JP2017524710A

JP2017524710A - Immunogenic composition against Campylobacter jejuni

Info

Publication number: JP2017524710A
Application number: JP2017506284A
Authority: JP
Inventors: パトリシアゲーリー，; マリオ，アーターモンテイロ，
Original assignee: US Department of Navy
Current assignee: US Department of Navy
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2017-08-31
Anticipated expiration: 2035-07-31
Also published as: AU2015301368B2; JP6530051B2; WO2016022412A1; AU2015301368A1; WO2016022412A8; AU2018204255A1; CA2957430A1; WO2016022412A9; EP3188748A1; AU2018204255B2; EP3188748A4; CA2957430C

Abstract

本発明の主題は、特定の病原性カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）株由来の単離された莢膜多糖を含む、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）に対する免疫原性組成物に関する。本発明の主題は、多糖組成物を、抗カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）免疫応答の誘導において使用する方法にも関する。The subject of the present invention relates to an immunogenic composition against Campylobacter jejuni comprising an isolated capsular polysaccharide from a specific pathogenic Campylobacter jejuni strain. The subject of the invention also relates to a method of using the polysaccharide composition in the induction of an anti-Campylobacter jejuni immune response.

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００５年９月２１日に申請された米国仮特許出願第６０／７２２，０８６号の優先権を主張する、２００６年９月２０日に申請された米国非仮特許出願第１１／５２４，０５７号の一部継続出願であり、これらは本明細書に参照によって組み込まれている。本出願はまた、２０１４年９月２４日に申請された米国仮特許出願第６２／０５４，４５４号；２０１５年３月４日に申請された米国仮特許出願第６２／１２７，９２７号；２０１４年８月７日に申請された米国仮特許出願第６２／０３４，４３６号；および２０１５年５月２２日に申請された米国仮特許出願第６２／１６５，３０１号の利益を主張するものであり、これらは本明細書に参照によって組み込まれている。 CROSS REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS This application is a US non-provisional application filed September 20, 2006, claiming priority of US Provisional Patent Application No. 60 / 722,086 filed September 21, 2005. This is a continuation-in-part of Patent Application No. 11 / 524,057, which is hereby incorporated by reference. This application is also filed with US Provisional Patent Application No. 62 / 054,454, filed September 24, 2014; US Provisional Patent Application No. 62 / 127,927, filed March 4, 2015; Claims the benefit of US Provisional Patent Application No. 62 / 034,436, filed August 7, 2013; and US Provisional Patent Application No. 62 / 165,301, filed May 22, 2015. And are hereby incorporated by reference.

本発明の主題は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）によって引き起こされる下痢からの保護を付与する能力がある免疫原性組成物、および免疫原性組成物を使用してカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に対する免疫応答を誘導する方法に関する。 The subject of the invention is an immunogenic composition capable of conferring protection from diarrhea caused by Campylobacter jejuni, and immunization against C. jejuni using the immunogenic composition. It relates to a method for inducing a response.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）は、米国内で毎年２５０万の症例、世界中では４億超の症例を引き起こしていると見積もられる。開発途上国ではカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）はＥＴＥＣと同様、主に小児疾患である。カンピロバクター腸炎の症状には、下痢、腹痛、発熱および時として嘔吐が含まれる。便は通常、粘液、便中白血球および血液を含むが、水様下痢も観察される。この疾患は動物由来感染症であり、野生のおよび家畜化されたトリが主要な保有宿主となっている。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）は主要な食物由来の感染であり、大抵の場合は汚染された家禽が関連するが、突発的に大発生する場合は、水または生乳の汚染が関連していた（４４）。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）はライター症候群および炎症性腸症候群にも関連するが、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）腸炎の主要な合併症は、麻痺を生じ得る感染後性多発ニューロパチーのギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）である（Ａｌｌｏｓ，Ｂ．Ｍ．、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１７６（補遺２）：Ｓ１２５〜１２８頁（１９９７））。この関連性は、シアル酸を含有する、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）の外側コアと、ヒト・ガングリオシドとの間の分子擬態による（Ｍｏｒａｎら、Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．３：５２１頁（１９９６））。このため、ＬＯＳコアに対して生じた抗体は、ヒト神経組織に対する自己免疫応答をもたらす。 Campylobacter jejuni is estimated to cause 2.5 million cases annually in the United States and over 400 million cases worldwide. In developing countries, Campylobacter jejuni is mainly a pediatric disease, as is ETEC. Symptoms of Campylobacter enteritis include diarrhea, abdominal pain, fever and sometimes vomiting. Feces usually contain mucus, fecal leukocytes and blood, but watery diarrhea is also observed. The disease is an animal-derived infection, with wild and domestic birds being the primary reservoir. Campylobacter jejuni (C. jejuni) is a major food-borne infection, most often involving contaminated poultry, but sudden outbreaks have been associated with water or raw milk contamination ( 44). Campylobacter jejuni (C. jejuni) is also associated with Reiter's syndrome and inflammatory bowel syndrome, but the main complication of Campylobacter jejuni enteritis is the Guillain-Barre syndrome of post-infectious polyneuropathy that can cause paralysis (GBS) (Allos, B.M., J. Infect.Dis., 176 (Appendix 2): S125-128 (1997)). This association is due to molecular mimicry between the lipooligosaccharide (LOS) outer core containing sialic acid and human gangliosides (Moran et al., J. Endotox. Res. 3: 521 (1996)). Thus, antibodies raised against the LOS core result in an autoimmune response against human neural tissue.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）莢膜部分は、血清型の決定において重要である。しかし、４７を超える数のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＰｅｎｎｅｒ血清型が同定されているにも関わらず、ほとんどのカンピロバクター下痢疾患は、限られた数の血清型のみを発現するカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）によって引き起こされる。したがって、疫学研究に基いて選定されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株のみが、ワクチン組成物開発の適切な候補株となる。しかしこの生物のヒト疾患にとっての重要性にも関わらず、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に対する認可されたワクチンはない。 The Campylobacter jejuni capsular part is important in serotype determination. However, even though more than 47 C. jejuni Penner serotypes have been identified, most Campylobacter diarrhea diseases have only a limited number of serotypes expressed (C. jejuni). .Jejuni). Therefore, only C. jejuni strains selected based on epidemiological studies are suitable candidate strains for vaccine composition development. However, despite the importance of this organism to human disease, there is no approved vaccine against C. jejuni.

カンピロバクターにおけるＬＯＳ合成は、数個の遺伝子によって制御されており、これらには、ＬＯＳに組み込まれるシアル酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子が含まれる。このようにカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）は、多くの哺乳類細胞に見出される９炭素糖であるシアル酸を内在的に合成することができる数少ない細菌のうちの１つである。これは、ＬＯＳと、ＧＢＳにおいて重要なヒト・ガングリオシドとの間に観察される分子擬態と整合する（Ａｓｐｉｎａｌｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１３：１０２９頁（１９９３）；Ａｓｐｉｎａｌｌら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６２：２１２２〜２１２５頁（１９９４）；Ａｓｐｉｎａｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３３：２４１頁（１９９４）；Ｓａｌｌｏｗａｙら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、６４：２９４５頁（１９９６））。 LOS synthesis in Campylobacter is controlled by several genes, which include genes encoding enzymes involved in the biosynthesis of sialic acid that is incorporated into LOS. Thus, Campylobacter jejuni is one of the few bacteria that can endogenously synthesize sialic acid, a 9-carbon sugar found in many mammalian cells. This is consistent with the molecular mimicry observed between LOS and human gangliosides important in GBS (Aspinall et al., Eur. J. Biochem., 213: 1029 (1993); Aspinall et al., Infect. Immun. 62: 2122-2125 (1994); Aspinall et al., Biochem., 33: 241 (1994); Salloway et al., Infect.Immun., 64: 2945 (1996)).

カンピロバクターゲノム配列に関して最近明らかになった興味深い事実は、ＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｃｅａｅのタイプＩＩ／ＩＩＩ莢膜遺伝子座に見られるものに類似した莢膜輸送遺伝子の全セットが存在することであった（Ｐａｒｋｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４０３：６６５頁（２０００）；Ｋａｒｌｙｓｈｅｖら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３５：５２９頁（２０００））。その後の、数個の莢膜輸送遺伝子に部位特異的変異を導入した遺伝研究から、莢膜が、Ｐｅｎｎｅｒ血清型別法における血清型決定因子であったことが示された（Ｋａｒｌｙｓｈｅｖら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３５：５２９頁（２０００））。Ｐｅｎｎｅｒ法（または、熱安定の意味のＨＳ）は、カンピロバクターの主要な２つの血清型別法のうちの１つであり、当初はリポ多糖Ｏ側鎖に基づくものと考えられていた（ＭｏｒａｎおよびＰｅｎｎｅｒ、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、８６：３６１頁（１９９９））。現在では、以前、Ｏ側鎖として報告されていた構造は、実は莢膜であると考えられている。 An interesting fact recently revealed regarding the Campylobacter genome sequence was that there was a full set of capsular transport genes similar to those found in the Type II / III capsular locus of Enterobactericae (Parkhill et al., Nature, 403: 665 (2000); Karlyshev et al., Mol. Microbiol., 35: 529 (2000)). Subsequent genetic studies in which site-specific mutations were introduced into several capsular transport genes showed that the capsular membrane was a serotype determinant in the Penner serotyping method (Kalyshev et al., Mol. Microbiol., 35: 529 (2000)). The Penner method (or HS in the sense of heat stability) is one of Campylobacter's two major serotyping methods and was originally thought to be based on the lipopolysaccharide O side chain (Moran and Penner, J. Appl. Microbiol., 86: 361 (1999)). Currently, the structure previously reported as the O side chain is actually considered to be a capsule.

本発明の組成物は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）株に由来し、多糖ポリマーを形成するように結合している、単離された莢膜多糖を含む多糖抗原を含む免疫原性組成物に関する。この多糖は、リポオリゴ糖構造およびギラン・バレー症候群または自己免疫異常に関連する他の構造から、単離されている。実施形態の組成物は、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４、ＨＳ４４、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、ＨＳ５、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４およびＨＳ５０からなる群から選択されるカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の単離された多糖をそれぞれが含む、１つまたは複数の多糖抗原を含む。 The composition of the present invention relates to an immunogenic composition comprising a polysaccharide antigen comprising an isolated capsular polysaccharide derived from a Campylobacter jejuni strain and bound to form a polysaccharide polymer. This polysaccharide has been isolated from lipooligosaccharide structures and other structures associated with Guillain-Barre syndrome or autoimmune abnormalities. The composition of the embodiment comprises a single strain from Campylobacter jejuni strain selected from the group consisting of HS1, HS1 / HS44, HS44, HS2, HS3, HS4, HS5, HS13, HS4 / 13/64 and HS50. It includes one or more polysaccharide antigens, each containing a released polysaccharide.

別の実施形態は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の単離された多糖または多糖ポリマーを各抗原が含む、１つまたは複数の多糖抗原を含む免疫原性組成物を投与することによって免疫応答を誘導する方法であって、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株は、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４、ＨＳ４４、ＨＳ、ＨＳ３、ＨＳ４、ＨＳ５、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４およびＨＳ５０からなる群から選択される、方法である。この組成物は、リポオリゴ糖構造およびギラン・バレー症候群または他の自己免疫異常に関連する他の構造を含まない。 Another embodiment is to immunize by administering an immunogenic composition comprising one or more polysaccharide antigens, each antigen comprising an isolated polysaccharide or polysaccharide polymer from a C. jejuni strain. A method for inducing a response, wherein the C. jejuni strain is selected from the group consisting of HS1, HS1 / HS44, HS44, HS, HS3, HS4, HS5, HS13, HS4 / 13/64 and HS50. It is a method. This composition does not contain lipooligosaccharide structures and other structures associated with Guillain-Barre syndrome or other autoimmune abnormalities.

別の実施形態は、１つまたは複数の抗原を投与することによって、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４およびＨＳ５０に対して免疫する方法であって、各抗原は、ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４およびＨＳ５０からなる群から選択されるカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の単離された多糖または多糖ポリマーを含む方法である。 Another embodiment is a method of immunizing against Campylobacter jejuni strains HS4, HS13, HS4 / 13/64 and HS50 by administering one or more antigens, wherein each antigen is , A method comprising an isolated polysaccharide or polysaccharide polymer from a C. jejuni strain selected from the group consisting of HS4, HS13, HS4 / 13/64 and HS50.

