JP2017195855A - Method for producing ceramide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、エンドグリコセラミダーゼを使用してスフィンゴ糖脂質からセラミドを製造する方法に関する。より具体的には、本発明は、界面活性剤の実質的非存在下で、エンドグリコセラミダーゼを使用してスフィンゴ糖脂質からセラミドを効率的に製造する方法に関する。 The present invention relates to a method for producing ceramide from glycosphingolipid using endoglycoceramidase. More specifically, the present invention relates to a method for efficiently producing ceramide from glycosphingolipids using endoglycoceramidase in the substantial absence of a surfactant.
セラミドは、角質層に存在し、水分を保持する保湿機能、及び外部刺激から肌を保護するバリア機能を担っている。角質層中のセラミドが加齢等によって減少すると、角質層の保水機能やバリア機能が低下し、皮膚が乾燥し易くなり、肌老化が促進されることが知られている。また、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎、老人性乾皮症、乾癬等の皮膚疾患では、角質層中のセラミドの減少による保湿機能やバリア機能の低下が生じていることが報告されている。 Ceramide is present in the stratum corneum and has a moisturizing function for retaining moisture and a barrier function for protecting the skin from external stimuli. It is known that when ceramide in the stratum corneum decreases due to aging or the like, the water retention function and barrier function of the stratum corneum are lowered, the skin is easily dried, and skin aging is promoted. In skin diseases such as dry skin, rough skin, atopic dermatitis, senile psoriasis, and psoriasis, it has been reported that moisturizing function and barrier function are reduced due to decrease of ceramide in stratum corneum. .
角質層の保水機能やバリア機能の低下に対しては、セラミドの外部補給が有効であることが知られている。近年、セラミドを配合した化粧料やサプリメント等が注目を浴びており、セラミド原料の需要は増加傾向にある。 It is known that external supply of ceramide is effective for reducing the water retention function and barrier function of the stratum corneum. In recent years, cosmetics and supplements containing ceramide have attracted attention, and the demand for ceramide raw materials is increasing.
従来、セラミドの製造方法として、スフィンゴ糖脂質の糖−セラミド間の結合を加水分解するエンドグリコセラミダーゼ（以下、「EGCase」と略記することがある）を用いて、スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる方法が知られている。当該方法に使用されるEGCaseについては、ロドコッカス属微生物、コリネバクテリウム属微生物、ヒル、ミミズ、シジミ、クラゲ、ヒドラ等によって産生されていることが報告されており、これまでに、各種EGCase遺伝子がクローニングされ、更に活性や基質特異性を改善したEGCaseの変異体も開発されている（例えば、特許文献１〜３参照）。 Conventionally, as a method for producing ceramide, endoglycoceramidase (hereinafter sometimes abbreviated as “EGCase”) that hydrolyzes the sugar-ceramide bond of glycosphingolipid is used to release ceramide from glycosphingolipid. The method is known. The EGCase used in the method has been reported to be produced by Rhodococcus microorganisms, Corynebacterium microorganisms, leeches, earthworms, swordfish, jellyfish, hydra, etc., and various EGCase genes have been reported so far. EGCase mutants that have been cloned and have improved activity and substrate specificity have also been developed (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
しかしながら、EGCaseは、疎水性が極めて強いタンパク質であり、界面活性剤非存在下では、分子が相互に凝集し、発揮される加水分解能が低くなるという特性がある（非特許文献１参照）。一般的に、酵素反応を使用した物質生産において、反応効率が低い系では反応時間を長くすることが収率の向上に有効になるが、界面活性剤非存在下でEGCaseをスフィンゴ糖脂質に作用させる場合には、反応時間を長くしても、セラミドの収率がさほど向上しないことも報告されている。そのため、従来、EGCaseを用いてスフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる場合、反応系にTriton X-100等の界面活性剤を添加することが不可欠になっていた。 However, EGCase is a highly hydrophobic protein, and in the absence of a surfactant, the molecules aggregate with each other and have a characteristic that the hydrolytic ability exhibited is low (see Non-Patent Document 1). In general, in the production of substances using enzymatic reactions, increasing the reaction time is effective in improving the yield in systems with low reaction efficiency, but EGCase acts on glycosphingolipids in the absence of a surfactant. In this case, it has been reported that the yield of ceramide does not improve so much even if the reaction time is increased. Therefore, conventionally, when releasing ceramide from glycosphingolipid using EGCase, it has become indispensable to add a surfactant such as Triton X-100 to the reaction system.
一方、界面活性剤は細胞毒性を示すことがあるので、化粧料や食品の原料として提供されるセラミドには、界面活性剤等の混入がないものであることが望ましい。しかしながら、界面活性剤は脂質との相溶性が高いため、界面活性剤存在下でEGCaseとスフィンゴ糖脂質を反応させてセラミドを遊離させる場合、反応後に遊離したセラミドと界面活性剤の分離が困難であり、界面活性剤とセラミドの分離に煩雑な精製工程が必要になるという欠点がある。 On the other hand, since a surfactant may show cytotoxicity, it is desirable that the ceramide provided as a raw material for cosmetics and foods does not contain a surfactant or the like. However, since surfactants are highly compatible with lipids, when ceramide is released by reacting EGCase with glycosphingolipid in the presence of surfactant, it is difficult to separate ceramide and surfactant released after the reaction. In addition, there is a disadvantage that a complicated purification step is required for separating the surfactant and ceramide.
本発明の目的は、界面活性剤を実質的に添加することなく、EGCaseを使用してスフィンゴ糖脂質からセラミドを効率的に製造する方法を提供することである。 An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing ceramide from glycosphingolipids using EGCase without substantially adding a surfactant.
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、界面活性剤の実質的非存在下でEGCaseを使用してスフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる際に、セラミド存在下でEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始することによって、セラミドを効率的に製造できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。 The present inventor has intensively studied to solve the above-mentioned problems. As a result, EGCase is released in the presence of ceramide in the presence of ceramide when EGCase is used to release ceramide from glycosphingolipids in the substantial absence of a surfactant. It was found that ceramide can be efficiently produced by initiating the hydrolysis reaction of glycosphingolipid. The present invention has been completed by further studies based on such knowledge.
即ち、本発明は、下記に掲げるセラミドの製造方法を提供する。
項１． 界面活性剤の実質的非存在下で、エンドグリコセラミダーゼを使用してスフィンゴ糖脂質からセラミドを製造する方法であって、
セラミド存在下でエンドグリコセラミダーゼによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始することを特徴とする、セラミドの製造方法。
項２． 下記第１〜３工程を含む、項１に記載の製造方法：
界面活性剤の実質的非存在下で、スフィンゴ糖脂質にエンドグリコセラミダーゼを作用させ、セラミドを遊離させる第１工程、
前記第１工程で遊離したセラミド及び残存しているスフィンゴ糖脂質を回収する第２工程、及び
前記第２工程で得られたセラミド及びスフィンゴ糖脂質の混合物に対して、界面活性剤の実質的非存在下で、エンドグリコセラミダーゼを作用させ、当該スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる第３工程。
項３． 前記第２工程が、ブライ−ダイヤー法により行われる、項２に記載の製造方法。
項４． 前記スフィンゴ糖脂質がセレブロシドである、項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
項５． 前記スフィンゴ糖脂質がコンニャク由来である、項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
項６． 前記エンドグリコセラミダーゼがエンドグリコセラミダーゼＩである、項４又は５に記載の製造方法。
That is, this invention provides the manufacturing method of ceramide hung up below.
Item 1. A method of producing ceramide from glycosphingolipids using endoglycoceramidase in the substantial absence of a surfactant, comprising:
A method for producing ceramide, characterized by starting a hydrolysis reaction of glycosphingolipid by endoglycoceramidase in the presence of ceramide.
Item 2. The manufacturing method of claim | item 1 including the following 1st-3rd process:
A first step of releasing ceramide by allowing endoglycoceramidase to act on glycosphingolipid in the substantial absence of a surfactant;
The second step of recovering the ceramide released in the first step and the remaining glycosphingolipid, and the mixture of the ceramide and the glycosphingolipid obtained in the second step are substantially free of surfactant. A third step in which endoglycoceramidase is allowed to act in the presence to release ceramide from the glycosphingolipid.
Item 3. Item 3. The manufacturing method according to Item 2, wherein the second step is performed by a Briyer method.
Item 4. Item 4. The production method according to any one of Items 1 to 3, wherein the glycosphingolipid is cerebroside.
Item 5. Item 5. The production method according to any one of Items 1 to 4, wherein the glycosphingolipid is derived from konjac.
Item 6. Item 6. The production method according to Item 4 or 5, wherein the endoglycoceramidase is endoglycoceramidase I.
本発明の製造方法によれば、界面活性剤を実質的に使用することなく、EGCaseによってスフィンゴ糖脂質からセラミドを効率的に遊離させることができるので、界面活性剤が実質的に混入しておらず、安全性が高いセラミドを高い収率で得ることができる。 According to the production method of the present invention, ceramide can be efficiently released from the glycosphingolipid by EGCase without substantially using a surfactant, so that the surfactant is not substantially mixed. Therefore, ceramide with high safety can be obtained in high yield.
