JP2017197487A - Non-fluorescent mutant of fluorescent protein - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、蛍光タンパク質と同じ抗原性を示す非蛍光性タンパク質、前記非蛍光性タンパク質をコードする遺伝子、前記遺伝子を含むベクター、前記非蛍光性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物、前記非蛍光性タンパク質を利用した非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法、及び前記蛍光タンパク質に対して免疫寛容を示す非ヒトクローン哺乳動物の作製方法に関する。 The present invention relates to a non-fluorescent protein having the same antigenicity as a fluorescent protein, a gene encoding the non-fluorescent protein, a vector containing the gene, a non-human mammal expressing the non-fluorescent protein, and the non-fluorescent protein The present invention relates to a method for transplanting non-human cloned mammals using proteins and a method for producing non-human cloned mammals that exhibit immunological tolerance against the fluorescent protein.
移植医学研究において、蛍光タンパク質は移植されたドナー細胞、組織、臓器の追跡マーカーとして非常に有用である。遺伝的均一性の高い近交系動物間の移植では拒絶反応は起きにくいが、移植ドナーが蛍光タンパク質を発現する場合は、蛍光タンパク質がレシピエント体内で抗原となり、拒絶反応を起こす。このような拒絶反応は、移植片の生着率の低下を招き、移植実験の成否や正確な評価に影響をきたす。 In transplantation medical research, fluorescent proteins are very useful as tracking markers for transplanted donor cells, tissues, and organs. In transplantation between inbred animals with high genetic uniformity, rejection is unlikely to occur, but when the transplant donor expresses fluorescent protein, the fluorescent protein becomes an antigen in the recipient body and causes rejection. Such rejection results in a decrease in the survival rate of the graft, and affects the success or failure of the transplant experiment and accurate evaluation.
蛍光タンパク質の蛍光を消失させた変異体を発現させた動物は、蛍光タンパク質に対し免疫寛容となる。このため、このような動物をレシピエントとした移植方法が以前から提案されている（特許文献１）。例えば、特許文献１には、GFPのアミノ酸配列における67位のチロシンをアラニンに置換し、GFPと同じ抗原性を示し、蛍光を発しない変異体を作製することが記載されており、また、この変異体を発現するマウスに、GFPを発現するマウスの細胞を移植する方法が記載されている。 Animals expressing mutants that have lost the fluorescence of the fluorescent protein are immunotolerant to the fluorescent protein. For this reason, a transplantation method using such an animal as a recipient has been proposed (Patent Document 1). For example, Patent Document 1 describes that a tyrosine at position 67 in the amino acid sequence of GFP is substituted with alanine to produce a mutant that exhibits the same antigenicity as GFP and does not emit fluorescence. A method of transplanting cells of a mouse expressing GFP into a mouse expressing a mutant is described.
特許文献１では、蛍光タンパク質としてGFPが使われているが、GFPは自家蛍光やヘモグロビンの吸収波長の影響を受けやすいという問題がある。また、特許文献１では、近交系動物間で移植を行っているが、このような移植法では、ドナーとレシピエントの遺伝的バックグラウンドが完全に一致していないという問題がある。更に近交系が確立されていない動物間ではこのような移植法は適用できないという問題もある。 In Patent Document 1, GFP is used as a fluorescent protein, but there is a problem that GFP is easily affected by autofluorescence and the absorption wavelength of hemoglobin. In Patent Document 1, transplantation is performed between inbred animals. However, such a transplantation method has a problem that the genetic backgrounds of the donor and the recipient are not completely matched. Furthermore, there is a problem that such transplantation methods cannot be applied between animals for which inbred lines have not been established.
本発明は、以上のような従来技術の問題を解決し、新しい非蛍光性タンパク質、及びそれを利用した移植方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to solve the above-described problems of the prior art and provide a new non-fluorescent protein and a transplantation method using the same.
本発明者は、非蛍光化する蛍光タンパク質としてGFPの代わりに遠赤色蛍光を発するmonomeric Plumを使用することにより、自家蛍光やヘモグロビンの吸収波長の問題を解決できるという着想を得て、この着想をもとにさらに研究を進めた。その結果、monomeric Plumのアミノ酸配列における68番目のチロシンをグリシンに置換することにより、monomeric Plumと同じ抗原性を維持しつつ蛍光を消失させ得ることを見出した。また、この非蛍光性タンパク質を利用した移植を、特許文献１のように、近交系動物間で行うのではなく、クローン動物間で行うことにより、monomeric Plum遺伝子を除いて、ドナーとレシピエントの遺伝的バックグラウンドを完全に一致させ得ることを見出した。 The present inventor obtained the idea that the problem of autofluorescence and absorption wavelength of hemoglobin can be solved by using a monomeric plum that emits far-red fluorescence instead of GFP as a non-fluorescent fluorescent protein. Based on this, further research was conducted. As a result, it was found that by replacing the 68th tyrosine in the amino acid sequence of the monomeric plum with glycine, the fluorescence could be lost while maintaining the same antigenicity as the monomeric plum. Moreover, transplantation using this non-fluorescent protein is not performed between inbred animals as in Patent Document 1, but is performed between cloned animals, so that the donor and recipient can be removed except for the monomeric plum gene. It was found that the genetic background of can be perfectly matched.
本発明は、以上の知見に基づき完成されたものである。 The present invention has been completed based on the above findings.
即ち、本発明は、以下の〔１〕〜〔１１〕を提供する。
〔１〕配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質の変異体であって、以下の特徴を有する蛍光性タンパク質の変異体、
（１）前記蛍光性タンパク質と同じ抗原性を示す、
（２）実質的に非蛍光性である、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である。
That is, the present invention provides the following [1] to [11].
[1] A fluorescent protein variant comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, wherein the fluorescent protein variant has the following characteristics:
(1) exhibits the same antigenicity as the fluorescent protein,
(2) substantially non-fluorescent,
(3) The amino acid corresponding to the 68th tyrosine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than tyrosine.
〔２〕チロシン以外のアミノ酸が、グリシンであることを特徴とする〔１〕に記載の蛍光性タンパク質の変異体。 [2] The fluorescent protein variant according to [1], wherein the amino acid other than tyrosine is glycine.
〔３〕配列番号２に記載のアミノ酸配列からなることを特徴とする〔１〕に記載の蛍光性タンパク質の変異体。 [3] The fluorescent protein variant of [1], comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
〔４〕〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子。 [4] A gene encoding a mutant of the fluorescent protein according to any one of [1] to [3].
〔５〕〔４〕に記載の遺伝子を含むベクター。 [5] A vector comprising the gene according to [4].
〔６〕〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の蛍光性タンパク質の変異体を発現することを特徴とする非ヒト哺乳動物。 [6] A non-human mammal characterized by expressing a mutant of the fluorescent protein according to any one of [1] to [3].
〔７〕非ヒト哺乳動物が、ブタであることを特徴とする〔６〕に記載の非ヒト哺乳動物。 [7] The non-human mammal according to [6], wherein the non-human mammal is a pig.
〔８〕非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法であって、移植ドナーとする非ヒトクローン哺乳動物が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物であり、移植レシピエントとする非ヒトクローン哺乳動物が〔１〕乃至〔３〕のいずれかに記載の蛍光性タンパク質の変異体を発現する非ヒト哺乳動物であることを特徴とする非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法。 [8] A method for transplantation between non-human clone mammals, wherein the non-human clone mammal as a transplant donor is a non-human mammal expressing a fluorescent protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, The non-human cloned mammal as a recipient is a non-human mammal expressing a mutant of the fluorescent protein according to any one of [1] to [3]. Transplant method.
〔９〕非ヒトクローン哺乳動物が、クローンブタであることを特徴とする〔８〕に記載の非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法。 [9] The method for transplanting between non-human cloned mammals according to [8], wherein the non-human cloned mammal is a cloned pig.
〔１０〕以下の工程を含む、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質に対して免疫寛容を示す非ヒトクローン哺乳動物の作製方法、
（１）核ドナー細胞を調製し、その核ドナー細胞に〔５〕に記載のベクターを導入し、〔４〕に記載の遺伝子を発現させる工程、
（２）除核したレシピエント卵を調製する工程、
（３）除核したレシピエント卵と核ドナー細胞を融合させる工程、
（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、
（５）クローン胚をレシピエント動物の卵管又は子宮に移植し、非ヒトクローン哺乳動物を得る工程。
[10] A method for producing a non-human cloned mammal showing immunological tolerance against a fluorescent protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, comprising the following steps:
(1) preparing a nuclear donor cell, introducing the vector according to [5] into the nuclear donor cell, and expressing the gene according to [4],
(2) preparing a enucleated recipient egg;
(3) fusing the enucleated recipient egg with nuclear donor cells;
(4) culturing the fused egg to obtain a cloned embryo,
(5) Transplanting a cloned embryo into the oviduct or uterus of a recipient animal to obtain a non-human cloned mammal.
〔１１〕非ヒトクローン哺乳動物が、クローンブタであることを特徴とする〔１０〕に記載の配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質に対して免疫寛容を示す非ヒトクローン哺乳動物の作製方法。 [11] The non-human cloned mammal showing immunological tolerance against the fluorescent protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 according to [10], wherein the non-human cloned mammal is a cloned pig Manufacturing method.
