JP2017195786A - Method for normalizing structural abnormality of intracellular enzyme protein, method for detecting structural abnormality of intracellular enzyme protein, and method for treating inherited metabolic diseases, and prediction and evaluation methods for therapeutic effect thereof - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、化学シャペロン化合物による酵素タンパク質の構造異常の正常化方法、プロテアーゼを用いた細胞内酵素タンパク質の高次構造異常の検出方法、および化学シャペロン化合物療法と酵素補充療法の併用療法による遺伝性代謝病の治療方法、ならびにその治療効果の予測・評価方法に関するものである。 The present invention relates to a method for normalizing a structural abnormality of an enzyme protein by a chemical chaperone compound, a method for detecting a higher-order structural abnormality of an intracellular enzyme protein using a protease, and heritability by a combined therapy of chemical chaperone compound therapy and enzyme replacement therapy. The present invention relates to a method for treating a metabolic disease, and a method for predicting and evaluating the therapeutic effect.
人は、一般には複雑な成分で構成されている食品や飲料を摂取し、単純な物質に分解し、これらの分解した物質を基本成分として使用して、生命維持に必要な物質を組み立てている。 People generally consume foods and beverages that are composed of complex ingredients, break down into simple substances, and use these decomposed substances as basic ingredients to assemble substances necessary for life support. .
このような摂取した物質をそれぞれの栄養素に分解・合成する複雑な代謝を担うのが酵素であり、この酵素は体内で生成される。したがって、その酵素が遺伝的な異常により機能障害や欠損を起こすと、その酵素が正常に機能せずに摂取した物質を正常に分解または合成することができずに体に不可欠な物質を組み立てることができなくなり、様々な遺伝性代謝疾患を発症することになる。 Enzymes are responsible for the complex metabolism that decomposes and synthesizes the ingested substances into their nutrients, and these enzymes are produced in the body. Therefore, if the enzyme causes a dysfunction or deficiency due to a genetic abnormality, the enzyme does not function normally and the ingested substance cannot be normally decomposed or synthesized, and an essential substance for the body is assembled. Will be unable to develop and develop various inherited metabolic diseases.
つまり、かかる遺伝性代謝病は、分解されるべき物質が分解されずに毒性のある中間代謝産物などとして蓄積されたり、または体に不可欠な物質が生成できなかったりすることで起こる。 That is, such a genetic metabolic disease occurs when a substance to be decomposed is not decomposed and accumulated as a toxic intermediate metabolite or a substance essential for the body cannot be generated.
遺伝性代謝病は遺伝的要因による疾患であり、例えば、アミノ酸代謝異常症、先天性代謝異常症、糖質代謝異常症、リソソーム代謝異常症などの疾患が挙げられる。 Hereditary metabolic diseases are diseases caused by genetic factors, and examples include diseases such as amino acid metabolism disorders, inborn errors of metabolism, carbohydrate metabolism disorders, and lysosomal metabolism disorders.
アミノ酸代謝異常症は、必須アミノ酸のフェニルアラニンからチロシンへ転換するフェニルアラニン水酸化酵素の異常によって生じる疾患である。先天性代謝異常症は、炭水化物、タンパク質、脂肪代謝の先天的異常による特定タンパク質の合成障害により発症する疾患である。糖質代謝異常症は、ガラクトース代謝に関係する酵素異常症により発症する疾患である。リソソーム代謝異常症は、細胞内で不要な物質を消化する役割を果たす、全身のすべての細胞に存在するリソソーム内の酵素が作用せず、または作用が低下して分解されるべき物質が分解されずにリソソーム内に蓄積されて発症する疾患である。 Amino acid metabolism disorders are diseases caused by abnormalities in phenylalanine hydroxylase that converts the essential amino acid phenylalanine to tyrosine. Inborn errors of metabolism are diseases that develop due to impaired synthesis of specific proteins due to inborn abnormalities in carbohydrate, protein, and fat metabolism. Glucose metabolism disorder is a disease that develops due to an enzyme disorder related to galactose metabolism. In lysosomal metabolic disorders, enzymes in lysosomes present in all cells throughout the body, which play a role in digesting unnecessary substances in the cells, do not work, or substances that should be degraded due to reduced action are degraded. It is a disease that develops without being accumulated in lysosomes.
リソソーム代謝異常症は、リソソーム内酵素の遺伝的欠損により数多くの病型が知られている。具体的な疾患としては、例えば、GM1−ガングリオシドーシス、GM2−ガングリオシドーシス、ファブリー病、ゴーシェ病、ポンペ病、ムコ多糖症などのリソソーム病が挙げられる。 Many types of lysosomal metabolic disorders are known due to genetic defects in lysosomal enzymes. Specific examples of the disease include GM1-gangliosidosis, GM2-gangliosidosis, Fabry disease, Gaucher disease, Pompe disease, and mucopolysaccharidosis.
