JP2017197509A - Resin-fixed peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新規の樹脂固定ペプチドに関する。 The present invention relates to a novel resin-immobilized peptide.
皮膚感作性物質は生体の感受性によっては重篤なアレルギー反応を誘発する。したがって、医薬品、農薬、食料品、化粧品、及び洗剤等の開発において、その原料や添加剤、最終製品等には皮膚感作性物質が含まれていないことが要求されており、これを確認する方法として種々の皮膚感作性試験が報告されている。 Skin sensitizers can cause serious allergic reactions depending on the sensitivity of the body. Therefore, in the development of pharmaceuticals, agricultural chemicals, foodstuffs, cosmetics, detergents, etc., it is required that the raw materials, additives, final products, etc. are free of skin sensitizing substances. Various skin sensitization tests have been reported as methods.
これらの皮膚感作性試験としては、被験物質を実験動物に適用する試験である、Maximization試験、Buehler試験、Local Lymph Node Assay等が挙げられる。しかし、この様な試験においては、実験動物の飼育及び管理等の必要があるだけでなく、皮膚観察等の作業が煩雑である等の問題があった。また、動物愛護の観点からも代替し得る方法を見出すことが求められていた。 Examples of these skin sensitization tests include a Maximization test, a Buehler test, and a Local Lymph Node Assay, which are tests in which a test substance is applied to an experimental animal. However, in such a test, there are problems such as not only the need for breeding and management of experimental animals but also complicated work such as skin observation. In addition, it has been required to find an alternative method from the viewpoint of animal welfare.
この様な問題を解決する方法として、DPRA（Direct Peptide Reactivity Assay）等のペプチド結合性を指標にするin vitroの試験系が開発されている（非特許文献１〜３）。この試験法は、皮膚感作性物質との結合性を有するペプチドを試薬として用い、被験物質と混合した後、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて混合前後のペプチド減少率を算出することで、被験物質に含まれる皮膚感作性物質の有無を評価するものである。 As a method for solving such a problem, an in vitro test system using a peptide binding property as an index such as DPRA (Direct Peptide Reactivity Assay) has been developed (Non-Patent Documents 1 to 3). This test method uses a peptide having a binding property to a skin sensitizer as a reagent, and after mixing with a test substance, the peptide decrease rate before and after mixing is calculated using HPLC chromatography to determine the test substance. The presence or absence of the contained skin sensitizer is evaluated.
しかしながら、これらの試験系では、水に対する溶解性が低い被験物質は試験そのものが実施できないといった問題があった。また、検定試薬（ペプチド）にはシステイン残基を含むものがあり、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することにより皮膚感作性物質との結合性が消失するため、皮膚感作性試験の精度が低下するといった問題があった。さらに、ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて混合前後のペプチド減少率を算出する際、被験物質（の一部）がペプチドと溶出時間が重なることがあり、正確なペプチド減少率を算出する事ができないといった問題があった。 However, these test systems have a problem that the test itself cannot be performed on a test substance having low solubility in water. In addition, some test reagents (peptides) contain cysteine residues, and due to the formation of disulfide bonds between the peptides, the binding to skin sensitizers disappears. There was a problem of a drop. Furthermore, when calculating the peptide decrease rate before and after mixing using HPLC chromatography, the elution time may overlap with the peptide (part of the test substance), and the exact peptide decrease rate cannot be calculated. was there.
従って、本発明の目的は、種々の被験物質に対して適応可能であり、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を検定する方法に用いることができる樹脂固定ペプチド、及びこれを含む試薬を提供することである。また、本発明では、樹脂固定ペプチドを含む皮膚感作性物質除去剤を提供する。 Therefore, the object of the present invention is adaptable to various test substances, and is a resin-immobilized peptide that can be used in a method for assaying skin sensitization of a test substance simply and quickly with higher accuracy, and It is to provide a reagent containing the same. Moreover, in this invention, the skin sensitizer removal agent containing a resin fixed peptide is provided.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、特定の樹脂固定ペプチドを用いて被験物質の皮膚感作性の検定を行った場合、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を検定できることを見出し、本発明を完成させた。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor conducted a test of the skin sensitization of a test substance using a specific resin-immobilized peptide, and the test substance was easily and quickly obtained with higher accuracy. The present inventors have found that skin sensitization can be assayed and completed the present invention.
すなわち、本発明では、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチドを提供する。 That is, the present invention provides a resin-immobilized peptide in which a peptide having a binding ability to a skin sensitizer and a resin are bound via a cleavage linker.
前記の皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドは、リジン残基を１個以上含むペプチドであるか、又はシステイン残基を１個以上含むペプチドであることが好ましい。 The peptide having the ability to bind to the skin sensitizer is preferably a peptide containing one or more lysine residues or a peptide containing one or more cysteine residues.
前記の切断リンカーは、光、又はアルカリ切断リンカーであることが好ましい。 The cleavage linker is preferably light or an alkali cleavage linker.
前記の切断リンカーは、前記の皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドのＣ末端のアミノ酸の側鎖を介して樹脂と結合することが好ましい。 The cleavage linker is preferably bonded to the resin via the side chain of the C-terminal amino acid of the peptide capable of binding to the skin sensitizer.
また、本発明では、下記式（２）で表される樹脂固定ペプチドを提供する。
（式中、Ｐはリジン残基を１個以上含むペプチド又はシステイン残基を１個以上含むペプチドを示す。Ｌ’は２価の炭化水素基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、カルボニル基、又はこれらの２以上が結合した２価の基を示す。Ｒは樹脂を示す。）
Moreover, in this invention, the resin fixed peptide represented by following formula (2) is provided.
(In the formula, P represents a peptide containing one or more lysine residues or a peptide containing one or more cysteine residues. L ′ represents a divalent hydrocarbon group, an ether bond, a thioether bond, an ester bond, an amide bond, A carbonyl group, or a divalent group in which two or more of these are bonded, R represents a resin.)
また、本発明では、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される樹脂固定ペプチドを提供する。
（式中、Ｒは樹脂を示す。）
In addition, the present invention provides a resin-immobilized peptide represented by the following formula (I) or (II).
(In the formula, R represents a resin.)
また、本発明では、前記の樹脂固定ペプチドを含む被験物質の皮膚感作性の検定試薬を提供する。 Moreover, in this invention, the test reagent of the skin sensitization property of the to-be-tested substance containing the said resin fixed peptide is provided.
また、本発明では、前記の樹脂固定ペプチドを含む皮膚感作性物質除去剤を提供する。 Moreover, in this invention, the skin sensitizer removal agent containing the said resin fixed peptide is provided.
本発明により、種々の被験物質に対して適応可能であり、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を検定する方法に用いられる樹脂固定ペプチド、及びこれを含む試薬を提供することができる。また、本発明により、樹脂固定ペプチドを含む皮膚感作性物質除去剤を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, there are provided a resin-immobilized peptide that can be applied to various test substances, and that is used in a method for assaying skin sensitization of a test substance with high accuracy in a simple and rapid manner, and a reagent containing the same. can do. In addition, according to the present invention, a skin sensitizer removal agent containing a resin-immobilized peptide can be provided.
