JP2018025406A - Method of analyzing mass of amino acid or vitamins - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法に関する。 The present invention relates to a method for mass spectrometry of amino acids or vitamins using a liquid chromatograph mass spectrometer.
アミノ酸やビタミン類は食品や健康サプリメント、医薬品、および化粧品などの有効成分であるが、これらの有効成分や不純物の同定や定量を行う方法として液体クロマトグラフィーを用いる方法が広く知られており、中でも近年では高感度に同定や定量ができる液体クロマトグラフ質量分析装置を用いる方法が普及している。 Amino acids and vitamins are active ingredients such as foods, health supplements, pharmaceuticals, and cosmetics, and methods using liquid chromatography are widely known as methods for identifying and quantifying these active ingredients and impurities. In recent years, a method using a liquid chromatograph mass spectrometer capable of highly sensitive identification and quantification has become widespread.
その中でも分子量が２０００以下のアミノ酸やビタミン類はアセトニトリル、アルコール類といった水溶性有機溶媒に可溶であるため従来からオクタデシルシリカゲル（ＯＤＳ）などの疎水性充填剤を用いた分析用カラムを用いて液体クロマトグラフ質量分析装置にて分析する方法が広く用いられている。 Among them, amino acids and vitamins having a molecular weight of 2000 or less are soluble in water-soluble organic solvents such as acetonitrile and alcohols, and thus have been conventionally liquidated using an analytical column using a hydrophobic filler such as octadecyl silica gel (ODS). A method of analyzing with a chromatograph mass spectrometer is widely used.
これらの液体クロマトグラフィー用カラムに用いられているハウジングは一般的にスレンレス製であるが、近年、金属との相互作用を受けやすい化合物がカラムのハウジングに吸着してしまう問題が確認されるようになり、アミノ酸やビタミン類においても特に液体クロマトグラフ質量分析装置を用いた場合に分析精度に大きな影響を及ぼすことがあった。このため、ハウジング全体または内面を非金属製素材であるポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）としたカラムも市販されている。しかし、ＯＤＳなどのシリカゲル基材を充填したカラムの場合、シリカゲル中に残存する金属の影響により充填剤と被分析化合物との二次的相互作用を及ぼす可能性があり完全にカラム内での被分析化合物の吸着の影響を解消させることが課題であった。 The housing used for these liquid chromatography columns is generally made of slenless, but in recent years, it has been confirmed that a compound susceptible to interaction with metals is adsorbed on the column housing. Therefore, amino acid and vitamins may have a great influence on analysis accuracy especially when a liquid chromatograph mass spectrometer is used. For this reason, a column in which the entire housing or the inner surface is made of polyetheretherketone resin (PEEK), which is a non-metallic material, is also commercially available. However, in the case of a column packed with a silica gel substrate such as ODS, there is a possibility that a secondary interaction between the packing material and the analyte will occur due to the influence of the metal remaining in the silica gel. The problem was to eliminate the influence of the adsorption of the analytical compound.
また、アミノ酸やビタミン類の中には水酸基、アミノ基、カルボキシル基といった極性官能基を有した親水性の高い化合物も多く存在しており、例えばカルニチン、バリンなどは逆相クロマトグラフィー法においてはほとんどカラム内にて保持、分離されず溶出されてしまうため、分析が難しいという課題があった。 In addition, many amino acids and vitamins have highly hydrophilic compounds having polar functional groups such as hydroxyl, amino and carboxyl groups. For example, carnitine and valine are rarely used in reversed-phase chromatography. There is a problem that the analysis is difficult because it is eluted without being held and separated in the column.
一方、親水性の高いアミノ酸やビタミン類については親水性相互作用クロマトグラフィー法により分離することができる。この方法では、未修飾のシリカゲルや親水性を有する水酸基、アミノ基、アミド基、スルホ基、カルボキシル基、スルホベタイン基、ホスホリルコリン基などを導入した親水性充填剤を用いた分析用カラム（例えば特開２０１０−７１７０７号公報：特許文献１）を用いることで逆相クロマトグラフィー法と同様の移動相を用いて溶出順を逆転させることができるため親水性化合物を良好に保持、分離させることができる。 On the other hand, highly hydrophilic amino acids and vitamins can be separated by hydrophilic interaction chromatography. In this method, an analytical column using an unmodified silica gel or a hydrophilic filler into which a hydrophilic hydroxyl group, amino group, amide group, sulfo group, carboxyl group, sulfobetaine group, phosphorylcholine group or the like is introduced (for example, a special column) Since the elution order can be reversed using a mobile phase similar to the reverse phase chromatography method by using Kai 2010-71707 gazette: Patent Document 1), hydrophilic compounds can be well retained and separated. .
ところが、この方法では逆に芳香族化合物やアルキル基を有する化合物など疎水性の高いアミノ酸やビタミン類がカラム内にて保持、分離されずに溶出されてしまう。
このため、親水性の高いものから疎水性が高いものまで含むアミノ酸やビタミン類を分離しようとすると複数のカラム、装置を用いる必要があること、それぞれの分離条件の検討などが必要であった。
However, in this method, on the contrary, highly hydrophobic amino acids and vitamins such as aromatic compounds and alkyl group-containing compounds are eluted without being retained and separated in the column.
For this reason, in order to separate amino acids and vitamins including those having high hydrophilicity to those having high hydrophobicity, it is necessary to use a plurality of columns and apparatuses, and examination of respective separation conditions is required.
