JP2017221159A - Bromelain-containing composition for highly sensitive detection of microorganisms in oral cavity of human or animal - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヒト又は動物の口腔から微生物を高感度に検出するための組成物及び方法に関する。具体的には、ヒト又は動物の口腔に生息する正常菌叢又は病原微生物の正確な数を測定するための組成物及び方法に関するものである。 The present invention relates to a composition and method for highly sensitively detecting microorganisms from the oral cavity of a human or animal. Specifically, it relates to compositions and methods for measuring the exact number of normal flora or pathogenic microorganisms that inhabit the oral cavity of humans or animals.
粘膜およびそれに近接した組織あるいは管腔の微生物感染の疾患例としては次のようなものがある。例えば、（１）高齢者に多い口腔カンジダ症や女性の膣カンジダ症の原因菌は、カンジダ属の真菌である。（２）小児に多いう蝕や高齢者に多い歯周病は、口腔の常在細菌の感染によって引き起こされる。 Examples of diseases of microbial infection of the mucous membrane and tissues or lumens in the vicinity thereof are as follows. For example, (1) the causative bacteria of oral candidiasis and vaginal candidiasis that are common in elderly people are fungi of the genus Candida. (2) Dental caries and periodontal disease, which are common in the elderly, are caused by infection of resident bacteria in the oral cavity.
カンジダは健常人にも見い出せる常在性真菌であり、ときによって病原性を示し、口腔、腟、及び皮膚のカンジダ症の原因となる。例えば、口腔カンジダ症は、舌の疼痛や味覚異常などの症状を呈してＱＯＬの低下をもたらす感染症で、特に高齢者に多く発症し、老人ホームにおいてはその治療や予防が重要な課題となっている。口腔カンジダ症の原因菌は、その大半がカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）であり、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、及びカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）などの菌種も比較的高い頻度で検出される。 Candida is a resident fungus that can also be found in healthy people, sometimes showing pathogenicity and causing candidiasis of the oral cavity, wrinkles, and skin. For example, oral candidiasis is an infectious disease that causes symptoms such as tongue pain and abnormal taste, resulting in a decrease in QOL. It occurs frequently in the elderly, and its treatment and prevention are important issues in nursing homes. ing. Most of the causative agents of oral candidiasis are Candida albicans, and bacterial species such as Candida tropicalis and Candida glabrata are also detected at a relatively high frequency. The
小児に多いう蝕、及び高齢者に多い歯周病の主たる原因菌は、それぞれＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、及びＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓであり、いずれも口腔常在細菌の一種である。 The main causative bacteria of caries that are common in children and periodontal disease that is common in the elderly are Streptococcus mutans and Porphyromonas gingivalis, both of which are types of oral resident bacteria.
これらの感染症の診断に際し、口腔、鼻腔又は膣の粘膜又は分泌物からの原因微生物の検出は、もっとも確実な証拠であるといえる。よって、これら感染症の診断に際し、患部である口腔から原因微生物を検出することが試みられている。もし原因微生物が同定されれば、それに応じた処置を行うことができるため、原因微生物の検出及び同定はこれらの感染症の治療や予防において非常に重要である。 In diagnosing these infections, the detection of causative microorganisms from the mucous membranes or secretions of the oral cavity, nasal cavity or vagina is the most reliable evidence. Therefore, in the diagnosis of these infectious diseases, attempts have been made to detect causative microorganisms from the oral cavity which is the affected area. If the causative microorganism is identified, the corresponding treatment can be performed, and therefore the detection and identification of the causative microorganism is very important in the treatment and prevention of these infectious diseases.
従来、ヒト又は動物の口腔などの粘膜部位からの微生物の採取は、それらの粘膜表面を綿棒などで擦過し、又は口腔をうがいすることで行われてきた。その後、採取された微生物を培養することにより原因微生物を検出していた。原因菌が多量に存在する場合は、従来の方法によって検出可能であるが、微生物は生体内で必ずしも均一に分散して存在しておらず、組織に付着していたり、複数個（同種間又は異種間）が凝集していたりする。よって、粘膜表面の一部を擦過した場合には、必ずしも微生物が存在する位置の検体を採取するとは限らず、感度良くかつ正確に微生物菌数を検出・測定することはできないという問題があった。また、例えば、たとえば口腔カンジダ症の場合、カンジダ菌は菌糸状となって舌組織に深く侵入するため浮遊状態の菌は少なく、浮遊状態として容易に採取できない。また、カンジダ菌は組織との親和性が高いため、回収された菌も組織片に凝集し、見かけ上少ない菌数として測定されることがある。このため、口腔カンジダ症などではその原因菌の検出率が悪く、検体をそのまま培養して形成されたコロニーを数えても、観察される菌数が実際の菌数よりも少なくなるという問題があった。 Conventionally, the collection of microorganisms from mucosal sites such as the oral cavity of humans or animals has been carried out by rubbing the mucosal surface with a cotton swab or the like, or gargle the oral cavity. Subsequently, the causative microorganism was detected by culturing the collected microorganism. When the causative bacteria are present in large quantities, they can be detected by conventional methods, but the microorganisms are not necessarily uniformly dispersed in the living body and are attached to the tissue, or a plurality of (same species or Different types) are agglomerated. Therefore, when a part of the mucosal surface is scraped, it is not always possible to collect a sample at a position where microorganisms are present, and there is a problem that the number of microorganisms cannot be detected and measured with high sensitivity and accuracy. . In addition, for example, in the case of oral candidiasis, Candida bacteria become mycelium and penetrate deeply into the tongue tissue, so there are few floating bacteria and they cannot be easily collected as floating conditions. In addition, since Candida has a high affinity with tissues, the collected bacteria may also aggregate in a tissue piece and may be measured as an apparently small number of bacteria. For this reason, the detection rate of the causative bacteria in oral candidiasis etc. is poor, and even if the colonies formed by culturing the specimens as they are are counted, the number of bacteria observed is less than the actual number of bacteria. It was.
また、口腔内の病原菌以外の微生物であっても、消化管内微生物叢に大きな影響を与えることから、このような微生物についても高感度かつ正確な定量が必要とされている。しかし、健常人においても同様に微生物菌叢の定性的および定量的な把握が困難であった。すなわち、病原菌の検出・測定以外の非病原性共生菌などの検出・測定においても、従来は十分有効な方法が存在していなかった。 In addition, even microorganisms other than pathogenic bacteria in the oral cavity have a great influence on the microbial flora in the digestive tract, and therefore, such microorganisms are required to be quantified with high sensitivity and accuracy. However, qualitative and quantitative understanding of the microbial flora was difficult in healthy individuals as well. That is, there has been no sufficiently effective method for detecting and measuring non-pathogenic symbiotic bacteria other than detecting and measuring pathogenic bacteria.
