JP2018000146A - Dna extraction method and bacteria detection method - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスに供するＤＮＡの抽出法及び、該抽出法で得られたＤＮＡを用いた細菌の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for extracting DNA to be subjected to a multiplex sequence of 16S rRNA gene amplicon and a method for detecting bacteria using the DNA obtained by the extraction method.
従来、遺伝子解析の手法を用いて食品等の試料から細菌を検出することが一般に行われている。この遺伝子解析に供するＤＮＡ溶液を調製するために、種々の方法が知られている。
例えば、特許文献１にはマルチプレックスＰＣＲにより食品中の微生物を解析して検出するため、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する方法が記載されている。
Conventionally, it has been generally performed to detect bacteria from a sample such as food using a gene analysis technique. Various methods are known for preparing a DNA solution for use in this genetic analysis.
For example, in Patent Document 1, in order to detect and detect microorganisms in food by multiplex PCR, detection is performed by treating with bacteriocin having a lytic enzyme and / or lytic activity, a surfactant, and a protein denaturant. A method for extracting the DNA of the target microorganism is described.
また特許文献２には、ＴＲＦＬＰ法とＳＳＣＰ法とを組み合わせた微生物群集構造解析方法に供するＤＮＡを、シリカ／ジルコニアビーズを用いて抽出することが記載されている。 Patent Document 2 describes that DNA used for a microbial community structure analysis method combining the TRFLP method and the SSCP method is extracted using silica / zirconia beads.
上述したように、特許文献１に記載の技術は、マルチプレックスＰＣＲによる特定微生物の検出方法であり、特許文献２に記載の技術は、ＴＲＦＬＰ法とＳＳＣＰ法とを組み合わせた微生物検出方法である。
これらに対し、近年、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスにより試料中の細菌を検出することが行われている。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスとは、特許文献１及び２に記載された細菌検出方法とは異なり、試料中から抽出されたＤＮＡにおける１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の特定領域を増幅させてなるアンプリコンを得、これをマルチプレックスシーケンスに供することにより試料中の細菌を網羅的に検出する方法である。このアンプリコンの生成には、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における多数菌種間で共通に保存された領域に結合するユニバーサルプライマーを用いる。このユニバーサルプライマーは通常、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における突然変異が起こりやすい可変領域を含む領域を増幅するために用いられる。マルチプレックスシーケンスは、サンプル由来のＤＮＡにサンプルごとに識別可能な配列を加えることで、複数サンプルを同時にシーケンスすることを可能とした技術であり、一般に、いわゆる次世代シーケンサーにより行われる。
As described above, the technique described in Patent Document 1 is a method for detecting a specific microorganism by multiplex PCR, and the technique described in Patent Document 2 is a microorganism detection method in which the TRFLP method and the SSCP method are combined.
In contrast, in recent years, bacteria in a sample have been detected by a multiplex sequence of 16S rRNA gene amplicons. A multiplex sequence of 16SrRNA gene amplicon is different from the bacterial detection methods described in Patent Documents 1 and 2, and obtains an amplicon obtained by amplifying a specific region of 16SrRNA gene in DNA extracted from a sample, This is a method for exhaustively detecting bacteria in a sample by subjecting it to a multiplex sequence. For generation of this amplicon, a universal primer that binds to a region conserved in common among many bacterial species in the 16S rRNA gene is used. This universal primer is usually used to amplify a region containing a variable region prone to mutation in the 16S rRNA gene. Multiplex sequencing is a technique that allows a plurality of samples to be sequenced simultaneously by adding a sequence that can be identified for each sample to DNA derived from the sample, and is generally performed by a so-called next-generation sequencer.
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスは、幅広い菌種に由来する多数の遺伝子配列を短時間で解析できるため、従来の検出方法に比べ、多数の菌種の検出を同時且つ短時間で行うことができる。
しかしながら、従来のＤＮＡ抽出方法を用いて試料から細菌ＤＮＡを抽出した場合、菌種によってＤＮＡの抽出効率が異なることによって、抽出したＤＮＡを１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスに供しても、実際の分布が反映される結果が得難い場合がある、という課題が存在した。
これに対し、上記の特許文献１及び２においては、１６ＳｒＲＮＡアンプリコンのマルチプレックスシーケンスを用いる際のそのような課題は何ら記載も示唆もされておらず、ましてその課題を解決するためのＤＮＡ抽出方法は何ら記載も示唆もされていない。
Since the multiplex sequence of 16S rRNA gene amplicon can analyze a large number of gene sequences derived from a wide range of bacterial species in a short time, a large number of bacterial species can be detected simultaneously and in a short time compared to conventional detection methods. it can.
However, when bacterial DNA is extracted from a sample using a conventional DNA extraction method, the extraction efficiency differs depending on the bacterial species, so that even if the extracted DNA is subjected to a multiplex sequence of a 16S rRNA gene amplicon, There was a problem that it might be difficult to obtain results reflecting the distribution.
On the other hand, in Patent Documents 1 and 2 described above, there is no description or suggestion of such a problem when using a multiplex sequence of 16SrRNA amplicon, and DNA extraction for solving the problem is not described. No method is described or suggested.
したがって、本発明の目的は、試料中からＤＮＡ抽出するに当たり、従来であれば抽出されにくい細菌のＤＮＡ、特に１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の抽出精度を高めることができ、１６ＳｒＲＮＡアンプリコンのマルチプレックスシーケンスに供した場合に実際の細菌分布に近い検出結果を得やすい簡便なＤＮＡの抽出方法、及びそれを用いた細菌検出方法を提供することにある。 Therefore, the object of the present invention is to improve the extraction accuracy of bacterial DNA, particularly 16S rRNA gene, which is difficult to extract by conventional methods when extracting DNA from a sample, and when it is used for a multiplex sequence of 16S rRNA amplicon Another object of the present invention is to provide a simple DNA extraction method that makes it easy to obtain detection results close to the actual bacterial distribution, and a bacteria detection method using the same.
本発明者は、１６ＳｒＲＮＡアンプリコンのマルチプレックスシーケンスによる細菌の検出感度と、ＤＮＡ抽出方法との関係について鋭意検討した。その結果、特定酵素による処理とビーズ処理との組み合わせにより、検出されにくい細菌の検出感度を効果的に向上させることができることを見出した。
本発明は、上記知見に基づくものであり、試料中の細菌のＤＮＡを抽出して、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスに供するＤＮＡ溶液を調製するＤＮＡ抽出方法であって、
前記ＤＮＡ溶液の調製に際し、前記試料に対して、以下の処理（Ａ）及び処理（Ｂ）を行う、ＤＮＡ抽出法を提供するものである。
（Ａ）アクロモペプチダーゼで処理することにより、試料中の細菌を溶菌する。
（Ｂ）ビーズで処理することにより、試料中の細菌を物理的に破砕する。
The present inventors diligently investigated the relationship between the detection sensitivity of bacteria by the 16S rRNA amplicon multiplex sequence and the DNA extraction method. As a result, it has been found that the combination of the treatment with a specific enzyme and the bead treatment can effectively improve the detection sensitivity of bacteria that are difficult to detect.
