JP2018014916A

JP2018014916A - Electroporation apparatus and electroporation method

Info

Publication number: JP2018014916A
Application number: JP2016147124A
Authority: JP
Inventors: 康雄櫻井; Yasuo Sakurai
Original assignee: Toshiba Medical Systems Corp
Current assignee: Canon Medical Systems Corp
Priority date: 2016-07-27
Filing date: 2016-07-27
Publication date: 2018-02-01
Anticipated expiration: 2036-07-27
Also published as: JP6815120B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an electroporation apparatus for efficiently introducing molecules in an extracellular solution into cells in a cell suspension thereof.SOLUTION: According to the present invention, there is provided an electroporation apparatus in which cell suspension containing a large number of cells and an introduced substance is contained in a large number of wells. In a measurement mode, a measurement voltage not inducing cell death is applied to an electrode in an electrode part to measure an electrical parameter related to the cell suspension in the well corresponding to the electrode part. From this electrical parameter, the amount of electric charge to be supplied is calculated. In a poration mode, an impulse voltage is applied to the electrode for a predetermined application time according to the amount of electric charge to be supplied, causing electroporation in the cells in the well.SELECTED DRAWING: Figure 3

Description

本発明の実施形態は、エレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法に関する。 Embodiments described herein relate generally to an electroporation apparatus and an electroporation method.

細胞に人工遺伝子等を電気的に導入するエレクトロポレーション方法は、電気穿孔法とも称せられ、遺伝子導入方法として特許文献１で知られている。このエレクトロポレーション方法は、細胞懸濁液内に短時間に高電圧を印加して電気的刺激（電気パルス）を細胞に与え、一時的に細胞膜を破壊して微細孔を細胞に生じさせている。そして、エレクトロポレーション方法では、この微細孔を介して細胞外液中の分子（遺伝子或いは薬剤化合物）を細胞内に導入させている。このようにエレクトロポレーション方法では、細胞懸濁液内で細胞に電気パルスを印加して細胞膜を一時的に透過性としている。 An electroporation method for electrically introducing an artificial gene or the like into a cell is also referred to as an electroporation method, and is known from Patent Document 1 as a gene introduction method. In this electroporation method, a high voltage is applied to the cell suspension in a short time to apply electrical stimulation (electric pulse) to the cells, temporarily destroying the cell membrane and generating micropores in the cells. Yes. In the electroporation method, molecules (genes or drug compounds) in the extracellular fluid are introduced into the cells through the micropores. Thus, in the electroporation method, an electric pulse is applied to a cell in a cell suspension to make the cell membrane temporarily permeable.

エレクトロポレーション方法は、電気的刺激を与える処理であることから、細胞がダメージを受けて細胞死を招くことがある。しかも、エレクトロポレーション方法は、細胞を個別的に処理するのではなく、多数の細胞を集団として扱ってＤＮＡ等の物質を注入する方法であることから、細胞の無駄遣いが多く、また、エレクトロポレーションの効率が非常に悪い問題がある。 Since the electroporation method is a process of applying electrical stimulation, the cells may be damaged and cause cell death. In addition, since the electroporation method is a method in which a large number of cells are treated as a group and a substance such as DNA is injected instead of individually treating the cells, there is a lot of waste of cells. There is a problem that the efficiency of the installation is very bad.

従来の実験室レベルで実施されるエレクトロポレーション方法では、反応ウェル内に平板電極が対向配置される対向平板２極方式が主流とされている。この平板２極方式は、反応ウェル内の位置に依存して、電場が変化していることから、細胞への人工遺伝子等の分子の導入効率にムラが出る問題がある。実験室レベルでは、細胞死或いは細胞破壊されたものを除外して良好にＤＮＡ等の物質が注入された細胞のみを選択すればその後の処理に問題がないとされている。しかし、臨床検査では、このエレクトロポレーション方法を適用するには、細胞の無駄遣いを減少させ、また、エレクトロポレーションの効率を良好にすることが要請されている。 In a conventional electroporation method performed at a laboratory level, an opposed flat plate bipolar method in which flat plate electrodes are opposed to each other in a reaction well is the mainstream. This flat plate bipolar method has a problem in that the efficiency of introduction of molecules such as artificial genes into cells is uneven because the electric field changes depending on the position in the reaction well. At the laboratory level, if only cells into which a substance such as DNA has been successfully injected are selected except for cell death or cell destruction, there is no problem in subsequent processing. However, in clinical examination, in order to apply this electroporation method, it is required to reduce the waste of cells and to improve the efficiency of electroporation.

このような背景から、非特許文献１において、電極として嶮山型電極の採用されているエレクトロポレーション装置が提案されている。このエレクトロポレーション装置では、反応ウェル内に、嶮山型電極としての多数の針状電極が配置され、細胞懸濁液内の電場が比較的均一に維持されている。このように反応ウェル内に、多数の針状電極が配置されるエレクトロポレーション装置では、対向平板２極方式に比べて、細胞が複数電極間に分布されることから、夫々の細胞にエレクトロポレーションのための固有の臨界電界強度（Ｅ＝ｋＶ／ｃｍ）を与えることができるとしている。ここで、Ｖは、電極間電圧であり、ｃｍは、電極間距離を意味している。 From such a background, Non-Patent Document 1 proposes an electroporation apparatus that employs an Ulsan type electrode as an electrode. In this electroporation apparatus, a large number of needle-like electrodes as an Ulsan type electrode are arranged in a reaction well, and the electric field in the cell suspension is maintained relatively uniform. Thus, in an electroporation apparatus in which a large number of needle-like electrodes are arranged in a reaction well, cells are distributed between a plurality of electrodes as compared to the opposed flat plate bipolar system. Inherent critical electric field strength (E = kV / cm) can be provided. Here, V is an inter-electrode voltage, and cm means an inter-electrode distance.

特開２００４−１４５１７号公報JP 2004-14517 A

"High-density distributed electrodenetwork, a multi-functional electroporation method for delivery ofmolecules of different sizes" SCIENTIFIC REPORTS | 3 : 3370 | DOI: 10.1038/srep03370"High-density distributed electrodenetwork, a multi-functional electroporation method for delivery of molecules of different sizes" SCIENTIFIC REPORTS | 3: 3370 | DOI: 10.1038 / srep03370

上述したように嶮山型電極の採用によって、多数の細胞に良好にＤＮＡ等の物質を注入できることが予想される。しかしながら、多数の患者から採取された細胞が検査対象とされ、同時並行処理される臨床検査では、エレクトロポレーション前の前処理の段階において液組成が異なる細胞懸濁液が調整され、予想するようなエレクトロポレーション効果を実現することができない問題がある。体細胞が複数の反応ウェルで同時にエレクトロポレーションされる例では、患者から採取できる細胞の数、修理、前工程から持ち込まれる処理液の量に差があり、各反応ウェルで検査対象の細胞懸濁液の電気抵抗が異なっている蓋然性が高くなる。従って、複数の反応ウェル毎に、同一の電圧を印加すると、反応ウェル毎に流れる電荷量が異なり、結果として、反応ウェルごとの人工遺伝子等の注入物質の導入効率にムラがでる問題がある。 As described above, it is expected that a substance such as DNA can be successfully injected into a large number of cells by employing the Hiyama type electrode. However, in clinical tests in which cells collected from a large number of patients are targeted for testing and are processed in parallel, cell suspensions with different liquid compositions are prepared and expected at the pretreatment stage prior to electroporation. There is a problem that an electroporation effect cannot be realized. In the case where somatic cells are electroporated simultaneously in multiple reaction wells, there are differences in the number of cells that can be collected from the patient, the amount of repair solution, and the amount of treatment solution brought from the previous process. The probability that the electrical resistance of the suspension is different is increased. Therefore, when the same voltage is applied to each of the plurality of reaction wells, the amount of charge flowing in each reaction well differs, and as a result, there is a problem that the introduction efficiency of an injection substance such as an artificial gene for each reaction well is uneven.

この発明の目的は、複数のウェルに格納された細胞懸濁液に電圧インパルスを印加してウェル毎に定まる電荷量を注入し、細胞外液中の分子をその細胞懸濁液内の細胞に効率的に導入させることができるエレクトロポレーション装置及びエレクトロポレーション方法を提供するにある。 The object of the present invention is to apply a voltage impulse to a cell suspension stored in a plurality of wells to inject a charge amount determined for each well, and to cause molecules in the extracellular fluid to flow into the cells in the cell suspension. It is an object of the present invention to provide an electroporation apparatus and an electroporation method that can be efficiently introduced.

