JP2018007647A - 哺乳動物生細胞を電磁的に刺激することにより生成する生体分子 - Google Patents
哺乳動物生細胞を電磁的に刺激することにより生成する生体分子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2018007647A JP2018007647A JP2016140840A JP2016140840A JP2018007647A JP 2018007647 A JP2018007647 A JP 2018007647A JP 2016140840 A JP2016140840 A JP 2016140840A JP 2016140840 A JP2016140840 A JP 2016140840A JP 2018007647 A JP2018007647 A JP 2018007647A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- culture
- mammalian
- csf
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【課題】電磁場を用い、哺乳動物細胞を電磁的に刺激することにより天然哺乳動物生体分子を生成する方法を提供する。
【解決手段】分子IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、G−CSF、GM−CSF、RANTES、HGF、LIF、EPO、および、セクレトームの各分子を、ヒト末梢血で見られる濃度の10倍超の濃度で含む生体分子を生成する方法であって、水平軸の周りを回転し、前記細胞を培養基中で浮遊させ続ける生物反応器内の、培養基付き培養チャンバに、ヒト成体幹細胞を置くステップと、前記培養物を、5〜100Hzの可変デューティ・サイクルを有する方形波と35〜200ガウスの磁場からなる時間変動電磁場にさらすステップを含む、方法。哺乳動物細胞は、時間変動電磁力にさらしたチャンバ内で成長させることが可能である。生体分子は細胞から単離することが可能である。
【選択図】なし
【解決手段】分子IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、G−CSF、GM−CSF、RANTES、HGF、LIF、EPO、および、セクレトームの各分子を、ヒト末梢血で見られる濃度の10倍超の濃度で含む生体分子を生成する方法であって、水平軸の周りを回転し、前記細胞を培養基中で浮遊させ続ける生物反応器内の、培養基付き培養チャンバに、ヒト成体幹細胞を置くステップと、前記培養物を、5〜100Hzの可変デューティ・サイクルを有する方形波と35〜200ガウスの磁場からなる時間変動電磁場にさらすステップを含む、方法。哺乳動物細胞は、時間変動電磁力にさらしたチャンバ内で成長させることが可能である。生体分子は細胞から単離することが可能である。
【選択図】なし
Description
本発明は概して、生体分子の生成分野に関する。特に本発明は、電磁場を用いて哺乳動物細胞を電磁的に刺激することにより、生体分子を生成するシステムおよびプロセスに関する。
顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、インターロイキン2〜32、ヒト成長因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、エリスロポイエチン、キナーゼ、サイトカイン、インターフェロン、組織プラスミノーゲン活性化因子、α1−アンチトリプシン、血液凝固第VIII因子、上皮成長因子、および卵胞刺激ホルモンなどの生体分子は、研究および治療的処置で広く用いられている。研究または治療的使用のためにこれらの分子を合成するのは難しいか、またはコストがかかっていた。例えば、G−CSF、内部ジスルフィド結合を含む25kDの糖タンパク質は、好中球顆粒球前駆細胞の生存、増殖、分化、および機能を誘発し、成熟好中球を機能的に活性化する。コロニー刺激因子ファミリーのうちG−CSFは、骨髄性白血病細胞株の顆粒球およびマクロファージに対する最も強力な末端分化誘発剤である。それは顆粒球の成長および成熟を刺激するタンパク質である。それは化学療法後の白血球の回復を促すために用いられる。臨床用途における遺伝子組み換え型ヒトG−CSFの2つの形態(フィルグラスチムおよびレノグラスチム)は、好中球顆粒球生成の強力な刺激剤であり、一部の好中球減少状態の感染性合併症を防ぐ効力を示した。これらを用いて、骨髄抑制治療から好中球の回復を加速させることが可能である。G−CSFはまた、発熱性好中球減少症の発生率を減少させることにより癌化学療法の死亡率を減らし、骨髄移植に支持される大量化学療法の死亡率を減らし、ひどい慢性好中球減少症の患者における感染症の発生率と継続期間を短縮する。
マウス顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)は、1983年にオーストラリアで最初に確認および精製され、日本およびアメリカ合衆国のグループが1986年にヒト形態をクローン化した。天然ヒト糖タンパク質は、174アミノ酸および177アミノ酸という2つの形態で存在する。より多く存在しより活性な174アミノ酸形態が、遺伝子組み換えDNA技術による医薬製品開発に用いられてきた。