The present invention is based on the above findings, and is a DNA extraction method for extracting a bacterial DNA in a sample and preparing a DNA solution for use in a multiplex sequence of a 16S rRNA gene amplicon,
The present invention provides a DNA extraction method in which the following treatment (A) and treatment (B) are performed on the sample when preparing the DNA solution.
(A) Bacteria in the sample are lysed by treatment with achromopeptidase.
(B) The bacteria in the sample are physically disrupted by treating with beads.
また本発明は、試料中の細菌を網羅的に検出する方法であって、
前記試料に対して、以下の処理（Ａ）及び処理（Ｂ）を行ってＤＮＡ溶液を調製し、該ＤＮＡ溶液から、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における可変領域の増幅物であるアンプリコンを得、得られたアンプリコンをマルチプレックスシーケンスに供する、細菌の検出方法を提供するものである。
（Ａ）アクロモペプチダーゼで処理することにより、試料中の細菌を溶菌する。
（Ｂ）ビーズで処理することにより、試料中の細菌を物理的に破砕する。
Further, the present invention is a method for comprehensively detecting bacteria in a sample,
The following treatment (A) and treatment (B) are performed on the sample to prepare a DNA solution, and an amplicon that is an amplification product of a variable region in the 16S rRNA gene is obtained from the DNA solution. The present invention provides a method for detecting bacteria in which recon is subjected to a multiplex sequence.
(A) Bacteria in the sample are lysed by treatment with achromopeptidase.
(B) The bacteria in the sample are physically disrupted by treating with beads.
本発明によれば、１６ＳｒＲＮＡアンプリコンのマルチプレックスシーケンスにより試料中の細菌を検出するに当たり、従来検出されにくかった細菌の検出感度を効果的に向上させることができ、且つ簡便なＤＮＡの抽出方法、及びそれを用いた細菌検出方法が提供される。 According to the present invention, in detecting bacteria in a sample by a multiplex sequence of 16S rRNA amplicons, it is possible to effectively improve the detection sensitivity of bacteria that have been difficult to detect conventionally, and a simple DNA extraction method, And a method for detecting bacteria using the same.
以下、本発明をその好ましい実施形態に基づいて説明する。
本発明のＤＮＡ抽出方法は、試料中の細菌のＤＮＡを抽出して、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスに供するＤＮＡ溶液を調製するＤＮＡ抽出方法である。
Hereinafter, the present invention will be described based on preferred embodiments thereof.
The DNA extraction method of the present invention is a DNA extraction method in which bacterial DNA in a sample is extracted to prepare a DNA solution for use in a 16S rRNA gene amplicon multiplex sequence.
試料としては、食品、食品工場の環境中より採取した拭き取り試料、ペットフード、家畜の飼料、医薬品、医薬部外品、土壌、上水、下水、土壌、体内臓器やそれらからの浸出物、血液、皮膚、糞便等を挙げることができる。中でも、食品、及び、食品工場の環境中より採取した拭き取り試料が好ましい。食品には、飲料も含まれる。また、食品には、それに含まれる細菌の種類が既知の食品（例えば発酵食品）だけでなく、含まれる細菌の種類が未知である食品（例えば発酵食品以外の食品）や細菌が含まれているか否か不明の食品も含まれる。本発明は、食品等の試料中における特定の細菌を検出するだけでなく、試料中にどのような細菌が含まれているかが未知である場合であっても、試料中の細菌を網羅的に検出することができる。このような本発明の細菌の検出方法は、例えば、食品中に混入した細菌の検出手段として有用である。上記の食品には、その原料及び製造過程における中間生成物も含まれる。
また試料が液状の場合は、そのまま下記の（Ａ）の処理及び（Ｂ）の処理を施してもよいが、試料が粉状等の固形状である場合は、溶媒への分散や、溶媒を用いた抽出、及び、ろ過などを適宜組み合わせて試料を液状又はゲル状等としたものに対し、下記の（Ａ）の処理及び（Ｂ）の処理を施すことが好ましい。この場合の溶媒としては、水や各種の緩衝液などが挙げられる。
Samples include wipes collected from the environment of food and food factories, pet food, livestock feed, pharmaceuticals, quasi drugs, soil, drinking water, sewage, soil, internal organs and exudates from them, blood , Skin, feces and the like. Among these, a wipe sample collected from the environment of food and food factories is preferable. Food includes beverages. In addition, foods contain not only foods with known types of bacteria (for example, fermented foods) but also foods with unknown types of bacteria (for example, foods other than fermented foods) and bacteria. This includes foods that are unknown. The present invention not only detects specific bacteria in a sample such as food, but also comprehensively identifies bacteria in the sample even when it is unknown what kind of bacteria are contained in the sample. Can be detected. Such a method for detecting bacteria according to the present invention is useful, for example, as a means for detecting bacteria mixed in food. The above food includes the raw materials and intermediate products in the production process.
When the sample is liquid, the following treatment (A) and treatment (B) may be performed as it is. However, when the sample is in a solid state such as powder, It is preferable to perform the following processing (A) and processing (B) on a sample that is made liquid or gel by appropriately combining extraction and filtration used. Examples of the solvent in this case include water and various buffer solutions.
試料中の細菌の属や種に限定はなく、グラム陰性菌及びグラム陽性菌の何れであってもよく、その両方であってもよい。グラム陽性菌を含む試料、とりわけＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｋｏｃｕｒｉａ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ属の少なくとも一種を含む試料については、試料中の細菌を網羅的に検出するという本発明の効果が一層得られやすい。 There is no limitation on the genus and species of bacteria in the sample, and any of Gram-negative bacteria and Gram-positive bacteria or both of them may be used. For samples containing Gram-positive bacteria, particularly samples containing at least one of Staphylococcus genus, Kocuria genus, Lactobacillus genus, and Leuconostoc genus, the effect of the present invention of comprehensively detecting bacteria in the sample is more easily obtained.
本発明のＤＮＡ抽出方法は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスに供するＤＮＡ溶液を調製するに当たり、以下の処理（Ａ）及び処理（Ｂ）を行う。
（Ａ）アクロモペプチダーゼで処理することにより、試料中の細菌を溶菌する。
（Ｂ）ビーズで処理することにより、試料中の細菌を物理的に破砕する。
In the DNA extraction method of the present invention, the following treatment (A) and treatment (B) are performed when preparing a DNA solution to be subjected to a multiplex sequence of 16S rRNA gene amplicons.
(A) Bacteria in the sample are lysed by treatment with achromopeptidase.
(B) The bacteria in the sample are physically disrupted by treating with beads.