実施形態によれば、
多数の細胞及び導入物質を含む細胞懸濁液が収納されている複数のウェルと、
前記ウェルに対応して設けられる複数の電極部であって、前記電極部の各々が前記細胞懸濁液に浸漬されるように支持されている複数電極を含む複数の電極部と、
測定用電圧及び前記ウェル内の細胞にエレクトロポレーションを生じさせるインパルス電圧を発生する電源部と、
測定モードにおいて、前記電源部から前記電極部の前記電極に前記測定電圧を印加して当該電極部に対応する前記ウェル内の細胞懸濁液に関する電気的パラメータを測定し、この電気的パラメータから供給すべき電荷量を算出する算出部と、
エレクトロポレーションモードにおいて、前記算出部で算出した電荷量に基づき、インパルス電圧を所定の印加時間、前記各電極部の前記電極に印加するインパルス電圧印加部と、
を具備するエレクトロポレーション装置が提供される。 According to the embodiment,
A plurality of wells containing a cell suspension containing a large number of cells and the introduced substance;
A plurality of electrode portions provided corresponding to the wells, each of the electrode portions including a plurality of electrodes supported so as to be immersed in the cell suspension; and
A power supply for generating a voltage for measurement and an impulse voltage for causing electroporation in the cells in the well;
In the measurement mode, the measurement voltage is applied to the electrode of the electrode unit from the power supply unit to measure an electrical parameter related to the cell suspension in the well corresponding to the electrode unit, and supply from the electrical parameter A calculation unit for calculating the amount of charge to be
In the electroporation mode, based on the amount of charge calculated by the calculation unit, an impulse voltage application unit that applies an impulse voltage to the electrodes of each electrode unit for a predetermined application time;
An electroporation apparatus is provided.

実施形態のエレクトロポレーション装置が組み込まれた細胞特性評価装置の１例を概略的に示す模式図である。It is a schematic diagram which shows roughly an example of the cell characteristic evaluation apparatus with which the electroporation apparatus of embodiment was integrated. 図１に示すエレクトロポレーション装置におけるウェル内に浸漬される電極配置を示す平面図である。It is a top view which shows the electrode arrangement | positioning immersed in the well in the electroporation apparatus shown in FIG. 図１に示すエレクトロポレーション装置におけるエレクトロポレーション回路部の概略を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the outline of the electroporation circuit part in the electroporation apparatus shown in FIG. 図１に示す細胞特性評価装置における処理を示すフローチャートである。It is a flowchart which shows the process in the cell characteristic evaluation apparatus shown in FIG. 図１に示すエレクトロポレーション（遺伝子導入）装置における動作手順を示すフローチャートである。2 is a flowchart showing an operation procedure in the electroporation (gene introduction) apparatus shown in FIG. 1. 図１に示すエレクトロポレーション装置における他の実施の形態に係るエレクトロポレーション回路部の概略を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the outline of the electroporation circuit part which concerns on other embodiment in the electroporation apparatus shown in FIG.

以下、エレクトロポレーション装置の実施の形態について、図面を参照して説明する。 Hereinafter, embodiments of an electroporation apparatus will be described with reference to the drawings.

始めに、図１を参照して実施の形態に係るエレクトロポレーション装置３０が組み込まれた細胞特性評価システム１０の１例を説明する。このシステム１０においては、エレクトロポレーション装置は、レポーターベクターとして遺伝子（ＤＮＡ）を導入する装置として実現され、被検細胞の異常活性を検出し、それに基づいて被検細胞の細胞特性を評価している。 First, an example of the cell characteristic evaluation system 10 incorporating the electroporation apparatus 30 according to the embodiment will be described with reference to FIG. In this system 10, the electroporation apparatus is realized as an apparatus for introducing a gene (DNA) as a reporter vector, detects abnormal activity of a test cell, and evaluates the cell characteristics of the test cell based on it. Yes.

システム１０は、細胞分離装置２０と、エレクトロポレーション装置３０と、測定装置４０と、これらの装置の下方に連続して延出され、容器部６０を搬送するステージ５０とから構成されている。このようにステージ５０上には、細胞分離装置２０、エレクトロポレーション装置、測定装置４０がステージ５０の移動に沿って配置され、容器部６０のウェル６２に被検細胞を含む試料１８が導かれた順次処理される。 The system 10 includes a cell separation device 20, an electroporation device 30, a measurement device 40, and a stage 50 that continuously extends below these devices and conveys a container unit 60. As described above, the cell separation device 20, the electroporation device, and the measurement device 40 are arranged on the stage 50 along the movement of the stage 50, and the sample 18 containing the test cell is guided to the well 62 of the container unit 60. Are processed sequentially.

細胞分離装置２０は、対象（例えば、患者）から得た検体（例えば、血液或いは尿）から、試験されるべき細胞、即ち、被検細胞を分離するための複数の分離器２２を具備している。複数の分離器２２は、容器部６０上のウェル６２の配列に対応してステージ５０の移動方向に対して略直交する方向（交差方向）に沿って配列されている。各分離器２２は、対象から得た検体を受け入れる受容器２４と、受容器２４で受け取った検体について消化等の処理を行う処理器２６と、処理器２６で処理された処理済み検体から被検細胞を分離するための分離部２８とを具備している。この分離器２２では、受容器２４、処理器２６及び分離部２８は、互いに内径の異なる３つの中空の筒状体が上方から下方に向けてこの順序で積層され、互いに液密に一体化されている。受容器２４、処理器２６及び分離部２８と各境界部は、弁（図示せず）により開閉可能に液絡されている。 The cell separation device 20 includes a plurality of separators 22 for separating cells to be tested, that is, test cells, from a sample (eg, blood or urine) obtained from a subject (eg, a patient). Yes. The plurality of separators 22 are arranged along a direction (cross direction) substantially orthogonal to the moving direction of the stage 50 corresponding to the arrangement of the wells 62 on the container part 60. Each separator 22 includes a receiver 24 that receives a sample obtained from a subject, a processor 26 that performs a process such as digestion on the sample received by the receiver 24, and a test sample that has been processed by the processor 26. And a separation unit 28 for separating cells. In this separator 22, the receiver 24, the processor 26, and the separator 28 are stacked in this order from the top to the bottom with three hollow cylindrical bodies having different inner diameters, and are liquid-tightly integrated with each other. ing. The receiver 24, the processor 26, the separation unit 28, and each boundary portion are in liquid communication with a valve (not shown) so as to be opened and closed.

受容器２４は、上部が開口した筒状で、下方に向けて漏斗状に形成されている筒状体に構成され、開閉可能な蓋を備えている。受容器２４と処理器２６との境界は、弁（図示せず）によって液密に閉じられて逆流が防止される。従って、この弁が閉じたときには、この弁は、受容器２４の底部を構成している。処理器２６は、受容器２４の下端と連続する筒状体に形成されている。受容器２４との境界部の弁が液密に閉じたときには、処理器２６は、有蓋となっている。同様に処理器２６は、分離部２８との境界部の弁が閉じたときには、有底となっている。分離部２８は、その内壁が処理器２６の内壁から液密に連続している筒状体であり、その下端には、弁（図示せず）が設けられている。この弁が液密に閉じられて、分離部２８は、有底に維持される。 The receptacle 24 has a cylindrical shape with an open top and is formed into a cylindrical body that is formed in a funnel shape downward, and includes a lid that can be opened and closed. The boundary between the receiver 24 and the processor 26 is liquid tightly closed by a valve (not shown) to prevent backflow. Thus, when the valve is closed, it constitutes the bottom of the receiver 24. The processor 26 is formed in a cylindrical body that is continuous with the lower end of the receiver 24. When the valve at the boundary with the receiver 24 is liquid-tightly closed, the processor 26 is covered. Similarly, the processor 26 is bottomed when the valve at the boundary with the separation unit 28 is closed. The separation part 28 is a cylindrical body whose inner wall is liquid-tightly continuous from the inner wall of the processor 26, and a valve (not shown) is provided at the lower end thereof. The valve is closed in a liquid-tight manner, and the separation unit 28 is maintained in a bottomed state.

