JP2017535750A - 妊娠の予後を提供する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、サンプルを直接質量スペクトル解析にかけることを含む妊娠の予後を提供する、および前記解析からもたらされた結果を５件の正常な妊娠から得られたサンプルから生成されたスペクトルと比較する方法に関する。本発明は、母体の体液および／または胚が培養された、または中に保たれている液体のサンプルを直接マトリクス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析法にかけること、ならびに２，０００および１００，０００ｍ／ｚの間での質量スペクトルの検出を特徴とする。スペクトルのプロファイルにおける変化につながる、質量スペクトルの変化は、胎児発達および１０妊娠の障害の特徴である。

Description

本発明は、サンプルを直接質量スペクトル解析にかけることを含む、妊娠の予後を提供する方法、および前記解析によるスペクトルと正常な妊娠から得られたサンプルから生成されたスペクトルとを比較する方法に関する。本発明は、母体の体液および／または胚が培養された、または中に保たれている液体のサンプルを直接マトリクス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析法にかけること、ならびに２，０００および１００，０００ｍ／ｚの間での質量スペクトルの検出を特徴とする。スペクトルのプロファイルにおける変化につながる、質量スペクトルの変化は、胎児発達および妊娠の障害の特徴である。

母体胎児の健康（産科ケア）は、多くの世界の国家医療サービスの中心である。子癇や胎児異常／ジストレスのような、妊娠の合併症による補助医療から緊急出産まで妊娠の増加する医療化は、その予算のかなりの割合がマタニティおよびリプロダクティブヘルス（Ｍａｔｅｒｎｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｈｅａｌｔｈ）に費やされていることを意味する。例えば英国において、国家の医療サービス予算（２０１０／１１において３４．４億ポンド）の３．２％が、今や補助医療と産科ケアとに費やされている。

感情的および財政的な観点から（合併症の妊娠および出産には、平穏無事な妊娠の１０〜１００倍の費用が個々の世帯にかかる）、新生児が「正常」、進行中および「無事」であるかどうかを検査することは、現在医療サービスに期待することである。過去５０年間の医療におけるＧＤＰ支出の増加は、一つは現在産科と関連するものを含む増加する検査によるものである。このような検査の精度向上と並んで、ほとんど無視されているコストの指数関数的な上昇がある。現在、高い効果があるが、国民健康サービス、健康保険会社または個人であるエンドユーザーへの値ごろ感がある妊娠スクリーニング検査を開発する必要がある。

妊娠性絨毛性疾患（Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）
妊娠性絨毛性疾患（ＧＴＤ）は、多くの場合、実際は癌であるが、追加の臨床的特徴、形態学的特徴および時に病状のスペクトルを伴う妊娠の考慮される形態でもありうる、広範囲の妊娠関連疾患をカバーする。ＧＴＤは、ヒポクラテスにより紀元前４００年ごろに最初に記述され、最終的には１８９５年に妊娠と関連付けられた。ＧＴＤは、侵入奇胎、絨毛腫および稀な胎盤部トロホブラスト腫瘍（ＰＳＴＴ）などの完全および部分的な胞状奇胎または悪性症例の前がん状態の疾患として存在する。悪性のＧＴＤは、妊娠性絨毛性腫瘍または新生物（ＧＴＴまたはＧＴＮ）ということができる。ＧＴＤの初期の兆候は、膣出血および嘔吐を含む。しかし、妊娠性絨毛性腫瘍を患う女性は、特に、胎盤部トロホブラスト腫瘍において、より重篤な異常膣出血、および無月経を示す。

正常な妊娠の場合、ｈＣＧ検査は、ＧＴＤの診断およびモニタリングの大部分を占める。多くの産科医のために、（超音波により確認されるような）正常な妊娠ではない場合、積極的な妊娠検査が潜在的なＧＴＤを直ちに示す。いくつかの場合、特に絨毛腫では、腫瘍は、非常に侵襲的であり、がん専門医による迅速な介入が患者の生存の機会を保持するために不可欠である。

しかし、ｈＣＧ検査および超音波のみでのＧＴＤのマネジメントは、ＧＴＤのスペクトル内の多様で複雑な疾患の全体像を提供するには不十分である。問題は、検出しうるｈＣＧの形態を識別（または多くを識別）しないｈＣＧアッセイにおいて既に明らかであり、場合によっては、偽陽性および偽陰性が誤診および不必要な治療につながっている。これらの問題は、各アッセイにおいて認識されるエピトープに関して、ｈＣＧアッセイのより良い定義を導いているが、ｈＣＧ変異体の産生をもたらす代謝の違いの根底にある根本的な問題を避けていない。ｈＣＧ形態が総ｈＣＧの絶対量よりも重要であることが示唆されている。この定性的な問題には、定性的な解決策が必要である。

妊娠悪阻（Ｈｙｐｅｒｅｍｅｓｉｓ Ｇｒａｖｉｄａｒｕｍ）
妊娠悪阻は、妊娠における持続的嘔吐として定義され、ケトーシス、低カリウム症および脱水症を伴う、体重の減少（ＡＯＣＧにより定義されるように、米国では体重の＞５％、またはＲＣＯＧにより定義されるように、英国では体重の＞１５％）をもたらす。したがって、単に初期の妊娠に伴うよく知られた「悪阻」の誇張された形態ではない。特に甲状腺機能での、血液量減少および代謝の異常は、母親および発達中の胎児両方に対して潜在的に生命を脅かす。一方、軽度および自己限定性の吐き気および嘔吐（悪阻）の経験は、妊娠中のすべての女性の８０％によくある出来事である。

妊娠悪阻の早期診断は、潜在的な有害性のため臨床的に重要であり、管理しないことでこれらの症状が著しく悪化するように、胎児の喪失をもたらし、場合によっては母親の死亡をもたらす。妊娠悪阻の死亡率は、かなりのものであり、点滴による水分補給の治療の導入前では、百万人の出生あたり１５９人の高さであった。米国において、悪性悪阻の発生率は、英国よりもはるかに高く、年間３８，０００人の女性が入院となる。

静脈内輸液および電解質置換、チアミン補給ならびに心理的支援などの治療法を含む、症候的なアプローチに基づく管理とともに、悪性悪阻への普遍的に認められた説明または治療はない。それにもかかわらず、疾患の早期発見および治療介入は、管理を改善すると見られ、これに関して生化学的マーカーは、有用であろう。

直接的なつながりはまだ証明されていないが、ｈＣＧが妊娠中の悪性悪阻の最も可能性が高い原因であろうことがしばしば示唆されている。これはｈＣＧレベルが予想外に高くなる傾向にある悪性悪阻の危険性がある女性の場合においてとりわけ正しい。より以前の研究は、検査された悪性悪阻のケースの３６％において、ｈＣＧレベルが正常値の９７．５パーセンタイルを超えていたことを明らかにした；しかし、単純に高ｈＣＧであることが必ずしも悪性悪阻に一致するとは限らない。

悪性悪阻に関連する、生化学的甲状腺機能亢進症は、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体とアゴニスティックなｈＣＧ交差反応に関連するメカニズムに寄与しており、甲状腺機能亢進症のリスク因子に特定されている。ＴＳＨおよびｈＣＧ両方のアルファサブユニットは同一であるので、これらは、特に高い血中濃度である程度のアゴニスト効果を有する。ｈＣＧのこのような甲状腺刺激効果は、悪性悪阻の主な症状である、重篤な嘔吐および吐き気として現れることが知られており；非常にそのようであるのため、歴史的に甲状腺機能検査は、妊娠診断および患者管理における決定要因であった。さらに、ｈＣＧの酸性アイソフォームは、重篤な嘔吐および吐き気の遷延化したケースにおける原因因子であると推測されている。根本的な説明では、ｈＣＧの酸性アイソフォームは、追加のシアル酸リッチなグリコシル化の存在により、ホルモンのより長い循環半減期、よって記載の甲状腺刺激効果の悪化を促進するということである。重要なことに、最近の研究は、悪性悪阻におけるｈＣＧの関与が単に定性的であるよりむしろ構造的であり、ｈＣＧの甲状腺刺激の形態が示唆されていることを示した。

子癇前症（Ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ）
子癇前症は、高血圧および尿中の多量のタンパク質を特徴とする妊娠の疾患である。これは、肝機能障害、腎臓機能障害、肺水腫、ならびに神経学的および視覚的障害を引き起こすであろう。処置をしなければ、子癇前症は、子癇と呼ばれる、妊娠中に生命を脅かす発作の発生へと発展するであろう。検出されたとしても、初期の子癇前症は、複数の母体および胎児の副作用に関連している。全世界の妊娠の２〜８％に影響を与え、最も一般的には３２週後であるが早ければ妊娠の２０週から発症するであろう。３２週以前に発症した子癇前症は、早期発症とみなされ、罹患率の上昇と関連する。ほとんどのケースでは、予定日より前に診断され、胎児と胎盤との分娩が唯一知られている子癇前症の治療である。

