JP2018059926A - Molecule measuring method, and molecule measurement device using the same - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、分子計測法およびそれを用いた分子計測装置に関し、特に分子間相互作用（結合力）の測定方法およびその計測装置に関する。 The present invention relates to a molecular measurement method and a molecular measurement apparatus using the same, and more particularly to a method for measuring an intermolecular interaction (binding force) and a measurement apparatus therefor.
生体分子の優れた分子認識能力を利用したバイオセンサーの研究は世界中で行われている。バイオセンサーの高機能化には生体分子間の相互作用を解析することが必要不可欠である。これまでのところ、特許文献１や非特許文献１、２などのように原子間力顕微鏡(ＡＦＭ：Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ)を用いた生体分子間相互作用測定方法（分子計測法）が実現している。例えば、非特許文献２では、原子間力顕微鏡を用いた生体分子間の相互作用の測定を行う方法と、その測定により生体分子間の結合力が数十〜数百ピコニュートンであることが報告されている。 Research on biosensors using the excellent molecular recognition ability of biomolecules has been conducted all over the world. It is indispensable to analyze the interaction between biomolecules in order to increase the functionality of biosensors. So far, a biomolecular interaction measurement method (molecular measurement method) using an atomic force microscope (AFM) has been realized as in Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2, and the like. . For example, Non-Patent Document 2 reports a method of measuring an interaction between biomolecules using an atomic force microscope, and reports that the binding force between biomolecules is several tens to several hundreds piconewton by the measurement. Has been.
このようなＡＦＭを用いた生体分子間相互作用の測定においては、カンチレバーを生体分子で修飾することが必要であり、一つ一つの相互作用を定量している。また、これによって、生体分子間の結合力の測定が可能となっている。 In the measurement of the interaction between biomolecules using such AFM, it is necessary to modify the cantilever with a biomolecule, and each interaction is quantified. This also makes it possible to measure the binding force between biomolecules.
しかしながら、ＡＦＭを用いた相互作用測定はカンチレバーを生体分子で修飾することが煩雑でありその測定は困難である。また一度に一つの相互作用（結合力）しか定量できない。生体分子に限らずより簡便な分子間相互作用を計測する測定方法（分子計測法）が求められている。 However, in the interaction measurement using AFM, it is complicated to modify the cantilever with a biomolecule, and the measurement is difficult. Only one interaction (binding force) can be quantified at a time. There is a demand for a measurement method (molecular measurement method) that measures not only biomolecules but also simpler intermolecular interactions.
本発明の分子計測法は、第１の分子と、前記第１の分子との相互作用により結合する第２の分子との結合力を測定する分子計測法であって、密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体を作成し、前記結合体と前記密度媒体とを充填したチャンバーを回転数を変化させながら回転させ、隣接する前記第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の回転数より前記結合力を計測することを特徴とする。 The molecular measurement method of the present invention is a molecular measurement method for measuring the binding force between a first molecule and a second molecule that binds by interaction with the first molecule, and has a specific gravity higher than that of a density medium. Small first fine particles, one of the first molecules and the second molecules, the other of the first molecules and the second molecules, and the second fine particles having a specific gravity greater than that of the density medium are sequentially bonded. The number of rotations at the time when the adjacent first fine particles and second fine particles are separated from each other is prepared by rotating a chamber filled with the combination and the density medium while changing the number of rotations. And measuring the binding force.
また本発明の分子計測装置は、計測制御装置と、前記計測制御装置により所定シーケンスにより回転数を変化させながらチャンバーを搭載したディスクを回転させるディスク回転装置と、前記ディスク回転装置のディスクの回転に同期して撮影対象の前記チャンバーをとらえて複数の画像を撮影するカメラとを備え、前記チャンバーは、密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体と、さらに前記密度媒体とを充填され、前記制御装置は、複数の前記画像の画像データから、隣接する前記第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の画像データを抽出し、抽出された前記画像データが撮影された時の前記ディスク装置の回転数を、前記シーケンスの情報から算出し、算出された前記回転数から前記結合力を算出する。 Further, the molecular measurement device of the present invention includes a measurement control device, a disk rotation device that rotates a disk on which a chamber is mounted while changing the number of rotations according to a predetermined sequence by the measurement control device, and rotation of the disk of the disk rotation device. A camera that captures the chamber to be imaged synchronously and captures a plurality of images, and the chamber includes a first microparticle having a specific gravity smaller than that of the density medium, the first molecule, and the second molecule. On the other hand, the control device is filled with a combined body in which the other one of the first molecule and the second molecule, the second fine particles having a specific gravity larger than that of the density medium, and the density medium are further bonded. Extract the image data at the time when the adjacent first fine particles and second fine particles are separated from each other from the image data of the plurality of images, the extracted The rotational speed of the disk device when the image data was shot, is calculated from the information of the sequence, to calculate the coupling force calculated from the rotational speed.
より簡便な分子間相互作用（結合力）の測定方法および測定装置を提供する。 Provided are a simpler method for measuring an intermolecular interaction (binding force) and a measuring apparatus.
以下、本発明の好適な実施の形態につき図面を用いて説明する。 Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
まず、本発明の分子計測法の原理を説明する。図１は、本発明の分子計測法を説明する図である。ここでは、測定対象として図１（１）に示す抗体１（第１の分子）と抗原５（第２の分子）の結合力の測定を一例に説明する。 First, the principle of the molecular measurement method of the present invention will be described. FIG. 1 is a diagram for explaining the molecular measurement method of the present invention. Here, measurement of the binding force between the antibody 1 (first molecule) and the antigen 5 (second molecule) shown in FIG.
（測定原理）
測定対象の一方の抗体１を微粒子(ビーズ）２と結合させた抗体固定化微粒子６、および抗体３を微粒子(ビーズ）４と結合させた抗体固定化微粒子７とをそれぞれ準備する。ここで抗体１および３は共に抗原５と結合できるもの（分子）とする。また、微粒子(ビーズ）２および微粒子(ビーズ）４とは互いに比重の異なっているものを選択する。そして抗体固定化微粒子６と抗体固定化微粒子７とを同じ抗原５に結合させる。つまり微粒子(ビーズ）２−抗体１−抗原５−抗体３−微粒子（ビーズ）４の順に結合させたサンプル（ここでは結合体と称す）１０１を作成する（図１（１））。
(Measurement principle)
An antibody-immobilized fine particle 6 in which one antibody 1 to be measured is bound to a fine particle (bead) 2 and an antibody-immobilized fine particle 7 in which an antibody 3 is bound to a fine particle (bead) 4 are prepared. Here, both antibodies 1 and 3 are assumed to be capable of binding to antigen 5 (molecules). Further, fine particles (beads) 2 and fine particles (beads) 4 having different specific gravity are selected. Then, the antibody-immobilized fine particles 6 and the antibody-immobilized fine particles 7 are bound to the same antigen 5. That is, a sample 101 (hereinafter referred to as a conjugate) in which fine particles (beads) 2 -antibody 1 -antigen 5 -antibody 3 -fine particles (beads) 4 are combined in this order is prepared (FIG. 1 (1)).
次にこのサンプル（結合体）１０１と、比重が微粒子(ビーズ）２と微粒子(ビーズ）４それぞれの比重の間の値である溶媒（パーコール）１０２とからなる懸濁液とする。そして、このサンプル（結合体）すなわち測定対象の抗体１と抗原５との結合部分に引っ張り力を加える。溶媒（パーコール）の中では、微粒子(ビーズ）２、微粒子(ビーズ）４と溶媒（パーコール）１０２の比重の大小関係から一方の微粒子(ビーズ）は浮き、他方の微粒子(ビーズ）が重りとして作用する。ここで、微粒子(ビーズ）２の比重が微粒子(ビーズ）４の比重よりも大きい場合、図１（２）に示すように微粒子(ビーズ）２、４には浮力Ｆ１と重力Ｆ２とが作用する。そして、この懸濁液をマイクロ流路構造のチャンバー９に入れ、チャンバー９全体を回転させて外力Ｆ３（後述するようにこれは例えば遠心力である）を徐々に加える。なお図１では回転軸８を中心にチャンバーをＲ０の向きに回転させる。 Next, a suspension comprising the sample (conjugate) 101 and a solvent (Percoll) 102 whose specific gravity is a value between the specific gravities of the fine particles (beads) 2 and the fine particles (beads) 4 is prepared. Then, a tensile force is applied to the binding portion between the sample (conjugate), that is, the antibody 1 to be measured and the antigen 5. In the solvent (Percoll), one of the fine particles (beads) floats and the other fine particle (beads) acts as a weight because of the specific gravity relationship between the fine particles (beads) 2, fine particles (beads) 4 and the solvent (Percoll) 102. To do. Here, when the specific gravity of the fine particles (beads) 2 is larger than the specific gravity of the fine particles (beads) 4, the buoyancy F1 and the gravity F2 act on the fine particles (beads) 2 and 4, as shown in FIG. . Then, this suspension is put into a chamber 9 having a micro-channel structure, and the entire chamber 9 is rotated to gradually apply an external force F3 (which is, for example, a centrifugal force as described later). In FIG. 1, the chamber is rotated in the direction of R0 about the rotation shaft 8.
その結果、２つの微粒子（ビーズ）は比重の大きいビーズ（ここでは微粒子(ビーズ）４）によって沈降する。そしてチャンバー９の壁面（チャンバーの内側の壁面、内壁面）９ｗと接触することで比重の大きいビーズに作用していた遠心力が壁面９ｗとの反作用力によって打ち消され、引張力は比重が小さいビーズ（ここでは微粒子(ビーズ）２）に作用する浮力と遠心力のみとなる（図１（３））。なお、ここでは結合体にかかる浮力Ｆ１が、重力Ｆ２よりも小さくなるように、２つの微粒子（ビーズ）および溶媒（パーコール）１０２を選択した例で説明している（つまり結合体が沈降し、チャンバー壁面に接触する場合）。したがって結合体はチャンバーの下側（遠心力の働く方向）に接触する。しかしながら浮力Ｆ１が重力Ｆ２より大きい場合は（つまり結合体が浮上し、チャンバー壁面に接触する場合）、ちょうどこの関係を逆転させたようにとらえることができる。つまり結合体はチャンバーの上側（遠心力の起点側の方向）に接触する。 As a result, the two fine particles (beads) are precipitated by beads having a large specific gravity (here, fine particles (beads) 4). The centrifugal force acting on the beads having a large specific gravity by contacting with the wall surface 9w (the inner wall surface and the inner wall surface) of the chamber 9 is canceled by the reaction force with the wall surface 9w, and the tensile force is a bead having a small specific gravity. Only buoyancy and centrifugal force acting on the microparticles (beads 2 here) are present (FIG. 1 (3)). Here, an example in which two fine particles (beads) and a solvent (Percoll) 102 are selected so that the buoyancy F1 applied to the conjugate is smaller than the gravity F2 (that is, the conjugate is settled, Contact the chamber wall). Therefore, the bonded body comes into contact with the lower side of the chamber (direction of centrifugal force). However, when the buoyancy F1 is greater than the gravity F2 (that is, when the combined body floats and contacts the chamber wall surface), this relationship can be regarded as just reversed. That is, the combined body comes into contact with the upper side of the chamber (direction of the centrifugal force starting side).
