JP2017524726A - 抗原結合性分子のナノ封入 - Google Patents
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Abstract
Description
a)C1−C10−アルキルシアノアクリレートおよびC1−C6−アルコキシ−C1−C10−アルキルシアノアクリレートのうちの1以上から選択される主モノマー成分を含むものである1以上のポリマーによって形成された高分子マトリックス;ならびに
b)少なくとも1つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む1以上の抗原結合性分子
を含み、
該1以上の抗原結合性分子が、該高分子マトリックス中にエステラーゼ放出可能に組み込まれている、
ナノスフェアを提供する。
i)C1−C10−アルキルシアノアクリレートおよびC1−C6−アルコキシ−C1−C10−アルキルシアノアクリレートから選択される1以上の重合性モノマーを含む疎水性の液相を準備すること;
ii)エマルジョンが形成されるように該疎水性の液相を親水性の液相中に微細分散させること、ここで、該エマルジョンのpHは4.0以下である;
iii)1以上の該重合性モノマーの重合が加速されるように該エマルジョンのpHを4.0から6.0の範囲の値まで上げること;
iv)次いで、少なくとも1つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む1以上の抗原結合性分子を添加すること;ならびに
v)最後に、該重合を、該pHをpH8.0を超えない値までさらに上げることにより継続させること
を含み;
これにより、ナノスフェア懸濁液を形成し、ここで、該1以上の抗原結合性分子は、1以上の該重合性モノマーの重合によって形成された高分子マトリックス中に組み込まれる、
ナノスフェアの調製方法を提供する。
i)C1−C10−アルキルシアノアクリレートおよびC1−C6−アルコキシ−C1−C10−アルキルシアノアクリレートから選択される1以上の重合性モノマーを含む疎水性の液相を準備すること;
ii)エマルジョンが形成されるように該疎水性の液相を親水性の液相中に微細分散させること、ここで、該エマルジョンのpHは4.0以下、例えばpH1.0から3.0の範囲である;
iii)1以上の該重合性モノマーの重合が加速されるように該エマルジョンのpHを4.0から6.0の範囲の値まで、特に4.8から5.5の範囲のpHまで、好ましくは4.9から5.2の範囲のpHまで上げること;
iv)次いで、少なくとも1つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む1以上の抗原結合性分子を添加すること;ならびに
v)最後に、該重合を、該pHをpH8.0を超えない値まで、特に6.8から7.5の範囲のpHまで、好ましくは6.9から7.2の範囲のpHまでさらに上げることにより継続させること;
を含み、
これにより、ナノスフェア懸濁液を形成し、該1以上の抗原結合性分子は、1以上の該重合性モノマーの重合によって形成された高分子マトリックス中に組み込まれる、
方法によって調製され得る。
本明細書に記載の実施例において、調製したナノ粒子のサイズおよび多分散指数(PDI)は、動的光散乱法における国際規格(International Standard on Dynamic Light Scattering)ISO13321(1996)およびISO22412(2008)に規定されたキュムラント解析により、ゼータサイザーデバイス(Malvern Instruments,Germany)を用いて測定した。これにより、平均粒子サイズ(z−平均直径)および分布の幅の推定値(PDI)が得られる。PDIは、本実施例で示している場合、サイズ分布の幅広さの無次元測定量であり、このゼータサイザーのソフトウェアでは0から1の範囲である。<0.05のPDI値は、単分散試料(即ち、非常に均一な粒子サイズ分布を有する試料)を示すが、高いPDI値ほど、より多分散の試料を示す。
抗ビオチンヤギIgGを負荷した高分子ナノ粒子の調製
IgG負荷ポリ(n−ブチル2−シアノアクリレート)(PBCA)ナノスフェアを以下のようにして調製した:
250μlのn−ブチル2−シアノアクリレート(モノマー)を21.5μlのダイズ油と、油相が得られるように混合した。16.25mgのポロキサマー188と6.5mgのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を1.3mlの0.1Mのリン酸と、水相が得られるように混合した。両方の相を氷上で維持した。これらの相を混合し、混合物を、超音波プローブ(Hielscher Ultrasonics GmbH,Germany,振幅70%,1サイクル)を用いて、なお氷冷下で2分間均質化した。得られたエマルジョンに、0.1Nの水酸化ナトリウム(NaOH)を撹拌(700rpm)下で滴下した。エマルジョンのpHが5.0に達したらすぐに、撹拌を継続したまま、1mgの抗ビオチンヤギIgGをゆっくり添加した。IgGの添加後、エマルジョンの撹拌を室温で約10分間継続した。次いで、0.1N NaOHの滴下によってpHを7.0まで上げ、試料を4℃で一晩インキュベートし、残留モノマーを重合させた。
封入効率(EE)