子癇前症の発症機序は、異常な胎盤形成が強い素因であるが、決定されていない。母体の免疫応答を含む多くの寄与および関連因子がある。子癇前症の影響の中心は、子宮胎盤の低酸素症、血管新生および抗血管新生タンパク質におけるアンバランス、酸化ストレス、母体の血管内皮機能不全、ならびに高い全身性炎症の結果として生じる存在である。疾患の多因子的性質を考えると、子癇前症を常に予測することは未だにできない。

多胎妊娠（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）
多胎妊娠は、双子、三つ子、四つ子などのように、女性が一つより多くの胚または胎児を妊娠している場合、発生する。多胎妊娠を見つけることは、通常超音波による複数の胎嚢の証明後、妊娠の１０〜１３週において確証される。妊娠の疾患を示すプロテインマーカーの分析は、数十年にわたり使用されているが、血清および尿のプロテオーム解析は、特に双子を確認する比較的新しいアプローチである。

自然流産（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｂｏｒｔｉｏｎ）または流産（ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ）
自然流産（流産としても知られている）は、妊娠初期の一般的な合併症であり、胚または胎児が妊娠の最初の２０週以内に自然死する場合、発生する。妊娠していることを知っている女性のうち、流産率は、約１０％から２０％であり、一方すべての受胎における割合は、約３０％から５０％である。約５％の女性は、連続して２回流産するが、女性は、複数流産することもある。このことについて早期に知ることは、産科医に介入する機会を提供でき、死産のリスクを潜在的に減少できる。

胚／妊娠早期
ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）は、胚発生において最も広く研究されているマーカーの一つである。産科のマーカーとして世界的に使用されているにもかかわらず、ｈＣＧは、その後に続くプロゲステロン産生の維持を通じて母体妊娠認知のシグナルに過ぎないものとしてしばしば見なされる。ｈＣＧ分子は、グリコシル化の程度および代謝低下のステージに寄与するいくつかのアイソフォームを有し、そのうちいくつかは、「正常な」ｈＣＧの機能とは異なるより特異的な機能を現在有するであろう。正常または規則的または完全なままのｈＣＧ（頻繁に言及され、その後本実施例においてｈＣＧとして示されるように）、妊娠中トロホブラストにより産生されるｈＣＧの主たる形態であり、ｈＣＧαとｈＣＧβとのサブユニットからなるヘテロダイマーである；しばしばベータｈＣＧとして誤って呼ばれており、分類を必要とする本実施例の目的のために、ｈＣＧのベータサブユニットは、はっきりと区別される。

高度にグリコシル化されたｈＣＧ（ｈＣＧｈまたは侵襲的トロホブラスト抗原（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＩＴＡ）は、妊娠中、特に妊娠初期までに産生されたｈＣＧの形態である。ｈＣＧβは、ｈＣＧの解離を通じてまたはｈＣＧαの不在下における異所性発現を通じて生じるｈＣＧβサブユニットの遊離型である。培養において胚の発生によるｈＣＧの発現および生産について多くの研究があるが、特定のｈＣＧ異性体の産生を特定の機能または機能不全と関連付けたものはほとんどなく、ただ最近になって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＣＧ濃度の変動性が着床の可能性のマーカーとなりうることが示唆されている。いくつかの研究は、ｈＣＧｈそのままを測定することが流産の正確な予測を提供しうることを示唆している。他にも、ｈＣＧｈが高い精度で着床の日での妊娠が失敗することに対して、満期妊娠を同定するために使用できることを報告していた。したがって、妊娠の潜在的な失敗から成功した妊娠と区別するためにこのｈＣＧ異性体を同定することは有益でありうる。また、初期胚のプロテオミクス、セクレトーム、および代謝プロファイリングと成功した着床率との間に相関があることも指摘されている。したがって、セクレトームにおけるｈＣＧ異性体プロファイリングは、特に非侵襲的な方法で、生存能力のある胚の同定のためのカギになりうる。最近の研究が着床を予測するための幾つかの代謝および生化学的マーカーを示唆しているにもかかわらず、いかなる臨床的価値もまだ見出されていないことを考慮すると、これは重要である。

ＵＳ２００９／００７５２９３は、サンプル中のｈＣＧの分子異性体のような１以上の妊娠関連マーカーの有無を同定することにより胚の生存可能性を予測する方法を記載している。高品質の胚は、ＣＲＡｂタンパク質の異性体であると考えられる、分子量９１４９〜９１５７の範囲におけるタンパク質を利用／代謝する胚の能力に基づいて低品質の胚と区別された。サンプルは、分析の前に、ＤＤＴによる処理およびアルブミンの除去により、処理された。前記方法は、特定のタンパク質の有無を同定することに基づいている。本発明の方法は、特定のたんぱく質の同定を必要としない。本発明は、健康な進行中の妊娠からの同等のサンプルから得られたスペクトルと比べて、スペクトルの全体のプロファイル、または特定の領域における変化を探す。

本明細書の方法は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析などの直接質量スペクトル解析にかけて、妊娠女性から得られたサンプルの迅速なスクリーニングを特徴とする。また、補助生殖技術の処置中培養における胚を取り囲む液体（緩衝食塩水、胚盤胞培養培地）の分析も、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析などの直接質量スペクトル解析により、同様に分析される。分析は、サンプルまたは次のような、例えば脱イオン蒸留水またはその他の適切な希釈剤中の希釈物について直接行われるであろう。任意に、例えば蒸留脱イオンＨ_２Ｏまたは０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）蒸留脱イオンＨ_２Ｏでの１／２から１／１０００の範囲での希釈は、濃縮サンプルに必要でありうる。結果として得られるスペクトルは、少なくとも２０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚ、またはそれ以上の質量／電荷範囲で荷電イオンとして分析される。特定のピークの有無とは対照的に、全体、もしくは特定の領域またはその組み合わせでのスペクトルのプロファイルにおける変化は、健康な進行中の妊娠からの同等のサンプルから得られたスペクトルと比較される。これは、妊娠の予後を提供する。いかなる特定の公知のタンパク質を探すこと、またはプロファイルの変化を引き起こすたんぱく質を同定することを必要としない。

本発明は、サンプルを直接質量スペクトル解析にかけることを含む、妊娠の予後を提供する方法を提供する。前記方法によるスペクトルは、正常な妊娠から得られたスペクトルと比較することができる。

「直接質量スペクトル解析」とは、質量スペクトル解析から生成されたデータが前記方法で用いられること、およびサンプルに存在する成分の推定質量ではないことを意味する。

サンプルは、妊娠女性から得られたサンプル、または胚を取り囲む培養物および／または保管媒体のサンプルでありうる。

本明細書において、「胚（ｅｍｂｒｙｏ）」は、受精後のいかなる細胞または細胞のグループを意味するが、子宮内への移植の前である。受精卵、割球、桑実胚、および胚盤胞を含む。

本明細書において、「妊娠の予後（Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｆｏｒ ａ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」は、胚の着床がうまくいく可能性を予測すること、および可能性を診断または予測することを意味し、つまり妊娠の疾患を患うまたは多胎妊娠である妊娠女性の予後を提供することである。本発明の方法は、染色体異常を有する胚を検出するために使用することもできる。妊娠の予後は、成功した進行中の妊娠または流産でありうる。本明細書において、「進行中の（ｏｎｇｏｉｎｇ）」妊娠は、予定日へと進むことが期待され、生児出生をもたらす正常な妊娠である。本明細書において、「妊娠の失敗（ｆａｉｌｉｎｇ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」は、生化学的妊娠、または自然流産（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ａｂｏｒｔｉｏｎ）／流産（ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ）、反復流産（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｍｉｓｃａｒｒｉａｇｅ）をもたらす妊娠を意味する。

本方法は、妊娠の疾患の予後および／または診断、ならびに多胎妊娠の予後を提供するために使用することができる。これらの方法のために、サンプルは、妊娠女性から得られる。本明細書において、「妊娠の疾患（ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」は、子宮外妊娠、生化学的妊娠（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）、早期流産（ＥＰＬ）、切迫流産、自然流産または流産、妊娠悪阻および妊娠性絨毛性疾患、胎盤機能不全、子癇前症、妊娠性糖尿病、前置胎盤、癒着胎盤、穿通胎盤、妊娠時胆汁鬱滞（Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃ Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）、ならびに正常および生殖補助の両方における反復流産を含む。妊娠性絨毛性疾患は、奇胎妊娠、絨毛腫、および胎盤トロホブラスト腫瘍（ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｔｕｍｏｕｒ）（ＰＳＴＴ）を含む。本明細書において、用語「妊娠の疾患（ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｏｆ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」は、女性から得られたサンプル（すなわち、胚培養液体サンプルではない）を意味する場合、胎児異数性（ｆｅｔａｌ ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ）のような胎児内部の状態を除く。