また、本発明の製造方法の好適な一態様では、界面活性剤の実質的非存在下でスフィンゴ糖脂質に対してEGCaseを作用させる第１工程、前記工程後に遊離したセラミドと残存するスフィンゴ糖脂質を回収する第２工程、並びに前記第２工程で得られたセラミドとスフィンゴ糖脂質の混合物に対して、界面活性剤の実質的非存在下でEGCaseを作用させる第３工程を実施することによって、セラミドの収率を飛躍的に向上させることが可能なる。 In a preferred embodiment of the production method of the present invention, the first step of allowing EGCase to act on the glycosphingolipid in the substantial absence of a surfactant, ceramide released after the above step and the remaining glycosphingolipid By carrying out EGCase in the substantial absence of a surfactant on the mixture of ceramide and glycosphingolipid obtained in the second step, and the second step of recovering the ceramide, The yield of ceramide can be dramatically improved.
本発明の製造方法は、界面活性剤の実質的非存在下で、エンドグリコセラミダーゼを使用してスフィンゴ糖脂質からセラミドを製造する方法であって、セラミド存在下でエンドグリコセラミダーゼによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始することを特徴とする。以下、本発明の製造方法について、詳述する。 The production method of the present invention is a method for producing ceramide from a glycosphingolipid using endoglycoceramidase in the substantial absence of a surfactant, and comprising the glycosphingolipid by endoglycoceramidase in the presence of ceramide. It is characterized by starting a hydrolysis reaction. Hereinafter, the production method of the present invention will be described in detail.
［使用材料］
スフィンゴ糖脂質
本発明の製造方法において、セラミドの製造原料となる基質として、スフィンゴ糖脂質を使用する。スフィンゴ糖脂質とは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造のセラミドの第１級アルコール性ヒドロキシ基に糖が結合した糖脂質である。
[Materials used]
Glycosphingolipid In the production method of the present invention, glycosphingolipid is used as a substrate that is a raw material for producing ceramide. The sphingoglycolipid is a glycolipid in which a saccharide is bound to a primary alcoholic hydroxy group of ceramide having a structure in which a fatty acid is amide-bonded to a sphingoid.
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質の由来については、特に制限されず、植物由来、動物由来、微生物由来のいずれであってもよいが、好ましくは植物由来が挙げられる。 The origin of the glycosphingolipid used in the present invention is not particularly limited and may be derived from a plant, an animal, or a microorganism, preferably a plant.
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質の由来植物としては、具体的には、アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマチャ、アマチャヅル、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カリン、ガルシニア、カルダモン、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、コンニャク（コンニャク芋）（こんにゃくトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、ゼニアオイ、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タラゴン、タロイモ、タンジン、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ヘチマ、ベニバナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マタタビ、マリーゴールド、マンゴー、ミツバ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコンニャク、サツマ芋、ジャガ芋、サト芋、ヤマ芋、ナガ芋等の芋類由来、更に好ましくはコンニャクが挙げられる。 Specific examples of the glycosphingolipid-derived plants used in the present invention include almonds, Aosa, Aonori, Akaza, Acacia, Akane, Aka grape, Japanese red pine (pine pine, persimmon, copal. The same), agaricus, akinonogeshi, akebi, morning glory, azalea, hydrangea, ashitaba, azuki bean, asparagus, acerola, asenyak, anise, avocado, achacha, amachiru, amaryllis, altea, arnica, aloe, angelica, apricot, angus Izayoi rose, yew, fig, ginkgo, ylang ylang, fennel, oolong tea, turmeric, usbenia mushroom, peony, udo, ume, vulgari, wenzhou mandarin orange, ages, escharotto, elephant crotch, swordfish, enokitake, elder Lawr, Pea, Orchid, Psyllium, Great White Thistle, Barley, Ochera, Osmanthus, Hypericum, Olysam, Onidokoro, Olive, Oregano, Orange (including Orange Peel), Carnation, Cacao, Oyster, Oyster, Kakkon, Kashiwa, Pumpkin, Pumpkin, Chamomile, camouflage, chamomile, calamari, larch, karin, garcinia, cardamom, raspberry, kiwi, kikyo, cabbage (including kale), caraway, cucumber, kumquat, ginnan, guava, wolfberry, kudzu, gardenia, cumin, cranberry, Walnut, grapefruit, clove, black pine, black bean, chlorella, black beetle, gentian pepper, cowberry, pepper, cosmos, burdock, wheat (including wheat germ), sesame, coconut Tuna, rice (including rice bran), coriander, konjak (konnyaku tobiko) (including konjac tobi powder), kombu, salmon berry, cypress, pomegranate, sweet potato, sugarcane, sugarcane, sugar beet, saffron, pomelo, hawthorn, Salamander, shiitake mushroom, cyclamen, perilla, shimeji, potato moth, peonies, jasmine, juzudama, shungiku, ginger, ginger, ginger, shrimp, ginkgo biloba, cinnamon, watermelon, sweet pea, cedar, star anise, star apple, sudachi, stevia, plum, Sage (salvia), mallow, celery, cucumber, assembly, buckwheat, broad bean, radish, soybean (including okara), daidai, thyme, bamboo shoot, onion, tarragon, taro, tangin, dandelion, chicory, primrose , Camellia, camellia, camellia, clover, camellia, tsuruna, camellia, dill, swordfish (geranium), chili, capsicum, crested radish, corn, dodami, tocon, tomato, ash, natsumo, natsuna , Mugwort, leek, carrot, garlic, leek, yarrow, saw palmetto, nobil, verbena, palm, pineapple, hibiscus, chickweed, basil, parsley, hollyhump, mint, pearl barley, banana, banaba, vanilla, paprika, hamamelis, peas , Sunflower, hinoki, hijiki, pistachio, hyssop (willow mint), daisies, daisies, cypress, hiba, castor, sunflower, loquat, phalaenopsis, phenegrek, fukinotou, black Berries, plums, blueberries (including bilberries), prunes, loofah, safflower, belladonna, bergamot, spinach, spinach, physalis, bodaiju, buttons, hops, jojoba, maitake, mao, maca, macadamia nuts, matatabi, marigold, Mango, Honey Bee, Mimosa, Myouga, Myrrh, Murasaki, Mace, Melissa, Melilot, Melon, Men (including cottonseed oil lees), Mushrooms, Cornflower, Yamame, Yamayuri, Yamamugi, Eucalyptus, Yukinoshita, Yuzu, Lily, Yokuinin, Yomena (Aster), Artemisia, Lime, Rye, Lilac, Raspberry, Peanut, Pepper, Apple (including Apple Fiber), Gentian, Ganoderma, Lettuce, Lemon, Astragalus, Lotus root, Rosehip, Low Marie, bay leaves, scallions, such as wasabi (horse including wasabi), and the like. Among these, preferably derived from moss such as konjac, satsuma koji, potato koji, sugar mushrooms, yama kaki, naga mushroom, and more preferably konjac.
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において、スフィンゴイド部分の構造については、特に制限されないが、具体的には、４−スフィンゲニン（スフィンゴシン）、４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）、４−ヒドロキシ−トランス−８−スフィンゲニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニン、スフィンガニン、トランス−８−スフィンゲニン、シス−８−スフィンゲニン、トランス−４−スフィンゲニン、トランス−４，トランス−８−スフィンガジエニン、トランス−４，シス−８−スフィンガジエニン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、コンニャク由来のスフィンゴ糖脂質を構成しているスフィンゴイド、具体的にはトランス−４，シス−８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニンが挙げられる。 In the glycosphingolipid used in the present invention, the structure of the sphingoid moiety is not particularly limited. Specifically, 4-sphingenin (sphingosine), 4-hydroxysphinganin (phytosphingosine), 4-hydroxy -Trans-8-sphingenin, 4-hydroxy-cis-8-sphingenin, sphinganine, trans-8-sphingenin, cis-8-sphingenin, trans-4-sphingenin, trans-4, trans-8-sphingadienin, Examples include trans-4, cis-8-sphingadienin. Among these, Preferably, sphingoids constituting konjac-derived sphingoglycolipids, specifically, trans-4, cis-8-sphingadienin, 4-hydroxy-cis-8-sphingenin are mentioned. .
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸の炭素数については、特に制限されないが、例えば、２〜３０、好ましくは１４〜２６、更に好ましくは１８〜２４が挙げられる。また、当該脂肪酸は、飽和脂肪酸、炭素−炭素二重結合及び／又は炭素−炭素三重結合を含む不飽和脂肪酸、並びにα−ヒドロキシ脂肪酸のいずれであってもよい。 In the glycosphingolipid used in the present invention, the number of carbon atoms of the fatty acid bonded to the sphingoid moiety is not particularly limited, but is, for example, 2 to 30, preferably 14 to 26, and more preferably 18 to 24. Can be mentioned. The fatty acid may be any of a saturated fatty acid, an unsaturated fatty acid containing a carbon-carbon double bond and / or a carbon-carbon triple bond, and an α-hydroxy fatty acid.