本発明では、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドと樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチド（以下、「樹脂固定ペプチド」と称する場合がある）を用いることにより、種々の被験物質に対して適応可能であり、簡便かつ迅速に、さらに高い精度で被験物質の皮膚感作性を検定することができる。なお、樹脂固定ペプチドは本発明の被験物質の皮膚感作性の検定方法（以下、「本発明の検定方法」と称する場合がある）における試薬（以下、「本発明の検定試薬」と称する場合がある）として用いることができる。つまり、本発明では樹脂固定ペプチドを含む試薬を用いて被験物質の皮膚感作性を検定することができる。 In the present invention, by using a resin-immobilized peptide (hereinafter sometimes referred to as “resin-immobilized peptide”) in which a peptide having a binding ability to a skin sensitizer and a resin are bonded via a cleavage linker, Therefore, it is possible to test the skin sensitization property of the test substance with higher accuracy in a simple and rapid manner. The resin-immobilized peptide may be referred to as a reagent (hereinafter referred to as “the assay reagent of the present invention”) in a test method for skin sensitization of the test substance of the present invention (hereinafter sometimes referred to as “the assay method of the present invention”). Can be used). That is, in the present invention, the skin sensitization property of the test substance can be assayed using a reagent containing a resin-immobilized peptide.
＜被験物質の皮膚感作性の検定方法＞
本発明の検定方法は、樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することを特徴とする。
<Test method for test substance skin sensitization>
The assay method of the present invention is characterized in that after a test substance is brought into contact with a resin-immobilized peptide, the presence or absence of binding between the peptide and the test substance is measured.
被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させることで、被験物質に含まれる皮膚感作性物質が樹脂固定ペプチドのペプチド部位と反応・結合し、結合物が生じる。一方、被験物質に皮膚感作性物質が含まれない場合は、前記の結合物は生じない。本発明は、この様な結合の有無（結合物の有無）を測定することで、被験物質に皮膚感作性物質が含まれるか否かを判断するものである。 When the test substance contains a skin sensitizing substance, the skin sensitizing substance contained in the test substance reacts and binds to the peptide site of the resin-fixed peptide by bringing the resin-fixed peptide into contact with the test substance. A bond is formed. On the other hand, when the test substance does not contain a skin sensitizing substance, the above-mentioned conjugate does not occur. The present invention determines whether or not a test substance contains a skin sensitizing substance by measuring the presence or absence of such binding (the presence or absence of a bound substance).
なお、前記の樹脂固定ペプチドに被験物質を接触させた後、前記の樹脂固定ペプチドのリンカー部を切断し、生成したペプチド部位を含む化合物について、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定してもよい。また、ペプチドと被験物質との結合の有無を、クロマトグラフィー法を用いて測定してもよい。 After contacting the test substance with the resin-immobilized peptide, the linker portion of the resin-immobilized peptide is cleaved, and the compound containing the generated peptide site is measured for the presence or absence of binding between the peptide and the test substance. Also good. Moreover, you may measure the presence or absence of the coupling | bonding of a peptide and a test substance using a chromatography method.
本発明の検定方法は、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させた後、その混合物から、樹脂固定ペプチド及び／又は樹脂固定ペプチドと被験物質（皮膚感作性物質）との結合物を分離し、得られた樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）のリンカー部を切断し、切断により生じたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）を分離した後、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定することを特徴としてもよい。 In the assay method of the present invention, for example, a resin-immobilized peptide and a test substance are brought into contact, and then, a mixture of the resin-immobilized peptide and / or the resin-immobilized peptide and the test substance (skin sensitizer) is obtained from the mixture. After separating and cleaving the linker part of the obtained resin-fixed peptide (including those bound to the test substance), and separating the compound containing the peptide site (including those bound to the test substance) generated by the cleavage, The presence or absence of binding between the peptide and the test substance may be measured.
つまり、本発明の検定方法では、下記の工程Ａ〜工程Ｅを含んでいてもよい。
工程Ａ：樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させる工程
工程Ｂ：工程Ａにより得られた混合物から、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）を分離する工程
工程Ｃ：工程Ｂで分離した樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）のリンカー部を切断する工程
工程Ｄ：工程Ｃにて生じたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）を分離する工程
工程Ｅ：工程Ｄにて分離されたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）について、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定する工程
That is, the test method of the present invention may include the following steps A to E.
Step A: Step of bringing the resin-immobilized peptide into contact with the test substance Step B: Separating the resin-immobilized peptide (including those bound to the test substance) from the mixture obtained in Step A Step C: Separation at Step B The step of cleaving the linker part of the resin-immobilized peptide (including those bound to the test substance) Step D: The step of separating the compound (including that bound to the test substance) containing the peptide site generated in Step C E: A step of measuring the presence or absence of binding between the peptide and the test substance for the compound containing the peptide site separated in Step D (including those bound to the test substance)
［工程Ａ］
本発明の検定方法における工程Ａは、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させる工程である。本工程において、被験物質に皮膚感作性物質が含まれる場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させることにより、樹脂固定ペプチドのペプチド部位と皮膚感作性物質とが結合することとなる。接触させる方法としては、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを溶媒中で混合させる方法が挙げられる。また、混合した後に静置する工程を有していても良い。
[Step A]
Step A in the assay method of the present invention is a step of bringing the resin-immobilized peptide into contact with the test substance. In this step, if the test substance contains a skin sensitizing substance, the peptide site of the resin-fixed peptide and the skin sensitizing substance are bound by bringing the resin-fixed peptide into contact with the test substance. . Examples of the contacting method include a method in which a resin-immobilized peptide and a test substance are mixed in a solvent. Moreover, you may have the process of leaving still after mixing.
工程Ａにおける接触時間は特に限定されないが、１分〜１２０時間程度が好ましく、より好ましくは５分〜４８時間程度、さらに好ましくは１０分〜３６時間程度である。工程Ａにおける温度（反応温度）は０〜１００℃程度が好ましく、より好ましくは１０〜６０℃程度、さらに好ましくは２０〜４０℃程度である。 The contact time in step A is not particularly limited, but is preferably about 1 minute to 120 hours, more preferably about 5 minutes to 48 hours, and still more preferably about 10 minutes to 36 hours. The temperature (reaction temperature) in step A is preferably about 0 to 100 ° C, more preferably about 10 to 60 ° C, and still more preferably about 20 to 40 ° C.
工程Ａにおいて使用される溶媒としては、被験物質を溶解することが可能なものであれば特に限定されず、例えば、水、リン酸ナトリウム、酢酸アンモニウム等の水性緩衝液、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒を用いることができる。有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）、２−ピロリドン、アセトニトリル、アセトン、クロロホルム、ヘキサン、シクロヘキサン、オリーブ油等植物油、炭素数１〜４の一価のアルコール等が挙げられる。炭素数１〜４の一価のアルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール等が挙げられる。これらの溶媒は１種又は２種以上を選択して使用することもできる。 The solvent used in step A is not particularly limited as long as it can dissolve the test substance. For example, water, an aqueous buffer such as sodium phosphate and ammonium acetate, an organic solvent, or these solvents A mixed solvent can be used. Examples of the organic solvent include dimethyl sulfoxide (DMSO), N, N-dimethylformamide (DMF), N, N-dimethylacetamide (DMAc), N-methyl-2-pyrrolidone (NMP), 2-pyrrolidone, acetonitrile, acetone, Examples include vegetable oils such as chloroform, hexane, cyclohexane and olive oil, and monohydric alcohols having 1 to 4 carbon atoms. Examples of the monovalent alcohol having 1 to 4 carbon atoms include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, and isobutanol. These solvents may be used alone or in combination of two or more.