本発明により、monomeric Plumを発現する細胞、組織、臓器を移植しても、拒絶反応を起こさない非ヒト哺乳動物が提供される。monomeric Plumは自家蛍光やヘモグロビンの吸収波長の影響を受けにくく、移植細胞等の追跡用マーカーとして優れている。従って、monomeric Plumを発現する細胞等に対して拒絶反応を起こさない前記非ヒト哺乳動物は、移植実験用動物として非常に有用である。 The present invention provides a non-human mammal that does not cause rejection even when cells, tissues, and organs that express monomeric plum are transplanted. Monomeric Plum is less susceptible to autofluorescence and the absorption wavelength of hemoglobin and is excellent as a marker for tracking transplanted cells. Therefore, the non-human mammal that does not cause rejection to cells expressing monomeric plum is very useful as an animal for transplantation experiments.
以下、本発明を詳細に説明する。
（Ａ）蛍光性タンパク質の変異体
本発明の蛍光性タンパク質の変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質の変異体であって、（１）前記蛍光性タンパク質と同じ抗原性を示す、（２）実質的に非蛍光性である、及び（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である、という特徴を有するものである。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
(A) Fluorescent protein variant The fluorescent protein variant of the present invention is a fluorescent protein variant comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and (1) the same antigen as the fluorescent protein. (2) substantially non-fluorescent, and (3) the amino acid corresponding to the 68th tyrosine in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than tyrosine Is.
配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質は、monomeric Plum又は単にPlumと呼ばれる遠赤色蛍光を発する蛍光性タンパク質である。この蛍光性タンパク質は、サンゴ（Discosoma sp.）由来の赤色蛍光タンパク質であるDsRedの変異体である。この蛍光性タンパク質をコードするcDNAを含むベクターは、タカラバイオ社から販売されている。 The fluorescent protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is a fluorescent protein that emits far-red fluorescence called monomeric plum or simply plum. This fluorescent protein is a mutant of DsRed, a red fluorescent protein derived from coral (Discosoma sp.). A vector containing cDNA encoding this fluorescent protein is commercially available from Takara Bio Inc.
本発明の蛍光性タンパク質の変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質（monomeric Plum）と同じ抗原性を示す。従って、本発明の変異体を発現する動物に、monomeric Plumを発現する細胞等を移植しても、その動物の体内にmonomeric Plumに対する抗体は産生されないと考えられる。monomeric Plumと同じ抗原性を示すかどうかは、本発明の変異体を発現する動物に、monomeric Plumを発現する細胞等を移植し、その動物の体内にmonomeric Plumに対する抗体が産生されるかどうか調べる方法、あるいは移植した細胞等の増殖性を調べる方法などにより判断できる。また、monomeric Plumと特異的に結合する抗体（例えば、タカラバイオ社ら販売されている抗DsRed抗体など）を用いたウェスタンブロッティングなどによってもmonomeric Plumと同じ抗原性を示すかどうかを判断することができる。 The mutant of the fluorescent protein of the present invention exhibits the same antigenicity as the fluorescent protein (monomeric plum) consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Therefore, it is considered that even when cells expressing monomeric plum are transplanted into an animal that expresses the mutant of the present invention, antibodies against monomeric plum are not produced in the animal body. Whether the antibody exhibits the same antigenicity as monomeric Plum is examined by transplanting cells expressing monomeric Plum to the animal expressing the mutant of the present invention to determine whether antibodies against the monomeric Plum are produced in the animal. It can be judged by a method or a method for examining the proliferative property of transplanted cells or the like. In addition, Western blotting using an antibody that specifically binds to the monomeric plum (for example, an anti-DsRed antibody sold by Takara Bio Inc.) can also determine whether the same antigenicity as the monomeric plum is exhibited. it can.
本発明の蛍光性タンパク質の変異体は、実質的に非蛍光性である。本明細書において「実質的に非蛍光性」とは、蛍光顕微鏡で実質的に蛍光が観察されないことをいう。具体的には、monomeric Plumと比較して蛍光強度が１％以下のような場合は、「実質的に非蛍光性」に該当する。 The fluorescent protein variants of the present invention are substantially non-fluorescent. As used herein, “substantially non-fluorescent” means that substantially no fluorescence is observed with a fluorescence microscope. Specifically, when the fluorescence intensity is 1% or less as compared with the monomeric plum, it is “substantially non-fluorescent”.
本発明の蛍光性タンパク質の変異体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である。「配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸」とは、アミノ酸配列の同一性に基づいて、配列番号１に記載のアミノ酸配列（monomeric Plumのアミノ酸配列）と整列させた場合に、配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸を意味する。「チロシン以外のアミノ酸」は特に限定されないが、分子量の小さいアミノ酸が好ましく、グリシンが特に好ましい。 In the mutant of the fluorescent protein of the present invention, the amino acid corresponding to the 68th tyrosine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than tyrosine. "The amino acid corresponding to the 68th tyrosine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1" was aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence of monomeric plum) based on the identity of the amino acid sequence In this case, it means the amino acid corresponding to the 68th tyrosine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. The “amino acid other than tyrosine” is not particularly limited, but an amino acid having a small molecular weight is preferable, and glycine is particularly preferable.
本発明の蛍光性タンパク質の変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸がチロシン以外のアミノ酸であり、かつ、上述した「monomeric Plumと同じ抗原性」及び「実質的に非蛍光性」という性質を保持できるものであれば特に限定されない。最も好ましいアミノ酸としては、配列番号２に記載のアミノ酸配列（即ち、配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンをグリシンに置き換えたアミノ酸配列）を挙げることができるが、これ以外のアミノ酸配列であってもよい。例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列（但し、68番目のグリシンがチロシンに置換されることはない）からなり、上述した「monomeric Plumと同じ抗原性」及び「実質的に非蛍光性」という性質を保持できるアミノ酸配列であってもよい。ここでいう「１若しくは数個」とは、通常は、１〜１０個であり、好ましくは、１〜５個であり、より好ましくは１〜３個であり、更に好ましくは１個である。また、本発明の蛍光性タンパク質の変異体のアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と高い同一性を示すアミノ酸配列（但し、68番目のグリシンがチロシンに置換されることはない）であって、上述した「monomeric Plumと同じ抗原性」及び「実質的に非蛍光性」という性質を保持できるアミノ酸配列であってもよい。ここでいう「高い同一性」とは、通常９５％以上の同一性、好ましくは９７％以上の同一性、より好ましくは９８％以上の同一性、更に好ましくは９９％以上の同一性を意味する。なお、本明細書における「同一性」の値は、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出することができる。例えば、NCBIの相同性アルゴリズムBLAST（Basic local alignment search tool）においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、算出することができる。 The amino acid sequence of the fluorescent protein variant of the present invention is such that the amino acid corresponding to the 68th tyrosine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than tyrosine, And “substantially non-fluorescent” are not particularly limited. The most preferred amino acid includes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (that is, the amino acid sequence in which the 68th tyrosine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is replaced with glycine), but other amino acid sequences It may be. For example, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added (however, the 68th glycine is not replaced by tyrosine), It may be an amino acid sequence capable of retaining the above-mentioned properties “same antigenicity as monomeric plum” and “substantially non-fluorescent”. The “one or several” referred to herein is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1. The amino acid sequence of the fluorescent protein variant of the present invention is an amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (however, the 68th glycine is not substituted with tyrosine). It may be an amino acid sequence capable of retaining the above-mentioned properties of “same antigenicity as monomeric plum” and “substantially non-fluorescent”. As used herein, “high identity” usually means 95% or more identity, preferably 97% or more identity, more preferably 98% or more identity, and even more preferably 99% or more identity. . The value of “identity” in the present specification can be calculated using a homology search program known to those skilled in the art. For example, it can be calculated by using default (initial setting) parameters in NCBI homology algorithm BLAST (Basic local alignment search tool).
（Ｂ）蛍光性タンパク質の変異体を発現する非ヒト哺乳動物
本発明の非ヒト哺乳動物は、上記の蛍光性タンパク質の変異体を発現することを特徴とするものである。
(B) Non-human mammal expressing fluorescent protein mutant The non-human mammal of the present invention is characterized by expressing the fluorescent protein mutant described above.
本発明の非ヒト哺乳動物は、主に移植実験のレシピエントとして用いられるので、ドナーとなる遺伝的に同一又は均質な個体の存在が前提となる。このため、本発明の非ヒト哺乳動物は、近交系動物又はクローン動物であることが好ましく、クローン動物であることが特に好ましい。クローン動物は、遺伝的に同一な個体を多数得ることのできる体細胞核移植によって得られるものが好ましい。本発明者らは、以前に、Plumを発現するトランスジェニッククローンブタを作製する方法について発表しているので（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）、体細胞核移植によって得られるクローン動物は、この方法に従って作製することができるが、他の方法に従って作製してもよい。 Since the non-human mammal of the present invention is mainly used as a recipient for transplantation experiments, it is premised on the existence of genetically identical or homogeneous individuals as donors. For this reason, the non-human mammal of the present invention is preferably an inbred animal or a cloned animal, and particularly preferably a cloned animal. The cloned animal is preferably one obtained by somatic cell nuclear transfer capable of obtaining many genetically identical individuals. Since the present inventors have previously published a method for producing transgenic cloned pigs that express Plum (Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177), by somatic cell nuclear transfer The resulting cloned animal can be produced according to this method, but may be produced according to other methods.