このため、親水性の高いものから疎水性が高いものまで含むアミノ酸やビタミン類を連続分析するための方法として逆相クロマトグラフィー用カラムと親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムとをともに用いて連続分析する方法も提案されている（例えば非特許文献１）。この方法ではまず疎水性のアミノ酸やビタミン類のみを逆相クロマトグラフィー用カラムを用いて分離・溶出させて親水性のアミノ酸やビタミン類は親水性相互作用クロマトグラフィー用カラムにトラップさせ、次に親水性相互作用クロマトグラフィー用カラム中の親水性のアミノ酸やビタミン類を分離・溶出させることができる。しかし、この方法は２本のカラムが必要になること、配管系が複雑となりまたは高価な専用装置が必要となるなど必ずしも簡便に分析できる方法ではなく、より簡便に親水性および疎水性のアミノ酸やビタミン類を分析ができる方法が望まれる。 Therefore, continuous analysis using both reversed-phase chromatography column and hydrophilic interaction chromatography column as a method for continuous analysis of amino acids and vitamins including those with high hydrophilicity to those with high hydrophobicity. There has also been proposed a method (for example, Non-Patent Document 1). In this method, first, only hydrophobic amino acids and vitamins are separated and eluted using a column for reverse phase chromatography, and hydrophilic amino acids and vitamins are trapped on a column for hydrophilic interaction chromatography and then hydrophilic. It is possible to separate and elute hydrophilic amino acids and vitamins in the column for sex interaction chromatography. However, this method is not necessarily a method that can be easily analyzed because two columns are required, the piping system is complicated, or an expensive dedicated device is required. A method capable of analyzing vitamins is desired.
本発明はかかる状況に鑑みてなされたものであり、カラム内のハウジングや充填剤による分析精度低下を抑制するとともに親水性の高いものから親水性の高いものまで幅広いアミノ酸やビタミン類を、複数の分析用カラムを用いずに簡便に分析することができる液体クロマトグラフ質量分析装置によるアミノ酸およびビタミン類の質量分析方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such circumstances, and suppresses a decrease in analysis accuracy due to the housing and packing material in the column, and a wide range of amino acids and vitamins ranging from highly hydrophilic to highly hydrophilic, It is an object of the present invention to provide a mass spectrometry method for amino acids and vitamins using a liquid chromatograph mass spectrometer that can be easily analyzed without using an analytical column.
本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、液体クロマトグラフィーで使用する際の充填剤およびカラムのハウジングの材質を特定の組み合わせから選定し、1本のカラムで逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードを適宜選択できるようにすることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to achieve the above-mentioned problems, the present inventors have selected a specific combination of packing materials and column housing materials for use in liquid chromatography, and using one column for reversed phase. The inventors have found that the above problems can be solved by appropriately selecting the chromatography mode or the hydrophilic interaction chromatography mode, and have completed the present invention.
すなわち本発明は次の事項に関する。
［１］アミノ酸およびビタミン類から選ばれる少なくとも１つを含む試料をカラムに送液し、該カラムにより、前記試料を各成分に分離し、分離された試料をイオン化して質量分析する液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法において、
ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂からなる充填剤に用いること、
前記充填剤が、全体または内面がポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）製の液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填されたカラムを用いること、
および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードにより分析を行うこと
を特徴とするアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［２］前記充填剤を構成するポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂１ｇあたりに、水酸基が０．１〜１０ｍｍｏｌ含まれていることを特徴とする［１］に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［３］前記充填剤の体積平均粒子径が１．０〜３０．０μｍである［１］または［２］のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［４］前記液体クロマトグラフィー用ハウジングのサイズが内径１．０〜１０．０ｍｍ、長さ３５〜３００ｍｍである［１］〜［３］のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［５］前記水溶性有機溶媒が、アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトン、メチルエチルケトンおよびテトラヒドロフランからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
［６］前記移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率が混合前の体積比で５：９５〜９５：５の範囲で変えて、逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードと切り替えることを特徴とする［１］〜［５］のいずれか１項に記載のアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。
That is, the present invention relates to the following matters.
[1] A liquid chromatograph in which a sample containing at least one selected from amino acids and vitamins is fed to a column, the sample is separated into components by the column, and the separated sample is ionized and subjected to mass spectrometry. In mass spectrometry of amino acids or vitamins using a mass spectrometer,
To be used for a filler comprising a polyhydroxy (meth) acrylate resin or a polyvinyl alcohol resin;
A column in which the packing material is packed in a liquid chromatography housing made of polyetheretherketone resin (PEEK), either entirely or internally,
And a method for mass spectrometry of amino acids or vitamins, wherein the analysis is performed in a reverse phase chromatography mode or a hydrophilic interaction chromatography mode using a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water as a mobile phase.
[2] The amino acid according to [1], wherein 0.1 to 10 mmol of hydroxyl group is contained per 1 g of the polyhydroxy (meth) acrylate resin or polyvinyl alcohol resin constituting the filler. Method for mass spectrometry of vitamins.
[3] The amino acid or vitamin mass spectrometry method according to any one of [1] or [2], wherein the filler has a volume average particle diameter of 1.0 to 30.0 μm.
[4] The mass spectrometry of the amino acid or vitamin according to any one of [1] to [3], wherein the liquid chromatography housing has an inner diameter of 1.0 to 10.0 mm and a length of 35 to 300 mm. Method.
