JP2017516751A - 薬剤誘導性性腺毒性または子宮毒性の治療および防止のための色素上皮由来因子（ｐｅｄｆ）の使用方法 - Google Patents

Abstract

薬剤により誘導される性腺毒性の治療または防止を、対象において実施するための方法を提供する。したがって、対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止することを含む方法を提供する。また、対象における性腺機能を決定し、そして、前記対象に、治療有効量のＰＥＤＦを投与して、薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止することを含む方法も提供する。また、対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止するための、ＰＥＤＦも提供する。また、卵母細胞の品質をｅｘ ｖｉｖｏで改善するための、培養細胞、培地、キットおよび方法も提供する。

Description

本発明は、いくつかの実施形態において、薬剤誘導性性腺毒性または子宮毒性を治療および防止するための色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の使用方法に関する。

過去３０年にわたって、早期段階での診断の向上および治療の改善のおかげでがん患者の生存率は顕著に改善してきた。その結果、治癒した対象の生活の質に及ぼす、がん治療の遅延型作用に対して、より大きな注目が集まっている。

大部分のがん型のための治療は、化学療法および放射線療法などの細胞傷害性の治療を含み、当該治療は生殖機能に部分的または決定的な影響を及ぼし、ホルモン環境および性腺保存を妨害し、その後は不妊症または早期閉経を誘導し得る。がん治療後の性腺毒性および子宮毒性のリスクは、治療および用量に依存し、年齢に関連すると考えられる。したがって、例えば、乳がん治療のためにエストロゲン受容体に対するアンタゴニストとしてタモキシフェンを使用すると、例えば、子宮においてアゴニスト活性が発生し、子宮内膜過形成および子宮内膜がんを含む、一定範囲の子宮内膜病理へとつながる［非特許文献１］。いくつかの化学療法剤、例えば、ドキソルビシン（ＤＸＲ）、シクロホスファミド、ブスルファンおよびイホスファミドは、乳がん、リンパ腫、白血病および肉腫を含む様々ながんの治療に用いられることが多いが、不可逆的な性腺毒性作用を有することが知られている。放射線療法後の性腺機能障害は、性腺が照射領域に近いか、またはその中にある場合に生じ得る［非特許文献２］。

がん治療後の性腺機能障害は、虚血をもたらす血管損傷の誘導と、酸化ストレスの誘導および細胞内カルシウムの増加などによるアポトーシス誘導による性腺への直接的な急性傷害と、の両方に起因すると考えられてきた［非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６］。

様々な型の悪性腫瘍の患者において生殖能力を保存するための戦略としては、体外受精（ＩＶＦ）、胚、卵母細胞および精子の凍結保存、卵巣皮質および全卵巣の凍結保存、卵巣移植、卵巣転位術、およびＧｎＲＨアゴニスト保護が挙げられる。今日にいたるまでに、ＩＶＦ後の胚および成熟卵母細胞の凍結保存だけが、米国生殖医学会（American Society of Reproductive Medicine）によって承認された技術である。

色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）スーパーファミリーの非阻害的メンバーであり、初めは神経細胞の増殖を促進、支援することができる神経栄養因子と報告されたものである。そののち神経栄養活性を有することに加えて、ＰＥＤＦは抗血管形成特性、抗炎症特性および抗酸化特性を有することが見出された。今日にいたるまでに、２つの異なるＰＥＤＦ受容体が提唱されている。即ち、ＰＥＤＦ神経保護、生存促進機能に関与する８０ｋＤａのＰＥＤＦ推定受容体（ＰＥＤＦ−Ｒ^Ｎ；ＰＮＰＬＡ２）、およびＰＥＤＦアポトーシス促進、抗血管形成活性に関与する６０ｋＤａのＰＥＤＦ推定受容体（ＰＥＤＦ−Ｒ^Ａ；ラミニン受容体）［非特許文献７、非特許文献８］である。ＰＥＤＦははじめ、網膜色素上皮細胞の培養培地中で発見されたが、神経系、卵巣、子宮、肝臓および血漿など身体全体で広く発現されている。生殖系においてＰＥＤＦは顕著に発現するにもかかわらず、卵巣および子宮におけるその機能に関しては限られたデータしか存在しない［非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３］。これまでの研究では、主としてＰＥＤＦが抗血管形成効果を有するために、腫瘍の治療に使用することが示唆されてきた［非特許文献７］。

さらなる関連背景技術には下記の特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６、非特許文献１７が挙げられる。

米国特許出願公開第２０１３００５３３１２号 米国特許出願公開第２００３０２１６２８６号 米国特許出願公開第２００７００８７９６７号 米国特許出願公開第２００４００７１６５９号 米国特許出願公開第２００９０１１８１９１号 米国特許出願公開第２００８０２７４９６７号 米国特許出願公開第２００９００６９２４１号 米国特許出願公開第２０１２０２４５０９７号 ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４０２３００７号 ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３１８４９８６号 米国特許第４，６６６，８２８号 米国特許第４，６８３，２０２号 米国特許第４，８０１，５３１号 米国特許第５，１９２，６５９号 米国特許第５，２７２，０５７号 米国特許第３，７９１，９３２号 米国特許第３，８３９，１５３号 米国特許第３，８５０，７５２号 米国特許第３，８５０，５７８号 米国特許第３，８５３，９８７号 米国特許第３，８６７，５１７号 米国特許第３，８７９，２６２号 米国特許第３，９０１，６５４号 米国特許第３，９３５，０７４号 米国特許第３，９８４，５３３号 米国特許第３，９９６，３４５号 米国特許第４，０３４，０７４号 米国特許第４，０９８，８７６号 米国特許第４，８７９，２１９号 米国特許第５，０１１，７７１号 米国特許第５，２８１，５２１号

Obstet Gynecol. 2014 Jun;123(6):1394-7 Brydoy et al. Acta Oncologica (2007). 46: 480-489 Ben-Aharon et al., Reprod Biol Endocrinol (2010), 8:20 Kampfer et al. Life Sci. (2014) 97(2): 129-36 Bar-Josef et a. Reproductive Toxicology (2010), 30: 566-572 Bar-Joseph et al. PLoS One (2011) 6: e23492 Manalo et al. Expert Opin Ther Pat (2011): 21, 121-130 Yamagishi et al. Cell Tissue Res (2005) 320: 437-445 Cheung et al., Endocrinology, 2006. 147(9): p. 4179-91 Chuderland et al. J Clin Endocrinol Metab (2013) 98: E258-266 Chuderland et al. Mol Hum Reprod (2013) 19: 72-81 Pollina et al., Cell Cycle, 2008. 7(13): p. 2056-70 Palmieri et al. Exp Cell Res, 1999. 247(1): p. 142-7 Nelius et al. [J Clin Oncol 31, 2013 (suppl 6; abstr 173)] Choong et al. [The Liddy Shriver Sarcoma Initiative - PEDF: A Potential Therapeutic Agent for Osteosarcoma: sarcomahelpdotorg/research/osteosarcoma-pedfdothtml] Ma and Waxman [Mol Cancer Ther. (2008) 7(12): 3670-3684] Jia and Waxman [Cancer Lett. (2013) 330(2):241-9] Ben-Aharon et al. Reproductive Biology and Endocrinology : RB&E (2010) 8: 20 Yanagishe et al. 2006 J. Endocrinol. Metab. 91:2447-2450 Bukman and Heineman, Human Reproduction Update, Vol. 7, No. 6, pp. 581-590 Target organ pathology, a basic text, Turton J and Hooson J (eds) Taylor & Francis, London, United Kingdom, 1998 H. Marquardt, S. G. Schafer, R. O. McClellan, F. Welsch (eds.), 「Toxicology」、Chapter 13: The Liver, 1999, Academic Press, London Rakesh K. et al. A. Agarwal et al. (eds.), Studies on Women's Health, Oxidative Stress in Applied Basic Research and Clinical Practice, Chapter 2 Sahoo DK, Protocols for Evaluating Antioxidant Defence and Oxidative Stress Parameters in Rat Testis, WebmedCentral BIOCHEMISTRY 2013;4(5):WMC004265"" Chapter 52, Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner), and the introduction thereto, 1202-1263, of Goodman and Gilman's 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」, Eighth Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc. (Health Professions Division) Nuovo GJ, et al. 1993, Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 17: 683-90 Komminoth P, et al. 1994, Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR. Pathol Res Pract., 190: 1017-25 「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition Fingl, et al., 1975, 「The Pharmacological Basis of Therapeutics」、Ch. 1 p.1 Kuldeep Jain and Pankaj Talwar (IVF techniques for the beginner, JP Medical Ltd 2013) 「Molecular Cloning: A laboratory Manual」、Sambrook et al., (1989) 「Current Protocols in Molecular Biology」、Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994) Ausubel et al., 「Current Protocols in Molecular Biology」、John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) Perbal, 「A Practical Guide to Molecular Cloning」、John Wiley & Sons, New York (1988) Watson et al., 「Recombinant DNA」、Scientific American Books, New York Birren et al. (eds) 「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」、Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998) 「Cell Biology: A Laboratory Handbook」、Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994) 「Current Protocols in Immunology」、Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994) Stites et al. (eds), 「Basic and Clinical Immunology」(8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) Mishell and Shiigi (eds), 「Selected Methods in Cellular Immunology」、W. H. Freeman and Co., New York (1980) 「Oligonucleotide Synthesis」、Gait, M. J., ed. (1984) 「Nucleic Acid Hybridization」、Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985) 「Transcription and Translation」、Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984) 「Animal Cell Culture」、Freshney, R. I., ed. (1986) 「Immobilized Cells and Enzymes」、IRL Press, (1986) 「A Practical Guide to Molecular Cloning」、Perbal, B., (1984) 「Methods in Enzymology」、Vol. 1-317, Academic Press 「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」、Academic Press, San Diego, CA (1990) Marshak et al., 「Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual」、CSHL Press (1996) Suh et al. J Cell Biol (1992) 119: 439-450 Breckwoldt et al. 1996, Sasson & Amsterdam 2002 Konson et al. Cancer Res (2010) 70 6247-6257 Ben-Aharon et al. Reproductive biology and endocrinology : RB&E (2010) 8: 20 Li et al. Stem Cells 2013 Chuderland, D. et al. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 98, E258-66 (2013) Chuderland, D. et al. Human reproduction (Oxford, England) 0, 1-9 (2013)

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、薬剤により誘導される性腺毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、前記対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止することを含む、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止するための、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、薬剤により誘導される性腺毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、
（ａ）前記対象における性腺機能を決定し、そして
（ｂ）前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与して、前記対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止する
ことを含む、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば前記性腺毒性は、性腺機能低下症、精子形成の減少、排卵の減少、早発卵巣不全および不妊症からなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、性腺毒性は、排卵の減少を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は化学療法および放射線療法からなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、薬剤は酸化ストレスを誘導する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は雌である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、雌は生殖年齢にある。

本発明のいくつかの実施形態によれば、雌は卵母細胞の回収を受けていない。

本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は雄である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、雄は生殖年齢にある。

本発明のいくつかの実施形態によれば、雄は精液採取を受けていない。

本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はがんと診断されている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、がんは、精巣がん、乳がん、卵巣がん、リンパ腫および白血病からなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、化学療法のための治療剤が最大耐量（ＭＴＤ）で投与される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、化学療法は、メクロレタミンプロカルバジンシクロホスファミド、イホスファミド、ブスルファン、メルファラン、クロラムブシル、およびクロルメチン、ドキソルビシン、シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、化学療法は、アルキル化剤、プロカルバジン、白金類似体およびアントラサイクリン抗生物質からなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、化学療法は、アントラサイクリン抗生物質、アルキル化剤、白金配位錯体、エピポドフィロトキシンおよびカンプトテシンからなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、化学療法はドキソルビシンである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、放射線療法は骨盤照射を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、放射線療法は全身照射（ＴＢＩ）を含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、方法は、対象に対する薬剤の投与をさらに含む。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、薬剤の投与と同時に行う。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は薬剤の投与後に行う。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、前記対象に、治療有効量のタモキシフェンおよび治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与して、前記がんを治療することを含む、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象におけるがんを治療するための、タモキシフェンおよび色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、タモキシフェン誘導性子宮毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、前記対象においてタモキシフェン誘導性子宮毒性を治療または防止することを含む、方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象においてタモキシフェン誘導性子宮毒性を治療または防止するための、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、タモキシフェンおよび色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をそれぞれ個別に収容した容器を含む、がんの治療用に同定された製品が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、活性成分となるタモキシフェンおよび色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、複数の活性成分は、共処方される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、複数の活性成分は、別々に処方される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性を診断するための方法であって、タモキシフェンによる治療後の対象の生物試料中のＰＥＤＦレベルを決定することを含み、前記レベルが所定閾値を下回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記生物試料中のＶＥＧＦのレベルを決定することをさらに含み、前記レベルが所定閾値を上回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＶＥＧＦレベルとＰＥＤＦとの比が、前記生物試料に対する所定の閾値を上回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする。

本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は雌である。

本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は生殖年齢にある。

本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は閉経前の期間にある。

本発明のいくつかの実施形態によれば、対象は閉経後の期間にある。

本発明のいくつかの実施形態によれば、対象はがんと診断されている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、がんは乳がんである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、タモキシフェンの投与と同時に行う。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、タモキシフェンの投与の後に行う。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、皮下注射によって行う。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、静脈内注射によって行う。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、０．０２〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲内で行う。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、０．１６２〜０．３２ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲内で行う。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＰＥＤＦは、ＰＥＤＦペプチドである。

本発明のいくつかの実施形態によれば、性腺機能パラメータは、ホルモン評価、超音波評価および精子分析からなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ホルモン評価は、ＬＨ、ＦＳＨ、エストラジオール、ＡＭＨ、テストステロン、ＳＨＢＧおよびプロゲステロンからなる群より選択される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、超音波評価は、胞状卵胞の計数である。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、卵母細胞の品質を改善するための方法であって、卵母細胞を含む培養細胞中の卵母細胞を、有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることによって、ｅｘ ｖｉｖｏで卵母細胞の品質を改善することを含む、前記方法が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、卵母細胞と、外部添加された色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）とを含む培養細胞が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、ＰＥＤＦを含む、ＩＶＦにおける使用のためのＩＶＦグレードの培地が提供される。

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、
（ｉ）ＩＶＦにおける使用のためのＩＶＦグレードの培地；および
（ｉｉ）ＰＥＤＦ
を含むキットが提供される。

本発明のいくつかの実施形態によれば、卵母細胞は、体外受精（ＩＶＦ）用の条件下で維持されている。

本発明のいくつかの実施形態によれば、接触は、卵母細胞の受精前に実施する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、接触は、卵母細胞の受精後に実施する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、接触は、卵母細胞の受精と同時に実施する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、接触は、培養細胞中の酸化物質が所定の閾値を上回って蓄積した後に実施する。

本発明のいくつかの実施形態によれば、卵母細胞は、卵巣または卵巣断片中に含まれる。

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＩＶＦのための卵母細胞は、卵巣または卵巣断片中に含まれる。

特に定義のない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する当業界における通常の知識を有する者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において用いることができるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含め本特許明細書が制御するものとする。さらに、材料、方法、および実施例は例示に過ぎず限定を意図するものではない。

本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面および画像を参照しながら、単に例示としてここで説明する。ここで図面に特に詳細に参照するが、ここで示す詳細は例示に過ぎず、本発明の実施形態の例示的考察のためだけのものであることを強調する。これに関して、図面と共に為される説明は、本発明の実施形態をどのように実施することができるかを当業者に明らかにする。