体細胞核移植によるクローン動物の作製方法としては、例えば、（１）核ドナー細胞を調製する工程、（２）除核したレシピエント卵を調製する工程、（３）除核したレシピエント卵と核ドナー細胞を融合させる工程、（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、及び（５）クローン胚をレシピエント動物の卵管又は子宮に移植し、クローン動物を得る工程を含む方法を示すことができる。 Examples of methods for producing cloned animals by somatic cell nuclear transfer include (1) a step of preparing nuclear donor cells, (2) a step of preparing enucleated recipient eggs, and (3) enucleated recipient eggs and nuclei. A method comprising: fusing donor cells; (4) culturing a fused egg to obtain a cloned embryo; and (5) transplanting the cloned embryo into the oviduct or uterus of a recipient animal to obtain a cloned animal. Can show.
工程（１）で使用する核ドナー細胞はクローン動物の作製に一般的に用いられているものでよく、例えば、胎仔線維芽細胞、唾液腺幹細胞、卵管由来線維芽細胞などを使用することができ、これらの中でも胎仔線維芽細胞を使用するのが好ましい。これらの細胞は公知の方法によって調製することができる。調製した核ドナー細胞は、細胞周期を休止期に誘導する。休止期への誘導は、血清飢餓培養法（Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-66.）、接触阻止法（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）などにより行うことができ、核ドナー細胞として胎仔線維芽細胞を用いた場合には、血清飢餓培養法によって行うのが好ましい。 The nuclear donor cells used in step (1) may be those commonly used for the production of cloned animals. For example, fetal fibroblasts, salivary gland stem cells, oviduct-derived fibroblasts, and the like can be used. Of these, fetal fibroblasts are preferably used. These cells can be prepared by a known method. The prepared nuclear donor cells induce the cell cycle to resting. Induction to the resting phase is performed by serum starvation culture method (Campbell KHS, McWhir J, Ritchie WA, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-66.) Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF.Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.) When fetal fibroblasts are used as nuclear donor cells, it is preferably performed by a serum starvation culture method.
工程（２）におけるレシピエント卵の除核は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法に従って行うことができる。このような方法としては、例えば、Polejaeva IAらの文献 （Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）に記載されている方法などを挙げることができる。 Enucleation of the recipient egg in the step (2) can be performed according to a technique generally adopted for production of a cloned embryo. Examples of such methods include Polejaeva IA et al. (Polejaeva IA, Chen SH, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. The method described in Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.
工程（２）で使用するレシピエント卵は、ヒト以外の哺乳動物の卵であればどのようなものでもよいが、工程（１）で調製する核ドナー細胞と同じ種類の動物の卵を用いるのが好ましい。また、除核は未受精卵に対して行うことが好ましく、特に第一極体の放出後の成熟卵に対して行うのが好ましい。 The recipient egg used in step (2) may be any egg from mammals other than humans, but the same type of animal egg as the nuclear donor cell prepared in step (1) is used. Is preferred. In addition, enucleation is preferably performed on unfertilized eggs, particularly preferably on mature eggs after the first polar body has been released.
工程（３）におけるレシピエント卵と核ドナー細胞の融合は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気融合法、注入法などによって行うことができる。電気融合法は、例えば、Polejaeva IAらの文献（Polejaeva IA, Chen S-H, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86-90.）の記載に従って行うことができ、注入法はOnishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.）の記載に従って行うことができる。電気融合法による電気刺激は、核ドナー細胞の核が卵に移植され、正常な胚が形成され得る範囲内であれば特に限定されないが、例えば、直流パルスであれば電圧は100〜300V/mm、時間は10〜30 micro-sec、回数は1〜3回とするのが好ましく、交流を併用する場合は周波数は1〜5MHz、電圧は1〜10V、時間は1〜30secとするのが好ましい。融合処理後の卵には、活性化処理を行うのが好ましい。活性化処理は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、電気刺激や塩化ストロンチウム処理などにより行うことができる。電気刺激による活性化処理としては、電圧30〜200 V/mm、時間10〜200 micro-sec、1〜5 回の直流パルスを印加する方法などを例示できる。また、活性化処理は、融合処理から0〜6時間後に行うのが好ましい。また、活性化処理後の卵には、極体放出抑制処理を行うのが好ましい。極体放出抑制処理は、サイトカラシンなどを用いて行うことができる。 The fusion of the recipient egg and the nuclear donor cell in the step (3) can be performed by a technique generally employed for producing a cloned embryo, such as an electrofusion method or an injection method. For example, Polejaeva IA et al. (Polejaeva IA, Chen SH, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares D, Colman A, Campbell KH. Cloned Nature 2000; 407: 86-90.) and the injection method is Onishi A et al. (Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda). K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190.). The electrical stimulation by the electrofusion method is not particularly limited as long as the nucleus of the nuclear donor cell is transplanted into an egg and a normal embryo can be formed. For example, in the case of a direct current pulse, the voltage is 100 to 300 V / mm. The time is preferably 10 to 30 micro-sec and the number of times is preferably 1 to 3 times. When alternating current is used together, the frequency is preferably 1 to 5 MHz, the voltage is 1 to 10 V, and the time is preferably 1 to 30 sec. . It is preferable to perform an activation treatment on the egg after the fusion treatment. The activation treatment can be performed by a technique generally employed for producing a cloned embryo, for example, electrical stimulation or strontium chloride treatment. Examples of the activation treatment by electrical stimulation include a method of applying a voltage of 30 to 200 V / mm, a time of 10 to 200 micro-sec, and 1 to 5 direct current pulses. The activation treatment is preferably performed 0 to 6 hours after the fusion treatment. Moreover, it is preferable to perform polar body discharge | release suppression processing to the egg after an activation process. The polar body release inhibiting treatment can be performed using cytochalasin or the like.
工程（４）における融合卵の培養は、クローン胚の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Betthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。培地としては、NCNU23培地、TCM199、BECM、PZM培地などを使用することができる。 In the step (4), the fusion egg is cultured by a method generally employed for producing a cloned embryo, for example, Betthauser J et al. (Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J , Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of Cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.). As the medium, NCNU23 medium, TCM199, BECM, PZM medium, or the like can be used.
工程（５）におけるクローン胚の卵管あるいは子宮への移植は、クローン動物の作製に一般的に採用されている手法、例えば、Onishi Aらの文献（Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190）やBetthauser Jらの文献（Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, Childs L, Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.）の記載に従って行うことができる。レシピエント動物は、ヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されないが、核ドナー細胞を採取した動物と同じ種類の動物を用いることが好ましい。クローン胚は、正常なクローン動物に生育できるものであれば特に限定されないが、１細胞期から胚盤胞期の胚を使用するのが好ましい。 Transplantation of the cloned embryo into the oviduct or uterus in step (5) is a technique generally employed for the production of cloned animals, for example, Onishi A et al. (Onishi A, Iwamoto M, Akira T, Mikawa S , Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry ACF. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000; 289: 1188-1190) and Betthauser J et al. Eilertsen K, Enos J, Forsythe T, Golueke P, Jurgella G, Koppang R, Lesmeister T, Mallon K, Mell G, Misica P, Pace M, Pfister-Genskow M, Strelchenko N, Voelker G, Watt S, Thompson S, Bishop M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nature Biotechnology 2000; 18: 1055-1059.). The recipient animal is not particularly limited as long as it is a mammal other than a human, but it is preferable to use the same type of animal as the animal from which the nuclear donor cells were collected. The cloned embryo is not particularly limited as long as it can grow in a normal cloned animal, but it is preferable to use an embryo from the 1-cell stage to the blastocyst stage.
哺乳動物の種類は、ヒト以外の哺乳動物であればどのようなものでもよく、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サルなどが挙げることができる。これらの哺乳動物の中でもブタを特に好ましいものとして挙げることができる。これは、１）ブタはヒトと同じ手術（術具、術式）が利用できる、２）ブタではヒトの手術時の合併症が再現されることから、ヒトの前臨床試験が可能である、３）ブタではヒトと同じ投与量及び投与方法による薬効の検証が可能である、といった理由からである。 The mammals may be any mammals other than humans, such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats, horses, cows, sheep, pigs, goats, monkeys, etc. Can be mentioned. Among these mammals, pigs can be mentioned as particularly preferred. This is because 1) pigs can use the same surgery (operating tool, surgical method) as humans, and 2) human pigs can reproduce the complications of human surgery, so human preclinical studies are possible. 3) This is because in pigs, it is possible to verify the efficacy by the same dosage and administration method as in humans.
蛍光性タンパク質の変異体の発現は、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子を動物に導入することより行うことができる。 Expression of the fluorescent protein mutant can be performed by introducing a gene encoding the fluorescent protein mutant into the animal.
蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、市販のPlum遺伝子をもとに、当業者の既知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法（Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd ED., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989、及びCurrent Protocols in Molecular Biology， Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997)）などにより作製することができる。また、市販の変異用キット、例えば、QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)などを使って、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子を作製することもできる。 Genes encoding mutants of fluorescent proteins are based on commercially available Plum genes, and methods known to those skilled in the art, such as site-directed mutagenesis (Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd ED., Cold Spring). Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989, and Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997)). A gene encoding a fluorescent protein mutant can also be prepared using a commercially available mutation kit such as QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene).