[5] Any one of [1] to [4], wherein the water-soluble organic solvent is at least one selected from the group consisting of acetonitrile, methyl alcohol, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, acetone, methyl ethyl ketone, and tetrahydrofuran. A method for mass spectrometry of amino acids or vitamins as described in 1. above.
[6] The reverse phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode are obtained by changing the composition ratio of the water-soluble organic solvent and water in the mobile phase in the range of 5:95 to 95: 5 by volume ratio before mixing. The method for mass spectrometry of amino acids or vitamins according to any one of [1] to [5], wherein
本発明にかかるアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法によれば、水酸基を有するポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂からなる充填剤と、ハウジング全体または内面がポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製のカラムと組み合わせ、および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて、逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードを適時選択することで親水性の高いアミノ酸およびビタミン類から疎水性の高いアミノ酸およびビタミン類まで、分析精度が高く、また簡便に分析できるため、医薬品、化粧品、食品、農業、医療等の幅広い分野に有用であり、中でも食品、健康サプリメント、医薬品、化粧品などを液体クロマトグラフ質量分析装置を用いて有効成分や不純物の同定や定量を行う方法として有用である。 According to the mass spectrometric method for amino acids or vitamins according to the present invention, a filler comprising a polyhydroxy (meth) acrylate resin having a hydroxyl group or a polyvinyl alcohol resin, and the entire or inner surface of the polyether ether ketone (PEEK) Highly hydrophilic amino acids and vitamins by selecting a reversed-phase chromatography mode or hydrophilic interaction chromatography mode in a timely manner, using a combination of these columns and a mixed solvent of water-soluble organic solvent and water as the mobile phase It can be used in a wide range of fields such as pharmaceuticals, cosmetics, food, agriculture, and medicine because of its high analytical accuracy and simple analysis from amino acids to highly hydrophobic amino acids and vitamins. Liquid chromatograph mass spectrometer for cosmetics It is useful as a method for performing identification and quantification of the active ingredient and impurities are.
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明にかかる質量分析方法は、各種アミノ酸およびビタミン類から選ばれる少なくとも１つを液体クロマトグラフィーにて分離させた後、液体クロマトグラフ質量分析装置のイオン源で生成したイオンを質量分離部で質量電荷比により質量分離させて検出する方法であり、食品、化粧品、環境、農業、医療、工業材料等などの様々な分野において高感度質量分析法として用いることができる。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
In the mass spectrometry method according to the present invention, at least one selected from various amino acids and vitamins is separated by liquid chromatography, and then the ions generated by the ion source of the liquid chromatograph mass spectrometer are massed by the mass separation unit. This is a method of detecting by mass separation according to the charge ratio, and can be used as a high-sensitivity mass spectrometry method in various fields such as food, cosmetics, environment, agriculture, medicine, and industrial materials.
このうち、イオン源にはエレクトロスプレーイオン化法、大気圧化学イオン化法などに対応したものが、質量分離部には四重極型、イオントラップ型、飛行時間型などがある。
本発明における各種アミノ酸またはビタミン類の分析においてはイオン源、質量分離部の種類は特に制限なく使用することができる。各種アミノ酸またはビタミン類のイオン化にはエレクトロスプレーイオン化法が適しており、より高感度にて測定を行うためには流量を０．１〜１．０ｍｌ／ｍｉｎの範囲で使用することが好ましい。
Among these, the ion source corresponds to the electrospray ionization method, the atmospheric pressure chemical ionization method, and the like, and the mass separation unit includes a quadrupole type, an ion trap type, and a time-of-flight type.
In the analysis of various amino acids or vitamins in the present invention, the types of ion source and mass separation unit can be used without particular limitation. Electrospray ionization is suitable for ionization of various amino acids or vitamins, and it is preferable to use a flow rate in the range of 0.1 to 1.0 ml / min in order to perform measurement with higher sensitivity.
本発明によるアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法は、
ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂から構成される充填剤を用いること、
全体または内面がポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）製の液体クロマトグラフィー用ハウジングに前記充填剤が充填されたカラムを用いること、
および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードを適時選択させることで、
アミノ酸またはビタミン類のカラムへの吸着を抑制するとともに複数の分析用カラム、質量分析装置を用いることなく親水性の高いアミノ酸またはビタミン類から疎水性の高いアミノ酸またはビタミン類をそれぞれ分離・溶出させ、質量分析する方法である。
The method for mass spectrometry of amino acids or vitamins according to the present invention comprises:
Using a filler composed of a polyhydroxy (meth) acrylate resin or a polyvinyl alcohol resin,
Using a column in which the entire or inner surface is filled with the above-mentioned packing material in a liquid chromatography housing made of polyetheretherketone resin (PEEK);
In addition, by using a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water as a mobile phase, a reverse phase chromatography mode or a hydrophilic interaction chromatography mode is selected at appropriate times.
Suppresses adsorption of amino acids or vitamins onto the column and separates and elutes highly hydrophobic amino acids or vitamins from highly hydrophilic amino acids or vitamins without using multiple analytical columns and mass spectrometers, respectively. This is a method of mass spectrometry.