本発明の方法は、サンプルを得た際、子宮内妊娠、切迫流産、妊娠悪阻および妊娠性絨毛性疾患、ならびに多胎妊娠のような、すでに述べた妊娠の疾患のためのスクリーニング方法を提供する。本発明の方法はまた、胎盤機能不全、子癇前症、妊娠性糖尿病、妊娠時胆汁鬱滞、反復流産、ならびに正常および生殖補助の両方における自然流産のような、一般的には妊娠後期に生じるその他の妊娠の疾患（すなわち、サンプル採取後）を患うリスクの兆候を提供する。したがって、本方法は、診断的および予後的価値を有する。好ましくは、妊娠の疾患は、子癇前症、妊娠悪阻、または妊娠性絨毛性疾患から選択される。一実施形態において、妊娠の疾患は、妊娠性絨毛性疾患ではない。好ましくは、本方法は、多胎妊娠または自然流産の予後を提供するために用いられる。

本明細書において、「多胎妊娠（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）」は、女性が双子、三つ子、四つ子、五つ子などのような、複数の胚または胎児を身ごもっている妊娠を意味する。

本明細書において、「生化学的（ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）」妊娠は、妊娠テストが陽性結果をもたらすが、胚が適切に着床できず、進行中の妊娠とはならない状態を意味する。

妊娠女性から得られたサンプルは、体液サンプルである。体液は、脳脊髄液、精液、膣液、間質液、組織吸引物（ｔｉｓｓｕｅ ａｓｐｉｒａｔｅｓ）、唾液、ならびに朝起きてすぐの尿および中間尿サンプルなどの尿、血液および血清を含む。前記サンプルは、スポットカードサンプル（ｓｐｏｔ ｃａｒｄ ｓａｍｐｌｅ）、例えば尿または血液スポットカードサンプルであってもよく、前記サンプルは、ろ紙またはその他の捕捉材料につけられ、将来の分析のために乾燥して保存できる。血液サンプルは、通常の瀉血法を用いて採取された全血サンプルでありうる。例えば、サンプルは、静脈穿刺を使ってまたは指腹での採血もしくはヒールプリックなどのピンプリックサンプルとして得ることができる。血液サンプルは、ろ紙またはその他の適切な血液スポット捕捉材料で捕捉された乾燥血液スポットでもよい。好ましくは、サンプルは尿サンプルである。

女性からのサンプルは、妊娠中どの時点であっても得ることができる。好ましい一実施形態において、サンプルは、妊娠初期、例えば妊娠４〜１３週、好ましくは妊娠６〜１１週、５〜７週および／または８〜１１週において対象者から得ることができる。サンプルは、妊娠中期以後、すなわち妊娠１４週以降、好ましくは１６〜３５週、より好ましくは１８〜３０週に得ることができる。

また、本方法は、補助医療により提供された、培養胚の成功した着床またはアウトカムなどの妊娠の予後を与えるために使用することができる。本方法は、進行中の妊娠または自然流産（流産）、生化学的陽性妊娠などの流産が後に続く、成功した移植のための予後を与えること、ならびに胚における染色体異常を検出することができる。本方法は、補助生殖技術の処置中培養において胚を取り囲む液体（緩衝食塩水、胚または胚盤胞培養媒体など）のサンプルにおいて実施することができる。これは、胚が保管または凍結される液体を含む。また、胚そのものから培養媒体で生じるいかなる液体、例えば胚盤胞の孵化後のものを含む。サンプルは、移植に先立ち、いかなる時点においても採取することができる。好ましくは、サンプルは受精後３〜５日に採取される。サンプルは、胚盤胞形成前または後のどちらか一方で採取することができる。サンプルは、レシピエントへ移植するすぐ前、すなわち０．５〜１２時間前に採取することができる。

本明細書において、「染色体異常（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ）」は、細胞が正常な染色体数、例えばヒトでは４６から変化しているいかなる状態をも意味する。これらは、ダウン症候群、パトー症候群、ターナー症候群、クラインフェルター症候群、エドワーズ症候群、および２３番染色体以外の致命的なトリソミーはもちろんトリプルＸなどの、胎児の異数性を含む。

サンプル（母親または胚培養の液体）は、純サンプル（ｎｅａｔ ｓａｍｐｌｅ）でありうる。また、サンプルは、希釈または処理（濃縮、フィルター処理など）されうる。

好ましくは、サンプル（母親または胚培養の液体）は、希釈される。サンプルは、１／２（すなわち、１部の希釈剤に１部のサンプル）、１／５、１／１０、１／１００、１／２００、１／５００、１／１０００、１／２５００またはそれ以上に希釈されうる。もっとも好ましくは、サンプルは、１／１０００、すなわち１０００部の希釈剤に１部のサンプルとなるように希釈される。好ましくは、希釈剤は、水または０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）蒸留脱イオンＨ_２Ｏ、より好ましくは蒸留脱イオン水である。

サンプルをスポットカードまたは血液スポット捕捉材料に保管した場合、適切なバッファー、または希釈剤を用いて再構成することができる。好ましくは、希釈剤は、水または０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）蒸留脱イオンＨ_２Ｏ、より好ましくは蒸留脱イオン水である。

好ましくは、サンプル（母親または胚培養の液体）は、希釈の前に処理されない。このような処理は、興味あるタンパク質、例えばｈＣＧを濃縮すること；例えばＨＰＬＣによりｈＣＧを単離すること、汚染タンパク質、例えばアルブミンの除去、プロテアーゼ、例えばトリプシン消化、または分子内結合を崩壊または破壊するための化学物質での処理を含む。特に、サンプルは、還元剤で処理されないことが好ましい。より好ましくは、サンプルは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処理されない。尿サンプルの場合、サンプルは、ＤＴＴで処理されないことが好ましい。

直接質量スペクトル解析中、スペクトルは、マトリクスを用いて生成される。適切なマトリクス化合物は、シナピン酸、フェルラ酸（ＦＡ）およびアルファ４−シアノヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を含む。特徴的な分離質量ピークの強度は、特定のｍ／ｚ値の範囲として測定される、または比が特定のｍ／ｚピークの相対存在量を決定する。スペクトルは、１０００ｍ／ｚから１００，０００ ｍ／ｚの範囲にわたり分析される。好ましい範囲は、２０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚ、４，０００ｍ／ｚ〜３５，０００ｍ／ｚ、４，０００ｍ／ｚ〜８０，０００ｍ／ｚ、１０，０００ｍ／ｚ〜７５，０００ｍ／ｚ、７０，０００ｍ／ｚ〜８０，０００ｍ／ｚ、２，０００ｍ／ｚ〜１４，０００ｍ／ｚ；６，０００ｍ／ｚ〜１４，０００ｍ／ｚ、６，０００ｍ／ｚ〜８，０００ｍ／ｚ、１２，０００ｍ／ｚ〜５０，０００ｍ／ｚ、２０，０００ｍ／ｚ〜５０，０００ｍ／ｚ；２２，０００ｍ／ｚ〜２６，０００ｍ／ｚ；３０，０００ｍ／ｚ〜４０，０００ｍ／ｚ；および３５，０００ｍ／ｚ〜４０，０００ｍ／ｚまたはその組み合わせを含む。スペクトルは、全体として分析することができる、または１以上の部分的な範囲、もしくは領域、例えば２，０００ｍ／ｚから１６，０００ｍ／ｚ、および７０，０００ｍ／ｚ〜８０，０００ｍ／ｚを分析することができる。トムソンユニット（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｕｎｉｔｓ）（Ｔｈ）は、それ自体がｋＤａにおける質量に比例する質量：電荷（ｍ／ｚ）の領域を同定する。

ピークのクラスターは、図１に示すように、尿において見られる。

２，０００ｍ／ｚから６，０００ｍ／ｚ−トリプシン阻害剤の代謝から生じ、大部分であるが独占的ではない。

６，０００ｍ／ｚから１４，０００ｍ／ｚ−ヒト絨毛性ゴナドトロピンのベータコア代謝物から生じ、大部分であるが独占的ではない。

１４，０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚ ｈＣＧならびにそのアルファおよびベータサブユニットの分子変異体であり、大部分であるが独占的ではない。