遺伝子の導入は、トランスジェニック動物の作製に用いられる一般的な方法に従って行うことができる。前記したように、本発明の非ヒト哺乳動物はクローン動物であることが好ましいが、この場合、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子は核ドナー細胞に導入することが好ましい。核ドナー細胞へ遺伝子を導入する方法としては、例えば、細胞内に遺伝子を導入できるベクター（レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターなど）を使用する方法、電気パルスで遺伝子を導入する方法（エレクトロポレーション法）、細胞にガラス針などで直接遺伝子を注入する方法（マイクロインジェクション法）、リポソームに包含させて遺伝子を導入する方法などを挙げることができる。後述する実施例で述べるように、導入した遺伝子はメチル化によるサイレンシングを受ける可能性がある。これを避けるため、相同組換などにより、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子を、遺伝子を安定的に発現できる領域に導入してもよい。このような遺伝子を安定的に発現できる領域としては、ROSA26領域を例示できる。ROSA26領域は、マウスのものがよく知られているが、マウス以外の動物、例えば、ラット（Kobayashi et al., Stem Cells Dev. 2012 Nov 1;21(16):2981-6. doi: 10.1089/scd.2012.0065）やブタ（Li et al., Cell Res. 2014 Apr;24(4):501-4. doi: 10.1038/cr.2014.15.及びKong et al., PLoS One. 2014 Sep 18;9(9):e107945. doi: 10.1371/journal.pone.0107945.）などにおいても知られている。 The gene can be introduced according to a general method used for producing a transgenic animal. As described above, the non-human mammal of the present invention is preferably a cloned animal. In this case, it is preferable to introduce a gene encoding a fluorescent protein mutant into a nuclear donor cell. As a method for introducing a gene into a nuclear donor cell, for example, a method using a vector capable of introducing a gene into the cell (retroviral vector, adenoviral vector, etc.), a method for introducing a gene with an electric pulse (electroporation method) ), A method of directly injecting a gene into a cell with a glass needle or the like (microinjection method), a method of introducing a gene by inclusion in a liposome, and the like. As described in Examples below, the introduced gene may be silenced by methylation. In order to avoid this, a gene encoding a fluorescent protein variant may be introduced into a region where the gene can be stably expressed by homologous recombination or the like. An example of a region where such a gene can be stably expressed is the ROSA26 region. The ROSA26 region is well known for mice, but animals other than mice, such as rats (Kobayashi et al., Stem Cells Dev. 2012 Nov 1; 21 (16): 2981-6. Doi: 10.1089 / scd.2012.0065) and swine (Li et al., Cell Res. 2014 Apr; 24 (4): 501-4. doi: 10.1038 / cr.2014.15. and Kong et al., PLoS One. 2014 Sep 18; 9 ( 9): e107945. Doi: 10.1371 / journal.pone.0107945.).
蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子は、この遺伝子を適当なプロモーター下流に連結した遺伝子構築物とすることが好ましい。プロモーターとしては、非ヒト哺乳動物で作動可能なものであれば特に限定されないが、例えば、ウイルス（例、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルスなど）由来遺伝子プロモーター、各種哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ニワトリ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーターなどを挙げることができる。各哺乳動物由来のプロモーターとしては、例えば、アルブミン、エンドセリン、メタロチオネイン、平滑筋αアクチン、ポリペプチド鎖延長因子1α(EF-1α)、βアクチン、α及びβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク、血清アミロイドＰコンポーネント、レニンなどのプロモーターを挙げることができる。好ましいプロモーターとしては、βアクチンプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーターなどが挙げられる。遺伝子構築物においては、プロモーター配列の上流にエンハンサー配列を含んでいてもよい。使用できるエンハンサー配列としてはCMVエンハンサーなどが挙げられる。また、遺伝子構築物においては、必要に応じて、蛍光性タンパク質の変異体をコードする遺伝子の下流には、ポリAシグナルを連結してもよい。更に、必要に応じて真核生物遺伝子のイントロンの一部をプロモーター領域の5'上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3'下流に連結してもよい。 The gene encoding the fluorescent protein mutant is preferably a gene construct in which this gene is linked downstream of an appropriate promoter. The promoter is not particularly limited as long as it can operate in a non-human mammal. For example, a promoter derived from a virus (eg, cytomegalovirus, Moloney leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, etc.), various mammals ( Examples thereof include promoters derived from humans, pigs, chickens, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice and the like. Examples of promoters derived from each mammal include albumin, endothelin, metallothionein, smooth muscle α-actin, polypeptide chain elongation factor 1α (EF-1α), β-actin, α and β-myosin heavy chain, myosin light chain 1 and 2 And promoters such as myelin basic protein, serum amyloid P component, and renin. Preferred promoters include β-actin promoter and CMV (cytomegalovirus) promoter. The gene construct may contain an enhancer sequence upstream of the promoter sequence. Enhancer sequences that can be used include CMV enhancers. In the gene construct, a poly A signal may be linked downstream of the gene encoding the fluorescent protein mutant, if necessary. Furthermore, if necessary, a part of the intron of the eukaryotic gene may be linked 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3 ′ downstream of the translation region.
（Ｃ）蛍光性タンパク質の変異体を利用した移植方法
本発明の非ヒトクローン哺乳動物間の移植方法は、移植ドナーとする非ヒトクローン哺乳動物が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる蛍光性タンパク質を発現する非ヒト哺乳動物であり、移植レシピエントとする非ヒトクローン哺乳動物が上記の蛍光性タンパク質の変異体を発現する非ヒト哺乳動物であることを特徴とするものである。
(C) Transplantation method using mutant of fluorescent protein Transplantation method between non-human cloned mammals of the present invention is a method in which a non-human cloned mammal used as a transplant donor consists of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. It is a non-human mammal that expresses a protein, and the non-human cloned mammal that is a transplant recipient is a non-human mammal that expresses a mutant of the above-mentioned fluorescent protein.
クローン動物は遺伝的に同一であることから、これらの動物間では本来拒絶反応は起きない。しかし、通常、移植ドナー細胞等には追跡マーカーとして蛍光タンパク質を発現させるため、この蛍光タンパク質がレシピエント体内で抗原となり、拒絶反応を引き起こす。本発明の移植方法では、レシピエントに上記の蛍光性タンパク質の変異体を発現させ、これにより拒絶反応を回避する。 Since cloned animals are genetically identical, there is essentially no rejection between these animals. However, since a fluorescent protein is usually expressed as a tracking marker in transplanted donor cells and the like, this fluorescent protein becomes an antigen in the recipient body and causes rejection. In the transplantation method of the present invention, the above-mentioned fluorescent protein mutant is expressed in the recipient, thereby avoiding rejection.
本発明の移植方法は、例えば、以下のような用途に用いることができる。
１）ヒト膵島移植の予備実験
本発明の移植方法は、ヒトの膵島移植において、膵島の機能をより高く発揮させるべく、ヒト以外の哺乳動物間で予備実験を行い、どこに移植すれば定着率が高いのか、さらには血糖値改善の効果が高いかを確認(つまり移植部位の決定)するために用いることができる。哺乳動物としては、ブタを用いるのが好ましい。ブタでは、ヒトの臨床で使用される術具(デバイス)・術式をそのまま利用して移植手術が可能であり、この点が大きなメリットである。また、マウスはヒトと比べ血糖値が高めであるのに対し、ブタの血糖値はヒトに近く、ブタで得た知見をそのままヒトへ外挿できるというメリットもある。
The transplantation method of the present invention can be used for the following applications, for example.
1) Preliminary experiment for human islet transplantation In the transplantation method of the present invention, in the islet transplantation of humans, a preliminary experiment is conducted between mammals other than humans in order to make the function of the islets higher. It can be used to confirm whether the effect is high or the effect of improving blood glucose level is high (that is, determination of the transplant site). As the mammal, pigs are preferably used. In pigs, transplantation surgery can be performed using the surgical instruments (devices) and methods used in human clinical practice, which is a great advantage. In addition, mice have higher blood glucose levels than humans, whereas pigs have blood glucose levels that are close to those of humans, and there is an advantage that the knowledge obtained in pigs can be extrapolated to humans as it is.
２）癌細胞移植後の転移の追跡
本発明の移植方法は、Plumで標識された癌細胞を移植して、転移の状況を観察するという用途にも用いることができる。光の組織透過性は、その波長に大きく影響するため、GFPと比べ、長波長のPlumタンパク質はin vivo imagingに適している(組織透過性が良い)。即ち、組織深部の蛍光イメージングを感度良く可能にすることができる。
2) Tracking of metastasis after cancer cell transplantation The transplantation method of the present invention can also be used for the purpose of transplanting cancer cells labeled with Plum and observing the status of metastasis. Since tissue permeability of light greatly affects its wavelength, Plum protein with a longer wavelength is suitable for in vivo imaging (good tissue permeability) compared to GFP. That is, fluorescence imaging of deep tissue can be made with high sensitivity.