マウス口腔カンジダ症では菌糸が生体組織に深く侵入しているために、その生体組織を分散するのにタンパク分解酵素のトリプシンが有効であると考えられている。例えば、マウスの口腔カンジダ症モデルの場合は、舌苔など、菌が密集して侵襲している部位の組織を切り取り、その組織をホモジネートした後、トリプシンによって処理することにより、培養後に観察される見かけの生菌数が上昇することが報告されている（非特許文献１）。しかし、この方法は、少なくとも一部の組織を切除する過程を含み、そのままヒトに適用可能な方法ではない。ヒトにおいて、特に病態を形成していない健常人の舌表面及び唾液などの粘膜の外側にある分泌液、あるいは管腔液中のカンジダなどの微生物の菌数を検出・測定する際に、有効な処理法については、知られていない。 In mouse oral candidiasis, the mycelium penetrates deeply into the living tissue, so the proteolytic enzyme trypsin is considered to be effective in dispersing the living tissue. For example, in the case of a mouse oral candidiasis model, the tissue observed at the site where bacteria are densely invaded, such as tongue lichen, is cut out, homogenized, and then treated with trypsin. It has been reported that the number of viable bacteria increases (Non-patent Document 1). However, this method includes a process of excising at least a part of tissue, and is not a method that can be directly applied to humans. It is effective in detecting and measuring the number of microorganisms such as Candida and other secreted liquids outside the mucous membranes such as the surface of the tongue and saliva of healthy people who do not have any pathological condition in humans. The processing method is not known.
ブロメラインは、パイナップルの果実などに含まれるプロテアーゼであり、食品として摂取することで、舌苔除去効果及び口臭除去効果を有することが報告されている（特許文献１）。また、ブロメラインを含有する口腔ケア用の治療及び予防組成物が、歯の洗浄効果、歯垢蓄積の減少効果、再石灰化促進効果を有することが開示されている（特許文献２）。しかし、これらはいずれも口腔内微生物の除去又は沈着阻害が目的であり、生存微生物の効率的な回収に関しては全く言及されていない。 Bromelain is a protease contained in pineapple fruit and the like, and it has been reported that it has a tongue coating removing effect and a bad breath removing effect when ingested as a food (Patent Document 1). Moreover, it is disclosed that the therapeutic and preventive composition for oral care containing bromelain has a tooth cleaning effect, a plaque accumulation reducing effect, and a remineralization promoting effect (Patent Document 2). However, all of these are aimed at removal of oral microorganisms or inhibition of deposition, and nothing is mentioned regarding efficient recovery of viable microorganisms.
このように、従来、容易かつ安全で、高感度・高精度で口腔内の菌数を検出・測定する方法は知られていなかった。よって、安全かつ簡便に効率よく口腔内の微生物検体を採取する方法、及び口腔内の微生物の種類及び菌数を精度高く測定する方法が求められていた。従って、本発明は、ヒト又は動物の口腔などの粘膜部位から微生物を採取し、その菌の同定及び／又は菌数の測定方法に関して、従来の方法を改良し、対象微生物の検出感度や菌数の測定精度を改善することを課題にしている。 Thus, conventionally, there has been no known method for detecting and measuring the number of bacteria in the oral cavity with high sensitivity and high accuracy, which is easy and safe. Therefore, there has been a demand for a method for collecting a microorganism sample in the oral cavity safely and simply and efficiently, and a method for accurately measuring the type and number of microorganisms in the oral cavity. Accordingly, the present invention collects microorganisms from mucosal sites such as the oral cavity of humans or animals, improves the conventional method regarding the identification of the bacteria and / or the method for measuring the number of bacteria, and the detection sensitivity and the number of bacteria of the target microorganism. The problem is to improve the measurement accuracy of
よって、本発明は、ヒトや動物などの哺乳動物の口腔などの粘膜部位から、綿棒などによる擦過や洗浄などによって微生物を採取する際、検体中に回収される菌の数を増やして検出感度を上げること、さらに検体中に含まれる菌の数を精度高く測定することを課題とする。 Therefore, the present invention increases the number of bacteria collected in a specimen to increase detection sensitivity when collecting microorganisms from a mucosal site such as the oral cavity of mammals such as humans and animals by rubbing or washing with a cotton swab or the like. It is an object to raise the number of bacteria contained in the specimen with high accuracy.
本発明者らは微生物をより効率的に採取する処理方法について鋭意検討した結果、ブロメラインを含む液で、粘膜部位を処理（具体的な例としては、同酵素を含有するうがい液によるうがい、又は予め同酵素を含む溶液に浸した綿棒やガーゼ等で口腔内の粘膜部位等をぬぐう等）することにより、粘膜部位から微生物を高い回収率で採取できることを見出した。更に、本発明の方法によれば生きた状態で菌を多く回収することができるため、当該生菌を培養することで正確な菌数を測定することができることを見出した。さらに、凝集する微生物集団も効率よく分散させながら回収することができ、より正確な菌数測定が可能であることを見出した。これらの知見から、本発明者らは、ヒト及び動物に安全に適用できるタンパク分解酵素であるブロメラインを含有する組成物を利用することにより、粘膜組織と微生物の結合力を低下させながら生きた状態で菌を回収し、さらには凝集する微生物集団を分散させることで、簡便かつ安全に口腔内の微生物の回収量を増加させ、また、正確な測定を可能とすることができることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies on a treatment method for collecting microorganisms more efficiently, the present inventors treated mucosal sites with a liquid containing bromelain (specific examples include gargle with a gargle containing the enzyme, or It was found that the microorganism can be collected from the mucosal site at a high recovery rate by wiping the mucosal site in the oral cavity with a cotton swab or gauze previously soaked in a solution containing the enzyme. Furthermore, according to the method of the present invention, it was found that a large number of bacteria can be recovered in a living state, so that the accurate number of bacteria can be measured by culturing the live bacteria. Furthermore, the present inventors have found that a microbial population that aggregates can be recovered while being efficiently dispersed, and that the number of bacteria can be measured more accurately. From these findings, the present inventors have used a composition containing bromelain, which is a proteolytic enzyme that can be safely applied to humans and animals, so that the living state is reduced while reducing the binding force between mucosal tissue and microorganisms. In the present invention, it is found that the amount of microorganisms collected in the oral cavity can be easily and safely increased and accurate measurement can be performed by collecting the microorganisms in the dispersion and further dispersing the aggregated microbial population. Was completed.