図１のＡ〜Ｂは、ドキソルビシン（ＤＸＲ）がマウス卵巣中のＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルを低下させることを示す図である。図１のＡは、実験の設定を記載する図である：７週齢のＩＣＲ雌マウス（一群当たり、ｎ＝５匹）を、標準的な妊馬血清性性腺刺激ホルモン／ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ／ｈＣＧ）プロトコール［非特許文献１８］を用いて過剰排卵処理した。ＰＭＳＧの２４時間後、マウスに、ＤＸＲまたは生理食塩水（対照）を投与した。ｈＣＧの２４時間後に、卵巣を回収した。図１のＢは、図１のＡに記載のプロトコール実施後の、対照マウスおよびＤＸＲ処理マウスの卵巣におけるＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルを示すグラフである。総ＲＮＡを卵巣から抽出し、ＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルの変化（相対量；ＲＱ）を、ＰＥＤＦに対する特異的プライマー（配列番号１０〜１１）を用いたｑＰＣＲにより測定し、ＨＰＲＴ（配列番号６〜７）を用いて較正した。（^＊はＰ＜０．０５である）−対照値と有意に異なる。 図２のＡ〜Ｂは、ｒＰＥＤＦがＤＸＲ処理下での排卵を改善することを示す図である。図２のＡは、実験の設定を記載する図である。７週齢のＩＣＲ雌マウス（一群当たり、ｎ＝４匹）をＤＸＲまたは生理食塩水（対照）で処理し、翌日マウスにｒＰＥＤＦまたはＴＲＩＳ（対照）を投与した。実験の４日目に、標準的なＰＭＳＧ／ｈＣＧプロトコール［非特許文献１８］を用いてマウスに過剰排卵を誘導した。マウスを、ｈＣＧ投与の１６〜１７時間後に屠殺した。図２のＢは、図２のＡに記載のプロトコール実施後の、対照マウス、ＤＸＲ処理マウスおよびＤＸＲ＋ｒＰＥＤＦ処理マウスにおける排卵された卵母細胞の数を示すグラフである。バーは平均±ＳＥＭを表す。（^＊はＰ＜０．０５である）−ＤＸＲ値と有意に異なる。 図３のＡ〜Ｂは、顆粒膜細胞の生存率およびＰＥＤＦ ｍＲＮＡに対するＨ_２Ｏ_２の作用を示す図である。ＬＨ−１５細胞を、段階的に濃度を高めたＨ_２Ｏ_２（２％血清、２４時間）に曝露した。図３のＡは、ＭＴＴアッセイにより測定した細胞の生存率を示すグラフである。バーは、５つの独立した実験を表す；各処理と対照との比を、平均±ＳＤＶとしてプロットした。（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はｐ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。図３のＢは、ＰＥＤＦに対する特異的プライマー（配列番号８〜９）を用いたｑＰＣＲ分析により測定し、ＨＰＲＴ（配列番号６〜７）で較正したＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルの変化を示すグラフである。バーは、３つの独立した実験を表す；各処理と対照との比を、平均±ＳＤＶとしてプロットした。（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はｐ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 図４のＡ〜Ｃは、ＰＥＤＦがＯＳ条件下でＬＨ−１５顆粒膜細胞の生存率を高めることを示す図である。ＬＨ−１５細胞株を、ｒＰＥＤＦ（１ｎＭおよび５ｎＭ）を含むまたは含まない、段階的に濃度を高めたＨ_２Ｏ_２（２％血清、２４時間）に曝露した。図４は、ＭＴＴアッセイによって測定した細胞の生存率を示すグラフである。バーは、３つの独立した実験を表す；各処理と対照との比を、平均±ＳＤＶとしてプロットした。（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はｐ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。図４のＢは、抗ＢＡＸ抗体を用いた、対照細胞およびＨ_２Ｏ_２処理細胞におけるＢＡＸタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロットの写真である。ＢＡＸタンパク質レベルは、アクチンを用いて較正した。図４のＣは、ウェスタンブロットにより評価した、対照細胞およびＨ_２Ｏ_２処理細胞におけるＢＡＸタンパク質レベルの濃度測定分析を示すグラフである。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析した。バーは、３つの独立した実験を表す；各処理と対照との比を、平均±ＳＤＶとしてプロットした。（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はｐ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 図５のＡ〜Ｂは、顆粒膜細胞におけるＳＯＤ−１およびＧＰＸ−１のｍＲＮＡレベルに対するＨ_２Ｏ_２の副作用を、ｒＰＥＤＦが逆転させることを示す図である。ＬＨ−１５細胞を、ｐＰＥＤＦ（１ｎＭ）を含むまたは含まない、Ｈ_２Ｏ_２（２％血清、２４時間）に曝露した。図５のＡは、ＳＯＤ−１ ｍＲＮＡレベルの変化を示すグラフ、図５のＢは、ＧＰＸ−１ ｍＲＮＡレベルの変化を示すグラフであり、ｍＲＮＡレベルはＳＯＤ−１（配列番号１２〜１３）およびＧＰＸ−１（配列番号１４〜１５）に対する特異的プライマーを用いたｑＰＣＲ分析により測定し、ＨＰＲＴ（配列番号６〜７）で較正した。バーは、３つの独立した実験を表す；各処理と対照との比を、平均±ＳＤＶとしてプロットした。（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はｐ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 図６のＡ〜Ｃは、卵巣における、ＰＥＤＦ受容体であるＰＮＰＬＡ２の発現を示す図である。図６のＡは、抗ＰＮＰＬＡ２抗体（ｂ、ｃ）および二次抗体のみの対照（ａ）で標識されたマウス卵巣切片の代表的な免疫組織化学顕微鏡写真である。バーは、１００μＭを表す。図６のＢは、マウス卵巣（マウス）およびＬＨ−１５細胞（ラット）におけるＰＮＰＬＡ２ ｍＲＮＡの発現（ラインａ）を示す代表的なＰＣＲ分析（×３５サイクル）のオートラジオグラフである。対照はＧＡＰＤＨ（ラインｂ）。図６のＣは、抗ＰＮＰＬＡ２抗体を用いた、マウス卵巣（マウス）およびＬＨ−１５細胞（ラット）におけるＰＮＰＬＡ２タンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロットの写真である。 図７のＡ〜Ｂは、ＰＥＤＦが、顆粒膜細胞中のＡＫＴシグナル伝達経路を活性化することを示す図である。ＬＨ−１５細胞を血清飢餓条件に置き（０．１％、１６時間）、一定時間ｒＰＥＤＦ（１ｎＭ）で処理した。図７のＡは、対照細胞およびｒＰＥＤＦ処理細胞におけるリン酸化ＡＫＴ（Ｐｈｏ−ＡＫＴ）および一般的なＡＫＴ（ｇｅｎ−ＡＫＴ）のタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロット分析の写真である。図７のＢは、図７のＡに示された結果の濃度測定分析を示すグラフである。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析した。バーは、３つの独立した実験を表す；各時点におけるＰｈｏ−ＡＫＴと対照との比を、平均±ＳＤＶとしてプロットした。（^＊はＰ＜０．０５である）−対照値と有意に異なる。 タモキシフェンによる７日間の処理後の卵巣切除マウスの子宮重量（グラム）を示す棒グラフであり、亜急性タモキシフェン処理が用量依存的に子宮重量を増加させることを示す。バーは、平均±ＳＥＭを表す。（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 図９のＡ〜Ｄは、亜急性タモキシフェン処理によって卵巣切除マウスの子宮におけるＰＥＤＦレベルは低下するが、ＶＥＧＦレベルは増加することを示す図である。卵巣切除マウスに、タモキシフェンを７日間投与した。図９のＡは、ＶＥＧＦおよびＰＥＤＦのタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロット分析の写真である。図９のＢ〜Ｄは、ウェスタンブロットにより評価した、ＶＥＧＦタンパク質レベル（図９のＢ）、ＰＥＤＦタンパク質レベル（図９のＣ）およびＶＥＧＦ／ＰＥＤＦ比（図９のＤ）の濃度測定分析を示す棒グラフである。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析し、負荷対照であるアクチンに対して正規化した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照との比を表す。一群当たり、ｎ＝３／４匹のマウス、（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 卵巣切除されたマウスの子宮における、ＰＥＤＦ受容体であるＰＮＰＬＡ２およびラミニン−ＲのｍＲＮＡレベルに対する亜急性タモキシフェン処理の作用を示す図であり、ｍＲＮＡレベルは、ＰＮＰＬＡ２（配列番号１６〜１７）およびラミニン−Ｒ（配列番号１８〜１９）に対する特異的プライマーを用いたｑＰＣＲ分析により測定し、ＨＰＲＴ（配列番号６〜７）を用いて較正した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、処理と対照との比を表す。一群当たり、ｎ＝３／４匹のマウス。（^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 溶媒のみ（対照群）、タモキシフェンのみ、またはＰＥＤＦとの組み合わせによる７日間の処理後の卵巣切除マウスの子宮重量を示し、ｒＰＥＤＦを用いた処理が子宮重量に対する亜急性タモキシフェン処理の副作用を減少させることを示す棒グラフである。卵巣切除マウスに、溶媒のみ（対照群）、タモキシフェン、またはタモキシフェンとｒＰＥＤＦの組合せを７日間投与した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照（タモキシフェンのみ）との比を表す。対照ｎ＝１３；タモキシフェンｎ＝２２；タモキシフェン＋ｒＰＥＤＦｎ＝１６。（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 図１２のＡ〜Ｂは、ｒＰＥＤＦを用いた処理が、卵巣切除マウスの子宮におけるＶＥＧＦタンパク質レベルに対する亜急性タモキシフェン処理の副作用を減少させることを示す図である。卵巣切除マウスに、溶媒のみ（対照群）、タモキシフェン、またはタモキシフェンとｒＰＥＤＦとの組合せを７日間投与した。図１２のＡは、ＶＥＧＦタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロットの写真である。図１２のＢは、図１２のＡに示したウェスタンブロット分析結果の濃度測定分析により評価した、ＶＥＧＦタンパク質レベルを示す棒グラフである。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析し、負荷対照であるアクチンに対して正規化した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照との比を表す。対照ｎ＝１３；タモキシフェンｎ＝２２；タモキシフェン＋ｒＰＥＤＦ ｎ＝１６。（^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 図１３のＡ〜Ｂは、ＰＥＤＦが、亜急性タモキシフェン処理後の卵巣切除マウスの子宮におけるＡＫＴシグナル伝達経路の活性化を下方調節することを示す図である。卵巣切除マウスに、タモキシフェンのみ、またはタモキシフェンとｒＰＥＤＦとの組合せを７日間投与した。図１３のＡは、タモキシフェンのみ（対照）およびタモキシフェン＋ｒＰＥＤＦで処理したマウスにおけるリン酸化ＡＫＴ（ｐ−ＡＫＴ）および一般的なＡＫＴ（ｇｅｎ−ＡＫＴ）のタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロット分析の写真である。図１３Ｂは、図１３のＡに示したウェスタンブロット分析結果の濃度測定分析により評価した、ｐ−ＡＫＴレベルを示す棒グラフである。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析し、ｇｅｎ−ＡＫＴに対して正規化した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照におけるｐ−ＡＫＴとの比を表す。一群当たり、ｎ＝４匹のマウス。（^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 図１４のＡ〜Ｂは、ＰＥＤＦが、亜急性タモキシフェン処理後の卵巣切除マウスの子宮におけるＪＮＫシグナル伝達経路の活性化を上方調節することを示す図である。卵巣切除マウスに、タモキシフェンのみ、またはタモキシフェンとｒＰＥＤＦとの組合せを７日間投与した。図１４のＡは、タモキシフェンのみ（対照）およびタモキシフェン＋ｒＰＥＤＦで処理したマウスにおけるリン酸化ＪＮＬ（ｐ−ＪＮＫ）および一般的なＪＮＫ（ｇｅｎ−ＪＮＫ）のタンパク質レベルを示す、代表的なウェスタンブロットの写真である。図１４のＢは、図１４のＡに示したウェスタンブロット分析結果の濃度測定分析により評価した、ｐ−ＪＮＫレベルを示す棒グラフである。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析し、ｇｅｎ−ＪＮＫに対して正規化した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照におけるｐ−ＪＮＫ間の比を表す。一群当たり、ｎ＝４匹のマウス。（^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 タモキシフェンを用いた長期的な処理（マウスあたり２．５μｇ／週５日を１カ月間）後の卵巣切除マウスの子宮重量（グラム）を示す棒グラフであり、長期的なタモキシフェン処理が子宮重量を有意に増加させることを示す。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照との比を表す。一群当たり、ｎ＝６／７匹のマウス。（^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 図１６のＡ〜Ｄは、長期的なタモキシフェン処理により、卵巣切除マウスの子宮におけるＰＥＤＦレベルは低下するが、ＶＥＧＦレベルは増加することを示す図である。卵巣切除マウスに、週５日のタモキシフェン投与を１カ月間実施した。図１６のＡは、ＶＥＧＦタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロットの写真である。図１６のＢ〜Ｄは、ウェスタンブロットにより評価した、ＶＥＧＦタンパク質レベル（図１６のＢ）、ＰＥＤＦタンパク質レベル（図１６のＣ）およびＶＥＧＦ／ＰＥＤＦ比（図１６のＤ）の濃度測定分析を示す棒グラフである。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析し、負荷対照であるアクチンに対して正規化した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照との比を表す。一群当たり、ｎ＝６／７匹のマウス。（^＊はＰ＜０．０５であり^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 卵巣切除マウスの子宮における、ＰＥＤＦ受容体であるＰＮＰＬＡ２およびラミニン−ＲのｍＲＮＡレベルに対する長期的なタモキシフェン処理の作用を示す図であり、ｍＲＮＡレベルはＰＮＰＬＡ２（配列番号１６〜１７）およびラミニン−Ｒ（配列番号１８〜１９）に対する特異的なプライマーを用いたｑＰＣＲ分析により測定し、ＨＰＲＴ（配列番号６〜７）で較正した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照との比を表す。一群当たり、ｎ＝６／７匹のマウス。（^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。 タモキシフェンのみ、またはＰＥＤＦと組み合わせた長期的処理後の卵巣切除マウスの子宮重量（グラム）を示し、ｒＰＥＤＦを用いた処理が子宮重量に対する亜急性タモキシフェン処理の副作用を減少させることを示す棒グラフである。卵巣切除マウスに、１カ月にわたって週に５日間、タモキシフェンを、またはタモキシフェンとｒＰＥＤＦとの組合せを投与した。バーは平均±ＳＥＭ、一群当たりｎ＝６匹のマウスを表す。 図１９のＡ〜Ｂは、卵巣切除マウスの子宮におけるＶＥＧＦタンパク質レベルに対する長期的なタモキシフェン処理の副作用を、ｒＰＥＤＦを用いた処理が減少させることを示す図である。卵巣切除マウスに、タモキシフェン投与、またはタモキシフェンとｒＰＥＤＦとを組合せた投与を、１カ月間にわたり週に５日実施した。図１９のＡは、ＶＥＧＦタンパク質レベルを示す代表的なウェスタンブロットの写真である。図１９のＢは、図１９のＡに示したウェスタンブロット分析結果の濃度測定分析により評価したＶＥＧＦタンパク質レベルを示す棒グラフである。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析し、負荷対照であるアクチンに対して正規化した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照（タモキシフェンのみ）との比を表す。一群当たり、ｎ＝６匹のマウス。（^＊はＰ＜０．０５である）−対照値と有意に異なる。 対照マウス、長期的にタモキシフェンで処理したマウス、および長期的にタモキシフェン＋ｒＰＥＤＦで処理したマウスの子宮におけるＣＤ３４染色（赤色）を示す代表的な免疫組織化学顕微鏡写真である。下側パネルは、白色で印を付けた選択領域の拡大図を示す。対抗染色を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３２２４２（青色）を用いて行った。 図２１のＡ〜Ｂは、卵巣切除マウスの子宮における、ホルモン受容体であるエストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現に対する、ｒＰＥＤＦを含むおよび含まない亜急性タモキシフェン処理の作用を示す図である。図２１のＡは、ＥＲα（配列番号２０〜２１）、ＥＲβ（配列番号２２〜２３）およびＰＲ（配列番号２４〜２５）に対する特異的プライマーを用いたｑＰＣＲ分析により測定し、ＨＰＲＴ（配列番号６〜７）で較正したＥＲα、ＥＲβおよびＰＲのｍＲＮＡレベルを示す。図２１のＢは、ウェスタンブロットにより評価したＥＲαタンパク質レベルの濃度測定分析を示す。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析し、負荷対照であるアクチンに対して正規化した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照との比を表す。一群当たり、ｎ＝４匹のマウス。 図２２のＡ〜Ｂは、卵巣切除マウスの子宮における、ホルモン受容体であるエストロゲン受容体α（ＥＲα）、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の発現に対する、ｒＰＥＤＦを含むおよび含まない長期的なタモキシフェン処理の作用を示す図である。図２２のＡは、ＥＲα（配列番号２０〜２１）、ＥＲβ（配列番号２２〜２３）およびＰＲ（配列番号２４〜２５）に対する特異的なプライマーを用いたｑＰＣＲ分析により測定し、ＨＰＲＴ（配列番号２４〜２５）で較正したＥＲα、ＥＲβおよびＰＲのｍＲＮＡレベルを示す。図２２のＢは、ウェスタンブロットにより評価したＥＲαタンパク質レベルの濃度測定分析を示す。バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて分析し、負荷対照であるアクチンに対して正規化した。バーは、平均±ＳＥＭとしてプロットした、各処理と対照との比を表す。一群当たり、ｎ＝６匹のマウス。（^＊はＰ＜０．０５であり、^＊＊はＰ＜０．０１である）−対照値と有意に異なる。