（Ａ）アクロモペプチダーゼは細胞の細胞壁のペプチドグリカンを分解する作用を有する。アクロモペプチダーゼによる処理は、通常、容器内の試料にアクロモペプチダーゼを添加して行う。アクロモペプチダーゼの添加後に容器内の試料を適宜撹拌することが好ましい。この酵素による処理は、３５℃以上５５℃以下程度で行うことが好ましい。この酵素による処理時間は１５分以上６０分以下程度であることが好ましい。本発明のＤＮＡ抽出方法では、アクロモペプチダーゼに加えて他のペプチドグリカン分解酵素を用いてもよく用いなくてもよく、また用いる際には、アクロモペプチダーゼによる処理と同時であっても異なっていてもよいが、他のペプチドグリカン分解酵素を用いる場合には、ペプチドグリカン分解酵素のうちアクロモペプチダーゼの酵素量（Ｕ）が最も多いことが好ましい。 (A) Achromopeptidase has an action of degrading peptidoglycan on the cell wall of the cell. The treatment with achromopeptidase is usually performed by adding achromopeptidase to the sample in the container. It is preferable that the sample in the container is appropriately stirred after the addition of achromopeptidase. The treatment with the enzyme is preferably performed at about 35 ° C. or more and 55 ° C. or less. The treatment time with this enzyme is preferably about 15 minutes to 60 minutes. In the DNA extraction method of the present invention, other peptidoglycan degrading enzymes may or may not be used in addition to achromopeptidase, and when used, they may be different from the treatment with achromopeptidase. However, when other peptidoglycan degrading enzymes are used, it is preferable that the amount of achromopeptidase enzyme (U) is the largest among the peptidoglycan degrading enzymes.
（Ｂ）のビーズ処理は、試料とビーズとの混合物に物理的衝撃を与えて細胞破砕する処理である。物理的衝撃を与える方法としては、試料とビーズとの混合物入り密閉容器を振動させる方法や、試料とビーズとの混合物入りの容器を超音波処理する方法などが挙げられる。試料とビーズとの混合物入り密閉容器を振動させる方法としては、各種のビーズ式ホモジナイザーやビーズ式細胞破砕装置を用いる方法を挙げることができる。 The bead treatment (B) is a treatment for crushing cells by applying a physical impact to the mixture of the sample and the beads. Examples of the method of giving a physical impact include a method of vibrating a sealed container containing a mixture of a sample and beads, a method of ultrasonicating a container containing a mixture of a sample and beads, and the like. Examples of the method of vibrating the sealed container containing the mixture of the sample and the beads include methods using various bead type homogenizers and bead type cell crushing apparatuses.
試料及びビーズ入り密閉容器を振動させる場合、その振動の形態としては、互いに直交する３方向である上下方向、前後方向、左右方向の何れの方向に振動させるものであってもよく、２方向の動きを組み合わせたものであってもよく、３方向の動きを組み合わせたものであってもよい。３方向の動きを組み合わせた振動の形態としては、例えば、容器を、上下に動かしながら水平面における軌道が８の字を描くように振動させる形態が挙げられる。８の字を描くようにとは、容器の何れか一か所の軌道が、上下方向からみたときに８の字であればよい。このように３方向の動きを組み合わせた形態の振動によれば、ビーズと細菌との接触が活発になり、細胞破砕をより一層効果的に行うことができるため好ましい。振動とは、一の位置から他の位置に移動し、前記一の位置に戻ることをいい、例えば容器支持体の旋回に伴う振動であれば、その支持体の１回の旋回に伴う動きをいう。 In the case of vibrating the sample and the beaded sealed container, the form of vibration may be one that vibrates in any of the three directions perpendicular to each other, the vertical direction, the front-rear direction, and the left-right direction. A combination of movements or a combination of movements in three directions may be used. As a form of vibration combining the movements in the three directions, for example, a form in which the container is vibrated so that the trajectory in the horizontal plane draws a figure 8 while moving up and down is mentioned. In order to draw the figure 8, the trajectory of any one of the containers may be a figure 8 when viewed from the vertical direction. Thus, according to the vibration of the form in which the movements in the three directions are combined, the contact between the beads and the bacteria becomes active, and cell disruption can be performed more effectively, which is preferable. The vibration refers to moving from one position to another position and returning to the one position. For example, if the vibration is associated with the turning of the container support, the movement associated with one turn of the support is indicated. Say.
試料及びビーズ入り密閉容器の振動が容器支持体の旋回に伴うものである場合、広範な細菌種を効果的に破砕する点からこの旋回の回転数は３，０００ｒｐｍ以上が好ましく、ＤＮＡの断片化を最小限とする点から、５，０００ｒｐｍ以下であることが好ましい。また、振動時間は広範な細菌種を効果的に破砕する点から３０秒以上が好ましく、ＤＮＡの断片化を最小限とする点から６０秒以下が好ましい。この振動時間は、振動を複数回に分けて行う場合は合計の振動時間である。 When the vibration of the sealed container containing the sample and the beads is accompanied by the rotation of the container support, the rotation speed of the rotation is preferably 3,000 rpm or more from the viewpoint of effectively crushing a wide variety of bacterial species, and DNA fragmentation Is preferably 5,000 rpm or less from the viewpoint of minimizing. The vibration time is preferably 30 seconds or longer from the viewpoint of effectively crushing a wide range of bacterial species, and preferably 60 seconds or shorter from the viewpoint of minimizing DNA fragmentation. This vibration time is the total vibration time when the vibration is divided into a plurality of times.
ビーズ処理の際、ビーズの容積／ビーズ以外の内容液の容積の比率は、１／１０以上１以下が好ましい。また密閉容器中の内容積に対する当該容器の内容液（ビーズを含む）の容積の割合は、概ね、５容量％以上４０容量％以下が好ましく、１０容量％以上２０容量％以下がより好ましい。 In the bead treatment, the ratio of the volume of the beads / the volume of the content liquid other than the beads is preferably 1/10 or more and 1 or less. Further, the ratio of the volume of the content liquid (including beads) in the container to the internal volume in the closed container is generally preferably 5% by volume to 40% by volume, and more preferably 10% by volume to 20% by volume.
ビーズ処理の際における密閉容器中の内容液には外添による界面活性剤が含まれていてもよく、含まれていなくてもよい。ここでいう外添による界面活性剤とは、処理対象の試料に由来せず、ＤＮＡ抽出する過程で用いる試薬に含まれた界面活性剤をいう。界面活性剤の例としては、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などが挙げられる。 The content liquid in the sealed container at the time of the bead treatment may or may not contain a surfactant by external addition. The term “surfactant by external addition” as used herein refers to a surfactant that is not derived from the sample to be treated but is contained in the reagent used in the DNA extraction process. Examples of the surfactant include sodium lauryl sulfate (SDS).
ビーズ処理に用いるビーズの材質としては、非金属であることが好ましく、ジルコニアビーズ、ガラスビーズが挙げられる。特に、グラム陽性菌等の細胞破砕効果に優れるため、ジルコニアビーズが好ましい。 The material of the beads used for the bead processing is preferably non-metallic, and examples thereof include zirconia beads and glass beads. In particular, zirconia beads are preferred because of excellent cell disruption effects such as Gram-positive bacteria.