３）その他の用途
本発明の移植方法は、上記以外にも、細胞シート・オルガノイド等の人工組織構造体移植、肝細胞・心筋細胞等の細胞移植、中枢・末梢神経細胞移植、網膜修復等を目的とする眼球への細胞移植、軟骨・靱帯・人工骨等の移植などに用いることができる。このような用途においても、哺乳動物としては、ブタを用いるのが好ましい。蛍光タンパク質発現クローンブタと非蛍光タンパク質発現クローンブタの組み合わせ、あるいは蛍光タンパク質発現細胞とその細胞に免疫寛容なクローンブタの組み合わせを用いることの、小実験動物（マウス・ラット）にはないメリットは、ブタの体格がヒトに近く、ヒト用の医療機器や術式が適用できる点である。例えば、ヒトに用いられる内視鏡術によって、人工組織や細胞をブタに移植することができる。細胞や人工組織構造体の移植を伴う再生医療では、自家移植が前提となる場合が多いので、本発明で実現する移植用ドナーとレシピエントの組み合わせは、自家移植の状況を再現していることになる。また、細胞や人工組織構造体の移植研究においては、ヒトに外挿できる移植のスケール（移植する細胞の数など）で実験が行われることが必須である。ヒトへの有効性を主張するためには、小さなマウス・ラットのスケールでのデータではなく、体格がヒトに近いブタでの実施が必須である。
3) Other uses In addition to the above, the transplantation method of the present invention includes transplantation of artificial tissue structures such as cell sheets and organoids, cell transplantation of hepatocytes / cardiomyocytes, central / peripheral nerve cell transplantation, retinal repair, etc. It can be used for cell transplantation to the target eyeball, transplantation of cartilage, ligament, artificial bone, and the like. Also in such a use, it is preferable to use a pig as a mammal. The advantages of using a combination of fluorescent protein-expressing clone pigs and non-fluorescent protein-expressing cloned pigs, or a combination of fluorescent protein-expressing cells and cloned pigs that are immunotolerant to the cells, are not found in small experimental animals (mouse and rat). The physique of pigs is close to that of humans, and human medical devices and procedures can be applied. For example, artificial tissues and cells can be transplanted into pigs by endoscopy used in humans. In regenerative medicine involving transplantation of cells and artificial tissue structures, autotransplantation is often a prerequisite, so the combination of transplantation donor and recipient realized in the present invention reproduces the situation of autotransplantation. become. In addition, in transplantation research of cells and artificial tissue structures, it is essential to conduct experiments on a transplantation scale (such as the number of cells to be transplanted) that can be extrapolated to humans. In order to insist on human efficacy, it is essential to use pigs that are close to humans, not small mouse / rat scale data.
次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to these Examples.
〔材料と方法〕
（１）動物の管理と試薬
本実施例に記載したすべての動物実験は、明治大学の施設内動物管理使用委員会によって承認された(IAUCU-11-0002, -12-0008)。特記しない限り試薬は、Sigma-Aldrich社(St. Louis, MO, USA)から購入した。
[Materials and methods]
(1) Animal management and reagents All animal experiments described in this example were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Meiji University (IAUCU-11-0002, -12-0008). Unless otherwise noted, reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
（２）mPlum発現ベクターの構築
pCX-Plum-puroRベクター（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）を基にmPlum発現ベクターを構築した。本実施例で使用される発現ベクターは、サイトメガロウイルス最初期（IE）エンハンサーの付いたニワトリβアクチンプロモーター（CAGプロモーター）、mPlum cDNA、ポリアデニル化シグナルを含むウサギβグロビン3'隣接配列、及びホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターによって駆動されるピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ遺伝子からなった（図１Ａ）。発現ベクター中のPlum cDNAのY68G変異は、部位特異的突然変異誘発によって誘導された。最後に、構築されたmPlum発現ベクター（pCX-mPlum-puroRと名付けられた（図１Ａ））は、3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)を用いた配列決定により確認された。4.3-kbの導入遺伝子断片は、SalI (Takara Bio、Shiga, Japan)及びBamHI (Takara Bio)を用いた酵素消化によって プラスミドベクターから切り出され、ゲル電気泳動により分離され、QIAquick gel extraction kit (QIAGEN, Hilden, Germany)を用いて精製された。
(2) Construction of mPlum expression vector
An mPlum expression vector was constructed based on the pCX-Plum-puroR vector (Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177). The expression vector used in this example is a chicken β-actin promoter (CAG promoter) with cytomegalovirus immediate early (IE) enhancer, mPlum cDNA, rabbit β-globin 3 ′ flanking sequence containing polyadenylation signal, and phospho It consisted of the puromycin N-acetyltransferase gene driven by the glycerate kinase (PGK) promoter (FIG. 1A). The Y68G mutation of Plum cDNA in the expression vector was induced by site-directed mutagenesis. Finally, the constructed mPlum expression vector (named pCX-mPlum-puroR (FIG. 1A)) was confirmed by sequencing using a 3130xl Genetic Analyzer (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). The 4.3-kb transgene fragment was excised from the plasmid vector by enzymatic digestion using SalI (Takara Bio, Shiga, Japan) and BamHI (Takara Bio), separated by gel electrophoresis, and QIAquick gel extraction kit (QIAGEN, Hilden, Germany).
（３）核ドナー細胞の調製
Kurome M et al., J Reprod Dev 435 2008; 54: 254-258の記載に従い、雌ブタ胎仔線維芽細胞の初代培養を核ドナー細胞のために準備した。ブタ胎仔線維芽細胞（PFFs）を、15％ウシ胎仔血清(FBS, Bovogen Biologicals Pty Ltd., Victoria, Australia)及び抗生物質-抗真菌剤溶液(Life Technologies)を補充した最小必須培地(MEM Alpha, Life Technologies)中で、I型コラーゲン被覆ディッシュ(AGC Techno Glass, Shizuoka, Japan)を用い、37℃の5％CO2を含む加湿雰囲気中で、培養した。
(3) Preparation of nuclear donor cells
Primary cultures of sow fetal fibroblasts were prepared for nuclear donor cells as described by Kurome M et al., J Reprod Dev 435 2008; 54: 254-258. Porcine fetal fibroblasts (PFFs) in minimal essential medium (MEM Alpha, supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS, Bovogen Biologicals Pty Ltd., Victoria, Australia) and antibiotic-antifungal solution (Life Technologies) In Life Technologies), type I collagen-coated dishes (AGC Techno Glass, Shizuoka, Japan) were used and cultured in a humidified atmosphere containing 5% CO 2 at 37 ° C.
トランスフェクションのために、PFFsを70〜90％コンフルエンスまで培養し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）で2回洗浄し、0.05％トリプシン−エチレンジアミン四酢酸(trypsin-EDTA, Life Technologies)で処理した後、回収した。その後、回収した細胞（6.0×105）を、Neon Transfection System kit (Life Technologies)の一部として供給されている60μlの再懸濁緩衝液に再懸濁し、1.5μgの線形化pCX-mPlum-puroRを加えた。次いで、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの条件は、パルス電圧を1100 Vとし、パルス幅を30ミリ秒とし、パルス数を1とした。エレクトロポレーションから48時間後、細胞を2.5 μg/mlのピューロマイシンを含む培地に移した。培養12日目に、ピューロマイシン耐性細胞を回収し、I型コラーゲン被覆ディッシュ(AGC Techno Glass)上に播種した。これらの細胞（mPlum-PFFs）を2〜3日以内にコンフルエンスまで増殖させ、次いでmPlumを発現するトランスジェニック胎仔を作製するための核ドナー細胞として後で使用するために凍結保存した。以前に作製された（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）Plum導入遺伝子を発現する対照PFFs（Plum-PFFs）も培養した。 For transfection, PFFs were cultured to 70-90% confluence, washed twice with Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), and 0.05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (trypsin-EDTA, Life Technologies). After treatment, it was collected. The recovered cells (6.0 × 10 5 ) are then resuspended in 60 μl of resuspension buffer supplied as part of the Neon Transfection System kit (Life Technologies) and 1.5 μg of linearized pCX-mPlum- Added puroR. The cells were then electroporated. The electroporation conditions were a pulse voltage of 1100 V, a pulse width of 30 milliseconds, and a pulse number of 1. Forty-eight hours after electroporation, cells were transferred to medium containing 2.5 μg / ml puromycin. On day 12 of culture, puromycin-resistant cells were collected and seeded on a type I collagen-coated dish (AGC Techno Glass). These cells (mPlum-PFFs) were grown to confluence within 2-3 days and then cryopreserved for later use as nuclear donor cells to generate transgenic fetuses expressing mPlum. Control PFFs (Plum-PFFs) expressing Plum transgenes were also cultured previously produced (Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177).
（４）フローサイトメトリー分析
確立された形質転換線維芽細胞の蛍光及びトランスジェニッククローン胎仔からの血液細胞を、561-nm (黄色−緑色)レーザーを備えたBD FACSAria III cell sorter (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)によって分析した。赤血球を除去するために、全血細胞をBD Pharm Lyse (Becton, Dickinson and Company) 試薬で処理した。前方及び側方散乱特性に基づいたゲーティング戦略によってリンパ球集団を選択した。
(4) Flow cytometric analysis Fluorescence of established transformed fibroblasts and blood cells from transgenic cloned fetuses were analyzed using a BD FACSAria III cell sorter (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA). To remove red blood cells, whole blood cells were treated with BD Pharm Lyse (Becton, Dickinson and Company) reagent. Lymphocyte populations were selected by a gating strategy based on forward and side scatter characteristics.