大腸菌発現系で合成された遺伝子組み換えヒトG−CSFをフィルグラスチムと呼ぶ。フィスグラスチムの構造は天然の糖タンパク質とはわずかに異なる。多くの公開研究がフィルグラスチムを利用し、それはオーストラリアで市販が認められた最初のG−CSF形態だった。
レノグラスチムという遺伝子組み換えヒトG−CSFのもうひとつの形態は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で合成される。これは哺乳動物細胞発現系であるため、レノグラスチムは174アミノ酸天然ヒトG−CSFと区別がつかない。フィルグラスチムとレノグラスチムの違いによる臨床的または治療的な結果はまだ明らかになっておらず、公的な比較研究はない。
G−CSF(フィルグラスチム)は、非骨髄性悪性腫瘍のために骨髄抑制化学療法を受けている患者の、発熱性好中球減少症の防止に用いられる。それは、化学療法後の好中球減少症の継続期間と重症度を低減する。
G−CSF(レノグラスチム)はまた、確立された細胞毒性化学療法に関連する感染症の発生率を低減するために用いることが認められている。
それはヒトの体内で天然に生成されるが、ヒトG−CSFの単離は商業的に達成されていない。したがって、G−CSFの生成は、大腸菌発現系で合成されるG−CSFまたはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で合成される遺伝子組み換えヒトG−CSFを生成する、遺伝子組み換えDNA技術などの合成手段によってのみ商業的に達成されている。これらの「合成」プロセスは両方とも生成物の作成に費用がかかり、そのためすでに過重な負担がかかっている医療制度にさらなる負担を課している。
ヒトおよび実験動物の天然生体分子を増大するための技術およびそれに由来する治療効果について広範囲にわたる公開物があり、その多くはMillaらの著作Current Drug Metabolismに見られる。しかしながら、手ごろな価格のG−CSFを商業的量で獲得することに関連する問題と同様に、手ごろな価格で多量のGM−CSF、サイトカイン、インターロイキン、および他の所望の天然哺乳動物生体分子を獲得することは達成されていない。
天然哺乳動物生体分子を生成する既存のプロセスを用いることの短所には、手ごろな価格およびタイムリーかつ効率的なやり方で商業的量の分子を獲得するという課題が含まれる。
本発明は先行プロセスおよびシステムの短所を克服し、商業的量の哺乳動物生体分子を生成する効率的なシステムを提供する。
本発明は、担体培地の哺乳動物細胞から天然哺乳動物生体分子を生成するプロセスに関する。本発明のさらなる態様には、哺乳動物細胞をチャンバに導入し、細胞を成長させ、天然にグリコシル化された哺乳動物生体分子の量を増加させるのに十分なスピードおよび時間でチャンバを回転させることを含む。細胞は好適には電磁場にさらし、該電磁場は、本発明の好適な実施形態では時間変動電磁場(TVEMF)とする。
本発明の別の態様は、本発明に記載のプロセスに従い哺乳動物生細胞を電磁的に刺激することにより生成した天然哺乳動物生体分子を、1つまたは複数含む組成物を提供することである。
本発明のさらに別の態様は、本発明の実施形態に従って生成したタンパク質、ポリペプチド、糖タンパク質、サイトカイン、翻訳後タンパク質、翻訳後ペプチド、および翻訳後ポリペプチドなどの天然哺乳動物生体分子を、1つまたは複数含む組成物を提供する。特に本発明は、IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、G−CSF、GM−CSF、RANTES、HGF、LIF、およびEPOを、比較的短い期間(10日以下)で、ヒト末梢血よりはるかに高い濃度(10倍超の濃度)で大量に生成することに及ぶ。本発明の別の特異な長所は、先行発明では生成されなかったセクレトームを生成することである。
本発明のさらに他の態様は、これらの生体分子を1つまたは複数含む組成物と、これらの分子を治療目的で用いることに関する。本発明のさらに別の目的は、後の研究または治療的使用のため個々の構成要素に分けることが可能な天然哺乳動物生体分子の混合物を生成することである。
本発明の他の態様、特徴、および長所は、開示を目的に提供される本発明の目下好適な実施形態に関する以下の記載により明らかになろう。
簡潔に言うと、本発明は、分子IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、G−CSF、GM−CSF、RANTES、HGF、LIF、EPO、および、セクレトームの各分子を、ヒト末梢血で見られる濃度の10倍超の濃度で含む天然生体分子を生成する方法を含み、該方法は、ヒト成体幹細胞を培養基付き培養チャンバに置くステップと、該培養物を、5〜100Hzの可変デューティ・サイクルを有する方形波と35〜200ガウスの磁場からなる時間変動電磁場にさらすステップを含む。
以下の定義は、本発明の文脈における定義された語の記載と理解を助けることを意図する。該定義はこれらの用語を、本出願全体の記載に満たないものであると限定するものではない。さらに、TVEMFに関連していくつかの定義が含まれるが、これに関する定義は全て互いに相補的であると考えるべきであり、互いに対立すると解釈するべきではない。