別の実施形態は、１つまたは複数の抗原を投与することによって、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４、ＨＳ４４に対して免疫する方法であって、各抗原は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４からなる群から選択されるカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の単離された多糖または多糖ポリマーを含む方法である。 Another embodiment is a method of immunizing against Campylobacter jejuni strains HS1, HS1 / HS44, HS44 by administering one or more antigens, wherein each antigen is Campylobacter jejuni ( C. jejuni) A method comprising an isolated polysaccharide or polysaccharide polymer from a C. jejuni strain selected from the group consisting of strain HS4, HS13, HS4 / 13/64.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ１およびＨＳ４４Ｐｅｎｎｅｒ型株由来の可変的なＣＰＳ遺伝子座のアライメントを示す図である。遺伝子は図中に示した通りであり、メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）生合成およびトランスフェラーゼ；ＣＰＳ輸送および構築；推定上のメチルトランスフェラーゼ；ヘプトース／デオキシヘプトース生合成；推定上のグリコシルトランスフェラーゼ；糖生合成；ならびに推測された遺伝子を含む。FIG. 2 shows an alignment of variable CPS loci from C. jejuni HS1 and HS44 Penner type strains. The genes are as shown in the figure, methyl phosphoramidate (MeOPN) biosynthesis and transferase; CPS transport and assembly; putative methyltransferase; heptose / deoxyheptose biosynthesis; putative glycosyltransferase; Including sugar biosynthesis; as well as putative genes. ＨＳ１タイコ酸様の莢膜の構造を示す図である。It is a figure which shows the structure of a HS1 tycoic acid-like capsule. カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ：１／４４タイコ酸ＣＰＳの２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを示す図である。このＮＭＲスペクトルから、ＭｅＯＰＮ部分とＦｒｕ単位の３位とが繋がっていること、ならびにリン酸ジエステルとＧａｌの４位およびＧｒｏの１位とが繋がっていることが示される。FIG. ¹ shows a 2D ¹ H- ³¹ P HMBC NMR spectrum of C. jejuni HS: 1/44 tycoic acid CPS. This NMR spectrum shows that the MeOPN moiety and the 3rd position of the Fru unit are connected, and that the phosphate diester and the 4th position of Gal and the 1st position of Gro are connected. カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ４４ＣＰＳ物質のＧＣ−ＭＳおよびＮＭＲを示す図である。（Ａ）（ｉ）タイコ酸ＣＰＳの主鎖単位である、グリセロール（Ｇｒｏ）およびガラクトース（Ｇａｌ）、ならびに（ｉｉ）ヘプトースに富む第２のＣＰＳから生じた主鎖単位である、６−デオキシ−３−Ｏ−メチル−アルトロ−ヘプトース（６ｄ−３−Ｏ−Ｍｅ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ）、６−デオキシ−アルトロ−ヘプトース（６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ）および６−デオキシ−ガラクト−ヘプトース（６ｄ−ｇａｌ−Ｈｅｐ）を示す、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ４４の２つのＣＰＳ由来のアルジトール・アセテート誘導体のＧＣ−ＭＳプロファイル。（Ｂ）ヘプトースに富むＣＰＳの６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐｆ、６−デオキシ−ｇａｌａｃｔｏ−Ｈｅｐｆおよび６ｄ−３−Ｏ−Ｍｅ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐｆ、ならびにタイコ酸ＣＰＳのＧａｌから生じたα−アノマー共鳴を示す、ＨＳ４４ＣＰＳ物質の^１ＨＮＭＲスペクトル。FIG. 2 shows GC-MS and NMR of C. jejuni HS44 CPS material. (A) (i) the main chain units of tycoic acid CPS, glycerol (Gro) and galactose (Gal), and (ii) the main chain units resulting from the second CPS rich in heptose, 6-deoxy- 3-O-methyl-altro-heptose (6d-3-O-Me-altro-Hep), 6-deoxy-altro-heptose (6d-altro-Hep) and 6-deoxy-galacto-heptose (6d-gal- GC-MS profile of two CPS-derived alditol acetate derivatives of C. jejuni HS44 showing Hep). (B) shows α-anomeric resonances generated from 6d-altro-Hepf, 6-deoxy-galacto-Hepf and 6d-3-O-Me-altro-Hepf of heptose-rich CPS, and Gal of tycoic acid CPS. ¹ H NMR spectrum of HS44 CPS material. ＨＳ１ＣＰＳ遺伝子座の変異体の特性決定を示す図である。Ａ．粗製ＣＰＳ調製物のアルシアン・ブルー染色１２．５％ＳＤＳＰＡＧＥ。レーン１：ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌｕｓタンパク質標準物質、レーン２：ＨＳ１野生型、レーン３：ＨＳ１１．０８突然変異体、レーン４：相補されたＨＳ１１．０８突然変異体、レーン５：ＨＳ１１．０９突然変異体、レーン６：相補されＨＳ１１．０９突然変異体、レーン７：ＨＳ１野生型。Ｂ．ＨＳ１．０８相補体由来のＣＰＳの^３１ＰＮＭＲ；Ｃ．ＨＳ１．０９相補体由来のＣＰＳの^３１ＰＮＭＲ；Ｄ．ＨＳ１野生型由来のＣＰＳの^３１ＰＮＭＲ。FIG. 5 shows characterization of variants at the HS1 CPS locus. A. Alcian blue stained 12.5% SDS PAGE of crude CPS preparation. Lane 1: Precision Plus protein standard, Lane 2: HS1 wild type, Lane 3: HS11.08 mutant, Lane 4: Complemented HS11.08 mutant, Lane 5: HS11.09 mutant, Lane 6: Complemented HS11.09 mutant, Lane 7: HS1 wild type. B. C. ³¹ P NMR of CPS from HS1.08 complement; ³¹ P NMR of CPS derived from HS 1.09 complement; ³¹ P NMR of CPS from HS1 wild type. カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５ＣＰＳのアルジトール・アセテート誘導体のＧＣ−ＭＳプロファイルを示す図である。FIG. 6 shows a GC-MS profile of an alditol acetate derivative of C. jejuni CG2995 CPS. カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５ＣＰＳの^１ＨＮＭＲスペクトルを示す図である。 ^{1 is} a ¹ H NMR spectrum of C. jejuni CG2995 CPS. FIG. （Ａ）カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５ＣＰＳの２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣＮＭＲスペクトル；および（Ｂ）カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５ＣＰＳの１Ｄ選択的^１ＨＮＯＥを示す図である。照射によるピークは「^＊」によって示す。０．２５０μｓの混合時間を使用した。(A) 2D ¹ H- ¹³ C HSQC NMR spectrum of C. jejuni CG2995 CPS; and (B) 1D selective ¹ H NOE of C. jejuni CG2995 CPS. The peak due to irradiation is indicated by “ ^* ”. A mixing time of 0.250 μs was used. カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５ＣＰＳの^３１ＰＮＭＲスペクトルを示す図である。FIG. 5 shows a ³¹ P NMR spectrum of C. jejuni CG2995 CPS. カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５ＣＰＳの２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲスペクトルを示す図である。FIG. 2 shows 2D ¹ H- ³¹ P HMBC NMR spectrum of C. jejuni CG2995 CPS. ｉ）カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５の主要なＰＳ構造、ｉｉ）異型体１、ｉｉｉ）異型体２、およびｉｖ）異型体３の４つの異型体を示すＨＳ５ＣＰＳを示す図である。i) Campylobacter jejuni CG2995 major PS structure, ii) variant 1, iii) variant 2, and iv) variant 5 HS5 CPS showing variant 4. ３，６−ジデオキシ−リボ−ヘプトースの存在量の減少を示すＴＥＭＰＯ酸化後のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５のＣＰＳのアルジトール・アセテート誘導体のＧＣ−ＭＳプロファイル（上）を示す図である。FIG. 6 shows a GC-MS profile (top) of the CPS alditol acetate derivative of C. jejuni CG2995 after TEMPO oxidation showing a decrease in the abundance of 3,6-dideoxy-ribo-heptose. ３，６−ジデオキシ−リボ−ヘプトースの存在量の減少を示すＴＥＭＰＯ酸化を示す図である。これから、そのＣ−７の一級ヒドロキシル（ＭｅＯＰＮを欠く）が、このＣＰＳにおいて好まれる酸化部位であり、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５ＣＰＳの担体タンパク質ＣＲＭ１９７へのコンジュゲート化に主に関与することが示される。FIG. 5 shows TEMPO oxidation showing a decrease in the abundance of 3,6-dideoxy-ribo-heptose. Thus, the primary hydroxyl of C-7 (devoid of MeOPN) is the preferred oxidation site in this CPS and is primarily involved in conjugation of C. jejuni CG2995 CPS to the carrier protein CRM197. Is shown. ＨＳ１コンジュゲート・ワクチン（結合型ワクチン）の特性決定を示す図である。Ａ．コンジュゲートＣＰＳ中のＭｅＯＰＮの存在を示す、ＨＳ１_ＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート・ワクチンの^３１ＰＮＭＲ。Ｂ．ゲルコード・ブルー染色１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン１：ＣＲＭ_１９７、レーン２：ＨＳ１−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート。タンパク質標準物質の質量は左に示す。FIG. 6 shows characterization of HS1 conjugate vaccine (conjugated vaccine). A. ³¹ P NMR of HS1 _CPS- CRM ₁₉₇ conjugate vaccine indicating the presence of MeOPN in the conjugate _CPS . B. Gel code blue stained 12% SDS-PAGE gel. Lane 1: CRM ₁₉₇ , Lane 2: HS1-CRM ₁₉₇ conjugate. The mass of the protein standard is shown on the left. ＨＳ：１３ＣＰＳのＮＭＲを示す図である。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）３０１９ＣＰＳ（血清型ＨＳ：１３）の（Ａ）１Ｄ ^１ＨＮＭＲ；および（Ｂ）１Ｄ ^３１ＰＮＭＲスペクトル。It is a figure which shows NMR of HS: 13 CPS. (A) 1D ¹ H NMR; and (B) 1D ³¹ P NMR spectrum of C. jejuni 3019 CPS (serotype HS: 13). ＮＭＲによるＭｅＯＰＮ基の結合の決定を示す図である。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＢＨ−０１−０１４２ＣＰＳの２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲスペクトル（Ａ’：Ｃ残基を有する１，２，３−結合６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ／ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ、Ｃ：ＭｅＯＰＮ）。It is a figure which shows the determination of the coupling | bonding of MeOPN group by NMR. 2D ¹ H- ³¹ P HMBC NMR spectrum of C. jejuni BH-01-0142 CPS (A ′: 1,2,3-linked 6d-ido-Hep / LD-ido-Hep with C residue) , C: MeOPN). 非糖部分が３−ヒドロキシプロパノイルであったことを示すＮＭＲ分析である。（Ａ）カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＢＨ−０１−０１４２ＣＰＳの２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＭＢＣＮＭＲスペクトル（Ｂ’：残基Ｄを有する１，３，４−結合Ｇａｌ；（Ｂ）Ｄ：３−ヒドロキシプロパノイル基。It is a NMR analysis which shows that the non-sugar part was 3-hydroxypropanoyl. (A) Campylobacter jejuni BH-01-0142 CPS 2D ¹ H- ¹³ C HMBC NMR spectrum (B ′: 1,3,4-bonded Gal with residue D; (B) D: 3 -Hydroxypropanoyl group. マウスにおけるＨＳ１−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートの免疫原性を示す図である。Ａ．３回の投与の２週間後のＨＳ１−ＢＳＡに対するＥＬＩＳＡ力価。Ｂ．１：１０００に最終希釈したマウス血清で免疫検出したカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）細胞のドットブロット。FIG. 5 shows the immunogenicity of HS1-CRM ₁₉₇ conjugate in mice. A. ELISA titer against HS1-BSA 2 weeks after 3 doses. B. Dot blot of Campylobacter jejuni cells immunodetected with 1: 1000 final diluted mouse serum. ＨＳ５−ＣＲＭ_１９７コンジュゲートに対する免疫応答を示す図である。３用量（コンジュゲートの重量に基づいて、１０μｇおよび５０μｇ）を用いて４週間の間隔でマウスを免疫した。最後の投与の２週間後、マウスから採血した。FIG. 5 shows immune response to HS5-CRM ₁₉₇ conjugate. Mice were immunized at 4 week intervals with 3 doses (10 μg and 50 μg based on the weight of the conjugate). Two weeks after the last administration, blood was collected from the mice. ＢＨ０１４２（ＨＳ３）コンジュゲート・ワクチンがマウスにおいて免疫原性であることを示す図である。データは、処置群毎における、逆数のＩｇＧ最終力価の平均（±標準誤差）を表す。FIG. 5 shows that BH0142 (HS3) conjugate vaccine is immunogenic in mice. Data represent the mean (± standard error) of the reciprocal IgG final titer for each treatment group. ＨＳ１−ＣＲＭ１９７ワクチンの免疫原性を実証するドットブロットである。精製莢膜（１ｍｇ／ｍｌ）を３連（各２μｌ）でニトロセルロースにドットブロットし、ＨＳ１−ＣＲＭ１９７ワクチンに対するウサギ・ポリクローナル抗血清で免疫検出した。ＨＳ１：野生型ＨＳ１莢膜、ＨＳ１．０８：フルクトース分枝およびＭｅＯＰＮを欠く、ＨＳ１のフルクトース・トランスフェラーゼ変異体由来の莢膜、ＨＳ２３／３６：異種莢膜（ＨＳ２３／３６）を発現する８１−１７６由来の莢膜。2 is a dot blot demonstrating the immunogenicity of the HS1-CRM197 vaccine. Purified capsules (1 mg / ml) were dot blotted in triplicate (2 μl each) onto nitrocellulose and immunodetected with rabbit polyclonal antisera against the HS1-CRM197 vaccine. HS1: Wild type HS1 capsule, HS1.08: fructose branch and MeOPN-derived capsule derived from fructose transferase mutant of HS1, HS23 / 36: expressing heterologous capsule (HS23 / 36) 81-176 The capsule of origin.

本明細書で使用される「多糖抗原」という用語は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉまたはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）莢膜由来の莢膜多糖を指す。本明細書で使用される場合、各多糖抗原は、１つのカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の多糖または多糖ポリマーを含む。本発明の組成物は、複数の多糖抗原から構成されていてもよい。本明細書で使用される「多糖」は、炭水化物ポリマー分子を構成する２つ以上の単糖単位を指す。「多糖ポリマー」は、繋ぎ合わされた２つ以上の多糖分子を指す。本明細書で使用される、多糖構造中の「ｎ」は、そのポリマー中の多糖反復の数を指し、１以上であり、１００までになり得る。 As used herein, the term “polysaccharide antigen” refers to a capsular polysaccharide derived from a C. jejuni or Campylobacter jejuni capsule. As used herein, each polysaccharide antigen comprises a polysaccharide or polysaccharide polymer from one C. jejuni strain. The composition of the present invention may be composed of a plurality of polysaccharide antigens. As used herein, “polysaccharide” refers to two or more monosaccharide units that make up a carbohydrate polymer molecule. “Polysaccharide polymer” refers to two or more polysaccharide molecules joined together. As used herein, “n” in a polysaccharide structure refers to the number of polysaccharide repeats in the polymer and is greater than or equal to 1 and can be up to 100.

本発明の実施形態は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株の莢膜由来の多糖または多糖ポリマーを含む多糖抗原を含む。莢膜多糖が単離される株は、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４、ＨＳ４４、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、ＨＳ５、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４およびＨＳ５０からなる群から選択される。莢膜多糖ポリマーは、個々のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の、繋ぎ合わされて多糖ポリマーを形成した１〜１００コピーの多糖構造を含む。本発明の免疫原性組成物は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）多糖構造または多糖ポリマーを各多糖抗原が含む、１つまたは複数の多糖抗原を含む。これらの多糖は、リポオリゴ糖またはＧＢＳもしくは他の自己免疫異常に関連する他の構造から分離された形で単離または精製されている。 Embodiments of the present invention include polysaccharide antigens comprising polysaccharides or polysaccharide polymers derived from the capsules of C. jejuni strains. The strain from which the capsular polysaccharide is isolated is selected from the group consisting of HS1, HS1 / HS44, HS44, HS2, HS3, HS4, HS5, HS13, HS4 / 13/64 and HS50. The capsular polysaccharide polymer contains 1 to 100 copies of the polysaccharide structure joined together to form a polysaccharide polymer from individual C. jejuni strains. The immunogenic composition of the present invention comprises one or more polysaccharide antigens, each polysaccharide antigen comprising an isolated C. jejuni polysaccharide structure or polysaccharide polymer derived from a C. jejuni strain. including. These polysaccharides have been isolated or purified in a form separated from lipooligosaccharides or other structures associated with GBS or other autoimmune abnormalities.

多数のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株が同定されている。本発明の一実施形態は、ヒトにおいて疾患をもたらすことが示されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の莢膜多糖のみを含む。 A number of Campylobacter jejuni strains have been identified. One embodiment of the present invention includes only capsular polysaccharides from C. jejuni strains that have been shown to cause disease in humans.

ＨＳ１／ＨＳ４４およびＨＳ４４多糖構造
カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に対するワクチン戦略は、多くの株のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のリポオリゴ糖（ＬＯＳ）コアと、ヒト・ガングリオシドとの間の分子擬態のために大きく制限されてきた（Ｍｏｒａｎら、Ｊ．Ｅｎｄｏｔｏｘ．Ｒｅｓ．、３：５２１頁（１９９６））。この擬態は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）感染が、感染後性多発ニューロパチーのギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）と強く関連する主要な要因であると考えられる（Ａｌｌｏｓ、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１７６（補遺）：Ｓ１２５〜１２８頁（１９９７））。このため、ＬＯＳコアに対して生じた抗体は、ヒト神経組織に対する自己免疫応答をもたらす。カンピロバクター腸炎の症例のうち、３０００分の１もの症例がＧＢＳに至ると見積もられている。したがって、ガングリオシド擬態を含むカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に対するいずれの全細胞ワクチンも、ＧＢＳを発症する可能性を伴い得る。 HS1 / HS44 and HS44 polysaccharide structures The vaccine strategy against C. jejuni is due to molecular mimicry between the lipooligosaccharide (LOS) core of many strains of Campylobacter jejuni and human ganglioside. (Moran et al., J. Endotox. Res., 3: 521 (1996)). This mimicry is believed to be a major factor in Campylobacter jejuni infection that is strongly associated with post-infectious polyneuropathy Guillain-Barre syndrome (GBS) (Allos, J. Infect. Dis., 176). (Addendum): S125-128 (1997)). Thus, antibodies raised against the LOS core result in an autoimmune response against human neural tissue. It is estimated that as many as one in 3000 cases of Campylobacter enteritis will reach GBS. Thus, any whole cell vaccine against C. jejuni that contains a ganglioside mimetic can be associated with the possibility of developing GBS.

分子ＣＰＳ型別システムが最近開発され、ＣＰＳ型とＰｅｎｎｅｒ型との強い相関が再確認された（Ｐｏｌｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１７５０頁（２０１１））。Ｐｅｎｎｅｒ血清型別および分子ＣＰＳ型別のいずれからも、ひと握りのＣＰＳ型が世界全体において優勢であることが明らかになっている。ＣＰＳ型の中では、ＨＳ１複合体が最も一般的もののうちの１つであり、世界全体において、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）により誘導される下痢の８．２％の原因となっている（（Ｐｏｌｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１７５０頁（２０１１）；Ｐｉｋｅら、ｐｌＯｓＯｎｅ、８：ｅ６７３７５（２０１３））。この複合体はＨＳ１およびＨＳ４４型から構成され、菌株をＨＳ１、ＨＳ４４またはＨＳ１／４４として血清型別することができる。これまでのところ、ＨＳ１型株のＣＰＳ構造しか記載されておらず、これは、タイコ酸様構造［−４）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１−２）−Ｇｒｏ−（１−Ｐ−］_ｎ中のリン酸（Ｐ）によって結合した４−置換α−Ｄ−ガラクトース（Ｇａｌ）およびグリセロール（Ｇｒｏ）から構成される反復単位から構成される（Ａｓｐｉｎａｌｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１６：８８０頁（１９９３））。ＨＳ１ＣＰＳ主鎖は、Ｇａｌ単位のＣ−２およびＣ−３においてβ−Ｄ−フルクトフラノース（Ｆｒｕ）分枝によって修飾されていることがあり、この分枝はさらにＣ−３においてメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）によって修飾されていることがある（図１；（ＭｃＮａｌｌｙら、ＦＥＢＳＪ．２７２：４４０７頁（２００５））。フルクトフラノース分枝およびメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）はいずれも非化学量論的量で見出されるがこれはおそらく、それぞれのトランスフェラーゼをコードする遺伝子内の、塩基のホモポリマー領域における相変異（ｐｈａｓｅｖａｒｉａｔｉｏｎ）による（ＭｃＮａｌｌｙら、ＦＥＢＳＪ．２７２：４４０７頁（２００５））。この多糖（ＢＸ５４５８５９）の合成のための１１個の遺伝子をコードする約１５ｋｂのＨＳ１ＣＰＳ遺伝子座は、これまでにカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）において同定された最も小さいＣＰＳ遺伝子座である（Ｋａｒｌｙｓｈｅｖら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：４００４頁（２００５））（図１）。 A molecular CPS typing system was recently developed and the strong correlation between CPS and Penner was reconfirmed (Poly et al., J. Clin. Microbiol. 49: 1750 (2011)). Both Penner serotypes and molecular CPS types have revealed that a handful of CPS types dominate worldwide. Among the CPS types, the HS1 complex is one of the most common and is responsible for 8.2% of diarrhea induced by C. jejuni worldwide (( Poly et al., J. Clin. Microbiol. 49: 1750 (2011); Pike et al., PlOs One, 8: e67375 (2013)) This complex is composed of HS1 and HS44 types, and the strain is designated as HS1, HS44 or HS1. / 44, so far, only the CPS structure of the HS1 type strain has been described, which is a tycoic acid-like structure [-4) -α-D-Galp- (1- 2) 4-Gro- (1-P-) 4-substituted α-D-galactose (Gal) and glyceride linked by phosphoric acid (P) in _n (Aspinall et al., Eur. J. Biochem. 216: 880 (1993)) The HS1 CPS backbone is at the Gal units C-2 and C-3. It may be modified by β-D-fructofuranose (Fru) branch, which may be further modified at C-3 by methyl phosphoramidate (MeOPN) (FIG. 1). (McNally et al., FEBS J. 272: 4407 (2005)) Both fructofuranose branching and methyl phosphoramidate (MeOPN) are found in non-stoichiometric amounts, which are probably Phase mutation in the homopolymer region of the base in the gene encoding transferase (phase v (McNally et al., FEBS J. 272: 4407 (2005)) The approximately 15 kb HS1 CPS locus encoding 11 genes for the synthesis of this polysaccharide (BX545858) has so far been described by Campylobacter jejuni ( C. jejuni) is the smallest CPS locus identified (Kalyshev et al., Appl. Environ. Microbiol. 71: 4004 (2005)) (FIG. 1).