（５）体細胞核移植（SCNT）
SCNTは、Matsunari H et al., Cloning Stem Cells 2008; 10: 313-323及びWatanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177の記載の方法に若干の変更を加えて行った。簡単に説明すると、第一極体を含み、インビトロで成熟した卵母細胞を、面取りピペットを用いて、10mMのHEPES及び0.3％(w/v)ポリビニルピロリドン(HEPES-TL-PVP)を含むタイロード乳糖培地中で、0.1μg/mlのデメコルチン、5μg/mlのサイトカラシンB(CB)、及び10% FBSの存在下で、極体及び隣接する細胞質を穏やかに吸引することによって除核した。
(5) Somatic cell nuclear transfer (SCNT)
SCNT was performed by slightly modifying the method described in Matsunari H et al., Cloning Stem Cells 2008; 10: 313-323 and Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177. Briefly, an oocyte containing a first polar body and matured in vitro, using a beveled pipette, a tie containing 10 mM HEPES and 0.3% (w / v) polyvinylpyrrolidone (HEPES-TL-PVP). Enucleation was performed by gently aspirating the polar body and adjacent cytoplasm in the presence of 0.1 μg / ml demecortin, 5 μg / ml cytochalasin B (CB), and 10% FBS in loaded lactose medium.
核ドナー細胞は、2日間の血清飢餓による細胞周期同期化後に使用した。一つの核ドナー細胞を、除核された卵母細胞の囲卵腔に挿入した。核ドナー細胞-卵母細胞複合体を、0.15mM MgSO4, 0.01%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)及び0.5 mM HEPESを含む280mMのマンニトール溶液(pH 7.2; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)に入れ、その後、二つの電極針間に保持した。単一の直流（DC）パルス（267 V/mm, 20 μsec）とパルス前後の交流（AC）フィールド（2 V、1 MHz、5 sec）によって、細胞融合装置(LF201, Nepa Gene, Chiba, Japan)を用いて膜融合を誘導した。再構築された胚を、ウシ血清アルブミン（BSA）を補充したブタ受精卵培地-5(PZM-5; Research Institute for the Functional Peptides, Yamagata, Japan)中で、1〜1.5時間培養し、その後に電気的活性化を行った。電気的活性化を誘導するため、再構築された胚を、融合チャンバースライドの二つのワイヤ電極間（これらは1.0 mm離れている）に並べた。融合チャンバースライドには、280 mM マンニトール、0.05 mM CaCl2、0.1 mM MgSO4 及び 0.01% (w/v) PVAからなる活性化溶液が充填されている。電気パルス機(Multiporator, Eppendorf, Hamburg, Germany)を用いて、150V/mmの単一のDCパルスが、100 μsec間適用された。活性化後、再構築された胚を、PZM-5中で3時間、5 μg/ml CB及び500 nM Scriptaidの存在下で、培養し、その後更に12〜15時間、500 nM Scriptaidの存在下で培養した。これらの処理の後、クローン胚は、PZM-5中で7日間培養し、それらのインビトロでの発達を評価した。 Nuclear donor cells were used after cell cycle synchronization with 2 days of serum starvation. One nuclear donor cell was inserted into the ovum cavity of the enucleated oocyte. Nuclear donor cells - oocyte complex, 0.15mM MgSO 4, 0.01% ( w / v) polyvinyl alcohol (PVA) and mannitol solutions of 280mM containing 0.5 mM HEPES (pH 7.2; Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) to And then held between the two electrode needles. Cell fusion device (LF201, Nepa Gene, Chiba, Japan) by single direct current (DC) pulse (267 V / mm, 20 μsec) and alternating current (AC) field before and after pulse (2 V, 1 MHz, 5 sec) ) Was used to induce membrane fusion. The reconstructed embryo is cultured for 1 to 1.5 hours in porcine fertilized egg medium-5 (PZM-5; Research Institute for the Functional Peptides, Yamagata, Japan) supplemented with bovine serum albumin (BSA). Electrical activation was performed. To induce electrical activation, reconstructed embryos were aligned between the two wire electrodes of the fusion chamber slide, which are 1.0 mm apart. The fusion chamber slide is filled with an activation solution consisting of 280 mM mannitol, 0.05 mM CaCl 2 , 0.1 mM MgSO 4 and 0.01% (w / v) PVA. A single DC pulse of 150 V / mm was applied for 100 μsec using an electric pulse machine (Multiporator, Eppendorf, Hamburg, Germany). After activation, reconstructed embryos were cultured in PZM-5 for 3 hours in the presence of 5 μg / ml CB and 500 nM Scriptaid, then for another 12-15 hours in the presence of 500 nM Scriptaid. Cultured. After these treatments, cloned embryos were cultured in PZM-5 for 7 days and their in vitro development was evaluated.
胚培養を、38.5 ℃で、5% CO2、5% O2、及び90% N2の加湿雰囲気中で行った。桑実胚期の後、胚を、10％FBSを補充したPZM-5中で培養した。 Embryo culture was performed at 38.5 ° C. in a humidified atmosphere of 5% CO 2 , 5% O 2 , and 90% N 2 . After the morula stage, embryos were cultured in PZM-5 supplemented with 10% FBS.
（６）レシピエントブタへのクローン胚の移植
体重100〜105 kgの未経産ブタ(Large White/Landrace × Duroc)をクローン胚のレシピエントとして用いた。発情を誘導するために、ブタに、1,000 IUのウマ絨毛性ゴナドトロピン(eCG, ASKA Pharmaceutical, Tokyo, Japan)の単回筋肉内注射をした。1,500 IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG, Kyoritsu Pharmaceutical, Tokyo, Japan)の筋肉内注射によって排卵を誘発させた。この注射はeCG注射の66時間後に行った。hCG注射の約146時間後に、5又は6日間培養されたクローン胚をレシピエントの子宮角に外科的に移植した。
(6) Transplantation of cloned embryos into recipient pigs A heifer (Large White / Landrace x Duroc) weighing 100 to 105 kg was used as a recipient of cloned embryos. To induce estrus, pigs received a single intramuscular injection of 1,000 IU of equine chorionic gonadotropin (eCG, ASKA Pharmaceutical, Tokyo, Japan). Ovulation was induced by intramuscular injection of 1,500 IU human chorionic gonadotropin (hCG, Kyoritsu Pharmaceutical, Tokyo, Japan). This injection was made 66 hours after eCG injection. Approximately 146 hours after hCG injection, cloned embryos cultured for 5 or 6 days were surgically transplanted into the uterine horn of the recipient.
（７）トランスジェニッククローン胚、胎仔、子豚の生産
7日目のクローン胚盤胞の一部を、20％のエチレングリコール(Nacalai Tesque)及び5mg/ mlのHoechst 33342を含むHEPES-TL-PVPとともに、ガラススライド(Matsunami Glass Ind., Ltd., Osaka, Japan)上に載せた。細胞数を求めるため、これらの胚を蛍光顕微鏡(TE-300 microscope, Nikon, Tokyo, Japan)で調べた。
(7) Production of transgenic cloned embryos, fetuses and piglets
A portion of the 7th day cloned blastocyst with a glass slide (Matsunami Glass Ind., Ltd., Osaka, together with 20% ethylene glycol (Nacalai Tesque) and HEPES-TL-PVP containing 5 mg / ml Hoechst 33342 , Japan). To determine the number of cells, these embryos were examined with a fluorescence microscope (TE-300 microscope, Nikon, Tokyo, Japan).
クローン胎仔を回収するために、SCNT胚を移植したレシピエントブタを、妊娠37-38日に安楽死させた。これらの胎仔をmPlum導入遺伝子の組込み及び発現を調べるために使用した。若返らせた線維芽細胞(NeomPlum-PFFs)の生成のためにも胎仔を使用した。mPlumを発現するクローン子豚を生産するために、核ドナーとしてNeomPlum-PFFsを用いて、SCNTを行った。クローン子豚の組織/器官における蛍光を、蛍光顕微鏡(MVX10, Olympus; excitation, 532.5-587.5 nm; emission, 607.5-682.5 nm)を用いて調べた。 To recover the cloned fetuses, recipient pigs transplanted with SCNT embryos were euthanized at 37-38 gestation. These fetuses were used to examine the integration and expression of the mPlum transgene. Fetuses were also used for the generation of rejuvenated fibroblasts (NeomPlum-PFFs). To produce cloned piglets expressing mPlum, SCNT was performed using NeomPlum-PFFs as nuclear donors. Fluorescence in tissues / organs of cloned piglets was examined using a fluorescence microscope (MVX10, Olympus; excitation, 532.5-587.5 nm; emission, 607.5-682.5 nm).