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸として、具体的には、ヘキサデカン酸（Ｃ１６：０）、オクタデカン酸（Ｃ１８：０）、イコサン酸（Ｃ２０：０）、ヘネイコサン酸（Ｃ２１：０）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）、トリコサン酸（Ｃ２３：０）、テトラドコサン酸（Ｃ２４：０）、ペンタコサン酸（Ｃ２５：０）、ヘキサドコサン酸（Ｃ２６：０）、ヘプタコサン酸（Ｃ２７：０）、オクタドコサン酸（２８：０）、シス−９−オクタデセン酸（Ｃ１８：１）等が挙げられる。なお、前記脂肪酸の括弧内に示す表記「ＣＸ：Ｙ」において、ＣＸは１分子当たりの炭素数を示し、Ｙは１分子当たりの不飽和結合の数を示し、例えば「Ｃ１６：０」とは炭素数１６且つ不飽和結合数が０の脂肪酸を表す。これらの脂肪酸の中でも、好ましくは、コンニャク由来のスフィンゴ糖脂質を構成している脂肪酸、具体的にはオクタデカン酸、ドコサン酸、イコサン酸が挙げられる。 In the glycosphingolipid used in the present invention, as the fatty acid bound to the sphingoid moiety, specifically, hexadecanoic acid (C16: 0), octadecanoic acid (C18: 0), icosanoic acid (C20: 0) , Heneicosanoic acid (C21: 0), docosanoic acid (C22: 0), tricosanoic acid (C23: 0), tetradocosanoic acid (C24: 0), pentacosanoic acid (C25: 0), hexadocosanoic acid (C26: 0), heptacosane Examples include acid (C27: 0), octadocosanoic acid (28: 0), cis-9-octadecenoic acid (C18: 1), and the like. In the notation “CX: Y” shown in parentheses of the fatty acid, CX represents the number of carbons per molecule, Y represents the number of unsaturated bonds per molecule, and for example, “C16: 0” It represents a fatty acid having 16 carbon atoms and zero unsaturated bonds. Among these fatty acids, preferably, fatty acids constituting the glycosphingolipid derived from konjac, specifically, octadecanoic acid, docosanoic acid, and icosanoic acid.
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質に結合している糖部分の構造については、特に制限されず、単糖又は糖鎖であればよい。 The structure of the sugar moiety bound to the glycosphingolipid used in the present invention is not particularly limited as long as it is a monosaccharide or a sugar chain.
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において糖部分が単糖である場合、その構成糖の種類については、特に制限されないが、具体的には、グルコースが挙げられる。これらの単糖の中でも、好ましくはグルコースが挙げられる。 In the glycosphingolipid used in the present invention, when the sugar moiety is a monosaccharide, the type of the constituent sugar is not particularly limited, and specific examples thereof include glucose. Among these monosaccharides, glucose is preferable.
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質において糖部分が糖鎖である場合、その構成糖鎖の種類については、特に制限されず、例えば、当該糖鎖のセラミド側末端がグルコース残基で構成されている糖鎖であればよく、具体的には、ラクトース、糖鎖−セラミド間がガラクトシド結合によって結合しているガラ系、Galα1-4Gal単位を有するグロボ系、Galα1-3Gal単位を有するイソグロボ系、Galβ1-3GlcNAc単位を有するラクト系、Galβ1-4GlcNAc単位を有するネオラクト系、シアル酸残基又はGalNAcβ1-4Gal単位を有するガングリオ系等が挙げられる。 In the glycosphingolipid used in the present invention, when the sugar moiety is a sugar chain, the type of the constituent sugar chain is not particularly limited. For example, the ceramide side terminal of the sugar chain is composed of a glucose residue. In particular, lactose, Gala system in which the sugar chain and ceramide are bonded by a galactoside bond, Globo system having Galα1-4Gal unit, Isoglobo system having Galα1-3Gal unit, Galβ1 Examples include a lacto system having a -3GlcNAc unit, a neolacto system having a Galβ1-4GlcNAc unit, a sialic acid residue, or a ganglio system having a GalNAcβ1-4Gal unit.
本発明で使用されるスフィンゴ糖脂質について糖部分の構造に応じて分類すると、具体的には、Glcβ1-1Cer（グルコシルセラミド）等のセレブロシド；Galβ1-4Glcβ1-1Cer（ラクトシルセラミド）；Galα-1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcβ1-3Galα-1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcα-1-3GalNAcβ1-3Galα-1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のグロボ系スフィンゴ糖脂質；GalNAcβ1-3Galα-1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のイソグロボ系スフィンゴ糖脂質；GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer、Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のラクト系スフィンゴ糖脂質；Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のネオラクト系スフィンゴ糖脂質；NeuAcα-2-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcβ1-4(NeuAcα-2-3)Galβ1-4Glcβ1-1Cer、Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1Cer、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcβ1-4(NeuAcα-2-8NeuAcα-2-3)Galβ1-4Glcβ1-1Cer、NeuAcα-2-8NeuAcα-2-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer、Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer、GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer等のガングリオ系スフィンゴ糖脂質等が挙げられる。なお、本明細書において、「Cer」はセラミド、「Glc」はグルコース、「Gal」はガラクトース、「GlcNAc」はN-アセチルグルコサミン、「GalNAc」はN-アセチルガラクトサミン、「NeuAc」はシアルサンの略記である。 The glycosphingolipids used in the present invention are classified according to the structure of the sugar moiety. Specifically, cerebrosides such as Glcβ1-1Cer (glucosylceramide); Galβ1-4Glcβ1-1Cer (lactosylceramide); Galα-1 Globo-type sphingoglycolipids such as -4Galβ1-4Glcβ1-1Cer, GalNAcβ1-3Galα-1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer, GalNAcα-1-3GalNAcβ1-3Galα-1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer; GalNAcβ1-3Galα-1-3Galβ1- 4Glcβ1-1Cer and other isoglobo-type glycosphingolipids; GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer, Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer and other lacto-sphingolipids; Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer Glycolipids: NeuAcα-2-3Galβ1-4Glcβ1-1Cer, GalNAcβ1-4 (NeuAcα-2-3) Galβ1-4Glcβ1-1Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4 (NeuAcα2-3) Galβ1-4Glcβ1-1Cer, NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAcβ -4 (NeuAcα2-3) Galβ1-4Glcβ1-1Cer, GalNAcβ1-4 (NeuAcα-2-8NeuAcα-2-3) Galβ1-4Glcβ1-1Cer, NeuAcα-2-8NeuAcα-2-3Galβ1- Examples include ganglio-type glycosphingolipids such as 4Glcβ1-1Cer, Galβ1-3GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer, GalNAcβ1-4Galβ1-4Glcβ1-1Cer, and the like. In this specification, `` Cer '' is ceramide, `` Glc '' is glucose, `` Gal '' is galactose, `` GlcNAc '' is N-acetylglucosamine, `` GalNAc '' is N-acetylgalactosamine, and `` NeuAc '' is an abbreviation for sialican. It is.
これらの中でも、より一層効率的にセラミドを製造するという観点から、好ましくはグルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、更に好ましくはグルコシルセラミドが挙げられる。グルコシルセラミドは、コンニャク由来のスフィンゴ糖脂質に多く含まれているセレブロシドである。 Among these, from the viewpoint of producing ceramide more efficiently, glucosylceramide, lactosylceramide, and more preferably glucosylceramide are exemplified. Glucosylceramide is a cerebroside that is abundant in glycosphingolipids derived from konjac.
スフィンゴ糖脂質は、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、スフィンゴ糖脂質は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。 Glycosphingolipids can be obtained from the aforementioned derived plants by a known extraction method. In addition, glycosphingolipid is commercially available, and a commercially available product may be used.
本発明の製造方法において、スフィンゴ糖脂質は、１種の構造又は由来のものを単独で使用してもよく、２種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。 In the production method of the present invention, the glycosphingolipid may be used alone or in combination with two or more structures or origins.
エンドグリコセラミダーゼ
本発明の製造方法では、スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させるために、EGCaseを使用する。EGCaseは、スフィンゴ糖脂質の糖−セラミド間の結合を加水分解する酵素である。
The endoglycoceramidase production method of the present invention, in order to release the ceramide from glycosphingolipids uses EGCase. EGCase is an enzyme that hydrolyzes the sugar-ceramide bond of glycosphingolipid.
EGCaseは、等電点及び分子量が異なる３つの分子種（EGCaseI、EGCaseII、及びEGCaseIII）が知られており、分子種に応じて基質特異性が異なることが知られている。本発明の製造方法では、使用するEGCaseの分子種は、基質となるスフィンゴ糖脂質の構造に応じて適宜設定すればよい。例えば、スフィンゴ糖脂質として、セレブロシド、特にコンニャク由来のスフィンゴ糖脂質を使用する場合であれば、EGCaseIが好適に使用される。 Three molecular species (EGCaseI, EGCaseII, and EGCaseIII) having different isoelectric points and molecular weights are known for EGCase, and the substrate specificity is known to vary depending on the molecular species. In the production method of the present invention, the molecular species of EGCase to be used may be appropriately set according to the structure of the glycosphingolipid as a substrate. For example, when using cerebroside, particularly konjac-derived glycosphingolipid as the glycosphingolipid, EGCaseI is preferably used.
EGCaseは、ロドコッカス属微生物、コリネバクテリウム属微生物、ヒル、ミミズ、シジミ、クラゲ、ヒドラ等によって産生されていることが知られており、そのアミノ酸配列及びその遺伝子配列についても明らかにされている。本発明の製造方法では、これらの生物由来のEGCaseを使用してもよく、またこれらの生物由来のEGCaseを改変した変異体を使用してもよい。 EGCase is known to be produced by Rhodococcus microorganisms, Corynebacterium microorganisms, leeches, earthworms, shijimi, jellyfish, hydra, and the like, and its amino acid sequence and gene sequence have also been clarified. In the production method of the present invention, EGCases derived from these organisms may be used, or mutants obtained by modifying EGCases derived from these organisms may be used.