［工程Ｂ］
本発明の検定方法における工程Ｂは、工程Ａにて得られた混合物から、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）を分離する工程である。工程Ｂにおける分離方法としては、例えば、遠心分離、フィルターろ過による分離、磁性ビーズを利用した分離等が挙げられる。なお、工程Ｂにて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。
[Step B]
Step B in the assay method of the present invention is a step of separating the resin-immobilized peptide (including those bound to the test substance) from the mixture obtained in Step A. Examples of the separation method in Step B include centrifugation, separation by filter filtration, separation using magnetic beads, and the like. In addition, the solvent used at the process B is not specifically limited, For example, what was illustrated at the process A can be used.
遠心分離は、工程Ａを経て得られた混合物を遠心分離に付すことで、混合物中の樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）と、樹脂固定ペプチドとは結合していない被験物質とを分離する方法である。例えば、前記の混合物を遠心分離に付した後に上清を取り除くことで、前記の樹脂固定ペプチドを高い純度で得ることができる。 Centrifugation involves subjecting the mixture obtained through step A to centrifugation, so that the resin-immobilized peptide (including those bound to the test substance) in the mixture and the test substance not bound to the resin-immobilized peptide Is a method of separating. For example, the resin-immobilized peptide can be obtained with high purity by removing the supernatant after centrifuging the mixture.
フィルターろ過による分離は、工程Ａを経て得られた混合物をフィルターろ過に付すことで、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）と、樹脂固定ペプチドとは結合していない被験物質とをサイズの大小によって分離する方法であり、これらのサイズの差が大きい場合に特に有効である。例えば、前記の混合物をフィルターろ過に付すことにより、前記の樹脂固定ペプチドを高い純度で得ることができる。 Separation by filter filtration is performed by subjecting the mixture obtained through step A to filter filtration, so that the resin-immobilized peptide (including those bound to the test substance) and the test substance not bound to the resin-immobilized peptide can be obtained. This is a method of separating by size, and is particularly effective when the difference between these sizes is large. For example, the resin-immobilized peptide can be obtained with high purity by subjecting the mixture to filtration.
磁性ビーズを利用した分離は、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）の樹脂部分に磁性ビーズを使用した場合に有効な分離方法であり、磁性ビーズと磁石の磁力を利用した分離方法である。具体的には、工程Ａを経て得られた混合物に磁石を接触させることで、磁石に樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）を付着させ、樹脂固定ペプチドとは結合していない被験物質と分離する方法である。なお、磁石から樹脂固定ペプチドを解離させる方法としては、例えば、磁石の磁力を失わせる方法（例えば、磁石として電磁石を用いる方法）が挙げられる。また、磁石に樹脂固定ペプチドが付着した状態において、後述の工程Ｃ及びＤを行うことにより、切断リンカーの一部を含むペプチド（被験物質と結合したものを含む）を得る方法も挙げられる。これにより、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）や、切断リンカーの一部を含むペプチド（被験物質と結合したものを含む）を高い純度で得ることができる。 Separation using magnetic beads is an effective separation method when using magnetic beads in the resin part of resin-immobilized peptides (including those bound to test substances), and uses magnetic force between magnetic beads and magnets. It is. Specifically, by bringing a magnet into contact with the mixture obtained through step A, a resin-immobilized peptide (including those bound to a test substance) is attached to the magnet, and a test that is not bound to the resin-immobilized peptide. It is a method of separating from substances. Examples of the method for dissociating the resin-immobilized peptide from the magnet include a method for losing the magnetic force of the magnet (for example, a method using an electromagnet as the magnet). In addition, in a state where the resin-immobilized peptide is attached to the magnet, a method of obtaining a peptide containing a part of the cleaved linker (including those bound to the test substance) by performing Steps C and D described later is also included. Thereby, resin-fixed peptides (including those bound to the test substance) and peptides containing a part of the cleavage linker (including those bound to the test substance) can be obtained with high purity.
本発明の検定方法が工程Ｂを含む場合、工程Ａを経て得られた混合物から樹脂固定ペプチドとは結合能の無い被験物質を除去できるため、樹脂固定ペプチドと被験物質（皮膚感作性物質）とが結合した樹脂固定ペプチドのみが得られることとなり、その結果、皮膚感作性の検定精度が向上する。 When the assay method of the present invention includes Step B, since the test substance that does not bind to the resin-fixed peptide can be removed from the mixture obtained through Step A, the resin-fixed peptide and the test substance (skin sensitizer) As a result, only the resin-immobilized peptide to which and are bound is obtained, and as a result, the accuracy of the skin sensitization assay is improved.
［工程Ｃ］
本発明の検定方法における工程Ｃは、工程Ｂで分離した樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）のリンカー部を切断する工程である。これにより、切断リンカーの一部を含むペプチド（被験物質と結合したものを含む）と、切断リンカーの一部を含む樹脂が得られる。なお、切断リンカーの一部を含むペプチドを、「ペプチド部位を含む化合物」と称する場合がある。なお、工程Ｃにて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。
[Step C]
Step C in the assay method of the present invention is a step of cleaving the linker portion of the resin-immobilized peptide (including those bound to the test substance) separated in step B. As a result, a peptide containing a part of the cleavage linker (including those bound to the test substance) and a resin containing a part of the cleavage linker are obtained. A peptide containing a part of the cleavage linker may be referred to as a “compound containing a peptide site”. In addition, the solvent used at the process C is not specifically limited, For example, what was illustrated at the process A can be used.
工程Ｃにおいて、光により切断する場合、その切断方法は特に限定されないが、例えば、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）に対して光を照射する方法が挙げられる。照射する光の種類は特に限定されないが、例えば、紫外線（波長３１５ｎｍ〜３８０ｎｍ）が挙げられる。また、光源としては特に限定されないが、低圧水銀灯、中圧水銀灯、高圧水銀灯、超高圧水銀灯、ケミカルランプ、ブラックライトランプ、マイクロウェーブ励起水銀灯、メタルハライドランプ等が好ましく用いられる。 In step C, when cleaving with light, the cleaving method is not particularly limited, and examples thereof include a method of irradiating light to a resin-immobilized peptide (including those bound to a test substance). Although the kind of light to irradiate is not specifically limited, For example, an ultraviolet-ray (wavelength 315nm-380nm) is mentioned. The light source is not particularly limited, but a low-pressure mercury lamp, a medium-pressure mercury lamp, a high-pressure mercury lamp, an ultrahigh-pressure mercury lamp, a chemical lamp, a black light lamp, a microwave excitation mercury lamp, a metal halide lamp and the like are preferably used.