さらに、この状態から回転速度を増加させていくと、サンプル（結合体）に作用する力は大きくなりある回転数に達した時点でサンプル（結合体）の結合が破断して２つのビーズが分離する（図１（４））。したがって分離したときのチャンバーの回転数がわかれば、このときの引張力を求めることができ、サンプル（結合体）の結合力を見積もることができる。 Furthermore, if the rotational speed is increased from this state, the force acting on the sample (conjugate) increases, and when the rotation speed reaches a certain number of times, the binding of the sample (conjugate) is broken and the two beads are separated. (FIG. 1 (4)). Therefore, if the number of rotations of the chamber when separated is known, the tensile force at this time can be obtained, and the binding force of the sample (conjugate) can be estimated.
ここでサンプル（結合体）は微粒子(ビーズ）２−抗体１−抗原５−抗体３−微粒子（ビーズ）４の順に結合させたものであるから、測定対象が抗体１と抗原５の結合力である場合は、この結合力が一番弱くなるように抗体、抗原あるいは微粒子(ビーズ）の材料を選定すればよい。なお、抗体１，３は微粒子（ビーズ）２，４とくらべ後述するようにその大きさや質量が極めて小さく、抗体固定化微粒子６、７はそれぞれ実質的に微粒子（ビーズ）２，４の比重（あるいは密度）である。また測定対象に結合を図１（４）に示す結合が取れた部分、すなわち抗体１と抗原５の結合部分とすると、サンプル（結合体）は、微粒子(ビーズ）２（第１の微粒子）−抗体１（第１の分子）−抗原５（第２の分子）−抗体固定化微粒子７（第２の微粒子）のように構成しているとみなすことができる。 Here, since the sample (conjugate) is obtained by binding in the order of fine particles (beads) 2 -antibody 1 -antigen 5 -antibody 3 -fine particles (beads) 4, the measurement target is the binding force between antibody 1 and antigen 5. In some cases, the antibody, antigen, or fine particle (bead) material may be selected so that the binding force is the weakest. As will be described later, antibodies 1 and 3 are extremely small in size and mass as will be described later, and antibody-immobilized microparticles 6 and 7 are substantially specific gravity of microparticles (beads) 2 and 4, respectively. Or density). Further, if the binding to the measurement target is the part shown in FIG. 1 (4), that is, the binding part of antibody 1 and antigen 5, the sample (conjugate) is fine particle (bead) 2 (first fine particle) − It can be considered that it is constituted as antibody 1 (first molecule) -antigen 5 (second molecule) -antibody-immobilized fine particle 7 (second fine particle).
（測定の方法）
測定原理に示したように、第１の分子（例えば抗体１）と、この第１の分子との相互作用により結合する第２の分子（例えば抗原５）との結合力を測定する本発明の分子計測法は、次のような手順で分子間の相互作用（結合力）を測定する。
(Measurement method)
As shown in the measurement principle, the present invention measures the binding force between a first molecule (for example, antibody 1) and a second molecule (for example, antigen 5) that binds by interaction with the first molecule. In the molecular measurement method, the interaction (binding force) between molecules is measured by the following procedure.
まず、図１（１）に示すように、パーコールよりも比重の小さい第１の微粒子（例えば微粒子２や実験例においてのポリスチレン微粒子）、第１の分子と第２の分子の一方、第１の分子と第２の分子の他方、パーコールよりも比重の大きい第２の微粒子（例えば、抗体固定化微粒子７や実験例においての抗体を結合したシリカ微粒子）の順にそれぞれ結合させた結合体（例えば１０１）を作成する。（ステップ１） First, as shown in FIG. 1 (1), the first fine particles having a specific gravity smaller than that of Percoll (for example, fine particles 2 or polystyrene fine particles in the experimental example), one of the first molecules and the second molecules, Conjugates (for example, 101) that are bonded in the order of the second fine particles (for example, the antibody-immobilized fine particles 7 and the silica fine particles to which the antibody in the experimental example is bound) having a specific gravity greater than that of Percoll, the other of the molecule and the second molecule. ). (Step 1)
次に、図１（２）に示すように、結合体とパーコールとを充填したチャンバー９を回転数を変化させながら回転させる。（ステップ２） Next, as shown in FIG. 1 (2), the chamber 9 filled with the combined body and percoll is rotated while changing the rotational speed. (Step 2)
そして、図１（３）に示すように、回転数を上昇させて、パーコールよりも比重の大きい第２の微粒子を遠心力が向かう方向のチャンバー９の壁面に押し付け、第２の微粒子にかかる遠心力をチャンバー９の壁面での反作用で打ち消すようにする。（ステップ３） Then, as shown in FIG. 1 (3), the number of rotations is increased, the second fine particles having a specific gravity larger than that of Percoll are pressed against the wall surface of the chamber 9 in the direction of the centrifugal force, and the centrifugal force applied to the second fine particles The force is canceled by the reaction on the wall surface of the chamber 9. (Step 3)
さらに、図１（４）に示すように、隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れるまで回転数を上げ、隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れる時点の回転数を計測、その回転数から結合力を算出する。（ステップ４）なお、後述するようにステップ１での結合体の構成形態により、ステップ３を取り除くことが可能である。 Further, as shown in FIG. 1 (4), the rotational speed is increased until the adjacent first fine particles and the second fine particles are separated from each other, and the rotational speed at the time when the adjacent first fine particles and the second fine particles are separated from each other. And the binding force is calculated from the number of rotations. (Step 4) As will be described later, Step 3 can be eliminated depending on the configuration of the combined body in Step 1.
上記した測定原理や測定の方法では、サンプル（結合体）１０１と、比重が微粒子(ビーズ）２と微粒子(ビーズ）４それぞれの比重の間の値である溶媒（パーコール）１０２を用いるとして説明した。この溶媒（パーコール）１０２としては、溶媒やパーコールに限らずショ糖溶液、塩化シシウム、Ｆｉｃｏｌｌなどを２つの微粒子（２、４）あるいは結合体１０１に外力（遠心力）を与える媒体とすることができる。本発明では、２つの微粒子（２、４）の間の比重（あるいは密度）を有し２つの微粒子（２、４）あるいは結合体１０１に外力（遠心力）を与える媒体であればよい。本発明では、このような媒体を密度媒体（ｄｅｎｓｉｔｙ ｍｅｄｉａ）と称する。 In the measurement principle and measurement method described above, the sample (conjugate) 101 and the solvent (Percoll) 102 whose specific gravity is a value between the specific gravity of each of the fine particles (beads) 2 and the fine particles (beads) 4 are described. . The solvent (Percoll) 102 is not limited to a solvent or Percoll, but a sucrose solution, cesium chloride, Ficoll, or the like may be used as a medium for applying an external force (centrifugal force) to the two fine particles (2, 4) or the combined body 101. it can. In the present invention, any medium having a specific gravity (or density) between the two fine particles (2, 4) and applying an external force (centrifugal force) to the two fine particles (2, 4) or the combined body 101 may be used. In the present invention, such a medium is referred to as a density medium.
なお、本発明の測定原理においては、測定対象として抗体１と抗原５の結合力の測定を例に説明したが、本発明の分子計測法は、結合体の構成を様々な材料に代えることで様々な分子間の結合力の測定が可能である。 In the measurement principle of the present invention, the measurement of the binding force between the antibody 1 and the antigen 5 has been described as an example of the measurement target. However, the molecular measurement method of the present invention can change the configuration of the conjugate to various materials. It is possible to measure the bond strength between various molecules.
（測定の対象）
本発明の分子計測法は、抗体１と抗原５の結合力の測定の他に、ある特定の分子と相互作用を備える（すなわち結合する）プローブ分子とその特定の分子との結合力の測定が代表的な測定対象となる。そうしたものの中では、例えば特定の分子と特異的に結合するアプタマー（核酸分子やペプチドなど）とその特定の分子との結合力の測定等がある。
(Measurement target)
In the molecular measurement method of the present invention, in addition to the measurement of the binding force between the antibody 1 and the antigen 5, the measurement of the binding force between a probe molecule having an interaction (that is, binding) with a specific molecule and the specific molecule is possible. This is a typical measurement target. Among them, for example, there is measurement of the binding force between an aptamer (such as a nucleic acid molecule or a peptide) that specifically binds to a specific molecule and the specific molecule.
（微粒子の形態）
上述した抗体の他に、アプタマー、ビオチンなどの分子相互作用能のある分子を微粒子２、４の表面に固定化するようにしてもよい。また微粒子の種類には樹脂粒子、無機材料粒子、ゲルビーズさらにはポリマーソームやリポソームなどの小胞体であってもよい。
(Fine particle form)
In addition to the above-described antibodies, molecules having molecular interaction ability such as aptamer and biotin may be immobilized on the surfaces of the fine particles 2 and 4. The fine particles may be resin particles, inorganic material particles, gel beads, or vesicles such as polymersomes and liposomes.
さらに微粒子の結合に関与する分子数を制御する目的で微粒子表面に固定化する分子の密度を適当に調整することもできる。また、トポロジー効果による分子結合数制御を目的として粒子表面や固相表面にナノ・マイクロ構造を形成することもできる。 Furthermore, the density of molecules immobilized on the surface of the fine particles can be appropriately adjusted for the purpose of controlling the number of molecules involved in the fine particle binding. In addition, for the purpose of controlling the number of molecular bonds by the topology effect, a nano / micro structure can be formed on the particle surface or solid surface.
（結合体の形態）
上述した例では、抗体固定化微粒子６、７がともに抗原５を介して結合される例を示した。本発明は、抗体に限らず互いに分子相互作用能のある分子に使用可能である。つまり、相互作用（結合）する一方の分子（抗体１，３）をそれぞれ微粒子２、４に結合（固定化）させた分子固定化微粒子（抗体固定化微粒子６、７）を作成し、これらを相互作用（結合）する他方の分子（抗原５）を介して結合させるように結合体を構成した。しかしながら、他方の分子も直接微粒子に結合（固定化）させるように結合体を構成してもよい。
(Conjugate form)
In the above-described example, the antibody-immobilized fine particles 6 and 7 are both bound through the antigen 5. The present invention can be used not only for antibodies but also for molecules having molecular interaction ability. That is, molecule-immobilized microparticles (antibody-immobilized microparticles 6 and 7) are prepared by binding (immobilizing) one molecule (antibody 1 and 3) that interacts (bonds) to microparticles 2 and 4, respectively. The conjugate was configured to bind via the other interacting (binding) molecule (antigen 5). However, the conjugate may be configured so that the other molecule is directly bound (immobilized) to the fine particles.