本発明によるアミノ酸またはビタミン類は分子量が２０００以下の有機化合物であり、水やアセトニトリル、アルコール類などの水溶性有機溶媒に溶解可能であり液体クロマトグラフ質量分析装置にて検出可能であれば化合物の骨格、官能基などの構造に制約はなく、親水性の高いものから、疎水性の高いものまで幅広く分析することができる。 The amino acids or vitamins according to the present invention are organic compounds having a molecular weight of 2000 or less and can be dissolved in water, water-soluble organic solvents such as acetonitrile and alcohols, and can be detected by a liquid chromatograph mass spectrometer. There are no restrictions on the structure of the skeleton, functional groups, etc., and a wide range of analysis can be performed from highly hydrophilic to highly hydrophobic.
ここで本発明で用いるアミノ酸またはビタミン類としては、水酸基、アミノ基、カルボキシル基等の極性官能基を有するものに代表されるような親水性のものや、前記極性官能基が無いまたは乏しい疎水性のものがあり、親水性のものとして、カルニチン、バリン等が挙げられ、疎水性のものとして、フルスルチタミン、レパウジオシド等を挙げることができる。また、ビタミン類は、ビタミン及びビタミン様物質を含む。
以下に、本発明で使用される液体クロマトグラフィーの構成を示す。
Here, the amino acids or vitamins used in the present invention are hydrophilic such as those having a polar functional group such as a hydroxyl group, an amino group, and a carboxyl group, and have no or poor hydrophobicity. Examples include hydrophilic ones such as carnitine and valine, and hydrophobic ones such as fursultitamine and repadioside. Vitamins include vitamins and vitamin-like substances.
Below, the structure of the liquid chromatography used by this invention is shown.
（充填剤）
充填剤には水酸基を有するポリヒドロキシ（メタ）クリレート系樹脂もしくはポリビニルアルコール系樹脂を用いることができる。水酸基は前記樹脂中に予め含有している水酸基またはエステル基の水酸基への変換のほか、樹脂中の水酸基などを介して新たに複数の水酸基を導入してもよい。
(filler)
As the filler, a polyhydroxy (meth) acrylate resin or a polyvinyl alcohol resin having a hydroxyl group can be used. In addition to the conversion of hydroxyl groups or ester groups previously contained in the resin into hydroxyl groups, a plurality of hydroxyl groups may be newly introduced through hydroxyl groups in the resin.
水酸基の含有量は充填剤を構成するヒドロキシ（メタ）クリレート系樹脂もしくはポリビニルアルコール系樹脂１ｇあたり１〜１０ｍｍｏｌであることが好ましい。水酸基の含有量が充填剤１ｇあたり１０ｍｍｏｌ以上となると充填剤の親水性が強すぎてしまい逆相クロマトグラフィーによる化合物の分離・保持が不十分となる。一方、１ｍｍｏｌ以下であると充填剤の親水性が弱く親水性相互作用クロマトグラフィーが作用しなくなることがある。 The content of the hydroxyl group is preferably 1 to 10 mmol per 1 g of hydroxy (meth) acrylate resin or polyvinyl alcohol resin constituting the filler. When the hydroxyl group content is 10 mmol or more per gram of filler, the hydrophilicity of the filler is too strong, and the separation and retention of the compound by reverse phase chromatography becomes insufficient. On the other hand, if it is 1 mmol or less, the hydrophilicity of the filler is weak and hydrophilic interaction chromatography may not work.
ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂の例としては、１個以上のエチレン性炭素−炭素二重結合と１個以上の水酸基を有するヒドロキシ（メタ）アクリレートの重合体、または該ヒドロキシ（メタ）アクリレートと他のモノマーとの共重合体が挙げられる。例えば該ヒドロキシ（メタ）アクリレートとしては、グリセリンジメタクリレート、グリセリンモノメタクリレート、２−ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシブチルメタクリレートおよび２−ヒドロキシ-3-アクリロイロキシプロピルメタクリレートなどが挙げられ、これらは単独でもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。これらの中でも、グリセリンジメタクリレートの単独重合体が特に好ましい。 Examples of polyhydroxy (meth) acrylate resins include polymers of hydroxy (meth) acrylate having one or more ethylenic carbon-carbon double bonds and one or more hydroxyl groups, or the hydroxy (meth) acrylate and Examples include copolymers with other monomers. Examples of the hydroxy (meth) acrylate include glycerin dimethacrylate, glycerin monomethacrylate, 2-hydroxypropyl methacrylate, 2-hydroxybutyl methacrylate and 2-hydroxy-3-acryloyloxypropyl methacrylate. In addition, two or more kinds may be used in combination. Among these, a homopolymer of glycerin dimethacrylate is particularly preferable.
また、ポリビニルアルコール系樹脂の例としては、カルボン酸ビニルエステルと架橋性単量体から構成される架橋共重合体のエステル基をケン化またはエステル交換反応によってアルコール性水酸基に変換したものが挙げられる。カルボン酸ビニルエステルとしては、例えば酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、吉草酸ビニルおよびピバリン酸ビニル等が挙げられ、これらは単独でもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。これらの中でも、酢酸ビニル及びプロピオン酸ビニルが比較的親水性があり重合およびケン化が容易であるので好ましい。 Moreover, as an example of polyvinyl alcohol-type resin, what converted the ester group of the crosslinked copolymer comprised from carboxylate vinyl ester and a crosslinking | crosslinked monomer into the alcoholic hydroxyl group by saponification or transesterification reaction is mentioned. . Examples of the carboxylic acid vinyl ester include vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl butyrate, vinyl valerate, and vinyl pivalate. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, vinyl acetate and vinyl propionate are preferable because they are relatively hydrophilic and can be easily polymerized and saponified.