分離部２８の内部には、分離材が固定されている。システム１０の使用時には、分離部２８底の下方のステージ５０上に、分離された被検細胞を含む試料１８を分離部２８から受け取り、試料を収容するウェル６２を具備している容器部６０が載置される。ステージ５０は、矢印５１で示されるようにステージ移動機構５４によって移動され、容器部６０上に配置された複数のウェル６２は、夫々分離部２８に対応して設けられ、矢印５１で示されるステージ５０の進行方向に対して略直交するように配列されている。ここで、処理器２６は、その内部に含む検体に対して消化および生化学反応などの所望の処理を行う加熱および／または恒温機構を備えても良い。また、分離材は、処理器２６からの下りてきた検体から、被検細胞を含む試料１８を分離、採取する部材であってもよく、或いは、処理器２６からの下りてきた検体から、夾雑物を取り除く部材であっても良い。分離材は、分離部２８の中心軸に交差する面に沿って広がり分離部２８の内壁の円周に亘って固定されていて良い。分離材は、例えば、フィルター、メンブランおよび／または磁石などであっても良い。受容器２４の蓋及び受容器２４と処理器２６と分離部２８との各境界部に設けられる弁（いずれも図示せず）は、開閉制御部１２によって開閉制御され、処理された試料が順次滴下されて下方に流下される。 A separating material is fixed inside the separating portion 28. When the system 10 is used, on the stage 50 below the bottom of the separation unit 28, the container unit 60 including the well 62 for receiving the sample 18 containing the separated test cells from the separation unit 28 and containing the sample is provided. Placed. The stage 50 is moved by the stage moving mechanism 54 as indicated by an arrow 51, and a plurality of wells 62 arranged on the container part 60 are provided corresponding to the separation part 28, respectively. They are arranged so as to be substantially orthogonal to the 50 traveling directions. Here, the processor 26 may include a heating and / or thermostatic mechanism that performs a desired process such as digestion and biochemical reaction on the specimen contained therein. The separation material may be a member that separates and collects the sample 18 including the test cell from the sample that has descended from the processor 26, or may be contaminated from the sample that has descended from the processor 26. It may be a member that removes an object. The separating material may extend along a plane intersecting the central axis of the separating portion 28 and may be fixed over the circumference of the inner wall of the separating portion 28. The separating material may be, for example, a filter, a membrane, and / or a magnet. The lid of the receiver 24 and the valves (none of which are shown) provided at each boundary between the receiver 24, the processor 26 and the separation unit 28 are controlled to open and close by the open / close control unit 12, and the processed samples are sequentially supplied. It is dropped and flows downward.

分離器２２で分離された被検細胞を含む試料１８は、ステージ５０上に載置された容器部６０上のウェル６２に収容される。被検細胞を収容する容器部６０は、エレクトロポレーション装置に送られる。 The sample 18 containing the test cells separated by the separator 22 is accommodated in the well 62 on the container unit 60 placed on the stage 50. The container part 60 which accommodates a test cell is sent to an electroporation apparatus.

エレクトロポレーション装置は、容器部６０のウェル６２に対応して複数のプローブヘッド３４を備えている。各プローブヘッド３４は、容器部６０の各ウェル６２に収容された被検細胞に対してレポーターベクターを導入するエレクトロポレーションのための剣山電極３２を支持している。このプローブヘッド３４は、昇降機構３６によって個別に或いは同時に降下されて剣山電極３２、３３がウェル６２内の試薬１８に浸漬される。剣山電極３２、３３には、エレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０が接続され、エレクトロポレーション回路部７０からの微小時間（数十マイクロ秒）に亘るインパルス電圧が剣山電極３２、３３に印加されてレポーターベクターが被検細胞に導入される。レポーターベクターの被検細胞への導入処理後には、昇降機構３６が動作されてプローブヘッド３４が上昇され、図示するような定位置に復帰される。 The electroporation apparatus includes a plurality of probe heads 34 corresponding to the wells 62 of the container unit 60. Each probe head 34 supports a sword mountain electrode 32 for electroporation for introducing a reporter vector to a test cell accommodated in each well 62 of the container 60. The probe head 34 is lowered individually or simultaneously by the elevating mechanism 36, and the sword mountain electrodes 32 and 33 are immersed in the reagent 18 in the well 62. An electroporation (gene introduction) circuit unit 70 is connected to the sword mountain electrodes 32 and 33, and an impulse voltage from the electroporation circuit unit 70 for a short time (several tens of microseconds) is applied to the sword mountain electrodes 32 and 33. Then, the reporter vector is introduced into the test cell. After the introduction process of the reporter vector into the test cell, the elevating mechanism 36 is operated to raise the probe head 34 and return to a fixed position as shown.

導入プローブヘッド３４は、図２に示すように剣山電極を構成する複数の電極３２、３３を支持し、複数の電極３２、３３によってエレクトロポレーターを構成している。複数の電極３２、３３は、例えば、５０〜６０本の電極で構成され、互いに近接する電極対の一方が陽極に、また、他方がアースに定められるように電源部直流電源に接続される。このように剣山電極を構成する複数の電極３２、３３は、導入プローブヘッド３４から所定長だけ延出されて等長の露出長を与えられ、その先端（自由端）が同一の仮想面上に２次元的分布される。図２においては、剣山電極の構成を簡略化して示すために９本の電極のみが示され、プラス側の電極３２が白抜きの円で示され、アース側の電極３３がハッチされた円で示され、交互にプラス側の電極３２及びアース側の電極３３が配置されている様子が示されている。 As shown in FIG. 2, the introduction probe head 34 supports a plurality of electrodes 32, 33 constituting a sword mountain electrode, and the plurality of electrodes 32, 33 constitute an electroporator. The plurality of electrodes 32 and 33 are composed of, for example, 50 to 60 electrodes, and are connected to the power source DC power supply so that one of the electrode pairs adjacent to each other is defined as the anode and the other is defined as the ground. In this way, the plurality of electrodes 32 and 33 constituting the sword mountain electrode are extended from the introduction probe head 34 by a predetermined length and given an equal length exposure length, and their tips (free ends) are on the same virtual surface. Two-dimensional distribution. In FIG. 2, only nine electrodes are shown in order to simplify the configuration of the Kenzan electrode, the plus side electrode 32 is indicated by a white circle, and the ground side electrode 33 is indicated by a hatched circle. It is shown that the positive side electrode 32 and the ground side electrode 33 are alternately arranged.

エレクトロポレーション回路部７０は、図３に示すように選択スイッチ７３によって切り替えられて選択可能な直流電源７２及び交流電源７１を含む電源部９０を備え、電源部９０のプラス側は、個別に開閉時間ｔが制御される個別スイッチ７４及び電流検出部７５を介して剣山電極のプラス側電極３２に接続され、電源部９０のマイナス側は、剣山電極のマイナス側電極３２に接続されている。容器部６０のウェル６２には、それぞれ検査対象の細胞懸濁液が収納され、図３では、これらプラス側の電極３２及びアース側の電極３３が細胞懸濁液に浸漬されている。容器部６０のウェル６２内には、ほぼ同一容量の細胞懸濁液が導入されるように、制御されるが、後に述べるようにウェル６２毎にインパルス時間及び／またはインパルス電圧が制御されることから、厳密に一定容量の細胞懸濁液が導入されなくとも良い。ここで、直流電源７２は、主にエレクトロポレーションを実行するポレーションモードの際に利用され、交流電源７１は、エレクトロポレーション前における細胞懸濁液の電気特性を測定して印加条件を算出する測定モードの際に利用される。 As shown in FIG. 3, the electroporation circuit unit 70 includes a power source unit 90 including a DC power source 72 and an AC power source 71 that can be switched by a selection switch 73, and the positive side of the power source unit 90 is individually opened and closed. It is connected to the plus side electrode 32 of the Kenzan electrode via the individual switch 74 and the current detection unit 75 whose time t is controlled, and the minus side of the power supply unit 90 is connected to the minus side electrode 32 of the Kenzan electrode. Each of the wells 62 of the container 60 stores a cell suspension to be examined. In FIG. 3, the plus side electrode 32 and the ground side electrode 33 are immersed in the cell suspension. Control is performed so that approximately the same volume of cell suspension is introduced into the well 62 of the container unit 60, but the impulse time and / or impulse voltage is controlled for each well 62 as described later. Thus, a strictly constant volume of cell suspension need not be introduced. Here, the DC power source 72 is mainly used in a poration mode in which electroporation is performed, and the AC power source 71 measures the electrical characteristics of the cell suspension before electroporation and calculates application conditions. Used in the measurement mode.

