JP2017214308A - 放射性医薬組成物、及び、放射能標識抗体のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
本発明において「放射能標識抗体」とは、放射性核種を標識したモノクローナル抗体である。
本発明の一の態様である、放射能標識抗体のスクリーニング方法は、少なくとも評価ステップ(a)及び選択ステップ(b)の2ステップを含むものである。
本発明の一態様である放射性医薬組成物は、腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体を有効成分として含むものである。本発明において「腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体」とは、対象患者の腹腔内で転移した腫瘍細胞に対する抗体結合性が高いものをいい、かかる抗体結合性は、前述したスクリーニング方法を用いて評価することができる。また、本発明における「腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体」は、前述したスクリーニング方法を用いて選択することができる。
セツキシマブは、メルクセローノ株式会社から入手した「アービタックス(登録商標)注射液100mg」を用いた。
トラスツズマブは、中外製薬株式会社から入手した「ハーセプチン(登録商標)注射用150」を用いた。
3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]-pentadeca-1(15),11,13-trience-3,6,9-triacetic acid(PCTA)は、Macrocyclics, Inc.から入手した。
64Cuは、McCarthyらの方法(Nuclear medicine and biology,vol.24,1997,pp.35-43)及びObataらの方法(Nuclear medicine and biology,vol.30,2003,pp.535-539)に準じて製造・精製した。
ヒト大腸がん細胞(HCT116)のRFP過剰発現株(HCT116−RFPは、Yoshii et al 2016 International Journal of Oncology, vol.48, pp.1477-1484 4に従い作製した。
マウスは、日本エスエルシー株式会社から入手したBALB/c Slc−nu/nu(雌性)、6週齢のものを使用した。
標識は、以下の様な条件で行った。まず、セツキシマブ溶液(「アービタックス(登録商標)注射液100mg」そのまま)をホウ酸緩衝液(0.05mol/L,pH8.5)にbuffer置換し、2mg/mLに濃度調節を行った。その後、PCTAを5等量になるよう混合し、37°Cで一昼夜反応させた。その後、得られたセツキシマブ−PCTA溶液を0.1mol/Lクエン酸アンモウム緩衝液(pH5.5)にbuffer置換し、2mg/mLに濃度を調節した。得られた溶液に、0.1mol/Lクエン酸アンモウム緩衝液(pH5.5)で溶解した64Cuを加え、40℃で60分間反応させ、セツキシマブ−PCTA結合体に64Cuを標識した。必要があれば、標識後の64Cu標識放射性抗体をゲルろ過カラムで精製し、その後、以下に条件を示すラジオTLCにより純度検定試験を行い、放射化学的純度95%以上の64Cu標識放射性抗体を得た。
<ラジオTLCによる純度検定試験>
TLCプレート:シリカゲルプレート(製品名:Silica gel60、メルク株
式会社製)
展開相:80%メタノール
検出:フルオロイメージアナライザー(形式:FLA−7000,富士フイルム株式会社製)
標識は、以下の様な条件で行った。まず、「ハーセプチン(登録商標)注射用150」のトラスツズマブ含有バイアルにハーセプチン濃度が6mg/Lになるように生理食塩液を加えてトラスツズマブ溶液を調製した。このトラスツズマブ溶液をホウ酸緩衝液(0.05mol/L,pH8.5)にbuffer置換し、2mg/mLに濃度調節を行った。その後、PCTAを5等量になるよう混合し、37℃で一昼夜反応させた。その後、得られたトラスツズマブ−PCTA溶液を0.1mol/Lクエン酸アンモニウム緩衝液(pH5.5)にbuffer置換し、2mg/mLに濃度を調節した。得られた溶液に、0.1mol/Lクエン酸アンモニウム緩衝液(pH5.5)で溶解した64Cuを加え、40℃で60分間反応させ、トラスツズマブ−PCTA結合体に64Cuを標識した。必要があれば、標識後の64Cu標識放射性抗体をゲルろ過カラムで精製し、その後、実施例1に示す条件と同じラジオTLCにより純度検定試験を行い、放射化学的純度95%以上の64Cu標識放射性抗体を得た。
正常マウスに対し、実施例1に示す方法に従って合成した64Cu標識セツキシマブ(3.7MBq/20μg/100μL)を尾静脈又は腹腔内に投与した。投与後、3時間、6時間、18時間、24時間、48時間後にマウスを犠牲死させ、各臓器を摘出した。摘出した臓器の重量を計測した他、放射能をγカウンターで測定し、放射能濃度(%ID/g)を決定した。