よって、本発明は、ヒト又は動物の口腔などの粘膜部位から微生物を採取し、微生物の菌数を測定する際に、採取方法や前処理法を改良し、対象微生物の検出感度や菌数の測定精度を大幅に改善したものであり、具体的には以下の発明に関する：
（１） ブロメラインを含有することを特徴とする、哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で採取するための組成物。
（２） 哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で高感度に検出する方法において用いられるための、（１）に記載の組成物。
（３） 前記微生物が、カンジダ菌、好気性細菌及び／又は嫌気性細菌である、（１）又は（２）に記載の組成物。
（４） 液体状であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の組成物。
（５） うがい液又は口腔ぬぐい液である、（４）に記載の組成物。
（６） ブロメラインの含有量が、０.０１％〜０.５％であることを特徴とする、（４）又は（５）に記載の組成物。
（７） 固体、顆粒状、パウダー状、又はゲル状であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の組成物。
（８） 液体中に溶解又は懸濁させることにより、（４）〜（６）のいずれか１項に記載の組成物を生成させるための、（７）に記載の組成物。
（９） （１）〜（８）のいずれか１項に記載の組成物を含有する、口腔ぬぐい用器具。
（１０） （１）〜（８）のいずれか１項に記載の組成物を含有する、口腔微生物採取用キット又は口腔微生物検出用キット。
（１１） （１）〜（８）のいずれか１項に記載の組成物を被験者の口腔粘膜と接触させること、及び、当該接触部位に存在する菌を含有するサンプルを採取することを含む、口腔内生存微生物の採取方法。
（１２） （１）〜（８）のいずれか１項に記載の組成物を被験者の口腔粘膜と接触させること、当該接触部位に存在する菌を含有するサンプルを採取すること、当該サンプル中の所望の微生物が増殖する条件で培養すること、増殖した微生物の生菌数を計数することを含む、口腔内生存微生物の測定方法。
（１３） （１２）に記載の口腔内生存微生物の測定方法を用いることを特徴とする、感染症の診断のための情報を提供する方法。
Therefore, the present invention collects microorganisms from mucosal sites such as the oral cavity of humans or animals, and improves the collection method and pretreatment method when measuring the number of microorganisms. The measurement accuracy is greatly improved, and specifically relates to the following inventions:
(1) A composition for collecting microorganisms in a living state from the oral cavity of a mammal, characterized by containing bromelain.
(2) The composition according to (1), which is used in a method of highly sensitively detecting microorganisms from the oral cavity of a mammal.
(3) The composition according to (1) or (2), wherein the microorganism is Candida, an aerobic bacterium, and / or an anaerobic bacterium.
(4) The composition according to any one of (1) to (3), which is liquid.
(5) The composition according to (4), wherein the composition is a gargle or an oral wipe.
(6) The composition according to (4) or (5), wherein the content of bromelain is 0.01% to 0.5%.
(7) The composition according to any one of (1) to (3), which is solid, granular, powder, or gel.
(8) The composition as described in (7) for producing | generating the composition as described in any one of (4)-(6) by making it melt | dissolve or suspend in a liquid.
(9) An oral wiping device containing the composition according to any one of (1) to (8).
(10) An oral microorganism collection kit or oral microorganism detection kit containing the composition according to any one of (1) to (8).
(11) The method includes contacting the composition according to any one of (1) to (8) with the oral mucosa of the subject, and collecting a sample containing bacteria present at the contact site. A method for collecting living microorganisms in the oral cavity.
(12) Contacting the composition of any one of (1) to (8) with the oral mucosa of a subject, collecting a sample containing bacteria present at the contact site, A method for measuring an intraoral viable microorganism, comprising culturing under a condition in which a desired microorganism grows and counting the number of viable microorganisms grown.
(13) A method for providing information for diagnosis of an infectious disease, characterized in that the method for measuring an intraoral viable microorganism described in (12) is used.
よって、本発明は、タンパク分解酵素であるブロメラインを含有する、哺乳動物の口腔内の微生物を生きた状態で採取するための組成物に関する。ブロメラインは、パイナップルなどに含まれるシステインプロテーアーゼであり、根茎由来のステムブロメライン（ＥＣ ３．４．２２．３２）や果実由来のフルートブロメライン（ＥＣ ３．４．２２．３３）を含むが、本発明の目的を達成する限り他のブロメラインであってもよい。 Therefore, this invention relates to the composition for extract | collecting the microorganisms in the oral cavity of a mammal in the living state containing the bromelain which is a proteolytic enzyme. Bromelain is a cysteine protease contained in pineapple and the like, and includes stem bromelain derived from rhizome (EC 3.4.22.32) and flute bromelain derived from fruit (EC 3.4.22.33), Other bromelain may be used as long as the object of the present invention is achieved.
本明細書において、「微生物」とは、真菌及び細菌を含み、ヒト又は動物の口腔粘膜部位に付着する微生物であれば特に限定されるものではなく、例えば、好気性細菌、嫌気性細菌、酵母、カンジダを含む。また、微生物は、病原微生物に限られるものではなく、非病原性共生菌も含む。例えば、微生物として、一般にタンパク分解酵素耐性を示す微生物も含む。 In the present specification, the term “microorganism” includes fungi and bacteria and is not particularly limited as long as it is a microorganism that adheres to the oral mucosa site of humans or animals. For example, aerobic bacteria, anaerobic bacteria, yeast , Including Candida. Microorganisms are not limited to pathogenic microorganisms but also include non-pathogenic symbiotic bacteria. For example, microorganisms that generally exhibit resistance to proteolytic enzymes are also included as microorganisms.
本明細書において、「哺乳動物」とは、ヒト及び動物を含む哺乳動物全般を意味する。本明細書において「動物」とは、ヒト以外の哺乳動物を意味し、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、リス、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、及びヤギ等を挙げることができる。 In the present specification, “mammal” means all mammals including humans and animals. As used herein, “animal” means mammals other than humans, such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, squirrels, rabbits, dogs, cats, monkeys, sheep, pigs, cows, horses, goats, etc. Can be mentioned.
本発明の組成物は哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で採取するために用いられるものである。本明細書において、微生物が生存した状態であるとは、生体の構造又は機能を維持している状態であれば良く、例えば完全な細胞膜を有していることや、ＡＴＰ等の代謝活性があること、及び／又は、増殖活性があることを意味していても良い。 The composition of the present invention is used for collecting microorganisms in a living state from the oral cavity of a mammal. In this specification, the state in which a microorganism is alive may be in a state where the structure or function of a living body is maintained. For example, it has a complete cell membrane or has metabolic activity such as ATP. And / or may mean proliferative activity.
好ましくは、本発明の組成物は哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で高感度に検出する方法において用いられるための組成物である。また、本明細書において、「高感度」とは、ブロメラインを含有しない場合の微生物回収率よりも優れた回収率であることを意味し、たとえば、１．５倍又はそれ以上、１．８倍又はそれ以上、１．９倍又はそれ以上、２倍又はそれ以上であってもよい。 Preferably, the composition of the present invention is a composition for use in a method for detecting microorganisms from the oral cavity of a mammal with high sensitivity. In the present specification, “high sensitivity” means that the recovery rate is superior to the recovery rate of microorganisms when no bromelain is contained, for example, 1.5 times or more, 1.8 times. Alternatively, it may be 1.9 times or more, 2 times or more.
本発明の組成物は、使用態様に合わせて形態を選択することができ、例えば、液体状、スプレー状、クレーム状、ペースト状、固体状、顆粒状、パウダー状、又はゲル状であってもよい。また、本発明の組成物は、その使用態様に応じて、うがい液、又は口腔ぬぐい液とすることができ、あるいは、液体中に溶解又は懸濁させるための形態であってもよい。例えば、本発明の組成物が液体状である場合、ブロメラインの含有量としては、例えば、０.０１％〜０.５％、０．０１〜０．２５％、０．０５〜０．５％、０．０５〜０．２５％とすることができる。 The composition of the present invention can be selected in the form according to the use mode, and may be, for example, liquid, spray, claim, paste, solid, granule, powder, or gel. Good. Moreover, the composition of this invention can be used as a gargle liquid or a mouth-wiping liquid according to the use aspect, or the form for melt | dissolving or suspending in a liquid may be sufficient. For example, when the composition of the present invention is in a liquid form, the bromelain content is, for example, 0.01% to 0.5%, 0.01 to 0.25%, 0.05 to 0.5%. 0.05 to 0.25%.