ヒドロキシ（メタ）クリレート系樹脂もしくはポリビニルアルコール系樹脂から構成される充填剤は、十分な分離性能および高感度を得るために、体積平均粒子径が１．０〜３０．０μｍであることが好ましく、さらに３．０〜１０．０μｍの範囲にあることが好ましい。本願における上記の体積平均粒子径は、コールターカウンター法を用いて次のように測定される。すなわち、測定装置としてＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４（ベックマン・コールター社製）を用い、ポリマー充填剤０．２ｇにアイソトン（希釈液）２５ｍＬを加え、超音波を３分間当てて分散させた後、約１０００個の測定個数にて体積平均粒子径を測定する。体積平均粒径を好ましい範囲とするには、風力分級、ふるい分けによる分級、沈殿を利用した分級等で制御できる。 また、前記充填剤の形状は球形であることが好ましい。さらに、充填剤は、３０ＭＰａまでの圧力に耐えうる強度を有することが好ましい。また、充填剤には任意の割合で水酸基以外のアミノ基、スルホ基、カルボキシル基等のイオン性官能基を導入することもできる。 The filler composed of a hydroxy (meth) acrylate resin or a polyvinyl alcohol resin preferably has a volume average particle diameter of 1.0 to 30.0 μm in order to obtain sufficient separation performance and high sensitivity. Furthermore, it is preferable that it exists in the range of 3.0-10.0 micrometers. The volume average particle diameter in the present application is measured as follows using a Coulter counter method. That is, using Multisizer 4 (manufactured by Beckman Coulter, Inc.) as a measuring device, adding 25 mL of isotone (diluted solution) to 0.2 g of the polymer filler, applying ultrasonic waves for 3 minutes to disperse, and then measuring about 1000 measurements The volume average particle diameter is measured by the number. In order to make the volume average particle size within a preferable range, it can be controlled by air classification, classification by sieving, classification using precipitation, or the like. The filler preferably has a spherical shape. Furthermore, the filler preferably has a strength that can withstand a pressure of up to 30 MPa. Moreover, an ionic functional group such as an amino group other than a hydroxyl group, a sulfo group, or a carboxyl group can be introduced into the filler at an arbitrary ratio.
（カラム）
充填剤が充填されたカラムは、全体または内面がポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製であるハウジングを用いる。具体的には、ハウジング全体がＰＥＥＫ製であっても、ステンレスなどの材質から外管が構成され、接触面となる内面にＰＥＥＫが内張りされたものであってもよい。このうち、全面がＰＥＥＫ製の円筒型ハウジングはイオンクロマトグラフィーなどでも使用されており本発明によるアミノ酸およびビタミン類の分析方法にも好ましく使用することができる。
(column)
The column filled with the packing material uses a housing whose whole or inner surface is made of polyether ether ketone (PEEK). Specifically, even if the entire housing is made of PEEK, the outer tube may be made of a material such as stainless steel, and PEEK may be lined on the inner surface serving as the contact surface. Among these, the cylindrical housing made entirely of PEEK is also used in ion chromatography and the like and can be preferably used in the method for analyzing amino acids and vitamins according to the present invention.
カラムの内径はより高分離、高感度に分析を行うために１．０〜１０．０ｍｍとすることが好ましく、２．０〜６．０ｍｍとすることがさらに好ましく、２．０〜４．６ｍｍとすることが特に好ましい。１．０ｍｍ未満では多孔質粒子の充填が極めて困難となることがある。また１０．０ｍｍを越えると高速分析時にカラム性能が十分得られないことがあるほか、カラム容量が大きいためカラム圧力が高くなり測定可能流速が制限される場合がある。 The inner diameter of the column is preferably 1.0 to 10.0 mm, more preferably 2.0 to 6.0 mm, more preferably 2.0 to 4.6 mm in order to perform analysis with higher separation and higher sensitivity. It is particularly preferable that If it is less than 1.0 mm, filling of the porous particles may be extremely difficult. On the other hand, if it exceeds 10.0 mm, sufficient column performance may not be obtained during high-speed analysis, and the column pressure increases due to the large column volume, which may limit the measurable flow rate.
また、カラムの長さは３５〜３００ｍｍとすることが好ましく、４０〜２５０ｍｍとすることがさらに好ましく、５０〜２５０ｍｍとすることが特に好ましい。３５ｍｍ未満では測定する試料が十分にカラム内に保持、分離できないことがある。また３００ｍｍを越えるとカラム圧力が高くなりカラムからの溶出も著しく遅くなる可能性がある。 The column length is preferably 35 to 300 mm, more preferably 40 to 250 mm, and particularly preferably 50 to 250 mm. If it is less than 35 mm, the sample to be measured may not be sufficiently held and separated in the column. On the other hand, if it exceeds 300 mm, the column pressure becomes high and the elution from the column may be remarkably slow.
また、カラムには必要に応じて、フィルターが設けられることもあるが、フィルターの材料もＰＥＥＫ製であることが望ましい。
本発明では、前記樹脂製充填剤と、充填剤と接触する内面がＰＥＥＫからなるハウジングとを組合せるので、アミノ酸やビタミン類と相互作用する金属が存在しないために、分析精度に大きく向上できる。
The column may be provided with a filter as necessary, but the filter material is preferably made of PEEK.