本出願全体で用いる場合、「哺乳動物細胞」または「哺乳動物細胞組成物」という用語は、本発明の実施形態に従って用いるまたは成長させる哺乳動物細胞を意味する。ヒト成体幹細胞は臍帯血細胞などの誕生後細胞を意味し、幹細胞バンクから容易に入手可能である。それらはまた、血液を採取し遠心分離機で分離することにより、(血液サンプルを採取するように採取した)末梢血から得ることが可能である。
本出願全体で用いる場合、「哺乳動物細胞混合物」、「哺乳動物細胞培養物」、「哺乳動物担体培地」、および他の同様の用語は、哺乳動物細胞と細胞成長用培地といった細胞の拡大を可能にする物質との混合物を意味する。哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞と、細胞培養基または細胞担体培地などの物質をただ混ぜた混合物中に存在することができる。好適には、哺乳動物細胞混合物は、哺乳動物細胞とダルベッコ培地(DMEM)を含む。好適には、哺乳動物細胞混合物の少なくとも半分は、DMEMなどの細胞培養基である。
「許容可能な担体」という用語は、概して、哺乳動物細胞が、拡大前、拡大中または拡大後であろうとなかろうと生存可能である、つまり、細胞に対して有害でない任意の物質を意味する。このような担体は当技術分野で周知であり、本出願全体で斯かる目的で記載される物質など、様々な物質を含み得る。
成体幹細胞は、(骨髄、臍帯血細胞、血管周囲細胞などの)血液細胞、ホウォートンゼリー、または割礼包皮といった非常に若い組織とすることが可能である。血液細胞は、血液サンプルを提供する血管から取り出す。それらは概して、その後、遠心分離して中間層または「バフィーコート」を用いることにより分離し、幹細胞が豊富な混合物にする。
本出願全体で用いる場合、「TVEMF」という用語は時間変動電磁力を意味する。
本出願全体で用いる場合、「TVRMF−拡大細胞」という用語は、TVEMF−拡大というプロセスにかけた細胞を意味する。
本出願全体で用いる場合、「有害物質」という用語または関連用語は、哺乳動物細胞つまり患者に有害である物質を意味する。特に、有害物質という用語には、(底に沈殿した)死滅細胞および死滅マクロファージを含む。他の有害物質は既知であり、これらの物質は既知の細胞混合物から除去される。
本出願全体で用いる上記のように定義した用語または他の用語に言及する他の記述は、上記の定義により限定されるのではなく、該定義に貢献し得るものである。本発明の種々の態様に関する情報は本出願全体で提供され、それが含まれる部分のみに限定されることなく、本発明全体の理解に貢献する。
天然哺乳動物生体分子を生成する方法を記載する。哺乳動物細胞と担体培地を、細胞成長を維持可能なチャンバに導入し、該チャンバを、約5〜約100Hzかつ約35〜約200ガウスのTVEMFにかける。これらのパラメータは好適である。哺乳動物細胞および担体培地を、35〜39℃、3%〜7%CO2という細胞成長条件下で成長チャンバに維持する。チャンバは任意の種類の容器とすることが可能であり、TVEMFは、細胞を含む上清液または担体培地に細胞数が著しく増えるまで、および/または、天然哺乳動物生体分子が担体培地または上清液に採取可能な量(少なくとも50ピコグラムのIL2)で存在するまで、適用する。天然哺乳動物生体分子の混合物を含む上清または担体培地をチャンバから取り出し、細胞を溶解し、その後天然哺乳動物生体分子を天然哺乳動物生体分子の個別分子要素または混合物に分離することが可能である。天然哺乳動物生体分子は上清または担体培地から直接的に単離することが可能である場合もあれば、天然哺乳動物生体分子を得るために細胞を溶解することが必要な場合もある。これらの分子要素は、治療目的または研究用に用いることが可能である。
本発明の態様に従い、哺乳動物細胞を細胞培養チャンバに置く。細胞培養チャンバを、時間変動電磁力が時間変動電磁力源によりチャンバ内に生じる期間中維持する。細胞成長が天然哺乳動物生体分子量の増加をもたらした後、細胞および天然哺乳動物生体分子をチャンバから取り出す。
本発明のプロセスでは、細胞を、拡大前の細胞と実質的に同じ三次元形状を維持または有し(分子は平坦化も伸張もされておらず、体内と同じ形状である)、通常同一の細胞間支持(細胞間の化学、ホルモン、及び神経に関する相互作用が不変である)および細胞間形状(細胞は互いに体内と同じ関係のままであり、容器の壁から飛び出すことも互いの中に飛び込むこともない)を維持または有するようなやり方で拡大する。多くの場合、これは、細胞を例えば水平軸の周りを回転する生物反応器内に保つことにより、細胞拡大時に該細胞を培養物または担体培地中に浮遊させ続け、該細胞が固体表面に接触しないようにすることにより達成することができる。
本発明の一態様では、天然哺乳動物生体分子の混合物を、哺乳動物生細胞を電磁的に刺激することにより生成する。
簡潔に言うと、回転TVEMF−生物反応器は、テキサス州ヒューストン、Synthecon社により販売されている機種である。該生物反応器の操作説明書は、同社ウェブサイトにある。