使用したＨＳ１型株はＭＳＣ５７３６０およびＨＳ４４株（ＡＴＣＣ４３４６３）であり、米国タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）（マナッサス、バージニア）から入手した。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＣＧ９８−Ｕ−７７は、タイの下痢症例から単離されたものであり、ｔｈｅＡｒｍｅｄＦｏｒｃｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＡＦＲＩＭＳ）から入手した。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株は、３７℃で、微好気条件（５％Ｏ_２、１０％ＣＯ_２および８５％Ｎ_２）下、必要なら適切な抗生物質を補充したミュラー・ヒントン（ＭＨ）寒天プレート上で通常手順として培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ株は、適切な抗生物質を補充したＬＢ培地で育てた。 HS1 type strains used were MSC57360 and HS44 strains (ATCC 43463), which were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginia). C. jejuni strain CG98-U-77 was isolated from a case of diarrhea in Thailand and was obtained from the Armed Forces Research Institute of Medical Sciences (AFRIMS). Campylobacter jejuni strain was developed at 37 ° C. under microaerobic conditions (5% O ₂ , 10% CO ₂ and 85% N ₂ ), with Mueller Hinton (MH) supplemented with appropriate antibiotics as needed ) Cultivated as a normal procedure on agar plates. E. E. coli strains were grown in LB medium supplemented with appropriate antibiotics.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ゲノムＤＮＡを１６時間培養物から抽出した。ＣＰＳ遺伝子座の配列決定は、以前に記載されたように（Ｋａｒｌｙｓｈｅｖら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：９０頁（２００５）；ＰｏｌｙらＪ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：１７５０頁（２０１１）；Ｋａｒｌｙｓｈｅｖら、Ｇｅｎｅ、５２２：３７頁（２０１３））行った。 C. jejuni genomic DNA was extracted from the culture for 16 hours. Sequencing of the CPS locus was performed as previously described (Kalyshev et al., Mol. Microbiol. 55: 90 (2005); Poly et al. J. Clin. Microbiol. 49: 1750 (2011); Karlyshev et al., Gene, 522: 37 (2013)).

ＣＰＳを、７０℃、２時間の熱水−フェノール抽出によって細胞から抽出した。水層を水で透析（１０００Ｄａ）し、続いて超遠心によりＣＰＳをＬＯＳから分離した。ＣＰＳを含有する上清物をサイズ排除クロマトグラフィー（セファデックスＧ５０）にかけてさらに精製して、無傷のＣＰＳを得た。 CPS was extracted from the cells by hot water-phenol extraction at 70 ° C. for 2 hours. The aqueous layer was dialyzed against water (1000 Da), followed by separation of CPS from LOS by ultracentrifugation. The supernatant containing CPS was further purified by size exclusion chromatography (Sephadex G50) to obtain intact CPS.

単糖組成の決定は、アルジトール・アセテート法が容易に適用可能な手順を用いて行い（Ｃｈｅｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４３：１０３４頁（２００８））、アルジトール・アセテートは、ＤＢ−１７キャピラリーカラムを使用してＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎＰＯＬＡＲＩＳ（商標）−Ｑ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ、ウォルサム、マサチューセッツ）ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）で分析した。糖の結合の種類は、以前に記載されているように（Ｃｈｅｎら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４３：１０３４頁（２００８））、ＧＣ／ＭＳにより高メチル化アルジトール・アセテートを特性決定することによって、特性決定した。ＮＭＲ実験は、２９５Ｋで、重水素化トリメチルシリル・プロパン酸およびオルトリン酸を外部標準とし、Ｂｒｕｋｅｒクライオ・プラットフォームを備えたＢｒｕｋｅｒ４００ＭＨｚ分光計（ＢｒｕｋｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉａ、マサチューセッツ）で行った。 Determination of the monosaccharide composition is performed using a procedure to which the alditol acetate method can be easily applied (Chen et al., Carbohydr. Res. 343: 1034 (2008)), and alditol acetate uses a DB-17 capillary column. ThermoFinnigan POLARIS ™ -Q (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, Mass.) Gas chromatograph / mass spectrometer (GC / MS). The type of sugar linkage can be characterized by characterizing hypermethylated alditol acetate by GC / MS as previously described (Chen et al., Carbohydr. Res. 343: 1034 (2008)). Were determined. NMR experiments were performed at 295 K on a Bruker 400 MHz spectrometer (Bruker Corporation, Billeria, Mass.) Equipped with a Bruker cryoplatform with deuterated trimethylsilyl propanoic acid and orthophosphoric acid as external standards.

多糖の合成のための遺伝子を含む可変的な領域は、莢膜の合成および構築に関与するＡＢＣトランスポーターをコードする保存された遺伝子の間に位置し（図１）、この領域にはＨＳ１ＣＰＳ遺伝子座の可変的な領域も認められる（ＭｃＮａｌｌｙら、ＦＥＢＳＪ．２７２：４４０７頁（２００５））。ＨＳ４４型株の莢膜遺伝子座のＤＮＡ配列は、ＨＳ１に見出される１１個の遺伝子のうちの１０個のホモログを含み、機能未知の遺伝子であるＨＳ１．０８のみを欠いていた（図１）。ＨＳ４４莢膜生合成遺伝子座の遺伝子の内訳を表１にまとめる。共有されるホモログは、推定上のメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）トランスフェラーゼ（ＨＳ４４．０７）がＨＳ１のそれと４７％の同一性しか示さなかった以外は全て、９６％超の同一性を有していた。 The variable region containing the gene for polysaccharide synthesis is located between the conserved genes encoding ABC transporters involved in capsule synthesis and assembly (FIG. 1), and this region contains HS1 CPS. A variable region of the locus is also observed (McNally et al., FEBS J. 272: 4407 (2005)). The DNA sequence of the capsular locus of the HS44 type strain contained 10 homologs of 11 genes found in HS1 and lacked only HS1.08, a gene of unknown function (FIG. 1). Table 1 summarizes the breakdown of the genes of the HS44 capsule biosynthesis locus. All shared homologs have greater than 96% identity except that the putative methyl phosphoramidate (MeOPN) transferase (HS44.07) showed only 47% identity with that of HS1. It was.

ＨＳ４４遺伝子座にはさらに１０個の遺伝子の挿入がＨＳ１．０７とＨＳ１．０９との間に含まれ、これは９，２５８塩基対に渡る（表１、図１）。これらの遺伝子には、デオキシヘプトース生合成に関与すると予測される酵素をコードする４個の遺伝子と（ＨＳ４４．０８〜ＨＳ４４．１１）、６−デオキシ−アルトロ−ヘプトース生合成に関与することが最近示されたエピメラーゼ・レダクターゼと相同性があるタンパク質をコードする３個の遺伝子（ＨＳ４４．１２、ＨＳ４４．１３およびＨＳ４４．１５）とが含まれる。ＨＳ４４のＣＰＳ遺伝子座は、ＮＣＴＣ１１１６８（ＨＳ２）の機能未知のタンパク質をコードするＣＪ１４２９ｃに類似した遺伝子（ＨＳ４４．１４）、ヌクレオチジル−糖ピラノース・ムターゼ（ＨＳ４４．１６）、および推定上のヘプトシルトランスフェラーゼ（ＨＳ４４．１７、表１および図１）も含む。対照的に、ＨＳ１／４４として型別された臨床分離株の可変的なＣＰＳ遺伝子座のＤＮＡ配列は、ＨＳ１の型の株における配列と同一であった。これらの２個の莢膜遺伝子座の１１個の遺伝子から予測された最小のタンパク質相同性は９９％超であった。 The HS44 locus further contains an insertion of 10 genes between HS1.07 and HS1.09, which spans 9,258 base pairs (Table 1, FIG. 1). These genes include four genes encoding enzymes that are predicted to be involved in deoxyheptose biosynthesis (HS44.08 to HS44.11) and may be involved in 6-deoxy-altro-heptose biosynthesis. Three genes (HS44.12, HS44.13 and HS44.15) encoding proteins with homology to the recently shown epimerase reductase are included. The CPS locus of HS44 contains a gene similar to CJ1429c (HS44.14) encoding a protein of unknown function of NCTC 11168 (HS2), nucleotidyl-sugar pyranose mutase (HS44.16), and putative heptosyl Also included is a transferase (HS44.17, Table 1 and FIG. 1). In contrast, the DNA sequence of the variable CPS locus of clinical isolates typed as HS1 / 44 was identical to that in the HS1 type strain. The minimum protein homology predicted from 11 genes at these two capsular loci was> 99%.

精密な構造解析から、ＨＳ１／４４の多糖構造が、以前に記載されたＨＳ１株のタイコ酸莢膜多糖（ＣＰＳ）の多糖構造（Ａｓｐｉｎａｌｌ，ＭｃＤｏｎａｌｄら、１９９３年、ＭｃＮａｌｌｙ，Ｊａｒｒｅｌｌら、２００５年）である、→４）−［ＭｅＯＰＮ→３）−β−Ｄ−Ｆｒｕ−（１→］−α−Ｇａｌ−（１→２）−Ｇｒｏ−（１→Ｐ→（図２）と類似していることが明らかになった。 From a precise structural analysis, the polysaccharide structure of HS1 / 44 is the previously described polysaccharide structure of the tycoate capsular polysaccharide (CPS) of the HS1 strain (Aspinall, McDonald et al., 1993, McNally, Jarrel et al., 2005). It is similar to 4)-[MeOPN → 3) -β-D-Fru- (1 →] -α-Gal- (1 → 2) -Gro- (1 → P → (FIG. 2). It became clear.

図３は、ＨＳ１／４４ＣＰＳにおいてリンとプロトンとが繋がっていることの検出を示しており、これは、タイコ酸のジエステルリン酸（δ_Ｐ０．５および１．５）がＧｒｏの１位およびＧａｌの４位に結合し、メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）（δ_Ｐ１４．３）がＦｒｕ残基の３位（δ_Ｈ４．８３）に付加されていることによる。Ｆｒｕ分枝を有する４−結合ＧａｌのＨ−４共鳴は、δ４．６８に現れ、一方、脱フルクトース化４−結合Ｇａｌの場合はδ４．４９で共鳴した（図３）。類似したパターンがＧｒｏのＨ−１共鳴についても観察された。ＨＳ１型株およびＨＳ１／４４ＣＰＳを同時に分析したところ、２，３，４−三置換Ｇａｌ結合（ＧＣ−ＭＳ）およびメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）共鳴（^３１ＰＮＭＲ）の強度が低いことから判断されるように、ＨＳ１／４４ＣＰＳに含有されるフルクトース化の程度が低かったことが示唆された。 FIG. 3 shows the detection of the linkage of phosphorus and protons in HS1 / 44 CPS, indicating that the diester phosphate of tycoic acid (δ _P 0.5 and 1.5) is in position 1 of Gro And methyl phosphoroamidate (MeOPN) (δ _P 14.3) is added to position 3 (δ _H 4.83) of the Fru residue. The H-4 resonance of 4-bonded Gal with Fru branches appeared at δ4.68, whereas the defructosylated 4-bonded Gal resonated at δ4.49 (FIG. 3). A similar pattern was also observed for Gro's H-1 resonance. When HS1 type strain and HS1 / 44 CPS were analyzed simultaneously, the intensity of 2,3,4-trisubstituted Gal binding (GC-MS) and methyl phosphoramidate (MeOPN) resonance ( ³¹ P NMR) was low. From this, it was suggested that the degree of fructose contained in HS1 / 44 CPS was low.

ＨＳ４４ＣＰＳ物質の分析によって、明確に異なる２つの多糖莢膜構造が同定された。一方のＣＰＳは、上述のＨＳ１およびＨＳ１／４４のタイコ酸ＣＰＳ（図２）に類似していたが、そのメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）含有Ｆｒｕ分枝は観察されなかった。第２のＣＰＳはヘプトースに富み、６−デオキシ−ガラクト−ヘプトース（６ｄ−ｇａｌ−Ｈｅｐ）、６−デオキシ−アルトロ−ヘプトース（６ｄ−ａｌｔｒｏ−Ｈｅｐ）、およびより少量の６−デオキシ−３−Ｏ−メチル−アルトロ−ヘプトース（６ｄ−ａｌｔｒｏ−３−Ｏ−Ｍｅ−Ｈｅｐｆ）の反復ブロックから構成されている。ヘプトース構成を、ＧＣによって、構成がはっきり分かっている合成標準物質と比較することによって特性決定した。結合型分析（ＧＣ−ＭＳ）（図４Ａ）から、デオキシ−ヘプトースは、部分的に末端および２−置換単位としてフラノース形態で存在することが明らかになった。 Analysis of the HS44 CPS material identified two distinct polysaccharide capsule structures. One CPS was similar to the HS1 and HS1 / 44 tycoic acid CPS described above (FIG. 2), but its methyl phosphoramidate (MeOPN) -containing Fru branch was not observed. The second CPS is rich in heptose, 6-deoxy-galacto-heptose (6d-gal-Hep), 6-deoxy-altro-heptose (6d-altro-Hep), and a smaller amount of 6-deoxy-3-O. -It is composed of repeating blocks of methyl-altro-heptose (6d-altro-3-O-Me-Hepf). The heptose composition was characterized by comparison with a synthetic standard with a well-defined composition by GC. Binding analysis (GC-MS) (FIG. 4A) revealed that deoxy-heptose exists partially in the furanose form as a terminal and 2-substituted unit.

一緒に行ったＮＭＲ研究（図４Ｂ）から、デオキシ−ヘプトースの存在が確認され（δ_Ｈ１．５〜２．０）、これらの単位がαアノマー配置にあることが明らかになった（δ_Ｐ５．１５〜５．４２）。ＨＳ４４ＣＰＳ物質は、ＨＳ１およびＨＳ１／４４が発現するものとは異なる新たなメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）部分（δ_Ｐ１４．０）を伴っていた。これは、この株で観察される推定上のメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）トランスフェラーゼが分岐したものであることと整合する。 A joint NMR study (FIG. 4B) confirmed the presence of deoxy-heptose (δ _H 1.5-2.0) and revealed that these units were in the α-anomeric configuration (δ _P 5.15-5.42). The HS44 CPS material was accompanied by a new methyl phosphoramidate (MeOPN) moiety (δ _P 14.0) different from that expressed by HS1 and HS1 / 44. This is consistent with the divergent putative methyl phosphoramidate (MeOPN) transferase observed in this strain.

ＨＳ１．０８遺伝子の産物は８４９アミノ酸の、予測されたタンパク質をコードし、これは推定上の糖トランスフェラーゼとして注釈されている（Ｋａｒｌｙｓｈｅｅｖら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、５５：９０頁（２００５））。ＨＳ４４タイコ酸様ＣＰＳは、非化学量論的なフルクトース分枝を欠き、莢膜遺伝子座においてＨＳ１．０８遺伝子が欠損していることから、本発明者らは、ＨＳ１．０８がフルクトース・トランスフェラーゼをコードすると仮定した。この遺伝子の変異体は、アルシアン・ブルー染色ゲル上で発現したとき、ＭＷがより低い莢膜を発現し、ＭＷは、ゲルによって示されるように、相補体では野生型のＭＷにまで回復した。ＮＭＲ分析からも相補が確認されたが、^３１ＰＮＭＲにおけるメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）共鳴の強度がより低いことから（図５Ｂ）、この場合の相補が部分的であったことが示唆された。したがって、ＨＳ１．０８は、ＦｒｕをＧａｌに転移することができるトランスフェラーゼをコードするようである。 The product of the HS1.08 gene encodes a predicted protein of 849 amino acids, which has been annotated as a putative sugar transferase (Kalysheev et al., Mol. Microbiol., 55:90 (2005)). Since HS44 tycoate-like CPS lacks non-stoichiometric fructose branching and lacks the HS1.08 gene at the capsular locus, the inventors have identified that HS1.08 inhibits fructose transferase. Assumed to code. A mutant of this gene expressed a capsule with a lower MW when expressed on an Alcian blue stained gel, and the MW recovered to wild-type MW in the complement as shown by the gel. Complementation was also confirmed by NMR analysis, but the intensity of methyl phosphoramidate (MeOPN) resonance in ³¹ P NMR was lower (FIG. 5B), suggesting that complementation in this case was partial. It was done. Thus, HS1.08 appears to encode a transferase that can transfer Fru to Gal.