本発明の製造方法において、EGCaseは、EGCase産生能を有する生物を培養又は飼育して得られたものであってもよく、また遺伝子工学的手法によって得られたものであってもよい。また、EGCaseは、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。 In the production method of the present invention, EGCase may be obtained by culturing or breeding an organism having EGCase-producing ability, or may be obtained by genetic engineering techniques. EGCase is commercially available, and a commercially available product may be used.
本発明の製造方法において、EGCaseは、１種のものを単独で使用してもよく、２種以上のものを組み合わせて使用してもよい。 In the production method of the present invention, one type of EGCase may be used alone, or two or more types may be used in combination.
セラミド
本発明の製造方法では、EGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始する時点で、セラミドを共存させる。このようにセラミドをEGCaseによる反応開始時点で予め存在させることによって、界面活性剤の実質的非存在下で、スフィンゴ糖脂質を効率的に加水分解して高収率でセラミドを遊離させることが可能になる。
Ceramide In the production method of the present invention, ceramide is allowed to coexist when the hydrolysis reaction of glycosphingolipid by EGCase is started. In this way, by pre-existing ceramide at the beginning of the reaction with EGCase, it is possible to efficiently hydrolyze glycosphingolipid and release ceramide in high yield in the substantial absence of surfactant. become.
本発明の製造方法において、反応開始時に系中に予め存在させるセラミドの種類については、特に制限されず、その由来、スフィンゴイドの構造、結合している脂肪酸の構造等については、前記スフィンゴ糖脂質の欄で例示したものと同様である。 In the production method of the present invention, the kind of ceramide previously present in the system at the start of the reaction is not particularly limited, and the origin, sphingoid structure, bound fatty acid structure, and the like are described above. It is the same as that illustrated in the column.
本発明の製造方法において、反応開始時に系中に予め存在させるセラミドは、１種の構造又は由来のものを単独で使用してもよく、２種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。 In the production method of the present invention, the ceramide previously present in the system at the start of the reaction may be used alone or in combination of two or more structures or origins. May be.
また、本発明の製造方法において、反応開始時に系中に予め存在させるセラミドの由来は、基質として使用されるスフィンゴ糖脂質と異なっていてもよいが、当該スフィンゴ糖脂質と同一であることが好ましい。即ち、例えば、基質としてコンニャク由来のスフィンゴ糖脂質を使用する場合、反応開始時に系中に予め存在させるセラミドはコンニャク由来であることが好ましい。このように、応開始時に系中に予め存在させるセラミドと基質として使用されるスフィンゴ糖脂質の由来が同一であれば、反応後に系中に遊離しているセラミドが全て同一生物種由来で構成されるので、反応後に回収されるセラミドの構造を均質にすることが可能になる。 In the production method of the present invention, the origin of ceramide previously present in the system at the start of the reaction may be different from the glycosphingolipid used as a substrate, but is preferably the same as the glycosphingolipid. . That is, for example, when using a glycosphingolipid derived from konjac as a substrate, it is preferable that the ceramide previously present in the system at the start of the reaction is derived from konjac. In this way, if the origin of the ceramide pre-existing in the system at the start of reaction and the glycosphingolipid used as a substrate are the same, all ceramides released in the system after the reaction are composed of the same species. Therefore, the structure of ceramide recovered after the reaction can be made uniform.
［反応条件］
界面活性剤の実質的非存在下でのEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応
本発明の製造方法では、界面活性剤の実質的非存在下で、スフィンゴ糖脂質とスフィンゴ糖脂質を共存させて、EGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始する。
[Reaction conditions]
Hydrolysis reaction of glycosphingolipid by EGCase in the substantial absence of surfactant In the production method of the present invention, the glycosphingolipid and the glycosphingolipid are allowed to coexist in the substantial absence of surfactant, Initiates hydrolysis of glycosphingolipids by EGCase.
本発明の製造方法において、「界面活性剤の実質的非存在下」とは、セラミド非存在下でのEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応において、反応効率を向上させるために必要とされる界面活性剤の濃度未満であること（即ち、界面活性剤の濃度が、反応効率に影響しない範囲であること）を意味し、具体的には、本発明の製造方法における反応液中での界面活性剤の濃度の許容範囲として、通常0.02重量％以下、好ましくは０重量％が挙げられる。 In the production method of the present invention, “substantially in the absence of a surfactant” means an interface required for improving the reaction efficiency in the hydrolysis reaction of glycosphingolipid by EGCase in the absence of ceramide. This means that the concentration is less than the concentration of the activator (that is, the concentration of the surfactant is within a range not affecting the reaction efficiency), and specifically, the surface activity in the reaction solution in the production method of the present invention. The allowable range of the concentration of the agent is usually 0.02% by weight or less, preferably 0% by weight.
本発明の製造方法では、反応溶媒に、スフィンゴ糖脂質、セラミド、及びEGCaseを添加し、界面活性剤の実質的非存在下でEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始させ、スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる。 In the production method of the present invention, glycosphingolipid, ceramide, and EGCase are added to the reaction solvent, and the hydrolysis reaction of the glycosphingolipid by EGCase is initiated in the substantial absence of a surfactant. Release ceramide.
前記反応溶媒の組成については、EGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応が可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、水；酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液；生理食塩水等が挙げられる。 The composition of the reaction solvent is not particularly limited as long as the glycosphingolipid can be hydrolyzed by EGCase. For example, water; acetate buffer, citrate buffer, phosphate buffer, boric acid Buffer solutions such as buffer solutions; physiological saline and the like.
反応溶媒におけるスフィンゴ糖脂質の濃度（反応開始時の濃度）については、特に制限されないが、例えば、1〜30重量％、好ましくは3〜25重量％、更に好ましくは5〜25重量％が挙げられる。 The concentration of the glycosphingolipid in the reaction solvent (concentration at the start of the reaction) is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 30% by weight, preferably 3 to 25% by weight, and more preferably 5 to 25% by weight. .
反応溶媒におけるセラミドの濃度（反応開始時の濃度）については、特に制限されないが、例えば、1〜30重量％、好ましくは3〜25重量％、更に好ましくは5〜25重量％が挙げられる。 The concentration of ceramide in the reaction solvent (concentration at the start of the reaction) is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 30% by weight, preferably 3 to 25% by weight, and more preferably 5 to 25% by weight.
また、反応開始時に、反応溶媒中に共存させるスフィンゴ糖脂質とセラミドの比率については、特に制限されないが、より一層効率的にEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を進行させるという観点から、スフィンゴ糖脂質１モル当たり、セラミドが通常0.5〜2.0モル、好ましくは0.6〜1.5モル、更に好ましくは0.8〜1.2モルとなる比率が挙げられる。 In addition, the ratio of the glycosphingolipid and ceramide coexisting in the reaction solvent at the start of the reaction is not particularly limited, but from the viewpoint of more efficiently promoting the glycosphingolipid hydrolysis reaction by EGCase, The ratio of ceramide is usually 0.5 to 2.0 mol, preferably 0.6 to 1.5 mol, more preferably 0.8 to 1.2 mol per mol of lipid.
反応溶媒におけるEGCaseの濃度（反応開始時の濃度）については、使用するEGCaseの種類、反応時間等を勘案して適宜設定すればよいが、例えば、0.1〜1.0mg/mL、好ましくは0.2〜0.8mg/mL、更に好ましくは0.4〜0.6mg/mLが挙げられる。 The concentration of EGCase in the reaction solvent (concentration at the start of the reaction) may be appropriately set in consideration of the type of EGCase to be used, reaction time, etc., for example, 0.1 to 1.0 mg / mL, preferably 0.2 to 0.8. mg / mL, more preferably 0.4 to 0.6 mg / mL.
本発明の製造方法において、EGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応の反応時間については、反応溶媒に添加されているスフィンゴ糖脂質及びEGCaseの濃度、反応温度等を勘案して適宜設定すればよいが、例えば12時間以上、好ましくは12〜20時間、更に好ましくは14〜18時間が挙げられる。 In the production method of the present invention, the reaction time of the glycosphingolipid hydrolysis reaction by EGCase may be appropriately set in consideration of the concentration of glycosphingolipid and EGCase added to the reaction solvent, the reaction temperature, etc. For example, 12 hours or more, preferably 12 to 20 hours, more preferably 14 to 18 hours.
本発明の製造方法において、EGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応の反応温度については、使用するEGCaseの作用温度域内で適宜設定すればよいが、通常20〜40℃、好ましくは25〜39℃、更に好ましくは35〜38℃が挙げられる。 In the production method of the present invention, the reaction temperature of the glycosphingolipid hydrolysis reaction by EGCase may be appropriately set within the working temperature range of EGCase to be used, but usually 20 to 40 ° C, preferably 25 to 39 ° C, More preferably, 35-38 degreeC is mentioned.
好適な一態様
また、本発明の製造方法の好適な一態様として、下記第１〜３工程を含む方法が挙げられる。
第１工程：界面活性剤の実質的非存在下で、スフィンゴ糖脂質にエンドグリコセラミダーゼを作用させ、セラミドを遊離させる。
第２工程：前記第１工程で遊離したセラミド及び残存しているスフィンゴ糖脂質を回収する。
第３工程：前記第２工程で得られたセラミド及びスフィンゴ糖脂質の混合物に対して、界面活性剤の実質的非存在下で、エンドグリコセラミダーゼを作用させ、当該スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる。
A preferred embodiment A preferred embodiment of the production method of the present invention includes a method including the following first to third steps.
First step: Endoglycoceramidase is allowed to act on the glycosphingolipid in the substantial absence of a surfactant to release ceramide.