本発明は、いくつかの実施形態において、薬剤誘導性性腺または子宮毒性を治療および防止するためのＰＥＤＦの使用方法に関する。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明が、その適用において、以下の説明に記載されるか、または実施例によって例示される詳細に限定されないことを理解するべきである。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は、さまざまな方法で実践若しくは遂行されることが可能である。

多くのがん型のための治療は、性腺毒性または子宮毒性を部分的または決定的に誘導する可能性がある化学療法および放射線療法などの細胞傷害性の治療を含む。

ＰＥＤＦは、身体中で遍在的に発現される、神経栄養特性、抗血管形成特性、抗炎症特性および抗酸化特性を持つ多機能因子である。生殖系における顕著な発現にもかかわらず、卵巣および子宮におけるＰＥＤＦ機能に関するデータは限られている。これまでの研究では、ＰＥＤＦの直接的な抗腫瘍形成効果および抗血管形成効果のため、腫瘍の治療におけるＰＥＤＦの使用が示唆されてきた。しかしながら、化学療法および放射線療法の破壊的作用から性腺を保護する際のＰＥＤＦの役割については、開示されたことがない。

本発明の実施化にあたり、本発明者らはここで、ＰＥＤＦの投与が化学療法による治療などの毒性薬剤により誘導される性腺または子宮毒性を防止可能であることを明らかにし、薬剤誘導性性腺毒性およびタモキシフェン誘導性子宮毒性の治療または防止におけるその使用を明らかにする。

本明細書で以下に例示されるように（実施例１および図１のＡ〜Ｂおよび図２のＡ〜Ｂ）、本発明者らは、化学療法剤ＤＸＲがＤＸＲ処理マウスの卵巣におけるＰＥＤＦ ｍＲＮＡの発現を減少させ、ＤＸＲ処理後のｒＰＥＤＦ投与によってＤＸＲ処理マウスにおいて排卵される卵母細胞の数が有意に改善することを見出した。さらに、本発明者らは、酸化ストレスの誘導（例えば、Ｈ_２Ｏ_２）がＬＨ−１５ラット顆粒膜細胞におけるＰＥＤＦ ｍＲＮＡ発現に対して負の用量依存的作用があり、ｒＰＥＤＦの投与によって、一般的にＨ_２Ｏ_２と関連する酸化ストレス、すなわち、酸化ストレス誘導性アポトーシスの速度が有意に減弱し、アポトーシス促進タンパク質ＢＡＸの酸化ストレス誘導性発現の上昇が低下し、ＳＯＤ−１レベルおよびＧＰＸ−１レベルが増加することを見出した（実施例２ならびに図４のＡ〜Ｂ、図５のＡ〜Ｃおよび図６のＡ〜Ｂ）。実施例３ならびに図６のＡ〜Ｃおよび図７のＡ〜Ｂにさらに示されるように、本発明者らは、顆粒膜細胞、莢膜細胞および卵母細胞がＰＥＤＦ生存促進受容体であるＰＮＰＬＡ２を発現し、ｒＰＥＤＦによって一度刺激されると、ＬＨ−１５顆粒膜細胞が生存促進細胞シグナル伝達の活性化の指標となるＡＫＴのリン酸化を示すことを証明した。

結果として、これらの知見は、ＰＥＤＦの投与がＤＸＲなどの化学療法による治療により誘導される性腺毒性を防止できることを示しており、薬剤誘導性性腺毒性の治療または防止におけるその使用を示唆する。

本明細書の以下でさらに例示されるように（実施例４および図８、図９のＡ〜Ｂ、図１５、図１６のＡ〜Ｃ、図１８、図１９のＡ〜Ｂ、図２０）、本発明者らは、亜急性および長期的タモキシフェン処理が両方とも、卵巣切除マウスの子宮において、子宮重量を増加させ、ＶＥＧＦタンパク質レベルを上方調節し、ＰＥＤＦタンパク質レベルを減少させ、ＶＥＧＦとＰＥＤＦタンパク質レベルとの比を増大させることを示した。本発明者らは、タモキシフェンとｒＰＥＤＦとの組合せ投与が、モキシフェンにより誘導される、子宮重量およびＶＥＧＦ発現に対する副作用を有意に減弱させることを示した。さらに、実施例４ならびに図１０、図１３のＡ〜Ｂ、図１４のＡ〜Ｂ、図１７、図２１のＡ〜Ｂおよび図２２のＡ〜Ｂに示されるように、タモキシフェン処理がＰＥＤＦ生存促進受容体であるＰＮＰＬＡ２の発現を上方調節し、タモキシフェンとｒＰＥＤＦとの組合せ処理がアポトーシス促進シグナル伝達分子、ＪＮＫのリン酸化の増加、生存促進シグナル伝達分子、ＡＫＴのリン酸化の減少およびＥＲα子宮発現の特異的減少を誘導した。

結果として、これらの知見は、ＰＥＤＦの投与がタモキシフェン処理によって誘導される子宮に対する副作用を防止可能であることを示し、タモキシフェン誘導性子宮毒性の治療または防止におけるその使用を示唆する。

かくして、本発明の態様によれば、薬剤により誘導される性腺毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、前記対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止することを含む、方法が提供される。

薬剤により誘導される性腺毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、
（ａ）前記対象における性腺機能を決定し、そして
（ｂ）前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与して、前記対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止する
ことを含む、方法が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止するための、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が提供される。

本明細書で使用する、「色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）」は、セルピンＦ１、ＥＰＣ−１、細胞増殖誘導遺伝子３５タンパク質およびＰＩＧ３５としても知られ、ｒＰＥＤＦと互換的に言及され、ポリヌクレオチドおよびその発現産物、例えば、ＳＥＲＰＩＮＦ１遺伝子のタンパク質を指す。特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦタンパク質とは、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿００２６１５．４（配列番号１）、Ｍ７６９７９（配列番号２６）またはＮＰ＿００２６０６．３（配列番号２７）で提供されるものなどのヒトタンパク質を指す。本発明におけるＰＥＤＦは、性腺毒性の防止、子宮毒性の防止、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害、生存促進、抗血管形成、抗炎症、抗腫瘍形成および／または抗酸化シグナルの誘導の少なくとも１つの機能を有し、いくつかの実施形態においては、すべての機能を有する。本発明の使用のためのＰＥＤＦの定量方法は、当業界で周知である（そのいくつかは、実施例に記載されており、例えば、タモキシフェン処理した動物の子宮重量に対する効果、タモキシフェン処理した動物のＶＥＧＦ子宮発現に対する効果、タモキシフェン処理した動物のＥＲα子宮発現に対する効果、ＤＸＲ処理した動物の排卵された卵母細胞数に対する効果、アポトーシスおよび顆粒膜細胞のアポトーシス関連タンパク質の発現に対する酸化ストレスの効果などである）。

ＰＥＤＦという用語は、修飾および非修飾ＰＥＤＦを指す。特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、リン酸化ＰＥＤＦである。ＰＥＤＦは、３つの異なる部位でリン酸化され、そのうちＳｅｒ２４およびＳｅｒ１１４はカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）により、Ｓｅｒ２２７はタンパク質キナーゼ（ＰＫＡ）によりリン酸化される。具体的には、三リン酸化ＰＥＤＦの使用が企図される。特許文献６は、ＣＫ２およびＰＫＡを用いたＰＥＤＦのリン酸化を教示しており、本明細書に完全に組み込まれる。

ＰＥＤＦという用語はまた、ＰＥＤＦペプチド断片も指す。本発明はまた、例えば、それぞれ、全体が参照により本明細書に組み込まれる、特許文献７、特許文献８、特許文献９および特許文献１０に開示されたものなどの、全長ＰＥＤＦの生物活性を保持するＰＥＤＦペプチドの使用、すなわち、薬剤により誘導される性腺毒性の治療もしくは防止またはタモキシフェン誘導性子宮毒性の治療もしくは防止のための使用も企図する。

ＰＥＤＦは、非特許文献１９に記載のように精製することができる。あるいは、ＰＥＤＦは、Ｂｉｏｖｅｎｄｏｒ Ｉｎｃ．から市販されている。

本明細書で使用する、「ＰＥＤＦ受容体」、「ＰＥＤＦＲ」または「ＰＥＤＦ−Ｒ」とは、細胞表面分子であって、ＰＥＤＦと結合し、ＦａｓＬ；ＣＤ９５、Ｒａｓ；Ｒａｆ；Ｍｅｋｋ１；Ｍｅｋ；Ｅｒｋ；ＪＮＫ；ＩＰ３；Ａｋｔ；ＩＫＫ；ＮＦ−カッパ−Ｂ；ＰＬＡ２；およびＰＰＡＲ−γなどの経路を介するシグナル伝達を開始するものを指す。

特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦ受容体は、ＰＥＤＦ−Ｒ^Ｎと呼ばれる８０ｋＤａのＰＥＤＦ受容体、即ちＰＮＰＬＡ２であり、ＰＥＤＦ神経保護機能や、生存促進機能に関与する。

さらなる、または代替的な実施形態によれば、ＰＥＤＦ受容体は、ＰＥＤＦ−Ｒ^Ａと呼ばれる、６０ｋＤａのＰＥＤＦ受容体、即ちラミニン受容体であり、ＰＥＤＦアポトーシス促進活性や、抗血管形成活性に関与する。

特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、ＰＥＤＦ−Ｒ^ＮまたはＰＮＰＬＡ２と呼ばれる８０ｋＤａのＰＥＤＦ受容体を介してその機能を発揮する。

本明細書で使用する用語「薬剤誘導性性腺毒性」とは、本明細書に後述する外因性因子の摂取により誘導される、卵巣または精巣を含む生殖器に対する一時的または永続的な損傷を指す。特定の実施形態によれば、生殖器に対する損傷は、治療された対象と同じ年齢の対象における、国立健康機関等の基準において正常とされる性腺機能と比較した、性腺機能の低下をもたらす。特定の実施形態によれば、低下は、治療前と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％またはさらにはそれより高い、すなわち、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を超える。性腺機能の低下を、以下でさらに詳述されるように、ホルモン評価、超音波評価および／または精液分析などの当業界で公知の任意の方法によって評価することができるが、これらに限定されるものではない。

特定の実施形態によれば、性腺毒性は、性腺の生殖関連機能に影響を及ぼす。

さらなる、または代替的な実施形態によれば、性腺毒性は、性腺における細胞死および／または細胞機能の損傷を伴う。

さらなる、または代替的な実施形態によれば、性腺毒性は、ホルモン生成（例えば、エストロゲン、プロゲステロン、およびテストステロン）の減少を伴う。

性腺毒性の限定されるものではない兆候としては、不妊症、性腺機能低下症、排卵の減少、早発卵巣不全、早発閉経、上皮（中皮）および管状過形成、卵母細胞破壊、顆粒膜細胞のアポトーシス、卵胞閉鎖にいたる卵胞発達の停止、卵胞萎縮および間質萎縮、過剰排卵、卵胞黄体化、卵胞嚢胞、黄体の縮小／欠損、黄体の増大／持続、黄体の空胞変性、セルトリ型管状過形成、間質腺肥大／過形成萎縮、発情周期のかく乱、卵巣間膜平滑筋過形成、精子形成の減少、精子生産の減少または精巣からのテストステロン分泌の減少、管系を通る精子の輸送の阻害、精子の質の悪化、生殖細胞の変性、崩壊、剥離および／または枯渇、精巣における体液分泌の減少および管の収縮、ならびにライディッヒ細胞の過形成が挙げられる。

特定の実施形態によれば、性腺毒性は、性腺機能低下症、精子形成の減少、排卵の減少、早発卵巣不全および不妊症からなる群より選択される。

特定の実施形態によれば、性腺毒性は、排卵の減少を含む。

性腺機能を決定する方法は、当業界で周知であり、例えば、非特許文献２０、非特許文献２１および非特許文献２２に記載されている。性腺機能は、生物試料もしくは動物モデルにおいて決定するか、または必要とする対象において直接決定することができる。

特定の実施形態によれば、前記方法は、対象における性腺機能の決定をさらに含む。性腺機能の決定は、薬剤を用いる治療の前、治療中および／または治療後に行うことができる。

かくして、特定の実施形態によれば、性腺機能の決定は、ｉｎ ｖｉｖｏで（対象または動物モデル内で）行う。

他の特定の実施形態によれば、性腺機能の決定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで（例えば、対象に由来する生物試料で）行う。

特定の実施形態によれば、生物試料は、血液試料（例えば、血清、血漿）を含む。

特定の実施形態によれば、生物試料は、卵胞液を含む。

別の特定の実施形態によれば、生物試料は、精液試料を含む。

性腺機能を決定するための技術の限定されるものではない例としては、ホルモン評価、生化学的評価、画像検査（例えば、超音波検査）、卵巣生検、精液分析、臨床試験、ならびに病理学的および組織病理学的分析が挙げられる。

特定の実施形態によれば、性腺機能パラメータは、ホルモン評価、超音波評価および精子分析からなる群より選択される。

ホルモン評価の方法は、当業界で周知であり、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ＦＳＨ：ＬＨ比、プロゲステロン、エストロゲン、エストラジオール（Ｅ_２）、Ｂ−ｈＣＧ、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）、ＳＨＢＧ、１７−ヒドロキシプロゲステロン、遊離および総テストステロン、ＤＨＥＡ−Ｓ、アンドロステンジオン、３ａ，１７（３−アンドロスタンジオールグルクロニド）、コルチゾール、プロラクチン、ならびに／あるいはインヒビンＡおよび／またはインヒビンＢのレベルの測定、性腺刺激ホルモン類似体刺激検査、クロミフェンチャレンジ検査（ＣＣＴ、ベースラインＦＳＨ測定の変形）、ＧｎＲＨアゴニスト刺激検査（ＧＡＳＴ）、外来ＦＳＨ卵巣予備能力検査（ＥＦＯＲＴ）を含む。ホルモン評価は、典型的には、血液試料で行われる。

特定の実施形態によれば、ホルモン評価は、ＬＨ、ＦＳＨ、エストラジオール、ＡＭＨ、テストステロン、ＳＨＢＧおよびプロゲステロンからなる群より選択される。

本明細書で使用する用語「超音波評価」とは、生殖器の超音波画像検査を指し、胞状卵胞計数、および胞状卵胞または小濾胞、卵巣体積、波形および拍動指数を含む卵巣間質収縮期最大流速、卵胞血管分布、子宮および子宮内膜の形態および厚さの測定が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

特定の実施形態によれば、超音波評価は、胞状卵胞計数である。

本明細書で使用する、互換使用可能な用語「精子分析」および「精液分析」は、精液試料中の精子の濃度、形態および／または運動性を決定することを指す。

特定の実施形態によれば、性腺機能を決定するために、少なくとも１つの性腺機能パラメータが用いられる。他の実施形態によれば、上記のパラメータのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つが、性腺機能を決定するために用いられる。特定の実施形態によれば、用いられる性腺機能パラメータは、ホルモン評価と超音波評価、またはホルモン評価と精子分析を含む。

本明細書で使用する用語「薬剤」とは、疾患（例えば、がん）の治療のために用いられ、性腺に対する毒性の副作用を有する物質を指す。そのような薬剤の限定されるものではない例としては、化学療法、放射線療法、光線療法および光線力学療法、外科手術、栄養療法、切除療法、放射線療法と化学療法の組合せ、小線源療法（ｂｒａｃｈｉｏｔｈｅｒａｐｙ）、陽子線療法、免疫療法、細胞療法ならびに光子線放射線外科療法が挙げられる。