遺伝子ＨＳ１．０９は推定上のＣＤＰグリセロール・トランスフェラーゼと注釈されていた（Ｋａｒｌｙｓｈｅｖら、２００５年）。ＨＳ１においてこの遺伝子が変異すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのアルシアン・ブルー染色によって検出されるようにＣＰＳが失われる（図５Ａ）。この変異体の相補体のゲル解析ではうすいＣＰＳバンドが認められたが（図５Ａ）、ＣＰＳ発現の回復は、メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）の存在を示した^３１ＰＮＭＲスペクトルから確認された（図５Ｂ）。 The gene HS1.09 was annotated as a putative CDP glycerol transferase (Kalyshev et al., 2005). Mutation of this gene in HS1 results in loss of CPS as detected by Alcian blue staining of SDS-PAGE gels (FIG. 5A). Although a light CPS band was observed in the gel analysis of the complement of this mutant (FIG. 5A), recovery of CPS expression was confirmed from a ³¹ P NMR spectrum showing the presence of methyl phosphoramidate (MeOPN). (FIG. 5B).

一実施形態では、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４およびＨＳ４４カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株に対するワクチン組成物に含めるのに有用な免疫原性組成物は、構造： In one embodiment, an immunogenic composition useful for inclusion in a vaccine composition against HS1, HS1 / HS44 and HS44 C. jejuni strains has the structure:

を含む多糖抗原、またはこの多糖構造の反復を含むポリマーを含み、式中、「ｎ」は１〜１００である。ＨＳ４４の多糖構造は、Ｇａｌの２または３位において繋がれた「［ＭｅＯＰＮ］→３）−Ｆｒｕｆ」単位を含まない上記の構造を含む。したがって、別の実施形態では、免疫原性組成物は、構造：
［→４）−ａ−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→２）−Ｇｒｏ−（１→Ｐ→］_ｎ
（式中、「ｎ」は１〜１００である）を含む、ＨＳ４４由来の反復多糖構造を有する多糖抗原を含む。 Or a polymer containing repeats of this polysaccharide structure, wherein “n” is 1-100. The polysaccharide structure of HS44 includes the above structure without the “[MeOPN] → 3) -Fruf” unit linked at the 2 or 3 position of Gal. Thus, in another embodiment, the immunogenic composition has the structure:
[→ 4) -a-D-Galp- (1 → 2) -Gro- (1 → P →] _n
(Wherein “n” is 1 to 100), including polysaccharide antigens having a repeating polysaccharide structure derived from HS44.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）株ＰＧ３５８８（ＨＳ：１）：
カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）株ＰＧ３５８８（ＨＳ：１）莢膜多糖（ＣＰＳ）を、穏やかな酢酸（５％）で処理すると、フルクトース（Ｆｒｕｆ）側枝、およびそれに付随するメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）単位が除去された。脱フルクトース化ＣＰＳの^１ＨＮＭＲでは、α−Ｄ−Ｇａｌ残基（Ｆｒｕｆ置換のない）に対応するδ５．２１にアノマー共鳴が認められた。Ｈ５ δ４．１８は、Ｈ６ δ３．７５プロトン共鳴から帰属され、Ｇｒｏ共鳴はＨ１／１’ δ４．０５／４．１２、Ｈ２ δ３．９８、およびＨ３／３’ ３．７８／３．８２であることが見出された。 Campylobacter jejuni strain PG3588 (HS: 1):
Treatment of Campylobacter jejuni strain PG3588 (HS: 1) capsular polysaccharide (CPS) with mild acetic acid (5%) resulted in fructose (Fruf) side branches and the associated methyl phosphoramidate (MeOPN). ) Unit removed. In ¹ H NMR of defructosylated CPS, an anomeric resonance was observed at δ5.21 corresponding to the α-D-Gal residue (without Fruf substitution). H5 δ 4.18 is assigned from the H6 δ 3.75 proton resonance, and the Gro resonances are H1 / 1 ′ δ4.05 / 4.12, H2 δ3.98, and H3 / 3 ′ 3.78 / 3.82. It was found.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）株ＰＧ３５８８（ＨＳ：１）莢膜多糖の全炭素共鳴が、２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣを用いて帰属された。これらを表２にまとめる。２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣ（図４）では、（δ_Ｈ４．５４／δ_Ｐ１．１４）および（δ_Ｈ４．０５、４．１１／δ_Ｐ１．１４）に強い交差ピークが認められた。このことから、リン酸ジエステルが存在し、これは、ＧｒｏおよびＧａｌのＣ４にリン酸ジエステルによって付加されていることが確認された。この２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣではもう１つの共鳴がメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）部分についてδ１４．０４に検出され、この共鳴は、δ_Ｈ３．７５／δ_Ｐ１４．０４に交差ピークを示したことから、メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）がＧａｌのＣ−６に付加されていることが同定された。 The total carbon resonances of Campylobacter jejuni strain PG3588 (HS: 1) capsular polysaccharide were assigned using 2D ¹ H- ¹³ C HSQC. These are summarized in Table 2. In 2D ¹ H- ³¹ P HMBC (FIG. 4), strong cross peaks are observed at (δ _H 4.54 / δ _P 1.14) and (δ _H 4.05, 4.11 / δ _P 1.14). It was. From this, it was confirmed that a phosphoric diester was present, which was added to Gro4 and Gal C4 by the phosphoric diester. The ^2D 1 ^H- 31 P HMBC In Another resonance is detected δ14.04 for methyl phosphoramidate (MeOPN) moiety, the resonance cross peaks δ _H 3.75 / δ _P 14.04 It was identified that methyl phosphoramidate (MeOPN) was added to C-6 of Gal.

ＨＳ５由来の多糖構造
一実施形態は、ＨＳ５由来の構造の単離された莢膜多糖構造またはポリマーを含有するカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に対する免疫原性組成物である。この多糖構造は、以下の構造の４つの変異型を含む： HS5-derived polysaccharide structure One embodiment is an immunogenic composition against C. jejuni that contains an isolated capsular polysaccharide structure or polymer of HS5-derived structure. This polysaccharide structure includes four variants of the following structure:

単糖組成分析の結果から、株ＣＧ２９９５（ＨＳ：５）の莢膜多糖（ＣＰＳ）は、３，６−ジデオキシ−リボ−ヘプトース、グルシトールおよびＤ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースを含有していたことが明らかになった（図６）。次の各残基の複数の結合が観察された：末端３，６−ジデオキシ−リボ−ヘプトース、２，６−二置換グルシトール、２，３，６−三置換グルシトール、２−一置換Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、２，６−二置換Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、２，７−二置換Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、および２，６，７−三置換Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース。 From the results of monosaccharide composition analysis, the capsular polysaccharide (CPS) of strain CG2995 (HS: 5) contained 3,6-dideoxy-ribo-heptose, glucitol and D-glycero-D-manno-heptose. It became clear (Fig. 6). Multiple linkages of each of the following residues were observed: terminal 3,6-dideoxy-ribo-heptose, 2,6-disubstituted glucitol, 2,3,6-trisubstituted glucitol, 2-monosubstituted D-glycero -D-manno-heptose, 2,6-disubstituted D-glycero-D-manno-heptose, 2,7-disubstituted D-glycero-D-manno-heptose, and 2,6,7-trisubstituted D- Glycero-D-manno-heptose.

ＣＰＳの１Ｄ ^１ＨＮＭＲから６つのアノマー・ピークが明らかになった。うち３つは５．２０ｐｐｍ、５．１８ｐｐｍおよび５．１６ｐｐｍ（それぞれＡ、Ｂ、Ｃ）において、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース残基に関連付けられ、うち３つは５．２１ｐｐｍ、４．９６ｐｐｍおよび４．８７ｐｐｍ（それぞれＫ、Ｌ、Ｎ）において、３，６−ジデオキシ−リボ−ヘプトース残基に関連付けられる（図７）。結合および環の共鳴は次に２Ｄ ^１Ｈ−^１ＨＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹおよびＮＯＥＳＹ実験によって確認した。ＮＭＲ実験によって見出された結合は、ＧＣ−ＭＳによって帰属された結合と一致した。 Six anomeric peaks were revealed from 1D ¹ H NMR of CPS. Three of them are associated with D-glycero-D-manno-heptose residues at 5.20 ppm, 5.18 ppm and 5.16 ppm (A, B, C, respectively), three of which are 5.21 ppm, 4. At 96 ppm and 4.87 ppm (K, L, N, respectively), it is associated with 3,6-dideoxy-ribo-heptose residues (FIG. 7). Binding and the resonance of the ring then ^2D 1 ^H- 1 H COSY, was confirmed by TOCSY and NOESY experiments. The bonds found by NMR experiments were consistent with those assigned by GC-MS.

２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＳＱＣおよびＨＭＢＣの助けを借りて、グルシトール残基（Ｘ、Ｙ、Ｚ）を、６つのヘプトース残基からの環領域の共鳴と共に帰属することができた。予想通り、グリコシド結合に関わる炭素である、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースＡ、ＢおよびＣのＣ２（δ７８．１）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースＡのＣ６（δ７６．８）、グルシトールＹおよびＺのＣ２（δ８１．６）、グルシトールＸのＣ２（δ８２．５）、ならびにグルシトールＹおよびＺのＣ３（δ７８．８）は、低磁場の共鳴であることが見出された（図８（Ａ））。３，６−ジデオキシ−リボ−ヘプトースに関連付けられるデオキシ共鳴は、δ３７．１（Ｃ３）およびδ３６．１（Ｃ６）において容易に観察された。選択的１ＤｎＯｅ実験（図８（Ｂ））も、上記の結合の存在を示した。 With the help of 2D ¹ H- ¹³ C HSQC and HMBC, glucitol residues (X, Y, Z) could be assigned with ring region resonances from six heptose residues. As expected, C2 (δ78.1) of D-glycero-D-manno-heptose A, B and C which are carbons involved in glycosidic bonds, C6 (δ76.8) of D-glycero-D-manno-heptose A , C2 of Glucitol Y and Z (δ81.6), C2 of Glucitol X (δ82.5), and C3 of Glucitol Y and Z (δ78.8) were found to be low-field resonances ( FIG. 8 (A)). The deoxyresonance associated with 3,6-dideoxy-ribo-heptose was readily observed at δ37.1 (C3) and δ36.1 (C6). A selective 1D nOe experiment (FIG. 8B) also showed the presence of the above binding.

１Ｄ ^３１Ｐおよび２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲから、０．９６および１．３０ｐｐｍの共鳴が明らかになったがこれは、莢膜多糖反復がリン酸架橋によって結合していることを示している（図９）。この架橋によって、グルシトールの６位とＤ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースの７位とを介した結合が生じる（図９）。１Ｄ ^３１Ｐスペクトルではさらに、メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を示すδ１４．５のピークが得られ、２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣによって、このメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）は、７−置換３，６−ジデオキシ−リボ−ヘプトースを生ずる形で結合していることが分かった（図１０）。 1D ³¹ P and 2D ¹ H- ³¹ P HMBC NMR revealed 0.96 and 1.30 ppm resonances, indicating that the capsular polysaccharide repeats are linked by phosphate bridges. (FIG. 9). This cross-linking results in a bond through position 6 of glucitol and position 7 of D-glycero-D-manno-heptose (FIG. 9). In the 1D ³¹ P spectrum, a peak of δ14.5 indicating methyl phosphoramidate (MeOPN) is obtained, and by 2D ¹ H- ³¹ P HMBC, this methyl phosphoramidate (MeOPN) is 7- It was found that the 3,6-dideoxy-ribo-heptose was linked in such a way as to yield (FIG. 10).

主要な莢膜多糖が１つ観察され、その主鎖は［−７）−α−Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース−（１−３）−グルシトール−（６−）−Ｐ−］であり、α−３，６−ジデオキシ−リボ−ヘプトースによって、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースは２，６−二置換され、グルシトールは２−一置換されていた（図１１ｉ）。莢膜多糖反復には他に３つの異型体があることも分かった：２−一置換Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースを有し、グルシトールがＤ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースに３位ではなく２位において結合している異型体１（図１１ｉｉ）、Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースが２，６−二置換されており、グルシトールがＤ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースに３位ではなく２位において結合している異型体２（図１１ｉｉｉ）、ならびに２−一置換Ｄ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースおよび２−一置換グルシトールを有する異型体３（図１１ｉｖ）。 One major capsular polysaccharide is observed, the backbone of which is [-7) -α-D-glycero-D-manno-heptose- (1-3) -glucitol- (6-)-P-] D-glycero-D-manno-heptose was 2,6-disubstituted and glucitol was 2-monosubstituted by α-3,6-dideoxy-ribo-heptose (FIG. 11i). It was also found that there are three other variants in the capsular polysaccharide repeat: 2-monosubstituted D-glycero-D-manno-heptose, with glucitol in position 3 in D-glycero-D-manno-heptose Rather than the variant 1 bound in position 2 (FIG. 11ii), D-glycero-D-manno-heptose is 2,6-disubstituted, and glucitol is replaced with D-glycero-D-manno-heptose 3 Variant 2 (FIG. 11iii) bound at position 2 but not position, and variant 3 with 2-monosubstituted D-glycero-D-manno-heptose and 2-monosubstituted glucitol (FIG. 11iv).

ＣＰＳ多糖のタンパク質担体へのコンジュゲート化（複合化）
１つまたは複数の多糖または多糖ポリマーを担体分子にコンジュゲートして、免疫を向上させてもよい。担体は、一実施形態ではタンパク質担体分子である。タンパク質担体の例として、ＣＲＭ_１９７を多糖または多糖ポリマーにコンジュゲートしてもよい。ＴＥＭＰＯ酸化後のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ２９９５のＣＰＳのアルジトール・アセテート誘導体のＧＣ−ＭＳプロファイルを図１２に示す。コンジュゲート化を図１３に例示する。 Conjugation of CPS polysaccharide to protein carrier (conjugation)
One or more polysaccharides or polysaccharide polymers may be conjugated to a carrier molecule to improve immunity. The carrier is a protein carrier molecule in one embodiment. As an example of a protein carrier, CRM ₁₉₇ may be conjugated to a polysaccharide or polysaccharide polymer. FIG. 12 shows the GC-MS profile of the CPS alditol acetate derivative of C. jejuni CG2995 after TEMPO oxidation. Conjugation is illustrated in FIG.

ＨＳ５多糖のコンジュゲート化
単離された、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ５多糖をタンパク質構造にコンジュゲートした。これを、多糖または多糖ポリマーのコンジュゲート化の例示としてここに記述する。コンジュゲート化の全体のスキームを図１３に例示する。任意のタンパク質担体をコンジュゲートすることを想定している。さらに、幾つもの手段によって、タンパク質担体へのコンジュゲート化を行うことができる。 Conjugation of HS5 polysaccharide An isolated, C. jejuni HS5 polysaccharide was conjugated to the protein structure. This is described herein as an illustration of conjugation of polysaccharides or polysaccharide polymers. The overall scheme of conjugation is illustrated in FIG. It is envisaged to conjugate any protein carrier. Furthermore, conjugation to a protein carrier can be accomplished by a number of means.

実例として、図１３では、多糖を、ＴＥＭＰＯにより媒介される酸化によってＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした。図１３に示すこの方法では、第１のステップは、完全な状態のままのＣＰＳの一級ヒドロキシルの約１０％を、ＴＥＭＰＯにより媒介される酸化によってカルボン酸に酸化することである。図１３のスキームは、酸化部位の１つとしてＤＤ−Ｈｅｐの一級ヒドロキシルを用いたコンジュゲート化を例示する。非化学量論的酸化も、ＧｌｃのＣ−６、および側鎖置換基のＣＨ_２−ＯＨで起き得る。ＣＰＳの活性化に続いて、担体タンパク質（例えばＣＲＭ_１９７）へのコンジュゲート化を、図１３に示すＴＥＭＰＯにより媒介される方法で、カルボジイミド・カップリングによって達成した。コンジュゲート化は、ゲル電気泳動など、任意の方法によって可視化する。 Illustratively, in FIG. 13, the polysaccharide was conjugated to CRM ₁₉₇ by TEMPO-mediated oxidation. In this method shown in FIG. 13, the first step is to oxidize about 10% of the intact CPS primary hydroxyl to carboxylic acid by TEMPO-mediated oxidation. The scheme of FIG. 13 illustrates conjugation using DD-Hep primary hydroxyl as one of the oxidation sites. Also non-stoichiometric oxide, may occur in _CH 2 -OH of C-6, and side chain substituents Glc. Following activation of CPS, conjugation to a carrier protein (eg CRM ₁₉₇ ) was achieved by carbodiimide coupling in a TEMPO-mediated manner as shown in FIG. Conjugation is visualized by any method, such as gel electrophoresis.