本明細書において、「口腔ぬぐい用器具」とは、口腔粘膜をぬぐうことにより、該口腔粘膜上の微生物を採取する器具を意味する。一態様において、本発明の口腔ぬぐい用器具は、口腔粘膜と接触する部位の少なくとも一部において本発明の組成物を含む。好ましくは、口腔ぬぐい用器具は、本発明の組成物を液体として含浸した物であり、例えば、綿棒、コットンパフ、又はガーゼを挙げることができる。あるいは、本発明の口腔ぬぐい用器具は、固体状、顆粒状、又はパウダー状の本発明の組成物を含有していてもよい。この場合、必要に応じて該口腔ぬぐい用器具は、水や生理食塩水等の液体に浸してから用いても良い。 In the present specification, the “oral wiping device” means a device that collects microorganisms on the oral mucosa by wiping the oral mucosa. In one aspect, the oral wiping device of the present invention comprises the composition of the present invention at least at a part of the site that comes into contact with the oral mucosa. Preferably, the oral wiping device is a product impregnated with the composition of the present invention as a liquid, and examples thereof include a cotton swab, cotton puff, or gauze. Alternatively, the oral wiping device of the present invention may contain the composition of the present invention in a solid, granular, or powder form. In this case, if necessary, the oral wiper may be used after being immersed in a liquid such as water or physiological saline.
本明細書において、「口腔微生物採取用キット」は、本発明の組成物を備え、必要に応じて、口腔ぬぐい用器具、希釈用の液体、微生物回収用の液体、又は説明書等を備えていても良い。また、「口腔微生物検出用キット」は、本発明の組成物を備え、必要に応じて、口腔ぬぐい用器具、希釈用の液体、微生物回収用の液体、説明書、又は微生物検出用培地や試薬を備えていても良い。ここで、「希釈用の液体」とは、キットに含まれる本発明の組成物が希釈して用いるためのものである場合に、希釈液として使用する液体を意味し、例えば、水、生理食塩水、緩衝液（例えば、ＰＢＳ）などが含まれる。この場合、本発明のキットは、濃縮されたブロメライン組成物を含有する。また、「微生物回収用の液体」とは、キットに含まれる口腔ぬぐい用器具を用いて採取した微生物を液体中に浮遊させて回収する際に使用される液体を意味し、例えば、水、生理食塩水、緩衝液（例えば、ＰＢＳ）、本発明の液体状の組成物などが含まれる。キットに含まれる本発明の組成物及び液体は、それぞれ、チューブ、バイアル、ＰＴＰ包装、アンプル、トレイ、カップ又はチューブ等の容器に収納されていても良い。また、本発明の組成物は、キットに含まれる口腔ぬぐい用器具に含まれていても良い。ただし、キットに備え付けられた口腔ぬぐい用器具は、必ずしも本発明の組成物を含む必要はなく、本発明のキットが口腔ぬぐい用器具と本発明の組成物を別々に有して、使用時に本発明の組成物を口腔ぬぐい用器具に付着又は含浸させて用いるようになっていても良い。 In the present specification, “oral microorganism collection kit” includes the composition of the present invention, and includes an oral wiping device, a liquid for dilution, a liquid for collecting microorganisms, or instructions as necessary. May be. The “oral microorganism detection kit” comprises the composition of the present invention, and if necessary, an oral wiper, a liquid for dilution, a liquid for recovering microorganisms, instructions, or a medium or reagent for detecting microorganisms May be provided. Here, the “dilution liquid” means a liquid used as a diluent when the composition of the present invention contained in the kit is diluted and used, for example, water, physiological saline Water, buffer solution (eg, PBS) and the like are included. In this case, the kit of the present invention contains a concentrated bromelain composition. In addition, the “microorganism recovery liquid” means a liquid used when the microorganisms collected using the oral wiper included in the kit are suspended in the liquid and recovered, for example, water, physiological Saline, buffer solution (for example, PBS), liquid composition of the present invention, and the like are included. The composition and liquid of the present invention contained in the kit may be stored in a container such as a tube, a vial, PTP packaging, an ampoule, a tray, a cup, or a tube, respectively. Moreover, the composition of this invention may be contained in the device for oral wiping included in a kit. However, the oral wiping device provided in the kit is not necessarily required to contain the composition of the present invention, and the kit of the present invention has the oral wiping device and the composition of the present invention separately, and the The composition of the present invention may be used by adhering or impregnating the oral wiping device.
なお、本発明の組成物は、口腔のみならず、鼻腔や膣などの他の粘膜部位において使用することもできる。よって、別の態様において、本発明は、ブロメラインを含有することを特徴とする、哺乳動物の粘膜（例えば、鼻腔粘膜、膣粘膜）から微生物を生存した状態で採取又は検出するための組成物、当該組成物を含有する、粘膜ぬぐい用器具、当該組成物を含有する、粘膜ぬぐい用キットを含む。また、本発明は、前記組成物を被験者の粘膜と接触させること、当該接触部位に存在する菌を含有するサンプルを採取すること、当該サンプル中の所望の微生物が増殖する条件で培養すること、増殖した微生物の生菌数を計数することを含む、粘膜内生存微生物の測定方法をも含む。更に、本発明は、前記粘膜内生存微生物の測定方法を用いることを特徴とする、感染症の診断のための情報を提供する方法を含む。この場合における各種定義・条件や好ましい態様は、口腔の場合についての本明細書の記載がそのまま適用される。この場合の感染症としては、例えば、鼻腔粘膜の場合、急性鼻炎や急性副鼻腔炎といった鼻腔の感染症、又は膣カンジダ症や細菌性膣炎といった膣の感染症を挙げることができる。 The composition of the present invention can be used not only in the oral cavity but also in other mucosal sites such as the nasal cavity and vagina. Thus, in another aspect, the present invention relates to a composition for collecting or detecting microorganisms in a viable state from a mammalian mucosa (eg, nasal mucosa, vaginal mucosa), characterized by containing bromelain, A mucosal wiping device containing the composition and a mucosal wiping kit containing the composition are included. Further, the present invention comprises contacting the composition with the mucous membrane of a subject, collecting a sample containing bacteria present at the contact site, culturing under conditions where desired microorganisms in the sample grow, It also includes a method for measuring intramucosal viable microorganisms, which includes counting the number of viable microorganisms that have proliferated. Furthermore, the present invention includes a method for providing information for diagnosis of infectious diseases, characterized in that the method for measuring viable mucosa in the mucosa is used. For the various definitions, conditions and preferred embodiments in this case, the description in the present specification for the oral cavity is applied as it is. Examples of the infection in this case include nasal infection such as acute rhinitis and acute sinusitis, and vaginal infection such as vaginal candidiasis and bacterial vaginosis.