特定の実施形態によれば、薬剤は、酸化ストレスを誘導する。

本明細書で使用する用語「酸化ストレス」とは、性腺中の反応性酸素種（ＲＯＳ）などの酸化促進物質と、防御抗酸化物質との不均衡を指し、ＲＯＳの蓄積、ＤＮＡ損傷、脂質過酸化、タンパク質の酸化、アポトーシス促進タンパク質の活性化および／または細胞死をもたらす。酸化ストレスを評価する方法は、当業界で周知であり、例えば、非特許文献２３および非特許文献２４に記載されている。基本的には、これらの方法を、スクリーニングアッセイ、最終産物アッセイ、特異的酵素の活性および酸化ストレスの様々なマーカーを用いるメタボロミクスに分けることができ、化学発光法、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比色アッセイ、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析、ＨＰＬＣ、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）およびガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）が挙げられ、これらのいくつかは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ａｂｃａｍ社、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｌａｂｓ社などの市販するキットを用いて試験することができる。

特定の酸化ストレスアッセイの限定されるものではない例としては、フリーラジカルと反応するルミノール（５−アミノ−２，３ジヒドロ−１，４フタラジンジオン）などのプローブを用いて、包括的なＲＯＳを測定する化学発光アッセイ；ＲＯＳの存在下で還元され、青黒い化合物、即ちホルマザンを形成する電子受容体であるニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）を用いることによって、ＲＯＳを生成する細胞を検出する組織化学染色；特異的抗体（例えば、酸化的ＤＮＡ付加物である８−ヒドロキシ２−デオキシグアノシンに対する抗体）を用いる免疫組織化学またはウェスタンブロット分析；酸化反応の蛍光最終産物（例えば、ヒドロエチジンとＯ２−との反応により生成される、赤色の蛍光を発するエチジウムブロマイド）を用いることによりＲＯＳの存在を検出する落射蛍光顕微鏡；個々の細胞内ＲＯＳラジカルを検出するフローサイトメトリー分析（例えば、２，７ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）のＲＯＳによる酸化は、細胞を高度に蛍光性にするため、形成された過酸化水素の細胞内レベルを測定するのに用いることができ、またヒドロエチジン（ＨＥ）はＯ２−により酸化されて、赤色の蛍光を放出するエチジウムブロマイドになるため、スーパーオキシドの細胞内レベルの測定のために用いることができる）；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、チオレドキシンリダクターゼ（ＴｒｘＲ）、キサンチンオキシダーゼ、ＮＯＳ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）などの特定の酵素活性の検出；２，２０−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）のＡＢＴＳ＋への酸化を阻害する試料中の抗酸化物質の作用に基づく、メトミオグロビンを用いた総抗酸化物質の評価；亜硝酸塩および硝酸塩などのＮＯの代謝物を決定するためのＧｒｉｅｓｓ反応または化学発光アッセイ；チオバルビツール酸反応物質（ＴＢＡＲＳ）などを用いる脂質過酸化物の測定；マーカーとしてタンパク質カルボニル含量などを用いるタンパク質酸化の測定；脂質ヒドロペルオキシドの測定；総（遊離およびエステル化）８−Ｆ２−イソプロスタン、イソプロスタンｉＰＦ_２α−ＶＩ、８−ヒドロキシ−２−デオキシグアノシン（８−ＯＨ−ｄＧ）、脂溶性抗酸化物質（ビタミンＡ、ビタミンＥ、ベータ−カロテン、およびリコペン）の測定；ピルビン酸、Ｈ_２Ｏ_２、またはアスコルビン酸、グルタチオン尿酸、ビタミン−ＥおよびＣｏＱ−１０などのフリーラジカルスカベンジャー含量の定量；ならびに細胞の生存率および細胞死の評価（例えば、黄色の塩であるＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ 米国、ミズーリ州、セントルイス）を青紫の不溶性ホルマザン沈降物に還元する生細胞を選択的に検出する機能に基づくＭＴＴ試験、ＴＵＮＥＬアッセイ（例えば、Ｒｏｃｈｅ、ドイツ連邦共和国、マンハイム）およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖアッセイ［例えば、ＡｐｏＡｌｅｒｔ（登録商標）Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）］を用いる方法）が挙げられる。

特定の実施形態によれば、薬剤は、化学療法および放射線療法からなる群より選択される。

本明細書で使用する用語「化学療法」とは、がんなどの疾患の治療において用いられる細胞傷害薬または抗新生物薬を指す。

化学療法剤の限定されるものではない例としては、アクビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドリアマイシン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；メシル酸ビスナフィド；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチメル；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシウレア；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソール酢酸塩；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸塩；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；タキソール；テコガランナトリウム；テガフル；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トポテカン塩酸塩；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロン酸塩；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピシン硫酸塩；ビングリシナート硫酸塩；ビンロイロシン硫酸塩；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩が挙げられる。さらなる抗新生物剤としては、非特許文献２５に開示されたものが挙げられる。

化学療法承認薬の限定されるものではない例としては、アバレリックス、アルデスロイキン、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、ベバクジマブ、ベキサロテン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カルステロン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セレコキシブ、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、アクチノマイシンＤ、ダルベポエチンアルファ、ダルベポエチンアルファ、ダウノルビシンリポソーマル、ダウノルビシン、デシタビン、デニロイキンジフチトックス、デキスラゾキサン、デキスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エリオットＢ溶液、エピルビシン、エポエチンアルファ、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル５−ＦＵ、フルベストラント、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガミシン、ゴセレリン酢酸塩、ヒストレリン酢酸塩、ヒドロキシウレア、イブリツモマブチウキセタン、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、イリノテカン、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド酢酸塩、レバミソール、ロムスチン、ＣＣＮＵ、メクロレタミン、窒素マスタード、メゲストロール酢酸塩、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メルカプトプリン６−ＭＰ、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトタン、ミトキサントロン、フェンプロピオン酸ナンドロロン、ネララビン、ノフェツモマブ、オプレルベキン、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パリフェルミン、パミドロナート、ペガデマーゼ、ペガスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペメトレキセド二ナトリウム、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ミトラマイシン、ポルフィマーナトリウム、プロカルバジン、キナクリン、ラスブリカーゼ、リツキシマブ、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、マレイン酸スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシドＶＭ−２６、テストラクトン、チオグアニン６−ＴＧ、チオテパ、チオテパ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノインＡＴＲＡ、ウラシルマスタード、バルルビシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ゾレドロナートおよびゾレドロン酸が挙げられる。

特定の実施形態によれば、化学療法は、メクロレタミン、プロカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、ブスルファン、メルファラン、クロラムブシル、クロルメチン、ドキソルビシン、シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択される。

特定の実施形態によれば、化学療法は、アルキル化剤、プロカルバジン、白金類似体およびアントラサイクリン系抗生物質からなる群より選択される。

特定の実施形態によれば、化学療法は、アントラサイクリン系抗生物質、アルキル化剤、白金配位錯体、エピポドフィロトキシンおよびカンプトテシンからなる群より選択される。

特定の実施形態によれば、化学療法はドキソルビシンである。

本明細書で使用する用語「放射線療法」とは、疾患（例えば、がん）の治療などにおける、高エネルギー放射線への曝露を指す。放射線の限定されるものではない例としては、Ｘ線、ガンマ線および荷電粒子が挙げられる。放射線への曝露は、外部ビーム、内部放射線療法、または放射性物質を用いる全身放射線療法によるものであってもよい。本発明の特定の実施形態によれば、放射線療法は、全身照射（ＴＢＩ）または性腺が骨盤部照射などの照射野に近いか、もしくはその中にある局所放射線照射を含む。

かくして、特定の実施形態によれば、放射線療法は、全身照射（ＴＢＩ）を含む。

別の特定の実施形態によれば、放射線療法は、骨盤部照射を含む。

本発明のこの態様によれば、本明細書で使用する、「それを必要とする対象」とは、性腺毒性を誘導する薬剤で治療された、または治療されることが予想される哺乳動物の雄または雌の対象（例えば、ヒト）を指す。対象は、典型的には生殖年齢にあるが、ＰＥＤＦは薬剤により性腺に対して誘導される有害作用を防止するため、それを生殖年齢よりも若い雄または雌の対象における治療または防止において用いることもできる。獣医学的使用も企図される。

特定の実施形態によれば、対象は雌である。

他の特定の実施形態によれば、対象は雄である。

特定の実施形態によれば、対象は生殖年齢にある。

本明細書で使用する用語「生殖年齢」とは、対象が自然に、または介入により妊娠できる有性生殖を行うことができる年齢を指す。

特定の実施形態によれば、雌は、卵母細胞回収を受けていない。

他の特定の実施形態によれば、雄は、精液採取を受けていない。

特定の実施形態によれば、対象はがんと診断されている。

がんは、任意の原発性の固形がんもしくは非固形がんおよび／または転移がんであってもよい。がんの限定されるものではない例としては、消化管の腫瘍（結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌腫、結腸直腸がん、結腸直腸腺腫、遺伝性非腺腫性１型、遺伝性非腺腫性２型、遺伝性非腺腫性３型、遺伝性非腺腫性６型；結腸直腸がん、遺伝性非腺腫性７型、小腸および／または大腸癌、食道癌腫、食道がんを伴う胼胝症、胃癌、膵臓癌、膵臓内分泌腫瘍）、子宮内膜癌腫、隆起性皮膚線維肉腫、胆嚢癌、胆管腫瘍、前立腺がん、前立腺腺癌、腎臓がん（例えば、ウィルムス腫瘍２型または１型）、肝臓がん（例えば、肝芽腫、肝細胞癌腫、肝細胞がん）、膀胱がん、胎児性横紋筋肉腫、胚細胞腫瘍、絨毛性腫瘍、精巣生殖細胞腫瘍、卵巣、子宮、上皮性卵巣の未熟型奇形腫、仙尾骨腫瘍、絨毛癌腫、胎盤部位の絨毛性腫瘍、上皮成人腫瘍、卵巣癌腫、漿液性卵巣がん、卵巣性索腫瘍、頸部癌、子宮頸癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌、鼻咽頭癌、乳癌腫（例えば、乳管がん、浸潤性乳管内がん、散発性の乳がん、乳がん感受性、４型乳がん、乳がん−１および乳がん−３、乳−卵巣がん）、扁平上皮癌腫（例えば、頭頸部における）、神経原性腫瘍、星状細胞腫、神経節芽細胞腫、神経芽細胞腫、リンパ腫（例えば、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、胸腺リンパ腫）、神経膠腫、腺癌腫、副腎腫瘍、遺伝性副腎皮質癌、脳の悪性腫瘍（腫瘍）、他の様々な癌腫（例えば、気管支大細胞癌、管癌、エーリッヒ・レトレ（Ｅｈｒｌｉｃｈ−Ｌｅｔｔｒｅ）腹水癌、類表皮癌、大細胞癌、ルイス肺癌、髄様癌、粘膜表皮癌、燕麦細胞癌、小細胞癌、紡錘細胞癌、有棘細胞癌、移行細胞癌、未分化癌、癌肉腫、絨毛癌、嚢胞腺癌）、上衣芽細胞腫、上皮腫、赤白血病（例えば、フレンド赤白血病、リンパ芽球の赤白血病）、線維肉腫、巨細胞腫瘍、グリア腫瘍、グリア芽腫（例えば、多形成グリア芽腫、星状細胞腫）、神経膠腫ヘパトーマ、ヘテロハイブリドーマ、ヘテロミエローマ、組織球腫、ハイブリドーマ（例えば、Ｂ細胞ハイブリドーマ）、副腎腫、インスリノーマ、膵島腫瘍、角化症、平滑筋芽細胞腫、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性プレＢ細胞性白血病、急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病、急性巨核芽球性白血病、単球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄細胞性白血病、好酸球増多を伴う急性骨髄細胞性白血病、Ｂ細胞性白血病、好塩基球性白血病、慢性骨髄細胞性白血病、慢性白血病、Ｂ細胞性白血病、好酸球性白血病、フレンド白血病、顆粒球性または骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、リンパ球性白血病、巨核芽球性白血病、単球性白血病、単球マクロファージ白血病、骨髄芽球性、骨髄性白血病、骨髄性単球性白血病、血漿細胞性白血病、プレ−Ｂ細胞性白血病、前骨髄球性白血病、亜急性白血病、Ｔ細胞性白血病、リンパ系腫瘍、骨髄細胞悪性腫瘍に対する素因、急性非リンパ球性白血病）、リンパ肉腫、メラノーマ、乳腺腫瘍、肥満細胞腫、髄芽細胞腫、中皮腫、転移性腫瘍、単球性腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、腎芽細胞腫、神経組織グリア腫瘍、神経組織ニューロン腫瘍、神経線維腫症、神経芽細胞腫、乏突起膠腫、骨軟骨腫、オステオミエローマ（ｏｓｔｅｏｍｙｅｌｏｍａ）、骨肉腫（例えば、ユーイング骨肉腫）、乳頭腫、移行細胞腫、褐色細胞腫、下垂体部腫瘍（浸潤性）、形質細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、組織球性細胞肉腫、イエンセン肉腫、骨原性肉腫、細網細胞肉腫）、神経鞘腫、皮下腫瘍、（例えば多能性の）奇形癌、奇形腫、精巣腫瘍、胸腺腫および毛包上皮腫、胃がん、線維肉腫、多形成グリア芽腫；多発性グロムス腫瘍、リ・フラウメニ症候群、脂肪肉腫、リンチ症候群ＩＩ型、男性生殖細胞腫瘍、肥満細胞性白血病、甲状腺髄様がん、多発性髄膜腫、内分泌新生物粘液肉腫、家族性非クロム親和性傍神経節腫、石灰化上皮腫、乳頭状、家族性および散発性のラブドイド素因症候群、家族性のラブドイド腫瘍、軟組織肉腫、ならびにグリア芽腫を伴うターコット症候群が挙げられる。

特定の実施形態によれば、がんは精巣がん、乳がん、卵巣がん、リンパ腫および白血病からなる群より選択される。

特定の実施形態によれば、がんは骨肉腫ではない。

他の特定の実施形態によれば、がんは前立腺がんではない。

他の特定の実施形態によれば、がんは結腸腺癌ではない。

記載のように、本発明者らは、ＰＥＤＦを用いて、タモキシフェンを用いる治療によって誘導される子宮損傷を保護し、さらには軽減さえもすることができることも明らかにした。

かくして、本発明の別の態様によれば、がんの治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、前記対象に、治療有効量のタモキシフェンおよび治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与して、前記がんを治療することを含む、方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象におけるがんを治療するための、タモキシフェンおよび色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が提供される。

本発明のさらに別の態様によれば、タモキシフェン誘導性子宮毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、前記対象においてタモキシフェン誘導性子宮毒性を治療または防止することを含む、方法が提供される。

本発明の別の態様によれば、対象においてタモキシフェン誘導性子宮毒性を治療または防止するための、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）が提供される。

本明細書で使用する用語「タモキシフェン誘導性子宮毒性」とは、非ステロイド性抗エストロゲン剤であるタモキシフェンの外因性の投与により誘導される、子宮に対する一時的または永続的な損傷を指す。典型的には、タモキシフェンを用いた女性への治療により、子宮内膜増殖、子宮内膜過形成、ポリープ形成、および肉腫や浸潤性癌腫などの子宮内膜がんや子宮がんがおこりえる。

タモキシフェンにより誘導される子宮毒性は、当業界で公知の任意の方法によって評価することができ、例えばさらに上述したような、子宮が塊を含有するかどうか、または子宮内膜が通常より厚いかどうかを見るための超音波（例えば、骨盤または経膣超音波）、ソノヒステログラフィー、子宮内膜生検、子宮鏡検査、子宮内膜掻爬術（Ｄ＆Ｃ）、ＭＲＩ、および高レベルの血中ＣＡ１２５などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

特定の実施形態によれば、前記方法は、前記対象における子宮毒性を決定することをさらに含む。子宮毒性の決定は、タモキシフェンを用いる治療中および／または治療後に行うことができる。