胚培養液体において一般的にみられるピークは、図４（および９）に示すように、異なる妊娠アウトカムの間で異なる。

ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳを含む質量分析法などの、質量スペクトルを生成する方法は、通常、定量的な技術ではない。例えば、これらのスペクトルのＹ軸は、スペクトル内の質量ピークの「相対強度」の指標であるが、一つのサンプルともう一つのサンプルとの質量ピーク間のものではない。これを克服するために、正規化は、Ｙ軸の値をサンプルスペクトル間で比較可能にする必要がある。したがって、直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルは、好ましくは正規化される。スペクトルは、データ処理をされ、質量スペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標（ｎｏｒｍａｌｉｓｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｉｎｄｅｘ）となる。これは、定性的な質量スペクトルを定量的な値に変換する。正規化は、データの繰り返しおよび不一致を減少するためのデータ構造を生成する処理である。いくつかの正規化技術が可能である。典型的な正規化方法は、与点での総面積のパーセンテージ、二乗差および差の比を含む。パーセンテージ差は、以下のように計算される。

この際、Ｙｒｅｆは、スペクトルの最小の測定されたＹ値であり、Ｙ１は、各点のＹ値である。

二乗差は、以下のように計算される。

比の差は、以下のように計算される。

したがって、質量スペクトルからのデータは、スペクトルに示される定性的変化の定量的尺度を提供するために操作（正規化）される。

好ましくは、スペクトルモデルは、データ処理の方法により製作され、設定された範囲内での質量スペクトルの相対的割合の正規化された統計的に決定された指標となる。このことは、任意の与えられた質量値での平均値および百分率の変動がモデル化されうるように、全てのスペクトルを比較可能にする。

規定範囲内での質量スペクトルの相対的割合の正規化された統計的に決定された指標は、興味のある規定エリアまたはその組み合わせ、例えば２０００〜１４０００ｍ／ｚ；６０００〜１４，０００ｍ／ｚ；１２，０００ｍ／ｚ〜５０，０００ｍ／ｚ、３０，０００ｍ／ｚ〜４０，０００ｍ／ｚおよび１４，０００から１００，０００ｍ／ｚにおける質量スペクトルの曲線下の全面積を用いることから計算することができる。その後、これは、特定の疾患である患者からのサンプルにおいて変化する質量領域の相対強度を計算するために使用することができる。

質量スペクトルの曲線下の面積は、質量スペクトルを所与の値のｍ／ｚの多くの瓶に分割することにより計算される。本明細書中、「瓶」は、通常の統計的意味を有し、例えば統計分析においてデータがソートされた一連の数値範囲の一つである。例えば、瓶は、１００ｍ／ｚ、５０ｍ／ｚ、２５ｍ／ｚ、１０ｍ／ｚまたは５ｍ／ｚのサイズでありうる。使用される瓶のサイズが小さいほど、方法がより洗練される。スペクトル内での興味のある２以上の領域が分析された場合、異なるサイズの瓶が各領域のために使用することができる。例えば、１，０００〜１０，０００ｍ／ｚの範囲は、１０ｍ／ｚ瓶を用いて分析された１４，０００〜１００，０００ｍ／ｚの範囲と共に５ｍ／ｚ瓶を用いて分析することができる。

相対強度（Ｙ軸値）は、「二乗差（ｓｑｕａｒｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）」法により計算することができ、よって比較可能なＹ値が全ての瓶に与えられる。この方法において、スペクトルの最小のＹ値（Ｙｒｅｆ）をすべての瓶でのＹ値から減算して、差を二乗した。二乗差を計算するのに使用される式＝（ｙ１−ｙｒｅｆ）^２および計算された二乗差を「相対強度」と名付けた。

サンプルにおける各質量瓶での相対強度は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）、Ｓｔａｔｓ Ｄｉｒｅｃｔ（登録商標）およびＯｒｉｇｉｎ ８（登録商標）などの市販の統計的検定を用いて捕捉できる。

好ましくは、各サンプルは、標準スペクトルモデルと比較される。「標準スペクトルモデル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｍｏｄｅｌ）は、健常な妊娠で得られたサンプルの回収物の統計分析から決定された、設定範囲内での期待質量である。本明細書において、「正常で健康な（ｎｏｒｍａｌ ｈｅａｌｔｈｙ」妊娠女性は、妊娠疾患ではない女性である、または培養胚の成功した移植後で進行中の妊娠である女性である。好ましくは、期待質量の標準スペクトルモデルは、一致する妊娠期間においてサンプルの回収物の統計分析から決定される。サンプルは、同じサンプルタイプから生成された標準スペクトルと比較され、例えば培養液体サンプルは、母親のサンプルではなく、胚培養液から生成された標準スペクトルと比較され、逆の場合も同じである。質量変化、相対強度の増加もしくは減少、または標準スペクトルと比べてサンプルスペクトルにおける２以上のピークの間での相対強度の比の変化などの、あらゆる変化は、妊娠の予後における変化の指標でありうる。例えば、妊娠疾患に関連しているピークの相対強度における増加は、妊娠疾患の存在の指標でありうる。好ましくは、範囲は、約５００ｍ／ｚ〜１００，０００ｍ／ｚの間であり、例えば１，０００ｍ／ｚ〜７５，０００ｍ／ｚ、２，５００ｍ／ｚ〜５０，０００ｍ／ｚ、５，０００ｍ／ｚ〜２５，０００ｍ／ｚ、６，０００ｍ／ｚ〜１４，０００ｍ／ｚもしくは１２，０００ｍ／ｚ〜５０，０００ｍ／ｚまたはその組み合わせである。もっとも好ましくは、前記範囲は、６，０００ｍ／ｚ〜１４，０００ｍ／ｚである。好ましくは、期待質量のスペクトルモデルは、同じタイプのサンプル、例えば一致する妊娠期間または胚齢における母親または胚培養の液体の収集物の統計分析から決定される。

好ましくは、スペクトルモデルは、データ処理の方法により作製され、設定範囲内での質量スペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標となる。このことは、任意の所与の質量値での平均値および百分率の変動がモデル化されうるように、全てのスペクトルを比較可能にする。

好ましくは、上記設定範囲内での質量スペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標から生成された、パラレルな「疾患」モデルは、妊娠疾患を患う妊娠女性、またはうまく着床できなかった胚からの培養液体サンプルから得られたサンプルから作製される。サンプルからのスペクトルは、その後同じタイプのサンプルから生成された疾患モデルと比較することができる。妊娠疾患または着床しにくい胚に関連する質量またはピークの変化の存在は、妊娠疾患または着床および／もしくは妊娠の予後不良の指標でありうる。

スペクトルがデータ処理の方法を受け、質量スペクトルの相対的比率の正規化された統計的に決定された指標をもたらす時点で、いかなる有意な質量変化は、所与の疾患または診断的有用性に起因しうる。

標準スペクトルモデルおよび疾患モデルは、その後「ホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔｓ）」、すなわち２つのモデルの間のポイントまたは領域の違いを同定するためにプロットすることにより比較される（例えば、図４に示される）。これは、ピークのサイズにおける減少もしくは増加、またはピークの出現でありうる。ポイントの違いは、その後妊娠の予後を決定するために使用することができる。これは、適切なアルゴリズムを用いて行うことができる。

さまざまな状態における分析のための好ましい範囲およびその組み合わせを以下に示す。

妊娠性絨毛性疾患（ＧＴＤ）：３５，０００〜４５，０００ｍ／ｚ、好ましくは３７，６００〜３９，６００ｍ／ｚ。

悪性悪阻：２２，０００〜４０，０００ｍ／ｚ；好ましくは１１，０００〜２６，０００ｍ／ｚ、および／または３２，５００〜３４，５００ｍ／ｚ、および／または３５，０００〜３７，０００ｍ／ｚおよび／または３７，５００〜４０，０００ｍ／ｚ。

子癇前症：２，０００〜１００，０００ｍ／ｚ；好ましくは１４，０００〜１００，０００ｍ／ｚおよび／または２，０００〜１４，０００ｍ／ｚ；特に６，０００〜８，０００ｍ／ｚ。

成功した胚移植：２２，０００〜４０，０００ｍ／ｚ；好ましくは２２，０００〜２６，０００ｍ／ｚおよび／または３５，０００〜４０，０００ｍ／ｚ。

失敗した移植：９７００〜１０，０００ｍ／ｚおよび／または７，５００〜８，０００ｍ／ｚおよび／または１０，５００〜１２，０００ｍ／ｚ。

胚培養液からの妊娠のアウトカム：１２，０００〜５０，０００ｍ／ｚ。好ましくは４６００〜４７００ｍ／ｚおよび／または６４００〜６５００ｍ／ｚおよび／または９１００〜９２００ｍ／ｚ。また、好ましい範囲は、１５，８００〜１６，１００ｍ／ｚおよび／または約３６，４００ｍ／ｚおよび／または９，０００〜９５００ｍ／ｚ，および／または８，４００〜８，７００ｍ／ｚおよび／または約２８，０００ｍ／ｚを含む。

自然流産：６０００〜１２０００ｍ／ｚ。好ましい範囲は、６０００〜６０５０ｍ／ｚおよび／または６４５０〜６５００ｍ／ｚおよび／または９３５０〜９４００ｍ／ｚおよび／または１１１５０〜１１２００ｍ／ｚおよび／または１１８００〜１１８５０ｍ／ｚを含む。