工程Ｃにおいて、アルカリにより切断する場合、その切断方法は特に限定されないが、例えば、樹脂固定ペプチド（被験物質と結合したものを含む）を含む溶液に、アルカリ溶液を混合すること等が挙げられる。使用されるアルカリとしては特に限定されないが、例えば、アンモニア、ヒドラジン、トリエチルアミン、水素化ホウ素ナトリウム、水酸化ナトリウムを用いることができる。アルカリ溶液は、これらのアルカリを溶媒（例えば、水、有機溶媒、又はこれらの混合溶媒等）に溶解させることで調製することができる。 In step C, when cleaving with an alkali, the cleaving method is not particularly limited, and examples thereof include mixing an alkali solution with a solution containing a resin-immobilized peptide (including those bound to a test substance). Although it does not specifically limit as an alkali used, For example, ammonia, hydrazine, triethylamine, sodium borohydride, sodium hydroxide can be used. The alkaline solution can be prepared by dissolving these alkalis in a solvent (for example, water, an organic solvent, or a mixed solvent thereof).
工程Ｃにおいて、光、又はアルカリ以外の切断方法としては、加熱によるもの、酸によるもの、酵素反応によるもの等が挙げられる。 In step C, examples of the cutting method other than light or alkali include heating, acid, enzymatic reaction, and the like.
本発明の検定方法が工程Ｃを含む場合、ペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）と、切断リンカーの一部を含む樹脂とが得られる。これらは、その物性（例えば分子量や、サイズ等）が異なるため、種々の分離方法（例えば、工程Ｄにおける分離方法）により分離することができる。 When the assay method of the present invention includes Step C, a compound containing a peptide site (including those bound to a test substance) and a resin containing a part of a cleavage linker are obtained. Since these have different physical properties (for example, molecular weight, size, etc.), they can be separated by various separation methods (for example, separation methods in step D).
［工程Ｄ］
本発明の検定方法における工程Ｄは、工程Ｃにて生じたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）を分離する工程である。より具体的には、工程Ｂにおける分離方法として例示した、遠心分離、フィルターろ過による分離、磁性ビーズを利用した分離等により、工程Ｃにて生じるペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）を分離し、切断リンカーの一部を含む樹脂を除去する工程である。なお、工程Ｄにて用いられる溶媒は特に限定されず、例えば、工程Ａにて例示したものを用いることができる。
[Step D]
Step D in the assay method of the present invention is a step of separating the compound containing the peptide site produced in Step C (including those bound to the test substance). More specifically, a compound containing a peptide moiety produced in Step C (a compound bound to a test substance) by centrifugation, separation by filter filtration, separation using magnetic beads, etc., exemplified as the separation method in Step B. And the resin containing a part of the cleavage linker is removed. In addition, the solvent used at the process D is not specifically limited, For example, what was illustrated at the process A can be used.
本発明の検定方法が工程Ｄを含む場合、純度の高いペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）が得られるため、より皮膚感作性の検定精度が向上する。 When the assay method of the present invention includes Step D, a compound containing a highly pure peptide site (including those bound to a test substance) is obtained, so that the accuracy of assaying skin sensitization is further improved.
［工程Ｅ］
本発明の検定方法における工程Ｅは、工程Ｄにて分離されたペプチド部位を含む化合物（被験物質と結合したものを含む）について、ペプチドと被験物質との結合の有無を測定する工程である。具体的な測定方法としては特に限定されないが、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー法（ＴＬＣ）等のクロマトグラフィー法を用いた方法が挙げられる。具体的には、例えば、樹脂固定ペプチドと被験物質とを接触させて得られるサンプル（溶液）と、樹脂固定ペプチドのみを含むリファレンス（溶液）とを用意し、必要に応じて上記の工程Ｂ〜Ｄを行った後にそれぞれをクロマトグラフィー法にて測定し、得られる量比（例えばＨＰＬＣにて得られるピークの面積）の差から、ペプチドと被験物質との結合物が生じているか否かを判断する方法が挙げられる。
[Step E]
Step E in the assay method of the present invention is a step of measuring the presence or absence of binding between the peptide and the test substance for the compound containing the peptide site separated in Step D (including those bound to the test substance). Although it does not specifically limit as a concrete measuring method, For example, chromatographic methods, such as ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, normal phase chromatography, reverse phase chromatography, and thin layer chromatography (TLC), were used. A method is mentioned. Specifically, for example, a sample (solution) obtained by bringing a resin-immobilized peptide and a test substance into contact with each other and a reference (solution) containing only the resin-immobilized peptide are prepared. After performing D, each is measured by a chromatographic method, and it is determined from the difference in the obtained quantitative ratio (for example, the peak area obtained by HPLC) whether or not a conjugate of the peptide and the test substance is produced. The method of doing is mentioned.
本発明の検定方法におけるクロマトグラフィー法以外の測定方法としては、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法や、マトリクス支援レーザーイオン化（ＭＡＬＤＩ）法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）法、電子衝撃イオン化（ＥＩ）法、高速原子衝撃イオン化（ＦＡＢ）法等を用いた質量分析法、赤外分光法（ＩＲ法）等の本分野において公知乃至慣用の方法を用いることができる。なお、これらの測定方法は２以上を組み合わせて用いることもできる。 Examples of measuring methods other than the chromatography method in the assay method of the present invention include, for example, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, matrix-assisted laser ionization (MALDI) method, electrospray ionization (ESI) method, atmospheric pressure chemical ionization ( A publicly known or commonly used method such as mass spectrometry using APCI) method, electron impact ionization (EI) method, fast atom bombardment ionization (FAB) method, infrared spectroscopy (IR method) or the like may be used. it can. Note that two or more of these measurement methods can be used in combination.
＜樹脂固定ペプチド＞
本発明の樹脂固定ペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチド（以下、「ペプチド」と称する場合がある）と樹脂とが切断リンカーを介して結合した樹脂固定ペプチドである。なお、本発明の樹脂固定ペプチドは下記式（１）で表すことができ、式中のＰは皮膚感作性物質との結合能を有するペプチド（ペプチド部位）、Ｌは切断リンカー（リンカー部位）、Ｒは樹脂（樹脂部位）を示す。
Ｐ−Ｌ−Ｒ （１）
<Resin-fixed peptide>
The resin-immobilized peptide of the present invention is a resin-immobilized peptide in which a peptide having a binding ability to a skin sensitizer (hereinafter sometimes referred to as “peptide”) and a resin are bonded via a cleavage linker. The resin-immobilized peptide of the present invention can be represented by the following formula (1), where P is a peptide having a binding ability to a skin sensitizer (peptide moiety), and L is a cleavage linker (linker moiety). , R represents a resin (resin part).
PLR (1)
前記のペプチドは、皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドであれば特に限定されない。また、前記のペプチドは保護基を有していても良い。この様なペプチドとしては、例えば、リジン残基を１個以上含むペプチドや、システイン残基を１個以上含むペプチドが挙げられる。これらのペプチドは、皮膚感作性物質とリジン残基やシステイン残基を介して結合する。皮膚感作性物質との結合能を有するペプチドにおけるアミノ酸の重合度は特に限定されないが、例えば３〜２０であることが好ましく、より好ましくは４〜１５、さらに好ましくは５〜１０である。 The peptide is not particularly limited as long as it has a binding ability to a skin sensitizer. Further, the peptide may have a protecting group. Examples of such a peptide include a peptide containing one or more lysine residues and a peptide containing one or more cysteine residues. These peptides bind to skin sensitizers via lysine or cysteine residues. The degree of polymerization of amino acids in the peptide having the ability to bind to a skin sensitizer is not particularly limited, but is preferably 3 to 20, for example, more preferably 4 to 15, and still more preferably 5 to 10.