かくして、特定の実施形態によれば、子宮毒性の決定は、ｉｎ ｖｉｖｏで（対象または動物モデル内で）行われる。

他の特定の実施形態によれば、子宮毒性の決定は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで（例えば、対象または動物モデルに由来する生物試料で）行われる。

特定の実施形態によれば、生物試料は、子宮内膜生検を含む。

本発明者らは、タモキシフェンを用いる治療が、ＶＥＧＦタンパク質レベルの増加、ＰＥＤＦタンパク質レベルの低下およびＶＥＧＦ／ＰＥＤＦタンパク質レベル比の増大をもたらすことを発見した。

かくして、本発明の別の態様によれば、対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性を診断するための方法であって、タモキシフェンによる治療後の対象の生物試料中のＰＥＤＦレベルを決定することを含み、前記レベルが所定閾値を下回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする方法が提供される。

特定の実施形態によれば、タモキシフェン誘導性子宮毒性を診断するための方法は、生物試料中のＶＥＧＦのレベルを決定することをさらに含み、前記レベルが所定閾値を上回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする。

別の特定の実施形態によれば、ＶＥＧＦレベルとＰＥＤＦとの比が、前記生物試料に対する所定の閾値を上回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする。

「血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）」とは、ＶＥＧＦ−Ａ、血管透過因子、ＶＰＦ、およびＭＶＣＤ１としても知られており、ＶＥＧＦＡ遺伝子のポリヌクレオチドおよび発現産物、例えば、ポリペプチドを指す。特定の実施形態によれば、ＶＥＧＦタンパク質とはヒトタンパク質を指し、以下のＧｅｎＢａｎｋ番号で提供されるものなどである。ＮＰ＿００１０２０５３７（配列番号２９）、ＮＰ＿００１０２０５３８（配列番号３０）、ＮＰ＿００１０２０５３９（配列番号３１）、ＮＰ＿００１０２０５４０（配列番号３２）、ＮＰ＿００１０２０５４１（配列番号３３）、ＮＰ＿００１０２８９２８（配列番号３４）、ＮＰ＿００１１６５０９３（配列番号３５）、ＮＰ＿００１１６５０９４（配列番号３６）、ＮＰ＿００１１６５０９５（配列番号３７）、ＮＰ＿００１１６５０９６（配列番号３８）、ＮＰ＿００１１６５０９７（配列番号３９）、ＮＰ＿００１１６５０９８（配列番号４０）、ＮＰ＿００１１６５０９９（配列番号４１）、ＮＰ＿００１１６５１００（配列番号４２）、ＮＰ＿００１１６５１０１（配列番号４３）、ＮＰ＿００１１９１３１３（配列番号４４）、ＮＰ＿００１１９１３１４（配列番号４５）、ＮＰ＿００１２７３９７３（配列番号４６）およびＮＰ＿００３３６７（配列番号４７）。

本明細書で使用する用語「診断すること」とは、（例えば、疾患、障害、病態または症候群であって、例えば、子宮毒性などの）病理の存在または非存在を決定すること、病理または症状を分類すること、病理の重篤度を決定すること、病理の進行をモニタリングすること、病理の転帰および／または回復の見込みを予測すること、ならびに特定の疾患について対象をスクリーニングすることを指す。

本明細書で用いられる語句「ＰＥＤＦのレベル」または「ＶＥＧＦのレベル」とは、生物試料中の、それぞれ、ＰＥＤＦまたはＶＥＧＦの遺伝子発現の程度および／または遺伝子産物の活性を指す。したがって、ＰＥＤＦおよび／またはＶＥＧＦのレベルを、タンパク質検出方法を用いてアミノ酸レベルで決定することができる。

かくして、ＰＥＤＦおよび／またはＶＥＧＦのアミノ酸配列（タンパク質）のレベルを、ＰＥＤＦまたはＶＥＧＦ特異的抗体を用いた、免疫複合体［すなわち、生物試料中に存在するＰＥＤＦ抗原とＰＥＤＦ特異的抗体との間で形成される複合体、または生物試料中に存在するＶＥＧＦ抗原とＶＥＧＦ特異的抗体との間で形成される複合体］の形成により決定することができる。

本発明の免疫複合体は、様々な温度、塩濃度およびｐＨ値で形成させることができ、それらは用いられる方法および生物試料に応じて変化させてもよく、当業者であれば、それぞれの免疫複合体の形成にとって好適な条件を調整することができる。

本発明のこの態様の方法によれば、免疫複合体形成の検出は、タモキシフェン誘導性子宮毒性診断の指標となる。様々な方法を用いて、本発明のＰＥＤＦおよび／またはＶＥＧＦ免疫複合体の形成を検出することができ、当業者であれば、それぞれの免疫複合体にとってどの方法が好適であるか、および／または診断に用いる細胞型を決定することができる。

本発明の免疫複合体において用いられる抗体を、当業界で公知の方法を用いて標識することができる。標識抗体は、一次抗体（すなわち、特異的抗原、例えば、ＰＥＤＦ特異的抗原もしくはＶＥＧＦ特異的抗原に結合する抗体）または一次抗体に結合する二次抗体（例えば、標識ヤギ抗ウサギ抗体、標識マウス抗ヒト抗体）であってもよいことが理解される。抗体を、標識に直接結合するか、または酵素に結合することができる。

生物試料中のＰＥＤＦおよび／またはＶＥＧＦ免疫複合体の検出は、当業界で周知の方法を用いて実施することができ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット分析およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）分析、免疫沈降法（ＩＰ）、免疫組織化学、または分子量に基づく手法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

上記に代えて、または上記に加えて、ＰＥＤＦおよび／またはＶＥＧＦのレベルを、ｍＲＮＡ検出方法を用いて核酸レベルで決定することができる。

ＲＮＡまたはｃＤＮＡの検出方法は、生物試料中の配列番号１に記載したＰＥＤＦ転写物、配列番号２８に記載したＶＥＧＦ転写物（ＮＭ＿００１０２５３６６）などのＰＥＤＦまたはＶＥＧＦ核酸配列、またはその一部にハイブリダイズすることができる単離されたポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプローブ／プライマーなど）を用いて実施することができる。そのようなポリヌクレオチドは、（例えば、１５〜２００塩基の）短鎖ポリヌクレオチド、１００〜２０００塩基の中鎖ポリヌクレオチドおよび２０００塩基を超える長鎖ポリヌクレオチドなどの、任意のサイズであってもよい。

ＰＥＤＦおよび／またはＶＥＧＦのレベルの、アミノ酸または核酸のいずれかのレベルの決定は、がんと診断され、子宮誘導毒性のある薬剤で治療することができる対象から採取した生物試料中で行われる。

本発明により用いられる単離されたポリヌクレオチドプローブは、任意の直接または間接的に標識されたＲＮＡ分子［（例えば１７〜５０塩基の）ＲＮＡオリゴヌクレオチド、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ分子など］、ＤＮＡ分子（例えば１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ分子、ゲノム分子など）および／または本発明のＰＥＤＦもしくはＶＥＧＦ ＲＮＡ転写物に特異的であるそれらの類似体［例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）など］であってもよい。

本発明の教示に従って設計されるオリゴヌクレオチドは、酵素的合成または固相合成などの当業界で公知の任意のオリゴヌクレオチド合成法に従って生成することができる。

本発明において用いる単離されたポリヌクレオチドは、タグまたは標識分子を用いて直接的または間接的に標識することができる。

上記ポリヌクレオチドは、様々なＲＮＡおよびｃＤＮＡ検出法において用いることができ、検出法にはノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）［半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、例えば、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（商標）（Ｒｏｃｈｅ）を用いる定量的ＲＴ−ＰＣＲなど］、ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ染色［例えば、非特許文献２６および非特許文献２７に記載］、およびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析［例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）、カリフォルニア州、サンタクララ）を使用］などが挙げられる。

本明細書で用いられる語句「所定の閾値を下回る」とは、タモキシフェンを用いて治療されていない健康な対象、またはタモキシフェンを用いる治療前の同じ対象から採取した対照試料中のＰＥＤＦの発現に対して、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％とした所定の閾値を超えた、ＰＥＤＦ発現量の低下を指す。そのような対照レベルは、科学文献から取得することができる。

本明細書で用いられる語句「所定の閾値を上回る」とは、タモキシフェンを用いて治療されていない健康な対象、またはタモキシフェンを用いる治療の前の同じ対象から採取した対照試料中のＶＥＧＦの発現に対して、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％またはそれ以上とした所定の閾値を超えた、ＶＥＧＦの発現の増加を指す。そのような対照レベルは、科学文献から取得することができる。

タモキシフェン誘導性子宮毒性の存在を、さらなるアッセイ、例えば、超音波、子宮内膜生検および子宮鏡検査を用いてさらに検証することができることが理解される。

本発明のこの態様によれば、本明細書で使用する用語「それを必要とする対象」とは、タモキシフェンを用いて治療された、または治療されると予想される雌の哺乳動物の対象（例えば、ヒト）を指す。獣医学的使用も企図される。

対象は、生殖年齢にある、生殖年齢未満である、または生殖年齢を超えていてもよい。

特定の実施形態によれば、対象は生殖年齢にある。

他の特定の実施形態によれば、対象は閉経前の期間にある。ヒトにおいて、閉経前の期間とは、多くの女性の場合、４５〜５５歳よりも前の期間である。

さらに他の特定の実施形態によれば、対象は閉経後の期間にある。ヒトにおいては、閉経は、１２カ月にわたり月経期間がない状態と定義され、多くの女性の場合閉経後の期間は４５〜５５歳に始まる。

特定の実施形態によれば、対象はがんと診断されている。

特定の実施形態によれば、がんは乳がんである。

用語「治療する」とは、病理（疾患、障害、もしくは病態）の発達を阻害すること、もしくは停止させること、および／または病理の軽減、寛解、もしくは退縮を引き起こすことを指す。当業者であれば、様々な方法およびアッセイを用いて病理の発達を評価し、同様に、様々な方法およびアッセイを用いて、病理の軽減、寛解または退縮を評価することができることを理解できる。

本明細書で使用する用語「防止する」とは、発症のリスクを有し得るが、発症したとまだ診断されていない対象において、疾患、障害または病態が生じないようにすることを指す。特定の実施形態によれば、方法または使用は、薬剤（すなわち、性腺毒性を誘導する薬剤）または子宮誘導毒性のある薬剤、例えば、タモキシフェンを当該対象に投与することをさらに含む。

特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、薬剤またはタモキシフェンと同時に投与される。

他の特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、薬剤またはタモキシフェンの１回目、２回目または複数回の投与後に投与される。

別の特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、薬剤またはタモキシフェンの投与前に投与される。

特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、性腺中の酸化物質が所定の閾値を上回って蓄積した後に投与される。

本明細書で用いられる語句「所定の閾値を上回って蓄積」とは、好適な対照、例えば、薬剤による処置の前のレベルや、培養の開始時のレベルに対して、例えば、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３０００倍とした所定の閾値を超えた、蓄積量の倍数増加を指す。

特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは、単独で、または他の確立された、もしくは実験的な治療レジメン、例えばＧｎＲＨアゴニスト保護、と組み合わせて、性腺毒性または卵巣毒性を治療または防止するために使用することができる。

ＰＥＤＦと、前記薬剤またはタモキシフェンとは、それ自体で、またはそれぞれもしくは両方を好適な担体もしくは賦形剤と混合した医薬組成物として、対象に投与することができる。

本明細書で使用する、「医薬組成物」とは、本明細書に記載の活性成分を、生理的に好適な担体および賦形剤など他の化学的成分と共に含む製剤を指す。医薬組成物の目的は、生物への化合物の投与を容易にすることである。

ここで、用語「活性成分」とは、生物学的効果を得ることができる、ＰＥＤＦや、薬剤および／またはタモキシフェンを指す。複数の活性成分は、まとめて処方してもよいし、別々に処方してもよい。

以降、互換使用可能な語句「生理的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」とは、生物に対して顕著な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物活性および特性を無効化しない担体または希釈剤を指す。補助剤は、これらの語句に含まれる。

ここで、用語「賦形剤」とは、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

薬物の処方および投与のための技術は、参照により本明細書に組み込まれる非特許文献２８に見出すことができる。

好適な投与経路は、例えば、経口投与、直腸投与、経粘膜投与、特に、経鼻投与、経腸送達または非経口送達、例えば、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射ならびにくも膜下注射、直接脳室内注射、例えば、右心室腔または左心室腔への心臓内注射、共通冠動脈注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射、または眼内注射を含んでもよい。

特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、皮下注射によって行われる。

別の特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦの投与は、静脈内注射によって行われる。

あるいは、全身ではなく局所に、例えば、患者の組織領域（例えば、性腺）への直接の医薬組成物の注入により、医薬組成物を投与することができる。

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、当業界で周知のプロセスにより、例えば、公知の混合、溶解、顆粒化、糖衣錠作製、微粒子化、乳化、カプセル化、捕捉または凍結乾燥などのプロセスによる手段により製造することができる。

かくして、本発明のいくつかの実施形態における使用のための医薬組成物は、賦形剤および補助剤を含む、活性成分の製剤への調製を容易にし、薬学的に使用可能な製剤をもたらす１または複数の生理的に許容される担体を用いて、公知の方法で処方することができる。適切な処方は、選択される投与経路に依存する。

注射用には、医薬組成物の活性成分を、水性溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、または生理学的塩バッファーなどの生理的に適合するバッファーの溶液として処方することができる。経粘膜投与用には、透過させようとする障壁に適した浸透剤が処方に用いられる。そのような浸透剤は、当業界で一般的に知られている。

経口投与用には、活性化合物と当業界で周知の薬学的に許容される担体とを混合することによって、医薬組成物を容易に処方することができる。そのような担体は、医薬組成物を患者による経口摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などへの処方を可能にする。経口使用のための薬理学的製剤は、固体賦形剤を用いて作製可能であり、場合により、得られる混合物を粉砕し、得られた顆粒に必要に応じて好適な補助剤を添加した後、混合物を加工して、錠剤または糖衣錠のコアを得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えば、コーンスターチ、コムギスターチ、コメスターチ、ジャガイモスターチ、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理的に許容されるポリマーである。必要に応じて崩壊剤を添加することができ、その例として、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウム、などが挙げられる。

糖衣錠のコアは、好適なコーティングと共に提供される。この目的のために、濃縮糖溶液を用いることができ、所望により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有してもよい。染料または色素を、識別のため、または活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。

経口的に用いることができる医薬組成物は、ゼラチンから作られた押し込み式カプセルならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤とから作られた軟質密封カプセルを含む。押し込み式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、スターチなどの結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および場合により安定剤、と混合した活性成分を含有してもよい。軟質カプセル中では、活性成分を、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに、安定剤を添加することができる。経口投与のための全ての処方は、選択された投与経路に好適な用量にあるべきである。

口腔内投与用には、組成物は、公知の方法で処方した錠剤またはロゼンジ剤の形態を取ってもよい。

鼻吸入による投与用には、本発明のいくつかの実施形態における使用のための活性成分を、好適な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンもしくは二酸化炭素を使用した加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー形状で、容易に送達される。加圧されたエアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより、用量単位を決定することができる。当該化合物と、ラクトースまたはスターチなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含有する、ディスペンサー中で使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルやカートリッジに処方することができる。

本明細書に記載の医薬組成物を、例えば、ボーラス注射または連続輸注による非経口投与用に処方することができる。注射用の処方は、単位用量形態、例えば、アンプルに封入して、または複数用量容器で、所望により保存剤を添加して提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳液であってもよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含有してもよい。

非経口投与用の医薬組成物は、水溶性形態の活性製剤の水性溶液を含む。さらに、活性成分の懸濁液を、適切な油性または水系の注射用懸濁液として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルなどの合成脂肪酸エステル、トリグリセリドまたはリポソームを含む。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。場合により、懸濁液はまた、好適な安定剤、または活性成分の溶解度を高めて高濃縮溶液の調製を可能にするための薬剤を含有してもよい。