ヒト大腸がん細胞(HCT116)のRFP過剰発現株(HCT116−RFP)を用い、腹膜播種モデルを作成した。本検討で使用したモデルは、HCT116−RFP細胞(3×106細胞)を500μL PBSに溶解し、マウス腹腔内に移植し、1週間経たものを使用した。作製したモデルマウス4匹に対し、実施例1に示す方法に従って合成した64Cu標識セツキシマブ(3.7MBq/20μg/100μL)を尾静脈又は腹腔内にそれぞれ投与した。3時間、6時間、18時間、24時間、48時間後に、マウスを犠牲死させ、蛍光実体顕微鏡で確認しながら腫瘍(2−3mm前後)を取り出し、OCTコンパウンドを用い、凍結切片(8μm)を作成した。同様に、100%ID/g、50%ID/g、25%ID/g、12.5%ID/g、6.25%ID/g、3.13%ID/gとなるように作成した標準サンプル(20%ゼラチン中)でも切片(標準切片)を作成した。腫瘍切片、標準切片ともに、イメージングプレートを使用し、オートラジオグラフィーイメージを得た。標準切片のシグナル強度から、検量線を作成し、腫瘍切片における放射能濃度(%ID/g)を計算した。なお、本法で腫瘍臓器(肝臓・腎臓・筋肉)についても放射能濃度を測定したが、γカウンターで決定した放射能濃度とほぼ一致していた。
ヒト大腸がん細胞(HCT116)細胞のRFP過剰発現株(HCT116−RFP)を用い、64Cu標識セツキシマブ並びに64Cu標識トラスツズマブの結合性を評価した。HCT116−RFP細胞(1×106細胞/mL)に実施例1に示す方法に従って合成した64Cu標識セツキシマブ、及び、実施例2に示す方法に従って合成した64Cu標識トラスツズマブを各々14.8kBqずつ加え、1時間氷上で反応させた後、遠心後細胞を回収した。直ちに、PBSで細胞を洗浄し、得られた細胞を1mLのPBSに溶解し、γカウンターを用いて放射能を測定し、細胞に結合した放射能の割合を算出した。
HCT116−RFP細胞を移植した腹膜播種モデルを使用し、64Cu標識セツキシマブ及び64Cu標識トラスツズマブを用いた放射免疫治療実験を行った。
ヒト大腸がん細胞(HCT116)細胞のRFP過剰発現株(HCT116−RFP)を用い、腹膜播種モデルを作成した。本検討で使用したモデルは、HCT116−RFP細胞(0.5×106細胞)を500μL PBSに溶解し、マウス腹腔内に移植し、1週間経たものを使用した。作製したモデルマウスに対し、実施例1に示す方法に従って合成した64Cu標識セツキシマブ、又は、実施例2に示す方法に従って合成した64Cu標識トラスツズマブを腹腔内投与(22.2MBq/20μg/100μL)し、投与日を治療開始0日目として治療を行い、治療効果を生理食塩水を同様に投与したコントロール群と比較した。また、放射性標識していない抗体を用いた既存の分子標的治療の効果と比較する目的で、セツキシマブ投与群(1mg/kg,実験期間中週2回投与)、並びにトラスツズマブ投与群(1mg/kg,実験期間中週2回投与)の検討も行った。治療経過は、RFPシグナルを蛍光イメージング装置(IVIS)で計測したほか、体重測定・マウス全身状態の観察を経時的に行った。腹部の膨張、治療開始0日目の体重に対し20%を超える体重減少、全身虚弱をエンドポイントの指標とした。
図5に示すとおり、64Cu標識セツキシマブによる内照射治療では、コントロール群と比較し、腫瘍の増殖が抑制されていることが明らかとなった。64Cu標識トラスツズマブによる内照射治療、並びに、セツキシマブ及びトラスツズマブによる分子標的治療では、コントロール群と比較し、有意差は見られなかった。
また、図6に示すとおり、64Cu標識セツキシマブ投与群では、生存が有意に延長されていた(P<0.05)。一方、64Cu標識トラスツズマブ投与群及びその他の群は、コントロール群と比較し、有意差は見られなかった。
これにより、抗体結合性事前診断により結合性が高かった64Cu標識セツキシマブが腹膜播種モデルにおいて高い治療効果を有することが示された。また、その効果は既存の分子標的治療よりも高かった。
ヒト大腸がん細胞(HCT116)のRFP過剰発現株(HCT116−RFP)を用い、腹膜播種モデルを作成した。本検討で使用したモデルは、HCT116−RFP細胞(1×107細胞)を50μL PBSに溶解し、50μLのマトリゲルと混合したうえで、マウス腹腔内に移植することで作成した。マウスA,Bについては下腹部脊椎付近に、マウスCについては腹腔中心部に移植した。1週間後、実施例1に示す方法に従って合成した64Cu標識セツキシマブを腹腔内投与し(7.4MBq/20μg/100μL)、24時間後PETガイド下手術を行い、術中迅速診断が可能か評価した(図7)。PETガイド下手術には、OpenPET(登録商標)(Yamaya et al. IEEE 2013, Tashima IEEE 2012他,WO2012−164664他)を使用した。
正常マウスに、実施例1に示す方法に従って合成した64Cu標識セツキシマブ(7.4MBq/20μg/100μL)を正常マウスに腹腔内投与し、24時間後にPET撮像により画像を取得した。
HCT116−RFP細胞を移植し病気が進行した進行性腹膜播種モデルを使用し、64Cu標識セツキシマブを用いたリアルタイムPET手術と放射免疫治療の組み合わせ使用による効果を検討した。