ＨＳ１多糖のコンジュゲート化
ＨＳ１タイコ酸ＣＰＳおよびタンパク質担体ＣＲＭ_１９７から構成される糖コンジュゲートを、ＨＳ５に用いたのと類似したコンジュゲート化スキームによって、ＣＰＳ中の反応可能な一級ヒドロキシルの１０％を化学量論的に酸化することに基づいて作製した。一級ヒドロキシルの酸化後、活性化されたＨＳ１ＣＰＳは次に、ＣＰＳ中に新しく生じたカルボン酸官能基と、露出しているＣＲＭ_１９７リシン単位とのカルボジイミド・タイプのカップリングによって、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした。重要なことに、ＮＭＲによるＨＳ１ＣＰＳ−ＣＲＭ_１９７コンジュゲート・ワクチンの分析から、コンジュゲート化操作の間もメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）およびリン酸部分は無傷のままであったことが確認された。これらの結果を図１４に示す。部分的に酸化されたＨＳ１ＣＰＳのアノマー共鳴の強度の比較から、主鎖のＧａｌ残基の半数が、Ｆｒｕ含有メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）単位による分枝を有していたことが示された。 Conjugation of HS1 polysaccharide A sugar conjugate composed of HS1 tycoic acid CPS and the protein carrier CRM ₁₉₇ was converted to 10% of the reactive primary hydroxyl in CPS by a conjugation scheme similar to that used for HS5. Prepared based on stoichiometric oxidation. After oxidation of the primary hydroxyl, the activated HS1 CPS is then conjugated to CRM ₁₉₇ by carbodiimide type coupling of the newly generated carboxylic acid functional group in CPS with the exposed CRM ₁₉₇ lysine unit. Gated. Importantly, analysis of the HS1 CPS-CRM ₁₉₇ conjugate vaccine by NMR confirmed that the methyl phosphoramidate (MeOPN) and phosphate moieties remained intact during the conjugation procedure. It was done. These results are shown in FIG. A comparison of the anomeric resonance intensities of partially oxidized HS1 CPS shows that half of the main chain Gal residues had branching by Fru-containing methyl phosphoramidate (MeOPN) units. It was done.

ＨＳ複合体中の多糖
カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｐｅｎｎｅｒ血清型複合体中に多糖構造が同定された。例えば、抗ＨＳ４血清は、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４およびＨＳ５０莢膜を含めたＨＳ４複合体の他の株との交差反応を生ずる。これらの株から多糖を単離し分析したところ、共通のイド−ヘプトース単位を含有する二糖が同定された。これらの株、およびこれらの株由来の単離された多糖を表３に列挙する。 Polysaccharides in HS conjugates Polysaccharide structures were identified in C. jejuni Penner serotype conjugates. For example, anti-HS4 sera cross-react with other strains of the HS4 complex, including HS13, HS4 / 13/64 and HS50 capsules. When polysaccharides were isolated and analyzed from these strains, disaccharides containing a common id-heptose unit were identified. These strains and the isolated polysaccharides from these strains are listed in Table 3.

表３から明らかなように、これらの単離された莢膜多糖に共通の驚くべき特徴はイド−ヘプトース単位である。したがって、一実施形態は、これらの株のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の多糖構造を各々が含む、１つまたは複数の多糖抗原を含む免疫原性組成物である。 As is apparent from Table 3, a surprising feature common to these isolated capsular polysaccharides is the id-heptose unit. Thus, one embodiment is an immunogenic composition comprising one or more polysaccharide antigens, each comprising a polysaccharide structure from C. jejuni of these strains.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＣＧ８４８６（ＨＳ：４：１３：６４）の以前に記載されたＣＰＳ構造は、主に二糖反復単位［→３）−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］からなり、非化学量論的にＯ−メチル・ホスホロアミデート置換基がイド−ヘプトースのＣ−２およびＣ−７位に付加されている。副成分であるＬ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース（ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）が、組成分析にアルジトール・アセテート誘導体を使用し、結合分析に高メチル化アルジトール・アセテート誘導体を使用してＧＬＣ−ＭＳにより検出され、これはこの株では新しく見出された。６−デオキシ−ヘプトースおよびＬ−グリセロ−Ｄ−ヘプトースの糖の環構成は、イドースとして帰属された。僅かな量の１，７−アンヒドロ−Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース（１，７−アンヒドロ−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）および１，６−アンヒドロ−Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース（１，６−アンヒドロ−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）が、酸加水分解中にＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐから生じた。 The previously described CPS structure of Campylobacter jejuni strain CG8486 (HS: 4:13:64) is mainly a disaccharide repeat unit [→ 3) -6d-β-D-ido-Hep- ( 1 → 4) -β-GlcNAc- (1 →] with non-stoichiometric addition of O-methyl phosphoramidate substituents at the C-2 and C-7 positions of id-heptose L-glycero-D-id-heptose (LD-ido-Hep), an accessory component, uses alditol acetate derivatives for composition analysis and GLC- using highly methylated alditol acetate derivatives for binding analysis. Detected by MS, which was newly found in this strain, the sugar ring organization of 6-deoxy-heptose and L-glycero-D-heptose assigned as idose Small amounts of 1,7-anhydro-L-glycero-D-id-heptose (1,7-anhydro-LD-ido-Hep) and 1,6-anhydro-L-glycero-D-id- Heptose (1,6-anhydro-LD-ido-Hep) was generated from LD-ido-Hep during acid hydrolysis.

以前に報告されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ８４８６ＣＰＳの結合型（３−置換６ｄ−イド−ヘプトース［→３）−６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］および２，３−二置換６ｄ−イド−ヘプトース［→２，３）−６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］、３，７−二置換６ｄ−イド−ヘプトース［→３，７）−６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］、４−置換Ｎ−アセチル−グルコサミン［→４）−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］）に加えて、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ：４：１３：６４ＣＰＳの高メチル化アルジトール・アセテート誘導体のＧＬＣ−ＭＳのＧＬＣプロファイルは、３−置換Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース［→３）−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］および２，３−二置換Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース［→２，３）−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］を含む、以前に報告された構造中には検出されなかったさらに２つのＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐの結合型を示した。 Previously reported forms of C. jejuni CG8486 CPS (3-substituted 6d-id-heptose [→ 3) -6d-ido-Hep- (1 →) and 2,3-disubstituted 6d- Id-heptose [→ 2, 3) -6d-ido-Hep- (1 →], 3,7-disubstituted 6d-id-heptose [→ 3,7) -6d-ido-Hep- (1 →], GLC- of highly methylated alditol acetate derivative of C. jejuni HS: 4:13:64 CPS in addition to 4-substituted N-acetyl-glucosamine [→ 4) -GlcNAc- (1 →]) The GLC profile of MS is 3-substituted L-glycero-D-id-heptose [→ 3) -LD-ido-Hep- (1 →] and 2,3-di Two more LD-ido- not detected in previously reported structures, including the substituted L-glycero-D-id-heptose [→ 2,3) -LD-ido-Hep- (1 →] Hep binding type was shown.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＧ８４８６ＣＰＳの１Ｄ ^１ＨＮＭＲでは、δ４．９４およびδ４．６６に、２つのβ−グリコシドの２つの共鳴が認められ、これらはそれぞれ６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ／ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐおよびＧｌｃＮＡｃであった。３つの単糖残基（６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ、ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐおよびＧｌｃＮＡｃ）に対して２つのアノマー・プロトン共鳴があることから、６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐおよびＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐのいずれも、Ｈ−６位以外の糖の環系全体に渡って同じ化学シフトを含む可能性があることが示唆された。これは、これらの間の唯一の差異は、Ｃ−６位のヒドロキシル基の有無であったからである。^１ＨＮＭＲスペクトルから、ＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル部分に特徴的であった、δ２．０７における１つのメチル一重線、ならびに６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐの６−デオキシ部分であった、δ１．７７およびδ２．０３におけるメチレンのシグナルも明らかになった。加えて、１Ｄ ^３１ＰＮＭＲによって、δｐ１４．７における特徴的なメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）シグナルが検出された。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）血清型ＨＳ４：１３：６４のＣＰＳ（表３を参照されたい）は、そのＣＰＳ中に６−ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐおよびＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐの双方を含有すると判定した。
主な反復である［→３）−６ｄ−β−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］（６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２および／またはＣ−７において非化学量論的にＭｅＯＰＮを有する）、および
副次的な反復である［→３）−ＬＤ−β−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］（ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２において非化学量論的にＭｅＯＰＮを有する）。 The 1D ¹ H NMR of C. jejuni CG8486 CPS shows two resonances of two β-glycosides at δ4.94 and δ4.66, each of which is 6d-ido-Hep / LD-ido. -Hep and GlcNAc. Since there are two anomeric proton resonances for three monosaccharide residues (6d-ido-Hep, LD-ido-Hep and GlcNAc), both 6d-ido-Hep and LD-ido-Hep are It has been suggested that it may contain the same chemical shifts throughout the sugar ring system other than the H-6 position. This is because the only difference between them was the presence or absence of a hydroxyl group at the C-6 position. ^{From the 1} H NMR spectrum, one methyl singlet at δ2.07, characteristic of the N-acetyl moiety of GlcNAc, and the 6-deoxy moiety of 6d-ido-Hep, δ1.77 and δ2. The methylene signal at 03 was also revealed. In addition, a characteristic methyl phosphoramidate (MeOPN) signal at δp14.7 was detected by 1D ³¹ P NMR. C. jejuni serotype HS4: 13: 64 CPS (see Table 3) was determined to contain both 6-d-ido-Hep and LD-ido-Hep in its CPS. .
The main repeat [→ 3) -6d-β-ido-Hep- (1 → 4) -β-GlcNAc- (1 →] (not in C-2 and / or C-7 of 6d-ido-Hep Stoichiometrically with MeOPN), and the secondary iteration [→ 3) -LD-β-ido-Hep- (1 → 4) -β-GlcNAc- (1 →) (LD-ido- Non-stoichiometric MeOPN at Hep C-2).

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ：４型株（株ＭＫ７）のＣＰＳ決定
カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＭＫ７（ＨＳ４）から単離されたＣＰＳは、アルジトール・アセテート誘導体のＧＣ−ＭＳプロファイル決定によると、Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース（ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）およびＮ−アセチル−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）から構成されていた。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ：４型株の上記のＣＰＳ組成は、ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐの代わりに主に６−デオキシ−イド−ヘプトース（６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）を含有する、血清型ＨＳ：４複合体（ＨＳ：４，１３，６４；株ＣＧ８４８６）の以前に報告されたＣＰＳに類似していた。高メチル化アルジトール・アセテート誘導体のＧＣ−ＭＳは、各単糖について次の結合型を示した：３−置換Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース［→３）−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］および４−置換Ｎ−アセチルグルコサミン［→４）−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］。 C. jejuni HS: CPS determination of type 4 strain (strain MK7) CPS isolated from Campylobacter jejuni strain MK7 (HS4) is determined by GC-MS profile determination of alditol acetate derivative And L-glycero-D-id-heptose (LD-ido-Hep) and N-acetyl-glucosamine (GlcNAc). The above CPS composition of C. jejuni HS: type 4 strain is a serotype HS containing mainly 6-deoxy-id-heptose instead of LD-ido-Hep. : 4 complex (HS: 4, 13, 64; strain CG8486) was similar to the previously reported CPS. GC-MS of the highly methylated alditol acetate derivative showed the following conjugated form for each monosaccharide: 3-substituted L-glycero-D-id-heptose [→ 3) -LD-ido-Hep- (1 →] and 4-substituted N-acetylglucosamine [→ 4) -GlcNAc- (1 →].

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＭＫ７（ＨＳ：４の型の株）ＣＰＳの^１ＨＮＭＲスペクトルでは、ＧｌｃＮＡｃおよびＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐに対しそれぞれδ４．７０およびδ４．９４における２つのβ−アノマー・プロトン共鳴が認められた。^１ＨＮＭＲスペクトルから、ＧｌｃＮＡｃのＮ−アセチル部分に特徴的であった、δ２．０７における１つのメチル一重線、ならびにδ３．５０からδ４．５５の間の広範囲の重なりあった糖の環上プロトン共鳴も明らかになった。加えて、１Ｄ ^３１ＰＮＭＲによって、δｐ１４．３における微弱なメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）シグナルも検出された。メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）の置換部位は、このＨＳ：４型株ではメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）置換の量が少ないために検出することができなかった。 The ¹ H NMR spectrum of Campylobacter jejuni strain MK7 (HS: type 4 strain) CPS shows two β-anomers at δ4.70 and δ4.94 for GlcNAc and LD-ido-Hep, respectively. Proton resonance was observed. ^{From the 1} H NMR spectrum, one methyl singlet at δ2.07, characteristic of the N-acetyl moiety of GlcNAc, and a broadly overlapping sugar ring proton between δ3.50 and δ4.55 Resonance was also revealed. In addition, a weak methyl phosphoramidate (MeOPN) signal at δp14.3 was also detected by 1D ³¹ P NMR. The substitution site for methyl phosphoramidate (MeOPN) could not be detected in this HS: 4 strain due to the low amount of methyl phosphoramidate (MeOPN) substitution.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）血清型ＨＳ：１３（株ＭＫ１６）のＣＰＳ決定
カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＨＳ４型株（ＭＫ７）は、［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］の二糖反復から構成されるＣＰＳを含有する。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＭＫ１６（血清型ＨＳ：１３）のアルジトール・アセテート誘導体のＧＣ−ＭＳを用いた単糖組成分析から、グルコース（Ｇｌｃ）、６−デオキシ−イド−ヘプトース（６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）およびＬ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース（ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）の存在が、アルジトール・アセテート誘導体プロファイルのＧＳ−ＭＳ決定によって明らかになった。高メチル化アルジトール・アセテート誘導体のプロファイルの結合解析から、これらの単位は、４−置換グルコース［→４）−Ｇｌｃ−（１→］、３−置換６−デオキシ−イド−ヘプトース［→３）−６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］、２，３−二置換６−デオキシ−イド−ヘプトース［→２，３）−６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］、３−置換Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース［→３）−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］、および３，７−二置換６−デオキシ−イド−ヘプトース［→３，７）−６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］として存在していたことが示された。加えて、少量の末端グルコース［Ｇｌｃ−（１→］が、ＣＰＳの非還元末端として検出された。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）血清型ＨＳ：１３は、４−置換ＧｌｃＮＡｃ（血清型ＨＳ：４：１３：６４およびＨＳ：４に見られる）の代わりに４−置換Ｇｌｃを主鎖として含有する。 CPS determination of Campylobacter jejuni serotype HS: 13 (strain MK16) Campylobacter jejuni HS4 strain (MK7) is [→ 3) -L-β-D-ido-Hep- ( 1 → 4) -β-GlcNAc- (1 →) containing CPS composed of disaccharide repeats GC- of the alditol acetate derivative of Campylobacter jejuni strain MK16 (serotype HS: 13) From the monosaccharide composition analysis using MS, the presence of glucose (Glc), 6-deoxy-id-heptose (6d-ido-Hep) and L-glycero-D-id-heptose (LD-ido-Hep) As revealed by GS-MS determination of alditol acetate derivative profile. From the binding analysis of the profile of the lutitol-acetate derivative, these units are: 4-substituted glucose [→ 4) -Glc- (1 →], 3-substituted 6-deoxy-id-heptose [→ 3) -6d-ido -Hep- (1 →), 2,3-disubstituted 6-deoxy-id-heptose [→ 2,3) -6d-ido-Hep- (1 →], 3-substituted L-glycero-D-id- Present as heptose [→ 3) -LD-ido-Hep- (1 →], and 3,7-disubstituted 6-deoxy-id-heptose [→ 3,7) -6d-ido-Hep- (1 →] In addition, a small amount of terminal glucose [Glc- (1 →]] was detected as the non-reducing end of CPS Campylobacter jejuni serotype HS: 13 -Substitution G cNAc containing 4-substituted Glc instead of (serotype HS: 4: 13:: 64 and HS found to 4) as a main chain.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）血清型ＨＳ：１３ＣＰＳの^１ＨＮＭＲスペクトルでは、δ４．６３およびδ４．９２における２つのβ−アノマー・プロトン共鳴が認められ、これらはそれぞれＧｌｃおよび６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ／ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐとして帰属された（図１５Ａ）。^１ＨＮＭＲスペクトルから、６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐの６−デオキシ部分に特徴的であった、δ１．８６およびδ２．００におけるメチレンのシグナル（多重線）、ならびにδ３．３０からδ４．５５の間の広範囲の重なりあった糖の環上プロトン共鳴も明らかになった。１Ｄ ^３１ＰＮＭＲによって、メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）シグナルに典型的であったδｐ１４．１およびδｐ１４．４における２つの共鳴が検出された（図１５Ｂ）。 The ¹ H NMR spectrum of Campylobacter jejuni serotype HS: 13 CPS shows two β-anomeric proton resonances at δ4.63 and δ4.92, which are Glc and 6d-ido-Hep, respectively. / LD-ido-Hep (FIG. 15A). ^{From the 1} H NMR spectrum, the methylene signal at δ1.86 and δ2.00 (multiple line), characteristic of the 6-deoxy moiety of 6d-ido-Hep, and between δ3.30 and δ4.55 A wide range of overlapping sugar ring proton resonances was also revealed. 1D ³¹ P NMR detected two resonances at δp14.1 and δp14.4 that were typical for methyl phosphoramidate (MeOPN) signals (FIG. 15B).