本発明の組成物が含有するブロメラインは、食品中に含まれるため、哺乳動物は食経験があることから、生体への毒性が低いと考えられる。ブロメラインを含有する液状組成物を用いて直接、口腔内を処理して微生物含有サンプルを回収することによって、回収されたサンプル中の微生物の生菌数を上昇させることができる。その結果、口腔内微生物の検出において、検出率を向上させ、正確な定量を可能とする。特に、感染症の直接の原因となる微生物を特定することを容易とすることで、診断の確度を高めることができる。病態をもたない健常人においても、同様に本発明の組成物を利用することにより検出率が向上し、健常人に常在する微生物の生菌数を正確に把握することができる。また、対象微生物の菌数の測定精度が上がるため、感染症の重症度の診断に際し、より的確な考察を加えることが可能になる。このような効果によって、ヒト又は動物の口腔などの粘膜部位の感染症に対し、より効果的な治療を施すことが可能になる。
また、近年、ヒトの口腔や鼻腔又は膣の粘膜部位に常在する微生物の研究が進み、いくつかの微生物は、感染症の惹起のみならず、その感染によって引き起される免疫系の亢進を介して、糖尿病などの代謝性疾患を悪化させることが分かってきた。したがって、ヒトの口腔や鼻腔又は膣に存在する微生物の検出感度や菌数の測定精度を大幅に改善することにより、ヒトの常在微生物研究をより効率的に行うことができる。なお、副次的な効果として、口腔中の微生物生菌数が減少することになり、歯周病、口腔カンジダ症などに関わる微生物の生菌数を減少することができ、ヒト又は動物の口腔衛生改善効果や健康維持効果、さらには疾病の予防効果に繋がることが期待される。
Since bromelain contained in the composition of the present invention is contained in foods, mammals have a dietary experience, so it is considered that the toxicity to living bodies is low. By directly treating the oral cavity using a liquid composition containing bromelain and collecting a microorganism-containing sample, the number of viable microorganisms in the collected sample can be increased. As a result, in the detection of oral microorganisms, the detection rate is improved and accurate quantification is enabled. In particular, it is possible to increase the accuracy of diagnosis by facilitating the identification of microorganisms that directly cause infectious diseases. Even in a healthy person who does not have a disease state, the detection rate is improved by using the composition of the present invention in the same manner, and the number of viable microorganisms resident in the healthy person can be accurately grasped. In addition, since the measurement accuracy of the number of target microorganisms is increased, more accurate consideration can be added when diagnosing the severity of infectious diseases. Such an effect makes it possible to perform more effective treatment for infections of mucosal sites such as the oral cavity of humans or animals.
In recent years, research on microorganisms resident in human oral cavity, nasal cavity or vaginal mucosa has progressed, and some microorganisms not only cause infectious diseases but also enhance the immune system caused by the infection. It has been found that it exacerbates metabolic diseases such as diabetes. Therefore, human resident microorganism research can be performed more efficiently by greatly improving the detection sensitivity of microorganisms present in the human oral cavity, nasal cavity or vagina and the accuracy of measuring the number of bacteria. As a secondary effect, the number of living microorganisms in the oral cavity decreases, and the number of living microorganisms related to periodontal disease, oral candidiasis, etc. can be reduced. It is expected to lead to hygiene improvement effects, health maintenance effects, and disease prevention effects.
本発明のブロメラインを含有する組成物は、市販のブロメライン粉末を適宜、賦形剤、安定化剤、乳化剤、保存剤、防腐剤、結合剤等の添加物と混合して、液体状、クリーム状、ゲル状などの所望の形態とすることにより得ることができる。例えば、本発明のブロメラインを含有する組成物が液体の場合、市販のブロメライン粉末を水、生理食塩水、又は緩衝液（例えば、ＰＢＳ）中に溶解又は懸濁させることにより得ることができる。または、例えば、固体、顆粒状、パウダー状、又はゲル状のブロメライン原薬を液体中に溶解又は懸濁させることにより、液体状の本発明の組成物を生成させることもできる。 The composition containing bromelain of the present invention is prepared by mixing commercially available bromelain powder with additives such as excipients, stabilizers, emulsifiers, preservatives, preservatives, binders, etc. It can be obtained in a desired form such as a gel. For example, when the composition containing bromelain of the present invention is a liquid, it can be obtained by dissolving or suspending commercially available bromelain powder in water, physiological saline, or a buffer solution (for example, PBS). Alternatively, for example, the liquid composition of the present invention can be produced by dissolving or suspending a solid, granular, powder, or gel bromelain drug substance in a liquid.
本発明のブロメラインを含有することを特徴とする、哺乳動物の口腔から微生物を生存した状態で採取するための組成物が液体の場合、直接、ヒトの口腔の中に入れて３０秒「もぐもぐ」した（本明細書では『うがい』と称する）後、容器に吐き出すことにより微生物を採取することができる。「もぐもぐ」については例えば３〜１０秒、４〜７秒、又は５秒行うことができる。また、うがいを２回以上（例えば、２回、３回）行い、全うがい液から微生物を採取することができる。以下、うがいした後の本発明の組成物を「口腔うがい液」という。 When the composition for collecting microorganisms from a mammal's oral cavity in a liquid state characterized by containing the bromelain of the present invention is liquid, it is put directly into the human oral cavity for 30 seconds. Then (referred to as “gargle” in the present specification), the microorganisms can be collected by discharging into a container. The “mogu mogu” can be performed for 3 to 10 seconds, 4 to 7 seconds, or 5 seconds, for example. Moreover, gargle can be performed twice or more (for example, twice or three times), and microorganisms can be collected from the entire gargle. Hereinafter, the composition of the present invention after gargle is referred to as “oral gargle”.
または、本発明の組成物を含有する口腔ぬぐい用器具で口腔の粘膜部位をぬぐって、ぬぐった部位を微生物回収用の液体中で攪拌し、口腔ぬぐい用器具から付着物を十分に脱離させて微生物を採取することができる。あるいは、本発明の組成物をスプレーやクリーム等により口腔粘膜に予め塗布し、塗布部を別途口腔ぬぐい用器具でぬぐい、口腔ぬぐい用器具のぬぐった部位を微生物回収用の液体中で攪拌し、口腔ぬぐい用器具から付着物を十分に脱離させて微生物を採取してもよい。以下、口腔をぬぐった後の口腔ぬぐい用器具で攪拌し、微生物を回収した液体を「口腔ぬぐい液」という。 Alternatively, the oral mucosa site is wiped with the oral wipe device containing the composition of the present invention, the wiped site is stirred in the liquid for collecting microorganisms, and the deposits are sufficiently detached from the oral wipe device. Microorganisms can be collected. Alternatively, the composition of the present invention is preliminarily applied to the oral mucosa by spraying or cream, the application part is separately wiped with an oral wiper, and the wiped part of the oral wiper is stirred in a liquid for collecting microorganisms, Microorganisms may be collected by sufficiently detaching deposits from the oral wiping device. Hereinafter, a liquid obtained by stirring with an oral wiper after the oral cavity has been wiped and collecting microorganisms is referred to as an “oral wipe”.