また、上述の例では２つの微粒子２、４を用いて説明したが、後述するように一方の微粒子を単に個体表面に置き換えてもよい。つまり、たとえば微粒子４に代えて壁面９ｗに抗体３を結合させたチャンバーをあらかじめ用意し、これに抗体１と微粒子２が結合した抗体固定化微粒子６を抗原５を介してチャンバー壁面９ｗと抗体固定化微粒子６とを結合するようにサンプル（結合体）を構成してもよい。この場合は、チャンバー壁面９ｗ−抗体３−抗原５−抗体１−微粒子２の順に結合された結合体となる。 In the above example, the two fine particles 2 and 4 are used for explanation. However, as will be described later, one fine particle may be simply replaced with the solid surface. That is, for example, instead of the fine particles 4, a chamber in which the antibody 3 is bound to the wall surface 9 w is prepared in advance, and the antibody-immobilized fine particles 6 in which the antibody 1 and the fine particles 2 are bound thereto The sample (conjugate) may be configured to bind to the activated microparticles 6. In this case, it becomes the conjugate | bonded_body couple | bonded in order of the chamber wall surface 9w-antibody 3-antigen 5-antibody 1-microparticle 2. FIG.
次に本発明の分子計測法を用いる分子計測装置について説明する。図２は、本発明の分子計測法を用いる分子計測装置を示す図である。 Next, a molecular measurement apparatus using the molecular measurement method of the present invention will be described. FIG. 2 is a diagram showing a molecular measurement apparatus using the molecular measurement method of the present invention.
本発明の分子計測装置１０は、ＣＣＤカメラ１１、キセノンランプ１２、対物レンズ（Ｏｂｊｅｃｔ Ｌｅｎｓ）１６、ハーフミラー１７、鏡筒１８、固定台２０、ディスク回転装置２１とを備えている。また、計測制御装置１９をさらに備える。計測制御装置１９は、信号ＣＳ１〜ＣＳ３によって、ＣＣＤカメラ１１、キセノンランプ１２、対物レンズ（Ｏｂｊｅｃｔ Ｌｅｎｓ）１６、ディスク回転装置２１の動作制御を行う。また、ＣＣＤカメラ１１から撮影データを取り込み、撮影データやＣＣＤカメラ１１、キセノンランプ１２、対物レンズ（Ｏｂｊｅｃｔ Ｌｅｎｓ）１６、ディスク回転装置２１の動作制御情報などのデータ整理を行う。 The molecular measuring apparatus 10 of the present invention includes a CCD camera 11, a xenon lamp 12, an objective lens 16, a half mirror 17, a lens barrel 18, a fixed base 20, and a disk rotating device 21. The measurement control device 19 is further provided. The measurement control device 19 controls operations of the CCD camera 11, the xenon lamp 12, the objective lens (Object Lens) 16, and the disk rotation device 21 by signals CS <b> 1 to CS <b> 3. Further, it captures image data from the CCD camera 11 and organizes data such as operation data of the image data, the CCD camera 11, the xenon lamp 12, the objective lens 16, and the disk rotating device 21.
固定台２０は、鏡筒１８、キセノンランプ１２、ディスク回転装置２１が備え付けられ、鏡筒１８にはさらにＣＣＤカメラ１１がセットされる。 The fixed base 20 is provided with a lens barrel 18, a xenon lamp 12, and a disk rotating device 21, and a CCD camera 11 is further set on the lens barrel 18.
また鏡筒１８は、固定台２０に設置されたキセノンランプ１２からのランプ光が、ラインＬ１に沿って鏡筒１８内のハーフミラー１７で受けるように構成される。ハーフミラー１７は、ランプ光（キセノンランプ光）を鏡筒１８のラインＬ１に沿ってハーフミラー１７から対物レンズ１６の方向にこのランプ光を反射する。そしてランプ光は対物レンズ１６を介してターゲットに照射される。ターゲットからのラインＬ１に沿った反射光を対物レンズ１６、鏡筒１８を経てＣＣＤカメラ１１で受ける。ＣＣＤカメラ１１はターゲットからの反射光によりターゲット表面の画像を取り込む。 The lens barrel 18 is configured such that the lamp light from the xenon lamp 12 installed on the fixed base 20 is received by the half mirror 17 in the lens barrel 18 along the line L1. The half mirror 17 reflects the lamp light (xenon lamp light) from the half mirror 17 toward the objective lens 16 along the line L 1 of the lens barrel 18. The lamp light is irradiated to the target via the objective lens 16. Reflected light from the target along the line L 1 is received by the CCD camera 11 through the objective lens 16 and the lens barrel 18. The CCD camera 11 captures an image of the target surface by reflected light from the target.
ディスク回転装置は、後述するマイクロ流路型チャンバーを備えたディスク１３がセットされる。上記したターゲットはこのディスク上に形成されたチャンバーであり、対物レンズ１６ならびにＣＣＤカメラ１１は、このチャンバーの位置に焦点が合うよう設定される。 In the disk rotating device, a disk 13 having a micro-channel chamber described later is set. The above-described target is a chamber formed on the disk, and the objective lens 16 and the CCD camera 11 are set so as to focus on the position of the chamber.
次にディスク１３について説明する。図３はマイクロ流路型チャンバーを備えたディスクを示す図である。ディスク１３はＣＤ（Ｃｏｍｐａｃｔ Ｄｉｓｃ）とほぼ同じ形状である。したがって中心部にディスク回転装置２１の回転軸の軸受用の孔１５を備えている。ディスク１３を基板として、この基板上にジメチルポリシロキサン（ＰＭＤＳ）を材料としたマイクロ流路型デバイスチップ１４を備える。マイクロ流路型デバイスチップ１４には例えば、チャンバー（マイクロチャンバー）３１が複数パターニングされている。なお、図３においては、１つのマイクロ流路型デバイスチップ１４を基板のディスク１３に取り付ける構成を示しているが、ディスク１３に直接チャンバー３１を形成してもよいし、複数のマイクロ流路型デバイスチップ１４をディスク１３全面に張り付けるようにしてもよい。 Next, the disk 13 will be described. FIG. 3 is a view showing a disk provided with a microchannel chamber. The disk 13 has substantially the same shape as a CD (Compact Disc). Therefore, a hole 15 for a bearing of the rotating shaft of the disk rotating device 21 is provided at the center. A disk 13 is used as a substrate, and a microchannel device chip 14 made of dimethylpolysiloxane (PMDS) is provided on the substrate. For example, a plurality of chambers (microchambers) 31 are patterned on the microchannel device chip 14. 3 shows a configuration in which one microchannel device chip 14 is attached to the substrate disk 13, the chamber 31 may be formed directly on the disk 13, or a plurality of microchannel types may be formed. The device chip 14 may be attached to the entire surface of the disk 13.
このように構成されたディスク１３のチャンバー３１に上述したサンプル（結合体）を溶媒（パーコール）１０２とともにセットする。この時キセノンランプ光がディスク１３のチャンバー３１の表面にあたるようにディスク回転装置２１の回転軸を所望の位置にあわせ、ＣＣＤカメラの撮影画像の焦点がターゲットのチャンバー３１に合うようにセットする。 The above-described sample (conjugate) is set together with the solvent (Percoll) 102 in the chamber 31 of the disk 13 thus configured. At this time, the rotation axis of the disk rotating device 21 is set to a desired position so that the xenon lamp light hits the surface of the chamber 31 of the disk 13, and the image taken by the CCD camera is set to be in focus with the target chamber 31.
計測制御装置１９は、所定のシーケンスに従ってディスク回転装置２１に回転させ、サンプル（結合体）に外力Ｆ３（遠心力）を印加する。また、このシーケンスに従い、ディスク１３上にある観測対象のチャンバー３１をストロボ撮影するようＣＣＤカメラ１１、キセノンランプ１２のオンオフを制御する。すなわち、ディスク１３が１回転（あるいは整数回）するたびに計測が終了するまでディスクの回転に同期して、計測するチャンバーをとらえるようにＣＣＤカメラ１１、ディスク回転装置２１、キセノンランプ１２を制御する。また、ディスクの回転を徐々に上げていき印加する遠心力を強めるようシーケンス制御する。 The measurement control device 19 rotates the disk rotation device 21 according to a predetermined sequence, and applies an external force F3 (centrifugal force) to the sample (conjugate). Further, according to this sequence, the on / off of the CCD camera 11 and the xenon lamp 12 is controlled so that the observation target chamber 31 on the disk 13 is flash-photographed. That is, the CCD camera 11, the disk rotating device 21, and the xenon lamp 12 are controlled so as to capture the chamber to be measured in synchronization with the rotation of the disk every time the disk 13 is rotated once (or an integer number of times). . In addition, the sequence control is performed so as to increase the centrifugal force by gradually increasing the rotation of the disk.
また計測制御装置１９は、キセノンランプ１２のオンオフ制御の他、ランプ光の強度の制御、ならびに対物レンズ（Ｏｂｊｅｃｔ Ｌｅｎｓ）１６を含めた焦点合わせ制御を行うようにしてもよい。 In addition to the on / off control of the xenon lamp 12, the measurement control device 19 may perform control of lamp light intensity and focus control including an objective lens (Object Lens) 16.
なお、計測制御装置１９は撮影データを取り込むデータを収集する。計測制御装置１９にＰＣなどのデータ処理装置（不図示）およびデータ処理ソフトを搭載して、データ処理装置が撮影データから結合体の切断時点を判断し、その時点のディスク１３の回転数や時間などを集計するようにしてもよい。画像のデータの判断は、データ処理装置やデータ処理ソフトにより機械学習可能なニューラルネットワークを組み込むことで、精度のよい実現が可能である。 Note that the measurement control device 19 collects data for capturing image data. A data processing device (not shown) such as a PC and data processing software are mounted on the measurement control device 19, and the data processing device determines the cutting time of the combined body from the photographed data, and the rotational speed and time of the disk 13 at that time. You may make it total. The determination of image data can be realized with high accuracy by incorporating a neural network that can be machine-learned by a data processing device or data processing software.
（実験例）
上記した原理に基づいて、抗マウスＩｇＧ抗体とマウスＩｇＧとの抗原抗体反応による結合の結合力の測定の実証例に以下に示す。
(Experimental example)
Based on the above principle, an example of measurement of the binding force of an anti-mouse IgG antibody and mouse IgG by the antigen-antibody reaction is shown below.
まず、測定に用いるマイクロ流路型デバイスチップ１４は、５ｍｍ角のジメチルポリシロキサン(ＰＤＭＳ)製チップとした。このデバイスチップ１４には、直径２００μｍのマイクロチャンバー３１を複数パターニングした。 First, the microchannel device chip 14 used for the measurement was a 5 mm square dimethylpolysiloxane (PDMS) chip. A plurality of micro chambers 31 having a diameter of 200 μm were patterned on the device chip 14.