最適には、ユーザは、哺乳動物細胞の三次元形状ならびにその細胞間支持および細胞間形状を維持するように、最小の壁衝突頻度および強度を促す回転速度を好適に選択することが推奨される。本発明の好適なスピードは、5〜120RPM、好適には10〜40RPM、さらに好適には10〜30RPMである。細胞は、ペトリ皿またはフラスコで培養することもできる、TVEMFは、米国特許第8,376,925号明細書、同第8,029,432号明細書、同第8,137,258号明細書、および同第8,137,259号明細書に記載されている装置により生成することが可能である。
哺乳動物細胞混合物は、好適には透明な培養チャンバを通して好適には視覚的に評価し、回転スピードダイアルを用いて手動で調整することができる。哺乳動物細胞混合物の評価および調整はセンサ(例えば、レーザ)により自動化することもでき、該センサによりTVEMF−チャンバ内の哺乳動物細胞の位置を監視する。
さらに、操作中、本発明は、電磁発生装置の電源を入れ、(フーリエ曲線に従う)方形波出力が哺乳動物細胞混合物を含むチャンバにおいて、35ガウス〜300ガウスの範囲で望ましい電磁場を発生するように調整することを考える。
細胞がTVEMFチャンバにある時間中、それは、好適には、栄養素と新しい培地(好適にはDMEMおよび5%ヒト血清アルブミン)を与えられ、ホルモン、サイトカイン、および/または成長因子(好適にはG−CSF)にさらされ;有害物質は取り除かれる。TVEMF−チャンバの細胞から取り除かれた有害物質には、有害な粒状物の死細胞、ならびに、顆粒球およびマクロファージの有害物質が含まれる。また、例えば1日に1回、または2日に1回、手作業で(例えば、シリンジで)、新しい培地と、好適には、上記のような栄養素と成長因子といった他の望ましい添加物を生物反応器に入れ、細胞廃物および毒素を含む古い培地を抜き取る。
細胞が、好適には、10日以下という十分な時間で拡大する(体積当たりの数、つまり密度を増大する)ように、細胞のTVEMF−拡大を制御する。上記および本出願全体で示すように、本発明のTVEMF−拡大哺乳動物細胞は、天然発生の非TVEMF−拡大哺乳動物細胞と実質的に同じ三次元形状ならびに細胞間支持および細胞間形状を有する。好適には、TVEMF−拡大をTVEMF−生物反応器において、約26℃〜約41℃の温度で、より好適には約37±2℃の温度で3日間行う。
本発明で考察するように時間変動電磁力にかける回転生物反応器において、本発明の範囲から離れることなく、様々な変更を行うことが可能であることから、上記記載に含まれる全事項は限定ではなく例示と解釈されたい。
本発明で用いる哺乳動物細胞は、好適にはヒトから直接的または非直接的に収集することができる。あるいは、該哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞の保管所もしくは他の保存場所、または、商業的供給源もしくは他の供給源から得ることができる。細胞は溜めることができる。哺乳動物細胞はネガティブ分離技術により単離することができ、該技術には沈殿および遠心分離などがあるが、これらに限定されるわけではない。多くのネガティブ分離技術が当技術分野では周知である。しかしながら、ポジティブ分離技術も用いることができる。哺乳動物細胞を単離する方法は当技術分野で既知であり、該方法は、所望の哺乳動物細胞を溶解しない、あるいは、不可逆的に傷つけない限り、用いることができる。例えば、特定の哺乳動物細胞に対して選択性を持つアフィニティ法を用いることができる。
収集した哺乳動物細胞は、TVEMF−拡大を行うため、TVEMF−チャンバに置かなければならない。上記のとおり、「哺乳動物細胞混合物」という用語には、哺乳動物細胞と細胞成長用媒体など細胞拡大を可能にする物質との混合物が含まれ、これはTVEMF−チャンバに置く。細胞培養基、つまり細胞の成長および拡大を可能にする培地は当技術分野で周知である。好適には、細胞の成長を可能にする物質は細胞培養基、より好適にはダルベッコ培地である。細胞培地の構成要素は当然、細胞を殺すことも傷つけることもしてはならない。他の構成要素も、TVEMF−拡大前またはその間に哺乳動物細胞混合物に加えることができる。例えば、哺乳動物細胞は、ダルベッコ培地付き生物反応器に置き、さらに、5%(または、他の所望量、例えば約1%〜10%の範囲)のヒト血清アルブミンを補うことができる。哺乳動物細胞混合物への他の添加物も、生物反応器に置く前に、生物反応器の外側または内側で哺乳動物細胞に加えることができ、該添加物には成長因子、銅キレート剤、サイトカイン、ホルモン、およびTVEMF細胞成長を高めることができる他の物質が含まれるが、これらに限定されるわけではない。好適には、用いる哺乳動物細胞の体積は約10mL〜約100mLであり、より好適には50mL〜約100mLを約25mL〜約100mLのダルベッコ培地(DMEM)と混ぜ、5%のヒト血清アルブミンを補い、その結果哺乳動物細胞混合物の総体積は生物反応器に置いた際に約75〜約200mLとなる。
「TVEMFチャンバに置いた」という用語は、哺乳動物細胞混合物を限定するものではなく、培養チャンバの完全に外側で作り、その後培養チャンバの内側に置くことができる。また、哺乳動物細胞混合物を生物反応器の内側で完全に混ぜることもできる。例えば、哺乳動物細胞混合物をダルベッコ培地付きチャンバに置き、5%のヒト血清アルブミンを、予めチャンバに置いておくか、生物反応器に同時に加えるか、または、哺乳動物細胞を生物反応器に置いた後に加えるかの何れかにより補う。