In the present invention, since the resin filler and the housing made of PEEK on the inner surface in contact with the filler are combined, there is no metal that interacts with amino acids and vitamins, so that the analysis accuracy can be greatly improved.
（移動相）
本発明による液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸およびビタミン類の質量分析方法においては移動相に水および水溶性有機溶媒との混合溶媒を用いて、水溶性有機溶媒：水の組成比率を変えることで逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードを適時選択させることができる。特に水溶性有機溶媒比率が５０〜７０％を境界に比率を低くすると逆相クロマトグラフィーモード、高くすると親水性相互作用クロマトグラフィーモードが発現させることができる。このため本発明によれば、複数のカラムを必要とせず、１本のカラムでより簡便に幅広い特性のアミノ酸やビタミン類を分析することが可能である。
(Mobile phase)
In the mass spectrometry method for amino acids and vitamins using the liquid chromatograph mass spectrometer according to the present invention, a mixed solvent of water and a water-soluble organic solvent is used as the mobile phase, and the composition ratio of the water-soluble organic solvent: water is changed. Thus, the reverse phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode can be selected in a timely manner. In particular, when the water-soluble organic solvent ratio is 50 to 70% as a boundary and the ratio is lowered, the reversed-phase chromatography mode can be developed. For this reason, according to the present invention, it is possible to analyze amino acids and vitamins having a wide range of characteristics more easily with one column without requiring a plurality of columns.
ここで、逆相クロマトグラフィーモードとは、通常、移動相として水溶性有機溶媒および水の混合溶媒を用いた際に、前記混合溶媒の水の比率を高くして、親水性の高い成分から順に溶出させるモードをいう。対して、親水性相互作用クロマトグラフィーモードとは、通常、前記混合溶媒の水溶性有機溶媒の比率を高くして、極性の低い成分から順に溶出させるモードをいう。なお、本発明では、逆相クロマトグラフィーモードを発現させた後に親水性相互作用クロマトグラフィーモードへ切替えてもよく、反対に、親水性相互作用クロマトグラフィーモードを発現させた後に逆相クロマトグラフィーモードへ切替えてもよい。各モードの切替えは移動相の水溶性有機溶媒と水との組成比率を変えることで容易に行うことができる。 Here, the reverse phase chromatography mode usually means that when a mixed solvent of water-soluble organic solvent and water is used as a mobile phase, the ratio of water in the mixed solvent is increased, and the components having higher hydrophilicity are sequentially ordered. The mode to elute. On the other hand, the hydrophilic interaction chromatography mode usually refers to a mode in which the ratio of the water-soluble organic solvent in the mixed solvent is increased and the components having a low polarity are eluted in order. In the present invention, the reverse-phase chromatography mode may be developed and then switched to the hydrophilic interaction chromatography mode. Conversely, the hydrophilic interaction chromatography mode may be developed and then the reverse-phase chromatography mode may be switched. It may be switched. Switching between the modes can be easily performed by changing the composition ratio of the water-soluble organic solvent of the mobile phase and water.
疎水性の高いアミノ酸およびビタミン類の分離・溶出には逆相クロマトグラフィーモードを用いることが好ましいため水溶性有機溶媒：水の組成比率を、混合前の体積の比として、１：９９〜５０：５０とすることが好ましく、５：９５〜５０：５０とすることがさらに好ましく、１０：９０〜５０：５０とすることが特に好ましい。また、親水性の高いアミノ酸およびビタミン類の分離・溶出には親水性相互作用クロマトグラフィーモードを用いることが好ましいため水溶性有機溶媒：水の組成比率を混合前の体積の比として、６０：４０〜９９：１とすることが好ましく、７０：３０〜９５：５とすることがさらに好ましく、７５：２５〜９５：５と することが特に好ましい。 Since it is preferable to use the reverse phase chromatography mode for separation and elution of highly hydrophobic amino acids and vitamins, the composition ratio of water-soluble organic solvent: water is 1:99 to 50: 50, preferably 5:95 to 50:50, more preferably 10:90 to 50:50. In addition, since it is preferable to use the hydrophilic interaction chromatography mode for separating and eluting highly hydrophilic amino acids and vitamins, the composition ratio of water-soluble organic solvent: water is 60:40 as the volume ratio before mixing. To 99: 1, more preferably 70:30 to 95: 5, and particularly preferably 75:25 to 95: 5.
また、本発明による液体クロマトグラフ質量分析装置を用いたアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法においては分析中に水および水溶性有機溶媒との比率を一定として単一の移動相を用いるアイソクラティック法、水溶性有機溶媒比率に勾配を設けるグラジエント法のいずれにおいても分析が可能であるが、逆相クロマトグラフィーモードと親水性相互作用クロマトグラフィーモードとを交互に用いて測定を行う場合には分析時に移動相の切り替えを完了させることができる点でグラジエント法がより好ましい。 Further, in the mass spectrometry method for amino acids or vitamins using the liquid chromatograph mass spectrometer according to the present invention, an isocratic method using a single mobile phase with a constant ratio between water and a water-soluble organic solvent during the analysis. Analysis can be performed by any gradient method in which a gradient is set in the ratio of water-soluble organic solvent. However, when measurement is performed alternately using the reverse phase chromatography mode and the hydrophilic interaction chromatography mode, The gradient method is more preferable in that the switching of the mobile phase can be completed.