あるいは、活性成分は粉末形態でもよく、使用前に好適なビヒクル、例えば、滅菌済みでパイロジェンを含まない水系溶液を用いて構成することができる。

本発明のいくつかの実施形態の医薬組成物を、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドなどの公知の坐剤基剤を用いて、坐剤または停留浣腸などの直腸用組成物に処方することもできる。

本発明の範囲内での使用に好適な医薬組成物は、意図される目的を達成するのに有効な量の活性成分を含有する組成物を含む。

本明細書で用いられる語句「治療有効量」とは、障害（すなわち、性腺毒性、卵巣毒性もしくはがん）の症状の防止、軽減、もしくは改善、または治療される対象の生存期間を延長するのに有効な活性成分（例えば、ＰＥＤＦ）の量を指す。

特に、本明細書の提供する詳細な開示に照らせば、当業者の能力の範囲内において治療有効量の決定をすることが十分可能である。

本発明の方法において用いられる製剤について、治療有効量または用量は、最初に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイから見積もることができる。例えば、所望の濃度または力価を達成するための用量を、動物モデルにおいて処方することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。

本明細書に記載の活性成分の毒性および治療効能を、（以下の実施例に記載のように）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、培養細胞中で、または実験動物によって、標準的な薬学的手順によって決定することができる。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方する際に用いることができる。用量は、用いられる剤形および利用する投与経路に応じて変化させてもよい。医師はそれぞれ、患者の病態を鑑みて、正確な処方、投与経路および用量を選択することができる（例えば、非特許文献２９を参照されたい）。

投与量および投与間隔を個別に調整して、生物学的効果を誘導するか、または抑制するのに十分な活性成分のレベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を提供することができる。ＭＥＣは、それぞれの製剤について変化するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏのデータから見積もることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個体の特徴および投与経路に依存する。検出アッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。

治療される病態の重症度および応答性、ならびに用いられる薬剤の種類に応じて、投薬は単回または複数回のいずれであってもよく、治療過程は、範囲内の用量、例えば、最小有効用量（ＭＥＤ）、半有効量、最大下用量（ｓｕｂ−ｍａｘｉｍａｌ ｄｏｓｅ）、最大耐量（ＭＴＤ）もしくは最適生物用量（ｏｐｔｉｍｕｍ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｄｏｓｅ）（ＯＢＤ）を用いて、数日から数週間、または治癒が達成されるまで、または疾患状態の縮小が達成されるまで続く。

特定の実施形態によれば、前記薬剤またはタモキシフェンは、ＭＴＤで投与される。

本明細書で使用する用語「最大耐量」または「ＭＴＤ」とは、有効であるが、対象が許容することのできない過剰な毒性を引き起こさない、薬剤の最も高い用量を指す。一般に、ＭＴＤは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、培養細胞中で、または実験動物中で標準的な薬学的手順によって決定することができる。一般に、ＭＴＤは対象特異的であり、血液量と相関する測定値である患者の体表面積をもとに調整される。最終的には、必要な技術と経験を有する者、例えば医師（腫瘍学者等）が、ＭＴＤを決定することができる。

ＰＥＤＦの例示的用量を、以下に提供する：
０．０２〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日、０．１６２〜０．３２ｍｇ／ｋｇ／日、０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ／日、０．１〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日、０．２〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日または０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ／日などである。

特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは０．０２〜０．４ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲内で投与される。

別の特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは０．１６２〜０．３２ｍｇ／ｋｇ／日の用量範囲内で投与される。

投与される組成物の量は、勿論、治療される対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方する医師の判断などに依存する。

本発明の組成物を、必要に応じて、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有してもよい、パックまたはディスペンサー装置、例えば、ＦＤＡ認可済キットとして提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの、金属またはプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置に、投与のための指示書を添付してもよい。パックまたはディスペンサーには、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府機関が規定した形態で容器と関連した通知書が収容されていてもよく、当該通知書は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与が機関によって認可されていることを示す。そのような通知書は、例えば、処方薬について米国食品医薬品局により認可されたラベルまたは認可された製品挿入物のものであってもよい。上述したように、適合する薬学的な担体を用いて処方した本発明の製剤を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、示された病態の治療のためであるというラベルを付けることもできる。

本発明の態様によれば、がんの治療における使用のためのタモキシフェンおよびＰＥＤＦを包装した製品が提供される。

また、前記薬剤と、前記薬剤により誘導される性腺毒性の治療または防止における使用のために同定されたＰＥＤＦとを包装した製品も提供される。前記薬剤またはタモキシフェンと、ＰＥＤＦとを、ｃ−処方（ｃ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）中のそれぞれ個別の容器中に包装することができる。製品に、使用のための指示書を添付してもよい。

本発明の別の態様によれば、卵母細胞の品質を改善するための方法であって、卵母細胞を含む培養細胞中の前記卵母細胞を、有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることによって、ｅｘ ｖｉｖｏで卵母細胞の質を改善することを含む、方法が提供される。

本明細書で使用する用語「卵母細胞」とは、受精していない卵母細胞、受精した卵母細胞（１細胞接合子とも呼ばれる）および胚盤胞段階までの卵割段階を含む、任意の発生段階の胚を指す。

本明細書で使用する、単数形の「卵母細胞」は、１個の卵母細胞および複数の卵母細胞、例えば、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上の卵母細胞を含む。

特定の実施形態によれば、卵母細胞は、卵巣または卵巣断片中に含まれる。

特定の実施形態によれば、卵母細胞は単離されたものである。

特定の実施形態によれば、卵母細胞とＰＥＤＦとの接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで行われる。かくして、ＰＥＤＦは、ＰＥＤＦが卵母細胞と直接接触するように添加される。特定の実施形態によれば、ＰＥＤＦは抗酸化量で添加される。

本明細書で使用する用語「抗酸化量」とは、例えば、ＰＥＤＦを含まない好適な対照と比較して、酸化ストレスの少なくとも５％の低下をもたらす量を指す。酸化ストレスの低下は、一般に、培養細胞中および／または特に、卵母細胞中で起こるものでもよい。特定の実施形態によれば、低下は、少なくとも１０％、３０％、４０％またはさらにはより高い、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を超える。酸化ストレスの低下は、上述したように、例えば、抗酸化物質の増加、および／またはＲＯＳ、ＤＮＡ損傷、脂質過酸化、タンパク質の酸化、アポトーシス促進タンパク質の活性化および／または細胞死の減少として現れてもよい。

本発明の別の態様によれば、卵母細胞および外部添加されたＰＥＤＦを含む培養細胞が提供される。

本明細書で使用する用語「培養細胞」とは、その天然の環境の外の制御された条件下（すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ）で増殖させた卵母細胞を含む細胞集団を指す。典型的には、細胞集団は、卵母細胞の生存と最適には受精を支援し、卵母細胞を育てる栄養素を含有する適切な規定培養培地で増殖させる。特定の実施形態によれば、培養細胞は、哺乳動物培養細胞（例えば、ヒト）である。

特定の実施形態によれば、卵母細胞は、体外受精（ＩＶＦ）用の条件下で維持される。

ＩＶＦ技術は、当業者には公知である。典型的には、雌を最初に排卵誘発剤で処理して、複数の卵母細胞の成熟を促進する。薬物の種類および用量は患者のプロファイルおよび用いられる促進プロトコールに応じて変化する。次いで、これらの卵母細胞を、顕微鏡下手術（例えば、経膣卵母細胞回収）によって直接卵巣から外科的に回収する。次いで、回収された卵母細胞を好適な培養皿に入れ、受精のために雄から採取された精子に曝露する。卵母細胞採取および授精の日が０日目である。多くの場合、受精の可能性を高めるために、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）として知られる追加の手順が必要である。受精後、受精した卵母細胞を、約３〜５日間、多細胞胚まで増殖させる。この期間に、培養条件および胚を連続的に評価する。その後、胚を回収し、子宮壁への胚の埋め込みが起こると予想される雌に戻し、その時点から、正常な妊娠となる。ＩＶＦ手順に含まれる方法に関するさらなる詳細については、非特許文献３０を参照されたい。

本明細書で用いられる語句「ＩＶＦ用の条件下で維持される」とは、体外での精子による卵母細胞の受精、受精した卵母細胞の分裂および／またはある段階の成熟度までの胚の発生を可能にする条件を指す。

特定の実施形態によれば、卵母細胞は、受精卵、卵割段階の胚、または胚盤胞の発生を可能にする条件下で維持される。

特定の実施形態によれば、接触は、卵母細胞の受精の前に実施する。

特定の実施形態によれば、接触は、卵母細胞の受精の後に実施する。

他の特定の実施形態によれば、接触は、卵母細胞の受精と同時に実施する。

特定の実施形態によれば、接触は、培養細胞中の酸化物質が所定の閾値を上回って蓄積した後に実施する。

特定の実施形態によれば、接触は、卵母細胞の凍結前または解凍中または解凍後に実施する。

本発明の別の態様によれば、ＰＥＤＦを含む、ＩＶＦにおける使用のためのＩＶＦグレードの培地が提供される。

また、
（ｉ）ＩＶＦにおける使用のためのＩＶＦグレードの培地；および
（ｉｉ）ＰＥＤＦ
を含むキットも提供される。

本明細書で使用する用語「ＩＶＦグレードの培地」とは、（例えば、ヒトにおける）ＩＶＦ手順の間に配偶子または胚のｉｎ ｖｉｔｒｏでのインキュベーションおよび培養にとって好適な培地を指す。様々な好適な培地が利用可能であり、その種類および組成は当業者には周知である。特定の実施形態によれば、培養培地は、少なくとも水、塩類、栄養素、必須アミノ酸、ビタミンおよびホルモンを含有し、また、１つまたは複数の増殖因子を含んでもよい。好適な培地としては、ＨＴＦ培地；改変Ｗｈｉｔｔｅｎｓ培地；Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍｓ Ｔ６培地；Ｈａｍｓ Ｆ１０；Ｅａｒｌｅｓ液；Ｈａｍｓ−Ｆｌｏ；ＩＶＦ５０；Ｇ１．１；Ｇ１．２；Ｇ２．２；（例えば、Ｓｙｄｎｅｙ ＩＶＦ Ｃｌｅａｖａｇｅ、Ｓｙｄｎｅｙ ＩＶＦ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ、Ｓｙｄｎｅｙ ＩＶＦ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎなどの）ＣｏｏｋのＩＶＦ培地；（例えば、ＦｅｒｔｉＣｕｌｔ（商標）ＩＶＦ、ＦｅｒｔｉＣｕｌｔ（商標）Ｇ３などの）ＦｅｒｔｉＰｒｏ ＩＶＦ培地；Ｇｙｎｅｍｅｄ ＩＶＦ培地（ＧＭ５０１ Ｂａｓｉｃ、ＧＭ５０１ Ｃｕｌｔ）；（例えば、ＩＶＣ−ＯＮＥ（商標）、ＩＶＣ−ＴＷＯ（商標）、ＩＶＣ−ＴＨＲＥＥ（商標）などの）ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ ＩＶＦ培地；（例えば、Ｐ１（登録商標）、ＥＣＭ（登録商標）、ＳＳＭ（商標）、ＭｕｌｔｉＢｌａｓｔｗ（登録商標）、ＨＴＦなどの）Ｉｒｖｉｎｅ ＩＶＦ培地；Ｌｉｆｅ Ｇｌｏｂａｌ ＩＶＦ培地（ｇｌｏｂａｌ（登録商標）、ｇｌｏｂａｌ（登録商標）ｆｏｒ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ｇｌｏｂａｌ（登録商標）ＨＰ、ｇｌｏｂａｌ（登録商標）ｔｏｔａｌ（登録商標）ｆｏｒ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ｇｌｏｂａｌ（登録商標）ｆｏｒ Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ、ｇｌｏｂａｌ（登録商標）Ｃｏｌｌｅｃｔ（登録商標）、ｇｌｏｂａｌ（登録商標）ｔｏｔａｌ（登録商標）ｗ／ＨＥＰＥＳ、ｇｌｏｂａｌ（登録商標）ｗ／ＨＥＰＥＳ、Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ、ＨＴＦ、ＨＴＦｘｔｒａ）；Ｏｒｉｇｉｏ ＩＶＦ培地（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＩＶＦ、ＩＳＭ１（商標）、ＩＳＭ２（商標）、ＥｍｂｒｙｏＡｓｓｉｓｔ（商標）、ＢｌａｓｔＡｓｓｉｓｔ（登録商標）、ＥｍｂｒｙｏＧｅｎ（登録商標））；（例えば、Ｑｕｉｎｎｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）Ｆｅｒｔ、Ｑｕｉｎｎｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）Ｃｌｅａｖａｇｅ、Ｑｕｉｎｎｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ（登録商標）Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔなどの）Ｓａｇｅ ＩＶＦ培地；ならびに（例えば、Ｇ−ＧＡＭＥＴＥ（商標）、Ｇ−ＭＯＰＳ（商標）、Ｇ−ＩＶＦ（商標）ＰＬＵＳ、Ｇ−１（商標）、Ｇ−２（商標）ＰＬＵＳ、ＩＶＦ（商標）、およびＣＣＭ（商標）などの）Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ ＩＶＦ培地が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本明細書で使用する用語「約」とは、±１０％を指す。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびその同根語は、「含むが、限定されるものではない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。

用語「からなる」は、「含み、それに限定される」を意味する。

用語「から実質的になる」は、組成物、方法または構造がさらなる成分、ステップおよび／または部分を含んでもよいことを意味するが、さらなる成分、ステップおよび／または部分が特許請求された組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にのみである。

本明細書で使用する、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈において別途明確に指示しない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、その混合物を含む、複数の化合物を含んでもよい。

本出願を通して、本発明の様々な実施形態を、範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔性のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定と解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能なサブ範囲ならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのサブ範囲、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、および６を具体的に開示したものと考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

本明細書において数値範囲を示す場合、それは常にその示した範囲内の任意の数値（小数または整数）を含むことを意味する。第１の指示数と第２の指示数との「間の範囲」という語句、および第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という語句は、本明細書では互換使用可能であり、第１および第２の指示数ならびにその間の全ての小数および整数を含むことを意味する。

本明細書で使用する用語「方法」とは、所与の任務を達成するための様式、手段、技術および手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の当業界の従事者にとって公知の様式、手段、技術および手順、または公知の様式、手段、技術および手順から容易に開発される様式、手段、技術および手順を含むが、これらに限定されるものではない。

特定の配列表を参照する場合、そのような参照は、その相補配列に実質的に対応する配列も包含し、軽微な配列の変異、例えば、シーケンシングの誤り、クローニングの誤り、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加をもたらす他の改変による変異も含まれることを理解されたい。当該変異の頻度は５０ヌクレオチドに１個未満、あるいは、１００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、２００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、５００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、１０００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、５，０００ヌクレオチドに１個未満、あるいは、１０，０００ヌクレオチドに１個未満とする。

明確さを目的として、個別の実施形態の文脈の中で説明されている本発明の複数の特徴は、１つの実施形態の中に組み合わせて設けることもでき、上の説明は、このような組合せが明示的に記載されているものと解釈すべきことを理解されたい。逆に、簡潔さを目的として、１つの実施形態の文脈の中で説明されている本発明のさまざまな特徴は、個別に設ける、または適切な部分組合せとして設ける、または本発明の任意の他の説明されている実施形態において適切に設けることもでき、上の説明は、このような個別の実施形態が明示的に記載されているものと解釈すべきである。さまざまな実施形態の文脈の中で説明されている特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作・機能しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴とはみなさないものとする。

上記および添付特許請求の範囲に記載された本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例において実験的に支持される。

上記説明と共に、本発明のいくつかの実施形態を限定することなく例示する実施例を、以下に参照する。

一般に、本明細書で用いられる命名法および本発明で用いられる実験手順は、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献中に余すところなく説明されている。例えば、非特許文献３１、非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６；特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４および特許文献１５に記載の方法；非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９、非特許文献４０；利用可能なイムノアッセイは、特許文献および科学文献に広く記載されており、例えば、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０および特許文献３１を参照されたい；非特許文献４１、非特許文献４２、非特許文献４３、非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６、非特許文献４７、非特許文献４８、非特許文献４９を参照されたい；これらの全ては、参照により、本明細書に完全に記載されたように組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本明細書を通して提供する。これらに記載の手順は、当業者には周知であると考えられ、読者の便宜のために提供する。これらに含まれる情報は全て、参照により本明細書に組み込まれる。