任意で、システムおよびプロセスを、組織培養プロセス(T型フラスコ、ローラーボトルなど)と組み合わせて利用し、天然哺乳動物生体分子の成長を生じさせることができる。この環境では、成長促進遺伝子をレギュレーションし、成長阻害遺伝子をダウンレギュレーションすることが可能である。効果は、プロセス終了後もある期間にわたって持続することが知られている。本記載の混合物は上清液中の混合物であり、これは、細胞培養物と担体培地を一緒に混ぜ、それを、上清液が採取可能な量の天然哺乳動物生体分子を有するまで電磁力にかけることにより生成する。上清液のサンプルを取り出し、分析して、上清液の構成要素を特定する。サンプルは、例えば、研究室多重分析プロファイリング技術を用いて分析することが可能である。このような多重分析プロファイリング技術の例には、テキサス州オースティン、LUMINEX社のシステム(LabMAP(商標))があり、これは当業者には周知であり、異なるタンパク質、ペプチド、およびDNA分子を一斉に定量分析することが可能である。多重イムノブロット法および抗体またはプローブを利用する技法を用いて、タンパク質、ペプチド、DNA、およびRNAという上清の構成要素を特定することが可能である。上清における所望の構成要素の存在を確かめた後、タンパク質、ペプチド、DNA、またはRNAを、フローサイトメーターまたは高圧液体クロマトグラフィなどの方法を用いて、上清から分離することが可能である。刺激する哺乳動物生体物質は、好適には、前駆細胞または神経細胞などのヒト細胞である。
細胞の溶解が必要な場合がある。所望のタンパク質が細胞外に放出されない場合、例えばホモジナイザーもしくはボールミルによる直接機械的記述といった機械的方法、または、超音波処理の使用などの、種々の方法を用いることができる。これらは全て当業者に周知である。あるいは、凍結/融解サイクルの使用といった技法、溶剤もしくは洗浄剤を用いた化学的手段、または、酵素を用いた生物学的手段により、細胞内タンパク質を細胞から取り出すことができる。所望のタンパク質が細胞からそれ自身の作用により放出されるか、いくつかの外的手段が必要かどうかに関わらず、所望のタンパク質を結果として生じる混合物から取り出すことが必要である。これは、沈殿後のゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィといった既存の手段により達成可能である。これらの技法は全て当業者にとって既知である。
本発明の態様または実施形態に従って生成した、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、サイトカイン、翻訳後タンパク質、翻訳後ペプチド、および翻訳後ポリペプチドなどの天然哺乳動物生体分子を1つまたは複数含む組成物を調製することが可能である。天然哺乳動物生体分子は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、サイトカイン、翻訳後タンパク質、翻訳後ペプチド、および翻訳後ポリペプチドから選択し、これには具体的にG−CSF、GM−CSF、HGF、LIF、サイトカイン、EGF、ならびに、IL−2、IL−6、IL−8、およびIL−10などのインターロイキンが含まれるが、これらに限定されるわけではない。加えて、セクレトームを生成する。
本発明の組成物は、医薬的に許容される担体;血漿、血、アルブミン、細胞培養基、成長因子、銅キレート剤、ホルモン、バッファ、または凍結保存剤を含むことができる。「医薬的に許容できる担体」は、天然分子の哺乳動物、好適にはヒトへの導入を可能にする作用物を意味する。このような担体は、本明細書で述べる物質を含み、特に、組成物を導入する哺乳動物に使用することができる任意の物質を含む。組成物の哺乳動物への「導入」という用語は、組成物の動物への「投与」を指す。組成物は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、散剤、糖衣錠、水性または油性の懸濁液、シロップ、エリキシル剤、および水溶液から選択した形状とすることができる。用いる組成物の種類は、当然、所望の投与ルートに左右されるだろう。(末梢血より少なくとも10倍の濃度の)組成物は、経口的、局所的、直腸的、経鼻的、経皮的、もしくは非経口的(つまり、筋肉内、静脈内、および皮下)で、または、任意の他の適切な方法で投与することが可能である。
天然哺乳動物生体分子を生成する好適な方法は、(a)哺乳動物細胞と担体培地をSynthecon社の円筒形チャンバに導入するステップと;(b)前記円筒形チャンバを、前記細胞が該円筒形チャンバの円筒形壁に実質的に接触しない十分な回転スピードで、その軸周りを回転させるステップと;(c)天然哺乳動物生体分子が採取可能な量で担体液に存在するまで回転を続けるステップと;(d)1つまたは複数の前記天然哺乳動物生体分子を、フローサイトメトリーなどの標準的な分離法により前記担体培地から分離するステップを含む。
好適な実施形態を本明細書では記載しているが、当業者は、本発明には種々の変更および修正が含まれることを理解しよう。本発明の範囲が上記実施形態に限定されることはない。