ビーズの粒径としては、φ（直径）０．１ｍｍ以上φ１ｍｍ以下、特にφ０．３ｍｍ以上φ０．８ｍｍ以下、とりわけφ０．５ｍｍ程度であることが、広範な細菌種を効果的に破砕する点から好ましい。 The particle diameter of the beads is φ (diameter) 0.1 mm or more and φ1 mm or less, particularly φ0.3 mm or more and φ0.8 mm or less, particularly φ0.5 mm, from the point of effectively crushing a wide range of bacterial species. preferable.
（Ａ）の処理と、（Ｂ）の処理とは、どちらを先に行ってもよく、また同時に行ってもよいが、特に、（Ａ）の処理の後に、（Ｂ）の処理を行うことが、アクロモペプチダーゼ処理により柔軟化させた細胞壁をビーズ処理により効果的に破砕できる点から好ましい。 Either the process (A) or the process (B) may be performed first or at the same time. In particular, the process (B) is performed after the process (A). However, it is preferable because the cell wall softened by the achromopeptidase treatment can be effectively disrupted by the bead treatment.
本発明のＤＮＡ抽出方法は、前記試料をタンパク質分解酵素で処理する工程を含むことが好ましい。
これにより、ＤＮＡ結合タンパク質を分解し、ＤＮＡ抽出効率を高めることができる点や、試料中のＤＮＡを分解するヌクレアーゼを失活させやすい点から好ましい。タンパク質分解酵素として、例えばプロテイナーゼＫなどが挙げられる。（Ａ）の処理の後に（Ｂ）の処理を行う場合は、タンパク質分解酵素は（Ａ）の処理の後であって（Ｂ）の処理の前に添加することが、タンパク質分解酵素の作用によるアクロモペプチダーゼの失活を防止できる点や、試料中のＤＮＡの分解防止の点から好ましい。
The DNA extraction method of the present invention preferably includes a step of treating the sample with a proteolytic enzyme.
This is preferable from the viewpoint of degrading the DNA-binding protein and increasing the DNA extraction efficiency and easily deactivating a nuclease that degrades the DNA in the sample. Examples of proteolytic enzymes include proteinase K. When the treatment (B) is performed after the treatment (A), the proteolytic enzyme is added after the treatment (A) and before the treatment (B). It is preferable from the viewpoint of preventing the inactivation of achromopeptidase and preventing the degradation of DNA in the sample.
また、後述するスピンカラムを用いたＤＮＡ抽出においては、（Ａ）の処理及び（Ｂ）の処理の後に、ＲＮＡ分解酵素を添加してサンプル中のＲＮＡを分解すると、純度の高いＤＮＡを精製することができるため好ましい。「ＲＮＡ分解酵素」としては核酸中ＲＮＡを選択的に分解する作用を有する酵素を特に制限なく用いることができ、例えばＲＮａｓｅＡなどが挙げられる。 In addition, in DNA extraction using a spin column, which will be described later, high-purity DNA is purified by adding RNA-degrading enzyme after the treatments (A) and (B) to degrade RNA in the sample. This is preferable. As the “RNA degrading enzyme”, an enzyme having an action of selectively degrading RNA in a nucleic acid can be used without particular limitation, and examples thereof include RNase A.
本発明のＤＮＡ抽出方法においては、ＤＮＡの抽出は、前記処理（Ａ）及び処理（Ｂ）後の試料を、スピンカラムを有するＤＮＡ抽出キットで処理することにより該試料から前記ＤＮＡ溶液を得ることが、純度の高いＤＮＡ溶液が得られる点で好ましい。スピンカラムとは、例えば核酸吸着性の担体を有し、かつ遠心機により遠心操作が可能なカラムをいう。核酸吸着性の担体としては、シリカ等が挙げられる。核酸吸着性の担体は、通常カラムの底部に配置されている。担体の形状としては例えばメンブレン状が挙げられる。 In the DNA extraction method of the present invention, the DNA extraction is performed by treating the sample after the treatment (A) and the treatment (B) with a DNA extraction kit having a spin column to obtain the DNA solution from the sample. However, it is preferable in that a highly pure DNA solution can be obtained. A spin column refers to a column having a nucleic acid-adsorbing carrier and capable of being centrifuged by a centrifuge, for example. Examples of the nucleic acid-adsorbing carrier include silica. The nucleic acid-adsorbing carrier is usually arranged at the bottom of the column. Examples of the shape of the carrier include a membrane shape.
前記のキットは、スピンカラムのほか、例えば、カオトロピックイオンを含む核酸吸着液、スピンカラムの核酸結合性担体に吸着されたＤＮＡを溶出するための溶出液などを備えている。カオトロピックイオンの例としては、グアニジニウムイオン、ヨウ化物イオンなどが挙げられる。カオトロピックイオンはカオトロピック塩により供給され、このカオトロピック塩としては、例えば、塩酸グアニジン、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム等が挙げられる。これに加えて、前記のキットは、ＳＤＳ等の界面活性剤及びタンパク質分解酵素を含有し細胞を溶解させるための溶出バッファーや、担体に吸着されたＤＮＡ以外の成分を洗浄除去する洗浄液などを更に備えていてもよい。スピンカラムを有するＤＮＡ抽出キットのうち商業的に入手可能なものとしては、例えば、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ（ＴａＫａＲａ）、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ プラスミド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）が挙げられる。 In addition to the spin column, the kit includes a nucleic acid adsorption solution containing chaotropic ions, an elution solution for eluting DNA adsorbed on the nucleic acid binding carrier of the spin column, and the like. Examples of chaotropic ions include guanidinium ions and iodide ions. Chaotropic ions are supplied by chaotropic salts, and examples of the chaotropic salts include guanidine hydrochloride, guanidine thiocyanate, sodium iodide and the like. In addition, the kit further includes an elution buffer for lysing cells containing a surfactant such as SDS and a proteolytic enzyme, and a washing solution for washing and removing components other than DNA adsorbed on the carrier. You may have. Examples of commercially available DNA extraction kits having a spin column include NucleoSpin (registered trademark) Tissue (TaKaRa) and Quantum Prep plasmid (BIO-RAD).
上記（Ｂ）の処理後の試料に（Ｂ）の処理で用いたビーズが混在している場合であって、当該（Ｂ）の処理後の試料を、スピンカラムに供する場合、このビーズが混在した試料のからビーズを除いたものをスピンカラムに供することが好ましい。（Ｂ）の処理の後に試料からビーズを除去する方法としては、例えば、ビーズが混在した試料に、必要に応じて遠心分離や溶媒による分離等を行う方法が挙げられる。遠心分離によりビーズを除去する場合、遠心分離の遠心力は１０，０００×ｇ以上１５,０００×ｇ以下であることが好ましい。スピンカラムを有する抽出キットでＤＮＡを抽出する場合は、得られた上清液をスピンカラムに供すればよい。 In the case where the bead used in the process (B) is mixed in the sample after the process (B), when the sample after the process (B) is used for a spin column, the bead is mixed. It is preferable to use a sample obtained by removing beads from the prepared sample. Examples of the method for removing the beads from the sample after the treatment (B) include a method in which a sample containing beads is subjected to centrifugation, separation with a solvent, or the like as necessary. When the beads are removed by centrifugation, the centrifugal force of the centrifugation is preferably 10,000 × g or more and 15,000 × g or less. When DNA is extracted with an extraction kit having a spin column, the obtained supernatant may be applied to the spin column.