水溶性有機溶媒にはアセトニトリル、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、テトラヒドロフラン等のエーテル類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類などが挙げられ、これらは単独でもよく、２種以上を組合せて用いてもよい。移動相には任意の割合でギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどを添加することもできる。 Examples of water-soluble organic solvents include alcohols such as acetonitrile, methanol, ethanol, and isopropyl alcohol, ethers such as tetrahydrofuran, ketones such as acetone and methyl ethyl ketone, and these may be used alone or in combination of two or more. May be. Ammonium formate, ammonium acetate, and the like can be added to the mobile phase at an arbitrary ratio.
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら制限されるものではない。
尚、ポリマー充填剤の平均粒子径は、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ４（ベックマン・コールター社製）を用いて、ポリマー充填剤０．２ｇにアイソトン（希釈液）２５ｍＬを加え、超音波を３分間当てて分散させた後、約１０００個の測定個数にて体積平均粒子径を測定した。
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not restrict | limited at all by these Examples.
The average particle size of the polymer filler was dispersed by adding 25 mL of isotone (diluted solution) to 0.2 g of the polymer filler using Multisizer 4 (manufactured by Beckman Coulter) and applying ultrasonic waves for 3 minutes. Thereafter, the volume average particle diameter was measured at about 1000 measurement pieces.
（実施例１）
（充填剤およびカラムの作製）
ポリマー充填剤としてモノマー中に水酸基を有するグリセリンジメタクリレートを単独重合して得られたポリヒドロキシメタクリレート樹脂（体積平均粒子径５μｍ）を用いた。重合体２．５ｇと無水酢酸１７ｍｌ、ピリジン３３ｍｌを用いて９０℃、１６ｈｒ加熱撹拌を行い重合体中の水酸基と無水酢酸との反応量から水酸基量を測定した結果、重合体の水酸基量は１ｇあたり２．０ｍｍｏｌであった。
Example 1
(Production of packing material and column)
A polyhydroxymethacrylate resin (volume average particle diameter 5 μm) obtained by homopolymerizing glycerin dimethacrylate having a hydroxyl group in the monomer was used as a polymer filler. As a result of measuring the amount of hydroxyl groups from the reaction amount of hydroxyl groups and acetic anhydride in the polymer by heating and stirring at 90 ° C. for 16 hours using 2.5 g of the polymer, 17 ml of acetic anhydride and 33 ml of pyridine, the amount of hydroxyl groups in the polymer was 1 g. Per mmol.
得られたポリヒドロキシメタクリレート樹脂からなる充填剤を、内径２．０ｍｍ×長さ１５０ｍｍのＰＥＥＫ製ハウジング（（株）巴製作所製）に３０ＭＰａの圧力で、２０分かけて充填を行い、分析用カラムを得た。 The obtained packing material made of polyhydroxymethacrylate resin is packed in a PEEK housing having an inner diameter of 2.0 mm × length of 150 mm (manufactured by Sakai Seisakusho Co., Ltd.) at a pressure of 30 MPa over 20 minutes. Got.
（カラムの評価）
まず逆相クロマトグラフィー法により、続いて親水性相互作用クロマトグラフィー法の連続分析によりアミノ酸およびビタミン類の質量分析を実施した。液体クロマトグラフィー質量分析装置として、イオン源にエレクトロスプレーイオン化法、質量分離部に四重極型を有するＬＣＭＳ−８０３０（（株）島津製作所製）を用いた。カラム温度３０℃、流量を０．２ｍｌ／ｍｉｎとした。移動相には１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液とアセトニトリルを用いてグラジエント法により測定を行った。
(Column evaluation)
First, mass spectrometry of amino acids and vitamins was performed by reverse-phase chromatography, followed by continuous analysis by hydrophilic interaction chromatography. As a liquid chromatography mass spectrometer, LCMS-8030 (manufactured by Shimadzu Corporation) having an electrospray ionization method as an ion source and a quadrupole type as a mass separation unit was used. The column temperature was 30 ° C. and the flow rate was 0.2 ml / min. The mobile phase was measured by a gradient method using 10 mmol / L ammonium formate aqueous solution and acetonitrile.
試料にはカルニチン１００μｇ／ｍＬを用いて、まず始めにカルニチン２μＬを注入して分析をスタートさせた後に１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝１００：０（混合前体積比）からスタートを行い１０分かけて１５：８５ に勾配を設けながら逆相クロマトグラフィーモードにてカルニチンを溶出させた。 Carnitine 100 μg / mL was used as a sample. First, 2 μL of carnitine was injected to start the analysis, then 10 mmol / L ammonium formate aqueous solution: acetonitrile = 100: 0 (volume ratio before mixing) was started for 10 minutes. The carnitine was eluted in reverse phase chromatography mode with a gradient of 15:85.
次に１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液：アセトニトリル＝１５：８５のままで分析開始１５分の時点で再度カルニチン１００μｇ／ｍＬを２μＬ注入して親水性相互作用クロマトグラフィーモードにてカルニチンを溶出させた。 Next, with 10 mmol / L ammonium formate aqueous solution: acetonitrile = 15: 85, 2 μL of carnitine 100 μg / mL was injected again at the time of 15 minutes from the start of analysis, and carnitine was eluted in the hydrophilic interaction chromatography mode.