切断リンカーはペプチドに含まれる何れかのアミノ酸と結合していてもよいが、皮膚感作性物質との結合能の観点からは、ペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸と結合していることが好ましい。なお、前記の切断リンカーがペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸と結合している場合、ペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸の側鎖を介して結合していてもよいし、ペプチドのＣ末端のカルボキシル基又はＮ末端のアミノ基を介して結合していてもよい。この中でも、皮膚感作性物質との結合能の観点から、前記の切断リンカーがペプチドのＣ末端又はＮ末端のアミノ酸の側鎖を介して結合していることが好ましい。 The cleavage linker may be bound to any amino acid contained in the peptide, but from the viewpoint of the ability to bind to the skin sensitizer, it may be bound to the C-terminal or N-terminal amino acid of the peptide. preferable. When the above-mentioned cleavage linker is bonded to the C-terminal or N-terminal amino acid of the peptide, it may be bonded via the side chain of the peptide C-terminal or N-terminal amino acid, or the peptide C-terminal. It may be bonded via a carboxyl group or an N-terminal amino group. Among these, from the viewpoint of the ability to bind to a skin sensitizer, it is preferable that the above-mentioned cleavage linker is bonded via the side chain of the amino acid at the C-terminal or N-terminal of the peptide.
切断リンカーがペプチドのアミノ酸の側鎖を介して結合している場合のアミノ酸としては、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、システイン（Ｃ）等の側鎖に反応性官能基を有するアミノ酸であることが好ましい。 Amino acids in the case where the cleavage linker is bonded via the side chain of the amino acid of the peptide include lysine (K), arginine (R), aspartic acid (D), glutamic acid (E), cysteine (C) and the like. An amino acid having a reactive functional group in the chain is preferred.
前記のリジン残基を１個以上含むペプチドは、例えば、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＫＡＤやＲＦＡＡＫＡＡを含むペプチドであることが好ましく、より好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端に保護基を有していてもよいＨ−ＲＦＡＡＫＡＤ−ＯＨやＨ−ＲＦＡＡＫＡＡ−ＯＨである。また、前記のシステイン残基を１個以上含むペプチドは、例えば、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＣＡＤやＲＦＡＡＣＡＡを含むペプチドであることが好ましく、より好ましくはＮ末端及び／又はＣ末端に保護基を有していてもよいＨ−ＲＦＡＡＣＡＤ−ＯＨやＨ−ＲＦＡＡＣＡＡ―ＯＨである。なお、これらのペプチドは保護基を有していても良い。保護基としては、ペプチド合成において通常用いられる保護基を用いることができ、例えば、Ｎ末端保護基（例えば、Ａｃ（アセチル）基、Ｂｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）基、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）基、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）基、Ｃ末端保護基（例えば、ＯＢｚｌ（ベンジルエステル）基、ＯｔＢｕ（ｔ−ブチルエステル）基）、およびアミノ酸側鎖の保護基（Ｔｏｓ（トシル）基、Ｐｂｆ（４−メトキシトリチル）基、ＯｃＨｅｘ（シクロヘキシルエステル）基、ＭｅＢｚｌ（メチルベンジル）基、Ｔｒｔ（トリチル）基）が挙げられる。なお、前記のリジン残基を１個以上含むペプチドであって保護基を有するものとしては、Ａｃ−ＲＦＡＡＫＡＤ−ＯＨ等が例示され、前記のシステイン残基を１個以上含むペプチドであって保護基を有するものとしては、Ａｃ−ＲＦＡＡＣＡＤ−ＯＨ等が例示される。 The peptide containing one or more lysine residues is preferably a peptide containing, for example, RFAAKAD or RFAAKAA as a peptide sequence, and more preferably has a protecting group at the N-terminus and / or C-terminus. Good H-RFAAKAD-OH and H-RFAAKAA-OH. The peptide containing one or more cysteine residues is preferably a peptide containing, for example, RFAACAD or RFAACAA as a peptide sequence, and more preferably has a protecting group at the N-terminus and / or C-terminus. H-RFAACAD-OH or H-RFAACAA-OH may be used. These peptides may have a protecting group. As the protecting group, a protecting group usually used in peptide synthesis can be used. For example, an N-terminal protecting group (for example, Ac (acetyl) group, Boc (t-butyloxycarbonyl) group, Z (benzyloxycarbonyl)) Group, Fmoc (9-fluorenylmethyloxycarbonyl) group, C-terminal protecting group (eg OBzl (benzyl ester) group, OtBu (t-butyl ester) group), and amino acid side chain protecting group (Tos (tosyl)) ) Group, Pbf (4-methoxytrityl) group, OcHex (cyclohexyl ester) group, MeBzl (methylbenzyl) group, Trt (trityl) group), which is a peptide containing one or more of the above lysine residues. Examples of those having a protecting group include Ac-RFAAKAD-OH and the like. As those having a protecting group of emissions residues a peptide comprising one or more, Ac-RFAACAD-OH and the like.
前記のペプチドが、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＫＡＤを含むペプチドである場合、切断リンカーは、皮膚感作性物質との結合能の観点から、アスパラギン酸（Ｄ）の側鎖のカルボキシル基を介して結合することがさらに好ましい。なお、前記のペプチドが、ペプチド配列として、ＲＦＡＡＣＡＤを含むペプチドである場合も同様である。 When the peptide is a peptide containing RFAAKAD as a peptide sequence, the cleavage linker is bonded through the carboxyl group of the side chain of aspartic acid (D) from the viewpoint of the binding ability to the skin sensitizer. More preferably. The same applies when the peptide is a peptide containing RFAACAD as a peptide sequence.
前記の切断リンカーとしては、例えば、光切断リンカー（光により切断することが可能なリンカー）、アルカリ切断リンカー（アルカリにより切断することが可能なリンカー）、熱切断リンカー（熱により切断することが可能なリンカー）、酸切断リンカー（酸により切断することが可能なリンカー）、酵素切断リンカー（酵素により切断することが可能なリンカー）が挙げられ、光切断リンカーやアルカリ切断リンカーが好ましく用いられる。これらのリンカーの分子量は特に限定されないが、６０〜１０００程度であることが好ましく、より好ましくは１００〜４００である。 Examples of the cleavage linker include a photocleavage linker (linker that can be cleaved by light), an alkali cleave linker (linker that can be cleaved by alkali), and a heat cleaving linker (can be cleaved by heat). A linker capable of being cleaved by an acid) and an enzyme cleaved linker (a linker capable of being cleaved by an enzyme), and a photocleavable linker and an alkali cleaved linker are preferably used. The molecular weight of these linkers is not particularly limited, but is preferably about 60 to 1000, and more preferably 100 to 400.