得られた口腔うがい液又は口腔ぬぐい液を遠心分離し、沈殿物に２０％牛胎児血清を加えて残っているブロメラインの酵素反応を停止させた後、再度遠心分離して、その沈殿を培地で再懸濁し、ピッペティングもしくはボルテックス震盪等により攪拌した後、得られた懸濁液を生菌数測定用のサンプルとする。サンプルは遠心分離用の容器に入れて遠心分離し、その中に含まれる微生物並びに組織片を沈殿として回収する。 Centrifugation of the oral gargle or oral swab obtained, 20% fetal bovine serum is added to the precipitate to stop the remaining bromelain enzymatic reaction, and then the mixture is centrifuged again. After resuspension and stirring by pipetting or vortex shaking, the obtained suspension is used as a sample for viable count. The sample is placed in a centrifuge container and centrifuged, and the microorganisms and tissue fragments contained therein are collected as a precipitate.
生菌数は、例えば、回収された沈殿物の一定量を、目的の微生物に応じて適宜選択された培地に移し、目的の微生物の増殖に適した温度で一定時間培養し、形成されたコロニー数を計測することにより測定することができる。他にも生存微生物を測定する方法は既に広く知られており、例えば、膜透過性ＤＮＡ染色試薬と、それと異なる色の膜非透過性ＤＮＡ染色試薬を用いることにより、完全な膜を有する微生物を生存微生物として検出する方法（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標） ＢａｃＬｉｇｈｔ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ、サーモフィッサー・サイエンティフィック株式会社）や、微生物のＡＴＰ生成を検出することによりＡＴＰを生成する微生物を生存微生物として検出する方法（例えば、ＢａｃＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ 、プロメガ株式会社；ＲｕｂｙＧｌｏｗ、コスモバイオ株式会社）を採用することもできる。 The number of viable bacteria is, for example, a colony formed by transferring a certain amount of the collected precipitate to a medium appropriately selected according to the target microorganism, culturing at a temperature suitable for the growth of the target microorganism for a certain period of time. It can be measured by measuring the number. Other methods for measuring viable microorganisms are already widely known. For example, by using a membrane-permeable DNA staining reagent and a membrane-impermeable DNA staining reagent of a different color, a microorganism having a complete membrane can be obtained. Method for detecting as a living microorganism (LIVE / DEAD (registered trademark) BacLight Bacterial Viability Kit, Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) and detecting microorganisms that produce ATP by detecting ATP production as a living microorganism (For example, BacTiter-Glo Micro Cell Viability Assay, Promega Corporation; RubyGlow, Cosmo Bio Corporation) can also be employed.
以下に実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。なお、本願明細書全体を通じて引用する文献は、参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。 The present invention will be described in more detail below using examples, but this does not limit the scope of the present invention. References cited throughout the present specification are incorporated herein by reference in their entirety.
以下の実施例においては、食品中に含まれるためヒトを含む哺乳動物に食経験があり、そのため安全性が高いと考えられるタンパク分解酵素を含有するうがい液を用いてうがいした後、当該うがい液中の微生物についてより感度よく菌数を検出する方法を示す。 In the following examples, mammals including humans have dietary experience because they are contained in foods. Therefore, after gargleing with a mouthwash containing a proteolytic enzyme that is considered to be highly safe, the mouthwash A method for detecting the number of bacteria more sensitively with respect to the microorganisms therein is shown.
実施例１． 健常人における口腔ブロメライン入りうがい液を用いた口腔内カンジダ菌数測定
ブロメライン含有うがい液を調製し、直接、ヒトの口腔の中に入れて３０秒うがいして吐き出したうがい液中の微生物の生菌数を測定した。対照として、ブロメライン非含有のうがい液を使用した。具体的には以下の方法で行った。
Example 1. Bacterial count of Candida bacteria in the oral cavity using gargle containing oral bromelain in healthy persons Prepared gargle containing bromelain and put it directly into the oral cavity of humans. Number was measured. As a control, gargle containing no bromelain was used. Specifically, the following method was used.
ブロメライン含有うがい液は、滅菌したリン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中に、終濃度が０．０５％となるようにブロメラインを加えて溶解し、さらに濾過滅菌して調製した。対照うがい液として、滅菌したＰＢＳをブロメライン非含有うがい液として用いた。 The bromelain-containing gargle solution was prepared by adding bromelain to a final concentration of 0.05% in sterile phosphate buffered saline (PBS) and further sterilizing by filtration. As a control gargle, sterile PBS was used as a bromelain free gargle.
被験者１名がブロメライン非含有うがい液（１０ｍｌ）で口内を３０秒「もぐもぐ」うがいした後、該うがい液を滅菌した５０ｍｌ容プラスチック遠心管に吐き出し、３７℃で５分間、恒温槽にて静置した。５分後、０．０５％ブロメライン含有うがい液（１０ｍｌ）で口内を３０秒「もぐもぐ」うがいした後、該うがい液を滅菌した５０ｍｌ容プラスチック遠心管に吐き出し、３７℃で５分間、恒温槽にて静置した。それぞれのうがい液を遠心分離（３，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，室温）し、上清を除いた後、それぞれの沈殿に１ｍｌの２０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えて、ブロメラインの酵素反応を止めた。ピペッティングで十分に懸濁し、懸濁液を広口先端１ｍｌ容チップで１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブに移した。５，０００ｒｐｍ，４℃で１０分間遠心分離し、上清を除いた沈殿に２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（ペニシリン、カナマイシン、及びＨＥＰＥＳ添加；ｐＨ７．２に調整）を加えた。ピペッティングとボルテックス震盪により懸濁した後、懸濁液１００μｌをクロモアガーカンジダ培地に塗抹して３７℃で７２時間培養した。形成された緑色コロニーをカンジダ・アルビカンスとして計測した。得られたコロニー数を沈殿あたりのカンジダ生菌数として算出した。 One test subject gargles the mouth with a bromelain-free gargle solution (10 ml) for 30 seconds, then exhales the gargle solution into a sterilized 50 ml plastic centrifuge tube and leaves it in a thermostatic bath at 37 ° C. for 5 minutes. did. After 5 minutes, gargle the mouth with 0.05% bromelain-containing gargle (10 ml) for 30 seconds, and then spout the gargle into a sterile 50 ml plastic centrifuge tube at 37 ° C for 5 minutes. And left to stand. Each gargle was centrifuged (3,500 rpm, 10 min, room temperature), the supernatant was removed, and 1 ml of 20% fetal calf serum (FCS) was added to each precipitate to stop the bromelain enzymatic reaction. . The suspension was sufficiently suspended by pipetting, and the suspension was transferred to a 1.5 ml Eppendorf tube with a 1 ml tip with a wide-mouthed tip. Centrifugation was performed at 5,000 rpm and 4 ° C. for 10 minutes, and 200 μl of RPMI-1640 medium (added with penicillin, kanamycin, and HEPES; adjusted to pH 7.2) was added to the precipitate from which the supernatant was removed. After suspending by pipetting and vortex shaking, 100 μl of the suspension was smeared on a chromoagar candida medium and cultured at 37 ° C. for 72 hours. The formed green colonies were counted as Candida albicans. The number of colonies obtained was calculated as the number of viable Candida per precipitate.