（８）サザンブロット分析による導入遺伝子のコピー数の推定
ゲノムDNAを、トランスジェニッククローン胎仔の皮膚サンプルから、DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN)を用いて抽出した。精製ゲノムDNA（5μg）をPstI(Takara Bio)で消化し、ゲル電気泳動で分離し、ナイロンメンブレン(Hybond N+, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, UK)に移した。膜をブロッキング試薬(Blocking One, Nacalai Tesque)で、25℃、30分間ブロックした。ブロッキング後、膜を、ハイブリダイゼーション溶液(DIG Easy Hyb, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)中でインキュベートし、DNA標識試薬(DIG DNA Labeling Mix, Roche Diagnostics)を用いたPCRによって調製されたジゴキシゲニン（DIG）標識mPlumプローブとハイブリダイズさせた。化学発光試薬(DIG Luminescent Detection Kit, Roche Diagnostics)を用いてブロットを可視化し、シグナルをImageQuant LAS-4000 system (GE Healthcare Bio-Sciences)で検出及び画像化した。ブタのゲノムに組み込まれた導入遺伝子のコピー数を、ハイブリダイゼーションシグナルとコピー数コントロールのそれとを比較することによって決定した。標準シリーズ（二倍体ゲノムあたり1〜10コピー）を作成するために、コピー数コントロールを希釈した。
(8) Estimation of transgene copy number by Southern blot analysis Genomic DNA was extracted from skin samples of transgenic clone fetuses using DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN). Purified genomic DNA (5 μg) was digested with PstI (Takara Bio), separated by gel electrophoresis, and transferred to a nylon membrane (Hybond N +, GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, UK). The membrane was blocked with blocking reagent (Blocking One, Nacalai Tesque) for 30 minutes at 25 ° C. After blocking, the membranes were incubated in hybridization solution (DIG Easy Hyb, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) and digoxigenin (DIG) prepared by PCR using DNA labeling reagent (DIG DNA Labeling Mix, Roche Diagnostics) Hybridized with labeled mPlum probe. Blots were visualized using a chemiluminescent reagent (DIG Luminescent Detection Kit, Roche Diagnostics), and signals were detected and imaged with the ImageQuant LAS-4000 system (GE Healthcare Bio-Sciences). The copy number of the transgene integrated into the pig genome was determined by comparing the hybridization signal with that of the copy number control. The copy number control was diluted to create a standard series (1-10 copies per diploid genome).
（９）遺伝子型決定
mPlum導入遺伝子を、直接ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、胚盤胞からMightyAmp DNA polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan)を用いて、増幅した。プライマー配列は、5’-CTACAAGACCGACATCAAGCTG -3’（配列番号３）及び 5’-ACAGCTATGACTGGGAGTAGTCAGG-3’ （配列番号４）である。その後、Nested PCRを、適切なプライマー（5'-ACGAGGACTACACCATCGTGG-3'（配列番号５）および5'-TGTTCATGGCAGCCAGCATATGG-3'（配列番号６））で、PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio)を用いて、行った。Matsunari H et al., J Reprod Dev 2012; 58: 599-608の記載に従って単為生殖胚を作製した。
(9) Genotyping
The mPlum transgene was amplified from blastocysts by direct polymerase chain reaction (PCR) using Mighty Amp DNA polymerase (Takara Bio, Shiga, Japan). The primer sequences are 5′-CTACAAGACCGACATCAAGCTG-3 ′ (SEQ ID NO: 3) and 5′-ACAGCTATGACTGGGAGTAGTCAGG-3 ′ (SEQ ID NO: 4). Then, Nested PCR was performed using PrimeSTAR HS DNA polymerase (Takara Bio) with appropriate primers (5′-ACGAGGACTACACCATCGTGG-3 ′ (SEQ ID NO: 5) and 5′-TGTTCATGGCAGCCAGCATATGG-3 ′ (SEQ ID NO: 6)), went. Parthenogenetic embryos were prepared as described in Matsunari H et al., J Reprod Dev 2012; 58: 599-608.
（１０）ウェスタンブロット分析
クローン胎仔の皮膚及び肝臓を、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Nacalai Tesque)を含む溶解及び抽出緩衝液(RIPA buffer, Thermo Scientific, MA, USA)中でホモジナイズし、4℃で5分遠心分離（12,000×g）し、上清を集めた。サンプルのタンパク質濃度を、Lowry法に基づくDCタンパク質アッセイ(Bio-Rad, CA, USA)を用いて定量した。
(10) Western blot analysis Clonal fetal skin and liver are homogenized in lysis and extraction buffer (RIPA buffer, Thermo Scientific, MA, USA) containing a protease inhibitor cocktail (Nacalai Tesque) for 5 minutes at 4 ° C. The supernatant was collected by centrifugation (12,000 × g). The protein concentration of the samples was quantified using a DC protein assay based on the Lowry method (Bio-Rad, CA, USA).
抽出物からの約10μgのタンパク質を10％SDS-PAGEに供し、エレクトロブロッティングによってHybond-P PVDF膜(GE Healthcare Bio-Sciences, NJ, USA)に移した。膜は、Blocking One (Nacalai Tesque)で、25℃で30分間ブロックした。ブロッキング後、膜を、Plumタンパク質を認識する抗DsRed抗体(1:1,000 dilution; Takara bio)と共に25℃で1時間インキュベートし、続いて、HRP結合抗ウサギIgG抗体(1:10,000 dilution; Santa Cruz Biotechnology) と共に25℃で1時間インキュベートした。ブロットを、ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare Bio-Sciences)を用いて、可視化した。シグナルを、ImageQuant LAS-4000 system (GE Healthcare Bio-Sciences)を用いて、検出及び画像化した。 Approximately 10 μg of protein from the extract was subjected to 10% SDS-PAGE and transferred to Hybond-P PVDF membrane (GE Healthcare Bio-Sciences, NJ, USA) by electroblotting. The membrane was blocked with Blocking One (Nacalai Tesque) for 30 minutes at 25 ° C. After blocking, the membrane was incubated with anti-DsRed antibody that recognizes Plum protein (1: 1,000 dilution; Takara bio) for 1 hour at 25 ° C., followed by HRP-conjugated anti-rabbit IgG antibody (1: 10,000 dilution; Santa Cruz Biotechnology ) At 25 ° C. for 1 hour. Blots were visualized using ECL Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare Bio-Sciences). The signal was detected and imaged using the ImageQuant LAS-4000 system (GE Healthcare Bio-Sciences).
（１１）免疫組織化学
得られたクローン子豚から摘出された腎臓及び心臓組織を、4％パラホルムアルデヒド溶液(Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)中で固定し、パラフィンに包埋し、切片化し、標準的な方法を用いてヘマトキシリンで染色した。固定化切片を、ブロッキング溶液(2% BSA/DPBS)と共に1時間インキュベーションし、次いで、ウサギ抗DsRed抗体(Takara bio)で1時間処理した。過剰な抗体を除去した後、Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG(Life Technologies)と共に2時間インキュベートした。スライドを、Biorevo BZ9000 microscope (Keyence, Osaka, Japan)を用いて可視化した。
(11) Immunohistochemistry Kidney and heart tissues extracted from the obtained cloned piglets were fixed in 4% paraformaldehyde solution (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan), embedded in paraffin, and sectioned. Stained with hematoxylin using standard methods. Immobilized sections were incubated with blocking solution (2% BSA / DPBS) for 1 hour and then treated with rabbit anti-DsRed antibody (Takara bio) for 1 hour. After removing excess antibody, it was incubated with Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG (Life Technologies) for 2 hours. The slides were visualized using a Biorevo BZ9000 microscope (Keyence, Osaka, Japan).
（１２）DNAメチル化解析
ゲノムDNA抽出及び亜硫酸水素変換を、Arai Y et al., Genesis 2013; 51: 763-776の記載に従って行った。簡単に説明すると、ゲノムDNAを、DNA精製キット(DNeasy Blood & Tissue Kit, QIAGEN)を用いて、胎仔から単離された線維芽細胞から精製し、制限酵素HindIII(Takara Bio)で消化した。QIAquickゲル抽出キット（QIAGEN）を用いて消化されたゲノムDNAを精製した後、ゲノムDNAの亜硫酸水素変換を、EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA)を用いて行った。亜硫酸水素塩処理されたゲノムDNAを、BioTaq HS DNA polymerase (Bioline, London, UK)で、ニワトリβ-アクチンプロモーターに特異的なプライマー(Forward, 5’-TTTGTGGTTGYGTGAAAGTTTTG-3’（配列番号７）; Reverse, 5’-CCACACCCCCTACTCACC-3’ （配列番号８）)を用いて、増幅した。PCRは、以下の条件で行った： 95℃, 10 min; 40 cycles of 95℃, 30 sec; 60℃, 30 sec; 72℃, 1 min; final extension 72 C, 2 min。増幅したPCR産物を、pGEM T-Easyベクター(Promega, Madison, WI, USA)にクローニングし、メチル化状態を決定するために6〜8個のクローンを配列決定した。
(12) DNA methylation analysis Genomic DNA extraction and bisulfite conversion were performed as described in Arai Y et al., Genesis 2013; 51: 763-776. Briefly, genomic DNA was purified from fibroblasts isolated from fetuses using a DNA purification kit (DNeasy Blood & Tissue Kit, QIAGEN) and digested with restriction enzyme HindIII (Takara Bio). After purification of the digested genomic DNA using the QIAquick gel extraction kit (QIAGEN), the bisulfite conversion of the genomic DNA was performed using the EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA). Bisulfite-treated genomic DNA was converted into a primer specific for the chicken β-actin promoter (Forward, 5'-TTTGTGGTTGYGTGAAAGTTTTG-3 '(SEQ ID NO: 7)) using BioTaq HS DNA polymerase (Bioline, London, UK); Reverse , 5′-CCACACCCCCTACTCACC-3 ′ (SEQ ID NO: 8)). PCR was performed under the following conditions: 95 ° C, 10 min; 40 cycles of 95 ° C, 30 sec; 60 ° C, 30 sec; 72 ° C, 1 min; final extension 72 C, 2 min. The amplified PCR product was cloned into the pGEM T-Easy vector (Promega, Madison, Wis., USA) and 6-8 clones were sequenced to determine methylation status.