実施例1のPBCAナノスフェア懸濁液中の遊離(未封入)の抗ビオチンヤギIgGの量を、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)を用いて測定した。遊離である(即ち、ナノスフェア内に封入されているのではなく懸濁媒体中に溶解されている。)IgGは5.6%だけであることがわかった。[(添加されたIgGの総量)−(未封入のIgG)]/[添加されたIgGの総量]の商として計算される封入効率は94.4%であった。
封入されたIgGの抗原結合活性
250μlのn−ブチル2−シアノアクリレート(モノマー)を21.5μlのダイズ油と、油相が得られるように混合した。16.25mgのポロキサマー188と6.5mgのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を1.3mlの0.1Mのリン酸と、水相が得られるように混合した。両方の相を氷上で維持した。これらの相を混合し、混合物を、超音波プローブ(Hielscher Ultrasonics GmbH,Germany,100%振幅,1サイクル)を用いてなお氷冷下で5分間、エマルジョンが得られるように均質化した。500μlのエマルジョンを、上記の組成を有する800μlの水相で希釈した。0.1Nの水酸化ナトリウム(NaOH)を撹拌下(300から500rpm)で滴下した。エマルジョンのpHが5に達したらすぐに、撹拌を継続したまま、1mgの非特異的ヤギIgG(ビオチンに対する特異的結合活性なし)または1mgの抗ビオチンヤギIgG(ビオチンに特異的に結合する)をゆっくり添加した。IgGの添加後、0.1N NaOHの滴下によってpHを7まで上げ、試料を4℃で一晩インキュベートし、残留モノマーを重合させた。
封入されたIgGの生物学的活性
封入されたIgGの生物学的活性を、反発性軸索ガイダンス分子(Repulsive Guidance Molecule)A(RGMa)に対するモノクローナル抗体(mab)を負荷したPBCAナノスフェアにおいて、以下のようにして測定した:
抗RGMa mab負荷PBCAナノスフェアの懸濁液を実施例1に記載の方法(1mgのヤギIgGの代わりに2.26mgのこのmabを添加)を用いて調製し、これには遊離mabと封入mabが含まれていた(エステラーゼ処理後の試料名:「遊離+封入」)。一部のこの懸濁液のナノスフェアを遊離mabから限外濾過(Amicon Cell and Biomax 500kDaフィルターメンブレン)によって分離し、従って、封入mabのみを含む試料(エステラーゼ処理後の試料名:「封入」)を得た。各試料(9.55mg/mlのPBCA,1:10希釈液)の一部をブタ肝臓エステラーゼ(Sigma Aldrich Co.,Germany カタログ番号E2884,≧150U/ml,終濃度:0.22mg/ml)で、振盪下、37℃で4時間処理し、封入mabをナノスフェアから放出させた。対照として、全く抗体の負荷なしのPBCAナノ粒子を調製し、試料「遊離+封入」および「封入」について記載のとおりにエステラーゼで処理した(試料名:「空NP」)。
ヒトIgG−FITCコンジュゲートを負荷したPBCAナノ粒子の調製
ヒトIgG−FITCコンジュゲートを負荷したPBCAナノスフェアの懸濁液を、エマルジョンのpHを7.0に調整した後、(4℃で一晩の代わりに)室温で約4.5時間インキュベートしたこと以外は、実施例1に記載の方法を用いて調製した。
ヤギIgGを負荷したPBCAナノ粒子の調製
各試料について、21.5μlのダイズ油を表3に示した量のn−ブチル2−シアノアクリレート(モノマー)と、油相が得られるように注意深く混合した。16.25mgのポロキサマー188と6.5mgのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を1.3mlの0.1Mのリン酸と、水相が得られるように混合した。両方の相を氷上で維持した。これらの相を混合し、混合物を、超音波プローブ(Hielscher Ultrasonics GmbH,Germany,1サイクル)を用いて、表3に示した時間と条件下で均質化した。得られたエマルジョンに、撹拌下(300から500rpm)で0.1Nの水酸化ナトリウム(NaOH)を滴下した。エマルジョンのpHが表3に示した値に達したらすぐに、撹拌を継続したまま、1mgの抗ビオチンヤギIgGをゆっくり添加した。IgGの添加後、エマルジョンの撹拌を室温で約10分間継続した。次いで、0.1N NaOHの滴下によってpHを約6.0から7.0まで上げ、試料を4℃で一晩インキュベートし、残留モノマーを重合させた。
Claims (21)
- a)C1−C10−アルキルシアノアクリレートおよびC1−C6−アルコキシ−C1−C10−アルキルシアノアクリレートのうちの1以上から選択される主モノマー成分を含む1以上のポリマーによって形成された高分子マトリックス;ならびに
b)少なくとも1つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む1以上の抗原結合性分子
を含み、
1以上の該抗原結合性分子が、該高分子マトリックス中にエステラーゼ放出可能に組み込まれている、ナノスフェア。 - 1以上の抗原結合性分子が、ガンマグロブリン、ダイマー抗体ならびにFab断片およびF(ab)2断片から選択される、請求項1に記載のナノスフェア。