直径２０μｍのポリスチレンとシリカの２つの微粒子（ビーズ）を用意し、ともに抗マウスＩｇＧ抗体を共有結合によって固定化し抗体固定化微粒子を作成した。この固定化は、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）をその表面に備え付けた微粒子に、抗体のアミン（-ＮＨ２）と脱水縮合反応によりエステル結合させ行った。 Two microparticles (beads) of polystyrene and silica having a diameter of 20 μm were prepared, and anti-mouse IgG antibody was immobilized by covalent bonding to produce antibody-immobilized microparticles. This immobilization was performed by ester-bonding fine particles having a carboxyl group (—COOH) on the surface thereof with an amine (—NH 2 ) of an antibody by a dehydration condensation reaction.
抗体を固定化した２種のビーズに抗原であるマウスＩｇＧを加えて抗原抗体反応によって結合させた（サンドイッチ反応）。このようにしてポリスチレン微粒子−抗マウスＩｇＧ抗体−マウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体−シリカ微粒子の順に結合された結合体を得た。なお、抗マウスＩｇＧ抗体はポリクローナル抗体であり、１つの抗原に対し複数の抗体が結合できる。ポリスチレン粒子、シリカ粒子の大きさは直径約２０ｕｍであり、分子量１０００００程度の抗マウスＩｇＧはこれらに比べると極めて小さいため、ほぼ粒子同士が結合しているように見える。また、２つの微粒子（ビーズ）と抗マウスＩｇＧ抗体とはどちらも極めて強力な結合である共有結合のため、引っ張り力を加えた場合、まずは、マウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体が切断される。 Mouse IgG as an antigen was added to the two types of beads on which the antibody was immobilized, and bound by antigen-antibody reaction (sandwich reaction). Thus, a conjugate in which polystyrene microparticles-anti-mouse IgG antibody-mouse IgG-anti-mouse IgG antibody-silica microparticles were bonded in this order was obtained. The anti-mouse IgG antibody is a polyclonal antibody, and a plurality of antibodies can bind to one antigen. The size of polystyrene particles and silica particles is about 20 μm in diameter, and anti-mouse IgG having a molecular weight of about 100,000 is extremely small compared to these, so that it seems that the particles are almost bound to each other. In addition, since the two microparticles (beads) and the anti-mouse IgG antibody are both covalent bonds that are extremely strong bonds, when a tensile force is applied, first, the mouse IgG-anti-mouse IgG antibody is cleaved.
この結合体（結合した２つの微粒子（ビーズ））を、ポリスチレン微粒子とシリカ微粒子のそれぞれの比重（あるいは密度）の間となる比重（あるいは密度）に調整したパーコール（Percoll）液（溶媒）と共にマイクロ流路型デバイスチップ１４のマイクロチャンバー３１に封入した。ポリスチレン微粒子の密度は１０５２．６［ｋｇ／ｍ３］、シリカ微粒子の密度はおよそ２０００［ｋｇ／ｍ３］、したがって溶媒（パーコール）はその密度が１０９４．３［ｋｇ／ｍ３］のものを選択した。また、本実験ではディスク１３上のマイクロチャンバー３１は、ディスク１３の中心（回転軸の中心）から４．５ｃｍ（回転半径が４．５ｃｍ）となる位置に配置した。なお、本実験では、パーコールは、１０ｎｍ程度のシリカのナノ粒子をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングしたゾルを利用した。 This combined body (two bonded fine particles (beads)) is microscopically combined with a Percoll solution (solvent) adjusted to a specific gravity (or density) between the specific gravity (or density) of polystyrene fine particles and silica fine particles. It was enclosed in the micro chamber 31 of the flow path type device chip 14. The density of polystyrene fine particles is 1052.6 [kg / m 3 ], the density of silica fine particles is about 2000 [kg / m 3 ], and therefore the solvent (Percoll) has a density of 1094.3 [kg / m 3 ]. Selected. In this experiment, the microchamber 31 on the disk 13 was arranged at a position 4.5 cm (the rotation radius is 4.5 cm) from the center of the disk 13 (center of the rotation axis). In this experiment, Percoll used a sol in which silica nanoparticles of about 10 nm were coated with polyethylene glycol (PEG).
この結合体とパーコール液とを封入したマイクロチャンバー３１を備えたディスク１３を図２に示す実験装置（分子計測装置１０）に取り付け、遠心力を印加し、結合体の挙動を観測した。実際は上述のように２つの微粒子（ビーズ）が結合しているように見えるため、微粒子（ビーズ）の挙動を観察した。測定は、ディスク１３の回転数を実験装置のシーケンス制御により、０ｒｐｍから１００ｒｐｍ／ｓの上昇スピードで徐々に上げていき、結合が切れたところまで観測を行った。 The disc 13 provided with the microchamber 31 enclosing the conjugate and Percoll solution was attached to the experimental device (molecular measuring device 10) shown in FIG. 2, and centrifugal force was applied to observe the behavior of the conjugate. Actually, since the two fine particles (beads) seem to be bonded as described above, the behavior of the fine particles (beads) was observed. In the measurement, the number of rotations of the disk 13 was gradually increased from 0 rpm to 100 rpm / s by the sequence control of the experimental apparatus, and observation was performed until the bond was broken.
ディスク１３を取り付けた回転系が回転することで結合体に遠心力が印加される。回転している結合体の挙動は、系の回転周期と同期したキセノンランプから発するストロボ光によって顕微鏡画像を撮影し、観察を行った。 Centrifugal force is applied to the combined body as the rotating system to which the disk 13 is attached rotates. The behavior of the rotating conjugate was observed by taking a microscopic image with strobe light emitted from a xenon lamp synchronized with the rotation period of the system.
（結果）
ディスクの回転数が（１）略０ｒｐｍ、（２）５００ｒｐｍ、（３）９００ｒｐｍ、（４）１０００ｒｐｍにおけるチャンバー内のポリスチレン微粒子４１およびシリカ微粒子４２の様子を図４に示す。なお、図４はディスク１３の回転数を０ｒｐｍから１００ｒｐｍ／ｓの上昇スピードで徐々に上げて観測した結果であるので、図４（１）は測定開始時、図４（２）は５ｓ（ｓｅｃｏｎｄ）後、図４（３）は９ｓ後、図４（４）は１０ｓ後の状態である。ポリスチレン微粒子と隣接したシリカ微粒子は、１０００ｒｐｍに達した瞬間に分離した。また、図５に１０００ｒｐｍに達した時点でのより詳細な分離の瞬間のポリスチレン微粒子４１およびシリカ微粒子４２の様子を示す。図５（１）は１０００ｒｐｍに達した時点、図５（２）はその６０ｍｓ後、図５（３）はその１２０ｍｓ後、図５（４）はその１８０ｍｓ後、図５（５）はその２４０ｍｓ後の状態を示している。図４、図５とも図の上から下方向に遠心力が印加されている。
(result)
FIG. 4 shows the state of the polystyrene fine particles 41 and the silica fine particles 42 in the chamber when the number of rotations of the disk is (1) approximately 0 rpm, (2) 500 rpm, (3) 900 rpm, and (4) 1000 rpm. 4 shows the result of observation by gradually increasing the rotational speed of the disk 13 from 0 rpm to 100 rpm / s, so that FIG. 4 (1) is the start of measurement, and FIG. 4 (2) is 5 s (second). ), FIG. 4 (3) shows a state after 9 s, and FIG. 4 (4) shows a state after 10 s. Silica fine particles adjacent to the polystyrene fine particles were separated at the moment of reaching 1000 rpm. Further, FIG. 5 shows the state of the polystyrene fine particles 41 and the silica fine particles 42 at the time of more detailed separation when reaching 1000 rpm. 5 (1) is 1000 rpm, FIG. 5 (2) is 60 ms later, FIG. 5 (3) is 120 ms later, FIG. 5 (4) is 180 ms later, and FIG. 5 (5) is 240 ms later. The later state is shown. In both FIG. 4 and FIG. 5, centrifugal force is applied from the top to the bottom of the figure.
隣接したポリスチレンとシリカの両微粒子（ビーズ）を観察した場合、抗体抗原反応によって微粒子（ビーズ）同士が結合しているか、もしくは、結合していないポリスチレンビーズが遠心力を印加する前に天井方向に浮上し天井のカバーガラスと接触しており、顕微鏡で上から見た際に隣接しているように見えているかの２通りが考えられる。カバーガラスと接触しているシリカ微粒子（ビーズ）と隣接しているように見えるポリスチレン微粒子（ビーズ）は、回転系が回転し遠心力を印加し始めた直後、つまり１０００ｒｐｍに満たない回転数ですべて浮上しシリカ微粒子（ビーズ）と分離していたため１０００ｒｐｍで分離した微粒子（ビーズ）は，重なって結合しているように見える微粒子（ビーズ）ではなく，確かにシリカ微粒子（ビーズ）と抗原抗体反応によって結合していたと考えられる。 When both fine particles (beads) of polystyrene and silica adjacent to each other are observed, the fine particles (beads) are bound to each other by an antibody antigen reaction, or unbound polystyrene beads are directed toward the ceiling before applying centrifugal force. There are two possible ways of floating and coming into contact with the ceiling cover glass and appearing to be adjacent when viewed from above with a microscope. The polystyrene fine particles (beads) that appear to be adjacent to the silica fine particles (beads) that are in contact with the cover glass are all immediately after the rotation system starts rotating and the application of centrifugal force, that is, at a rotation speed of less than 1000 rpm. Since the particles floated and separated from the silica particles (beads), the particles (beads) separated at 1000 rpm are not the particles (beads) that seem to be bonded in an overlapping manner. It is thought that it was united.
以上からポリスチレンとシリカ同士隣接した微粒子（ビーズ）が分離したことをもって、マウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体が切断されたと判断できる。したがってこの時の回転数１０００ｒｐｍからこの時点でマウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体結合に引っ張った力は次の通り求めることができる。 From the above, it can be determined that the mouse IgG-anti-mouse IgG antibody was cleaved when the fine particles (beads) adjacent to each other of polystyrene and silica were separated. Therefore, the force pulled from the rotation speed of 1000 rpm to the mouse IgG-anti-mouse IgG antibody binding at this time can be determined as follows.
シリカ微粒子４２に比べポリスチレン微粒子４１の方が密度が小さいため、マウスＩｇＧ−抗マウスＩｇＧ抗体の結合を引っ張る力は溶媒（パーコール）でポリスチレン微粒子４１に作用する力を求めればよい。 Since the polystyrene fine particles 41 have a lower density than the silica fine particles 42, the force pulling the binding between the mouse IgG and the anti-mouse IgG antibody may be determined by the force acting on the polystyrene fine particles 41 with a solvent (Percoll).