Second step: The ceramide released in the first step and the remaining glycosphingolipid are recovered.
Third step: Endoglycoceramidase is allowed to act on the mixture of ceramide and glycosphingolipid obtained in the second step in the substantial absence of a surfactant to release ceramide from the glycosphingolipid. .
前記第１及び２工程は、本発明の製造方法で使用される原料（スフィンゴ糖脂質及びセラミド）の準備段階に該当し、前記第３工程は、前記「界面活性剤の実質的非存在下でのEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応」に該当する。 The first and second steps correspond to the preparation stage of the raw materials (sphingoglycolipid and ceramide) used in the production method of the present invention, and the third step is the step “in the substantial absence of the surfactant. Of the glycosphingolipid by EGCase ".
前記第１工程は、反応溶媒に、スフィンゴ糖脂質及びEGCaseを添加し、界面活性剤の実質的非存在下でEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を行い、スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる。前記第１工程では、セラミド非存在下でEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を行うため、スフィンゴ糖脂質の加水分解効率が低く、反応後には、スフィンゴ糖脂質から遊離したセラミドと加水分解反応を受けずに残存したスフィンゴ糖脂質が反応溶媒に含まれた状態になる。 In the first step, glycosphingolipid and EGCase are added to the reaction solvent, and the glycosphingolipid is hydrolyzed by EGCase in the substantial absence of a surfactant to release ceramide from the glycosphingolipid. In the first step, the glycosphingolipid is hydrolyzed by EGCase in the absence of ceramide, so that the efficiency of glycosphingolipid hydrolysis is low. After the reaction, hydrolysis reaction with ceramide released from the glycosphingolipid is performed. The remaining glycosphingolipid without receiving is contained in the reaction solvent.
前記第１工程において、達成するスフィンゴ糖脂質の加水分解率については、特に制限されないが、反応溶媒に添加したスフィンゴ糖脂質の総量に対して、10〜60モル％、好ましくは30〜60モル％、更に、好ましくは40〜60モル％のスフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させるように条件設定することが望ましい。第１工程において、このような加水分解率でスフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させることにより、後述する第３工程における加水分解反応を効率的に進行させることが可能になる。 The hydrolysis rate of the glycosphingolipid achieved in the first step is not particularly limited, but is 10 to 60 mol%, preferably 30 to 60 mol%, based on the total amount of glycosphingolipid added to the reaction solvent. Furthermore, it is desirable to set conditions so that ceramide is preferably released from 40 to 60 mol% of glycosphingolipid. In the first step, ceramide is released from the glycosphingolipid at such a hydrolysis rate, whereby the hydrolysis reaction in the third step described later can be efficiently advanced.
前記第１工程で使用される反応溶媒の組成については、EGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応が可能であることを限度として特に制限されず、例えば、水；酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液；生理食塩水等が挙げられる。 The composition of the reaction solvent used in the first step is not particularly limited as long as the hydrolysis reaction of glycosphingolipid by EGCase is possible. For example, water; acetate buffer, citrate buffer, Buffers such as phosphate buffer and borate buffer; physiological saline and the like.
前記第１工程において、反応溶媒に添加されるスフィンゴ糖脂質の濃度（反応開始時の濃度）については、特に制限されないが、例えば、1〜60重量％、好ましくは5〜60重量％、更に好ましくは10〜60重量％が挙げられる。 In the first step, the concentration of glycosphingolipid added to the reaction solvent (concentration at the start of the reaction) is not particularly limited, but is, for example, 1 to 60% by weight, preferably 5 to 60% by weight, and more preferably. 10 to 60% by weight.
前記第１工程において、反応溶媒に添加されるEGCaseの濃度（反応開始時の濃度）については、使用するEGCaseの種類、反応時間、達成すべきスフィンゴ糖脂質の加水分解率等を勘案して適宜設定すればよいが、例えば、0.1〜1.0mg/mL、好ましくは0.2〜0.8mg/mL、更に好ましくは0.4〜0.6mg/mLが挙げられる。 In the first step, the concentration of EGCase added to the reaction solvent (concentration at the start of the reaction) is appropriately determined in consideration of the type of EGCase used, the reaction time, the glycosphingolipid hydrolysis rate to be achieved, and the like. What is necessary is just to set, for example, 0.1-1.0 mg / mL, Preferably 0.2-0.8 mg / mL, More preferably, 0.4-0.6 mg / mL is mentioned.
前記第１工程において、EGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応の反応時間については、反応溶媒に添加されているスフィンゴ糖脂質、反応温度、達成すべきスフィンゴ糖脂質の加水分解率等を勘案して適宜設定すればよいが、例えば12時間以上、好ましくは12〜20時間、更に好ましくは14〜18時間が挙げられる。 In the first step, the reaction time of the glycosphingolipid hydrolysis reaction by EGCase takes into account the glycosphingolipid added to the reaction solvent, the reaction temperature, the hydrolysis rate of the glycosphingolipid to be achieved, and the like. What is necessary is just to set suitably, For example, 12 hours or more, Preferably 12-20 hours, More preferably, 14-18 hours are mentioned.
前記第１工程において、EGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応の反応温度については、使用するEGCaseの作用温度域内で適宜設定すればよいが、通常20〜40℃、好ましくは25〜39℃、更に好ましくは35〜38℃が挙げられる。 In the first step, the reaction temperature of the glycosphingolipid hydrolysis reaction by EGCase may be appropriately set within the working temperature range of EGCase to be used, but is usually 20 to 40 ° C., preferably 25 to 39 ° C. Preferably 35-38 degreeC is mentioned.
前記第２工程は、前記第１工程後に、反応溶媒中に遊離したセラミド及び残存しているスフィンゴ糖脂質を回収する。 In the second step, the ceramide released in the reaction solvent and the remaining glycosphingolipid are recovered after the first step.
セラミド及びスフィンゴ糖脂質の回収は、公知の脂質回収方法に従って行うことができる。具体的には、セラミド及びスフィンゴ糖脂質の回収方法として、ブライ−ダイヤー（Bligh-Dyer）法(E.G. Bligh,W.J.Dye. A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J.Biochem. Physiol. 3, 1959, 911-917.)、フォルク（Folch）法（Folch J., M.Lees, G. H. Sloanestanley, J. Biol. Chem., 226, 1957, 497-509.）等の溶媒抽出法が挙げられる。これらの溶媒抽出法の中でも、ブライ−ダイヤー法が好適である。 Recovery of ceramide and glycosphingolipid can be performed according to a known lipid recovery method. Specifically, as a method for recovering ceramide and glycosphingolipid, the Bligh-Dyer method (EG Bligh, WJDye. A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol. 3 , 1959, 911-917.) And Folch method (Folch J., M. Lees, GH Sloanestanley, J. Biol. Chem., 226, 1957, 497-509.) . Among these solvent extraction methods, the Briyer method is preferred.
第３工程では、前記第２工程において回収されたセラミド及びスフィンゴ糖脂質の混合物に対して、界面活性剤の実質的非存在下で、EGCaseを作用させ、当該スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる。 In the third step, EGCase is allowed to act on the mixture of ceramide and glycosphingolipid collected in the second step in the substantial absence of a surfactant to release ceramide from the glycosphingolipid.
前記第３工程は、反応溶媒に、前記第２工程において回収されたセラミド及びスフィンゴ糖脂質の混合物、並びにEGCaseを添加して、界面活性剤の実質的非存在下でEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始させ、スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる。 In the third step, the mixture of the ceramide and glycosphingolipid recovered in the second step and EGCase are added to the reaction solvent, and the glycosphingolipid is hydrolyzed by EGCase in the substantial absence of a surfactant. The degradation reaction is initiated to release ceramide from the glycosphingolipid.
前記第３工程は、前記「界面活性剤の実質的非存在下でのEGCaseによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応」を行う工程であり、使用する反応溶媒、反応溶媒中のスフィンゴ糖脂質、セラミド及びEGCaseの濃度、反応温度、反応時間等については、前述する通りである。 The third step is a step of performing the “hydrolysis reaction of sphingoglycolipid by EGCase in the substantial absence of surfactant”, the reaction solvent to be used, the glycosphingolipid in the reaction solvent, ceramide and The concentration of EGCase, reaction temperature, reaction time, etc. are as described above.
また、前記第３工程では、前記第２工程において回収されたセラミド及びスフィンゴ糖脂質の混合物を反応溶媒に添加することにより、基質となるスフィンゴ糖脂質、及びスフィンゴ糖脂質の効率的な加水分解反応を進行させるために必要なセラミドが供給されるため、反応溶媒に、前記第２工程において回収された混合物以外にセラミド及び／又はスフィンゴ糖脂質を別途添加する必要はないが、必要に応じて前記第２工程において回収された混合物以外にセラミド及び／又はスフィンゴ糖脂質を別途添加してもよい。 In the third step, the mixture of the ceramide and the glycosphingolipid collected in the second step is added to a reaction solvent, whereby the glycosphingolipid as a substrate and the efficient hydrolysis reaction of the glycosphingolipid are performed. Ceramide and / or glycosphingolipid need not be separately added to the reaction solvent in addition to the mixture recovered in the second step, but if necessary, In addition to the mixture collected in the second step, ceramide and / or glycosphingolipid may be added separately.