スピンカラムから溶出させたＤＮＡは必要に応じて適宜精製し、濃度を測定することが好ましい。以上のようにして、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のアンプリコンのマルチプレックスシーケンスに供するＤＮＡ溶液が調製される。この溶液の溶媒は特に限定されず、公知のものが用いられる。 The DNA eluted from the spin column is preferably purified as necessary and the concentration is measured. As described above, a DNA solution for use in the multiplex sequence of the 16S rRNA gene amplicon is prepared. The solvent of this solution is not specifically limited, A well-known thing is used.
（２：細菌検出）
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンの作製は、上記で調製したＤＮＡ溶液を鋳型とし、ユニバーサルプライマーを用いたｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）により行うことが好ましい。１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は、突然変異の起こりやすい可変領域Ｖ１〜Ｖ９が、その他の領域（多数の菌種間で高度に保存された保存領域）に挟まれている。ユニバーサルプライマーの設計は、例えば、このＶ１〜Ｖ９領域のうち何れか１以上を特異的に増幅させるように設計される。ユニバーサルプライマーは可変領域Ｖ１〜Ｖ９の何れか１つのみを増幅させるように設計されてもよいが、複数の可変領域をまたがって増幅させるように設計されたものである方が、細菌の検出効率が向上するため好ましい。ユニバーサルプライマーの例としては、図１及び図２に示すものが挙げられるが、それ以外に、上記可変領域を増幅させるための任意のプライマーを用いることが可能である。
(2: Bacteria detection)
The 16S rRNA gene amplicon is preferably produced by polymerase chain reaction (PCR) using a universal primer and the DNA solution prepared above as a template. In the 16S rRNA gene, variable regions V1 to V9 that are likely to be mutated are sandwiched between other regions (conserved regions highly conserved among many bacterial species). The universal primer is designed to specifically amplify any one or more of the V1 to V9 regions, for example. The universal primer may be designed to amplify only one of the variable regions V1 to V9, but the bacteria detection efficiency is better designed to amplify across a plurality of variable regions. Is preferable. Examples of universal primers include those shown in FIG. 1 and FIG. 2, but any other primer for amplifying the variable region can be used.
上記ＰＣＲで得られたアンプリコンは、マルチプレックスシーケンスに供される。マルチプレックスシーケンスは、上述した通り、複数種のサンプルそれぞれにおけるＤＮＡにサンプル間で異なる識別用配列を付加することで、同時にシーケンスすることを可能とする技術である。識別用配列は、インデックス等と呼ばれ、この用途のための公知のキット等を用いて付加することができる。
マルチプレックスシーケンスは、通常、次世代シーケンサーを用いて行われる。次世代シーケンサーとは、サンガー法を利用した蛍光キャピラリーシーケンサーである「第１世代シーケンサー」と対比させて用いられている用語であり、次世代シーケンサーでは、ジデオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼの伸長を止めるサンガー法を用いた第１世代シーケンサーと異なるシーケンシング原理が用いられている。このような原理としては例えば、合成シーケンシング法、パイロシーケンシング法、リガーゼ反応シーケンシング法などが挙げられる。次世代シーケンサーとしては、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡリガーゼによる逐次的ＤＮＡ合成法を用いて、数千万から数億のＤＮＡ断片に対して数十〜数千ｂｐのリード長の断片を網羅的に解析することによって並列的に塩基配列を決定するための装置が挙げられる。次世代シーケンサーの具体例としては、ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００ （ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、ＭｉＳｅｑ（登録商標） （ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、５５００ｘｌ ＳＯＬｉＤＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｉｏｎ ＰｒｏｔｏｎＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｉｏｎ ＰＧＭＴＭ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ＧＳ ＦＬＸ＋ （Ｒｏｃｈｅ社）などが挙げられるが、本発明に用いることができる次世代シーケンサーはこれらに限定されず、今後開発されるものも含む。
The amplicon obtained by the PCR is subjected to a multiplex sequence. As described above, the multiplex sequence is a technique that enables simultaneous sequencing by adding different identification sequences between samples to DNA in each of a plurality of types of samples. The identification sequence is called an index or the like, and can be added using a known kit for this use.
The multiplex sequence is usually performed using a next-generation sequencer. The next-generation sequencer is a term used in contrast to the “first generation sequencer”, which is a fluorescent capillary sequencer using the Sanger method. In the next-generation sequencer, the dideoxynucleotide is used to stop the extension of the DNA polymerase. A sequencing principle different from the first generation sequencer using the Sanger method is used. Examples of such principles include synthetic sequencing methods, pyrosequencing methods, ligase reaction sequencing methods, and the like. As a next-generation sequencer, a sequential DNA synthesis method using DNA polymerase or DNA ligase is used to comprehensively analyze tens of thousands to hundreds of millions of DNA fragments having a read length of tens to thousands of bp. Thus, an apparatus for determining a base sequence in parallel can be mentioned. Specific examples of next-generation sequencers include HiSeq (registered trademark) 2500 (illumina), MiSeq (registered trademark) (illumina), 5500xl SOLiD ™ (Life Technologies), Ion Proton ™ (Life Technologies PG). TM (Life Technologies), GS FLX + (Roche), etc. are mentioned, but the next-generation sequencer that can be used in the present invention is not limited to these, and includes those to be developed in the future.
マルチプレックスシーケンスにおいて得られたシークエンスは、公知のデータベースを用いた解析にかけられ、細菌が特定される。例えば、一の種の細菌の検出率は、試料中から抽出されたＤＮＡをシークエンスして得られた総リード数中、当該種の細菌として特定されたリード数として検出される。
以上の通り本発明では、本発明のＤＮＡ抽出方法で調製したＤＮＡ溶液を用いることにより、幅広い菌種のＤＮＡを効率よく抽出でき、実際の細菌分布を反映した細菌検出が可能となる。
The sequence obtained in the multiplex sequence is subjected to analysis using a known database to identify bacteria. For example, the detection rate of one species of bacteria is detected as the number of reads identified as the species of bacteria in the total number of reads obtained by sequencing DNA extracted from a sample.
As described above, in the present invention, by using the DNA solution prepared by the DNA extraction method of the present invention, DNA of a wide variety of bacterial species can be efficiently extracted, and bacteria can be detected reflecting the actual bacterial distribution.