多胎妊娠：６０００〜１４０００、好ましくは９０００〜１３０００。その他の好ましい範囲は、１２５００〜１２５５０ｍ／ｚおよび／または１０３００〜１０３５０ｍ／ｚおよび／または９６００〜９６５０ｍ／ｚを含む。

上記すべての状態のために、分析は、単一の範囲または任意の上記範囲の組み合わせで行うことができる。

本方法は、胚培養液を分析することにより胚において異数性などの染色体異常を検出するために使用することができる。胚における染色体異常を検出するための現行の方法は、その後遺伝分析に用いられる発生中の胚からの細胞の除去を必要とする。これは、単純な染色体分析が存在する染色体の数および異数性を同定するために実施されるＰＧＳ（フルネームを入れる）でありうる。また、遺伝的状態は、配列異常を探すことにより同定することができる。本発明の方法は、培養液から染色体異常を同定することができ、よって細胞を除去する必要がないままで、いかなる胚への害のリスクを取り除く。

好ましくは、本方法は、胚移植に先立ち、成功した胚移植の予後を提供するために使用される。移植後の胚の成功した移植の可能性は、胚を取り囲む培養液のサンプルからの２２，０００ｍ／ｚ〜４０，０００ｍ／ｚの範囲においてスペクトルを分析することにより評価することができる。培養液サンプルでの約２２，０００ｍ／ｚ〜２６，０００ｍ／ｚおよび約３５，０００ｍ／ｚ〜４０，０００ｍ／ｚ範囲における異常なピークの存在は、成功した移植の可能性が低い胚の指標でありうる。サンプルは、好ましくは受精後３〜５日の時点で得られる。得られた結果は、進行中の妊娠となる、成功した移植の可能性を基に胚を採点するために使用することができる。本発明の方法を使用して得られた結果は、従来の（ガードナースコアリング）方法と比較して改善されている（図６参照）。また、信頼できる結果は、初期段階、例えば移植直前、５日目とは対照的に受精後３日目に、本発明の方法により得ることができる。これは、意思決定および胚選択の時間をより提供する。

好ましくは、本方法は、胚移植後、成功した胚移植の予後を提供するために使用される。胚移植後の女性からの尿サンプルでの質量変化はまた、胚がうまく移植されたのかどうかを示すことができる。約９，７００ｍ／ｚから１０，０００ｍ／ｚ範囲におけるピークの減少または消失がある、および／またはおおよそ約７，５００ｍ／ｚから８，０００ｍ／ｚおよび約１０，５００ｍ／ｚから１２，０００ｍ／ｚでの異常に上昇したピークを有する胚移植後の女性からの尿サンプルは、移植失敗の指標である。

４６００から４７００ｍ／ｚ、６４００から６５００ｍ／ｚおよび９１００から９２００ｍ／ｚの特定の領域は、サンプル間、または胚を取り囲む培養液における妊娠の異なるアウトカムの予後を提供するために使用できる「ホットスポット（ｈｏｔ ｓｐｏｔｓ）」間での質量スペクトル差の領域と確認された（図５参照）。また、差の領域は、予測アルゴリズムを生成するために使用できる。図７および８に示すように、ホットスポットは、スペクトルにおいて確認することができ、その後これらの差の領域は、妊娠の予後を提供するために使用できるアルゴリズムを組み立てるために使用することができる。培養液サンプルにおける約１５，８００ｍ／ｚから１６，１００ｍ／ｚ、約３６，４００ｍ／ｚ、約９，０００〜９，５００ｍ／ｚ、約８４００ｍ／ｚ〜８７００ｍ／ｚおよび約２８，０００ｍ／ｚならびにその組み合わせの領域のピークは、アルゴリズムを発展するために使用できる。適切なアルゴリズムを生成する方法は、当業者に公知である。

好ましくは、本方法は、母親のサンプルの分析により多胎妊娠を検出するために使用される。双胎および三胎妊娠を検出することは、通常、超音波による複数の胚嚢の確認後、妊娠早期に確立される。妊娠疾患を示すたんぱく質マーカーの分析は、数十年間使用されているが、血清および尿のプロテオーム解析は、特に双子を確認するための比較的新しいアプローチである。本発明の方法は、ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳによる尿のスペクトル分析の相互関係を示すために使用でき、単胎から多胎妊娠を確認する。

多胎妊娠の検出を分析するための好ましい範囲は、６，０００ｍ／ｚ〜１４，０００ｍ／ｚである。母親のサンプルにおける約１０，３００ｍ／ｚから１０，３５０ｍ／ｚ、約９，６００〜９，６５０ｍ／ｚ、および約１２５００ｍ／ｚ〜１２５５０ｍ／ｚならびにその組み合わせの範囲でのピークは、アルゴリズムまたは意思決定の樹状図を開発するために使用できる。正常な妊娠と比較してタンパク質プロファイルの変化は、両方の範囲において発生する。

好ましくは、本方法は、母親のサンプルの分析による子癇前症の予後を提供するために、および／または子癇前症を検出するために使用される。子癇前症の検出および／または予後を分析するための好ましい範囲は、１４，０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚであり、また２，０００ｍ／ｚから１４，０００ｍ／ｚ、好ましくは６，０００〜８，０００ｍ／ｚの低質量の範囲である。正常な妊娠と比較してタンパク質プロファイルの変化は、両方の範囲において発生する。好ましくは、妊娠初期に採取されたサンプルの２，０００ｍ／ｚ〜１４，０００ｍ／ｚの範囲における質量シフトは、子癇前症が後期に発症しそうであることを示す。６０２９ｍ／ｚ、６５３８ｍ／ｚおよび／または６５９９ｍ／ｚ±５ｍ／ｚでのピークの変化は、図１０および１１に示すように、子癇前症を示す。したがって、陽性結果は、患者が予防的治療、例えばアスピリンおよび低分子量ヘパリンを与えられるべきことを示す。

好ましくは、本方法は、母親のサンプルの分析から妊娠悪阻の存在を検出するために使用される。妊娠悪阻に関して、分析のための好ましい範囲は、２２，０００ｍ／ｚから４０，０００ｍ／ｚである。正常に妊娠している女性からのサンプルにおいて、ピークは、２２，０００ｍ／ｚから２６，０００ｍ／ｚ、３５，０００ｍ／ｚから３７，０００ｍ／ｚおよび３７，５００ｍ／ｚから４０，０００ｍ／ｚの範囲内で見られる。妊娠悪阻の患者からのサンプルにおいて、３２，５００ｍ／ｚから３４，５００ｍ／ｚあたりに異常なピークが出現し、これは疾患を示す。３７，０８９．２２ｍ／ｚでの正常な妊娠サンプルで見られるピークは、より低いｍ／ｚへシフトし、そのため図３に示すように、異常なピークが妊娠悪阻の患者においてＨ１では３３，６７０．６８およびＨ２では３３，６７４．３４に出現する。

好ましくは、本方法は、母親のサンプルの分析から妊娠性絨毛性疾患の存在を検出するために使用される。妊娠性絨毛性疾患（ＧＴＤ）に関して、分析のための好ましい範囲は、３５，０００ｍ／ｚから４５，０００ｍ／ｚである。正常に妊娠している女性からのサンプルにおいて３５，０００ｍ／ｚから３７，５００ｍ／ｚで見られるピークの質量シフトは、ＧＴＤで発生する。約３７，６００ｍ／ｚから３９，２００ｍ／ｚの範囲へのピークのシフトは、奇胎妊娠を示すものでありうるし、約３７，９００ｍ／ｚから３９，６００ｍ／ｚの範囲へのピークのシフトは、絨毛腫を示すものでありうる。特に、図２に示すように、正常な妊娠で見られる、３６，６８７ｍ／ｚあたりのピークと比較して、３８，４０５ｍ／ｚあたりのピークは、奇胎妊娠を患う患者において見られ、３８，８０３ｍ／ｚあたりのピークは、絨毛腫を患う患者において見られる。

質量スペクトルの分析は、適切なコンピュータプログラムを用いて容易に判断することができる。コンピュータはまた、妊娠疾患、または成功した移植の可能性の指標を提供するために適切なアルゴリズムでプログラムされてもよい。

直接質量スペクトル解析は、質量分析法により行うことができる。適切な質量分析技術は、高速原子衝撃（ＦＡＢ）、化学イオン化（ＣＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、四重極型質量分析計、四重極イオントラップ、四重極イオントラップ、オービトラップ、四重極イオントラップなどのイオントラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴＭＳ）、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）または上記の組み合わせを含む。好ましくは、直接質量スペクトル解析は、ＭＡＬＤＩ−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法により行うことができる。