本検討では、ヒト大腸がん細胞(HCT116)細胞のRFP過剰発現株(HCT116−RFP)を用い、進行性腹膜播種モデルを作成した。本検討で使用したモデルは、HCT116−RFP細胞(0.5×106細胞)を500μL PBSに溶解し、マウス腹腔内に移植し、4週間経たものを使用した。作製したモデルマウスを、(i)64Cu−PETガイド下手術群(診断容量の64Cu標識セツキシマブを投与し、24h後にPETガイド下で開腹・腫瘍摘出を行い、閉腹を行う)、(ii)64Cu−PETガイド下手術+放射免疫治療群(治療容量の64Cu標識セツキシマブを投与し、48時間後にPETガイド下で開腹・腫瘍摘出を行い、閉腹を行う)、(iii)偽手術群(64Cu−PETガイド下手術群・64Cu−PETガイド下手術+放射免疫治療群と同様に手術を行うがPETガイドは行わない、64Cu標識セツキシマブは投与しない)に分け検討を行った。(i)は、診断容量の64Cu標識セツキシマブ(7.4MBq/20μg/100μL)を、(ii)治療容量の64Cu標識セツキシマブ(22.2MBq/20μg/100μL)をそれぞれ腹腔内投与した。また、(iii)では生理食塩水を同様に投与した。各群の投与日を治療開始0日目とした。治療経過は、RFPシグナルを蛍光イメージング装置(IVIS)で計測したほか、体重測定・マウス全身状態の観察を経時的に行った。腹部の膨張、治療開始0日目に比較して20%を超える体重減少、全身虚弱をエンドポイントの指標とした。
これらの検討から、64Cu標識セツキシマブを用いた放射免疫治療と術中迅速診断法の組み合わせは、進行性腹膜播種に有用であることが示された。
Claims (9)
- 腹腔内転移した腫瘍細胞に発現する抗原に対して特異的な放射能標識抗体を有効成分として含む、腹腔内腫瘍を治療するための放射性医薬組成物。
- 前記放射能標識抗体は、放射性銅で標識されたモノクローナル抗体である、請求項1に記載の放射性医薬組成物。
- 前記放射能標識抗体は、二官能性キレート剤を用いて、前記放射性銅で前記モノクローナル抗体を標識したものである、請求項2に記載の放射性医薬組成物。
- 前記二官能性キレート剤が、3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]-pentadeca-1(15),11,13-trience-3,6,9-triacetic acid(PCTA)である、請求項3に記載の放射性医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗体は、抗上皮成長因子受容体(EGFR)抗体又は抗ヒトEGFR関連物質2(HER2)抗体である、請求項2乃至4いずれか一項に記載の放射性医薬組成物。
- 前記モノクローナル抗体は、セツキシマブ又はトラスツズマブである、請求項5に記載の放射性医薬組成物。
- 腹腔内投与されるための、請求項1乃至6いずれか一項に記載の放射性医薬組成物。
- 腹腔内投与した後、前記放射能標識抗体から放出される放射線を体外より検出しながら腹腔内腫瘍を切除するために用いられる、請求項7に記載の放射性医薬組成物。
- 一以上の放射能標識抗体を用いて、患者の腹腔内より採取した腫瘍細胞に対する、前記放射能標識抗体の結合性を評価するステップと、
前記腫瘍細胞に対する前記放射能標識抗体の結合性に基づいて、前記放射能標識抗体の少なくとも一つを腹腔内腫瘍の治療薬の有効成分として選択するステップと、
を含む、放射能標識抗体のスクリーニング方法。
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---|---|---|---|---|
WO2022230390A1 (ja) * | 2021-04-27 | 2022-11-03 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 | 放射性医薬組成物の中間体の保存方法、放射性医薬組成物の調製または保存方法、放射性医薬組成物の中間体組成物、および、医薬製剤 |
KR20230163487A (ko) | 2021-03-31 | 2023-11-30 | 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 | 항egfr 항체의 방사성 복합체 및 방사성 의약 |
WO2024058201A1 (ja) * | 2022-09-16 | 2024-03-21 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 | 放射性医薬組成物の中間体の製造方法、放射性医薬組成物の中間体の精製用キット |
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2016
- 2016-05-31 JP JP2016108057A patent/JP2017214308A/ja active Pending
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WO2022230390A1 (ja) * | 2021-04-27 | 2022-11-03 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 | 放射性医薬組成物の中間体の保存方法、放射性医薬組成物の調製または保存方法、放射性医薬組成物の中間体組成物、および、医薬製剤 |
WO2024058201A1 (ja) * | 2022-09-16 | 2024-03-21 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 | 放射性医薬組成物の中間体の製造方法、放射性医薬組成物の中間体の精製用キット |
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