エレクトロポレーション回路部７０は、測定部９２及び印加条件算出部９４を備えている。測定モード時における各ウェル６２内に流れる電流は、電流検出部７５で検知され、電流検出部７５から測定部９２に出力されて各ウェル６２内の細胞懸濁液の回路定数（抵抗Ｒ、キャパシタＣ及び時定数τ）が測定用電圧値及び測定電流値から演算される。これらの演算された回路定数のパラメータは、各ウェル６２を特定するウェル番号とともに印加条件記憶部９６に記憶される。また、印加条件算出部９４では、これらの演算された回路定数のパラメータを利用してスイッチ閉成時間（インパルス時間）及び設定電荷量を含む印加条件を算出し、同様に、ウェル番号に関連付けられて印加条件記憶部９６に格納される。エレクトロポレーション回路部７０は、個別スイッチ７４の開閉を制御するスイッチ開閉制御部９７及び回路全体を制御する回路制御部９８を備えている。スイッチ開閉制御部９７は、ポレーションモード時にスイッチ７４の閉成時間を制御し、マイナス側電極３３からプラス側電極３４に供給する電荷量を制御している。また、回路制御部９８は、電源部９０、測定部９２、印加条件算出部９４、印加条件記憶部９６及びスイッチ開閉制御部９７を制御し、エレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０における測定モード及びポレーションモードを実行させている。測定モード及びポレーションモードについては、後により詳細に説明する。 The electroporation circuit unit 70 includes a measurement unit 92 and an application condition calculation unit 94. The current flowing in each well 62 in the measurement mode is detected by the current detection unit 75, and is output from the current detection unit 75 to the measurement unit 92, so that the circuit constant of the cell suspension in each well 62 (resistance R, capacitor C and time constant τ) are calculated from the measurement voltage value and the measurement current value. These calculated circuit constant parameters are stored in the application condition storage unit 96 together with the well number that identifies each well 62. In addition, the application condition calculation unit 94 calculates the application condition including the switch closing time (impulse time) and the set charge amount by using these calculated circuit constant parameters, and is similarly associated with the well number. And stored in the application condition storage unit 96. The electroporation circuit unit 70 includes a switch opening / closing control unit 97 that controls opening / closing of the individual switch 74 and a circuit control unit 98 that controls the entire circuit. The switch opening / closing control unit 97 controls the closing time of the switch 74 in the poration mode, and controls the amount of charge supplied from the minus side electrode 33 to the plus side electrode 34. The circuit control unit 98 controls the power supply unit 90, the measurement unit 92, the application condition calculation unit 94, the application condition storage unit 96, and the switch opening / closing control unit 97, and the measurement mode in the electroporation (gene introduction) circuit unit 70. And the poration mode is executed. The measurement mode and the poration mode will be described in detail later.

エレクトロポレーション装置は、レポーターベクターを含む試薬を容器部６０に供給するためのノズル（図示せず）を備え、エレクトロポレーション装置は、ノズルに試薬を送るための送液システム、送液システムに試薬を供給するための試薬収納容器（いずれも図示せず）を備えている。 The electroporation apparatus includes a nozzle (not shown) for supplying a reagent containing a reporter vector to the container 60, and the electroporation apparatus includes a liquid feeding system and a liquid feeding system for sending the reagent to the nozzle. A reagent storage container (both not shown) for supplying the reagent is provided.

尚、エレクトロポレーション装置は、所定時間に亘り、所定の培養条件下で容器部６０のウェル６２内の被検細胞を培養する培養器として機能しても良い。エレクトロポレーション装置の培養は、図１に示されるシステムの全体を制御する制御部８０により制御されれば良い。 The electroporation apparatus may function as an incubator for culturing test cells in the well 62 of the container unit 60 under a predetermined culture condition for a predetermined time. The culture of the electroporation apparatus may be controlled by the control unit 80 that controls the entire system shown in FIG.

エレクトロポレーション装置において、レポーターベクターが被検細胞に導入された後、この被検細胞が収納されているウェル６２を有する容器部６０は、次に測定装置４０に移送される。測定装置４０は、ステージ５０の一部分を上部と下部とから覆い、容器部６０を暗室内に収納した状態に維持する暗箱機構（図示せず）及び暗箱機構内部に配置され、ウェル６２内の試料１８を照明する光源（図示せず）を備えている。また、測定装置４０は、光源で照明されるウェル６２内の被写体（細胞）に焦点合わせされる対物レンズ４２及び対物レンズ４で伝播される被写体画像（細胞）を撮影する撮像部８２を具備している。光源および撮像部８２は、システム制御部８０によって制御され、システム制御部８０は、撮像部８２で撮影されたウェル６２内の被写体画像をメモリ８４にフレーム画像として格納し、撮影画像をそのまま、或いは、コントラスト処理または強調処理等を施して表示部８６に表示させている。測定装置４０が顕微鏡装置を備える場合には、測定装置４０の光源、対物レンズ４２および撮像部８２は、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラなどを搭載した顕微鏡装置に含まれている撮像部等が代用されても良い。システム制御部８０は、撮像部８２のみならず、開閉制御部１２、昇降機構３６、ステージ移動機構５２及びエレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０を制御して、図４に示す被検細胞の細胞特性を評価する方法を実施させている。 In the electroporation apparatus, after the reporter vector is introduced into the test cell, the container part 60 having the well 62 in which the test cell is accommodated is then transferred to the measurement apparatus 40. The measuring device 40 covers a part of the stage 50 from the upper part and the lower part, and is arranged in a dark box mechanism (not shown) and a dark box mechanism for maintaining the container part 60 in the dark room, and the sample in the well 62 A light source (not shown) for illuminating 18 is provided. The measuring device 40 includes an objective lens 42 focused on a subject (cell) in the well 62 illuminated by a light source and an imaging unit 82 that captures a subject image (cell) propagated by the objective lens 4. ing. The light source and imaging unit 82 is controlled by the system control unit 80, and the system control unit 80 stores the subject image in the well 62 taken by the imaging unit 82 as a frame image in the memory 84, and the taken image is used as it is or Then, a contrast process or an emphasis process is performed on the display unit 86. When the measuring device 40 includes a microscope device, the light source, the objective lens 42, and the imaging unit 82 of the measuring device 40 are replaced by an imaging unit or the like included in a microscope device equipped with a CCD camera or a CMOS camera. Also good. The system control unit 80 controls not only the imaging unit 82 but also the opening / closing control unit 12, the elevating mechanism 36, the stage moving mechanism 52, and the electroporation (gene introduction) circuit unit 70, so that the test cell shown in FIG. A method for evaluating cellular properties is being implemented.

システム制御部８０によって制御されている細胞特性評価システム１０では、評価方法を実施するに際して、はじめに細胞分離装置２０の分離部２８下方のステージ５０上に容器部６０が載置されて評価処理が開始される（Ｓ１８）。次に、上部開口から受容器２４内に、所望により予めミンスやホモジナイズなどの前処理がなされた検体が持ち込まれる。これと共に、処理器２６での処理に必要な試薬が添加される。試薬の添加は、処理器２６に開閉可能に設けられた試薬添加口から行われてもよい（Ｓ２０）。開閉処理部１２によって受容器２４の蓋が閉められ、処理器２６との境界の弁が開成される。予め設定された条件に従って処理器２６内で消化処理が行われる。処理器２６は予め設定された条件を満たす環境を作り出すための温度調節器を備えてよい（Ｓ２１）。次に、処理器２６と分離部２８との境界の弁か解放され、処理器２６内で処理された検体が分離部２８内部に送られる。分離部２８の分離材を通過することにより、検体に含まれる夾雑物が除去される（Ｓ２２）。分離された被検細胞を含む試料１８は、容器部６０のウェル６２に送られて収容される。ここで、分離材を通過するのに先駆けて処理器２６内で進められた反応を止めるための反応停止試薬が検体に対して添加されても良い。この添加は、予め分離部２８内に反応停止試薬を収容されていても良く、そのような試薬を添加するための開閉可能な試薬添加口が分離器２２の何れかの位置の壁面に設けられていても良い（Ｓ２３）。 In the cell characteristic evaluation system 10 controlled by the system control unit 80, when performing the evaluation method, the container unit 60 is first placed on the stage 50 below the separation unit 28 of the cell separation device 20 and the evaluation process is started. (S18). Next, a specimen that has been pretreated beforehand, such as mince or homogenization, is brought into the receiver 24 from the upper opening. At the same time, reagents necessary for processing in the processing unit 26 are added. The reagent may be added from a reagent addition port provided in the processor 26 so as to be openable and closable (S20). The lid of the receiver 24 is closed by the opening / closing processor 12 and a valve at the boundary with the processor 26 is opened. Digestion processing is performed in the processing device 26 according to preset conditions. The processor 26 may include a temperature controller for creating an environment that satisfies a preset condition (S21). Next, the valve at the boundary between the processor 26 and the separation unit 28 is released, and the specimen processed in the processor 26 is sent into the separation unit 28. By passing the separation material of the separation unit 28, contaminants contained in the specimen are removed (S22). The sample 18 containing the separated test cells is sent to and stored in the well 62 of the container unit 60. Here, a reaction stopping reagent for stopping the reaction advanced in the processor 26 prior to passing through the separation material may be added to the specimen. In this addition, a reaction stopping reagent may be stored in the separation unit 28 in advance, and a reagent addition port that can be opened and closed for adding such a reagent is provided on the wall surface at any position of the separator 22. (S23).