流体密度（密度媒体）ρf［ｋｇ／ｍ３］のとき、体積Ｖ［ｍ３］の物体に作用する浮力Ｆb［Ｎ］は、重力加速度をｇ［ｍ／ｓ２］とすると、 When the fluid density (density medium) ρf [kg / m 3 ], the buoyancy Fb [N] acting on the object having the volume V [m 3 ] is expressed as follows: g [m / s 2 ]
Ｆｂ ＝ ρf・Ｖ・ｇ ［Ｎ］ ・・・式１ Fb = ρf · V · g [N] Formula 1
として求められる。物体の密度がρsの時、浮力と重力の合力Ｆは上向きを正として、 As required. When the density of the object is ρs, the resultant force F of buoyancy and gravity is positive,
Ｆ ＝ （ρf−ρs）・Ｖ・ｇ ［Ｎ］ ・・・ 式２ F = (ρf−ρs) · V · g [N] Equation 2
として求められる。ここで遠心力によってポリスチレン微粒子に作用する引っ張り力は式２のｇの代わりに相対遠心加速度ＲＣＦ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｏｒｃｅ）を持ちいればよい（実際ＲＣＦは重力加速度ｇに対する比なのでｇをＲＣＦ・ｇとみなす）。したがって As required. Here, the tensile force acting on the polystyrene fine particles by the centrifugal force may have a relative centrifugal acceleration RCF (Relativistic Centrifugal Force) instead of g in Equation 2 (actually RCF is a ratio to the gravitational acceleration g, so g is expressed as RCF · g. I reckon). Therefore
Ｆ ＝ （ρf−ρs）・Ｖ・ＲＣＦ［×ｇ］ ［Ｎ］ ・・・ 式３ F = (ρf−ρs) · V · RCF [× g] [N] Expression 3
となる。微粒子（ビーズ）にかかる相対遠心加速度ＲＣＦは、回転系の加速度をａ、重力加速度をｇとすると、 It becomes. The relative centrifugal acceleration RCF applied to the fine particles (beads) is expressed as follows.
ＲＣＦ＝ａ／ｇ ・・・ 式４ RCF = a / g Formula 4
で求められる。ここで、回転系の加速度ａならびに回転角速度ωは回転半径をｒ[ｍ］、回転数Ｎ［ｒｐｍ］とするとそれぞれ式５、６ Is required. Here, the acceleration a and the rotational angular velocity ω of the rotating system are expressed by equations 5 and 6 when the rotational radius is r [m] and the rotational speed N [rpm], respectively.
回転系の加速度 ａ ＝ ｒω２ ・・・式５ Rotational acceleration a = rω 2 Equation 5
回転角速度 ω ＝ ２πＮ／６０ ・・・式６ Rotational angular velocity ω = 2πN / 60 Equation 6
である。重力加速度（ｇ）≒９.８０６６５［ｍ／ｓ２］であるので、式４〜６により It is. Since gravitational acceleration (g) ≈9.80665 [m / s 2 ],
ＲＣＦ≒ｒω２／ｇ＝４ｒ・π２・Ｎ２／（３６００・ｇ）［×ｇ］≒１１１８・ｒ・Ｎ２・１０−６［×ｇ］ RCF≈rω 2 / g = 4r · π 2 · N 2 / (3600 · g) [× g] ≈1118 · r · N 2 · 10 −6 [× g]
となる。したがってポリスチレン微粒子に作用する力は、回転半径ｒ＝４．５×１０−２［ｍ］、切断時の回転数Ｎ＝１０００［ｒｐｍ］、溶媒の密度ρf＝１０９４．３［ｋｇ／ｍ３］、ポリスチレン微粒子の密度ρs＝１０５２．６ ［ｋｇ／ｍ３］、ポリスチレン微粒子の直径が２０［μｍ］であるから、式３より、 It becomes. Therefore, the forces acting on the polystyrene fine particles are as follows: the radius of rotation r = 4.5 × 10 −2 [m], the rotational speed N = 1000 [rpm] at the time of cutting, and the solvent density ρf = 1094.3 [kg / m 3 ]. Since the density of polystyrene fine particles ρs = 1052.6 [kg / m 3 ] and the diameter of polystyrene fine particles is 20 [μm],
Ｆ＝（ρf−ρs）・Ｖ・ＲＣＦ［×ｇ］＝（ρf−ρs）・Ｖ × ４ｒ・π２・Ｎ２／（３６００・ｇ）・［×ｇ］＝１１１８・ｒ・Ｎ２・１０−６×（ρf−ρs）・Ｖ ［×ｇ］＝１１１８・４．５×１０−２・１０００２・１０−６×（１０９４．３−１０５２．６）×４／３×π×（１０×１０−６）３ ・９．８０６６５＝５０．３１×（１０９４．３−１０５２．６）×４．１９×１０−１５×９．８０６６５＝８．６・１０−１１ ［Ｎ］＝８６[ｐＮ] F = (ρf−ρs) · V · RCF [× g] = (ρf−ρs) · V × 4r · π 2 · N 2 / (3600 · g) · [× g] = 1118 · r · N 2 · 10 −6 × (ρf−ρs) · V [× g] = 1118 · 4.5 × 10 −2 · 1000 2 · 10 −6 × (1094.3−1052.6) × 4/3 × π × ( 10 × 10 -6) 3 · 9.80665 = 50.31 × (1094.3-1052.6) × 4.19 × 10 -15 × 9.80665 = 8.6 · 10 -11 [N] = 86 [pN]
となる。 It becomes.
実験を繰り返した結果、微粒子（ビーズ）が分離したときに微粒子（ビーズ）に作用していた力は８０−９０［ｐＮ］となった。このことは上記測定原理の実証であり、遠心マイクロ流体デバイスを用いた生体分子間相互作用測定が可能であることを示している。なお、上記は結合体にかかる浮力が重力より小さい場合（結合体が沈降するし、チャンバー内壁に引っ付く場合）を例に求めた。したがって浮き側の微粒子（ρｓ）と密度媒体（ρｆ）との関係で結合力を算出した。結合体にかかる重力が浮力より小さい場合（結合体が浮いてチャンバーの内壁に引っ付く場合）は、重り側の微粒子（ρａ）と密度媒体（ρｆ）との関係で結合力を算出すればよい。つまりρｓに代えて重り側の微粒子の密度（ρａ）を使って計算すればよい。 As a result of repeating the experiment, the force acting on the fine particles (beads) when the fine particles (beads) were separated was 80-90 [pN]. This is a proof of the above measurement principle and indicates that biomolecular interaction measurement using a centrifugal microfluidic device is possible. In addition, the above calculated | required for the case where the buoyancy concerning a conjugate | bonded_body is smaller than gravity (when a conjugate | bonded body sinks and it catches on the inner wall of a chamber). Therefore, the binding force was calculated from the relationship between the fine particles (ρs) on the floating side and the density medium (ρf). When the gravity applied to the combined body is smaller than the buoyancy (when the combined body floats and is attracted to the inner wall of the chamber), the binding force may be calculated based on the relationship between the weight side fine particles (ρa) and the density medium (ρf). . That is, the calculation may be performed using the density (ρa) of the fine particles on the weight side instead of ρs.
今回の実験によって得られた微粒子（ビーズ）の結合力は先述の生体分子間の相互作用に匹敵するほどの結合力であり、生体分子間の相互作用としては非常に高い値となっている。これは、今回使用したビーズが抗体のサイズに対して大きかったためと考えられる。ビーズの曲率が抗体に対して大きいため複数の抗体が複数の抗原分子と反応して結合したために結合力が大きくなったと考えられる。 The binding force of the fine particles (beads) obtained by this experiment is a binding force comparable to the above-described interaction between biomolecules, and the interaction between biomolecules is extremely high. This is probably because the beads used this time were larger than the antibody size. Since the curvature of the beads is large with respect to the antibody, it is considered that the binding force is increased because a plurality of antibodies react with and bind to a plurality of antigen molecules.
一方、抗体分子１分子について結合力を測定するには一分子抗原１分子抗体とが反応するように反応系を最適化して１分子結合を形成させる必要がある。 On the other hand, in order to measure the binding force for one antibody molecule, it is necessary to optimize the reaction system so as to react with one molecule antigen and one molecule antibody to form one molecule bond.
実施例１では、１つのチャンバーにおける分子間の結合力の測定を示した。しかしながら、顕微鏡の視野内に存在する微粒子（ビーズ）を複数観察することが可能であるため、１度の測定で複数の微粒子（ビーズ）に関して結合力を測定することが可能である。 In Example 1, measurement of the binding force between molecules in one chamber was shown. However, since it is possible to observe a plurality of fine particles (beads) present in the field of view of the microscope, it is possible to measure the binding force with respect to the plurality of fine particles (beads) by one measurement.
つまり、複数のサンプルを同時並行的に測定ができるため、これらの測定結果を統計的に生体分子間相互作用の解析が可能である。 That is, since a plurality of samples can be measured simultaneously, these measurement results can be statistically analyzed for interactions between biomolecules.
１つの方法としては、顕微鏡の視野内に存在する微粒子（ビーズ）を複数観察することが可能であるため、撮影データ1枚分に複数のチャンバーでの観測結果を撮影して、これらを計測制御装置１９に搭載したＰＣなどのデータ処理装置で処理する方法である。 As one method, it is possible to observe multiple particles (beads) present in the field of view of the microscope, so the observation results in multiple chambers can be imaged for one piece of imaging data, and these are controlled. This is a method of processing by a data processing device such as a PC mounted on the device 19.
また別の方法としては、計測制御装置１９のシーケンスを改良して、ディスク１３が１回転する間に複数のチャンバーの撮影を行うようにし、得られた画像データを計測制御装置１９のデータ処理装置でチャンバーごとに分けて処理するようにしてもよい。あるいは、上記２つを組み合わせてもよい。 As another method, the sequence of the measurement control device 19 is improved so that a plurality of chambers are photographed while the disk 13 rotates once, and the obtained image data is used as a data processing device of the measurement control device 19. The process may be performed separately for each chamber. Alternatively, the above two may be combined.
さらには、計測制御装置１９がディスク回転装置と対物レンズとの位置関係をコントロールしてより広範囲の撮影を行うようにしてもよい。 Furthermore, the measurement control device 19 may control the positional relationship between the disk rotation device and the objective lens to perform photographing over a wider range.
このように、同一構造の結合体の結合力の複数の同時計測を行うことによって、統計的に生体分子間相互作用（結合力）の測定を行うことが可能となる。その結果を、例えば図６に示すように測定された結合力とそのサンプル頻度との関係（ここではこれを分子間結合力のスペクトル測定と称す）として、容易に出すことができる。また、そもそも生体分子の結合力はばらつきが大きいため、このような統計的解析が非常に有効である。さらに、上記した抗マウスＩｇＧ抗体とマウスＩｇＧとの抗原抗体反応で用いる抗マウスＩｇＧ抗体のようなポリクローナル抗体はモノクローナル抗体と比べて選択反応性が低いため、複数の抗原と相互作用を持ち結合してしまう傾向が強い。したがってポリクローナル抗体のような選択反応性の低いものの結合状態を解析するには、このスペクトル測定が有効である。複数のサンプルによる結合力分布を統計的に解析すると分布のピークがそれぞれ結合した抗原の種類や結合位置に応じた結合力を示すことになり、分子結合の解析が可能となる。 In this way, by performing a plurality of simultaneous measurements of the binding force of the conjugate having the same structure, it is possible to statistically measure the interaction between biomolecules (binding force). The result can be easily obtained, for example, as a relationship between the measured binding force and its sample frequency as shown in FIG. 6 (herein, this is called spectrum measurement of intermolecular binding force). In the first place, since the binding force of biomolecules varies widely, such statistical analysis is very effective. Furthermore, since the polyclonal antibody such as the anti-mouse IgG antibody used in the antigen-antibody reaction between the anti-mouse IgG antibody and mouse IgG described above has a lower selective reactivity than the monoclonal antibody, it interacts with and binds to multiple antigens. There is a strong tendency to end up. Therefore, this spectral measurement is effective for analyzing the binding state of a low selective reactivity such as a polyclonal antibody. When the binding force distribution of a plurality of samples is statistically analyzed, the distribution peaks indicate the binding force according to the type and binding position of the bound antigen, and the molecular binding can be analyzed.