また、
ａ）サンプルを得ること
ｂ）前記サンプルを直接質量スペクトル解析にかけること；および
ｃ）前記分析によるスペクトルと正常で健康な進行中の妊娠のサンプルから得られた質量スペクトルとを比較して、前記サンプルからのスペクトルが妊娠の予後不良を示すかどうかを決定すること
を含む、妊娠の予後を提供する方法をも特徴とする。

好ましくは、本方法は、妊娠疾患の予後および／または検出を提供し、分析によるスペクトルは、正常で健康な妊娠、特に正常で健康な単胎妊娠の女性からのスペクトルと比較される。

また、本方法は、培養胚の成功した移植の予後を提供し、分析によるスペクトルは、うまく移植された、すなわち正常な妊娠をもたらす胚を取り囲む液体からのスペクトルと比較される。

本明細書中、動詞「含む」は、通常の辞書の意味であり、非排他的な包含を意味する。すなわち、１以上の特徴を含むための「含む」（または派生語のいずれか）の使用は、さらなる特徴をも含むことの可能性を排除しない。「望ましい」（または派生語のいずれか）は、好ましいが必須ではない１つ以上の特徴を示す。

本明細書（添付しているあらゆる請求項、要約および図面）で開示された全てまたは任意の特徴、および／または開示されたいかなる方法またはプロセスの全てまたは任意の工程は、少なくともかかる特徴および／または工程いくつかがお互いに背反する組み合わせを除き、任意の組み合わせで組み合わせることができる。

本明細書（添付しているあらゆる請求項、要約および図面）で開示された各特徴は、特に明記しない限り、同じ、同等または同様の目的を果たす別の特徴により、置換することができる。したがって、特に明記しない限り、開示された各特徴は、同等または同様の特徴の一般的な系の単なる一例である。

本発明は、前述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（添付しているあらゆる請求項、要約および図面）で開示された特徴からなる、いかなる新規の発明、またはいかなる新規の組み合わせ、またはそのように開示されたいかなる方法またはプロセスからなる、いかなる新規の発明、またはいかなる新規の組み合わせにまで及ぶ。

本願は、以下の図面を参照する下記実施例で説明される。

図１は、サンプルから生成されたスペクトルにおける関心領域を示す。 図２は、本実施例において分析された３つのサンプルからの３つのスペクトルのオーバーレイから得られたＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量スペクトルを示す；正常、奇胎および絨毛腫の妊娠の尿サンプル。きちんとした正常な妊娠の尿は、正常な状態を表す３６，６８７ｍ／ｚのピークを示す。奇胎妊娠の尿は、７，６００ｍ／ｚから３９，２００ｍ／ｚの範囲で３８，４０５ｍ／ｚのピークを示し、絨毛腫の尿サンプルは、３７，９００ｍ／ｚから３９，６００ｍ／ｚの範囲内にある３８，８０３ｍ／ｚのピークを示す。 図３は、悪性悪阻のスペクトルと比較した、正常な妊娠の尿の１４，０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚの範囲における期待ピーク領域の（オーバーレイ後、積み重ねた）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。２３８９７ｍ／ｚ、３６１２３ｍ／ｚおよび３８４０５ｍ／ｚでの最も高いスペクトルに示されるピークは、通常の状態を示す。図の下半分において、３３６７０ｍ／ｚおよび３３６７４ｍ／ｚのピークは、悪性悪阻を患う女性の尿に由来し、３７０８９ｍ／ｚでの正常な妊娠の量サンプルのスペクトルに隣接して示される。 図４は、進行中の妊娠、自然流産、生化学的妊娠、陰性妊娠をもたらすまたは胚が染色体異常である胚を取り囲む培養液のサンプルから得られたスペクトルにおけるホットスポットの同定を示す。異なるアウトカムを見渡すことで、変化の領域を見ることができる。これらの領域またはホットスポットは、例えば、相対的に、お互いの割合として、または比率として比較することができる。領域は、それ自身が質量（Ｋｄａ）に比例する質量：荷電（ｍ／ｚ）の領域を同定するトンプソンユニット（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｕｎｉｔｓ）（Ｔｈ）を単位として同定される。瓶は、相違が見られる任意のサイズおよび任意の領域で作ることができる。 図５は、３つのホットスポットを用いて進行中の妊娠と陰性妊娠との区別を示す。３つのホットスポットのみ、４６００から４７００ｍ／ｚ、６４００〜６５００ｍ／ｚ、および９１００〜９２００ｍ／ｚを用いることで、特に妊娠と陰性妊娠との合理的な区別を得ることができるが、妊娠と妊娠損失（生化学的妊娠および自然流産／流産）との間にはかなりのオーバーラップがある。 図６は、自覚的視覚胚盤胞スコアリング（ｓｕｂｊｅｃｔｉｖｅ ｖｉｓｕａｌ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｓｃｏｒｉｎｇ）（Ｇａｒｄｎｅｒ）と、我々のベストエンブリオセクレトームスコアリングテスト（Ｂｅｓｔ Ｅｍｂｒｙｏ Ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｔｅｓｔ）（ＢＥＳＳＴ）、成功した進行中の妊娠となる胚の可能性とを比較する単純相関を示す。１^ｓｔ Ｃｌｉｃｋ＝スピアマン順位相関 ｒｈｏ＝０．４。Ｐ＝０．００５（有意である）。 図７は、アルゴリズムにおいて我々にとってホットスポットがどのように同定することができ、選択することができるのかということに関する例を示す。 図８は、アルゴリズムの開発を示す。ホットスポットおよびホットスポット領域に関わるより複雑な分析を用いることにより、全アウトカムに対して最低限６０％陽性適中率を達成するために段階的に新たな領域に追加することで、アウトカムをベースとして確立できるアルゴリズムをデザインすることが可能である。矢印は、５７％まで正常な妊娠を開始するであろう胚盤胞を同定する確率が増加することを示す。 図９は、胚培養液のＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ後の平均スペクトルの２０００から８００００ｍ／ｚの質量範囲を示す。進行中の妊娠のプロファイルは、生化学的妊娠、自然流産（ＳＡＢ）、異数性の胚および着床されなかった胚（犠牲妊娠）のプロファイルと比較される。 図１０は、６０００〜１２，０００ｍ／ｚでの２８の正常なコントロールおよび１２の子癇前症サンプルの正規化されていない平均スペクトルを示す。矢印は、最も豊富なイオンシグナルを示し、そこでは強度が子癇前症と正常なコントロールとの間で異なる。 図１１は、子癇前症と正常なコントロールグループボックスとの示差質量（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｍａｓｓｅｓ）および算出された統計的有意性（ｐ≦０．０５）を有する選択された質量瓶のウィスカプロットを示す。ｍ／ｚ＝６０２９（プロット（ａ））、６５３８（プロット（ｂ））および６５９９（プロット（ｃ））。 図１２は、妊娠５〜７週（ａ）および妊娠８〜１１週（ｂ）の尿のスペクトル（６０００〜１４０００Ｔｈ）を示す。パネルは、妊娠における各期間の、多数の胚（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｍｂｒｙｏｓ）のプロファイルと一つの胚（ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｍｂｒｙｏｓ）のプロファイルとを比較する。後述の意思決定の樹状図を構築するために用いられた、ホットスポット１、２、および３を矢印で示す。 図１３は、多胎妊娠の存在を決定するために使用された意思決定の樹状図を示す。 図１４は、進行中の妊娠である女性および自然流産した女性のサンプルのスペクトルを比較する。

実施例１ 妊娠性絨毛性疾患
本実施例において、我々は、ＧＴＤ状態を示すｍ／ｚ変異のＭＡＬＤＩ分析の方法を示す。

結果
正常に妊娠している患者の尿サンプルの分析は、１４，０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚの質量範囲内でピークを示した。質量は、３５，０００ｍ／ｚから３７，５００ｍ／ｚの範囲内のピークを有する正常な妊娠から奇胎妊娠サンプルにおいて３７，６００ｍ／ｚから３９，２００ｍ／ｚおよび絨毛腫サンプルにおいて３７，９００ｍ／ｚから３９，６００ｍ／ｚの異常なピークへとシフトする。これらのシフト（同様の範囲に他のピークがない場合）は、疾患を示す。本実施例において、異常なピークは、本実施例では３６，６８７ｍ／ｚであった、正常な妊娠で見られるものと比較して、奇胎妊娠では３８，４０５ｍ／ｚおよび絨毛腫では３８，８０３ｍ／ｚである（図２）。