その結果、ブロメライン含有うがい液中のカンジダ菌生菌数は、ブロメライン非含有うがい液(対照うがい液)のカンジダ生菌数より２．２倍多かった。ブロメライン含有うがい液は、カンジダ菌の検出率を高くする効果があることが示された。 As a result, the Candida viable cell count in the bromelain-containing gargle liquid was 2.2 times greater than the Candida viable cell count in the bromelain-free gargle liquid (control gargle liquid). Bromelain-containing gargle was shown to have an effect of increasing the detection rate of Candida.
実施例２． 健常人における０．０１％及び０．２５％ブロメライン含有うがい液を用いたカンジダ菌数測定
ブロメライン含有うがい液を、滅菌したリン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中に、終濃度が０．０１％又は０．２５％なるようにブロメラインを加えて溶解し、さらに濾過滅菌することにより、０．０１％及び０．２５％ブロメライン入りうがい液を調製した。実施例１と同様にして、うがい及び微生物の回収・検出を行うことにより、うがい液中のカンジダ菌を測定した。
Example 2 Candida count using 0.01% and 0.25% bromelain-containing gargles in healthy individuals Bromineline-containing gargles in sterile phosphate buffered saline (PBS) with a final concentration of 0.01 A gargle containing 0.01% and 0.25% bromelain was prepared by adding bromelain to a concentration of 0.25% or 0.25% and dissolving, and further sterilizing by filtration. In the same manner as in Example 1, gargle and microorganisms were collected and detected to measure Candida bacteria in the gargle.
その結果、被験者２人において、０．０１％ブロメライン含有うがい液中のカンジダ菌生菌数は、ブロメライン非含有うがい液(対照うがい液)のカンジダ生菌数より、１．０４倍及び３．２倍多かった。また、０．２５％ブロメライン含有うがい液中のカンジダ菌生菌数は、ブロメライン非含有うがい液(対照うがい液)のカンジダ生菌数より５.９倍多かった。ブロメライン含有うがい液は、実施例１の０．０５％より５倍薄い濃度においても５倍濃い濃度においてもカンジダ菌の検出率を高くする効果があることが示された。 As a result, in 2 subjects, the number of Candida bacteria in the 0.01% bromelain-containing gargle liquid was 1.04 times and 3.2 times the number of Candida bacteria in the gargle liquid not containing bromelain (control gargle liquid). It was twice as many. In addition, the number of Candida viable bacteria in the 0.25% bromelain-containing gargle was 5.9 times greater than the number of Candida viable bacteria in the bromelain-free gargle (control gargle). It was shown that the bromelain-containing gargle has an effect of increasing the detection rate of Candida bacteria at a concentration five times lower than 0.05% of Example 1 and at a concentration five times higher.
実施例３． 健常人における０．５％ブロメライン入りぬぐい液のカンジダ生菌数測定に及ぼす効果
綿棒あるいは口腔ケア用スポンジ棒を０．５％ブロメライン入りぬぐい液に浸し、これを以て口腔内を擦過して試料を採取した。
Example 3 FIG. Effect of 0.5% bromelain wipes on Candida viable count in healthy volunteers Dip a cotton swab or oral care sponge stick into 0.5% bromelain wipes and use this to scrape the oral cavity to collect samples did.
（綿棒を用いた試験）
具体的には、被験者１人において、綿棒を０．５％ブロメライン入りぬぐい液及び対照ぬぐい液（例えば、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．２））に浸し、浸した綿棒を用いて被験者の舌の右側半分をブロメラインぬぐい液で、左側半分を対照ぬぐい液で擦過（スワブ）して、クロモアガーカンジダ平板培地に塗抹し、３７℃で７２時間培養した。生育したカンジダ菌のコロニーを数えた。
(Test using cotton swab)
Specifically, in one subject, a cotton swab is immersed in a 0.5% bromelain wipe and a control wipe (e.g., phosphate saline buffer (pH 7.2)), and the right side of the subject's tongue is immersed using the soaked cotton swab. One half was rubbed with a bromelain wipe and the left half was swabbed with a control wipe, smeared on a chromoagar candida plate, and cultured at 37 ° C. for 72 hours. The grown Candida colonies were counted.
その結果、ブロメラインぬぐい液では１４個、対照ぬぐい液では９個のコロニーを得た。ブロメラインぬぐい液の方が約１．６倍多く検出することができた。 As a result, 14 colonies were obtained for the bromelain wiping solution and 9 colonies were obtained for the control wiping solution. The bromelain wiping solution was detected approximately 1.6 times more.
（口腔ケア用スポンジ棒を用いた試験）
また、被験者１人において、口腔ケア用スポンジ棒を、それぞれ５０ｍＬ容プラスチック遠心管に入れた１０ｍＬの０．５％ブロメライン入りぬぐい液及び対照ぬぐい液（例えばｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓａｌｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ， ７．２））に浸し、口腔内（歯、歯肉、頬など）をぬぐい、残量のある元の遠心管にもどしてスポンジ棒を管壁に当ててよく絞り出すようにした。その後、遠心分離し、実施例１と同様な方法で処理し、カンジダ生菌数測定を行った。
(Test using a sponge stick for oral care)
Further, in one subject, 10 mL of a 0.5% bromelain wiping solution and a control wiping solution (for example, phosphate saline buffer (pH, 7.2)) were placed in a 50 mL plastic centrifuge tube for each subject. Soaked in the mouth, wiped the inside of the mouth (teeth, gums, cheeks, etc.), returned to the original centrifuge tube with sufficient remaining amount, and squeezed the sponge stick against the tube wall. Then, it centrifuged and processed by the method similar to Example 1, and performed Candida viable count.
その結果、０．５％ブロメライン入りぬぐい液のカンジダ菌生菌数は１９，４８０、及び対照ぬぐい液の生菌数は１４，４８０であり、ブロメライン入りぬぐい液の方が、対照よりも１．３５倍多く回収することができた。 As a result, the viable count of Candida bacteria in the 0.5% bromelain-containing swab was 19,480, and the viable count in the control swab was 14,480. 35 times more could be recovered.
実施例４． 健常人における０．０５％パパイン入りうがい液のカンジダ生菌数測定に及ぼす効果
実施例１の０.０５％ブロメラインの代わりに０.０５％パパインを用いて、実施例１と同様な方法でうがい及び微生物の回収・検出を行うことにより、うがい液中のカンジダ菌を測定した。その結果、被験者１人において、０.０５％パパイン含有うがい液中のカンジダ菌生菌数は１５,４８０であったのに対して、パパイン非含有うがい液（対照うがい液）のカンジダ生菌数は１６,２８０であり、ほとんど変わらなかった。すなわち、パパイン含有うがい液のカンジダ菌の検出率を高くする効果はない、あるいは、あっても弱いことを示している。
Example 4 Effect of gargle containing 0.05% papain on Candida viable count in healthy volunteers Using 0.05% papain instead of 0.05% bromelain in Example 1, gargle in the same manner as in Example 1 In addition, Candida bacteria in the gargle were measured by collecting and detecting microorganisms. As a result, in one test subject, the number of viable Candida bacteria in the 0.05% papain-containing gargle was 15,480, whereas the number of viable Candida bacteria in the papain-free gargle (control gargle). Was 16,280, almost unchanged. That is, it shows that there is no effect of increasing the detection rate of Candida bacteria in the papain-containing gargle, or that it is weak.