- 1抗原結合性分子(1種類または複数種)の少なくとも20%が、ナノスフェアからの放出後もなお、この抗原に結合し得る、請求項1または請求項2に記載のナノスフェア。
- ナノスフェアから放出された抗原結合性分子が、細胞アッセイなどの生物学的アッセイでの測定時、元の生物学的活性の少なくとも20%を保持している、請求項1から3のいずれか一項に記載のナノスフェア。
- 1以上のマトリックス形成ポリマーの主モノマー成分が、メチル2−シアノアクリレート、2−メトキシエチル2−シアノアクリレート、エチル2−シアノアクリレート、n−ブチル2−シアノアクリレート、2−オクチル2−シアノアクリレートおよびイソブチル2−シアノアクリレートのうちの1以上から選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載のナノスフェア。
- 1以上のマトリックス形成ポリマーが、ポリ(n−ブチル2−シアノアクリレート)、ポリ(エチル2−シアノアクリレート)およびこの混合物から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載のナノスフェア。
- ISO13321およびISO22412に従うキュムラント解析による測定時、0.5以下の範囲の多分散度、ならびに光子相関分光法による測定時、20から300nmの範囲の平均直径を有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の複数のナノスフェア。
- i)C1−C10−アルキルシアノアクリレートおよびC1−C6−アルコキシ−C1−C10−アルキルシアノアクリレートから選択される1以上の重合性モノマーを含む疎水性の液相を準備すること;
ii)エマルジョンが形成されるように該疎水性の液相を親水性の液相中に微細分散させること、ここで、該エマルジョンのpHは4.0以下である;
iii)1以上の該重合性モノマーの重合が加速されるように該エマルジョンのpHを4.0から6.0の範囲の値まで上げること;
iv)次いで、少なくとも1つの免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと少なくとも1つの免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む1以上の抗原結合性分子を添加すること;ならびに
v)最後に、該重合を、該pHをpH8.0を超えない値までさらに上げることにより継続させること;
を含み、これにより、ナノスフェア懸濁液を形成し、該1以上の抗原結合性分子は、1以上の該重合性モノマーの重合によって形成された高分子マトリックス中に組み込まれる、ナノスフェアの調製方法。 - ナノスフェアが、請求項2から7のいずれか一項に規定したとおりのものである、請求項8に記載の方法。
- 工程(ii)が、加圧下での均質化によって、および/または超音波処理により行なわれる、請求項8または請求項9に記載の方法。
- 工程(iii)においてpHを4.8から5.5の範囲の値まで上げる、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。
- 1以上の抗原結合性分子の添加後、エマルジョンを室温で5から20分間インキュベートする、請求項8から11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(v)においてエマルジョンのpHを6.8から7.5の範囲になるまで上げる、請求項8から12のいずれか一項に記載の方法。
- 疎水性の液相の量が、親水性の液相と疎水性の液相の総重量に対して1から40wt%である、請求項8から13のいずれか一項に記載の方法。
- 親水性の液相または疎水性の液相または両方に、1以上の安定剤が含有されている、請求項8から14のいずれか一項に記載の方法。
- 1以上の安定剤の量が、重合性モノマーの総重量に対して5から25wt%である、請求項15のいずれか一項に記載の方法。
- 1以上の安定剤が、ポロキサマー、n−C12−C16−アルキル硫酸ナトリウム、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサミン、ポリ(オキシエチレン)エーテル、ポリ(オキシエチレン)エステル、ポリエチレングリコールおよびこの混合物から選択される、請求項15または請求項16に記載の方法。
- 1以上の重合性モノマーが、メチル2−シアノアクリレート、2−メトキシエチル2−シアノアクリレート、エチル2−シアノアクリレート、n−ブチル2−シアノアクリレート、2−オクチル2−シアノアクリレートおよびイソブチル2−シアノアクリレートから選択される、請求項8から17のいずれか一項に記載の方法。
- 1以上の抗原結合性分子が、ガンマグロブリン、ダイマー抗体ならびにFab断片およびF(ab)2断片から選択される、請求項8から18のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項8から19のいずれか一項に記載の方法によって取得可能なナノスフェア。
- 請求項1から7のいずれか一項に記載の複数のナノスフェアおよび薬理学的に許容される担体を含む医薬組成物。
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