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＭＫ１６（血清型ＨＳ：１３）ＣＰＳは、ほぼ等濃度の以下の二糖反復（メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）が非化学量論的に６ｄ−β−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２およびＣ−７に付加されている）からなると判定した。
［→３）−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｇｌｃ−（１→］、および
［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｇｌｃ−（１→］。 Campylobacter jejuni strain MK16 (serotype HS: 13) CPS has approximately equal concentrations of the following disaccharide repeats (methyl phosphoramidate (MeOPN) non-stoichiometrically 6d-β-ido -Hep was added to C-2 and C-7).
[→ 3) -6d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) -β-Glc- (1 →], and [→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1 → 4 ) -Β-Glc- (1 →).

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）血清型ＨＳ３／１３／５０
ＨＳ：３：１３：５０複合体は、量的に低レベルの免疫交差反応性に基いて同定された。カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＢＨ−０１−０１４２（血清型ＨＳ：３：１３：５０）は、ＧＳ−ＭＳを用い、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＢＨ−０１−０１４２ＣＰＳ（血清型ＨＳ：３：１３：５０）の組成分析のためにアルジトール・アセテート誘導体プロファイル決定を用いたところ、ガラクトース（Ｇａｌ）、６−デオキシ−イド−ヘプトース（６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）およびＬ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース（ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ）から構成されていた。 Campylobacter jejuni serotype HS3 / 13/50
The HS: 3: 13: 50 complex was identified based on quantitatively low levels of immune cross-reactivity. Campylobacter jejuni (C. jejuni) strain BH-01-0142 (serotype HS: 3:13:50) uses GS-MS and Campylobacter jejuni (C. jejuni) BH-01-0142 CPS (serotype HS: 3:13:50) using alditol acetate derivative profile determination for galactose (Gal), 6-deoxy-id-heptose (6d-ido-Hep) and L-glycero-D-id -It was composed of heptose (LD-ido-Hep).

４−置換ガラクトース［→４）−Ｇａｌ−（１→］、３−置換６−デオキシ−ヘプトース［→３）−６ｄ−Ｈｅｐ−（１→］および３−置換Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース［→３）−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］の糖結合型が血清型ＨＳ：３：１３：５０のＣＰＳを構成していることが、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＢＨ−０１−０１４２ＣＰＳ（血清型（ＨＳ：３：１３：５０））の高メチル化アルジトール・アセテート誘導体のＧＣ−ＭＳプロファイル分析を用いて見出された。加えて、副成分の３，４−二置換ガラクトース［→３，４）−Ｇａｌ−（１→］、２，３−二置換６−デオキシ−ヘプトース［→２，３）−６ｄ−Ｈｅｐ−（１→］および２，３−二置換Ｌ−グリセロ−Ｄ−イド−ヘプトース［→２，３）−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］も特性決定された。上記の結果から、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）血清型ＨＳ：３，１３，５０ＣＰＳの主鎖単位は、［→４）−Ｇａｌ−（１→］、［→３）−６ｄ−Ｈｅｐ−（１→］および［→３）−ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→］であり、他の３つの非糖成分が、ＧａｌのＣ−３ならびに６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐおよびＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２に非化学量論的に付加されていたことが示唆された。さらに、末端Ｇａｌ［Ｇａｌ−（１→］も決定され、これは非還元末端であることが示唆された。 4-substituted galactose [→ 4) -Gal- (1 →], 3-substituted 6-deoxy-heptose [→ 3) -6d-Hep- (1 →] and 3-substituted L-glycero-D-id-heptose [→ 3] -LD-ido-Hep- (1 →) sugar-binding type constitutes CPS of serotype HS: 3: 13: 50. C. jejuni BH-01- It was found using GC-MS profile analysis of the highly methylated alditol acetate derivative of CPS (serotype (HS: 3: 13: 50)) In addition, the accessory component 3,4-disubstituted galactose [→ 3,4) -Gal- (1 →], 2,3-disubstituted 6-deoxy-heptose [→ 2,3) -6d-Hep- (1 →] and 2,3-disubstituted L-glycero -D-id-hept [→ 2,3) -LD-ido-Hep- (1 →) was also characterized, and from the above results, the main chain unit of Campylobacter jejuni serotype HS: 3,13,50 CPS Are [→ 4) -Gal- (1 →), [→ 3) -6d-Hep- (1 →] and [→ 3) -LD-ido-Hep- (1 →], and the other three It was suggested that non-sugar components were added non-stoichiometrically to Gal C-3 and 6d-ido-Hep and LD-ido-Hep C-2. (1 →] was also determined, suggesting that it is a non-reducing end.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）血清型ＨＳ：３：１３：５０ＣＰＳの^１ＨＮＭＲスペクトルでは、アノマー・プロトンのシグナルに対応する、δ５．００ｐｐｍからδ５．３０ｐｐｍの間の幅広い重なりピークが認められた。これらの重なりピークは、α−アノマー糖の存在を示唆する。加えて、^１ＨＮＭＲスペクトルから、６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐの６−デオキシ部分に特徴的な、δ１．８０およびδ２．０２におけるメチレンのシグナルも明らかになった。δ２．７２における別のプロトン共鳴は、^１ＨＮＭＲスペクトルでも明らかになったメチレンのシグナルであることが、後に確認された。 In the ¹ H NMR spectrum of C. jejuni serotype HS: 3:13:50 CPS, a broad overlapping peak between δ5.00 ppm and δ5.30 ppm was observed, corresponding to the anomeric proton signal. . These overlapping peaks suggest the presence of α-anomeric sugar. In addition, the ¹ H NMR spectrum also revealed a methylene signal at δ 1.80 and δ 2.02, characteristic of the 6-deoxy moiety of 6d-ido-Hep. It was later confirmed that another proton resonance at δ2.72 was a methylene signal that was also revealed in the ¹ H NMR spectrum.

非糖成分について情報を得るために、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＢＨ−０１−０１４２ＣＰＳの^３１ＰＮＭＲを行って、任意のリン置換基を決定した。δｐ１５．３におけるリン共鳴から、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＣＰＳの血清型ＨＳ：３，１３，５０の構造部分に関与していたＯ−メチル・ホスホロアミデート基（ＭｅＯＰＮ）またはＣＨ_３ＯＰ（Ｏ）ＮＨ_２（ＯＲ）の存在が明らかになった。メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）シグナルが１つ現れたことから、この固有の成分は、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＢＨ−０１−０１４２のＣＰＳの単糖残基のうちの１つに部分的に付加されていたことが示唆された。これは、糖結合型解分析の結果から、副成分の１，３，４−結合Ｇａｌ、１，２，３−結合６ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐおよび１，２，３−結合ＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐの存在が明らかになったからである。 In order to obtain information about the non-sugar components, ³¹ P NMR of C. jejuni BH-01-0142 CPS was performed to determine any phosphorus substituents. From the phosphorus resonance at δp15.3, the O-methyl phosphoramidate group (MeOPN) or CH ₃ OP involved in the structural part of serotype HS: 3, 13, 50 of C. jejuni CPS The presence of (O) NH ₂ (OR) was revealed. Since a single methyl phosphoramidate (MeOPN) signal appeared, this unique component was found in one of the CPS monosaccharide residues of Campylobacter jejuni strain BH-01-0142. It was suggested that it was partially added. This is based on the results of the sugar-binding type analysis, and the subcomponents 1,3,4-linked Gal, 1,2,3-linked 6d-ido-Hep and 1,2,3-linked LD-ido-Hep This is because the existence became clear.

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ＢＨ−０１−０１４２ＣＰＳの２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲを行って、メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）基の結合部位を明らかにした（図１６）。δｐ１５．３／δ_Ｈ３．７８における交差ピークは、メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）のリンとメチル基との相関に対応していた。δｐ１５．３とδ_Ｈ４．５６との間の強いプロトン−リン相関はメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）基の結合部位を示唆し、δｐ１５．３とδ_Ｈ５．１０におけるアノマー・プロトンとの間の弱いプロトン−リン相関も伴っていた。したがって、単糖結合型分析と２Ｄ ^１Ｈ−^３１ＰＨＭＢＣＮＭＲとの結果を組み合わせると、Ｏ−メチル−ホスホロアミデート基（残基Ｃ）は、６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐおよびＬＤ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ（残基Ａ’）のＣ−２位に付加されていたことが示された。 Campylobacter jejuni BH-01-0142 CPS 2D ¹ H- ³¹ P HMBC NMR was performed to reveal the binding site of the methyl phosphoramidate (MeOPN) group (FIG. 16). cross peaks in δp15.3 / δ _H 3.78 corresponded to the correlation between the phosphorus and the methyl group of methyl phosphoramidate (MeOPN). Strong proton between the δp15.3 and [delta] _H 4.56 - phosphorus correlation suggests a binding site of methyl phosphoramidate (MeOPN) group, and anomeric protons at δp15.3 and [delta] _H 5.10 It was also accompanied by a weak proton-phosphorus correlation. Therefore, when combining the results of monosaccharide-linked analysis and 2D ¹ H- ³¹ P HMBC NMR, the O-methyl-phosphoramidate group (residue C) becomes 6d-ido-Hep and LD-ido-Hep. It was shown that it was added to the C-2 position of (residue A ′).

２Ｄ ^１Ｈ−^１３ＣＨＭＢＣＮＭＲ実験（図１７）から、第２の非糖部分は３−ヒドロキシプロパノイルの部分であったことが示された。δ_Ｈ３．８９／δ_Ｃ１７３．０およびδ_Ｈ２．７２／δ_Ｃ１７３．０における交差ピークは、カルボニル・エステルＣ−１が、３−ヒドロキシプロパノイル基（残基Ｄ）のＨ−３およびＨ−２とそれぞれ３つの結合および２つの結合を介して繋がっていることを示した。δ_Ｈ５．２０／δ_Ｃ１７３．０における交差ピークを解釈し、１，３，４−結合Ｇａｌの副ピークを示した結合型分析の結果を考慮に入れることによって、３−ヒドロキシプロパノイル基は、ＧａｌのＣ−３に繋がっていることが観察された。 A 2D ¹ H- ¹³ C HMBC NMR experiment (FIG. 17) indicated that the second non-sugar moiety was a 3-hydroxypropanoyl moiety. Cross peaks at δ _H 3.89 / δ _C 173.0 and δ _H 2.72 / δ _C 173.0 indicate that the carbonyl ester C-1 is H- of the 3-hydroxypropanoyl group (residue D). 3 and H-2 were shown to be connected via 3 bonds and 2 bonds, respectively. By interpreting the cross peak at δ _H 5.20 / δ _C 173.0 and taking into account the results of coupled analysis showing a sub-peak of 1,3,4-linked Gal, the 3-hydroxypropanoyl group Was observed to be linked to Gal C-3.

本発明者らは、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）血清型ＨＳ：３が、二糖反復（６ｄ−α−ｉｄｏ−Ｈｅｐ／Ｌ−α−Ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２においてＯ−メチル−ホスホロアミデートにより、かつα−ＧａｌのＣ−３において３−ヒドロキシプロパノイル・エステルにより非化学量論的に置換されている）を伴うＣＰＳを有すると判定した。
［→３）Ｌ−α−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−α−Ｇａｌ−（１→］、および
［→３）−６ｄ−α−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−α−Ｇａｌ−（１→］。 We have identified that C. jejuni serotype HS: 3 is O-methyl- in the C-2 of the disaccharide repeat (6d-α-ido-Hep / L-α-D-ido-Hep). It was determined to have a CPS with phosphoramidate and non-stoichiometrically substituted by 3-hydroxypropanoyl ester at C-3 of α-Gal.
[→ 3) L-α-D-ido-Hep- (1 → 4) -α-Gal- (1 →), and [→ 3) -6d-α-ido-Hep- (1 → 4) -α -Gal- (1 →).

免疫原性組成物
カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に対する免疫原性組成物は、１つまたは複数の単離されたＣ．ｊｅｊｕｎｉ多糖または多糖ポリマーを含み得る。この組成物は、ギラン・バレー症候群に関連するＬＯＳを含まない多糖または多糖ポリマーを含有する。一実施形態は、１つまたは複数の単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）由来の多糖または多糖ポリマーを含む組成物であり、この多糖ポリマーは、１〜１００個の結合し合った多糖を含む（すなわち、「ｎ」は１以上である）。単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）多糖の構造は、株ＨＳ５、ＨＳ１、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、ＨＳ４／１３／６４、ＨＳ５０およびＨＳ１３のうちの１つまたは複数に由来する。 Immunogenic composition The immunogenic composition against Campylobacter jejuni is one or more isolated C. jejuni. It may comprise a jejuni polysaccharide or polysaccharide polymer. The composition contains a polysaccharide or polysaccharide polymer that does not contain LOS associated with Guillain-Barre syndrome. One embodiment is a composition comprising a polysaccharide or polysaccharide polymer derived from one or more isolated Campylobacter jejuni, wherein the polysaccharide polymer comprises 1-100 linked polysaccharides. (Ie, “n” is 1 or more). The structure of the isolated Campylobacter jejuni polysaccharide is derived from one or more of the strains HS5, HS1, HS2, HS3, HS4, HS4 / 13/64, HS50 and HS13.

一実施形態では、この組成物は、 In one embodiment, the composition comprises

カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ４４由来の［→４）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→２）−Ｇｒｏ−（１→Ｐ→］_ｎ；および
カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ１および／またはＨＳ１／４４由来の [→ 4) -α-D-Galp- (1 → 2) -Gro- (1 → P →] _{n from} C. jejuni strain HS44; and Campylobacter jejuni strain HS1 and / or Or from HS1 / 44

Ｌ−Ｄ−イド−ヘプトースの２位において非化学量論的にＯ−メチル−ホスホロアミデートにより置換されている、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ４／ＨＳ１３／ＨＳ６４由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１−＞４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２および／またはＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ４／１３／６４由来の［→３）−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−４において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ４由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有さないまたは６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２および／もしくはＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ株ＨＳ１３由来の［→３−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ；
ＨＳ２由来の [→ 3) from Campylobacter jejuni strain HS4 / HS13 / HS64, which is non-stoichiometrically substituted with O-methyl-phosphoramidate at position 2 of LD-id-heptose -L-β-D-ido-Hep- (1-> 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
From C. jejuni strain HS4 / 13/64, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-2 and / or C-7 of 6d-ido-Hep [ → 3) -6d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
[→ 3) -L-β-D- from Campylobacter jejuni strain HS4, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-4 of LD-ido-Hep. ido-Hep- (1 → 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
C. not having methyl phosphoramidate (MeOPN) or having non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-2 and / or C-7 of 6d-ido-Hep, [→ 3-6d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-Glc- (1 →] _n derived from jejuni strain HS13;
Derived from HS2

(式中、ＮＧｒｏ＝アミノグリセロール；Ｅｔｎ＝エタノールアミンである）；
６−デオキシ−アルファ−Ｄ−イド−ヘプトースの２位において非化学量論的にＯ−メチル−ホスホロアミデートにより置換されており、α−ＧａｌのＣ−３において３−ヒドロキシプロパノイル・エステル（ｈｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｏｙｌｅｓｔｅｒ）を有するまたは有さない、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ３由来の［→３）−Ｌ−アルファ−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１−＞４）−アルファ−Ｇａｌ−（１→］_ｎ；
ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−４において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ５０由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ；
ならびに
６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ５０由来の［→３−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ
からなる群から選択される１つまたは複数の多糖構造を含み、ここで、同じ多糖が結合して、１〜１００個の結合し合った多糖を含む多糖ポリマーを形成している（すなわち、「ｎ」は１以上である）。 (Where NGro = aminoglycerol; Etn = ethanolamine);
Non-stoichiometrically substituted by O-methyl-phosphoramidate at the 2-position of 6-deoxy-alpha-D-id-heptose and 3-hydroxypropanoyl ester at C-3 of α-Gal [→ 3) -L-alpha-D-ido-Hep- (1-> 4) -alpha-Gal- (1 from Campylobacter jejuni strain HS3, with or without (hydroxypropanoyl ester) →] _n ;
[→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1 → 4) derived from HS50, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-4 of LD-ido-Hep. ) -Β-D-Glc- (1 →] _n ;
As well as [→ 3-6d-β-D-] from C. jejuni strain HS50, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-7 of 6d-ido-Hep. ido-Hep- (1 → 4) -β-D-Glc- (1 →] _n
One or more polysaccharide structures selected from the group consisting of, wherein the same polysaccharides are joined to form a polysaccharide polymer comprising 1 to 100 joined polysaccharides (ie, “ n "is 1 or more).