被検細胞を含む試料１８をウェル６２に収容したままで、容器部６０は、エレクトロポレーション装置に送られる（Ｓ２４）。エレクトロポレーション装置のノズルからレポーターベクターを含む試薬が容器部６０のウェル６２に添加される。導入プローブヘッド３４の電極３２，３３が容器部６０のウェル６２内の試料１８に接触され、エレクトロポレーション回路部７０においてポレーションモードに先だって測定モードが実行され、電荷印加条件が設定される（Ｓ２５）。その後、電荷印加条件の設定後、ポレーションモードに切り替えられて、設定された電荷印加条件でエレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０が動作制御され、レポーターベクターが被検細胞に導入される（Ｓ２６）。エレクトロポレーション回路部７０の制御下で被検細胞は、所定の時間に亘り、所定の培養条件下で培養される（Ｓ２８）。 The container 60 is sent to the electroporation apparatus while the sample 18 containing the test cells is housed in the well 62 (S24). A reagent containing a reporter vector is added to the well 62 of the container 60 from the nozzle of the electroporation apparatus. The electrodes 32 and 33 of the introduction probe head 34 are brought into contact with the sample 18 in the well 62 of the container 60, and the electroporation circuit unit 70 executes the measurement mode prior to the poration mode, and sets the charge application conditions ( S25). Then, after setting the charge application conditions, the mode is switched to the poration mode, the operation of the electroporation (gene introduction) circuit unit 70 is controlled under the set charge application conditions, and the reporter vector is introduced into the test cell ( S26). Under the control of the electroporation circuit unit 70, the test cell is cultured under a predetermined culture condition for a predetermined time (S28).

ここでは、レポーターベクターが被検細胞に導入される例を示したが、レポーターベクターに代えて、または、レポーターベクターとともに、レポーターベクター以外の核酸、タンパク質、薬剤及び/またはイオンなどが被検細胞に導入されても良い。被検細胞に導入されるこれら物質は、単に導入物質と称するものとする。 Here, an example is shown in which a reporter vector is introduced into a test cell, but instead of the reporter vector, or together with the reporter vector, nucleic acids, proteins, drugs and / or ions other than the reporter vector are introduced into the test cell. May be introduced. These substances introduced into the test cells are simply referred to as introduction substances.

その後、容器部６０は、測定装置４０に送られる。測定装置４０では、容器部６０のウェル６２に収容された被検細胞におけるレポーター蛋白質量を測定する。測定装置４０における全ての手続きは、予めメモリ８４に格納されたプログラムおよび複数の情報が纏められたテーブルに従ってシステム制御部８０が実行制御する。例えば、光源からの光照射、照射時間および照射間隔などの照射条件の制御、撮像部８２による撮像および撮像条件の制御、撮像された画像についての画像処理および画像処理などが測定装置４０において制御される。また、細胞特性の判定についても、予めメモリ８４に格納されたプログラムに沿って、画像と細胞特性とを対応付けした情報を含むテーブルを参照して、システム制御部８０が実施する。 Thereafter, the container unit 60 is sent to the measuring device 40. In the measuring device 40, the amount of reporter protein in the test cell accommodated in the well 62 of the container part 60 is measured. All procedures in the measuring apparatus 40 are executed and controlled by the system control unit 80 in accordance with a table preliminarily stored in the memory 84 and a table in which a plurality of information is collected. For example, the measurement apparatus 40 controls light irradiation from the light source, control of irradiation conditions such as irradiation time and irradiation interval, imaging by the imaging unit 82 and control of imaging conditions, image processing and image processing on the captured image, and the like. The In addition, the determination of the cell characteristics is also performed by the system control unit 80 with reference to a table including information in which images and cell characteristics are associated with each other in accordance with a program stored in the memory 84 in advance.

エレクトロポレーション装置における被検細胞の培養の後、容器部６０は、測定装置４０に送られる。その後、光源からの光が容器部６０のウェル６２内に照射される。容器部６０のウェル６２を通過した光は、対物レンズ８７で集められ、その光から撮像部８２は任意に明視野画像を得る。その後、暗箱機構内において、被検細胞に導入されたレポーター蛋白質からの光学的な信号（ここでは、１例としての発光）を、対物レンズ８７を通して、撮像部８２によって撮像する。光源の光照射を止め、被検細胞からの発光が対物レンズ８７で集められ、その光から撮像部８２が発光画像を得る（Ｓ２８）。撮像部８２により得られた任意の明視野画像および発光画像は、システム制御部８０により画像処理されて任意に重ね合わされて（マージされて）表示部８４に表示される。システム制御部８０では、画像の表示部８４への表示と同時または表示と前後して、明視野画像および発光画像と、メモリ８４に格納されたテーブルとに基づいて、被検細胞の細胞特性を判定する。この判定の結果は、マージされた画像と共に表示部８４に示される（Ｓ２９）。表示部８４への各ウェル６２に評価判定結果が表示画像とともにメモリ８４に格納されて一連の処理が終了される（Ｓ３０）。 After culturing the test cells in the electroporation apparatus, the container part 60 is sent to the measuring apparatus 40. Thereafter, light from the light source is irradiated into the well 62 of the container unit 60. The light that has passed through the well 62 of the container unit 60 is collected by the objective lens 87, and the imaging unit 82 arbitrarily obtains a bright field image from the light. Thereafter, in the dark box mechanism, an optical signal (here, light emission as an example) from the reporter protein introduced into the test cell is imaged by the imaging unit 82 through the objective lens 87. Light emission from the light source is stopped, light emission from the subject cell is collected by the objective lens 87, and the imaging unit 82 obtains a light emission image from the light (S28). Arbitrary bright field images and light emission images obtained by the imaging unit 82 are subjected to image processing by the system control unit 80 and arbitrarily superimposed (merged) and displayed on the display unit 84. In the system control unit 80, the cell characteristics of the test cell are determined based on the bright field image and the luminescent image and the table stored in the memory 84 at the same time as or before and after the display of the image on the display unit 84. judge. The result of this determination is displayed on the display unit 84 together with the merged image (S29). The evaluation determination result is stored in the memory 84 together with the display image in each well 62 to the display unit 84, and a series of processing is completed (S30).

ここでは、レポーター蛋白質からの光学的な信号として発光が生じる例を示したが、発光とは異なるレポーター蛋白質が生じる検出な可能な信号についても、撮像部８２を構成する検出装置を交換することにより同様に測定することが可能である。 Here, an example in which light emission occurs as an optical signal from the reporter protein has been shown, but for a detectable signal in which a reporter protein different from the light emission is generated, the detection device constituting the imaging unit 82 can be replaced by replacing the detection device. It is possible to measure similarly.

図４に示されたステップＳ２５及びＳ２６に示される測定モード及びポレーションモードについて図２、図３及び図５を参照して詳細に説明する。 The measurement mode and the poration mode shown in steps S25 and S26 shown in FIG. 4 will be described in detail with reference to FIG. 2, FIG. 3, and FIG.

複数のウェル６２内の、複数の被検体細胞に均一にエレクトロポレーションするには、全てのウェル６２に同一の電荷量が供給されることが要請される。より厳密には、電荷量の密度を全ウェルで一定にし、個々の細胞が受ける電気的影響の大きさを揃えることが要請されている。ところが、被検体細胞を含む細胞懸濁液（試料１８）は、含まれる細胞の数や種類、前工程で使われた処理液がウェル６２に持込まれ量の違いにより細胞懸濁液の電気抵抗がウェルごとに異なっている。従って、全てのウェルに同じ電圧を印加して臨界電界強度（Ｅ＝ｋＶ／ｃｍ）を一定にすると、個々のウェル６２内に流れる電荷量に違いが生じる。（Ｖは、電極間電圧であり、ｃｍは、電極間距離を意味している。）そのため、ウェル毎に個々の細胞が受ける電気的影響の大きさが異なり、エレクトロポレーションの効果に差が生じる。結果として、ウェル６２間で検査結果の比較ができない問題に至っている。 In order to uniformly electroporate a plurality of subject cells in the plurality of wells 62, it is required that the same charge amount be supplied to all the wells 62. More precisely, it is required that the charge density be constant in all wells and that the magnitude of the electrical effect on individual cells be made uniform. However, in the cell suspension (sample 18) containing the subject cells, the electrical resistance of the cell suspension depends on the number and type of cells contained, and the amount of the treatment liquid used in the previous process brought into the well 62. Is different from well to well. Therefore, if the same voltage is applied to all the wells to make the critical electric field strength (E = kV / cm) constant, a difference occurs in the amount of charge flowing in each well 62. (V is the voltage between the electrodes, and cm means the distance between the electrodes.) Therefore, the magnitude of the electrical influence received by each cell differs from well to well, and there is a difference in the effect of electroporation. Arise. As a result, the test results cannot be compared between the wells 62.