実施例５． 健常人における０．０５％ブロメライン含有うがい液を用いた微生物生菌数測定
ブロメライン含有うがい液、及び対照うがい液は実施例１に記載の方法を用いて調整した。健常人３名について実施した。うがいは以下の３通りの方法で行った：（１）１回目は対照うがい液でうがいをし、２回目は、１回目のうがいから５分後に対照うがい液でうがいをする方法、（２）１回目は対照うがい液でうがいをし、２回目は、１回目のうがいから５分後にブロメライン含有うがい液でうがいをする方法、および（３）１回目はブロメライン含有うがい液でうがいをし、２回目は、１回目のうがいから５分後に対照うがい液でうがいをする方法。各うがいの時間は３０秒とした。３通りのうがいはそれぞれ異なる日に、昼食前に行った。それぞれのうがい液１０ｍｌを３７℃にて５分間保温した後４℃で保冷した。検体を二つに分け、検体量の９割をカンジダ生菌数測定に、検体量の１割を細菌生菌数測定に用いた。
Example 5 FIG. Viable microorganism count using 0.05% bromelain-containing gargle in healthy individuals Bromelain-containing gargle and control gargle were prepared using the method described in Example 1. The test was conducted on 3 healthy people. Gargle was performed by the following three methods: (1) The first time gargles with the control gargle and the second time gargles with the control gargle 5 minutes after the first gargle, (2) 1st time gargle with control gargle, 2nd gargle with bromelain-containing gargle 5 minutes after the first gargle, and (3) gargle with bromelain-containing gargle 1 The second time is a method of gargleing with the control gargle 5 minutes after the first gargle. Each gargle time was 30 seconds. The three gargles were on different days before lunch. 10 ml of each gargle was kept at 37 ° C. for 5 minutes and then kept at 4 ° C. The sample was divided into two, 90% of the sample amount was used for Candida viable count measurement, and 10% of the sample amount was used for viable bacterial count measurement.
カンジダ生菌数測定方法：
検体を遠心分離して得られた沈殿に２０％牛胎児血清１ｍｌを加えて懸濁した。得られた懸濁液を、再び遠心分離して、沈殿をＲＰＭＩ１６４０培地（ペニシリン、カナマイシン、及び４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸含有、ｐＨ７．２）で再懸濁し、その懸濁液をカンジダ生菌数測定用のサンプルとした。懸濁液は、必要に応じて希釈して、１００μｌをクロモアガーカンジダ培地に塗抹した。３７℃で７２時間培養後、形成したコロニーをカンジダ・アルビカンスとして計測した。得られたコロニー数を沈殿あたりの生菌数として算出した。
Candida viable count method:
1 ml of 20% fetal calf serum was added to the precipitate obtained by centrifuging the sample and suspended. The resulting suspension was centrifuged again and the precipitate was resuspended in RPMI 1640 medium (containing penicillin, kanamycin, and 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid, pH 7.2), The suspension was used as a sample for measuring Candida viable count. The suspension was diluted as necessary, and 100 μl was smeared on the chromoagar candida medium. After culturing at 37 ° C. for 72 hours, the formed colonies were counted as Candida albicans. The number of colonies obtained was calculated as the number of viable bacteria per precipitate.
細菌生菌数測定方法：
検体を１０倍希釈法で希釈し、適切な希釈液を一般細菌（好気性細菌）および嫌気性細菌生菌数測定用のサンプルとした。５０μｌを普通寒天培地およびＧＡＭ寒天培地に塗抹して３７℃で７２時間培養した。一般細菌および嫌気性細菌のコロニー数を計測した。得られたコロニー数を検体１ｍｌあたりの生菌数として算出した。
Bacteria count method:
The specimen was diluted by a 10-fold dilution method, and an appropriate dilution was used as a sample for measuring the number of viable bacteria (aerobic bacteria) and anaerobic bacteria. 50 μl was smeared on a normal agar medium and a GAM agar medium and cultured at 37 ° C. for 72 hours. The number of colonies of general bacteria and anaerobic bacteria was counted. The number of colonies obtained was calculated as the number of viable bacteria per ml of specimen.
３通りのうがいを行って回収したうがい液中のカンジダ生菌数、一般細菌（好気性細菌）生菌数および嫌気性細菌生菌数について、それぞれ２回目の生菌数を１回目の生菌数で割ってその比を百分率で表した結果を回収率として表２に示した。対照うがい液（ＰＢＳ）で２回うがいした場合は、表２で示したように各菌の回収率は７１〜９３％となり、若干の低下傾向を示すことがわかった。したがって、異なるうがい液の回収率の値が７１〜９３％であれば、対照うがい液と比較して優れた効果は特に認められないことを示す。１００％より大きい回収率は生菌数が増加していることを意味するため、回収された生菌数が増加する効果を有することを示し、反対に７１％より小さい回収率は生菌数が減少していることを意味するため、回収された生菌数が減少する効果を有することを示す。このように、対照うがい液（ＰＢＳ）で２回うがいした場合を対照として、ブロメライン含有うがい液の効果を評価した。１回目のうがいを対照うがい液（ＰＢＳ）で行い、２回目のうがいをブロメライン含有うがい液行い、各うがい液を回収及び測定した結果、その比は１６０〜２３０％（平均値は約２００％（２倍））となりブロメラインを含有することによって回収率が上昇した。１回目のうがいをブロメライン含有うがい液で行い、２回目のうがいを対照うがい液（ＰＢＳ）で行い、各うがい液を回収及び測定した結果、その比は１７〜３３％（平均値は約２５％）となり、極端に２回目のうがいにおける生菌数が低下した。いずれの結果も３種の微生物においてブロメライン含有うがい液の生菌回収効率が高いことを示した。 The number of viable Candida, the number of viable bacteria (aerobic bacteria) and the number of anaerobic bacteria in the gargle liquid collected by performing three types of gargles is the first viable count. The result of dividing by the number and expressing the ratio as a percentage is shown in Table 2 as the recovery rate. When gargled twice with the control gargle solution (PBS), as shown in Table 2, the recovery rate of each bacterium was 71 to 93%, indicating a slight downward tendency. Therefore, if the value of the recovery rate of different gargles is 71 to 93%, it indicates that an excellent effect is not particularly recognized as compared with the control gargle. A recovery rate of greater than 100% means that the number of viable bacteria has increased, indicating that the number of viable cells recovered has the effect of increasing. This means that the number of viable bacteria collected has an effect of decreasing because it means a decrease. As described above, the effect of the bromelain-containing gargle was evaluated using the case where the gargle was rinsed twice with the control gargle (PBS). The first gargle was treated with a control gargle (PBS), the second gargle was treated with bromelain-containing gargle, and each gargle was collected and measured. As a result, the ratio was 160-230% (the average value was about 200% ( (2 times)) and the bromelain content increased the recovery rate. The first gargle was performed with bromelain-containing gargle, the second gargle was performed with a control gargle (PBS), and each gargle was collected and measured. As a result, the ratio was 17 to 33% (the average value was about 25%). The number of viable bacteria in the second gargle was extremely reduced. All the results showed that the viable bacteria recovery efficiency of the bromelain-containing gargle was high in the three types of microorganisms.
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