材料および方法
試薬−Ｈ_２Ｏ_２、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地／Ｈａｍ Ｆ１２ １：１（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル国、ベイト ハメニク）、活性炭処理済みウシ胎仔血清（ＣＳ−ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、ニューヨーク州、グランドアイランド）、ドキソルビシン（ＤＸＲ、Ｔｅｖａ イスラエル国）。

一次抗体−抗ＰＮＰＬＡ２抗体、抗アクチン抗体（それぞれ、ＡＢＤ６６およびＭＡＢ１５０１；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国、カリフォルニア州、テメキュラ）、抗Ｐｈｏ−ＡＫＴ抗体および抗Ｇｅｎ−ＡＫＴ抗体（それぞれ、Ｐ４１１２およびＰ１６０１；Ｓｉｇｍａ、米国、ミズーリ州、セントルイス）および抗ＢＡＸ抗体（ｓｃ−５２６、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズ）、抗ＰＥＤＦ抗体（ｓｃ−２５５９４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＶＥＧＦ抗体（ｓｃ−１５２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＣＤ３４抗体（ＣＬ８９２７ＡＰ；Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国、ノースカロライナ州）および抗ＥＲα抗体（ａｂ１７４６、Ａｂｃａｍ、英国、ケンブリッジ）。

二次抗体−ＨＲＰ結合モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、米国、ペンシルベニア州）。ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８結合抗体、ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５５５結合抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国、マサチューセッツ州）、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３４２（Ｓｉｇｍａ）。

動物−ＤＸＲ損傷の評価は、７週齢の雌ＩＣＲマウスを用いて行い、０日目の過剰排卵処理のための妊娠した雌ウマ血清（ＰＭＳＧ、７ＩＵ）の皮下投与および２日目のヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ、７ＩＵ）の皮下投与に続いて実施した。１日目には、マウスにＤＸＲ（６ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（対照）を静脈内投与した。マウスの卵巣を３日目に回収した（図１のＡ）。ＤＸＲの破壊作用を克服するｒＰＥＤＦの作用については、０日目に７週齢の雌ＩＣＲマウスにＤＸＲ（６ｍｇ／ｋｇ）または生理食塩水（対照）による処理を静脈内投与で行い、１日目にｒＰＥＤＦ（２ｍｇ／ｋｇ）またはＴＲＩＳ（対照）を皮下投与した後、４日目にＰＭＳＧ（７ＩＵ）を皮下投与し、さらに６日目にｈＣＧ（７ＩＵ）を皮下投与して過剰排卵を誘導した。マウスの卵巣を７日目に回収した（図２のＡ）。閉経後の子宮組織に対するタモキシフェンの亜急性作用は、卵巣切除（ＯＶＸ）ＩＣＲマウスに対して、様々な濃度のタモキシフェン（０．３〜３．３μｇ／ｋｇ）で７日間にわたって毎日処理することで評価した。マウスの子宮を７日目に切除した。亜急性モデルにおけるｒＰＥＤＦ投与の効果を評価するために、タモキシフェン（２．５μｇ／マウス）およびｒＰＥＤＦ（１０ｍｇ／ｋｇ）をＯＶＸマウスに対して７日間にわたり毎日静脈投与することで処理した。タモキシフェンのみで処理したマウスを対照とした。閉経後の子宮組織に対するタモキシフェンの長期的作用は、ＯＶＸ ＩＣＲマウスに対して、１カ月間にわたり、週に５日、タモキシフェン（２．５μｇ／マウス）で処理することで評価した。長期的モデルにおけるｒＰＥＤＦ投与の効果を評価するために、タモキシフェン処理の８日目から１カ月間にわたり、マウスに更に３日に１回のｒＰＥＤＦ（２ｍｇ／ｋｇ）の静脈投与で処理した。タモキシフェンのみで処理したマウスを対照とした。

排卵された卵母細胞の数の評価−卵丘に封入された卵母細胞を、ｈＣＧ投与の１６〜１８ｈ後、卵管膨大部からＭ２培地（Ｓｉｇｍａ）中に単離した。卵丘細胞を、４００ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）に短時間曝露して除去し、排卵された卵母細胞数を両眼用顕微鏡下で計数した。

細胞培養−ラット顆粒膜細胞株ＬＨ−１５［非特許文献５０］を、［非特許文献５１］に記載のように、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）および１０％活性炭処理済みウシ胎仔血清（ＣＳ−ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（培養培地）を添加したホルモン非含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で培養した。細胞を、組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）刺激前および刺激中に１６時間、血清飢餓条件（０．１％ＣＳ−ＦＢＳ）に置くか、またはＨ_２Ｏ_２刺激中に２％ＣＳ−ＦＢＳ中でインキュベートした。

ウェスタンブロット分析−試料を、冷えた溶解バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％Ｉｇｅｐａｌ；Ｓｉｇｍａ）中でホモジェナイズし、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。タンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１０％、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、イスラエル国）により分離した。分離したタンパク質を、ミニタンク移動ユニット（ＴＥ２２、Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）中のニトロセルロース膜（Ｗｈａｔｍａｎ ＧｍｂＨ、ドイツ連邦共和国）上に移した。近似分子量を、予め染色しておいたタンパク質標準品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の移動度との比較により決定した。ブロットを、５％スキムミルク（Ａｌｂａ、米国、ニューヨーク州）を含有するＴＢＳＴ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で１時間ブロックした後、一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳＴ中で３回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。免疫反応性のバンドを、製造業者の指針に従って、増強化学発光（ＥＣＬ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国、イリノイ州）により可視化した。タンパク質バンドの強度を、Ｉｍａｇｅ Ｊ ソフトウェア（ＮＩＨ）により定量した。

免疫組織化学−パラフィン包埋切片を脱パラフィン化し、抗原回収剤（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ ａｇｅｎｔ）（Ｈ−３３００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国、カリフォルニア州、バーリンゲーム）で処理しながらマイクロ波で加熱し、氷上で室温まで冷却し、ＰＢＳ中で洗浄し、ＰＢＳＴｇ（０．２％Ｔｗｅｅｎおよびゼラチン含有ＰＢＳ）と共に１時間インキュベートし、その後ＰＢＳで洗浄し、ブロッキング溶液（Ｃｅｌｌ Ｍａｒｑｕｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国、カリフォルニア州）中で１０分間ブロッキングし、抗ＰＮＰＬＡ２一次抗体または抗ＣＤ３４一次抗体と共に一晩インキュベートした。次の日に、切片を、核マーカー（Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３４２、Ｓｉｇｍａ）と共に適切な二次抗体（ヤギ抗ラットＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ５５５コンジュゲート化抗体、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ４８８コンジュゲート化抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を適用する前後に、ＰＢＳＴｇおよびＰＢＳ中で洗浄し、濯ぎ、Ｍｏｗｉｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を用いてマウントし、二次抗体のみの対照に対して較正したＬｅｉｃａレーザー共焦点顕微鏡（ＳＰ５ Ｗｅｔｚａｌｒ、ドイツ連邦共和国）により可視化および写真撮影を行った。

ＰＥＤＦの生成−ヒト組換えＰＥＤＦ（ＮＭ＿００２６１５．４、配列番号１）を、大腸菌ＢＬ２１中で発現させた。細菌を３０℃でＯＤ６００ｎｍが０．５〜０．６になるまで増殖させ、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピル−Ｌ−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドにより４〜５時間誘導し、遠心分離し、そのペレットを溶解させた。組換えタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ、ドイツ連邦共和国、ダルムシュタット）を製造業者のプロトコールに従って用いるイオン金属アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで、ＧｅｌＣｏｄｅ（Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により展開するか、または特異的抗ＰＥＤＦ抗体を用いたウェスタンブロットを行った。９０％を超える純度の溶出液を、ｐＨ１０のＴＲＩＳバッファーに対して透析した［非特許文献５２］。

ＲＮＡの単離、逆転写（ＲＴ）、ＰＣＲおよびリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）−様々な組織（卵巣、眼）または顆粒膜細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の指示書に従って使用し、総ＲＮＡを単離し、Ｎａｎｏ−Ｄｒｏｐ分光光度計（ＮＤ−１０００；Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。合計１μｇのＲＮＡから、ＲＴ（Ｍａｘｉｍａ ＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、オリゴｄｔプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡを生成した。１μｌのＲＴ反応液および５０ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマー含有ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）混合物（Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＤＮＡを増幅した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国、カリフォルニア州、フォスターシティ）上で、１５ｎｇのｃＤＮＡおよび特異的プライマーと共にＳＹＢＲグリーン試薬（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＡＢＩ、米国、カリフォルニア州、カールスバッド）を用いて、ｍＲＮＡの発現レベルの変化を検出した。

ＭＴＴ細胞増殖アッセイ−等量のＬＨ−１５細胞を、６ウェルプレート上に、最終容量５００μｌとなるように播種した。処理後には、各ウェルを１０μｌのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；５ｍｇ／ｍｌ］と共に３０分間インキュベートし、次いでさらに３７℃で２〜４時間インキュベートした。ＨＣｌ（０．０７Ｍのイソプロパノール溶液）を１１０μｌ添加して反応を終了し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ １９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国、オレゴン州、ユージーン）でＯＤ５６０ｎｍを測定した。

子宮重量の評価−各実験の終了後、子宮を単離し、切除し、計量した。

統計解析−タンパク質バンドの強度差を、ｔ検定を用いて、有意差がＰ＜０．０５となる条件で評価した。各実験を少なくとも３回繰り返し、任意に１００％と設定した対照の強度に対するパーセンテージで強度を表した。

マウス卵巣に対するＤＸＲおよび外因性ＰＥＤＦの効果
ＤＸＲはマウス卵巣中のＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルを低下させる
マウス卵巣に対してＤＸＲが与える損傷を評価するために、標準的なＰＭＳＧ／ｈＣＧプロトコール［非特許文献５３］を用いて過剰排卵処理し、次いで、ＤＸＲで処理したマウスから回収したマウス卵巣において、ＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルを評価した（図１のＡ）。図１のＢに示されるように、ＤＸＲはＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルを有意に（Ｐ＜０．０５）低下させた。

外因性ＰＥＤＦはＤＸＲ条件下での排卵を改善する
ＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルに対するＤＸＲの負の作用に基づいて、外因性組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）による、排卵に対するＤＸＲの破壊作用を克服する作用について検討した。この目的のために、雌のマウスをＤＸＲで処理し、次の日にｒＰＥＤＦを投与した。実験の４日目に、標準的なＰＭＳＧ／ｈＣＧプロトコール［非特許文献５３］を用いてマウスに過剰排卵を誘導した。ｈＣＧ投与の１６〜１７時間後にマウスを屠殺した（図２のＡ）。図２のＢに示されるように、ｒＰＥＤＦは、ＤＸＲ誘導性の排卵された卵母細胞数の低下を有意に（Ｐ＜０．０５）減少させた。

ＬＨ−１５ラット顆粒膜細胞に対する酸化ストレスおよび外因性ＰＥＤＦの効果
Ｈ_２Ｏ_２はＬＨ−１５細胞の生存率およびこれら細胞中のＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼす
顆粒膜細胞に対して酸化ストレス（ＯＳ）が与える損傷を評価するために、ＭＴＴアッセイを用いて、細胞の生存率を追跡した。２４時間にわたる、段階的に濃度を高めた（１００〜５００μＭの）Ｈ_２Ｏ_２へのラット顆粒膜細胞株（「ＬＨ−１５細胞」と呼ぶ）の曝露は、統計的に有意な（Ｐ＜０．０５）、用量依存的な、細胞生存率の低下を引き起こした（図３のＡ）。さらにＨ_２Ｏ_２は、１００μＭ濃度で既にＰＥＤＦ ｍＲＮＡレベルを有意に（Ｐ＜０．０１）低下させた（図３のＢ）。

外因性ＰＥＤＦは、ＬＨ−１５細胞においてＨ_２Ｏ_２誘導性細胞傷害性を減弱させる
ＬＨ−１５細胞の生存率およびＰＥＤＦ ｍＲＮＡのレベルに対するＨ_２Ｏ_２の負の作用に基づいて、外因性組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）による、顆粒膜細胞におけるＨ_２Ｏ_２の破壊作用を克服する作用について検討した。この目的のために、ＬＨ−１５細胞を、ｒＰＥＤＦ（１ｎＭまたは５ｎＭ）の存在下または非存在下で、２４時間にわたって１００μＭまたは２００μＭのＨ_２Ｏ_２と共にインキュベートし、ＭＴＴアッセイで細胞生存率を評価した。図４のＡに示されるように、ｒＰＥＤＦは、Ｈ_２Ｏ_２誘導性の細胞生存率の低下を有意に（Ｐ＜０．０５）減少させた。さらに、同じ刺激条件下における、ＬＨ−１５細胞内における、アポトーシス促進タンパク質ＢＡＸの発現ならびに抗酸化酵素であるＳＯＤ−１およびＧＰＸ−１のｍＲＮＡレベルを追跡した。その結果、ＢＡＸレベルはＨ_２Ｏ_２処理後に上昇するが、ｒＰＥＤＦの外部添加によって、その発現は減少したことがわかる（図４のＢ〜Ｃ；Ｐ＜０．０５）。対照的に、ＳＯＤ−１およびＧＰＸ−１のｍＲＮＡレベルは、Ｈ_２Ｏ_２処理後に低下したが、ｒＰＥＤＦを外部添加によってそれらの発現は上昇した（図５のＡ〜Ｂ）。

ＰＥＤＦ受容体であるＰＮＰＬＡ２は、マウス卵巣およびラット顆粒膜細胞中で発現されている
ＰＥＤＦ受容体であるＰＮＰＬＡ２は、マウス卵巣中で発現される
生存促進性ＰＥＤＦ−Ｒである、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質２（ＰＮＰＬＡ２）のマウス卵巣における発現を、タンパク質レベルおよびｍＲＮＡレベルで評価した。マウス卵巣の免疫染色により、生存促進性ＰＥＤＦ−ＲであるＰＮＰＬＡ２は、顆粒膜細胞、莢膜細胞および卵母細胞中で発現されることがわかる（図６のＡ）。さらに、マウス卵巣は、ＰＥＤＦ−ＲのｍＲＮＡ（図６のＢ）およびタンパク質（図６のＣ）を発現する。

ＰＥＤＦ受容体であるＰＮＰＬＡ２は、ＬＨ−１５細胞中で発現される
これまでに観察された、ＬＨ−１５細胞に対するｒＰＥＤＦの効果から、顆粒膜細胞はＰＥＤＦ受容体（ＰＥＤＦ−Ｒ）を発現することを示唆している。図３のＢ〜Ｃに示されるように、顆粒膜細胞は、生存促進性ＰＥＤＦ−ＲであるＰＮＰＬＡ２のｍＲＮＡ（図６のＢ）およびタンパク質（図６のＣ）を発現する。

外因性ＰＥＤＦは顆粒膜細胞中のＡＫＴを活性化する
顆粒膜細胞が、ＰＥＤＦ生存促進機能を仲介するＰＮＰＬＡ２を発現することが示されたので、生存促進シグナル伝達経路における既知の因子であるＡＫＴ（非特許文献５４）に対する、ｒＰＥＤＦによる活性化作用を調べた。この目的のために、血清飢餓条件に置いたＬＨ−１５細胞を、様々な期間にわたって１ｎＭのｒＰＥＤＦで刺激した。その結果、ｒＰＥＤＦ刺激は、ＡＫＴに対して長期的な、時間依存的なリン酸化を刺激期間５分から誘導することが示された（図７のＡ〜Ｂ；Ｐ＜０．０５）。

かくして、理論によって束縛されるものではないが、げっ歯類の顆粒膜細胞、莢膜細胞および卵母細胞は、生存促進性ＰＥＤＦ受容体であるＰＮＰＬＡ２を発現し、それが一度ｒＰＥＤＦによって刺激されると、顆粒膜細胞においては、細胞シグナル伝達の中心的な生存促進メディエータであるＡＫＴのリン酸化が起こる、といった機構が考えられる。