光切断リンカーとしては、公知の光切断リンカーを適宜選択して使用することができ、特に限定されないが、２−ニトロベンゼン骨格、５−ニトロフェノール骨格、ニトロインドール骨格、又はクマリン骨格を有する光切断リンカー等を挙げることができ、この中でも２−ニトロベンゼン骨格、５−ニトロフェノール骨格を有する光切断リンカーが好ましい。 As the photocleavable linker, a known photocleavable linker can be appropriately selected and used, and is not particularly limited. However, the photocleavable linker having a 2-nitrobenzene skeleton, a 5-nitrophenol skeleton, a nitroindole skeleton, or a coumarin skeleton is used. Among them, a photocleavable linker having a 2-nitrobenzene skeleton or a 5-nitrophenol skeleton is preferable.
光切断リンカーは、例えば光切断リンカー剤により導入することができる。この様な光切断リンカー剤としては、例えば、Fmoc-Phg(2-NO2)-(C#CH2)OH（渡辺化学工業株式会社製：２−ニトロベンゼン骨格を有する光切断リンカー剤）等を挙げることができる。 The photocleavable linker can be introduced by, for example, a photocleavable linker agent. Examples of such a photocleavable linker agent include Fmoc-Phg (2-NO2)-(C # CH2) OH (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd .: photocleavable linker agent having a 2-nitrobenzene skeleton). Can do.
アルカリ切断リンカーとしては、公知のアルカリ切断リンカーを適宜選択して使用することができ、特に限定されないが、例えば、４−ヒドロキシメチル安息香酸を含むアルカリ切断リンカー等を挙げることができる。なお、アルカリ切断リンカーは、アルカリ切断リンカー剤により導入することができるが、アルカリ切断リンカー剤としては、４−ヒドロキシメチル安息香酸を含むリンカー剤が挙げられる。 As the alkali cleavage linker, a known alkali cleavage linker can be appropriately selected and used, and is not particularly limited. Examples thereof include an alkali cleavage linker containing 4-hydroxymethylbenzoic acid. In addition, although an alkali cleavage linker can be introduce | transduced with an alkali cleavage linker agent, As an alkali cleavage linker agent, the linker agent containing 4-hydroxymethyl benzoic acid is mentioned.
樹脂としては、特に限定されないが、例えば、ポリオキシアルキレンポリオール（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等）、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリブチレンテレフタレート、ポリブチレンナフタレート等）、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン−プロピレン共重合体等）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、及びこれらを２種以上組み合わせた樹脂（例えば、これらの共重合体）が挙げられる。また、磁性ビーズとして使用可能な樹脂を用いることができる。なお、本発明の検定方法において、使用する溶媒に対して不溶の樹脂を用いた場合は、樹脂固定ペプチドと被験物質の分離（例えば、遠心分離、フィルターろ過による分離）が容易となる。なお、これらの樹脂は、切断リンカーを導入する観点から、アミノ基、カルボキシル基、水酸基等の官能基を有する樹脂が好ましい。この様な樹脂としては、Fmoc-NH-PEG樹脂（渡辺化学工業株式会社製）、Amino PEGA resin、NovaPEG amino resin、NovaSyn TG amino resin（以上、メルク株式会社製）等が挙げられる。また、樹脂としては、切断リンカー（光、又はアルカリ切断リンカー等）を有する樹脂を用いることもできる。この様な樹脂としては、4-[4-(1-Fmoc-aminoethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butyramidomethyl-polystyrene（シグマ アルドリッチ ジャパン株式会社製）、ＨＭＢＡ−ＰＥＧ樹脂（渡辺化学工業株式会社製）等が挙げられる。 Although it does not specifically limit as resin, For example, polyoxyalkylene polyol (for example, polyethylene glycol, polypropylene glycol etc.), polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polyacrylic acid ester, polyester (for example, polyethylene terephthalate, polyethylene naphthalate, poly) Butylene terephthalate, polybutylene naphthalate, etc.), polyolefin (e.g., polyethylene, polypropylene, ethylene-propylene copolymer, etc.), polyvinyl chloride, polystyrene, and resins in combination of two or more thereof (e.g., copolymers thereof) ). Moreover, resin which can be used as a magnetic bead can be used. In the assay method of the present invention, when a resin insoluble in the solvent used is used, separation of the resin-immobilized peptide and the test substance (for example, separation by centrifugation or filter filtration) is facilitated. These resins are preferably resins having a functional group such as an amino group, a carboxyl group, and a hydroxyl group from the viewpoint of introducing a cleavage linker. Examples of such a resin include Fmoc-NH-PEG resin (manufactured by Watanabe Chemical Co., Ltd.), Amino PEGA resin, NovaPEG amino resin, NovaSyn TG amino resin (manufactured by Merck Co., Ltd.), and the like. Further, as the resin, a resin having a cleavage linker (such as light or an alkali cleavage linker) can also be used. Examples of such resins include 4- [4- (1-Fmoc-aminoethyl) -2-methoxy-5-nitrophenoxy] butyramidomethyl-polystyrene (manufactured by Sigma Aldrich Japan), HMBA-PEG resin (Watanabe Chemical Industries, Ltd.) Manufactured) and the like.
本発明の樹脂固定ペプチドは、ペプチド部位がシステイン残基を含むペプチドである場合であっても、ペプチド間でジスルフィド結合を形成することが無く、長期間に渡って安定である。これは、ペプチドを樹脂に固定することにより、ペプチドそのものを検定試薬として用いる場合と比べて、ペプチドが有するシステイン残基が反応する機会が少なくなることが一つの要因であると考えられる。 The resin-immobilized peptide of the present invention is stable for a long period without forming a disulfide bond between peptides even when the peptide site is a peptide containing a cysteine residue. This is thought to be due to the fact that by fixing the peptide to the resin, there are fewer opportunities for the cysteine residues of the peptide to react than when the peptide itself is used as an assay reagent.
本発明の樹脂固定ペプチドは、下記式（２）で表される樹脂固定ペプチドであることが好ましい。なお、式（２）中のＰは皮膚感作性物質との結合能を有するペプチド部位を示す。なお、Ｐはリジン残基を１個以上含むペプチド又はシステイン残基を１個以上含むペプチドであることが好ましい。Ｌ’はリンカーの一部を示し、例えば、２価の炭化水素基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、カルボニル基、及びこれらの２以上が結合した２価の基が挙げられる。なお、前記の２価の炭化水素基としては、例えば、２価の脂肪族炭化水素基（例えば、２価の直鎖状炭化水素基、又は２価の分岐鎖状炭化水素基）、２価の脂環式炭化水素基、２価の芳香族炭化水素基、及びこれらの２以上が結合した２価の炭化水素基であって、炭素数１〜２０（好ましくは炭素数２〜１０）の炭化水素基が挙げられる。Ｒは樹脂を示す。
また、樹脂固定ペプチドは、下記式（３）で表される樹脂固定ペプチドであることが好ましい。なお、式中のＰ及びＲは式（２）におけるものと同様である。
さらにまた、前記の樹脂固定ペプチドは、下記式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される樹脂固定ペプチドであることが好ましい。なお、式中のＲは式（２）におけるものと同様である。
本発明の樹脂固定ペプチドの製造方法は特に限定されないが、例えばペプチド固相合成法等を用いて製造することができる。具体的には、表面をアミノ基等で修飾した樹脂を固相として用い、光、又はアルカリ切断リンカー剤と反応させた後、脱水反応によって１つずつアミノ酸鎖を伸長していくことでペプチド部位を作製する方法が挙げられる。なお、切断リンカーを有する樹脂を用い、脱水反応によって１つずつアミノ酸鎖を伸長していくことでペプチド部位を作製する方法であってもよい。 Although the manufacturing method of the resin fixed peptide of this invention is not specifically limited, For example, it can manufacture using a peptide solid-phase synthesis method etc. Specifically, using a resin whose surface is modified with an amino group or the like as a solid phase, reacting with light or an alkali-cleaving linker, and then extending the amino acid chain one by one by dehydration reaction The method of producing is mentioned. In addition, the method of producing a peptide site | part by extending | stretching an amino acid chain | strand one by one by dehydration reaction using resin which has a cutting | disconnection linker may be used.