本発明の好適な実施形態では、3人のドナーの正常ヒト神経前駆細胞(NHNP)を溜め、ドナー間のばらつきをそれに応じて減少させた。対照として、NHNPを、カリフォルニア州サンディエゴ、Clonetics社から得た組織培養フラスコにおいて、標準細胞培養手順に従って従来の組織培養物内で成長させた。
細胞培養プロトコル
二次元培養では、10%FBS、シプロフロキサシン、およびファンギゾンを有するGTSF−2を用いて細胞を培養した(Goodwinら、Exp Biol Med (Maywood), February 1993, vol. 202, no. 2 181-192, Rotating Wall Vessel Cocultureof Small Intestine as a Prelude to Tissue Modeling: Aspects of Simulating Microgravity)。1倍PBS、コラゲナーゼ、DNアーゼ、およびトリプシンをカリフォルニア州サンディエゴ、Clonetics社から購入し、最初の細胞培養用CorningT−75フラスコ(ニューヨーク州コーニング、Corning社)を用いて各実験に適切な量の細胞を得た。簡潔に言うと、培養しようとする細胞を参考試薬を用いてT−フラスコから酵素的に分離し、PBS−CMFで一度洗浄し、トリパン色素排除(ニューヨーク州グランドアイランド、GIBCO社)により生存可能性を分析した。細胞を、100mmのペトリ皿(付着しないように処理した組織培養物)、または、ペトリ皿内の実在電極上で成長させた。電極は白金およびステンレス鋼でできていた。細胞培養物を、37℃かつ6%CO2濃度の加湿FormaCO2インキュベータに維持した。
二次元培養では、10%FBS、シプロフロキサシン、およびファンギゾンを有するGTSF−2を用いて細胞を培養した(Goodwinら、Exp Biol Med (Maywood), February 1993, vol. 202, no. 2 181-192, Rotating Wall Vessel Cocultureof Small Intestine as a Prelude to Tissue Modeling: Aspects of Simulating Microgravity)。1倍PBS、コラゲナーゼ、DNアーゼ、およびトリプシンをカリフォルニア州サンディエゴ、Clonetics社から購入し、最初の細胞培養用CorningT−75フラスコ(ニューヨーク州コーニング、Corning社)を用いて各実験に適切な量の細胞を得た。簡潔に言うと、培養しようとする細胞を参考試薬を用いてT−フラスコから酵素的に分離し、PBS−CMFで一度洗浄し、トリパン色素排除(ニューヨーク州グランドアイランド、GIBCO社)により生存可能性を分析した。細胞を、100mmのペトリ皿(付着しないように処理した組織培養物)、または、ペトリ皿内の実在電極上で成長させた。電極は白金およびステンレス鋼でできていた。細胞培養物を、37℃かつ6%CO2濃度の加湿FormaCO2インキュベータに維持した。
三次元培養では、NHNP細胞を上記のように調製し、RWVを、5mg/mLのCytodex−3タイプコラーゲンIコーティングマイクロ担体(Pharmacia社)と消化されたばかりのNHNP細胞とともに連続的に接種し、55mLの容器に2.5×105細胞/mLの細胞密度を生じさせた。組織を、直径3〜5mmの組織塊が形成されるまで10日間培養した。
発生器
オリジナル設計および機能の波形(TVEMF)発生器を開発し、それを用いて、1〜6mA(AC)の強度の方形波の波形を、上記特許に記載されているようにパルス幅を変調させた5〜100Hzの可変デューティ・サイクルで発生させた。NHNP細胞をこれらの磁場(ELF波)(35〜200ガウス)にさらした。
オリジナル設計および機能の波形(TVEMF)発生器を開発し、それを用いて、1〜6mA(AC)の強度の方形波の波形を、上記特許に記載されているようにパルス幅を変調させた5〜100Hzの可変デューティ・サイクルで発生させた。NHNP細胞をこれらの磁場(ELF波)(35〜200ガウス)にさらした。
二次元実験プロトコル
最初に、金属電極(白金およびステンレス鋼)をペトリ皿の内側に置き、中心に位置決めした。0.7mLの培地に2.5〜105細胞のNHNPを播種した。10%FBS、シプロフロキサシン、およびファンギゾンを有するGTSF−2を用いて細胞を培養した。1倍PBS、コラゲナーゼ、DNアーゼ、およびトリプシンをカリフォルニア州サンディエゴ、Clonetics社から購入し、最初の細胞培養用にCorningT−75フラスコ(ニューヨーク州コーニング、Corning社)を用いた。細胞を2日間培養した。細胞接種後2日目を実験プロトコルの0日目と考える。0日目に、各皿に15mLの培地を与え、波形を電極に適用した。3日目に細胞に15mLの培地を与え、その後6日目、9日目、12日目と3日毎に13mLを与えた。14日目及び17日目は、細胞に再び15mLの培地を与えた。17〜21日目は、細胞を10分間、コラゲナーゼ/DNアーゼカクテル中で培養し、その後トリプシンをカクテルに直接的に適用し、細胞をさらに3分間超培養した。完成培地を加えてトリプシンを非活性化する前に、カクテルミックスを数回ピペットで吸引・吐出した。細胞を1倍PBSで二度洗浄し、培地を再適用し、氷上に置いた。細胞を解剖顕微鏡下で観察し、数を数え、生存可能性について分析した。