以上説明したように本発明の分子計測法および分子計測装置は、遠心力を用いることにより複数の結合を一括測定可能となり、統計解析を一括で実施可能なスループットが得られる。これにより生体分子間に生じる相互作用の質を評価する新たな分析が可能となる。 As described above, the molecular measurement method and the molecular measurement apparatus of the present invention can measure a plurality of bonds at once by using centrifugal force, and can obtain a throughput capable of performing statistical analysis in a batch. This allows new analysis to evaluate the quality of interactions that occur between biomolecules.
例えば抗原抗体反応によるバイオ分析で得られたシグナルには抗体が間違って補足した分子に由来するシグナルが含まれるが、これを真正なシグナルと切り分ける術はない。しかし、一旦形成した結合が分離する閾値を再評価すれば、生体分子間の微妙な相互作用の違いから誤認識に由来する結合を識別することが可能となる。 For example, a signal obtained by bioanalysis by an antigen-antibody reaction includes a signal derived from a molecule mistakenly captured by an antibody, but there is no way to separate this from a genuine signal. However, once the threshold at which the formed bond is separated is re-evaluated, it is possible to identify the bond resulting from misrecognition from the subtle difference in the interaction between biomolecules.
この応用として前立腺癌特異的バイオマーカーであるＰＳＡの解析が考えられる。ＰＳＡは末梢血液中においてＴｏｔａｌ＿ＰＳＡとＦｒｅｅ＿ＰＳＡの２種の形態を取っているが、これらはもともと同一の物質であったことから抗体が誤認識する可能性が高い。 As this application, analysis of PSA which is a prostate cancer specific biomarker can be considered. PSA has two forms of Total_PSA and Free_PSA in the peripheral blood. Since these were originally the same substance, there is a high possibility that the antibody may be misrecognized.
このような場合、上記した分子間結合力のスペクトル測定を行うことにより本発明の適用によりＴｏｔａｌ＿ＰＳＡとＦｒｅｅ＿ＰＳＡの識別が可能になる。 In such a case, it is possible to distinguish between Total_PSA and Free_PSA by applying the present invention by measuring the spectrum of the intermolecular bonding force described above.
図７は、実施例１の結合体１０１を結合体５１０１に代えて本発明の分子計測法を行う例を示す図である。本実施例では、結合体１０１の一方の微粒子をチャンバー９の壁面の一部に塗布された薄膜状のシリカ５４に置き換えたものである。こうしておけば、実施例１と同じ要領で、薄膜状のシリカ５４に抗体３を結合させ、抗体固定化壁面５７が構成できる。したがってチャンバー壁面の薄膜状のシリカ５４−抗体３−抗原５−抗体１−微粒子２の順に結合された結合体を構成できる。なお、すべての実施例に当てはまるが、材料としてのシリカ５４は必須ではなく測定対象に応じて適宜選択可能である。また、図７では、チャンバー９の一部を覆うように薄膜状のシリカ５４を形成しているが、チャンバー９の壁面（内壁）の全てを覆うようにしてもよい。 FIG. 7 is a diagram illustrating an example in which the molecular measurement method of the present invention is performed by replacing the conjugate 101 of Example 1 with the conjugate 5101. In this embodiment, one fine particle of the bonded body 101 is replaced with a thin film-like silica 54 applied to a part of the wall surface of the chamber 9. In this way, the antibody-immobilized wall surface 57 can be formed by binding the antibody 3 to the thin-film silica 54 in the same manner as in Example 1. Therefore, it is possible to construct a conjugate in which the thin film-like silica 54-antibody 3-antigen 5-antibody 1-fine particles 2 in the order of the wall surface of the chamber are bound. In addition, although it applies to all the Examples, the silica 54 as a material is not essential and can be appropriately selected according to the measurement object. In FIG. 7, the thin-film silica 54 is formed so as to cover a part of the chamber 9, but the entire wall surface (inner wall) of the chamber 9 may be covered.
（実施例３の変形例）
図８は、図７で示した実施例３の変形例である。実験においてチャンバー９はＰＤＭＳを材料として作成する例を示したが、チャンバーそのものの材料を抗体３が結合できる素材に置き換えてしまうことも可能である。すなわち本変形例ではチャンバー６４そのものがシリカで構成されている。したがってシリカで出来たチャンバー６４−抗体３−抗原５−抗体１−微粒子２の順に結合された結合体を構成できる。こうすれば、薄膜状のシリカ５４をチャンバー９の壁面に覆うようにする手間が省けることになる。
(Modification of Example 3)
FIG. 8 shows a modification of the third embodiment shown in FIG. In the experiment, an example in which the chamber 9 is made using PDMS as a material has been shown. However, the material of the chamber itself may be replaced with a material to which the antibody 3 can bind. That is, in this modification, the chamber 64 itself is made of silica. Accordingly, it is possible to construct a conjugate made of silica in the order of chamber 64-antibody 3-antigen 5-antibody 1-fine particles 2. In this way, the trouble of covering the thin-film silica 54 on the wall surface of the chamber 9 can be saved.
以上説明したように、本発明の分子計測方法は、第１の分子（例えば抗体１）と、この第１の分子との相互作用により結合する第２の分子（例えば抗原５）との結合力を測定する分子計測法であって、パーコールよりも比重の小さい第１の微粒子（例えば微粒子２や実験例においてのポリスチレン微粒子）、第１の分子と第２の分子の一方、第１の分子と第２の分子の他方、パーコールよりも比重の大きい第２の微粒子（例えば、抗体固定化微粒子７や実験例においての抗体を結合したシリカ微粒子）の順にそれぞれ結合させた結合体（例えば１０１）を作成し、結合体とパーコールとを充填したチャンバー（例えば後述する３１など）を回転数を変化させながら回転させ、隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の回転数により結合力を計測する。 As described above, the molecular measurement method of the present invention has a binding force between a first molecule (for example, antibody 1) and a second molecule (for example, antigen 5) that binds by interaction with the first molecule. Is a first fine particle having a specific gravity smaller than that of Percoll (for example, fine particle 2 or polystyrene fine particle in the experimental example), one of the first molecule and the second molecule, and the first molecule On the other side of the second molecule, conjugates (for example, 101) in which second particles having a specific gravity greater than that of Percoll (for example, antibody-immobilized microparticles 7 and silica particles to which antibodies in experimental examples are bound) are sequentially bonded. The rotation speed at the time when the adjacent first fine particles and second fine particles are separated from each other by rotating a chamber (for example, 31 to be described later) that is prepared and filled with the combined body and Percoll while changing the rotation speed. To measure a more binding force.
特定の分子と特異的に結合するアプタマー（核酸分子やペプチドなど）のアプタマーと特定分子との結合力を測定する場合は、アプタマー（第１の分子）にパーコールよりも比重の小さい微粒子を結合させ、特定の分子（第２の分子）にパーコールよりも比重の大きい微粒子を結合させ（この逆でもよい）、アプタマーと特定の分子とさらに結合させ、引っ張り力を与えるようにすればよい。 When measuring the binding force between an aptamer (nucleic acid molecule or peptide, etc.) that specifically binds to a specific molecule and the specific molecule, bind the aptamer (first molecule) with fine particles with a specific gravity smaller than that of Percoll. Then, fine particles having a specific gravity larger than that of Percoll may be bound to a specific molecule (second molecule) (or vice versa), and aptamer may be further bonded to the specific molecule to give a tensile force.
言い換えると、第１の分子（例えば抗体１）と第２の分子（例えば抗原５）との結合を、第１の分子、第２の分子の一方につけた浮きと他方につけた重りにより引っ張り力を与え、その結合が切れる時に加えた引っ張り力を、チャンバーの回転数から求める測定方法である。 In other words, the binding force between the first molecule (for example, antibody 1) and the second molecule (for example, antigen 5) is increased by the lifting force applied to one of the first molecule and the second molecule and the weight applied to the other molecule. This is a measurement method in which the tensile force applied when the bond is broken is obtained from the number of rotations of the chamber.
なお、上記の例では抗体固定化微粒子７は微粒子４に抗体３（第３の分子）が結合されている。したがって、第１の微粒子および第２の微粒子のうち、第２の分子と結合する微粒子は、第３の分子を備え、第２の分子は第３の分子との相互作用により微粒子と結合するようにしてもよい。 In the above example, the antibody-immobilized fine particle 7 has the antibody 3 (third molecule) bound to the fine particle 4. Accordingly, among the first fine particles and the second fine particles, the fine particles that bind to the second molecules include the third molecules, and the second molecules are bound to the fine particles by the interaction with the third molecules. It may be.
浮きは、パーコールに対して比重（あるいは密度）の小さい微粒子が用いられ、重りはパーコールに対して比重（あるいは密度）の大きい微粒子であればいい。また、第１の分子と第２の分子とが結合した結合分子の一方に浮き、他方に重りがつけばよいので、測定対象の分子の種類によって浮きと重りのつけ方を選択すればよい。 For the float, fine particles having a small specific gravity (or density) with respect to Percoll are used, and the weight may be fine particles with a large specific gravity (or density) with respect to Percoll. Further, since it is only necessary to float on one of the binding molecules in which the first molecule and the second molecule are bonded and to attach the weight to the other, it is only necessary to select a method of attaching the float and weight depending on the type of the molecule to be measured.
また、第１の分子と第２の分子とが結合した結合分子が重りに結合している部分を、重りに代えてチャンバーの壁面に結合させてもよい。 In addition, a portion where a binding molecule in which the first molecule and the second molecule are bound to each other may be bound to the wall surface of the chamber instead of the weight.
第１の分子をプローブ分子を、第２の分子をそのプローブ分子が相互作用を備える特定の分子とすることも可能である。プローブ分子としては、抗体の他、アプタマー、ビオチンとすることもできる。 The first molecule can be a probe molecule and the second molecule can be a specific molecule with which the probe molecule interacts. As a probe molecule, aptamer or biotin can be used in addition to an antibody.