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。本発明は、以下の実施例により何ら制限されるものではない。
〔実施例１：アクロモペプチダーゼ及びビーズを用いたＤＮＡ溶液の調製〕
Ｉ）菌液の調製
一般的に食品から検出されやすい１０種類の細菌（それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃの各属のもの）について、以下の（１）〜（５）の手順に従って、細菌数が等量となるように混合し、細菌液を調製した。
（１）各細菌について、適切な液体培地及び温度条件で培養し、対数増殖期後期に培養液を採取した。
（２）（１）の培養液を適宜希釈し、適切な培地に塗抹した後、適切な条件で培養することにより、（１）の培養液中の菌数を計測した。
（３）（１）の培養液を１０，０００×ｇで２０分間遠心した後、上清を除去し、細菌ペレットを得た。得られた細菌ペレットを−２０℃で保管した。
（４）（２）の培養終了後、計測した菌数に基づき、各細菌の菌数が１×１０６／ｍｌとなるよう、（３）の細菌ペレットを蒸留水で適宜希釈した。
（５）１０種類の細菌について、（４）で希釈した菌液を等量ずつ混合し、細菌数等量混合細菌液とした。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. The present invention is not limited in any way by the following examples.
[Example 1: Preparation of DNA solution using achromopeptidase and beads]
I) Preparation of Bacteria 10 kinds of bacteria generally easy to detect in food (Escherichia, Staphylococcus, Kocuria, Salmonella, Listeria, Bacillus, Pseudomonas, Clostridium, Lactobacillus, Leucos, and below) According to the procedure of 1)-(5), it mixed so that the number of bacteria might become an equal amount, and the bacteria liquid was prepared.
(1) About each bacterium, it culture | cultivated on the appropriate liquid culture medium and temperature conditions, and the culture solution was extract | collected in the logarithmic growth phase late stage.
(2) The number of bacteria in the culture solution of (1) was measured by appropriately diluting the culture solution of (1), smearing it on an appropriate medium, and culturing under an appropriate condition.
(3) After centrifuging the culture solution of (1) at 10,000 × g for 20 minutes, the supernatant was removed to obtain a bacterial pellet. The resulting bacterial pellet was stored at -20 ° C.
(4) After completion of the culture in (2), the bacterial pellet of (3) was appropriately diluted with distilled water so that the bacterial count of each bacterium was 1 × 10 6 / ml based on the measured number of bacteria.
(5) About 10 types of bacteria, the bacterial solution diluted in (4) was mixed in an equal amount to obtain a mixed bacterial solution having an equal number of bacteria.
ＩＩ）細菌ＤＮＡの抽出及び精製
上記Ｉで得られた細菌数等量混合細菌液について、以下の（i）〜（xi）の手順に従って、アクロモペプチダーゼ及びビーズによる前処理、及び、スピンカラムタイプのキットであるＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（ＴａＫａＲａ）を用いたＤＮＡ抽出を行った。
（i） 細菌数等量混合細菌液１ｍｌをマイクロチューブに入れ、１０，０００×ｇで１０分間遠心した後、上清を除去し、細菌のペレットを用意した。
（ii）アクロモペプチダーゼ（１，２００Ｕ／ｍＬ）１００μｌを（i）で得られた細菌のペレットに添加し、攪拌した後、５５℃で１５分間インキュベートした。
（iii）（ii）の処理後の溶液に、Ｂｕｆｆｅｒ Ｔ１ ８０μｌ， ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液２５μｌを添加し、攪拌した後、５６℃で１時間インキュベートして酵素処理済サンプルを得た。
（iv） ２．０ｍｌサンプルチューブにφ０．５ｍｍのジルコニアビーズ２００ｍｇを入れ、（iii）で得られたサンプルを加え、ビーズ式細胞破砕装置ＭｉｃｒｏＳｍａｓｈ（登録商標）（トミー精工）で、４,５００ｒｐｍの条件で３０秒間ビーズ破砕処理を行った。ビーズの容積／ビーズ以外の内容液の容積の比率は、１／７であった。ビーズ処理時の密閉容器中の内容積に対する当該容器の内容液（ビーズを含む）の容積の割合は１１容量％であった。
（v）（iv）の処理後のサンプルチューブに、ＲＮａｓｅＡ（２０ ｍｇ／ｍｌ）溶液２０μｌを添加し、室温で５分インキュベートし、撹拌した。
（vi）（v）で得られた懸濁液にＢｕｆｆｅｒＢ３ ２００μｌを添加し、撹拌したのち、７０℃で１０分間インキュベートした。
（vii）（vi）で得たマイクロチューブを１１，０００×ｇ、５分間遠心し、上清を回収し、ビーズを除去した。
（viii）（vii）で得た上清に１００％エタノール２１０μｌを添加し、混合した。
（ix） （viii）で得られた溶液をカラムに添加し、１１，０００×ｇ、１分間遠心した。ろ液除去後、ＢｕｆｆｅｒＢＷ ５００μｌをカラムに添加し、同一条件で遠心し、ろ液を除去した。ＢｕｆｆｅｒＢ５ ６００μｌをカラムに添加し、同一条件で遠心し、ろ液を除去した。再度同一条件で遠心し、カラムのメンブレンを乾燥させた。
（x） （ix）で得たカラムをマイクロチューブにセットし、７０℃に温めたＢｕｆｆｅｒＢＥ １００μｌを添加し、室温で１分間インキュベートして抽出ＤＮＡを溶出させた後、１１，０００×ｇで１分間遠心して、溶出したＤＮＡをマイクロチューブの底に集めた。
（xi） 上記（x）で抽出したＤＮＡをＤｙｅＥｘ２．０ ＳｐｉｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ＤＮＡ溶液を得た。
II) Extraction and Purification of Bacterial DNA Pretreatment with achromopeptidase and beads and spin column type according to the following procedures (i) to (xi) for the bacterial number equivalent mixed bacterial liquid obtained in I above DNA extraction was performed using NucleoSpin Tissue (TaKaRa).
(I) 1 ml of a mixed bacterial solution with the same number of bacteria was placed in a microtube, centrifuged at 10,000 × g for 10 minutes, the supernatant was removed, and a bacterial pellet was prepared.
(Ii) 100 μl of achromopeptidase (1,200 U / mL) was added to the bacterial pellet obtained in (i), stirred, and then incubated at 55 ° C. for 15 minutes.
(Iii) 80 μl of Buffer T1 and 25 μl of Proteinase K solution were added to the solution after the treatment of (ii), stirred, and then incubated at 56 ° C. for 1 hour to obtain an enzyme-treated sample.
(Iv) Place 200 mg of φ0.5 mm zirconia beads in a 2.0 ml sample tube, add the sample obtained in (iii), and use a bead-type cell crusher MicroSmash (registered trademark) (Tomy Seiko) at 4,500 rpm. The beads were crushed for 30 seconds under the conditions. The ratio of the volume of the beads / the volume of the content liquid other than the beads was 1/7. The ratio of the volume of the content liquid (including beads) in the container to the internal volume in the sealed container at the time of bead processing was 11% by volume.