［反応後のセラミドの回収］
斯くして、界面活性剤の実質的非存在下でEGCaseによってスフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させた後、ブライ−ダイヤー法、フォルク法等の公知の脂質抽出法によって反応溶媒からセラミドを回収することにより、セラミドが得られる。
[Recovery of ceramide after reaction]
Thus, after ceramide is released from glycosphingolipids by EGCase in the substantial absence of a surfactant, ceramide is recovered from the reaction solvent by a known lipid extraction method such as the Briyer method or the Fork method. Thus, ceramide is obtained.
斯くして得られたセラミドは、化粧料、食品、医薬品の原料として使用することができる。 The ceramide thus obtained can be used as a raw material for cosmetics, foods and pharmaceuticals.
以下、実施例を挙げて、本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定して解釈されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated in detail, this invention is limited to a following example and is not interpreted.
実験材料
・グルコシドセラミド
コンニャク由来グルコシルセラミド（NS170302 Glucosylceramide, from Konjac, 純度(99% (TLC) （株）長良サイエンス）、大豆由来グルコシルセラミド（NS170602 Glucosylceramide, from Soybean, 純度(99% (TLC) （株）長良サイエンス）、タモギ茸由来グルコシルセラミド（NS170502 Glucosylceramide, from Tamogitake, 純度(99% (TLC) （株）長良サイエンス）、トウモロコシ由来グルコシルセラミド（NS170202 Glucosylceramide, from Maize, 純度(99% (TLC) （株）長良サイエンス）を購入して以下の実験に使用した。
Experimental material
・ Glucosylceramide derived from glucoside ceramide konjac (NS170302 Glucosylceramide, from Konjac, purity (99% (TLC) Nagara Science), glucosylceramide derived from soybean (NS170602 Glucosylceramide, from Soybean, purity (99% (TLC) Nagara) Science), Glucosylceramide derived from Tamogi (NS170502 Glucosylceramide, from Tamogitake, Purity (99% (TLC) Nagara Science), Glucosylceramide derived from corn (NS170202 Glucosylceramide, from Maize, Purity (99% (TLC)) Nagara Science) was purchased and used for the following experiments.
・EGCaseI
EGCaseIは、以下に示す遺伝子工学的手法によって得られたものを使用した。先ず、pTipLCH（特許第3944577号、及び特許第3793812号）のマルチクローニングサイトNdeI及びHindIII部位にRhodococcus equi M-750株由来EGCaseIの遺伝子を挿入し構築したベクターpTipEGCI (Journal of Lipid Reseach Vol.53 p2242-2251, 2012)をRhodococcus erthropolis L-88株(特許第3876310号)へ形質転換した。形質転換は、 特許第3876310号等に記載の方法に従いエレクトロポレーション法（電気穿孔法）で実施し、条件は次のようにした。400μLのRhodococcus erthropolis L-88のコンピテントセルとpTip-EGCIの混合液をエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad社：0.2 cmギャップキュベット）に移し、同社の遺伝子導入装置ジーンパルサーIIを用いて、電場強度12.5kV/cmで、パルスコントローラーの設定はキャパシタンス25μF、外部抵抗400Ωにてそれぞれ電気パルスを与えた。電気パルス処理した菌体とDNAの混合液を1mlのLB培地に混合し、30℃にて4時間培養した後集菌し、17.5μg/mlクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天培地に塗布し、30℃で培養し形質転換体を得た。
・ EGCaseI
EGCase I was obtained by the genetic engineering technique shown below. First, a vector pTipEGCI (Journal of Lipid Reseach Vol. 53 p2242) constructed by inserting the gene of EGCaseI derived from Rhodococcus equi M-750 strain into the multiple cloning site NdeI and HindIII sites of pTipLCH (Patent No. 3944577 and Patent No. 3793812). -2251, 2012) was transformed into Rhodococcus erthropolis L-88 strain (Patent No. 3876310). Transformation was carried out by electroporation (electroporation) according to the method described in Japanese Patent No. 3876310 and the conditions were as follows. Transfer 400 μL of Rhodococcus erthropolis L-88 competent cell and pTip-EGCI mixture to an electroporation cuvette (Bio-Rad: 0.2 cm gap cuvette) and use the gene transfer device Gene Pulser II The intensity was 12.5 kV / cm, and the pulse controller was set to have an electric pulse with a capacitance of 25 μF and an external resistance of 400Ω. The mixed solution of bacterial cells and DNA subjected to electric pulse treatment was mixed in 1 ml of LB medium, cultured at 30 ° C. for 4 hours, collected, applied to LB agar medium containing 17.5 μg / ml chloramphenicol, 30 The transformant was obtained by culturing at 0 ° C.
得られた形質転換体を、17.5μg/mlのクロラムフェニコールを含む10mlのLB培地に植菌し28℃で２日間培養した後、培養した菌液5mlを200mlにスケールアップしさらに28℃で２日間培養しシードとした。17.5μg/mlのクロラムフェニコールを含む1LのLB培地に上記のシードを添加し、終濃度0.5μg/mlになるようにチオストレプトンを添加し28℃で１日間培養しEGCaseIの発現を誘導した。 The obtained transformant was inoculated into 10 ml of LB medium containing 17.5 μg / ml chloramphenicol and cultured at 28 ° C. for 2 days. Then, 5 ml of the cultured bacterial solution was scaled up to 200 ml, and further 28 ° C. And seeded by culturing for 2 days. Add the above seeds to 1 L LB medium containing 17.5 μg / ml chloramphenicol, add thiostrepton to a final concentration of 0.5 μg / ml, and incubate at 28 ° C. for 1 day to express EGCaseI. Induced.
培養液を遠心分離して集菌し、細胞破砕用緩衝液 (50mM sodium phosphate buffer, 10% glycerol, 0.3 mM NaCl(pH8.0))で細胞を懸濁、リゾチーム（終濃度2 mg/ml）、ベンゾナーゼ(750 units)を加えて30分氷上静置した後超音波破砕して細胞を破砕した。破砕液を遠心分離し得られた上清を粗タンパク質液とし、タンパク精製に用いた。
前記で得られた粗タンパク質液を上記細胞破砕用緩衝液で平衡化したHis-Select HF Nickel Affinity Gel（Sigma社製）に吸着させた後、洗浄緩衝液 (50mM sodiumphosphate buffer, 10% glycerol, 0.3mM NaCl(pH6.0))で担体を洗浄した。タンパク質は、洗浄緩衝液に0〜400mMのイミダゾールの濃度勾配を形成し溶出した。EGCI溶出画分は20 mM sodiumacetate buffer (pH 5.5)にて透析後、不溶化物を遠心分離で除去し、遠心濃縮機(Amicon Ultra 30K, Millipore)にてタンパク質濃度が6.6 mg/mlになるように濃縮し、濃縮EGCaseI溶液とした。濃縮EGCaseI溶液は、酵素活性を確認後、濃縮液を50μLずつ0.2 mLマイクロチューブに分注して使用時まで-80℃で保管した。なお、得られた濃縮EGCaseI溶液は、-80℃で１年間貯蔵しても、酵素活性の失活は認められないことを確認できている。
The culture is centrifuged to collect the cells, and the cells are suspended in a cell disruption buffer (50 mM sodium phosphate buffer, 10% glycerol, 0.3 mM NaCl (pH 8.0)). Lysozyme (final concentration 2 mg / ml) Benzonase (750 units) was added, and the mixture was allowed to stand on ice for 30 minutes, and then ultrasonically disrupted to disrupt the cells. The supernatant obtained by centrifuging the disrupted solution was used as a crude protein solution, which was used for protein purification.
The crude protein solution obtained above was adsorbed on His-Select HF Nickel Affinity Gel (manufactured by Sigma) equilibrated with the above cell disruption buffer, and then washed with a washing buffer (50 mM sodium phosphate buffer, 10% glycerol, 0.3). The carrier was washed with mM NaCl (pH 6.0)). The protein was eluted by forming a 0-400 mM imidazole gradient in the wash buffer. The EGCI elution fraction is dialyzed with 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.5), insolubles are removed by centrifugation, and the protein concentration is adjusted to 6.6 mg / ml with a centrifugal concentrator (Amicon Ultra 30K, Millipore). Concentrated to give a concentrated EGCase I solution. After confirming the enzyme activity, the concentrated EGCase I solution was dispensed in 50 μL aliquots into 0.2 mL microtubes and stored at −80 ° C. until use. It has been confirmed that the obtained concentrated EGCase I solution does not show inactivation of enzyme activity even when stored at −80 ° C. for 1 year.
また、以下に示す実験において、EGCaseI溶液は、前記濃縮EGCaseI溶液を適宜稀釈したものを使用した。 In the experiments shown below, as the EGCase I solution, a solution obtained by appropriately diluting the concentrated EGCase I solution was used.
セラミド及びグルコシルセラミドの同定及び定量
セラミド及びグルコシルセラミドの同定及び定量は、以下の方法に従って行った。
サンプルを順相シリカゲルTLCプレート（5 cm）のプレートボトムから1.5 cmの薄層上の5 mmの幅に線状にスポットして、クロロホルム、メタノール及び酢酸の混合溶媒で飽和した展開層中でプレートトップまで展開後、十分に乾燥させて、10重量％硫酸銅及び8重量％リン酸を含む水溶液からなる銅リン試薬でスプレーした。なお、下記参考試験例１では前記混合溶媒として、クロロホルム：メタノール：酢酸の容量比が76:3.6:0.4のものを使用し、下記参考試験例２及び試験例１では、クロロホルム：メタノール：酢酸の容量比が99:2:0.4のものを使用した。次いで、銅リン試薬をスプレーしたTLCプレートを180℃に熱したホットプレート上で加熱した。TLCプレート上で分離したセラミド及びグルコシルセラミド等の脂質成分は特異的な紺色の発色を呈することで同定された。
Identification and quantification of ceramide and glucosylceramide Identification and quantification of ceramide and glucosylceramide were performed according to the following method.