得られたクロマトグラムを図１に示す。カルニチンは逆相クロマトグラフィーモードでは１．８分、親水性相互作用クロマトグラフィーモードでは２回目の注入から４．５分にて溶出されたが、いずれもカラムへの吸着はみられず良好なピーク形状が得られた。 The obtained chromatogram is shown in FIG. Carnitine was eluted at 1.8 minutes in reversed-phase chromatography mode and 4.5 minutes after the second injection in hydrophilic interaction chromatography mode, but none of them adsorbed to the column and showed a good peak. A shape was obtained.
尚、前記逆相クロマトグラフィーモードでの分析ピーク（ピーク１）は、カラム充填剤による保持がなされないまま素通りしたものと考えられ、良好に分離が行われたとは判断できない。つまり、上記の結果は、通常逆相クロマトグラフィーでは分離が困難とされているカルニチンにおいて、逆相クロマトグラフィーモードから親水性相互作用クロマトグラフィーモードへ同一カラムを使って走査することによって、親水性相互作用クロマトグラフィーモードの領域で良好な分離ピークを得ることができたことを示すものである。 The analysis peak (peak 1) in the reverse phase chromatography mode is considered to have passed without being retained by the column packing material, and it cannot be determined that the separation was performed well. In other words, the above results show that in carnitine, which is normally difficult to separate by reverse phase chromatography, scanning from the reverse phase chromatography mode to the hydrophilic interaction chromatography mode using the same column, the hydrophilic interaction This shows that a good separation peak could be obtained in the region of the action chromatography mode.
（比較例１）
（充填剤およびカラムの作製）
実施例１と同じポリマー充填剤を用いて、２．０×１５０ｍｍのステンレス製ハウジング（（株）杉山商事製）に３０ＭＰａ、２０分かけて充填剤の充填を行い、分析用カラムを得た。
(Comparative Example 1)
(Production of packing material and column)
Using the same polymer filler as in Example 1, a 2.0 × 150 mm stainless steel housing (manufactured by Sugiyama Corporation) was filled with the filler over 30 MPa for 20 minutes to obtain an analytical column.
（カラムの評価）
実施例１と同一の装置、分析条件にてカルニチンの測定を行った。
得られたクロマトグラムを図２に示す。カルニチンは逆相クロマトグラフィーモードでは１．８分、親水性相互作用クロマトグラフィーモードでは２回目の注入から５分にて溶出されたが、特に親水性相互作用クロマトグラフィーモードにおいて、ピーク２は実施例１と比べてカラムハウジングへの吸着由来のピーク形状悪化が確認された。
(Column evaluation)
Carnitine was measured using the same apparatus and analysis conditions as in Example 1.
The obtained chromatogram is shown in FIG. Carnitine was eluted at 1.8 minutes in reverse phase chromatography mode and 5 minutes after the second injection in hydrophilic interaction chromatography mode, especially peak 2 in the hydrophilic interaction chromatography mode. Compared with 1, the peak shape deterioration derived from adsorption to the column housing was confirmed.
すなわち、本発明の構成を採用することによって、カルニチンのような逆相クロマトグラフィー法で分析しにくかったものであっても、親水性のものから疎水性のものまで、幅広いアミノ酸やビタミン類を、精度が高く、また簡便に分析できることが示された。
尚、前記逆相クロマトグラフィーモードでの分析ピーク（ピーク１）は、実施例１と同様に、良好に分離が行われたとは判断できない。
That is, by adopting the configuration of the present invention, a wide range of amino acids and vitamins from hydrophilic to hydrophobic, even those that are difficult to analyze by reverse phase chromatography methods such as carnitine, It was shown that the accuracy was high and the analysis was simple.
In addition, it cannot be judged that the analysis peak (peak 1) in the reverse phase chromatography mode was satisfactorily separated as in Example 1.
１ 注入１回目（逆相クロマトグラフィーモード）によるカルニチンのピーク
２ 注入２回目（親水性相互作用クロマトグラフィーモード）によるカルニチンのピーク
1 Carnitine peak from the first injection (reverse phase chromatography mode) 2 Carnitine peak from the second injection (hydrophilic interaction chromatography mode)
Claims (6)
ポリヒドロキシ（メタ）アクリレート系樹脂またはポリビニルアルコール系樹脂からなる充填剤に用いること、
前記充填剤が、全体または内面がポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）製の液体クロマトグラフィー用ハウジングに充填されたカラムを用いること、
および移動相に水溶性有機溶媒と水との混合溶媒を用いて逆相クロマトグラフィーモードまたは親水性相互作用クロマトグラフィーモードにより分析を行うこと
を特徴とするアミノ酸またはビタミン類の質量分析方法。 A liquid chromatograph mass spectrometer that sends a sample containing at least one selected from amino acids and vitamins to a column, separates the sample into each component by the column, and ionizes the separated sample to perform mass analysis. In mass spectrometry of amino acids or vitamins using
To be used for a filler comprising a polyhydroxy (meth) acrylate resin or a polyvinyl alcohol resin;
A column in which the packing material is packed in a liquid chromatography housing made of polyetheretherketone resin (PEEK), either entirely or internally,
And a method for mass spectrometry of amino acids or vitamins, wherein the analysis is performed in a reverse phase chromatography mode or a hydrophilic interaction chromatography mode using a mixed solvent of a water-soluble organic solvent and water as a mobile phase.
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| CN109212005B (en) * | 2018-09-28 | 2020-07-24 | 山东一诺威新材料有限公司 | Method for measuring primary hydroxyl content in polyether polyol by potentiometric titration |
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