発明者は、複数ウェル６２に同一条件でエレクトロポレーションする為には、測定モードにおいて、各ウェル内の細胞懸濁液の電気的パラメータを測定し、この測定モードで測定された条件に基づいてエレクトロポレーションを実行することによってこのような問題を解消できると着想している。この測定モードにおける測定を前提とすれば、ウェル６２毎に個々の細胞が受ける電気的影響の大きさが異なっても、ウェル６２毎に個々の細胞に均一なエレクトロポレーションの効果を与えることができ、結果として、ウェル６２間で検査結果の比較ができるとしている。 In order to electroporate a plurality of wells 62 under the same conditions, the inventor measures the electrical parameters of the cell suspension in each well in the measurement mode, and based on the conditions measured in this measurement mode. The idea is that such problems can be solved by performing electroporation. If measurement in this measurement mode is assumed, even if the magnitude of the electrical influence received by each cell differs for each well 62, it is possible to give a uniform electroporation effect to each cell for each well 62. As a result, the test results can be compared between the wells 62.

エレクトロポレーションでは、長い時間電圧が印加されると、細胞は、細胞死に誘導されることから、微小時間（数十マイクロ秒）で電圧が印加されることが要請される。このときに電極３２、３３間に生ずる電荷量Ｑは、
Ｑ=ＣＶ（１−ｅ^-ｔ／τ）
τ=Ｒ・Ｃ
で表される。ここで、Ｒ及びＣは、それぞれウェル６２内の電極３２、３３間の抵抗及びキャパシタ、τは、時定数、Ｖは、測定モードで電極３２、３３間に印加する電圧、また、ｔは、電圧印加の経過時間である。ここで、抵抗Ｒは、主に電極３２、３３間の細胞懸濁液の抵抗に相当し、キャパシタＣは、電極３２、３３の表面の細胞懸濁液との間の界面に生じる電気２重層の静電容量に相当している。 In electroporation, when a voltage is applied for a long time, the cell is induced to cell death. Therefore, it is required that the voltage be applied in a very short time (tens of microseconds). The amount of charge Q generated between the electrodes 32 and 33 at this time is
Q = CV (1-e- ^{t / τ} )
τ = R ・ C
It is represented by Here, R and C are the resistance and capacitor between the electrodes 32 and 33 in the well 62, τ is the time constant, V is the voltage applied between the electrodes 32 and 33 in the measurement mode, and t is This is the elapsed time of voltage application. Here, the resistance R mainly corresponds to the resistance of the cell suspension between the electrodes 32 and 33, and the capacitor C is an electric double layer generated at the interface between the surface of the electrodes 32 and 33 and the cell suspension. It corresponds to the electrostatic capacity.

前処理で、ウェル６２内の細胞懸濁液の抵抗Ｒ及びキャパシタＣが異なり、ウェル毎に入れられる細胞懸濁液内の細胞の数で、これらのパラメータが変化される。また、被検体が異なれば、被検体の個体差が変化される。同一被検体であっても、サンプルされる個体差（細胞の数）が生じ、また、同一容積のウェル６２であっても細胞懸濁液を入れる量でこれらのパラメータが変化される。 In the pretreatment, the resistance R and the capacitor C of the cell suspension in the well 62 are different, and these parameters are changed depending on the number of cells in the cell suspension put in each well. Further, if the subject is different, the individual difference of the subject is changed. Even in the same subject, individual differences (number of cells) to be sampled occur, and even in the well 62 having the same volume, these parameters are changed by the amount of the cell suspension.

測定モードが開始される（Ｓ３２）と、始めに抵抗Ｒが測定される（Ｓ３３）。測定モードでは、細胞懸濁液内の細胞が細胞死を招かない様な（有意なダメージを与えないような）所定の交流電圧が第１の測定電圧として設定される。一例として、電極３２，３３間の距離が０.３mmに設定されている場合には、２０Ｖ／０．３ｍｍ≒６５Ｖ／ｍｍ以下の範囲に設定される。この範囲は、エレクトロポレーションを生じさせる際の直流インパルス電圧、例えば、２００−３００Ｖの１０〜２０％[１／５〜１／６]に相当し、低電圧２０〜６０Ｖのピークを有する交流電圧が第１の測定電圧として設定される。この抵抗Ｒの測定に際しては、回路制御部９８がスイッチ７３を制御して電源部９０の電源として交流電源７１を選択し、所定の時間（数秒）の間スイッチ７４を閉じて上述した所定電圧をピークとする所定の周波数（例えば、１０の４乗オーダーの周波数に相当する２０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚの周波数）の交流電圧Ｖ１を電極間３２，３３に印加する。この印加時の電極間３２，３３に流れる電流Ｉが電流検出部７５で検出され、測定部９２で抵抗値Ｒ（Ｒ=Ｖ１／Ｉ）が求められる（Ｓ３３）。印加電圧が交流であることから、抵抗値が電流Ｉ及び電圧Ｖ１から算出される。 When the measurement mode is started (S32), the resistance R is first measured (S33). In the measurement mode, a predetermined AC voltage is set as the first measurement voltage so that the cells in the cell suspension do not cause cell death (does not cause significant damage). As an example, when the distance between the electrodes 32 and 33 is set to 0.3 mm, the range is set to 20 V / 0.3 mm≈65 V / mm or less. This range corresponds to a DC impulse voltage when causing electroporation, for example, 10 to 20% [1/5 to 1/6] of 200 to 300 V, and an AC voltage having a peak of a low voltage of 20 to 60 V. Is set as the first measurement voltage. When measuring the resistance R, the circuit control unit 98 controls the switch 73 to select the AC power supply 71 as the power supply of the power supply unit 90, and closes the switch 74 for a predetermined time (several seconds) to apply the predetermined voltage described above. An alternating voltage V1 having a predetermined frequency (for example, a frequency of 20 kHz to 100 kHz corresponding to a frequency of the fourth power of 10) is applied between the electrodes 32 and 33. The current I flowing between the electrodes 32 and 33 at the time of application is detected by the current detector 75, and the resistance value R (R = V1 / I) is obtained by the measuring unit 92 (S33). Since the applied voltage is alternating current, the resistance value is calculated from the current I and the voltage V1.

次に、時定数τが測定される（Ｓ３４）。この時定数τの測定に際しては、回路制御部９８がスイッチ７３を制御して電源部９０の電源として直流電源７２を選択する。そして、所定の時間（数秒）の間スイッチ７４を閉じて第２の測定電圧として所定の直流電圧を電極間３２，３３に印加する。この直流電圧は、同様に細胞懸濁液内の細胞が細胞死を招かない様な（有意なダメージを与えないような）直流電圧（第２測定電圧）に設定される。一例として、電極３２，３３間の距離が０.３mmに設定されている場合には、２０Ｖ／０．３ｍｍ≒６５Ｖ／ｍｍ以下の範囲に第２の電圧が設定される。この第２の電圧は、数百マイクロ秒、１秒の間スイッチ７４が閉じられ、第２の電圧が電極３２，３３間に印加されて電流の変化が測定部９２で測定される。測定部９２では、時間経過に伴う電流変化から時間経過に伴う電圧変化を算出して定常状態に至る時定数τを求めることができる。 Next, the time constant τ is measured (S34). In measuring the time constant τ, the circuit control unit 98 controls the switch 73 to select the DC power source 72 as the power source of the power source unit 90. Then, the switch 74 is closed for a predetermined time (several seconds), and a predetermined DC voltage is applied to the electrodes 32 and 33 as the second measurement voltage. Similarly, this DC voltage is set to a DC voltage (second measurement voltage) so that cells in the cell suspension do not cause cell death (does not cause significant damage). As an example, when the distance between the electrodes 32 and 33 is set to 0.3 mm, the second voltage is set in a range of 20 V / 0.3 mm≈65 V / mm or less. As for this second voltage, the switch 74 is closed for several hundred microseconds for 1 second, the second voltage is applied between the electrodes 32 and 33, and the change in current is measured by the measuring unit 92. The measuring unit 92 can calculate a voltage change with the lapse of time from a current change with the lapse of time and obtain a time constant τ to reach a steady state.