一方、ディスク１３はチャンバー３１を複数備え、一連の計測シーケンスによって結合力の計測を複数同時に行うことが可能である、またさらに、一連の計測シーケンスよって得られた複数の結合力の計測結果により、結合力の測定値の度数分布であるスペクトル測定を行うこと可能である。 On the other hand, the disk 13 includes a plurality of chambers 31 and can simultaneously measure a plurality of binding forces by a series of measurement sequences. Further, according to a plurality of binding force measurement results obtained by a series of measurement sequences, It is possible to perform a spectrum measurement that is a frequency distribution of measured values of the binding force.
この分子計測法を取り入れた分子計測装置は、例えば、計測制御装置と、計測制御装置により所定シーケンスにより回転数を変化させながらチャンバーを搭載したディスクを回転させるディスク回転装置と、ディスク回転装置のディスクの回転に同期して撮影対象のチャンバーをとらえて複数の画像を撮影するカメラとを備え、チャンバーは、パーコールよりも比重の小さい第１の微粒子、第１の分子と第２の分子の一方、第１の分子と第２の分子の他方、パーコールよりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体と、さらにパーコールとを充填され、計測制御装置は、複数の画像の画像データから、隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の画像データを抽出し、抽出された画像データが撮影された時のディスク装置の回転数を、シーケンスの情報から算出し、算出された回転数から前記結合力を算出するように構成される。 A molecular measurement device incorporating this molecular measurement method includes, for example, a measurement control device, a disk rotation device that rotates a disk on which a chamber is mounted while changing the number of rotations according to a predetermined sequence by the measurement control device, and a disk of the disk rotation device A camera that captures a plurality of images in synchronization with the rotation of the imaging object, and the chamber is a first fine particle having a specific gravity smaller than that of Percoll, one of the first molecule and the second molecule, The other of the first molecule and the second molecule, the second particle having a specific gravity greater than that of Percoll, respectively, and a combination of Percol, and Percoll are further filled. When the image data when the adjacent first fine particles and second fine particles are separated from each other is extracted and the extracted image data is photographed The rotational speed of the disk device, calculated from the information of the sequence, and from the calculated rotational speed to calculate the binding force.
さらに計測制御装置は、機械学習システムを備え、機械学習システムが隣接する第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の前記画像データを抽出するようにすることもできる。このようにすればほぼすべての測定を精度よく自動に行うことが可能となる。 Further, the measurement control device may include a machine learning system, and the machine learning system may extract the image data at the time when the first fine particles and the second fine particles adjacent to each other are separated from each other. In this way, almost all measurements can be performed automatically with high accuracy.
本実施例は、ポリスチレンビーズを複数個結合させ、同時に結合力測定を行う場合における本発明の一例である。図９は第４の実施例を示す図であり、抗体固定化基板（６４０１）を用いた生体分子間相互作用の測定方法を示す図である。図９では、実施例３におけるチャンバー６４に代えて抗体固定化基板（６４０１）を用いている。抗体固定化基板（６４０１）は、あらかじめ抗体３をその基板表面に複数固定化したものである。また抗体１を微粒子(ビーズ）２と結合させた抗体固定化微粒子６を用いた例を示している。抗体３および抗体固定化微粒子６の抗体１はともに抗原５と抗原抗体反応で複数結合させたものを示している。 This example is an example of the present invention in the case where a plurality of polystyrene beads are bound and the binding force is measured simultaneously. FIG. 9 is a view showing a fourth embodiment and is a view showing a method for measuring an interaction between biomolecules using an antibody-immobilized substrate (6401). In FIG. 9, an antibody-immobilized substrate (6401) is used in place of the chamber 64 in Example 3. The antibody-immobilized substrate (6401) is obtained by immobilizing a plurality of antibodies 3 on the substrate surface in advance. In addition, an example using antibody-immobilized fine particles 6 in which antibody 1 is combined with fine particles (beads) 2 is shown. The antibody 3 and the antibody 1 of the antibody-immobilized fine particle 6 both show the antigen 5 and a plurality of antigens bound by antigen-antibody reaction.
図９に示すように、本実施例では、基板（６４０１）の抗体３と抗体固定化微粒子６の抗原１と、抗原５とをそれぞれ抗原抗体反応で複数結合させ（図９（ａ））、微粒子２（例えばポリスチレンビーズ）よりも比重の大きい溶媒（パーコール）でチャンバー内を満たし微粒子２、抗体固定化微粒子６には浮力Ｆ１が加わるようにしたうえで、遠心力Ｆ３を印加する（図９（ｂ））。こうすることによって上述の例と同じように、まず、結合力の小さい抗体固定化微粒子６は低回転数で結合が破断する（図９（ｃ）、特に同図の左端の抗体固定化微粒子６’）。さらに回転数を変化させることで抗体固定化微粒子６にかかる遠心力を上げていくことにより順次結合を破断させていく（図９（ｄ））。ここで複数の抗体固定化微粒子６に加えた遠心力の大きさと結合が破断した抗体固定化微粒子６の数との関係をプロットすることによりスペクトル解析が行える。 As shown in FIG. 9, in this example, the antibody 3 on the substrate (6401), the antigen 1 on the antibody-immobilized microparticles 6 and the antigen 5 were combined in a plurality by antigen-antibody reaction (FIG. 9 (a)), The inside of the chamber is filled with a solvent (Percoll) having a specific gravity larger than that of the fine particles 2 (for example, polystyrene beads) so that buoyancy F1 is applied to the fine particles 2 and the antibody-immobilized fine particles 6, and a centrifugal force F3 is applied (FIG. 9). (B)). By doing so, as in the above example, first, the antibody-immobilized microparticles 6 having a small binding force break the binding at a low rotational speed (FIG. 9 (c), in particular, the antibody-immobilized microparticles 6 at the left end of the same figure). '). Further, by increasing the centrifugal force applied to the antibody-immobilized fine particles 6 by changing the number of rotations, the bonds are sequentially broken (FIG. 9 (d)). Here, spectrum analysis can be performed by plotting the relationship between the magnitude of the centrifugal force applied to the plurality of antibody-immobilized microparticles 6 and the number of antibody-immobilized microparticles 6 whose bonds are broken.
（試料の作成）
実施例４の被測定試料の作成方法について説明する。図１０は、実施例４の被測定試料の作成方法を示す図である。図１０に示すように、まず抗体固定化基板（６４０１）のベースとなるガラス基板に対し抗体を固定化する（図１０（ａ））。ここでは、ＥＤＡＣを架橋剤として用いることでペプチド結合によってガラス基板に抗体を固定化した。抗体分子中に存在するカルボキシル基をＥＤＡＣによって活性化させた後に，ガラス基板にコーティングされているアミノ基と反応させることでガラス基板に抗体を固定化した。抗体を固定化するガラス基板には，ＡＰＳ（アミノシラン）コートスライドグラス（松浪硝子）を使用した。また、カップリング剤としてＰｏｌｙＬｉｎｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ ＣＯＯＨ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ （ＰｏｌｙＬｉｎｋ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ， ＰｏｌｙＬｉｎｋ Ｗａｓｈ／Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｎｆｆｅｒ， ＰｏｌｙＬｉｎｋ ＥＤＡＣ）を、基板の洗浄を行う際にはシカクリーン（関東化学）を０．３％加えた純水を洗剤として使用した。
(Sample preparation)
A method for producing a sample to be measured according to Example 4 will be described. FIG. 10 is a diagram illustrating a method of creating a sample to be measured according to the fourth embodiment. As shown in FIG. 10, first, an antibody is immobilized on a glass substrate serving as a base of the antibody-immobilized substrate (6401) (FIG. 10 (a)). Here, the antibody was immobilized on the glass substrate by peptide bond using EDAC as a cross-linking agent. After the carboxyl group present in the antibody molecule was activated by EDAC, the antibody was immobilized on the glass substrate by reacting with an amino group coated on the glass substrate. APS (aminosilane) coated slide glass (Matsunami Glass) was used as the glass substrate on which the antibody was immobilized. In addition, as a coupling agent, PolyLink Protein Coupling Kit for COOH Microparticles (PolyLink Coupling Buffer, PolyLink Wash / Storage Buffer, PolyLink EDAC) is used for cleaning the substrate (%). Pure water was used as a detergent.
次に、抗体固定化微粒子６の一例である抗体固定化済ポリスチレンビーズを抗原抗体反応で結合する。まず、図１０（ａ）で抗体３を固定化した基板（６４０１）に抗原５を加えて反応させ（図１０（ｂ））、未反応の抗原（抗原分子）５を洗浄し（図１０（ｃ））、抗体固定化済ポリスチレンビーズ６を加えて反応させて（図１０（ｄ））、
密度調整した溶媒（パーコール１０２）を加えカバーガラス６４０２をかぶせることにより所望の被測定試料を作成した(図１０（ｅ））。図９および図１０（ｅ）においては、遠心力が働く方向側に抗体固定化基板（６４０１）を配置する例を示しているが、これに代えて抗体固定化基板（６４０１）の上下を逆さ（すなわち遠心力が働く方向とは逆の位置に配置）にして遠心することも可能である。この場合は、例えば溶媒の比重が微粒子６の比重よりも小さいものを選択することができる。これに限らず微粒子が溶媒に沈むような関係を確保するよう適宜材料を選択するとよい。
Next, antibody-immobilized polystyrene beads, which are an example of antibody-immobilized fine particles 6, are bound by an antigen-antibody reaction. First, antigen 5 is added to the substrate (6401) on which antibody 3 is immobilized in FIG. 10 (a) and reacted (FIG. 10 (b)), and unreacted antigen (antigen molecule) 5 is washed (FIG. 10 (b)). c)), the antibody-immobilized polystyrene beads 6 are added and reacted (FIG. 10 (d)),
A solvent to which the density was adjusted (Percoll 102) was added and a cover glass 6402 was placed thereon to prepare a desired sample to be measured (FIG. 10 (e)). FIG. 9 and FIG. 10 (e) show an example in which the antibody-immobilized substrate (6401) is arranged on the side where the centrifugal force acts. Instead, the antibody-immobilized substrate (6401) is turned upside down. It is also possible to centrifuge (that is, at a position opposite to the direction in which the centrifugal force acts). In this case, for example, a solvent having a specific gravity smaller than that of the fine particles 6 can be selected. However, the present invention is not limited to this, and a material may be selected as appropriate so as to ensure a relationship in which fine particles sink in a solvent.