実施例２ 悪性悪阻
ここで、我々は、悪性悪阻である患者における質量シフトを区別することによりｈＣＧの分子形態を同定する方法を説明する。

結果
正常に妊娠している患者の尿サンプルの分析は、１４，０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚの質量範囲内でピークを示した。質量は、２２，０００ｍ／ｚから２６，０００ ｍ／ｚ、３５，０００ｍ／ｚから３７，０００ｍ／ｚおよび３７，５００ｍ／ｚから４０，０００ｍ／ｚの範囲内のピークを有する正常な妊娠から悪性悪阻の患者からのサンプルにおける３２，５００ｍ／ｚから３４，５００の異常なピークへとシフトし、疾患を示す。本実施例において、異常なピークは、Ｈ１の３３，６７０．６８ｍ／ｚおよびＨ２の３３，６７４．３４ｍ／ｚであり、これらは本実施例では３７，０８９．２２ｍ／ｚであった、正常な妊娠で見られるものと比較して、より低いｍ／ｚである（図３）。

実施例３ 子癇前症
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳによる尿の直接分析は、子癇前症が進行する患者の高い（＞１４，０００ｍ／ｚ超）および低い（＞２０００ｍ／ｚ〜１４，０００ｍ／ｚ）質量範囲でのタンパク質プロファイルにおける変化を明らかにする（図１０＆１１参照）。

これらの変化は、臨床での子癇前症を特徴づけるだけではなく、受胎後および妊娠初期の期間での低質量プロファイルのプロファイルの変化は、おそらく子癇前症が進行しており、母親および胎児の疾病率を減少させるためにアスピリンおよび低分子量ヘパリンなどの予防的治療を受けるべきである人を予測できる子癇前症を患い続けていた女性から得られたサンプルは、６，０００から８，０００ｍ／ｚの間でスペクトルにおける変化を示した。特に、６０２９ｍ／ｚ、６５３８ｍ／ｚおよび／または６５９９ｍ／ｚ（±５ｍ／ｚ）でのピークにおける変化は、図１０および１１に示すように子癇前症の患者で発生した。

実施例４ 胚／妊娠早期
本実施例において、我々は、胚移植、子宮腔内受精、もしくはその他の生殖補助方法後の、または自然妊娠による女性の尿、ならびに妊娠の評価、診断および予後のための培養での胚の移植前培地において、着床もしくは着床の可能性または両方を示すｍ／ｚ変異のＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ分析の方法を説明する。

結果
正常に妊娠している患者の尿および胚培養液サンプルの分析は、２，０００ｍ／ｚ〜１４，０００ｍ／ｚおよび１４，０００ｍ／ｚから１００，０００ｍ／ｚの質量範囲内でピークを示した。質量は、２２，０００ｍ／ｚから２６，０００ｍ／ｚ、３５，０００ｍ／ｚから３７，０００ｍ／ｚおよび３７，５００ｍ／ｚから４０，０００ｍ／ｚの範囲内のうまく着床した生殖補助方法の胚盤胞の培養液から培養液における２２，０００ｍ／ｚから２６，０００ｍ／ｚおよび３５，０００ｍ／ｚ〜４０，０００ｍ／ｚの異常なピークへとシフトする。

胚移植後の女性の尿サンプルは、９，７００ｍ／ｚから１０，０００ｍ／ｚのピークで独特なプロファイルを示し、これらの領域において減少したピークもしくはピークなし、および／または異常に上昇したピーク、典型的には失敗した移植および胎児の異数性に関連した、７，５００ｍ／ｚから８，０００ｍ／ｚおよび１０，５００ｍ／ｚから１２，０００ｍ／ｚのいずれかに対して、自然および進行中の妊娠において見られるものと比較できる。

培養液および妊娠早期尿両方の分析において、失敗するであろう（生化学的またはＳＡＢ）または決して陽性の妊娠テストをもたらさない（陰性妊娠）であろう妊娠から生存可能な進行中の妊娠を区別するために特定の領域の質量スペクトルプロファイルにおける変異を使用することが可能である（図９）。

実施例５ ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳを用いて使用済み胚盤胞培養培地におけるセクレトームパラメータの非侵襲解析を用いて妊娠のアウトカム（ｐｒｅｇｎａｎｃｙ ｏｕｔｃｏｍｅｓ）を予測する
研究デザイン、サイズ、期間：７５サンプルのＭＡＬＤＩ ＴｏＦ質量分析法を用いた胚培養の使用済み培地およびそれに続く妊娠アウトカムとの相関を分析する研究が行われた。

材料、設定および方法：胚移植の前に培養における胚盤胞の使用済み培養培地を所定のＡＲＴサイクルの一部として収集し、−２０℃で保存した。サンプルは、凍ったまま分析ラボラトリーへ送られ、上記マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴｏＦ）質量分析法（ＭＳ）にかけられた。

主な結果および偶然の役割：スペクトルのデータを１２，０００から５０，０００ｍ／ｚの範囲で収集し、正規化した。スペクトルデータの定量的特性は、培地コントロール（ｎ＝５）と同時に４つのグループ：妊娠 進行中（ｎ＝３２）、妊娠 自然流産（ｎ＝１１）、妊娠 生化学的（ｎ＝９）および妊娠せず（陰性妊娠テスト）（ｎ＝２３）を比較するために使用された（図４および５参照）。ＭＡＬＤＩを用いるこの方法（ベストエンブリオセクレトームスコアリングテスト（ＢＥＳＳＴ）と名付けた）は、それを自覚的視覚胚盤胞スコアリング（Ｇａｒｄｎｅｒ）および成功した進行中の妊娠となる胚の可能性と比較することにより検証された（図６）。

ｍ／ｚのばらつきを利用するアルゴリズムは、各アウトカムを予測するためにデザインされ、すべての区分は、２０未満のカットオフ基準の組み合わせを用いて割り当てられた。すべてのアウトカムは、たった５％の誤った分類と９５％の正確さとで予測できた（１ｆｐ生化学的、１ｆｐＳＡＢおよび２ｆｐ妊娠）（図７および８参照）。

実施例６ 自然流産／流産
妊娠の検査が陽性であり、米国のＡＲＴセンターに参加している女性の１２１の尿サンプルを分析する研究が行われた。妊娠６〜１０週の尿がＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳにより分析されて、進行中の単胎妊娠アウトカムと相関していた。サンプルは２０１４年３月から１２月にかけて収集および分析された。

材料、設定および方法：尿サンプルは、ＩＵＩ後、またはＡＲＴ後自然妊娠した女性から得られ、凍ったまま分析ラボラトリーへ送られた。解凍するとすぐに、サンプルは、そのままの尿またはｄＨ_２Ｏで１０〜１０００倍希釈されたもののいずれかで、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴｏＦ）質量分析法（ＭＳ）にかけられた。

主な結果および偶然の役割：質量スペクトルデータは、妊娠女性の尿のＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ後、６，０００から１４，０００ｍ／ｚの領域で分析された。スペクトルデータは、正規化され、プロファイルの定量的特性がアウトカム：進行中の妊娠（ｎ＝１１１）、およびその後の自然流産（ｎ＝１０）の間で比較された。ｍ／ｚのばらつきを利用するアルゴリズムは、＞９９％の正確さおよびたった一つの偽陰性であるアウトカムを予測するためにデザインされた。診断に関する決定は、カットオフ基準をベースにしたたった５つのｍ／ｚで構成されている意思決定の樹状図を用いて定式化された（図１４参照）。

スペクトルデータは、ｍＭａｓｓからＡＳＣＩ（情報交換標準コード）ファイルへ生ｍｚＸＭＬ（質量：電荷拡張マークアップ言語）データとして分析ソフトウェアに抽出された。データは、３０００〜１４０００Ｔｈ（ｍ／ｚ）で切り取られ、２つの重要な領域（領域１および領域２）に分割された（図１４参照）。領域２におけるスペクトルの正規化は、プロファイルを比較可能にし、６０００〜６０５０Ｔｈ、６４５０〜６５００Ｔｈ、９３５０〜９４００Ｔｈ、１１１５０〜１１２００Ｔｈ、および１１８００〜１１８５０Ｔｈでのホットスポットは、下記意思決定の樹状図を作るために使用された。

ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ質量分析の適用は、疾病に関連した、ターゲット分子を同定するために従来使用され、その後それらを定量化するための他の方法をデザインおよび開発される。直接ＭＡＬＤＩは、微生物学の研究所における細菌の同定に最大限効果的に適用されている。本研究において、我々はまた、妊娠早期における尿のスペクトルを分析するために直接的なアプローチを使用し、自然流産の可能性を予測する。我々のアプローチは、タンパク質およびペプチドの同定を度外視し、代わりにスペクトル内での特定のホットスポットのプロファイルパターンにおける変化を見る。スペクトル間でのこの変動性は、カットオフ値を作るために使用することができる。カットオフ超または未満でありうる、将来の自然流産を示すスペクトルの変化は、アルゴリズムを組むために組み合わせることができる。したがって、ごくわずかのホットスポットに関連する意思決定の樹状図を作ることにより、我々は、＞９９％の正確さとたった一つの偽陰性とでアウトカムを予測することができた。平均尿スペクトルの変化における変動性は、妊娠期間で変化し、異なる数学的アプローチは、より後の妊娠初期（８〜１０週）と比較した場合、妊娠最初期（５〜７週）における検出を最適化するために開発することができる。さらに、領域１におけるホットスポットの分析は、補助医療を受けている女性における所期の妊娠損失をさらにより明確にすることに付け加えて、検出アルゴリズムを改善できるであろう。