最初に、金属電極(白金およびステンレス鋼)をペトリ皿の内側に置き、中心に位置決めした。0.7mLの培地に2.5〜105細胞のNHNPを播種した。10%FBS、シプロフロキサシン、およびファンギゾンを有するGTSF−2を用いて細胞を培養した。1倍PBS、コラゲナーゼ、DNアーゼ、およびトリプシンをカリフォルニア州サンディエゴ、Clonetics社から購入し、最初の細胞培養用にCorningT−75フラスコ(ニューヨーク州コーニング、Corning社)を用いた。細胞を2日間培養した。細胞接種後2日目を実験プロトコルの0日目と考える。0日目に、各皿に15mLの培地を与え、波形を電極に適用した。3日目に細胞に15mLの培地を与え、その後6日目、9日目、12日目と3日毎に13mLを与えた。14日目及び17日目は、細胞に再び15mLの培地を与えた。17〜21日目は、細胞を10分間、コラゲナーゼ/DNアーゼカクテル中で培養し、その後トリプシンをカクテルに直接的に適用し、細胞をさらに3分間超培養した。完成培地を加えてトリプシンを非活性化する前に、カクテルミックスを数回ピペットで吸引・吐出した。細胞を1倍PBSで二度洗浄し、培地を再適用し、氷上に置いた。細胞を解剖顕微鏡下で観察し、数を数え、生存可能性について分析した。
同一プロトコルを同様の実験で続けた。ただし、細胞が金属表面に直接的に接触しないように、電極をペトリ皿内の培地中に置くのではなく、TVEMF処理皿の下面に取り付けた。
三次元(RWV)実験プロトコル
三次元神経系細胞および組織を、上記の方法により培養した。ただし、TVEMFSynthecon回転容器を修正して、電磁コイルを組み込んだ。コイルを、2次元構成と同じ電磁場強度を発するように、容器の芯に巻き付けた。他の条件は全て二次元実験条件と同一だった。生体分子についてのアフィメトリックス(affimatrix)調査に加え、プロテオノミクス分析を行い、セクレトームを培地に発見した。
三次元神経系細胞および組織を、上記の方法により培養した。ただし、TVEMFSynthecon回転容器を修正して、電磁コイルを組み込んだ。コイルを、2次元構成と同じ電磁場強度を発するように、容器の芯に巻き付けた。他の条件は全て二次元実験条件と同一だった。生体分子についてのアフィメトリックス(affimatrix)調査に加え、プロテオノミクス分析を行い、セクレトームを培地に発見した。
Claims (2)
- 分子IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、G−CSF、GM−CSF、RANTES、HGF、LIF、EPO、および、セクレトームの各分子を、ヒト末梢血で見られる濃度の10倍超の濃度で含む生体分子を生成する方法であって、水平軸の周りを回転し、前記細胞を培養基中で浮遊させ続ける生物反応器内の、培養基付き培養チャンバに、ヒト成体幹細胞を置くステップと、前記培養物を、5〜100Hzの可変デューティ・サイクルを有する方形波と35〜200ガウスの磁場からなる時間変動電磁場にさらすステップを含む、方法。
- 分子IL−2、IL−6、IL−8、IL−12、G−CSF、GM−CSF、RANTES、HGF、LIF、EPO、および、セクレトームの各分子を、ヒト末梢血で見られる濃度の10倍超の濃度で含む生体分子を生成する方法であって、ヒト成体幹細胞を培養基付き培養チャンバに置くステップと、前記細胞を培養しながら、前記培養物を5〜100Hzの可変デューティ・サイクルを有する方形波と35〜200ガウスの磁場からなる時間変動電磁場にさらすステップを含み、前記細胞が前記培養チャンバの固体表面に接触せず、前記細胞が培養の間中、同一の三次元細胞間形状を維持するように、前記細胞を前記培養基中に浮遊させた状態で培養する、方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016140840A JP2018007647A (ja) | 2016-07-15 | 2016-07-15 | 哺乳動物生細胞を電磁的に刺激することにより生成する生体分子 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2016140840A JP2018007647A (ja) | 2016-07-15 | 2016-07-15 | 哺乳動物生細胞を電磁的に刺激することにより生成する生体分子 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2018007647A true JP2018007647A (ja) | 2018-01-18 |
Family
ID=60994049
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016140840A Pending JP2018007647A (ja) | 2016-07-15 | 2016-07-15 | 哺乳動物生細胞を電磁的に刺激することにより生成する生体分子 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2018007647A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11071876B2 (en) | 2018-12-03 | 2021-07-27 | Aah Holdings Llc | Apparatus and method for treatment of mental and behavioral conditions and disorders with electromagnetic fields |