Ｑ=ＣＶ（１−ｅ^-ｔ／τ）
τ=Ｒ・Ｃ
このように、時定数τが判明することから、測定部９２において、ステップＳ３３で測定された抵抗Ｒを利用してキャパシタＣも計算により求めることができる（Ｓ３５）。ウェル６２毎に、求められた抵抗Ｒ、キャパシタＣ、時定数τ、測定時の第１電圧及び第２電圧は、印加条件設定部９６に表形式で格納される。印加条件算出部９４は、抵抗Ｒ、キャパシタＣ、時定数τ等のパラメータから直流インパルス電圧の印加時間ｔ、換言すれば、スイッチ７４の閉成時間ｔをウェル６２毎に算出する。上述した電荷量Ｑの式から明らかなように、直流インパルス電圧の印加時間ｔが算出されることによって電極３２，３３間に与えられる電荷量Ｑがすべてのウェル６２について一定化される。印加条件算出部９４で印加時間ｔ及び電荷量Ｑも、印加条件設定部９６に表形式で格納される。より具体的には、印加条件設定部９６に格納される表には、ウェル番号Ｗ１〜Ｗｎ毎に測定抵抗Ｒ１〜Ｒｎ、測定キャパシタＣ１〜Ｃｎ、測定時定数τ１〜τｎ、直流インパルス電圧の印加時間ｔ１〜ｔｎ、演算された電荷量Ｑ１〜Ｑｎ及び測定時の第１、第２電圧Ｖ１、Ｖ２が記載される。 Q = CV (1-e- ^{t / τ} )
τ = R ・ C
Thus, since the time constant τ is found, the measuring unit 92 can also obtain the capacitor C by calculation using the resistance R measured in step S33 (S35). For each well 62, the obtained resistance R, capacitor C, time constant τ, first voltage and second voltage at the time of measurement are stored in the application condition setting unit 96 in a table format. The application condition calculation unit 94 calculates the DC impulse voltage application time t, in other words, the switch 74 closing time t for each well 62 from parameters such as the resistance R, the capacitor C, and the time constant τ. As is apparent from the above-described equation of the charge amount Q, the charge amount Q applied between the electrodes 32 and 33 is made constant for all the wells 62 by calculating the application time t of the DC impulse voltage. The application condition calculation unit 94 also stores the application time t and the charge amount Q in the application condition setting unit 96 in a table format. More specifically, the table stored in the application condition setting unit 96 includes measurement resistors R1 to Rn, measurement capacitors C1 to Cn, measurement time constants τ1 to τn, and application of DC impulse voltage for each of well numbers W1 to Wn. The times t1 to tn, the calculated charge amounts Q1 to Qn, and the first and second voltages V1 and V2 at the time of measurement are described.

印加時間ｔ１〜ｔｎが演算されて印加条件設定部９６に格納されると、エレクトロポレーションが実行される（Ｓ３６）。システム制御部９７は、スイッチ７４が開成された状態で、直流電源７２にインパルス直流電圧Ｖを設定し、各スイッチ７４の閉成時間（インパルス印加時間）ｔ１〜ｔｎをスイッチ開閉制御部９７に設定してエレクトロポレーションを開始する。各スイッチ７４が印加時間ｔ１〜ｔｎで閉成されることから、インパルス電圧が各ウェル６２内の電極３２，３３に印加され、所望の電荷量Ｑ１〜Ｑｎがウェル６２毎に供給され、均一なエレクトロポレーションが実行される。このエレクトロポレーションの実行後に、処理が終了される（Ｓ３７）。 When the application times t1 to tn are calculated and stored in the application condition setting unit 96, electroporation is executed (S36). The system control unit 97 sets the impulse DC voltage V to the DC power source 72 in a state where the switch 74 is opened, and sets the closing time (impulse application time) t1 to tn of each switch 74 to the switch opening / closing control unit 97. Then start electroporation. Since each switch 74 is closed at the application time t1 to tn, an impulse voltage is applied to the electrodes 32 and 33 in each well 62, and a desired amount of charge Q1 to Qn is supplied to each well 62. Electroporation is performed. After the electroporation is executed, the process is terminated (S37).

インパルス直流電圧Ｖは、一例として（１５０Ｖ〜２００Ｖ）／０．３ｍｍ≒（５００Ｖ〜６５０Ｖ）／ｍｍ以下の範囲内でサンプル細胞に応じて設定される。印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎは、５０マイクロ秒以下に設定される。この印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎは、好ましくは、より小さい範囲に設定され、印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎが小さければ、小さい程、細胞死を阻止することができる。 As an example, the impulse DC voltage V is set in accordance with the sample cell within a range of (150 V to 200 V) /0.3 mm≈ (500 V to 650 V) / mm or less. The application time (impulse time) t1 to tn is set to 50 microseconds or less. The application time (impulse time) t1 to tn is preferably set to a smaller range, and the smaller the application time (impulse time) t1 to tn, the more the cell death can be prevented.

図３に示される回路においては、印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎが制御されるエレクトロポレーション（遺伝子導入）回路部７０の構成を説明しているが、印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎに代えて印加電圧（インパルス電圧）Ｖ１〜Ｖｎが可変されるように構成されても良い。図６を参照して印加電圧（インパルス電圧）Ｖ１〜Ｖｎが可変される他の実施の形態に係るエレクトロポレーション回路部７０の回路構成を説明する。図６において、図４に示したと同一符号は、同一部分或いは同一箇所を示すものとしてその説明を省略する。 In the circuit shown in FIG. 3, the configuration of the electroporation (gene introduction) circuit unit 70 in which the application time (impulse time) t1 to tn is controlled is described, but the application time (impulse time) t1 to tn. Instead of this, the applied voltages (impulse voltages) V1 to Vn may be varied. A circuit configuration of an electroporation circuit unit 70 according to another embodiment in which applied voltages (impulse voltages) V1 to Vn are variable will be described with reference to FIG. In FIG. 6, the same reference numerals as those shown in FIG. 4 denote the same parts or the same parts, and the description thereof is omitted.

印加電圧（インパルス電圧）Ｖ１〜Ｖｎを可変する可変印加電圧源（可変インパルス電圧源）は、個別スイッチ７４で抵抗ｒ０〜ｒｎを選択する電圧可変部７８が電源部９０に接続されて構成される。抵抗ｒ０〜ｒｎは、夫々抵抗値が異なり、共通接続されて電流検出部７５に接続されている。個別スイッチ７４で抵抗ｒ０〜ｒｎが選択されると、抵抗ｒｎの選択に基づいて直流インパルス電圧Ｖの電圧値が選択される。測定モード時においては、最も抵抗値の小さな抵抗ｒ０が選択されて測定系における抵抗損失が最小限に留められる。そして、図５に示すステップＳ３２〜Ｓ３５が実施されてウェル番号Ｗ１〜Ｗｎ毎の測定抵抗Ｒ１〜Ｒｎ、測定キャパシタＣ１〜Ｃｎ、測定時定数τ１〜τｎ等のパラメータで印加条件が求められる。ポレーションモード時においては、全てのウェル６２に同一の電荷量を供給すべく、求められた印加条件設定部９６に格納された表が参照されて一定の印加時間Ｔ０を基準とした各ウェル６２の電極３２，３３間に与えられるべき印加電圧ｖ０〜ｖｎが算出される。スイッチ開閉制御部９６は、各ウェル６２内に印加すべき印加電圧ｖ０〜ｖｎに応じて抵抗ｒ０〜ｒｎのいずれかを選定し、選定した抵抗ｒ０〜ｒｎにスイッチ７４が接続されるように制御してスイッチ７４を一定時間Ｔ０の間、閉成する。その結果、直流インパルス電圧Ｖｎの選択によってウェル６２毎の電荷量Ｑの均等化を図ることができる。 A variable applied voltage source (variable impulse voltage source) that varies the applied voltages (impulse voltages) V1 to Vn is configured by connecting a voltage variable section 78 that selects resistors r0 to rn by an individual switch 74 to a power supply section 90. . The resistors r0 to rn have different resistance values, and are connected in common and connected to the current detection unit 75. When the resistors r0 to rn are selected by the individual switch 74, the voltage value of the DC impulse voltage V is selected based on the selection of the resistor rn. In the measurement mode, the resistance r0 having the smallest resistance value is selected to minimize the resistance loss in the measurement system. Then, steps S32 to S35 shown in FIG. 5 are performed, and the application conditions are determined by parameters such as measurement resistors R1 to Rn, measurement capacitors C1 to Cn, measurement time constants τ1 to τn for each of the well numbers W1 to Wn. In the poration mode, each well 62 based on a certain application time T0 is referred to by referring to the table stored in the obtained application condition setting unit 96 in order to supply the same charge amount to all the wells 62. Applied voltages v0 to vn to be applied between the electrodes 32 and 33 are calculated. The switch opening / closing control unit 96 selects one of the resistors r0 to rn according to the applied voltages v0 to vn to be applied to each well 62, and controls the switch 74 to be connected to the selected resistors r0 to rn. Then, the switch 74 is closed for a predetermined time T0. As a result, the charge amount Q for each well 62 can be equalized by selecting the DC impulse voltage Vn.