分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の多糖または多糖ポリマーを担体に結合させることができ、前記担体はタンパク質であってもよい。一実施形態では、このタンパク質担体はＣＲＭ_１９７である。 Decomposition polysaccharides or polysaccharide polymers can be bound to a carrier, which may be a protein. In one embodiment, the protein carrier is CRM ₁₉₇ .

ＣＰＳコンジュゲートによる免疫応答の誘導
ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４およびＨＳ４４に対する免疫応答の誘導
一実施形態では、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４およびＨＳ４４カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株に対するワクチン組成物に含めるのに有用な免疫原性組成物は、構造： Induction of Immune Response by CPS Conjugates Induction of Immune Response against HS1, HS1 / HS44 and HS44 In one embodiment, useful for inclusion in vaccine compositions against HS1, HS1 / HS44 and HS44 strains of C. jejuni The immunogenic composition has the structure:

を含む多糖、またはこの多糖構造の反復を含むポリマーを含み、式中、「ｎ」。代替実施形態では、免疫原性組成物は、実施例１のようにＨＳ４４組成物を含むことがあり、これは「［ＭｅＯＰＮ］→３）−Ｆｒｕｆ」単位を含有しない。 Or a polymer comprising repeats of this polysaccharide structure, wherein “n”. In an alternative embodiment, the immunogenic composition may comprise an HS44 composition as in Example 1, which does not contain “[MeOPN] → 3) -Fruf” units.

驚くべきことに、ＨＳ１およびＨＳ１／ＨＳ４４株に見出される上記の構造は、
ＨＳ４４株に対する免疫応答を誘導する。この研究では、マウスを、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（クリフトン、ニュージャージー）と共に投与した漸増量のワクチンによって免疫した。最終免疫の２週間後、免疫した動物は全て、免疫前血清と比べ有意なレベルの（Ｐ＜０．０５）、ＨＳ１ＣＰＳに対し特異的な血清ＩｇＧ抗体を示した。さらに、この効果は、１用量あたり５０μｇのワクチン（重量に基づいて）で免疫したマウスが、１用量あたり１０μｇを投与したマウスよりも有意に高い（Ｐ＜０．０５）最終力価を有していたことから、用量依存的であった。これらの結果から、ＨＳ１が、マウスにおいて高いレベルの抗ＣＰＳ抗体を生ずることができることが明らかである。これらの研究の結果を図１８に例示する。ＨＳ１−ＣＲＭ１９７ワクチンの免疫原性を実証するドットブロットも図１９に示す。精製莢膜（１ｍｇ／ｍｌ）を３連（各２μｌ）でニトロセルロースにドットブロットし、ＨＳ１−ＣＲＭ１９７ワクチンに対するウサギ・ポリクローナル抗血清で免疫検出した。ＨＳ１：野生型ＨＳ１莢膜、ＨＳ１．０８：フルクトース分枝およびメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を欠く、ＨＳ１のフルクトース・トランスフェラーゼ変異体由来の莢膜、ＨＳ２３／３６：異種莢膜（ＨＳ２３／３６）を発現する８１−１７６由来の莢膜。 Surprisingly, the above structures found in the HS1 and HS1 / HS44 strains are:
Induces an immune response against the HS44 strain. In this study, mice were immunized with increasing doses of vaccine administered with Alhydrogel® (Clifton, NJ). Two weeks after the final immunization, all immunized animals showed serum IgG antibodies specific for HS1 CPS at a significant level (P <0.05) compared to pre-immune serum. Furthermore, this effect is that mice immunized with 50 μg of vaccine per dose (by weight) have a significantly higher (P <0.05) final titer than mice administered 10 μg per dose. It was dose-dependent. From these results, it is clear that HS1 can produce high levels of anti-CPS antibodies in mice. The results of these studies are illustrated in FIG. A dot blot demonstrating the immunogenicity of the HS1-CRM197 vaccine is also shown in FIG. Purified capsules (1 mg / ml) were dot blotted in triplicate (2 μl each) onto nitrocellulose and immunodetected with rabbit polyclonal antisera against the HS1-CRM197 vaccine. HS1: wild type HS1 capsule, HS1.08: capsule derived from a fructose transferase mutant of HS1, lacking fructose branching and methyl phosphoramidate (MeOPN), HS23 / 36: heterologous capsule (HS23 / A capsule derived from 81-176 expressing 36).

ＨＳ−５多糖組成物を使用した免疫応答の誘導
単離されたＨＳ５多糖が免疫応答を誘導する能力を評価した。単離されたＨＳ５多糖を、数あるタンパク質担体のうちの任意のものとコンジュゲートして使用する可能性が企図されるが、例示として、ＣＲＭ_１９７コンジュゲートＨＳ５多糖を評価した。 Induction of immune response using HS-5 polysaccharide composition The ability of isolated HS5 polysaccharide to induce an immune response was evaluated. While it is contemplated that the isolated HS5 polysaccharide may be used in conjugation with any of a number of protein carriers, as an example, the CRM ₁₉₇ conjugated HS5 polysaccharide was evaluated.

この研究では、実施例３の方法に基づいてＨＳ５をＣＲＭ_１９７にコンジュゲートした。ＢＡＬＢ／ｃマウスに、各１０μｇまたは５０μｇのＨＳ５多糖コンジュゲートを３用量、４週間の間隔で２００μｇのＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）（ＢｒｅｎｎｔａｇＡＧ、ドイツ）と共に投与した。マウスに合計３回注射した。最後の投与の２週間後、マウスから採血し、血清をＥＬＩＳＡで評価した。この研究の結果を、ＣＰＳ特異的ＩｇＧ応答を示す図１９に示す。 In this study, HS5 was conjugated to CRM ₁₉₇ based on the method of Example 3. BALB / c mice were dosed with 10 μg or 50 μg HS5 polysaccharide conjugate each with 200 μg ALHYDROGEL® (Brenntag AG, Germany) at 4 week intervals. Mice were injected a total of 3 times. Two weeks after the last administration, blood was collected from the mice, and the serum was evaluated by ELISA. The results of this study are shown in FIG. 19, which shows a CPS-specific IgG response.

ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされたＨＳ３の免疫応答も調べた。メスＢＡＬＢ／ｃマウスを、水酸化アルミニウム中のコンジュゲート・ワクチン（ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされた、ＢＨ０１４２由来のＨＳ３）を用いた皮下注射によって、４週間の間隔で３回免疫した。ワクチンは重量に基づいて投与した。５μｇの用量は約０．５μｇのコンジュゲートされた多糖に相当し、２５μｇの用量は約２．５μｇのコンジュゲートされた多糖に相当する。血清を各免疫の２週間後に採取した。莢膜特異的ＩｇＧ応答をＥＬＩＳＡによって決定した。結果を図２０に示す。 The immune response of HS3 conjugated to CRM ₁₉₇ was also examined. Female BALB / c mice were immunized three times at 4-week intervals by subcutaneous injection with a conjugate vaccine in aluminum hydroxide (HS3 from BH0142 conjugated to CRM ₁₉₇ ). The vaccine was administered on a weight basis. The 5 μg dose corresponds to about 0.5 μg conjugated polysaccharide and the 25 μg dose corresponds to about 2.5 μg conjugated polysaccharide. Serum was collected 2 weeks after each immunization. Capsule-specific IgG response was determined by ELISA. The results are shown in FIG.

加えて、ＨＳ４複合体のメンバー間の免疫交差反応も評価した。これらの研究では、ＨＳ４複合体の様々なメンバーの、細胞全体をプロテイナーゼＫで消化した試料を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、ＨＳ４複合体のメンバーの、細胞全体をホルマリンで死滅させたものに対し作製したウサギ・ポリクローナル抗血清でイムノブロットした。ＨＳ４抗血清はＨＳ１３およびＨＳ４と交差反応することが見出された。抗ＨＳ４／１３／６４血清は、ＨＳ６４およびＨＳ４、ならびに多少ＨＳ５０と交差反応することが見出された。 In addition, immune cross-reactivity between members of the HS4 complex was also evaluated. In these studies, samples of various members of the HS4 complex, whole cells digested with proteinase K, were electrophoresed on a 12.5% SDS-PAGE gel, and members of the HS4 complex were killed with formalin. Immunoblotting was carried out with a rabbit polyclonal antiserum prepared against the prepared product. HS4 antiserum was found to cross-react with HS13 and HS4. Anti-HS4 / 13/64 serum was found to cross-react with HS64 and HS4, and to some extent HS50.

類似した研究では、ウサギ抗ＨＳ１３血清は、ＨＳ４およびＨＳ１３と交差反応することが見出され、抗ＨＳ６４血清は、ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４およびＨＳ５０と交差反応することが見出された。同様にして、ＣＲＭ_１９７にコンジュゲートされた、ＨＳ４／１３／６４株の莢膜から構成されるコンジュゲート・ワクチンに対して作製されたウサギ・ポリクローナル抗血清をイムノブロットに使用して、ＨＳ４複合体の他のメンバーの、プロテイナーゼＫで消化した細胞全体の調製物に対するこのワクチンの交差反応性を決定した。このワクチンに対する抗体は、ＨＳ４およびＨＳ６４とは交差反応したが、ＨＳ１３またはＨＳ５０とは交差反応しなかった。 In a similar study, rabbit anti-HS13 serum was found to cross-react with HS4 and HS13, and anti-HS64 serum was found to cross-react with HS4, HS13, HS4 / 13/64 and HS50. . Similarly, a rabbit polyclonal antiserum raised against a conjugate vaccine composed of a capsule of HS4 / 13/64 conjugated to CRM ₁₉₇ was used in an immunoblot to produce HS4 conjugates. The cross-reactivity of this vaccine to whole cell preparations digested with proteinase K of other members of the body was determined. Antibodies against this vaccine cross-reacted with HS4 and HS64, but not with HS13 or HS50.

哺乳動物において抗カンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)免疫応答を誘導する方法
本発明の一実施形態は、莢膜多糖に対する免疫応答の誘導である。この実施形態の方法は、１つまたは複数の多糖抗原を含む免疫原性組成物を投与することを含み、各多糖抗原はカンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)莢膜多糖ポリマーを含む。カンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)莢膜多糖ポリマーは、実施例１〜４におけるように、カンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)株を構成する。したがって、莢膜多糖ポリマーは、個々のカンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)株由来の、繋ぎ合わされて多糖ポリマーを形成した１〜１００コピーの多糖構造を含む。免疫は、１つまたは複数の株のカンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)に対して誘導され得る。 Methods for Inducing an Anti-Camprobacter Jejuni Immune Response in a Mammal One embodiment of the present invention is the induction of an immune response against capsular polysaccharide. The method of this embodiment comprises administering an immunogenic composition comprising one or more polysaccharide antigens, each polysaccharide antigen comprising a C. jejuni capsular polysaccharide polymer. Campylobacter jejuni capsular polysaccharide polymer constitutes the C. jejuni strain as in Examples 1-4. Thus, the capsular polysaccharide polymer contains 1 to 100 copies of the polysaccharide structure joined together to form the polysaccharide polymer from individual C. jejuni strains. Immunity can be induced against one or more strains of C. jejuni.

莢膜多糖は、ＨＳ１およびＨＳ１複合体（ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４またはＨＳ４４）、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、ＨＳ５、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４ならびにＨＳ５０からなる群から選択される１つまたは複数のカンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)株に由来する。本発明の免疫原性組成物は、リポオリゴ糖またはＧＢＳに関連する他の構造を含まない単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）多糖構造、またはこの構造の多糖ポリマーを含む。多糖ポリマーは、担体分子にコンジュゲートされていてもコンジュゲートされていなくてもよく、組成物は、アジュバントを伴ってまたは伴わずに、１用量当たり０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で投与することができる。 The capsular polysaccharide is one or more Campylobacters selected from the group consisting of HS1 and HS1 complexes (HS1, HS1 / HS44 or HS44), HS2, HS3, HS4, HS5, HS13, HS4 / 13/64 and HS50. Derived from the C. jejuni strain. The immunogenic compositions of the invention comprise an isolated Campylobacter jejuni polysaccharide structure, or a polysaccharide polymer of this structure, that does not contain lipooligosaccharides or other structures associated with GBS. The polysaccharide polymer may or may not be conjugated to a carrier molecule, and the composition should be administered in a dosage range of 0.1 μg to 10 mg per dose with or without an adjuvant. Can do.

別の実施形態は、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４またはＨＳ４４由来の単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）莢膜多糖を投与することによって、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）に対する免疫応答を誘導する方法である。本発明の方法ではこの組成物を使用して、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４またはＨＳ４４に対する免疫応答を誘導する。例えば、ＬＯＳ成分、およびギラン・バレー症候群などの自己免疫応答を引き起こし得る他の成分から単離または精製された、ＨＳ１由来のものなどの単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）莢膜多糖を含む組成物を使用して、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４およびＨＳ４４のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株に対する免疫応答を誘導する。 Another embodiment is a method of inducing an immune response against Campylobacter jejuni by administering an isolated C. jejuni capsular polysaccharide from HS1, HS1 / HS44 or HS44. is there. This composition is used in the methods of the present invention to induce an immune response against HS1, HS1 / HS44 or HS44. For example, isolated Campylobacter jejuni capsular polysaccharides, such as those derived from HS1, isolated or purified from LOS components and other components that can cause autoimmune responses such as Guillain-Barre syndrome The composition comprising is used to induce an immune response against the C. jejuni strains of HS1, HS1 / HS44 and HS44.

別の実施形態では、ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／ＨＳ１３／ＨＳ６４またはＨＳ５０由来の１つまたは複数の多糖を含む、１つまたは複数の多糖を含む組成物は、ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／ＨＳ１３／Ｈ６４またはＨＳ５０を含むＨＳ４複合体の任意のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株に対する免疫を誘導する方法で使用することができる。 In another embodiment, the composition comprising one or more polysaccharides comprising one or more polysaccharides derived from HS4, HS13, HS4 / HS13 / HS64 or HS50 is HS4, HS13, HS4 / HS13 / H64 or It can be used in a method of inducing immunity against any Campylobacter jejuni strain of the HS4 complex, including HS50.

上記の組成物において、多糖または多糖ポリマーは担体に結合していてもよく、前記担体はタンパク質であってもよい。一実施形態では、タンパク質担体はＣＲＭ_１９７である。 In the above composition, the polysaccharide or polysaccharide polymer may be bound to a carrier, and the carrier may be a protein. In one embodiment, the protein carrier is CRM ₁₉₇ .