（１３）統計分析
実験結果を、平均（SEM）の平均±標準誤差として表した。データを、SPSS 16.0 software (SPSS, Chicago, IL, USA)を用いて解析した。比例したデータについては、群間の差は、χ2検定を用いて分析した。胚盤胞の細胞数データについては、群間の差は、スチューデントのt検定によって決定した。有意水準は、P <0.05に設定した。
(13) Statistical analysis The experimental results were expressed as mean (SEM) mean ± standard error. Data was analyzed using SPSS 16.0 software (SPSS, Chicago, IL, USA). For proportional data, differences between groups were analyzed using the χ2 test. For blastocyst cell number data, differences between groups were determined by Student's t test. The significance level was set at P <0.05.
〔実験結果〕
（１）mPlum遺伝子を導入した核ドナー細胞の調製と体細胞核移植胚の生産
mPlum-PFFsの形態や増殖能は、トランスフェクション及びピューロマイシン選択後に正常だった。mPlum-PFFsを蛍光顕微鏡で調べると、それらは蛍光を発していなかった（図１Ｄ、Ｄ’）。
〔Experimental result〕
(1) Preparation of nuclear donor cells transfected with mPlum gene and production of somatic cell nuclear transfer embryos
The morphology and proliferation ability of mPlum-PFFs were normal after transfection and puromycin selection. When mPlum-PFFs were examined with a fluorescence microscope, they did not fluoresce (FIG. 1D, D ′).
全部で127の核移植胚を、核ドナーとしてmPlum-PFFsを使用して再構築した。正常卵割率及び胚盤胞形成率は、それぞれ81.9％（104/127）と75.6％（96/126）であった。得られた胚盤胞における細胞の平均数は109.8±4.5だった。胚発生と胚盤胞の細胞数は、本発明者らの以前の研究で作製された同じPFFs（非トランスフェクト）及びPlum遺伝子導入PFFsを用いたSCNT胚に匹敵した（Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177）。 A total of 127 nuclear transfer embryos were reconstructed using mPlum-PFFs as nuclear donors. The normal cleavage rate and blastocyst formation rate were 81.9% (104/127) and 75.6% (96/126), respectively. The average number of cells in the resulting blastocyst was 109.8 ± 4.5. Embryogenesis and blastocyst cell numbers were comparable to SCNT embryos using the same PFFs (untransfected) and Plum transgenic PFFs generated in our previous studies (Watanabe M et al., J Reprod Dev 2015; 61: 169-177).
蛍光はクローン胚盤胞のいずれにおいても検出されなかった（図２Ｃ、Ｃ’）。一方、それらの胚盤胞はPlum導入遺伝子を有していることがPCR分析によって確認された（図２Ｄ）。 Fluorescence was not detected in any of the clonal blastocysts (FIG. 2C, C ′). On the other hand, these blastocysts were confirmed by PCR analysis to have a Plum transgene (FIG. 2D).
（２）mPlum遺伝子を有するトランスジェニッククローン胎仔の生産
全部で71の核移植胚を一頭のレシピエントブタに移植した。そのレシピエントブタから、37-38日目に開腹によって、8個体（11.3％）の胎仔を得た（表１）。
(2) Production of transgenic cloned fetuses having mPlum gene A total of 71 nuclear transfer embryos were transferred to one recipient pig. Eight (11.3%) fetuses were obtained from the recipient pigs by laparotomy on days 37-38 (Table 1).
これらの胎仔は、励起下でPlumの蛍光を発しなかった（図３Ｃ、Ｃ’）。皮膚を、線維芽細胞(NeomPlum-PFFs)の初代培養を確立するために、クローン胎仔から採取した（図３Ｈ、Ｈ’）。サザンブロット分析は、1〜10コピーの導入遺伝子が線維芽細胞に組み込まれたことを明らかにした（図３Ｄ）。ウェスタンブロット分析は、mPlumタンパク質がトランスジェニッククローン胎仔＃2おいてのみ発現したことを示した（図３Ｅ）。フローサイトメトリーを用いた分析は、＃2胎仔から樹立された線維芽細胞が、野生型（WT）と同様に、Plum蛍光を発現しなかったことを確認した（図３Ｉ）。 These fetuses did not emit Plum fluorescence under excitation (FIG. 3C, C ′). Skin was harvested from cloned fetuses to establish primary cultures of fibroblasts (NeomPlum-PFFs) (Fig. 3H, H '). Southern blot analysis revealed that 1-10 copies of the transgene were integrated into the fibroblasts (FIG. 3D). Western blot analysis showed that mPlum protein was expressed only in transgenic clone fetus # 2 (FIG. 3E). Analysis using flow cytometry confirmed that fibroblasts established from # 2 fetuses did not express Plum fluorescence, as did wild type (WT) (FIG. 3I).
本発明者らは、8個体の胎仔から確立された線維芽細胞を用いて、導入遺伝子のCAGプロモーター領域のDNAのメチル化分析もおこなった。結果は、トランスジェニック胎仔#6、7、及び8において導入遺伝子のCAGプロモーター領域が高度にメチル化された状態であったことを示した（図４）。このことは、これらの胎仔においてmPlumタンパク質の発現が阻害されていたことを示唆する。 The present inventors also performed DNA methylation analysis of the CAG promoter region of the transgene using fibroblasts established from 8 fetuses. The results indicated that the CAG promoter region of the transgene was highly methylated in transgenic fetuses # 6, 7, and 8 (FIG. 4). This suggests that mPlum protein expression was inhibited in these fetuses.
しかし、ウェスタンブロット法によって全くmPlumの発現を示さないクローン胎仔には、CAGプロモーター領域のメチル化状態の低い胎仔も含まれていた（＃1、3、4、5）。このことは、導入遺伝子が変異又はヘテロクロマチン領域に組み込まれたことを示唆する。 However, cloned fetuses that did not show any mPlum expression by Western blotting included fetuses with low methylation status in the CAG promoter region (# 1, 3, 4, 5). This suggests that the transgene has been incorporated into the mutated or heterochromatin region.
（３）mPlum遺伝子を有するトランスジェニッククローン子豚の生産
SCNT胚を、＃2胎仔(NeomPlum-PFFs-2)から確立された若返らせた核ドナー細胞を用いて作製した。これらの胚を、1頭のレシピエントブタに移植した。その結果、4個体の子孫を得たが、すべて死産であった(4/89, 4.5%)（表１）。これらの子孫がmPlum遺伝子を保有することをPCR分析によって確認した（図５Ａ）。
(3) Production of transgenic cloned piglets with mPlum gene
SCNT embryos were generated using rejuvenated nuclear donor cells established from # 2 fetuses (NeomPlum-PFFs-2). These embryos were transferred to one recipient pig. As a result, 4 offspring were obtained, but all were stillborn (4/89, 4.5%) (Table 1). It was confirmed by PCR analysis that these offspring possess the mPlum gene (FIG. 5A).
mPlum遺伝子を有するクローン子孫では、試験した11種類の細胞、組織、器官においてPlumの蛍光は観察されなかった。前記した細胞等には、リンパ球、皮膚、腎臓、膵臓、血管、心臓、骨格筋、肝臓、肺、脾臓、及び腸が含まれる（図５Ｃ、６）。しかしながら、抗DsRed抗体を用いたウェスタンブロット分析は、4つのすべての子孫の肝臓組織においてmPlumタンパク質の産生を検出した（図５Ｂ）。 In clone offspring carrying the mPlum gene, no fluorescence of Plum was observed in the 11 cells, tissues, and organs tested. Such cells include lymphocytes, skin, kidney, pancreas, blood vessels, heart, skeletal muscle, liver, lung, spleen, and intestine (FIGS. 5C and 6). However, Western blot analysis with anti-DsRed antibody detected the production of mPlum protein in the liver tissue of all four offspring (FIG. 5B).
本発明は、移植医学研究に有用なので、このような研究に関連する産業分野において利用可能である。 Since the present invention is useful for transplantation medical research, it can be used in industrial fields related to such research.
Claims (11)
（１）前記蛍光性タンパク質と同じ抗原性を示す、
（２）実質的に非蛍光性である、
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列における68番目のチロシンに相当するアミノ酸が、チロシン以外のアミノ酸である。 A fluorescent protein variant comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, wherein the fluorescent protein variant has the following characteristics:
(1) exhibits the same antigenicity as the fluorescent protein,
(2) substantially non-fluorescent,
(3) The amino acid corresponding to the 68th tyrosine in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid other than tyrosine.
（１）核ドナー細胞を調製し、その核ドナー細胞に請求項５に記載のベクターを導入し、請求項４に記載の遺伝子を発現させる工程、
（２）除核したレシピエント卵を調製する工程、
（３）除核したレシピエント卵と核ドナー細胞を融合させる工程、
（４）融合卵を培養し、クローン胚を得る工程、
（５）クローン胚をレシピエント動物の卵管又は子宮に移植し、非ヒトクローン哺乳動物を得る工程。 A method for producing a non-human cloned mammal exhibiting immunological tolerance against a fluorescent protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, comprising the following steps:
(1) preparing a nuclear donor cell, introducing the vector of claim 5 into the nuclear donor cell, and expressing the gene of claim 4;
(2) preparing a enucleated recipient egg;
(3) fusing the enucleated recipient egg with nuclear donor cells;
(4) culturing the fused egg to obtain a cloned embryo,
(5) Transplanting a cloned embryo into the oviduct or uterus of a recipient animal to obtain a non-human cloned mammal.
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