US11338150B2 (en) | 2017-05-08 | 2022-05-24 | Aah Holdings, Llc | Multi-coil electromagnetic apparatus |
-
2016
- 2016-07-15 JP JP2016140840A patent/JP2018007647A/ja active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11338150B2 (en) | 2017-05-08 | 2022-05-24 | Aah Holdings, Llc | Multi-coil electromagnetic apparatus |
US11071876B2 (en) | 2018-12-03 | 2021-07-27 | Aah Holdings Llc | Apparatus and method for treatment of mental and behavioral conditions and disorders with electromagnetic fields |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20210236544A1 (en) | Methods of mediating macrophage phenotypes | |
AU2014238305B2 (en) | Methods and non-immunogenic compositions for treating inflammatory disorders | |
EP3881852B1 (en) | Treatment of pain using protein solutions | |
US9410143B1 (en) | Biological molecules produced by electromagnetically stimulating living mammalian cells | |
AU2014238363B2 (en) | Methods and acellular compositions for treating inflammatory disorders | |
US20090081751A1 (en) | Natively glycosylated mammalian biological molecules produced by electromagnetically stimulating living mammalian cells | |
CN106754723B (zh) | 一种具有抗肿瘤功能的免疫细胞及其应用 | |
JP2018007647A (ja) | 哺乳動物生細胞を電磁的に刺激することにより生成する生体分子 | |
EP2880152A1 (de) | Verfahren zur kultivierung einer subpopulation zirkulierender epithelialer tumorzellen aus einer körperflüssigkeit | |
KR20180009985A (ko) | 살아있는 포유동물 세포를 전자기적으로 자극하여 생성된 생물학적 분자 | |
EP3272854A1 (en) | Biological molecules produced by electromagnetically stimulating living mammalian cells | |
EP3148574B1 (en) | Purified compositions of ivig and kh proteins for modulating lymphocytes and treating hepatitis b virus | |
CN107641636A (zh) | 通过电磁刺激哺乳动物活细胞产生的生物分子 | |
CN115698267A (zh) | 肿瘤浸润淋巴细胞的种子细胞培养基及其应用 | |
CN113403274B (zh) | 细胞治疗组合物及其制备方法和作为过敏性反应及自身免疫疾病治疗药物的应用 | |
JP2020505050A (ja) | 免疫寛容性プラズマサイトイド樹状細胞及びその製造方法 | |
CN116987666A (zh) | 靶向sting通路制备治疗性nk细胞 | |
KR20090034790A (ko) | 살아있는 포유류 세포를 전자기적으로 자극하여 생성된천연적으로 당화된 포유류 생물학적 분자들 | |
US20180021376A1 (en) | Naming of KH1 through KH55 good healthy cells synthesizes the KH1 through KH55 proteins |