例えば、この実施形態の方法は、
ａ．ＨＳ１およびＨＳ１複合体（ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４またはＨＳ４４）、ＨＳ２、ＨＳ３、ＨＳ４、ＨＳ５、ＨＳ１３、ＨＳ４／１３／６４ならびにＨＳ５０からなる群から選択されるカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株の莢膜由来の、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）の、１つまたは複数の単離された莢膜多糖ポリマーを含む免疫原性組成物を投与するステップであって、株の莢膜多糖は結合して、個々のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の、繋ぎ合わされてポリマーを形成した１〜１００コピーの多糖構造を含む多糖ポリマーを形成していてもよく、前記組成物は、リポオリゴ糖またはＧＢＳに関連する他の構造を含まない単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）多糖構造、またはこの構造のポリマーを含み、多糖または多糖ポリマーは、担体分子にコンジュゲートされていてもコンジュゲートされていなくてもよく、組成物は、アジュバントを伴ってまたは伴わずに、１用量当たり０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で投与することができ、多糖構造は、 For example, the method of this embodiment is:
a. Capsule of Campylobacter jejuni (C. jejuni) strain selected from the group consisting of HS1 and HS1 complex (HS1, HS1 / HS44 or HS44), HS2, HS3, HS4, HS5, HS13, HS4 / 13/64 and HS50 Administering an immunogenic composition comprising one or more isolated capsular polysaccharide polymers of Campylobacter jejuni, wherein the capsular polysaccharide of the strain binds, It may form a polysaccharide polymer comprising 1-100 copies of the polysaccharide structure joined together to form a polymer, derived from individual Campylobacter jejuni strains, said composition related to lipooligosaccharides or GBS Isolated Campylobacter jejuni (C.j ejuni) comprising a polysaccharide structure, or a polymer of this structure, the polysaccharide or polysaccharide polymer may or may not be conjugated to a carrier molecule, and the composition may or may not be conjugated with an adjuvant. A dose range of 0.1 μg to 10 mg per dose can be administered and the polysaccharide structure is

カンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)株ＨＳ４４由来の［→４）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→２）−Ｇｒｏ−（１→Ｐ→］_ｎ；
カンピロバクタージェジュニ(Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ)株ＨＳ１および／またはＨＳ１／４４由来の [→ 4) -α-D-Galp- (1 → 2) -Gro- (1 → P →] _n derived from C. jejuni strain HS44;
From C. jejuni strains HS1 and / or HS1 / 44

Ｌ−Ｄ−イド−ヘプトースの２位において非化学量論的にＯ−メチル−ホスホロアミデートにより置換されている、ＨＳ４／ＨＳ１３／ＨＳ６４由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１−＞４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２および／またはＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ４／１３／６４由来の［→３）−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−４において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ４由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有さないまたは６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２および／もしくはＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ１３由来の［→３−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ；
ＨＳ２由来の [→ 3) -L-β-D-ido from HS4 / HS13 / HS64, substituted non-stoichiometrically with O-methyl-phosphoramidate at position 2 of LD-id-heptose -Hep- (1-> 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
[→ 3) -6d-β-derived from HS4 / 13/64, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-2 and / or C-7 of 6d-ido-Hep D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
[→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1 → 4) derived from HS4, having non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-4 of LD-ido-Hep ) -Β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
HS13 derived without methyl phosphoramidate (MeOPN) or with non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-2 and / or C-7 in 6d-ido-Hep [→ 3-6d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-Glc- (1 →] _n ;
Derived from HS2

（式中、ＮＧｒｏ＝アミノグリセロール；Ｅｔｎ＝エタノールアミンである）；
６−デオキシ−アルファ−Ｄ−イド−ヘプトースの２位において非化学量論的にＯ−メチル−ホスホロアミデートにより置換されており、α−ＧａｌのＣ−３において３−ヒドロキシプロパノイル・エステルを有するまたは有さない、ＨＳ３由来の［→３）−Ｌ−アルファ−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１−＞４）−アルファ−Ｇａｌ−（１→］_ｎ；
ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−４において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ５０由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ；
ならびに
６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ５０由来の［→３−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ
からなる群から選択される構造のうちの１つまたは複数を含み、ここで、同じ多糖が結合して、１〜１００個の結合し合った多糖を含む多糖ポリマーを形成している（すなわち、「ｎ」は１以上である）、ステップ；
ｂ．１用量当たり０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で、アジュバントを伴ってまたは伴わずに、ステップ（ａ）に記載の組成物をブースト投与するステップ
を含む。 (Where NGro = aminoglycerol; Etn = ethanolamine);
Non-stoichiometrically substituted by O-methyl-phosphoramidate at the 2-position of 6-deoxy-alpha-D-id-heptose and 3-hydroxypropanoyl ester at C-3 of α-Gal [→ 3) -L-alpha-D-ido-Hep- (1-> 4) -alpha-Gal- (1 →] _{n from} HS3 with or without HS;
[→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1 → 4) derived from HS50, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-4 of LD-ido-Hep. ) -Β-D-Glc- (1 →] _n ;
And [5-6 d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) derived from HS50, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-7 of 6d-ido-Hep. ) -Β-D-Glc- (1 →) _n
Wherein one or more of the structures selected from the group consisting of: wherein the same polysaccharide is bound to form a polysaccharide polymer comprising 1 to 100 linked polysaccharides (ie, “N” is 1 or more), step;
b. Boost administration of the composition described in step (a) at a dose range of 0.1 μg to 10 mg per dose, with or without adjuvant.

別の実施形態は、１つまたは複数の単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）莢膜多糖を含む組成物を投与することによって、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ１；ＨＳ１／ＨＳ４４および／またはＨＳ４４に対して免疫する方法を含む。本方法は、
ａ．１つまたは複数のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）莢膜多糖ポリマーを含む免疫原性組成物を投与するステップであって、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）莢膜多糖ポリマーは、ＨＳ１、ＨＳ１／ＨＳ４４、ＨＳ４４からなる群から選択されるカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株の莢膜由来の多糖構造を含み、莢膜多糖ポリマーは、個々のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株由来の、繋ぎ合わされてリポオリゴ糖またはＧＢＳに関連する他の構造を含まないポリマーを形成した１〜１００コピーの多糖構造を含み、これは、アジュバントを伴ってまたは伴わずに、１用量当たり０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で投与され、多糖構造が、
カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ４４由来の［→４）−α−Ｄ−Ｇａｌｐ−（１→２）−Ｇｒｏ−（１→Ｐ→］_ｎ；または
カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ１および／またはＨＳ１／４４由来の Another embodiment is to administer a composition comprising one or more isolated Campylobacter jejuni capsular polysaccharides to produce Campylobacter jejuni strain HS1; HS1 / HS44 and / or Or a method of immunizing against HS44. This method
a. Administering an immunogenic composition comprising one or more Campylobacter jejuni capsular polysaccharide polymers, wherein the Campylobacter jejuni capsular polysaccharide polymer comprises HS1, HS1 / HS44, A capsular polysaccharide polymer comprising a capsule structure of a C. jejuni strain selected from the group consisting of HS44, wherein the capsular polysaccharide polymer is linked to a lipooligosaccharide from an individual C. jejuni strain. Or 1-100 copies of a polysaccharide structure formed polymer free of other structures related to GBS, administered with a dose range of 0.1 μg to 10 mg per dose with or without adjuvant The polysaccharide structure is
[→ 4) -α-D-Galp- (1 → 2) -Gro- (1 → P →] _{n from} Campylobacter jejuni strain HS44; or Campylobacter jejuni strain HS1 and / or Or from HS1 / 44

の構造から選択される構造のうちの１つまたは複数を含み、ここで、同じ多糖が結合して、１〜１００個の結合し合った多糖を含む多糖ポリマーを形成している（すなわち、「ｎ」は１以上である）、ステップ；
ｂ．１用量当たり０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で、アジュバントを伴ってまたは伴わずに、ステップ（ａ）に記載の組成物をブースト投与するステップ
を含む。 Wherein the same polysaccharide is bound to form a polysaccharide polymer comprising 1 to 100 linked polysaccharides (ie, “ n "is 1 or more), step;
b. Boost administration of the composition described in step (a) at a dose range of 0.1 μg to 10 mg per dose, with or without adjuvant.

別の実施形態は、ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／ＨＳ１３／Ｈ６４またはＨＳ５０由来の、１つまたは複数の単離されたカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）莢膜多糖を含む組成物を投与することによって、カンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）株ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／ＨＳ１３／Ｈ６４またはＨＳ５０に対して免疫する方法を含む。本方法は、
ａ．ＨＳ４、ＨＳ１３、ＨＳ４／ＨＳ１３／Ｈ６４またはＨＳ５０由来の１つまたは複数のカンピロバクタージェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）莢膜多糖を含む免疫原性組成物を投与するステップであって、莢膜多糖ポリマーは、繋ぎ合わされてリポオリゴ糖またはＧＢＳに関連する他の構造を含まないポリマーを形成した１〜１００コピーの多糖構造を含み、これは、アジュバントを伴ってまたは伴わずに、１用量当たり０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で投与され、多糖構造は、
Ｌ−Ｄ−イド−ヘプトースの２位において非化学量論的にＯ−メチル−ホスホロアミデートにより置換されている、ＨＳ４／ＨＳ１３／ＨＳ６４由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１−＞４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２および／またはＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ４／１３／６４由来の［→３）−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−４において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ４由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→］_ｎ；
メチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有さないまたは６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−２および／もしくはＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ１３由来の［→３−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ；
ＬＤ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−４において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ５０由来の［→３）−Ｌ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ；ならびに
６ｄ−ｉｄｏ−ＨｅｐのＣ−７において非化学量論的にメチル・ホスホロアミデート（ＭｅＯＰＮ）を有する、ＨＳ５０由来の［→３−６ｄ−β−Ｄ−ｉｄｏ−Ｈｅｐ−（１→４）−β−Ｄ−Ｇｌｃ−（１→］_ｎ
の構造から選択される構造のうちの１つまたは複数を含み、ここで、同じ多糖が結合して、１〜１００個の結合し合った多糖を含む多糖ポリマーを形成している（すなわち、「ｎ」は１以上である）、ステップ；
ｂ．０．１μｇ〜１０ｍｇの用量範囲で、アジュバントを伴ってまたは伴わずに、ステップ（ａ）に記載の組成物をブースト投与するステップ
を含む。 Another embodiment relates to Campylobacter by administering a composition comprising one or more isolated Campylobacter jejuni capsular polysaccharide from HS4, HS13, HS4 / HS13 / H64 or HS50. Methods of immunizing against C. jejuni strain HS4, HS13, HS4 / HS13 / H64 or HS50 are included. This method
a. Administering an immunogenic composition comprising one or more Campylobacter jejuni capsular polysaccharides derived from HS4, HS13, HS4 / HS13 / H64 or HS50, wherein the capsular polysaccharide polymer is linked 1-100 copies of the polysaccharide structure combined to form a polymer that does not contain lipooligosaccharides or other structures related to GBS, with or without adjuvant, 0.1 μg to 10 mg per dose Administered in a dose range, the polysaccharide structure is
[→ 3) -L-β-D-ido from HS4 / HS13 / HS64, substituted non-stoichiometrically with O-methyl-phosphoramidate at position 2 of LD-id-heptose -Hep- (1-> 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
[→ 3) -6d-β-derived from HS4 / 13/64, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-2 and / or C-7 of 6d-ido-Hep D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
[→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1 → 4) derived from HS4, having non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-4 of LD-ido-Hep ) -Β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
HS13 derived without methyl phosphoramidate (MeOPN) or with non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-2 and / or C-7 in 6d-ido-Hep [→ 3-6d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-Glc- (1 →] _n ;
[→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1 → 4) derived from HS50, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-4 of LD-ido-Hep. ) -Β-D-Glc- (1 →] _n ; and [→ 3- derived from HS50, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-7 of 6d-ido-Hep. 6d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-Glc- (1 →] _n
Wherein the same polysaccharide is bound to form a polysaccharide polymer comprising 1 to 100 linked polysaccharides (ie, “ n "is 1 or more), step;
b. Boosting the composition according to step (a) in a dose range of 0.1 μg to 10 mg with or without adjuvant.

多糖ポリマーは、担体分子および組成物にコンジュゲートされていてもコンジュゲートされていなくてもよい。上記の方法では、免疫原性組成物は、経口、経鼻、皮下、皮内、経真皮、経皮、筋肉内または直腸投与することができる。また担体分子はタンパク質、例えばＣＲＭ_１９７であっても、非タンパク質分子であってもよい。アジュバントは任意の数のアジュバントであってよい。アジュバントの例には、ＬＴＲ１９２Ｇ、水酸化アルミニウム、ＲＣ５２９Ｅ、ＱＳ２１、Ｅ２９４、オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチドおよびリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍｐｈｏｓｐｈａｇｅ）が含まれる。 The polysaccharide polymer may or may not be conjugated to the carrier molecule and composition. In the above methods, the immunogenic composition can be administered orally, nasally, subcutaneously, intradermally, transdermally, transdermally, intramuscularly or rectally. The carrier molecule may be a protein, such as CRM ₁₉₇ , or a non-protein molecule. The adjuvant can be any number of adjuvants. Examples of adjuvants include LTR192G, aluminum hydroxide, RC529E, QS21, E294, oligodeoxynucleotide (ODN), CpG-containing oligodeoxynucleotides and aluminum phosphate.

当然、上記の教示を考慮すると、本発明に対し多くの修正および変更が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内において、具体的記載とは異なる形で本発明を実施することもできることを理解されたい。 Of course, many modifications and variations of the present invention are possible in light of the above teachings. It is therefore to be understood that within the scope of the appended claims, the invention may be practiced otherwise than as specifically described.

Claims

An immunogenic composition against Campylobacter jejuni comprising one or more polysaccharide antigens, wherein each polysaccharide antigen is derived from a C. jejuni strain and contains 1 to 100 polysaccharides An isolated Campylobacter jejuni capsular polysaccharide, wherein said Campylobacter jejuni strain is HS1, HS1 / HS44, HS44, HS2, wherein said Campylobacter jejuni capsular polysaccharide is conjugated to form a repeating polysaccharide polymer comprising Selected from the group consisting of HS3, HS4, HS5, HS13, HS4 / 13/64 and HS50, wherein the composition comprises lipooligosaccharide structures and other structures associated with Guillain-Barre syndrome It has no immunogenic composition.

The isolated Campylobacter jejuni capsular polysaccharide is:
From Campylobacter jejuni strain HS1 and / or HS1 / 44
[→ 3) -L-β-D-ido from HS4 / HS13 / HS64, substituted non-stoichiometrically with O-methyl-phosphoramidate at position 2 of LD-id-heptose -Hep- (1-> 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
[→ 3) -6d-β-derived from HS4 / 13/64, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-2 and / or C-7 of 6d-ido-Hep D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
[→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1 → 4) derived from HS4, having non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-4 of LD-ido-Hep ) -Β-D-GlcNAc- (1 →] _n ;
HS13 derived without methyl phosphoramidate (MeOPN) or with non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-2 and / or C-7 in 6d-ido-Hep [→ 3-6d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-Glc- (1 →] _n ;
[→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1->) derived from HS50 having non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) at C-4 of LD-ido-Hep 4) -β-D-Glc- (1 →] _n ;
Derived from HS2
(Where NGro = aminoglycerol; Etn = ethanolamine);
Non-stoichiometrically substituted by O-methyl-phosphoramidate at the 2-position of 6-deoxy-alpha-D-id-heptose and 3-hydroxypropanoyl ester at C-3 of α-Gal [→ 3) -L-alpha-D-ido-Hep- (1-> 4) -alpha-Gal- (1 →] _{n from} HS3 with or without HS;
[→ 3) -L-β-D-ido-Hep- (1 → 4) derived from HS50, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-4 of LD-ido-Hep. ) -Β-D-Glc- (1 →] _n ; and [→ 3- derived from HS50, which has non-stoichiometric methyl phosphoramidate (MeOPN) in C-7 of 6d-ido-Hep. 6d-β-D-ido-Hep- (1 → 4) -β-D-Glc- (1 →] _n (wherein the polysaccharide repeat number “n” is 1 to 100, and a polysaccharide polymer is formed) )
The immunogenic composition of claim 1 comprising a structure selected from the group consisting of:

The composition according to claim 1 or 2, wherein the capsular polysaccharide is conjugated to a protein carrier.

4. The composition of claim 3, wherein the protein carrier is CRM ₁₉₇ .

The composition according to claim 1 or 2, which also comprises an adjuvant.

6. The composition of claim 5, wherein the adjuvant is selected from the group consisting of LTR192G, aluminum hydroxide, RC529E, QS21, E294, oligodeoxynucleotide (ODN), CpG-containing oligodeoxynucleotide and aluminum phosphate.

A method for inducing an immune response against a C. jejuni strain selected from HS1, HS1 / HS44, HS44, HS2, HS3, HS4, HS5, HS13, HS4 / 13/64 and HS50 Inducing an immune response against one or more C. jejuni strains,
a. Administering the capsular polysaccharide according to claim 1 or 2 in a dose range of 0.1 μg to 10 mg per dose;
b. A method comprising the step of boosting a capsular polysaccharide according to claim 1 or 2 in a dose range of 0.1 μg to 10 mg per dose.

8. The method of claim 7, wherein the capsular polysaccharide is conjugated to a protein carrier.

9. The method of claim 8, wherein the protein carrier is CRM ₁₉₇ .

8. The method of claim 7, wherein the composition also includes an adjuvant.

11. The method of claim 10, wherein the adjuvant is selected from the group consisting of LTR192G, aluminum hydroxide, RC529E, QS21, E294, oligodeoxynucleotide (ODN), CpG-containing oligodeoxynucleotide and aluminum phosphate.

8. The method of claim 7, wherein the composition is administered by a route selected from the group consisting of oral, nasal, subcutaneous, intradermal, transdermal, transdermal, intramuscular, and rectal.

2. The Campylobacter jejuni strain HS1 according to claim 1 by administering a composition comprising one or more isolated C. jejuni capsular polysaccharides; HS1 / HS44 and / or A method for inducing an immune response against HS44, comprising:
a. One or more isolated Campylobacter jejuni from a capsule of a C. jejuni strain selected from the group consisting of HS1, HS1 / HS44 or HS44 according to claim 1. Administering an immunogenic composition comprising a membrane polysaccharide, wherein the capsular polysaccharide can be conjugated to form a repeating polysaccharide polymer;
b. One or more isolated Campylobacter jejuni from a capsule of a C. jejuni strain selected from the group consisting of HS1, HS1 / HS44 or HS44 according to claim 1. Boosting an immunogenic composition comprising a membrane polysaccharide, wherein the capsular polysaccharide is administered in a dose range of 0.1 μg to 10 mg per dose, with or without an adjuvant. A method comprising steps that can be combined to form.

The polysaccharide structure
[→ 4) -α-D-Galp- (1 → 2) -Gro- (1 → P →] _{n from} Campylobacter jejuni strain HS44; or Campylobacter jejuni strain HS1 and / or Or from HS1 / 44
Wherein the same polysaccharide is bound to form a polysaccharide polymer comprising 1 to 100 linked polysaccharides (ie, “ 14. The method of claim 13, wherein “n” is 1 or greater).