Furthermore, the outer diameter of the hydrogel fiber 20 is desirably 0.75 to 40.0 [mm]. In this case, it is most suitable for transplantation into a living body. The outer diameter of the hydrogel fiber 20 is more preferably 0.75 to 2.0 [mm], and further preferably 1.0 ± 0.09 [mm].
本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ２０を用いた体内移植方法は、細胞２３を含むコア２１と、ハイドロゲルを含み、コア２１を被覆するシェル２２とを備え、外径が０．７５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバ２０が体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下であるハイドロゲルファイバ２０を製造する工程と、ハイドロゲルファイバ２０を生体の体内に移植する工程と、を含んでいる。これにより、免疫攻撃を受けることなく、細胞２３を生体の体内に移植することができる。 The in-vivo transplantation method using the hydrogel fiber 20 according to the present embodiment includes a core 21 containing cells 23 and a shell 22 containing the hydrogel and covering the core 21 and having an outer diameter of 0.75 [mm]. The step of manufacturing the hydrogel fiber 20 in which the ratio of the outer diameter to the maximum diameter of the abdominal circumference of the living body into which the hydrogel fiber 20 is implanted into the body is 7% or less; And transplanting into the body of a living body. Thereby, the cell 23 can be transplanted into the body of a living body without receiving an immune attack.
また、ハイドロゲルファイバ２０を用いた体内移植方法は、ハイドロゲルファイバ２０を生体の体内から取り出して回収する工程を更に含んでいる。したがって、必要に応じて、移植した細胞２３を体外へ取り出すことができる。 The in-vivo transplantation method using the hydrogel fiber 20 further includes a step of removing the hydrogel fiber 20 from the body and collecting it. Therefore, the transplanted cells 23 can be taken out of the body as necessary.
さらに、ハイドロゲルファイバ２０の外径は、０．７５〜４０．０〔ｍｍ〕であることが望ましい。この場合、生体の体内への移植に最適である。なお、ハイドロゲルファイバ２０の外径は、０．７５〜２．０〔ｍｍ〕であることがより望ましく、１．０±０．０９〔ｍｍ〕であることがさらに望ましい。 Furthermore, the outer diameter of the hydrogel fiber 20 is desirably 0.75 to 40.0 [mm]. In this case, it is most suitable for transplantation into a living body. The outer diameter of the hydrogel fiber 20 is more preferably 0.75 to 2.0 [mm], and further preferably 1.0 ± 0.09 [mm].
なお、移植の対象としての生体がヒトであることに、倫理的乃至法律的な制約がある場合には、前記生体からヒトを除外してもよい。 In addition, if there is an ethical or legal restriction that the living body to be transplanted is a human, the human may be excluded from the living body.
近年の再生医療工学の発展によって、ヒト由来の幹細胞を分化することで様々な機能性を有する細胞（分化細胞）を人工的に作製することが可能となってきている。しかしながら、実際の分化細胞を生体内に移植する際には、安全性及び機能性維持の観点から、細胞をデバイスに包埋して移植することが適切であると考えられ、生体適合性の高い移植デバイスの開発が急務となっている。本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ２０に内包された細胞２３は、免疫細胞に攻撃されることなく、異種生体内において機能を維持することが可能であり、必要に応じて生体から取り出すことも可能である。そのため、本実施の形態におけるハイドロゲルファイバ２０は、再生医療分野における移植材料として利用価値が高い、と言える。 With the recent development of regenerative medicine engineering, it has become possible to artificially produce cells (differentiated cells) having various functionalities by differentiating human-derived stem cells. However, when transplanting actual differentiated cells in vivo, it is considered appropriate to implant the cells by embedding them in a device from the viewpoint of safety and functionality maintenance, and have high biocompatibility. There is an urgent need to develop transplant devices. The cell 23 encapsulated in the hydrogel fiber 20 in the present embodiment can maintain its function in a heterogeneous living body without being attacked by immune cells, and can be removed from the living body as necessary. It is. Therefore, it can be said that the hydrogel fiber 20 in the present embodiment has high utility value as a transplant material in the field of regenerative medicine.
なお、本明細書の開示は、好適で例示的な実施の形態に関する特徴を述べたものである。ここに添付された特許請求の範囲内及びその趣旨内における種々の他の実施の形態、修正及び変形は、当業者であれば、本明細書の開示を総覧することによって、当然に考え付くことである。 It should be noted that the disclosure of the present specification describes features related to preferred and exemplary embodiments. Various other embodiments, modifications and variations within the scope and spirit of the claims attached hereto can naturally be conceived by those skilled in the art by reviewing the disclosure herein. is there.
本開示は、体内移植用のハイドロゲルファイバ及びハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法に適用することができる。 The present disclosure can be applied to a hydrogel fiber for body transplantation and a body transplantation method using the hydrogel fiber.
２０ ハイドロゲルファイバ
２１ コア
２２ シェル
２３ 細胞
３０ マウス
20 Hydrogel fiber 21 Core 22 Shell 23 Cell 30 Mouse
Claims (10)
細胞を含むコアと、
ハイドロゲルを含み、前記コアを被覆するシェルとを備え、
外径が０．７５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバが体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下であることを特徴とする体内移植用のハイドロゲルファイバ。 A hydrogel fiber for implantation in a body,
A core containing cells;
Comprising a hydrogel and a shell covering the core;
The outer diameter is 0.75 [mm] or more, and the ratio of the outer diameter to the maximum diameter of the abdominal circumference of the living body into which the hydrogel fiber is implanted into the body is 7 [%] or less. Hydrogel fiber for use.
細胞を含むコアと、ハイドロゲルを含み、前記コアを被覆するシェルとを備え、外径が０．７５〔ｍｍ〕以上であり、前記ハイドロゲルファイバが体内に移植される生体の腹囲の最大直径に対する前記外径の割合が７〔％〕以下であるハイドロゲルファイバを製造する工程と、
前記ハイドロゲルファイバを生体の体内に移植する工程と、
を含むことを特徴とするハイドロゲルファイバを用いた体内移植方法。 An in vivo implantation method using a hydrogel fiber,
A core containing cells, a shell containing hydrogel and covering the core, the outer diameter is 0.75 [mm] or more, and the maximum diameter of the abdominal circumference of a living body in which the hydrogel fiber is implanted in the body A step of producing a hydrogel fiber having a ratio of the outer diameter to 7% or less,
Transplanting the hydrogel fiber into a living body;
A body transplantation method using a hydrogel fiber, comprising:
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