マウス子宮組織に対するタモキシフェンおよび外因性ＰＥＤＦの効果
亜急性タモキシフェン処理は子宮重量ならびにＶＥＧＦおよびＰＥＤＦの発現に影響を及ぼす
閉経後の子宮組織に対するタモキシフェンの亜急性投与の作用を評価するために、卵巣切除（ＯＶＸ）マウスを、様々な濃度のタモキシフェンで７日間にわたって毎日処理した。図８に示されるように、亜急性タモキシフェン投与後に子宮重量の用量依存的増加が観察された。さらに、子宮のＶＥＧＦタンパク質レベルは、用量依存的に上方調節され（図９のＡ〜Ｂ）、子宮重量と正に相関していた。一方、ＰＥＤＦタンパク質の発現は、タモキシフェン用量が増加するにつれて下方調節された（図９のＡおよび図９のＣ）。亜急性タモキシフェン投与後の子宮におけるＶＥＧＦタンパク質レベルとＰＥＤＦタンパク質レベルの相互的な変化は、ＶＥＧＦ／ＰＥＤＦタンパク質レベル比の劇的で有意な用量依存的上昇をもたらした（図９のＤ）。

ＰＥＤＦはオートクリンおよびパラクリン活性を有する分泌型糖タンパク質であるため、ＰＥＤＦ活性に必須の受容体の発現レベルに対するタモキシフェンの作用を評価した。ＰＥＤＦは、ＰＮＡＰＬＡ２受容体を介して生存促進因子として機能するか、またはラミニン受容体を介して抗血管形成因子として機能することが示された。図１０に示されるように、亜急性タモキシフェン処理により、ＰＮＰＬＡ２受容体とラミニン受容体の両方のｍＲＮＡレベルが上方調節された。しかしながら、ＰＮＰＬＡ２受容体の増加は、ラミニン受容体の増加よりも顕著であった。これは、タモキシフェン処理後には、内因性ＰＥＤＦは、ラミニン受容体を介して抗血管形成活性を促進するよりも、ＰＮＰＬＡ２により結合しやすくなって、細胞の生存を誘導することを示唆している。

外因性ＰＥＤＦは、タモキシフェン誘導性過形成およびＶＥＧＦ上昇を減弱させる
子宮重量およびＶＥＧＦ発現に対するタモキシフェンの破壊作用を克服する外因性組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）の作用について検討した。マウスにおけるｒＰＥＤＦ処理の確立されたレジメン［非特許文献５５および非特許文献５６］に基づいて、７日間にわたり、１日用量のタモキシフェンで処理した卵巣切除マウスに、１０ｍｇ／ｋｇの用量でｒＰＥＤＦを投与した。図１１および図１２のＡ〜Ｂに示されるように、タモキシフェンのみの場合と比較して、タモキシフェン＋ｒＰＥＤＦで処理したマウスにおいて、子宮重量および子宮ＶＥＧＦタンパク質レベルの有意な減少が観察され、これは、ｒＰＥＤＦが、おそらくタモキシフェン誘導性ＶＥＧＦ上昇に抵抗することによって、タモキシフェン誘導性の子宮に対する副作用を無効化したことを示唆している。

シグナル伝達経路に対するｒＰＥＤＦの効果
亜急性タモキシフェンモデルにおける、ＡＫＴおよびＪＮＫのリン酸化レベルに対するｒＰＥＤＦの投与の効果の分析によって、タモキシフェンのみで処理したマウスと比べて、タモキシフェン＋ｒＰＥＤＦで処理したマウスにおいて、ＡＫＴのリン酸化の有意な減少（図１３のＡ〜Ｂ）およびＪＮＫのリン酸化の有意な増加（図１４のＡ〜Ｂ）が明らかとなった。このように、ｒＰＥＤＦによる処理は、がん関連シグナル伝達経路の活性化を低下させる可能性がある。

長期的なタモキシフェン処理は子宮重量ならびにＶＥＧＦおよびＰＥＤＦの発現に影響を及ぼす
がん患者は、長期間（最大１０年）にわたって、毎日、タモキシフェンによる治療を受けている。したがって、長期的なタモキシフェン投与の作用を評価するために、マウスに１カ月間にわたって週５日間のタモキシフェン（２．５μｇ／マウス）投与を行った。図１５および図１６のＡ〜Ｃに示されるように、長期的なタモキシフェン処理は、亜急性処理と類似する作用、すなわち、子宮重量の増加（図１５）、ＶＥＧＦタンパク質レベルの上方調節（図１６のＡ）およびＰＥＤＦタンパク質レベルの下方調節（図１６のＢ）が誘導された。結果として、ＶＥＧＦ／ＰＥＤＦ比は有意に増大し、亜急性処理モデルと対応していた（図１６のＣ）。

さらに、１カ月間のタモキシフェン処理後のＰＥＤＦの受容体発現の評価結果は、ＰＮＰＬＡ２のレベルは有意に増加するが、ラミニン受容体のレベルは有意に変化しないことを示した（図１７）。これは、生存経路の優位性が、長期にわたるタモキシフェン処理の後に、さらにより顕著になることを示している。

長期的な外因性ＰＥＤＦはタモキシフェン誘導性過形成、ＶＥＧＦ上昇および血管密度を減弱させる
子宮重量およびＶＥＧＦ発現に対する長期的タモキシフェン処理の破壊作用を克服する、外因性組換えＰＥＤＦ（ｒＰＥＤＦ）の作用について検討した。予備分析から、ｒＰＥＤＦによる処理は、タモキシフェンによる短期の開始期を経てから投与した方が、より効果的であることがわかった（データは示さず）。そこでタモキシフェン処理開始から８日目からｒＰＥＤＦのマウスへの投与を開始した。図１８に示されるように、子宮重量は、タモキシフェン＋ｒＰＥＤＦで処理したマウスにおいて下方調節されたが、統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．２）。子宮ＶＥＧＦタンパク質の発現レベルは、タモキシフェンのみで処理したマウスと比較した場合、タモキシフェン＋ｒＰＥＤＦで処理したマウスにおいて有意に低下し（図１９のＡ〜Ｂ）、これは、１カ月の処理後も子宮に対してｒＰＥＤＦの効果が持続していることを示唆している。

さらに、内皮細胞用マーカーとしてＣＤ３４を用いる免疫組織化学染色を用いて、タモキシフェンによる処理およびタモキシフェン＋ｒＰＥＤＦによる処理後の血管の変化を評価した。図２０に明示されるように、タモキシフェンのみによる処理は、対照と比べて、子宮血管密度の顕著な増加を誘導し、タモキシフェン＋ｒＰＥＤＦによる長期間処理は、タモキシフェンのみの場合と比較してＣＤ３４染色が減少した。

ＥＲα発現パターンの調節
ホルモン受容体の発現レベルは、乳がんのためのタモキシフェン治療における重要なアスペクトである。ＥＲ中介性シグナル伝達経路には特に注目が集まっている。これは、タモキシフェンはエストロゲン受容体（ＥＲ）に結合してその活性を発揮することができるため、ＥＲ発現レベルの変化はタモキシフェンに対する組織の応答を変化させ得るためである。したがって、次のステップでは、ホルモン受容体であるＥＲα受容体、ＥＲβ受容体およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）のレベルを、亜急性ｉｎ ｖｉｖｏタモキシフェン処理モデルおよび長期的なｉｎ ｖｉｖｏタモキシフェン処理モデルにおいて決定した。図２１のＡに示されるように、亜急性タモキシフェン処理は、ＥＲα ｍＲＮＡレベルを上方調節したものの、ＥＲβおよびＰＲに対して有意な作用を示さなかった。また図２１のＡから明らかなように、ｒＰＥＤＦ投与により、ＥＲα ｍＲＮＡレベルの亜急性タモキシフェン誘導性低下を減弱させることができた。さらに、ＥＲαのタンパク質レベルは、同様の傾向を示したが、統計的に有意ではなかった（図２１のＢ、ｐ＝０．１）。

図２２のＡに示されるように、長期的タモキシフェン処理によりＥＲαとＥＲβの両方のｍＲＮＡ発現は上方調節されたが、ＰＲ発現に対しては有意な作用を示さなかった。また図２２のＡにおいて明らかなように、ｒＰＥＤＦ投与は、ＥＲα ｍＲＮＡレベルの長期的なタモキシフェン誘導性低下を反転させることができた。ＥＲαタンパク質の発現レベルは、そのｍＲＮＡレベルと相関するため、ＥＲαタンパク質発現を下方調節するｒＰＥＤＦの効果が実証された（図２２のＢ）。これらをまとめると、ｒＰＥＤＦ処理によって、ＥＲβおよびＰＲの発現を変えることなく、子宮におけるＥＲαの発現が特異的に低下した。ＥＲα発現の低下は、タモキシフェン処理された子宮に対して２つの関連性がある。つまり、過形成応答を媒介することで知られるＥＲ関連シグナル伝達が減少すること、およびタモキシフェン分子はどの細胞においても結合できる受容体が少ないことであり、それらの結果、タモキシフェンに対する子宮の応答を低下させることができる。

本発明をその特定の実施形態と共に記載してきたが、多数の代替、改変および変種が当業者に明らかとなることは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲内に含まれるそれらの代替、改変及び変種の全てを包含することが意図される。

それぞれの出版物、特許および特許出願が、参照により本明細書に援用されるように具体的かつ個々に示されるのと同程度に、本明細書に記載のすべての出版物、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。さらに、本出願における参考文献の引用または同定は、かかる参考文献が従来技術として本発明に利用可能であるという許可として、解釈すべきではない。セクションの表題が用いられる範囲内で、それらが必ずしも制限されると解釈すべきではない。

配列番号２： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号５： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号６： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号７： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号８： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号９： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１０： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１１： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１２： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１３： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
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配列番号１７： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１８： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号１９： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２０： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２１： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２２： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２３： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２４： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２５： １本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド

Claims (50)

1. 薬剤により誘導される性腺毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、前記対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止することを含む、方法。
2. 対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止するための、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
3. 薬剤により誘導される性腺毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、
   （ａ）前記対象における性腺機能を決定し、そして
   （ｂ）前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与して、前記対象において薬剤により誘導される性腺毒性を治療または防止する
   ことを含む、方法。
4. 前記性腺毒性が、性腺機能低下症、精子形成の減少、排卵の減少、早発卵巣不全および不妊症からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法または使用。
5. 前記性腺毒性が排卵の減少を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法または使用。
6. 前記薬剤が化学療法および放射線療法からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法または使用。
7. 前記薬剤が酸化ストレスを誘導するものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法または使用。
8. 前記対象が雄である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法または使用。
9. 前記雄が生殖年齢にある、請求項８に記載の方法または使用。
10. 前記雄が精液採取を受けていない、請求項８または９に記載の方法または使用。
11. 前記対象ががんと診断されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法または使用。
12. 前記がんが、精巣がん、乳がん、卵巣がん、リンパ腫および白血病からなる群より選択されるものである、請求項１１に記載の方法または使用。
13. 前記化学療法のための治療剤が最大耐量（ＭＴＤ）で投与される、請求項６に記載の方法または使用。
14. 前記化学療法が、メクロレタミン、プロカルバジン、シクロホスファミド、イホスファミド、ブスルファン、メルファラン、クロラムブシル、クロルメチン、ドキソルビシン、シスプラチンおよびカルボプラチンからなる群より選択されるものである、請求項６に記載の方法または使用。
15. 前記化学療法が、アルキル化剤、プロカルバジン、白金類似体およびアントラサイクリン系抗生物質からなる群より選択されるものである、請求項６に記載の方法または使用。
16. 前記化学療法が、アントラサイクリン系抗生物質、アルキル化剤、白金配位錯体、エピポドフィロトキシンおよびカンプトテシンからなる群より選択されるものである、請求項６に記載の方法または使用。
17. 前記化学療法がドキソルビシンである、請求項６に記載の方法または使用。
18. 前記対象に対する前記薬剤の投与をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法または使用。
19. 前記ＰＥＤＦの投与を、前記薬剤の投与と同時に行う、請求項１８に記載の方法または使用。
20. 前記ＰＥＤＦの投与を、前記薬剤の投与後に行う、請求項１８に記載の方法または使用。
21. がんの治療を必要とする対象においてがんを治療するための方法であって、前記対象に、治療有効量のタモキシフェンおよび治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与して、前記がんを治療することを含む、方法。
22. 対象におけるがんを治療するための、タモキシフェンおよび色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
23. タモキシフェン誘導性子宮毒性の治療または防止を、それを必要とする対象において実施するための方法であって、前記対象に、治療有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）を投与することによって、前記対象においてタモキシフェン誘導性子宮毒性を治療または防止することを含む、方法。
24. 対象においてタモキシフェン誘導性子宮毒性を治療または防止するための、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）。
25. タモキシフェンおよび色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）をそれぞれ個別に収容した容器を含む、がんの治療用に同定された製品。
26. 活性成分となるタモキシフェンおよび色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
27. 対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性を診断するための方法であって、タモキシフェンによる治療後の対象の生物試料中のＰＥＤＦレベルを決定することを含み、前記レベルが所定閾値を下回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする方法。
28. 前記生物試料中のＶＥＧＦのレベルを決定することをさらに含み、前記レベルが所定閾値を上回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする、請求項２７に記載の方法。
29. ＶＥＧＦレベルとＰＥＤＦとの比が、前記生物試料に対する所定の閾値を上回ることをもって、前記対象におけるタモキシフェン誘導性子宮毒性の指標とする、請求項２８に記載の方法。
30. 前記対象が雌である、請求項１〜７、２１および２２のいずれか一項に記載の方法または使用。
31. 前記対象が生殖年齢にある、請求項２１〜２４、２７および３０のいずれか一項に記載の方法または使用。
32. 前記雌が卵母細胞の回収を受けていない、請求項３０または３１に記載の方法または使用。
33. 前記対象が閉経前の期間にある、請求項２１、２３および２７〜２９のいずれか一項に記載の方法または請求項２２もしくは２４に記載の使用。
34. 前記対象が閉経後の期間にある、請求項２１、２３および２７〜２９のいずれか一項に記載の方法または請求項２２もしくは２４に記載の使用。
35. 前記対象ががんと診断されている、請求項２３および２７〜２９のいずれか一項に記載の方法または請求項２４に記載の使用。
36. 前記がんが乳がんである、請求項２１、２２および３５のいずれか一項に記載の方法または使用。
37. 前記ＰＥＤＦの投与を、前記タモキシフェンの投与と同時に行う、請求項２１または２２に記載の方法または使用。
38. 前記ＰＥＤＦの投与を、前記タモキシフェンの投与後に行う、請求項２１または２２に記載の方法または使用。
39. 前記ＰＥＤＦがＰＥＤＦペプチドである、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法、使用、製品または医薬組成物。
40. 卵母細胞の品質を改善するための方法であって、卵母細胞を含む培養細胞中の前記卵母細胞を、有効量の色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）とｅｘ ｖｉｖｏで接触させることによって、ｅｘ ｖｉｖｏで卵母細胞の質を改善することを含む、方法。
41. 卵母細胞と、外部添加された色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）とを含む培養細胞。
42. ＰＥＤＦを含む、ＩＶＦにおける使用のためのＩＶＦグレードの培地。
43. （ｉ）ＩＶＦにおける使用のためのＩＶＦグレードの培地；および
    （ｉｉ）ＰＥＤＦ
    を含むキット。
44. 前記卵母細胞が、体外受精（ＩＶＦ）用の条件下で維持されている、請求項４０に記載の方法または請求項４１に記載の培養細胞。
45. 前記接触を、前記卵母細胞の受精の前に実施する、請求項４０に記載の方法。
46. 前記接触を、前記卵母細胞の受精後に実施する、請求項４０に記載の方法。
47. 前記接触を、前記卵母細胞の受精と同時に実施する、請求項４０に記載の方法。
48. 前記接触を、前記培養細胞中の酸化物質が所定の閾値を上回って蓄積した後に実施する、請求項４０に記載の方法。
49. 前記卵母細胞が、卵巣または卵巣断片中に含まれる、請求項４０および４５〜４８のいずれか一項に記載の方法または請求項４１もしくは４４に記載の培養細胞。
50. 前記ＩＶＦのための卵母細胞が、卵巣または卵巣断片中に含まれる、請求項４２に記載の培地または請求項４３に記載のキット。