尚、ウェル毎に直流インパルス電圧Ｖｎを選択することに加えて図４を参照する実施例で説明した印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎを選択するようにしても良い。即ち、印加時間（インパルス時間）ｔ１〜ｔｎ及び抵抗ｒ０〜ｒｎの組み合わせによってウェル６２毎の電荷量Ｑの均等化を図るようにしても良い。 In addition to selecting the DC impulse voltage Vn for each well, the application time (impulse time) t1 to tn described in the embodiment with reference to FIG. 4 may be selected. That is, the charge amount Q for each well 62 may be equalized by a combination of application time (impulse time) t1 to tn and resistors r0 to rn.

上記実施形態では、被検細胞の培養をエレクトロポレーション装置が行う例を示したが、被検細胞の培養は、測定装置４０において行っても良い。その場合、システム１０が更に細胞培養を可能にする部材を備えれば良く、或いは、エレクトロポレーション装置と測定装置４０と両方において、被検細胞が培養されても良い。 In the above embodiment, an example in which the electroporation apparatus performs the culture of the test cell has been described. However, the culture of the test cell may be performed in the measurement apparatus 40. In that case, the system 10 may further include a member that enables cell culture, or the test cells may be cultured in both the electroporation apparatus and the measurement apparatus 40.

また、容器部６０のウェル６２へのレポーターベクターの添加は、容器部６０のウェル６２がエレクトロポレーション装置の所定の位置に送られる以前の何れかの時期に行われても良い。その場合、システム１０は、レポーターベクター添加機構をエレクトロポレーション装置よりも上流の所望の位置に更に備えれば良い。 In addition, the reporter vector may be added to the well 62 of the container unit 60 at any time before the well 62 of the container unit 60 is sent to a predetermined position of the electroporation apparatus. In that case, the system 10 may further include a reporter vector addition mechanism at a desired position upstream of the electroporation apparatus.

上述したエレクトロポレーション（遺伝子導入）装置及びエレクトロポレーション（遺伝子導入）方法によれば、複数のウェルに格納された細胞懸濁液に電圧インパルスを印加してウェル毎に定まる電荷量を注入し、細胞外液中の分子をその細胞懸濁液内の細胞に効率的に導入させることができる。結果として、複数のウェルに対して、同じように電場をかけることができ、それにより、複数のウェルの被検体細胞のエレクトロポレーション条件が均一化でき、正確な診断ができる。また、このような構成のエレクトロポレーション装置を具備する被検細胞の細胞特性を評価するシステムにあっては、より高い精度で効率的に被検細胞の細胞特性を評価することができる。また、検査をスループットで行うことが可能であるので、簡便に検査を行うことが可能であり、試料の取り違えやコンタミネーションを防ぐことが可能である。 According to the electroporation (gene introduction) apparatus and the electroporation (gene introduction) method described above, a voltage impulse is applied to a cell suspension stored in a plurality of wells to inject a charge amount determined for each well. The molecules in the extracellular fluid can be efficiently introduced into the cells in the cell suspension. As a result, the electric field can be applied to the plurality of wells in the same manner, whereby the electroporation conditions of the subject cells in the plurality of wells can be made uniform and accurate diagnosis can be performed. Further, in the system for evaluating the cell characteristics of the test cell having the electroporation apparatus having such a configuration, the cell characteristics of the test cell can be efficiently evaluated with higher accuracy. In addition, since inspection can be performed with a throughput, it is possible to easily perform inspection, and it is possible to prevent sample mix-up and contamination.

１０…細胞特性評価システム、１２…開閉制御部、１８…試料、２０…細胞分離装置、２２…分離器、２４…受容器、２６…処理器、２８は分離部、３０…エレクトロポレーション（遺伝子導入）装置、３２，３３…電極、３４…プローブヘッド、４０…測定装置、５０…ステージ、５１…矢印、５４…ステージ移動機構、６０…容器部、６２…ウェル、７０…エレクトロポレーション回路部、７１…交流電源、７２…直流電源、７４…スイッチ、７５…電流検出部、７８…電圧可変部７８、
８０…システム制御部、８２…撮像部、８６…表示部、９０…電源部、９２…測定部、９４…印加条件算出部、９６…印加条件記憶部、９７…スイッチ開閉制御部 DESCRIPTION OF SYMBOLS 10 ... Cell characteristic evaluation system, 12 ... Opening / closing control part, 18 ... Sample, 20 ... Cell separation device, 22 ... Separator, 24 ... Receptor, 26 ... Processor, 28 is a separation part, 30 ... Electroporation (gene) Introduction) Device, 32, 33 ... Electrode, 34 ... Probe head, 40 ... Measuring device, 50 ... Stage, 51 ... Arrow, 54 ... Stage moving mechanism, 60 ... Container part, 62 ... Well, 70 ... Electroporation circuit part 71 ... AC power source, 72 ... DC power source, 74 ... switch, 75 ... current detection unit, 78 ... voltage variable unit 78,
DESCRIPTION OF SYMBOLS 80 ... System control part, 82 ... Imaging part, 86 ... Display part, 90 ... Power supply part, 92 ... Measurement part, 94 ... Application condition calculation part, 96 ... Application condition memory | storage part, 97 ... Switch opening / closing control part

Claims

A plurality of wells containing a cell suspension containing a large number of cells and the introduced substance;
A plurality of electrode portions provided corresponding to the wells, each of the electrode portions including a plurality of electrodes supported so as to be immersed in the cell suspension; and
A power supply for generating a voltage for measurement and an impulse voltage for causing electroporation in the cells in the well;
In the measurement mode, the measurement voltage is applied to the electrode of the electrode unit from the power supply unit to measure an electrical parameter related to the cell suspension in the well corresponding to the electrode unit, and supply from the electrical parameter A calculation unit for calculating the amount of charge to be
In the electroporation mode, based on the amount of charge calculated by the calculation unit, an impulse voltage application unit that applies an impulse voltage to the electrodes of each electrode unit for a predetermined application time;
An electroporation apparatus comprising:

The measurement voltage includes a measurement AC voltage and a measurement DC voltage that do not induce cell death in the cells,
The calculation unit calculates the resistance of the cell suspension in the well with the measurement AC voltage, measures the time constant of the cell suspension in the well with the measurement DC voltage, and the time constant and The electroporation apparatus according to claim 1, wherein the charge amount is calculated based on a resistance.

The electroporation apparatus according to claim 2, further comprising a storage unit that stores the resistance, the time constant, the capacitor, and the charge amount to be supplied with respect to the cell suspension for each well.

The impulse voltage application unit is connected between the power supply unit and the electrode, and controls the impulse voltage application time by opening and closing the switch corresponding to the electrode unit and the charge amount to be supplied. The electroporation apparatus according to claim 1, further comprising a portion.

The impulse voltage application unit is connected between the power source unit and the electrode, controls the switch corresponding to the electrode unit, and controls the opening and closing of the switch, and sets the voltage value of the impulse voltage according to the amount of charge to be supplied. The electroporation apparatus according to claim 1, further comprising a portion.

A cell suspension containing cells and an introduced substance is stored in each of a plurality of wells,
A plurality of electrode portions provided corresponding to the wells, wherein a plurality of electrodes supported by each of the electrode portions are immersed in the cell suspension;
In the measurement mode, a measurement voltage is applied to the electrode of the electrode unit to measure an electrical parameter related to the cell suspension in the well corresponding to the electrode unit, and the amount of charge to be supplied from the electrical parameter To calculate
In the poration mode, based on the calculated charge amount, an impulse voltage that causes electroporation to occur in the cells in the well is applied to the electrodes of the electrode portions for a predetermined application time.
An electroporation method comprising:

The measurement voltage includes a measurement AC voltage and a measurement DC voltage having a peak that does not induce cell death in the cell,
The charge amount is calculated by calculating the resistance of the cell suspension in the well with the measurement AC voltage, and measuring the time constant of the cell suspension in the well with the measurement DC voltage. The electroporation method according to claim 6, wherein a capacitor is calculated based on a constant and a resistance, and the charge amount is calculated.

The electroporation method according to claim 7, wherein the resistance, the time constant, the capacitor, and the charge amount to be supplied are stored for the cell suspension for each well.

7. The electroporation method according to claim 6, wherein the application time of the impulse voltage is controlled by opening and closing a switch connected to the electrode corresponding to the electrode portion in accordance with the charge amount to be supplied.

The electroporation apparatus according to claim 6, wherein the switch connected to the electrode corresponding to the electrode portion is controlled to be opened and closed, and an impulse voltage set according to the amount of charge to be supplied is applied.