実験においては、抗体分子５を固定化したガラス基板にφ３ｍｍの穴を開けたＰＤＭＳを貼り付けることでチャンバー(不図示）を作成した（図１０（ａ））。チャンバー内に１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳで１００倍に希釈した抗原分子５を加えて３０分間室温静置下で反応させ（図１０（ｂ））、溶液を取り除き０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＤＰＢＳを加えることで未反応分子を洗浄した（図１０（ｃ））。洗浄は同様の手順で３回を行った。１％ＢＳＡ含有ＤＰＢＳで１０００個／μｌ（マイクロリットル）になるように希釈した抗体固定化済ポリスチレンビーズ（６）を加えて室温静置下で３０分反応させビーズと基板を結合させ（図１０（ｄ））、密度調整したパーコール(Ｐｅｒｃｏｌｌ）１０２を加えてチャンバーを満たし，溶媒の漏れを防ぐためカバーガラス６４０２をかぶせ被測定試料を作成した（図１０（ｅ））。 In the experiment, a chamber (not shown) was created by attaching PDMS with a 3 mm hole to a glass substrate on which antibody molecules 5 were immobilized (FIG. 10A). Add antigen molecule 5 diluted 100-fold with 1% BSA-containing DPBS in the chamber, react at room temperature for 30 minutes (FIG. 10 (b)), remove the solution and add 0.05% Tween20-containing DPBS. The unreacted molecules were washed with (FIG. 10 (c)). Washing was performed three times in the same procedure. Antibody-immobilized polystyrene beads (6) diluted with 1% BSA-containing DPBS to 1000 / μl (microliter) are added and reacted at room temperature for 30 minutes to bind the beads to the substrate (FIG. 10). (D)), density-adjusted percoll (Percoll) 102 was added to fill the chamber, and a cover glass 6402 was placed over the sample to prevent leakage of the solvent (FIG. 10 (e)).
（実験）
このようにして作成した試料に対し、遠心力は、０〜１００Ｇ（Ｇ：重力加速度）まで１０Ｇ刻みで加わるように回転数を調整し，１分間回転させることで遠心力を印加した。遠心力印加後に基板を取り出し，顕微鏡にて結合が破断せずに残っていたビーズを数えた。ここから試料に加えた遠心力と結合が破断せずに残っていたビーズの数の結果から結合力分布（すなわち結合力スペクトル）を求めた。なお、比較対象試料として抗原５を全く加えない試料についても同様の実験を行った。
(Experiment)
For the sample thus prepared, the centrifugal force was applied by adjusting the rotational speed so that the centrifugal force was applied in increments of 10 G from 0 to 100 G (G: gravitational acceleration) and rotating for 1 minute. After applying the centrifugal force, the substrate was taken out, and the remaining beads without breaking the bond were counted with a microscope. The binding force distribution (that is, the binding force spectrum) was determined from the result of the centrifugal force applied to the sample and the number of beads remaining without breaking the binding. The same experiment was performed on a sample to which no antigen 5 was added as a sample to be compared.
（結果）
以上により求められた抗原を加えた場合／抗原を加えない場合についての結合力分布（結合力スペクトル）の結果を図１１、図１２にそれぞれ示す。図１１と図１２を見ると抗原を加えた場合の結合力は，２２．５〜３３．８ｐＮの区間でピークを持っており，抗原を加えない場合では，０〜１１．３ｐＮの区間で殆どの結合が破断していることがわかる。このように結合力のピーク値が異なることから，抗原分子を加えた場合では，殆どのポリスチレンビーズが抗原抗体反応によって結合していると考えることができる。また，結合力の違いによって特異的結合と非特異的結合の区別が可能であると考えられる。また，図１１を見ると９０〜１０１．３ｐＮの区間で第２のピークを持っているように見える。これは，１つのビーズについて結合に関与する抗体分子が複数個存在するため，結合力が大きくなってしまったものと見られる．この傾向は，ＡＦＭを用いた単分子間相互作用のスペクトル解析にも見られ，先行研究の結果と近い波形を取っていることから，整合性のある実験結果を得ることができたと考えられる。以上より，印加する遠心力の区間をより細かく設定し，結合力の分布を作成することで生体分子間相互作用のスペクトル解析が可能であることがこの結果からも確認できた。
(result)
FIG. 11 and FIG. 12 show the results of the binding force distribution (binding force spectrum) when the antigen obtained as described above is added / when the antigen is not added, respectively. 11 and 12, when the antigen is added, the binding force has a peak in the range of 22.5 to 33.8 pN, and when no antigen is added, the binding force is almost in the range of 0 to 11.3 pN. It can be seen that the bond of is broken. Since the binding force peak values are different in this way, it can be considered that most polystyrene beads are bound by the antigen-antibody reaction when antigen molecules are added. In addition, it is considered that specific binding and non-specific binding can be distinguished by the difference in binding force. Moreover, when FIG. 11 is seen, it seems to have a 2nd peak in the area of 90-101.3 pN. This seems to be because the binding force has increased due to the presence of multiple antibody molecules involved in binding per bead. This tendency is also seen in the spectrum analysis of the interaction between single molecules using AFM. Since the waveform is close to the result of previous research, it is considered that the consistent experimental results were obtained. From these results, it was confirmed from this result that the spectral analysis of the interaction between biomolecules is possible by setting the section of the applied centrifugal force more finely and creating the distribution of binding force.
本実施例からも明らかなように、１つのチャンバーで複数の試料を測定することも本結果から実証された。 As is clear from this example, it was also demonstrated from this result that a plurality of samples were measured in one chamber.
たとえば、生体検査・化学分析に利用が可能である。 For example, it can be used for biopsy and chemical analysis.
１、３ 抗体
２、４ 微粒子（ビーズ）
５ 抗原
６、７ 抗体固定化微粒子
８ ディスク回転軸
９ チャンバー
９ｗ チャンバー壁面
１０ 分子計測装置
１１ カメラ
１２ キセノンランプ
１３ ディスク
１４ マイクロ流路型チップ
１５ ディスク回転軸用孔
１６ 対物レンズ
１７ ハーフミラー
１８ 鏡筒
１９ 計測制御装置
２０ 固定台
２１ ディスク回転装置
４１ ポリスチレン微粒子
４３ シリカ微粒子
５４ 薄膜状のシリカ
５７ 抗体固定化壁面
６４ シリカ製チャンバー
６７ 抗体固定化チャンバー
１０１、５１０１、６１０１ 結合体
１０２ 溶媒（パーコール）
６４０１ 抗体固定化基板
６４０２ カバーガラス
Ｒ０ 回転方向
ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３ 制御信号
1, 3 Antibody 2, 4 Fine particles (beads)
5 Antigens 6 and 7 Antibody-immobilized fine particles 8 Disk rotation shaft 9 Chamber 9w Chamber wall surface 10 Molecular measuring device 11 Camera 12 Xenon lamp 13 Disk 14 Microchannel chip 15 Disk rotation shaft hole 16 Objective lens 17 Half mirror 18 Lens barrel 19 Measurement control device 20 Fixing base 21 Disk rotation device 41 Polystyrene fine particle 43 Silica fine particle 54 Thin-film silica 57 Antibody immobilization wall surface 64 Silica chamber 67 Antibody immobilization chamber 101, 5101, 6101 Conjugate 102 Solvent (Percoll)
6401 Antibody-immobilized substrate 6402 Cover glass R0 Rotation direction CS1, CS2, CS3 Control signal
Claims (14)
密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体を作成し、
前記結合体と前記密度媒体とを充填したチャンバーを回転数を変化させながら回転させ、
隣接する前記第１の微粒子と第２の微粒子が互いに離れた時点の回転数より前記結合力を計測することを特徴とする分子計測法。 A molecular measurement method for measuring a binding force between a first molecule and a second molecule that binds by interaction with the first molecule,
A first fine particle having a specific gravity smaller than that of the density medium; one of the first molecule and the second molecule; the other of the first molecule and the second molecule; a second having a specific gravity greater than that of the density medium. Create a combined body in which the fine particles are bonded in that order,
Rotating the chamber filled with the combined body and the density medium while changing the rotational speed,
A molecular measurement method, wherein the binding force is measured from the number of rotations when the adjacent first and second fine particles are separated from each other.
前記第２の分子は前記第３の分子との相互作用により前記微粒子と結合する
請求項１に記載の分子計測法。 Of the first fine particles and the second fine particles, the fine particles that bind to the second molecules include third molecules,
The molecular measurement method according to claim 1, wherein the second molecule binds to the fine particle by interaction with the third molecule.
Ｆ＝１１１８・ｒ・Ｎ２・１０−６×（ρf−ρs）・Ｖ ×ｇ
により算出することを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載の分子計測法。 As for the binding force, the binding force is F [N], the rotation speed is N [rpm], the volume of the first fine particles is V [m 3 ], and the density of the first fine particles is ρs [kg / m]. 3 ], when the density of the density medium is ρf [kg / m 3 ], the rotation radius r [m] of the chamber, and the gravitational acceleration [m / s 2 ],
F = 1118 · r · N 2 · 10 −6 × (ρf−ρs) · V × g
The molecular measurement method according to claim 1, wherein the molecular measurement method is calculated by:
前記計測制御装置により所定シーケンスにより回転数を変化させながらチャンバーを搭載したディスクを回転させるディスク回転装置と、
前記ディスク回転装置のディスクの回転に同期して撮影対象の前記チャンバーをとらえて複数の画像を撮影するカメラとを備え、
前記チャンバーは、密度媒体よりも比重の小さい第１の微粒子、前記第１の分子と前記第２の分子の一方、前記第１の分子と前記第２の分子の他方、前記密度媒体よりも比重の大きい第２の微粒子の順にそれぞれ結合させた結合体と、さらに前記密度媒体とを充填され、
前記計測制御装置は、複数の前記画像の画像データから、隣接する前記第１の微粒子と前記第２の微粒子が互いに離れた時点の画像データを抽出し、
抽出された前記画像データが撮影された時の前記ディスク装置の回転数を、前記シーケンスの情報から算出し、
算出された前記回転数から前記結合力を算出する分子計測装置。 A measurement control device;
A disk rotating device that rotates a disk mounted with a chamber while changing the number of rotations by a predetermined sequence by the measurement control device;
A camera for capturing a plurality of images by capturing the chamber to be imaged in synchronization with the rotation of the disk of the disk rotation device;
The chamber includes a first fine particle having a specific gravity smaller than that of the density medium, one of the first molecule and the second molecule, the other of the first molecule and the second molecule, and a specific gravity of the density medium. Filled with a bonded body that is bonded in the order of the second fine particles having a larger size, and the density medium,
The measurement control device extracts image data at a time when the adjacent first fine particles and the second fine particles are separated from each other from the image data of the plurality of images.
The number of rotations of the disk device when the extracted image data is taken is calculated from the information of the sequence,
A molecular measurement device that calculates the binding force from the calculated number of rotations.
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Citations (3)
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| JPS61265571A (en) * | 1985-05-14 | 1986-11-25 | イエル・ホールディング・エス・ピー・ア | Immunoassay method in centrifugal field using complementary particle having different specific gravity |
| JP2007263909A (en) * | 2006-03-30 | 2007-10-11 | Hitachi Ltd | Apparatus for measuring interaction of biological molecule |
| JP2012073066A (en) * | 2010-09-28 | 2012-04-12 | Osaka Univ | Method and device for measuring chemical bonding force |
-
2017
- 2017-09-27 JP JP2017186611A patent/JP7018563B2/en active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| HELMERSON KRISTIAN ET AL.: "Opticaltweezers-based immunosensor detects femtomolar concentrations of antigens", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 43, no. 2, JPN6021032397, 1997, pages 379 - 383, XP000681912, ISSN: 0004592741 * |
Also Published As
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