(V) 20 μl of RNase A (20 mg / ml) solution was added to the sample tube after the treatment of (iv), and incubated at room temperature for 5 minutes and stirred.
(Vi) 200 μl of Buffer B3 was added to the suspension obtained in (v), stirred, and incubated at 70 ° C. for 10 minutes.
(Vii) The microtube obtained in (vi) was centrifuged at 11,000 × g for 5 minutes, the supernatant was collected, and the beads were removed.
(Viii) 210 μl of 100% ethanol was added to the supernatant obtained in (vii) and mixed.
(Ix) The solution obtained in (viii) was added to the column and centrifuged at 11,000 × g for 1 minute. After removing the filtrate, 500 μl of Buffer BW was added to the column and centrifuged under the same conditions to remove the filtrate. Buffer B5 (600 μl) was added to the column and centrifuged under the same conditions to remove the filtrate. Centrifugation was performed again under the same conditions, and the column membrane was dried.
(X) Set the column obtained in (ix) in a microtube, add 100 μl of Buffer BE warmed to 70 ° C., incubate at room temperature for 1 minute to elute the extracted DNA, and then add 1 at 11,000 × g. The eluted DNA was collected at the bottom of the microtube by centrifuging for minutes.
(Xi) The DNA extracted in (x) was purified using DyeEx2.0 SpinKit (QIAGEN) to obtain a DNA solution.
〔比較例１：アクロモペプチダーゼ及びビーズを用いないＤＮＡ抽出〕
（ii）〜（iv）の処理の代わりに、ＢｕｆｆｅｒＴ１ １８０μｌ，ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ溶液２５μｌを細菌のペレットに添加し、攪拌した後、５６℃で１時間インキュベートした。
その点以外は、実施例１と同様にして、ＤＮＡ溶液を得た。
[Comparative Example 1: DNA extraction without achromopeptidase and beads]
Instead of the treatments (ii) to (iv), 180 μl of BufferT1 and 25 μl of Proteinase K solution were added to the bacterial pellet, stirred, and incubated at 56 ° C. for 1 hour.
Except for this point, a DNA solution was obtained in the same manner as in Example 1.
実施例１及び比較例１で得たＤＮＡ溶液それぞれについて、以下の（ａ）〜（ｆ）の方法による評価を実施した。
〔評価方法〕
（ａ：ＰＣＲによる目的領域の増幅）
上記（x）で得たＤＮＡ溶液２．５μｌ、１２．５μｌの２×ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（ＫＡＰＡ）、１μＭの各プライマー５μｌを混合し、ＰＣＲ反応ミックスを調製した。９８℃２分の変性反応を実施した後、９８℃１０秒のＤＮＡ変性反応、６０℃１５秒のアニーリング反応及び６８℃１分のＤＮＡ伸長反応を含むサイクルを２５サイクル繰り返した後、７２℃５分で全てのＤＮＡ伸長反応を完了させ、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子における特定領域の増幅物（アンプリコン）を含む反応溶液を得た。この方法により、プライマーとして、図１に記載のプライマーを用い、これよりＶ１領域及びＶ２領域の両方を含む領域を増幅させた反応溶液を得たほか、この反応溶液とは別に、図２に記載のプライマーを用い、Ｖ３領域及びＶ４領域の両方を含む領域を増幅させた反応溶液を得た。
Each DNA solution obtained in Example 1 and Comparative Example 1 was evaluated by the following methods (a) to (f).
〔Evaluation method〕
(A: Amplification of target region by PCR)
PCR reaction mix was prepared by mixing 2.5 μl of the DNA solution obtained in (x) above, 12.5 μl of 2 × KAPA Hif Hot Start Ready Mix (KAPA) and 5 μl of each primer of 1 μM. After carrying out a denaturation reaction at 98 ° C. for 2 minutes, a cycle including a DNA denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds, an annealing reaction at 60 ° C. for 15 seconds and a DNA extension reaction at 68 ° C. for 1 minute was repeated 25 cycles, All the DNA extension reactions were completed in minutes, and a reaction solution containing an amplification product (amplicon) of a specific region in the 16S rRNA gene was obtained. By this method, the primer shown in FIG. 1 was used as a primer, and a reaction solution in which a region including both the V1 region and the V2 region was amplified was obtained. In addition to this, the reaction solution was shown in FIG. Thus, a reaction solution in which a region including both the V3 region and the V4 region was amplified was obtained.
（ｂ：精製）
上記（ａ）で得たＤＮＡ溶液をＡｇｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いて精製した。
(B: Purification)
The DNA solution obtained in the above (a) was purified using Agncourt AMPRE XP (BECKMAN COULTER).
（ｃ：インデックスの付加）
上記（ｂ）で得たＤＮＡ溶液５μｌ、２５μｌの２×ＫＡＰＡ Ｈｉｆｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（ＫＡＰＡ）、各５μｌのＮｅｘｔｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ１，２、１０μｌの蒸留水を混合し、ＰＣＲ反応ミックスを調製した。９５℃３分の変性ステップを実施した後、９５℃３０秒の変性反応、５５℃３０秒のアニーリング反応及び７２℃３０秒のＤＮＡ伸長反応を含むサイクルを８サイクル繰り返した後、７２℃５分で全てのＤＮＡ伸長反応を完了させた。付加するインデックスは、実施例１と比較例１との間で異ならせただけでなく、Ｖ１及びＶ２領域含む領域を増幅させた反応溶液と、Ｖ３及びＶ４領域を含む領域を増幅させた反応溶液との間でも異ならせた。
(C: Add index)
5 μl of the DNA solution obtained in the above (b), 25 μl of 2 × KAPA Hif Hot Start Ready Mix (KAPA) and 5 μl of Nextra XT Index Primer 1, 2 and 10 μl of distilled water were mixed to prepare a PCR reaction mix. After carrying out a denaturation step at 95 ° C. for 3 minutes, after repeating 8 cycles of a denaturation reaction at 95 ° C. for 30 seconds, an annealing reaction at 55 ° C. for 30 seconds and a DNA extension reaction at 72 ° C. for 30 seconds, To complete all DNA extension reactions. The index to be added is not only different between Example 1 and Comparative Example 1, but also a reaction solution in which a region including the V1 and V2 regions is amplified and a reaction solution in which a region including the V3 and V4 regions is amplified. And also made it different.
（ｄ：精製）
上記（ｃ）で得たインデックス付加後のＤＮＡを、上記（ｂ）に従って、精製し、精製後のＤＮＡ溶液を得た。
(D: Purification)
The index-added DNA obtained in (c) above was purified according to (b) above to obtain a purified DNA solution.