Samples were spotted linearly from a plate bottom of a normal phase silica gel TLC plate (5 cm) to a width of 5 mm on a 1.5 cm thin layer and plated in a developing layer saturated with a mixed solvent of chloroform, methanol and acetic acid After developing to the top, it was thoroughly dried and sprayed with a copper phosphorus reagent consisting of an aqueous solution containing 10 wt% copper sulfate and 8 wt% phosphoric acid. In Reference Test Example 1 below, a mixed solvent having a volume ratio of chloroform: methanol: acetic acid of 76: 3.6: 0.4 is used. In Reference Test Example 2 and Test Example 1 below, chloroform: methanol: acetic acid is used. A volume ratio of 99: 2: 0.4 was used. The TLC plate sprayed with the copper phosphorus reagent was then heated on a hot plate heated to 180 ° C. Lipid components such as ceramide and glucosylceramide separated on the TLC plate were identified by exhibiting specific amber color development.
また、セラミドとグルコシルセラミドの量を定量するために、発色させたプレートからイメージスキャナーで取り込んだデジタル画像（TIF）を画像解析ソフトウエアー（JustTLC, SWEDAY, Sodara, Sanby, Sweden)で解析し、同一レーン上のセラミドとグルコシルセラミドのバンドをそれぞれの呈色度合に応じて数値化した。数値化したバンドの総和からセラミドの収率を下記式に従って算出した。また、精製した未知量のセラミドも同様の方法でTLC上に一定量をスポットした後に展開・発色後にバンドの呈色を数値化した。その際に、異なる既知量のグルコシルセラミドを別の３レーンにスポットさせておくことで、未知量のセラミドの呈色を３レーンのグルコシルセラミドの呈色の検量線から換算してセラミド含量を算出した。
参考試験例１
植物由来の精製グルコシルセラミド（大豆由来(S) 100μg、コンニャク由来(K) 100μg、トウモロコシ由来(C) 100μg、タモギダケ由来(T) 50μg）を基質として、これに、EGCaseI溶液50μL(6.6 mg/mL)、TritonX-100(終濃度0.02重量％)、及び0.1M酢酸ナトリウム水溶液(pH5.0) 440μLを加え、37℃で16時間インキュベーションした。その後、Bligh-Dyer抽出法によって脂質画分を回収し、得られた脂質画分を濃縮乾固して、セラミドとグルコシルセラミドの量の定量を行った。
Reference test example 1
Plant-derived purified glucosylceramide (soybean-derived (S) 100 μg, konjac-derived (K) 100 μg, corn-derived (C) 100 μg, tamogi mushroom-derived (T) 50 μg) was used as an EGCaseI solution 50 μL (6.6 mg / mL) ), TritonX-100 (final concentration 0.02% by weight), and 0.1M sodium acetate aqueous solution (pH 5.0) 440 μL were added and incubated at 37 ° C. for 16 hours. Thereafter, the lipid fraction was collected by the Bligh-Dyer extraction method, and the obtained lipid fraction was concentrated and dried to determine the amount of ceramide and glucosylceramide.
得られた結果を表１及び図１に示す。TritonX-100非存在下で、前記と同条件で反応を行った場合、セラミドの収率は45〜60％であったが（結果は省略）、0.02重量％のTritonX-100存在下では、セラミドの収率は向上しており、コンニャク由来のグルコシルセラミドを基質として使用した場合には、収率が82.5％にまで増量していた。 The obtained results are shown in Table 1 and FIG. When the reaction was carried out in the absence of TritonX-100 under the same conditions as above, the yield of ceramide was 45-60% (results omitted), but in the presence of 0.02% by weight of TritonX-100, ceramide was obtained. The yield was increased to 82.5% when konjac-derived glucosylceramide was used as a substrate.
参考試験例２
可溶化剤がEGCaseIによるグルコシルセラミドの加水分解効率に及ぼす影響を明らかにするために、以下の試験を行った。コンニャク由来の精製グルコシルセラミド100μgを基質として、これに、EGCaseI溶液50μL(6.6 mg/mL)、可溶化剤、及び0.1M酢酸ナトリウム水溶液(pH5.0) 440μLを加え、37℃で16時間インキュベーションした。なお、可溶化剤としては、デオキシコール酸ナトリウム(終濃度0.1重量％)、ジメチルスルフォキシド(終濃度重量％)、及びTriton X-100(終濃度0.02重量％又は0.2重量％)を使用した。また、比較のために、可溶化剤を添加することなく、前記と同条件でインキュベーションを行った。その後、Bligh-Dyer抽出法によって脂質画分を回収し、得られた脂質画分を濃縮乾固して、セラミドとグルコシルセラミドの量の定量を行った。
Reference test example 2
In order to clarify the influence of the solubilizer on the hydrolysis efficiency of glucosylceramide by EGCase I, the following tests were conducted. Purified glucosylceramide derived from konjac 100 μg as a substrate, EGCase I solution 50 μL (6.6 mg / mL), solubilizer, and 0.1 M sodium acetate aqueous solution (pH 5.0) 440 μL were added thereto, and incubated at 37 ° C. for 16 hours. . As solubilizers, sodium deoxycholate (final concentration 0.1 wt%), dimethyl sulfoxide (final concentration wt%), and Triton X-100 (final concentration 0.02 wt% or 0.2 wt%) were used. . For comparison, incubation was performed under the same conditions as described above without adding a solubilizer. Thereafter, the lipid fraction was collected by the Bligh-Dyer extraction method, and the obtained lipid fraction was concentrated and dried to determine the amount of ceramide and glucosylceramide.
得られた結果を表２に示し、可溶化剤としてTriton X-100(終濃度0.02重量％)を添加した場合の結果を図２に示す。可溶化剤非存在下では、セラミドの収率は57.1％であったが、Triton X-100の存在下ではセラミドの収率が向上しており、終濃度0.02重量％のTriton X-100存在下ではセラミドの収率は略100％にまで向上していた。また、デオキコール酸ナトリウム又はジメチルスルフォキシドの存在下では、セラミドの収率の大幅な向上は認められなかった。 The obtained results are shown in Table 2, and the results when Triton X-100 (final concentration 0.02% by weight) is added as a solubilizer are shown in FIG. In the absence of solubilizer, the yield of ceramide was 57.1%, but in the presence of Triton X-100, the yield of ceramide was improved and in the presence of Triton X-100 at a final concentration of 0.02% by weight. Then, the yield of ceramide was improved to about 100%. In addition, in the presence of sodium deoxycholate or dimethyl sulfoxide, no significant improvement in the yield of ceramide was observed.
試験例１
コンニャク由来のグルコシドセラミドのクロロホルム溶液100μL (135 nmol, 100μg)を入れた10本のねじ付丸底ガラス試験管（16×100 m/m）を用意し、遠心式エバポレーター(EYELA, CVE-100)中で、40℃で数分間遠心濃縮させて乾固させた。その後、450μLの0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)を各々の試験管に加え、基質液が目視で均一に懸濁されるまでボルックスミキサーで撹拌した後に小型超音波洗浄機(Elma Ultrasonic Cleaner, 460/H)で5秒間処理した。次いで、各々の試験管に、EGCaseI溶液50μL(2.6 mg/mL、4.0 mg/mL、5.3 mg/mL、又は6.6 mg/mL)を加えてボルテックスミキサーで撹拌した後に、37℃で16時間振とうして酵素反応させた（以上、第１工程）。
Test example 1
Prepare 10 threaded round-bottom glass test tubes (16 × 100 m / m) containing 100 μL (135 nmol, 100 μg) chloroform solution of konjac-derived glucoside ceramide and centrifuge evaporator (EYELA, CVE-100) Inside, it was concentrated to dryness by centrifugation at 40 ° C. for several minutes. After that, 450 μL of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0) was added to each tube, stirred with a Volx mixer until the substrate solution was uniformly suspended visually, and then a small ultrasonic cleaner (Elma Ultrasonic Cleaner, 460 / H) for 5 seconds. Next, add 50 μL of EGCase I solution (2.6 mg / mL, 4.0 mg / mL, 5.3 mg / mL, or 6.6 mg / mL) to each test tube and stir with a vortex mixer, and then shake at 37 ° C. for 16 hours. Then, the enzyme reaction was carried out (the first step).
その後、各々の試験管に1.3 mLの水、2 mLのクロロホルム、及び2 mLのメタノールを加えてボルテックスミキサーで撹拌した後に、2,500 rpmで５分間の遠心を行ない２層に分離させた（Bligh-Dyerの抽出法）。下層の有機層を分け取り、上層には2 mLのクロロホルムを加えてボルテックスミキサーで撹拌した後に、2,500 rpmで５分間の遠心を行なった。更に2 mLのクロロホルムを加えた撹拌と遠心を２回繰り返して下層を分け取り集めた10本の試験管からの下層を全て合わせてロータリーエバポレーターで濃縮乾固させた。濃縮乾固物を5 mLのクロロホルムに溶かして、0.5 mLずつを１０本の試験管に分注して、遠心式エバポレーターで、脂質画分を遠心濃縮乾固させた（以上、第２工程）。 Thereafter, 1.3 mL of water, 2 mL of chloroform, and 2 mL of methanol were added to each test tube, and the mixture was stirred with a vortex mixer, and then centrifuged at 2,500 rpm for 5 minutes to separate into two layers (Bligh- Dyer's extraction method). The lower organic layer was separated, 2 mL of chloroform was added to the upper layer, and the mixture was stirred with a vortex mixer, and then centrifuged at 2,500 rpm for 5 minutes. Further, stirring and centrifugation with addition of 2 mL of chloroform were repeated twice, and all the lower layers from the 10 test tubes collected by collecting the lower layer were combined and concentrated to dryness on a rotary evaporator. The concentrated dried product was dissolved in 5 mL of chloroform, 0.5 mL each was dispensed into 10 test tubes, and the lipid fraction was centrifuged and concentrated to dryness using a centrifugal evaporator (the second step). .