本発明の検定試薬は前記の樹脂固定ペプチドのみからなるものであってもよく、さらに１種又は２種以上の添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、安定化剤、溶媒等を含んでいてもよい。なお、本発明の検定試薬は、固体状（粉末状、顆粒状、錠剤等）、液体状（スラリー状）のいずれの形態で提供されてもよい。 The assay reagent of the present invention may consist only of the above-mentioned resin-immobilized peptide, and may further contain one or more additives. Examples of the additive may include a pH adjuster, a stabilizer, a solvent, and the like. The assay reagent of the present invention may be provided in any form of solid (powder, granule, tablet, etc.) or liquid (slurry).
本発明の樹脂固定ペプチドは、皮膚感作性物質除去剤としても用いることができる。つまり、医薬品、農薬、食料品、化粧品、及び洗剤等の開発において、その原料や添加剤、最終製品等に本発明の樹脂固定ペプチドを添加した後、適切に除去することによって、これらに含まれる皮膚感作性物質を除去することも可能である。なお、前記の皮膚感作性物質除去剤は前記の樹脂固定ペプチドのみからなるものであってもよく、さらに１種又は２種以上の添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ調整剤、安定化剤、溶媒等を含んでいてもよい。なお、皮膚感作性物質除去剤は、固体状（粉末状、顆粒状、錠剤等）、液体状（スラリー状）のいずれの形態で提供されてもよい。 The resin-immobilized peptide of the present invention can also be used as a skin sensitizer removal agent. In other words, in the development of pharmaceuticals, agricultural chemicals, foodstuffs, cosmetics, detergents, etc., the resin-immobilized peptide of the present invention is added to the raw materials, additives, final products, etc. and then included in these appropriately removed. It is also possible to remove skin sensitizers. In addition, the said skin sensitizer removal agent may consist only of said resin fixed peptide, and may further contain 1 type, or 2 or more types of additives. Examples of the additive may include a pH adjuster, a stabilizer, a solvent, and the like. The skin sensitizer removal agent may be provided in any form of solid (powder, granule, tablet, etc.) or liquid (slurry).
以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but the present invention is not limited to these examples.
［実施例１：樹脂固定ペプチド（１）の作製］
ＮＨ2−ＰＥＧ樹脂（官能基導入率０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上のアミノ基とＦｍｏｃ−Ｐｈｇ（２−ＮＯ２）−（Ｃ＃ＣＨ２）ＯＨをカップリングさせた。次に、得られた反応生成物のＦｍｏｃ基をピペリジンで脱保護し、脱保護されたアミノ基とＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨとをカップリングさせた。以下、同様の手法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔｂｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの順にカップリングを行い、無水酢酸を反応させた後、脱保護溶液（水：トリイソプロピルシラン：ＴＦＡ（体積比）＝０．０２：０．０２：１）で２時間反応させ、洗浄及び乾燥を行うことで、以下のモデル構造を有する樹脂固定ペプチド（１）を作製した。
[Example 1: Preparation of resin-immobilized peptide (1)]
NH 2-PEG resin amino groups on (functional group introduction rate 0.2 mmol / g) and Fmoc-Phg (2-NO2) - (C # CH2) and the OH was coupled. Next, the Fmoc group of the obtained reaction product was deprotected with piperidine, and the deprotected amino group and Fmoc-βAla-OH were coupled. Hereinafter, using the same method, Fmoc-Asp-Otbu, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc- Coupling was performed in the order of Arg (Pbf) -OH, and after reacting with acetic anhydride, deprotection solution (water: triisopropylsilane: TFA (volume ratio) = 0.02: 0.02: 1) was used for 2 hours. The resin-immobilized peptide (1) having the following model structure was prepared by reacting, washing and drying.
［実施例２：樹脂固定ペプチド（２）の作製］
ＮＨ2−ＰＥＧ樹脂（官能基導入率０．２ｍｍｏｌ／ｇ）上のアミノ基とＦｍｏｃ−Ｐｈｇ（２−ＮＯ２）−（Ｃ＃ＣＨ２）ＯＨをカップリングさせた。次に、得られた反応生成物のＦｍｏｃ基をピペリジンで脱保護し、脱保護されたアミノ基とＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨとをカップリングさせた。以下、同様の手法を用いて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔｂｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨの順にカップリングを行い、無水酢酸を反応させた後、脱保護溶液（水：トリイソプロピルシラン：ＴＦＡ（体積比）＝０．０２：０．０２：１）で２時間反応させ、洗浄及び乾燥を行うことで、以下のモデル構造を有する樹脂固定ペプチド（２）を作製した。
[Example 2: Preparation of resin-immobilized peptide (2)]
NH 2-PEG resin amino groups on (functional group introduction rate 0.2 mmol / g) and Fmoc-Phg (2-NO2) - (C # CH2) and the OH was coupled. Next, the Fmoc group of the obtained reaction product was deprotected with piperidine, and the deprotected amino group and Fmoc-βAla-OH were coupled. Hereinafter, using the same method, Fmoc-Asp-Otbu, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc- Coupling was performed in the order of Arg (Pbf) -OH, and after reacting with acetic anhydride, deprotection solution (water: triisopropylsilane: TFA (volume ratio) = 0.02: 0.02: 1) was used for 2 hours. The resin-immobilized peptide (2) having the following model structure was prepared by reacting, washing and drying.
なお、樹脂固定ペプチド（１）及び（２）の作製にて用いたＮＨ2−ＰＥＧ樹脂、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｇ（２−ＮＯ２）−（Ｃ＃ＣＨ２）ＯＨ、Ｆｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ−Ｏｔｂｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨは全て渡辺化学工業株式会社の製品である。 The NH 2 -PEG resin, Fmoc-Phg (2-NO 2)-(C # CH 2) OH, Fmoc-βAla-OH, Fmoc-Asp- used in the production of the resin-immobilized peptides (1) and (2) Otbu, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Cys (Trt) -OH, and Fmoc-Lys (Boc) -OH are all products of Watanabe Chemical Co., Ltd. is there.