（ｅ：ＤＮＡのクオリティー確認及び希釈）
上記（ｄ）で精製したＤＮＡについて、ＭｕｌｔｉＮＡ（島津製作所）で増幅領域の長さを測定した。更に（ｄ）で得たＤＮＡ溶液において、Ｑｕａｎｔｕｓ（登録商標） Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で二本鎖ＤＮＡの濃度を測定した。ＤＮＡの濃度が４ｎＭとなるように１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）でＤＮＡを希釈した。
(E: DNA quality confirmation and dilution)
For the DNA purified in (d) above, the length of the amplification region was measured with MultiNA (Shimadzu Corporation). Further, in the DNA solution obtained in (d), the concentration of double-stranded DNA was measured with a Quantus (registered trademark) Fluorometer (Promega). The DNA was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) so that the concentration of DNA was 4 nM.
（ｆ：ＮＧＳ用サンプル調製及びＮＧＳ解析）
上記（ｅ）で濃度を測定したＤＮＡ溶液から、Ｎｅｘｔｅｒａ（登録商標） ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてサンプルを調製した。得られたサンプルを、Ｍｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）に供し１６Ｓメタゲノミクス解析を行った。データ解析には、Ｂａｓｅ Ｓｐａｃｅ（登録商標）を用いた。総リード数における特定属と判断されたリード数の割合を、その属の細菌の検出率とした。検出率は、Ｖ１及びＶ２領域を含む領域を増幅させたサンプルにおける検出率と、Ｖ３及びＶ４領域含む領域を増幅させたサンプルにおける検出率との平均値として求めた。
(F: NGS sample preparation and NGS analysis)
A sample was prepared from the DNA solution whose concentration was measured in (e) above using Nextera (registered trademark) XT DNA Library Preparation Kit (illlumina). The obtained sample was subjected to Miseq (illumina) for 16S metagenomic analysis. For the data analysis, Base Space (registered trademark) was used. The ratio of the number of leads determined to be a specific genus in the total number of leads was taken as the detection rate of bacteria of that genus. The detection rate was determined as an average value of the detection rate in the sample in which the region including the V1 and V2 regions was amplified and the detection rate in the sample in which the region including the V3 and V4 regions were amplified.
〔評価結果〕
実施例１及び比較例１のＤＮＡ溶液それぞれについて１６ＳｒＲＮＡ遺伝子アンプリコンのマルチプレックスシーケンスに供した解析結果を図３〜図５に示す。図３及び図４は、遺伝子解析により同定された属のうち検出率０．１％以上の細菌を抜粋し、それらの検出率を記載した表である。図５は、実際に添加した１０種の細菌について、実施例１及び比較例１の検出率を比較して示すグラフである。図４及び図５に示すように、比較例１のＤＮＡ溶液では、一部のグラム陽性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｋｏｃｕｒｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の検出率が２％以下であった。一方図３及び図５に示すように、実施例１のアクロモペプチダーゼ及びビーズによる処理を行うことで、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓは２．５倍、Ｋｏｃｕｒｉａは８．３倍、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓは２．５倍、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃは１．６倍まで検出率が向上した。特定酵素による溶菌及びビーズによる物理的破砕処理を行うことにより、ＤＮＡを抽出しにくい細菌の抽出効率が上昇し、検出率が向上したと考えられる。
１６ＳｒＲＮＡアンプリコンのマルチプレックスシーケンス解析においては、試料中に存在する未知の細菌を網羅的に検出することが求められる。本発明のＤＮＡ抽出法を用いることにより、実際に存在している細菌をより正確に検出することが可能になると考えられる。
なおＰＣＲ増幅領域の違い（Ｖ１−Ｖ２／Ｖ３−Ｖ４）は、解析結果に大きな影響を与えなかった。また図３及び図４には、実際に添加した菌と異なる菌名が検出されているが、ＰＣＲ増幅領域の塩基配列が近いため、正しく分類ができなかったものと考えられる。
〔Evaluation results〕
The analysis results of each of the DNA solutions of Example 1 and Comparative Example 1 subjected to the 16S rRNA gene amplicon multiplex sequence are shown in FIGS. FIG. 3 and FIG. 4 are tables in which bacteria with a detection rate of 0.1% or more are extracted from genera identified by gene analysis and their detection rates are described. FIG. 5 is a graph showing comparison of detection rates of Example 1 and Comparative Example 1 for 10 kinds of bacteria actually added. As shown in FIGS. 4 and 5, in the DNA solution of Comparative Example 1, the detection rate of some Gram-positive bacteria (Staphylococcus, Kocuria, Lactobacillus, Leuconostoc) was 2% or less. On the other hand, as shown in FIG. 3 and FIG. 5, the treatment with the achromopeptidase and the beads of Example 1 is performed, Staphylococcus is 2.5 times, Kocuria is 8.3 times, Lactobacillus is 2.5 times, and Leuconostoc is The detection rate improved to 1.6 times. It is considered that by performing lysis with a specific enzyme and physical disruption with beads, the extraction efficiency of bacteria that are difficult to extract DNA increased and the detection rate improved.
In multiplex sequence analysis of 16SrRNA amplicons, it is required to comprehensively detect unknown bacteria present in a sample. By using the DNA extraction method of the present invention, it is considered possible to more accurately detect actually existing bacteria.
The difference in PCR amplification region (V1-V2 / V3-V4) did not significantly affect the analysis results. In addition, in FIG. 3 and FIG. 4, a bacterial name different from that actually added was detected, but it is considered that classification was not correctly performed because the base sequence of the PCR amplification region was close.
Claims (7)
前記ＤＮＡ溶液の調製に際し、前記試料に対して、以下の処理（Ａ）及び処理（Ｂ）を行う、ＤＮＡ抽出法。
（Ａ）アクロモペプチダーゼで処理することにより、試料中の細菌を溶菌する。
（Ｂ）ビーズで処理することにより、試料中の細菌を物理的に破砕する。 A DNA extraction method for extracting a bacterial DNA in a sample and preparing a DNA solution for use in a multiplex sequence of a 16S rRNA gene amplicon,
A DNA extraction method in which the following treatment (A) and treatment (B) are performed on the sample when preparing the DNA solution.
(A) Bacteria in the sample are lysed by treatment with achromopeptidase.
(B) The bacteria in the sample are physically disrupted by treating with beads.
前記試料に対して、以下の処理（Ａ）及び処理（Ｂ）を行ってＤＮＡ溶液を調製し、該ＤＮＡ溶液におけるＤＮＡを鋳型として、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子におけるユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲ反応に供することにより、アンプリコンを得、得られたアンプリコンをマルチプレックスシーケンスに供する、細菌の検出方法。
（Ａ）アクロモペプチダーゼで処理することにより、試料中の細菌を溶菌する。
（Ｂ）ビーズで処理することにより、試料中の細菌を物理的に破砕する。 A method for comprehensively detecting bacteria in a sample,
The sample is subjected to the following treatment (A) and treatment (B) to prepare a DNA solution, and subjected to a PCR reaction using a universal primer in the 16S rRNA gene using the DNA in the DNA solution as a template, A method for detecting bacteria, which comprises obtaining an amplicon and subjecting the obtained amplicon to a multiplex sequence.
(A) Bacteria in the sample are lysed by treatment with achromopeptidase.
(B) The bacteria in the sample are physically disrupted by treating with beads.
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