次いで、450μLの0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)を各々の試験管に加え、上記と同様な操作によりEGCaseI溶液50μL(2.6 mg/mL、4.0 mg/mL、5.3 mg/mL、又は6.6 mg/mL)を加えて、37℃で16時間振とうして酵素反応させた（以上、第３工程）。 Next, 450 μL of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0) was added to each test tube, and EGCase I solution 50 μL (2.6 mg / mL, 4.0 mg / mL, 5.3 mg / mL, or 6.6 mg) was prepared in the same manner as above. / mL), and the enzyme reaction was carried out by shaking at 37 ° C. for 16 hours (the third step).
前記第２工程後の脂質画分、及び第３工程後にBligh-Dyer抽出法によって回収して濃固した脂質画分について、セラミドとグルコシルセラミドの量の定量を行い、セラミドの収率を算出した。 The amount of ceramide and glucosylceramide was determined for the lipid fraction after the second step and the lipid fraction collected and concentrated by the Bligh-Dyer extraction method after the third step, and the yield of ceramide was calculated. .
得られた結果を表３及び図３に示す。前記第２工程後に得られた脂質画分（即ち、界面活性剤非存在下でグルコシドセラミドにEGCaseIを１回のみ作用させた場合）では、使用するEGCaseIを増やしても、セラミドの収率は55％程度以下に止まっていた。これに対して、前記第３工程後に得られた脂質画分では、略100％の収率でセラミドが得られていた。 The obtained results are shown in Table 3 and FIG. In the lipid fraction obtained after the second step (that is, when EGCaseI is allowed to act only once on glucoside ceramide in the absence of a surfactant), the yield of ceramide is 55 even if the EGCaseI used is increased. It remained below about%. In contrast, in the lipid fraction obtained after the third step, ceramide was obtained in a yield of approximately 100%.
以上の結果から、界面活性剤の実質的非存在下で、エンドグリコセラミダーゼを使用してスフィンゴ糖脂質からセラミドを製造する場合には、セラミド存在下でエンドグリコセラミダーゼによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始することによって、セラミドの収率が格段に向上することが可能になることが明らかとなった。特に、界面活性剤の実質的非存在下、スフィンゴ糖脂質にエンドグリコセラミダーゼを作用させる工程と、当該工程によって得られたスフィンゴ糖脂質とセラミドに対して再度界面活性剤の実質的非存在下でエンドグリコセラミダーゼを作用させる工程を行うことによって、セラミドの収率が飛躍的に向上することも明らかとなった。 From the above results, when producing ceramide from glycosphingolipid using endoglycoceramidase in the substantial absence of surfactant, hydrolysis reaction of glycosphingolipid by endoglycoceramidase in the presence of ceramide It has become clear that the yield of ceramide can be remarkably improved by starting the process. In particular, in the substantial absence of a surfactant, a step of causing glycosphingolipid to act on endoglycoceramidase, and again in the substantial absence of a surfactant on the glycosphingolipid and ceramide obtained by the step. It has also been clarified that the yield of ceramide is remarkably improved by performing the step of allowing endoglycoceramidase to act.
Claims (6)
セラミド存在下でエンドグリコセラミダーゼによるスフィンゴ糖脂質の加水分解反応を開始することを特徴とする、セラミドの製造方法。 A method of producing ceramide from glycosphingolipids using endoglycoceramidase in the substantial absence of a surfactant, comprising:
A method for producing ceramide, characterized by starting a hydrolysis reaction of glycosphingolipid by endoglycoceramidase in the presence of ceramide.
界面活性剤の実質的非存在下で、スフィンゴ糖脂質にエンドグリコセラミダーゼを作用させ、セラミドを遊離させる第１工程、
前記第１工程で遊離したセラミド及び残存しているスフィンゴ糖脂質を回収する第２工程、及び
前記第２工程で得られたセラミド及びスフィンゴ糖脂質の混合物に対して、界面活性剤の実質的非存在下で、エンドグリコセラミダーゼを作用させ、当該スフィンゴ糖脂質からセラミドを遊離させる第３工程。 The manufacturing method according to claim 1, comprising the following first to third steps:
A first step of releasing ceramide by allowing endoglycoceramidase to act on glycosphingolipid in the substantial absence of a surfactant;
The second step of recovering the ceramide released in the first step and the remaining glycosphingolipid, and the mixture of the ceramide and the glycosphingolipid obtained in the second step are substantially free of surfactant. A third step in which endoglycoceramidase is allowed to act in the presence to release ceramide from the glycosphingolipid.
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020045308A (en) * | 2018-09-18 | 2020-03-26 | 一丸ファルコス株式会社 | Novel ceramide and skin humectant containing the same and method for producing ceramide composition |
| JP2021048794A (en) * | 2019-09-25 | 2021-04-01 | オカヤス株式会社 | Ceramide aglycone-containing composition, and production method |
| WO2021131627A1 (en) * | 2019-12-26 | 2021-07-01 | 株式会社ジェヌインＲ＆Ｄ | Composition for producing ceramide |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02227087A (en) * | 1989-02-28 | 1990-09-10 | Oji Koonsutaac Kk | Production of cyclodextrin |
| JPH067161A (en) * | 1992-03-04 | 1994-01-18 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | New endoglycoceramidase |
| JPH0970293A (en) * | 1995-06-29 | 1997-03-18 | Takara Shuzo Co Ltd | Endoglycoceramidase activator gene |
| JP2003231640A (en) * | 2002-02-04 | 2003-08-19 | Unitika Ltd | Agent for treatment of atopic dermatitis |
| JP2007312677A (en) * | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Kyushu Univ | New endoglycoceramidase |
| JP2009022220A (en) * | 2007-07-20 | 2009-02-05 | Nagase Chemtex Corp | Method for producing ceramides |
| WO2009107223A1 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | 学校法人 明治大学 | Method of producing ceramide |
-
2016
- 2016-04-28 JP JP2016091428A patent/JP6823780B2/en active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02227087A (en) * | 1989-02-28 | 1990-09-10 | Oji Koonsutaac Kk | Production of cyclodextrin |
| JPH067161A (en) * | 1992-03-04 | 1994-01-18 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | New endoglycoceramidase |
| JPH0970293A (en) * | 1995-06-29 | 1997-03-18 | Takara Shuzo Co Ltd | Endoglycoceramidase activator gene |
| JP2003231640A (en) * | 2002-02-04 | 2003-08-19 | Unitika Ltd | Agent for treatment of atopic dermatitis |
| JP2007312677A (en) * | 2006-05-25 | 2007-12-06 | Kyushu Univ | New endoglycoceramidase |
| JP2009022220A (en) * | 2007-07-20 | 2009-02-05 | Nagase Chemtex Corp | Method for producing ceramides |
| WO2009107223A1 (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-03 | 学校法人 明治大学 | Method of producing ceramide |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS REPORTS, vol. 5, JPN6020003833, 19 November 2015 (2015-11-19), pages 160 - 167, ISSN: 0004205327 * |
| CAN. J. BIOCHEM. PHYSIOL., vol. 37, JPN6020003837, 1959, pages 911 - 917, ISSN: 0004205331 * |
| J. BIOL. CHEM., vol. 266, JPN6020003836, 1991, pages 7919 - 7926, ISSN: 0004205330 * |
| 日本農芸化学会誌, vol. 64, JPN6020003835, 1990, pages 1479 - 1483, ISSN: 0004205329 * |
| 油化学, vol. 40, JPN6020003834, 1991, pages 352 - 360, ISSN: 0004205328 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2020045308A (en) * | 2018-09-18 | 2020-03-26 | 一丸ファルコス株式会社 | Novel ceramide and skin humectant containing the same and method for producing ceramide composition |
| JP2021048794A (en) * | 2019-09-25 | 2021-04-01 | オカヤス株式会社 | Ceramide aglycone-containing composition, and production method |
| JP7215817B2 (en) | 2019-09-25 | 2023-01-31 | オカヤス株式会社 | Ceramide aglycone-containing composition and production method |
| WO2021131627A1 (en) * | 2019-12-26 | 2021-07-01 | 株式会社ジェヌインＲ＆Ｄ | Composition for producing ceramide |
| JP2021103950A (en) * | 2019-12-26 | 2021-07-26 | 株式会社ジェヌインＲ＆Ｄ | Composition for generating ceramide |
| JP7285007B2 (en) | 2019-12-26 | 2023-06-01 | 株式会社ジェヌインR&D | Ceramide-generating composition |
| TWI820368B (en) * | 2019-12-26 | 2023-11-01 | 日商真誠Ｒ＆Ｄ股份有限公司 | Composition for producing ceramide |
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