［実施例３：エチルアクリレートの皮膚感作性の検定１］
以下の操作手順でエチルアクリレートの皮膚感作性を検定した。
１ｍｇの樹脂固定ペプチド（１）を、５ｍｌのチューブ（株式会社ハイペップ研究所製）に入れ、５００μｌのＤＭＦで５回洗浄した後、５００μｌのＡ溶媒（水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１）で５回洗浄した。次に、１ｍｌの０．１重量％トリエチルアミンを含むＤＭＦにエチルアクリレートの濃度が１００ｍＭになるように添加して調製したものに樹脂固定ペプチド（１）を添加し、２４時間反応させた。次に、５００μｌのＤＭＦで５回洗浄した後、５００μｌのＡ溶媒で５回洗浄した。次に、Ａ溶媒を５００μｌ加えて撹拌した後、ピペットを使用してエッペンドルフチューブに回収した。次に、１５０００ｒｐｍ×１ｍｉｎの条件で遠心し、上清を廃棄した後、再度Ａ溶媒を５００μｌ加えて撹拌する操作を４回繰り返した。次に、４００μｌのＡ溶媒を投入し、紫外−可視ファイバ光源（浜松ホトニクス、ＬＥＤ光源用コントローラ(C11924)）を用い、光量８０％、照射距離：５ｃｍの条件で、２０分間、光（波長：約３６５ｎｍ）を照射した。次に、光照射後の試料を遠心（１５０００ｒｐｍ×１ｍｉｎ）し、その上清をフィルター（ミリポア ０．４５μｍ １００／ｐｋ：メルク社製）へ移すと共に、遠心（１５０００ｒｐｍ×１ｍｉｎ）し、１００μｌとなった所でＨＰＬＣ測定（カラム；zorbax社製ＳＢ−Ｃ１８（２．１×１００ｍｍ）、Ａ溶媒；水：ＴＦＡ（体積比）＝１００：０．１、Ｂ溶媒；アセトニトリル：ＴＦＡ＝１００：０．０８、グラジエント；０分／Ｂ溶媒１０％、１１分／Ｂ溶媒９０％；流速：０．３５ｍｌ／分）を行った。以下に、樹脂固定ペプチド（１）に光を照射して得られる切断物のモデルを示す。
[Example 3: Test 1 for skin sensitization of ethyl acrylate]
The skin sensitization of ethyl acrylate was tested by the following operation procedure.
1 mg of the resin-immobilized peptide (1) was put in a 5 ml tube (manufactured by Hypep Laboratories), washed 5 times with 500 μl of DMF, and then 500 μl of A solvent (water: TFA (volume ratio) = 100: 0. Washed 5 times in 1). Next, the resin-immobilized peptide (1) was added to a solution prepared by adding 1 ml of DMF containing 0.1 wt% triethylamine so that the concentration of ethyl acrylate was 100 mM, and allowed to react for 24 hours. Next, after washing 5 times with 500 μl of DMF, it was washed 5 times with 500 μl of A solvent. Next, 500 μl of A solvent was added and stirred, and then collected in an Eppendorf tube using a pipette. Next, centrifugation was carried out under the condition of 15000 rpm × 1 min, and after discarding the supernatant, the operation of adding 500 μl of solvent A and stirring again was repeated 4 times. Next, 400 μl of A solvent was added and light (wavelength: 20 minutes) was used under the conditions of 80% light quantity and 5 cm irradiation distance using an ultraviolet-visible fiber light source (Hamamatsu Photonics, LED light source controller (C11924)). About 365 nm). Next, the sample after light irradiation is centrifuged (15000 rpm × 1 min), and the supernatant is transferred to a filter (Millipore 0.45 μm 100 / pk: manufactured by Merck) and centrifuged (15000 rpm × 1 min) to 100 μl. HPLC measurement (column: SB-C18 (2.1 × 100 mm) manufactured by zorbax, A solvent; water: TFA (volume ratio) = 100: 0.1, B solvent; acetonitrile: TFA = 100: 0. 08, gradient; 0 min / B solvent 10%, 11 min / B solvent 90%; flow rate: 0.35 ml / min). Below, the model of the cut | disconnection thing obtained by irradiating light to resin fixed peptide (1) is shown.
［実施例４：シクラメンアルデヒドの皮膚感作性の検定１］
エチルアクリレートの代わりにシクラメンアルデヒドを用いたこと以外は実施例３と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
[Example 4: Assay 1 for skin sensitization of cyclamenaldehyde]
HPLC measurement was performed in the same manner as in Example 3 except that cyclamenaldehyde was used instead of ethyl acrylate.
（実施例３及び４のリファレンス）
皮膚感作性物質（エチルアクリレート）を用いないこと以外は実施例３と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
(Reference for Examples 3 and 4)
HPLC measurement was performed in the same manner as in Example 3 except that the skin sensitizer (ethyl acrylate) was not used.
［実施例５：エチルアクリレートの皮膚感作性の検定２］
樹脂固定ペプチド（１）の代わりに樹脂固定ペプチド（２）を用いたこと以外は実施例３と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
[Example 5: Test 2 for skin sensitization of ethyl acrylate]
HPLC measurement was performed in the same manner as in Example 3 except that the resin-immobilized peptide (2) was used instead of the resin-immobilized peptide (1).
［実施例６：シクラメンアルデヒドの皮膚感作性の検定２］
樹脂固定ペプチド（１）の代わりに樹脂固定ペプチド（２）を用いたこと以外は実施例４と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
[Example 6: Assay 2 for skin sensitization of cyclamenaldehyde]
HPLC measurement was performed in the same manner as in Example 4 except that the resin-immobilized peptide (2) was used instead of the resin-immobilized peptide (1).
（実施例５及び６のリファレンス）
皮膚感作性物質を用いないこと以外は実施例５と同様にして、ＨＰＬＣ測定を行った。
(Reference for Examples 5 and 6)
HPLC measurement was performed in the same manner as in Example 5 except that the skin sensitizer was not used.
＜評価＞
実施例３にて得られたＨＰＬＣのチャートと、そのリファレンスにて得られたＨＰＬＣのチャートとを比較することで、樹脂固定ペプチドのペプチド部位に由来する溶出ピーク面積が減少することを確認した。このことから、実施例３において、樹脂固定ペプチドのペプチド部位にエチルアクリレートが結合したことが示唆された。さらに、樹脂固定ペプチド（１）から切断されたペプチド部分とエチルアクリレートとの結合物に由来すると考えられる溶出ピークが見られた。また、実施例４〜６においても同様の結果が得られた。
<Evaluation>
By comparing the HPLC chart obtained in Example 3 with the HPLC chart obtained with the reference, it was confirmed that the elution peak area derived from the peptide site of the resin-immobilized peptide decreased. This suggested that in Example 3, ethyl acrylate was bound to the peptide site of the resin-immobilized peptide. Furthermore, an elution peak considered to be derived from a conjugate of the peptide portion cleaved from the resin-immobilized peptide (1) and ethyl acrylate was observed. Moreover, the same result was obtained also in Examples 4-6.
Claims (8)
（式中、Ｐはリジン残基を１個以上含むペプチド又はシステイン残基を１個以上含むペプチドを示す。Ｌ’は２価の炭化水素基、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、カルボニル基、又はこれらの２以上が結合した２価の基を示す。Ｒは樹脂を示す。） A resin-immobilized peptide represented by the following formula (2).
(In the formula, P represents a peptide containing one or more lysine residues or a peptide containing one or more cysteine residues. L ′ represents a divalent hydrocarbon group, an ether bond, a thioether bond, an ester bond, an amide bond, A carbonyl group, or a divalent group in which two or more of these are bonded, R represents a resin.)
（式中、Ｒは樹脂を示す。） A resin-immobilized peptide represented by the following formula (I) or (II).
(In the formula, R represents a resin.)
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