実施例７ 多胎妊娠対単胎妊娠
本研究は、ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳによるスペクトル分析の相関を表す最初のものであり、単胎妊娠から多胎妊娠を明らかにする。

研究デザイン、サイズ、期間：妊娠の検査が陽性であり、米国のＡＲＴセンターに参加している女性からの１１７の尿サンプルを分析する研究が行われた。妊娠６〜１０週の尿は、ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳで分析され、単胎妊娠または多胎妊娠と相関していた。

材料、設定および方法：
尿サンプルは、ＩＵＩ後、またはＡＲＴ後自然妊娠した女性から得られ、凍ったまま分析ラボラトリーへ送られた。解凍するとすぐに、サンプルは、そのままの尿またはｄＨ_２Ｏで１０〜１０００倍希釈されたもののいずれかで、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴｏＦ）質量分析法（ＭＳ）にかけられた。

主な結果および偶然の役割：
質量スペクトルデータは、妊娠女性の尿のＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ後、６，０００から１４，０００ｍ／ｚの領域で分析された。スペクトルデータは、正規化され、プロファイルの定量的特性がアウトカム：進行中の単胎妊娠（ｎ＝１１１）、進行中の双胎または三胎妊娠の間で比較された。ｍ／ｚのばらつきを利用するアルゴリズムは、＞９９％の正確さでアウトカムを予測するためにデザインされた。診断に関する決定は、カットオフ基準をベースにしたたった３つのｍ／ｚで構成されている意思決定の樹状図を用いて定式化された（図１２および１３参照）。

伝統的な免疫学的測定法をベースにしたアプローチおよび超音波アプローチとは異なり、妊娠最初期の尿のＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳは、妊娠のアウトカムおよび妊娠を試みる女性における成功を決定する正確、迅速および非侵襲な方法である。多胎妊娠の迅速かつ非侵襲な初期診断は、ＡＲＴを受ける女性および自然妊娠のマネジメントにおける貴重な新しいツールである。

実施例８ 異数性を同定するためにＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳを用いた使用済み胚盤胞培養培地におけるセクレトームパラメータの非侵襲分析：着床前の遺伝的スクリーニングの可能な代替
目的：ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳによる胚盤胞培地からの使用済み培地の質量スペクトルプロファイルにおける異数性マーカーのパラメータを同定すること。

デザイン：異数性胚盤胞におけるパターンの違いを同定するためにＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳを用いた胚盤胞培養からの使用済み培地を分析するプロスペクティブなパイロット研究。培地サンプルおよびコントロールは、２０１４年１２月から２０１５年４月にかけて収集、輸送、保存および分析された。

材料および方法：胚移植より前に培養における胚盤胞の使用済み培養培地は、４０の所定ＡＲＴサイクルの一部として収集され、−２０℃で保存された。胚盤胞のグレーディングが、ガードナーの基準に従って行われた。培地サンプルは、凍ったまま分析ラボラトリーへ送られ、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴｏＦ）質量分析法（ＭＳ）にかけられた。スペクトルのデータは、３，０００から３０，０００ｍ／ｚの領域で収集され、平滑化および正規化された。６０００ｍ／ｚから９５００ｍ／ｚの領域におけるスペクトルのホットスポットからのデータの定量的特性は、差異のために分析された。

結果：胚盤胞のグレーディング後、１９が５ＡＡグレードとされ、陽性妊娠とよい相関（１６／１９，８４．２％）があり、１８が混合グレードとされたが、陰性妊娠になり、３が異常なＰＧＳであり、格付けまたは移植されなかった。６０００ｍ／ｚから９５００ｍ／ｚの領域におけるＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ分析後のセクレトームパターンは、高グレードの胚、陰性妊娠をもたらす胚、および異数性の胚の間で、明確なパターンの違いを示す。特に、異数性の胚盤胞は、それらが高グレード胚または陰性妊娠をもたらす胚のいずれかとは完全に異なるように、８５００〜９０００ｍ／ｚの領域において、有意なプロファイルの違いを生じる。

結論：ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳによる使用済み胚盤胞培養培地の非侵襲分析は、その他の高および低クオリティな胚盤胞の中で異数性の胚盤胞を同定することができる。

実施例９ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳを用いた使用済み胚盤胞培養培地におけるセクレトームパラメータの非侵襲分析は胚盤胞グレーディングおよび妊娠アウトカムと相関する
目的：ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳによる使用済み胚盤胞培養培地の非侵襲プロテオーム解析と伝統的な胚盤胞グレーディングとの間での相関を調査すること。

デザイン：ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ質量分析法を用いた胚培養からの使用済み培地の９０サンプル、およびそれに続く胚盤胞グレーディングスコアでの相関を分析するプロスペクティブなパイロット研究。サンプルは、２０１４年４月から２０１５年４月の一年の間に収集、輸送、保存および分析された。

材料および方法：胚移植より前に培養における胚盤胞の使用済み培養培地は、９０の所定ＡＲＴサイクルの一部として収集され、−２０℃で保存された。胚盤胞のグレーディングが、ガードナーの基準に従って行われた。胚盤胞の培養後、３つのサンプルが異常なＰＧＳの結果（Ｎ＝３）に基づき除外され、１つのＦＥＴケースがグレードなしで除外された。８４サンプルが５ＡＡから３ＣＣに格付けされ、６つの初期胚盤胞が１ＢＢに格付けされた。グレードは、数値（１から１１）が割り当てられ、ランク付けされた。培地サンプルは、凍ったまま分析ラボラトリーへ送られ、マトリクス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、飛行時間型（ＴｏＦ）質量分析法（ＭＳ）にかけられた。スペクトルのデータは、３，０００から３０，０００ｍ／ｚの領域で収集され、平滑化および正規化された。スペクトルのホットスポットからのデータの定量的特性は、胚盤胞をランク付けするために使用された。Ｓｔａｔｓ Ｄｉｒｅｃｔソフトウェアを用いて、ランク付けされた胚盤胞のスコアは、スピアマンの順位相関による伝統的な胚盤胞グレーディングと相関していた。ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ分析から得られたランクスコアはまた、妊娠アウトカムと相関していた。

結果：胚盤胞の伝統的なグレーディングとＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳ後のセクレトーム分析スコアリングとの間には有意な相関があった（Ｒｈｏ ０．３３，Ｐ＝０．０２）。スペクトルデータの定量的特性はまた、妊娠アウトカムと２つのグループにおけるスペクトルスコアリング（妊娠および偽性妊娠−生化学的妊娠および自然流産を除く）とを比較するために使用された。ｍ／ｚのばらつきを利用するアルゴリズムは、各アウトカムを予測するためにデザインされ、すべての区分は、２０未満のカットオフ基準の組み合わせを用いて割り当てられた。

結論：ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ ＭＳによる使用済み胚盤胞培養の非侵襲分析は、胚盤胞グレーディングおよび妊娠アウトカムの伝統的な方法と相関する。

Claims (17)

1. サンプルを直接質量スペクトル解析にかけることを含む、妊娠の予後を提供する方法。
2. 成功した進行中の妊娠の予後を提供するための、請求項１に記載の方法。
3. 培養胚の成功した移植の予後を提供するための、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記方法が進行中の妊娠につながる成功した移植と陰性妊娠（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）とを区別できる、請求項３に記載の方法。
5. 前記サンプルが培養における胚を取り囲む液体を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 染色体異常が前記胚において検出される、請求項５に記載の方法。
7. 前記染色体異常が異数性である、請求項６に記載の方法。
8. 妊娠の疾患の予後を提供するための、請求項１に記載の方法。
9. 前記妊娠の疾患が子癇前症、妊娠悪阻、または妊娠性絨毛性疾患から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 前記妊娠の疾患が自然流産または多胎妊娠である、請求項８に記載の方法。
11. 前記サンプルが妊娠した女性から得られたものである、請求項１または８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記サンプルが尿、血液または血清サンプルから選択される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記サンプルを直接質量スペクトル解析の前に希釈する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記直接質量スペクトル解析から得られたスペクトルを正規化する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 各サンプルを健康な進行中の妊娠から得られたサンプルの収集物の統計分析から決定された約５００ｍ／ｚ〜１００，０００ｍ／ｚの間での期待質量の参照スペクトルモデルと比較する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記質量スペクトル解析を質量分析法により行う、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記質量分析法がマトリクス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ ＭＳ）である、請求項１１に記載の方法。