かかるリソソーム病の治療には、ファブリー病に対してアガルシダーゼアルファやアガルシダーゼベータ、ゴーシェ病に対してイミグルセラーゼ、ポンペ病に対してアルグルコシダーゼアルファ、ムコ多糖症I型に対してラロニダーゼ、ムコ多糖症II型に対してイズロサルフェース、ムコ多糖症VI型に対してガルサルファーゼの6疾患7種類のリソソーム病酵素補充療法製剤が承認されていて、これらの酵素製剤を点滴静注にて投与することにより、細胞外から細胞内そしてリソソーム内に酵素を輸送し、リソソーム内に蓄積している物質の分解を促進する酵素補充療法がおこなわれている。 Such lysosomal diseases include agarsidase alpha and agarsidase beta for Fabry disease, imiglucerase for Gaucher disease, alglucosidase alpha for Pompe disease, laronidase and mucopolysaccharidosis for mucopolysaccharidosis type I Izusalofa for type II and seven lysosomal disease enzyme replacement therapy products for six diseases of galsulfase for mucopolysaccharidosis type VI are approved, and these enzyme preparations are administered by intravenous infusion As a result, enzyme replacement therapy is carried out in which enzymes are transported from the outside of cells into cells and into lysosomes, and the degradation of substances accumulated in lysosomes is promoted.
酵素補充療法は、臨床症状を改善し、さらにその進行も抑制するとともに、他の根治療法(造血幹細胞移植や遺伝子治療法など)に比べて安全性が高いことが利点である。しかし、酵素製剤が到達しにくい中枢神経や角膜などへの効果は期待できないことや酵素製剤に対する抗体が産生され細胞内への取り込みが著しく低下すること、酵素製剤自体が極めて高額であることから国民医療費への負担が大きいことに加え、頻回の点滴治療が生涯必要であり患者への負担は少なくない。以上のごとく、酵素補充療法は、今後解決すべき課題が多い治療法でもある。 Enzyme replacement therapy is advantageous in that it improves clinical symptoms, further suppresses its progression, and is safer than other radical therapies (such as hematopoietic stem cell transplantation and gene therapy). However, because the effects on the central nervous system and cornea, which are difficult to reach the enzyme preparation, cannot be expected, the antibody against the enzyme preparation is produced and the uptake into cells is significantly reduced, and the enzyme preparation itself is extremely expensive. In addition to the large burden on medical expenses, frequent infusion treatments are necessary throughout the life, and the burden on patients is not limited. As described above, enzyme replacement therapy is also a treatment method with many problems to be solved in the future.
酵素補充療法に加えて、遺伝性代謝病の治療に化学シャペロン療法という新しい治療法が研究されている。 In addition to enzyme replacement therapy, a new treatment called chemical chaperone therapy is being studied for the treatment of inherited metabolic diseases.
化学シャペロン療法とは、遺伝性代謝病の病因となる変異酵素タンパク質が細胞内で合成される際に、酵素の活性中心に化学シャペロン化合物が結合することで、不安定な構造異常を形成する運命にあった変異酵素タンパク質を正常高次構造の酵素タンパク質へと導き、酵素タンパク質の細胞内安定性を維持することで、その酵素タンパク質本来の機能を発揮させ、細胞内に過剰蓄積した生体内基質を分解処理することで細胞障害を改善することを基本原理とする、遺伝性代謝病の治療方法の一つと考えられている。しかし、これまで化学シャペロンにより細胞内酵素タンパク質の正常高次構造が形成・維持されていることを証明した報告はなく、本発明が提供する技術によりその事実が初めて証明された。 Chemical chaperone therapy is the fate of forming unstable structural abnormalities by binding chemical chaperone compounds to the active center of the enzyme when a mutant enzyme protein that causes genetic metabolic diseases is synthesized in the cell. In vivo substrate that over-accumulates in the cell by leading the enzyme protein of normal structure to the enzyme protein of normal higher-order structure, maintaining the intracellular stability of the enzyme protein, and exerting the original function of the enzyme protein It is considered to be one of the treatment methods for hereditary metabolic diseases based on the basic principle of improving cell damage by decomposing and treating. However, there has been no report that proves that a normal higher-order structure of an intracellular enzyme protein has been formed and maintained by a chemical chaperone, and this fact has been proved for the first time by the technique provided by the present invention.
現在では、去痰剤として汎用されるアンブロキソール塩酸塩(ムコソルバン錠)がゴーシェ病に対する治療薬として承認され、特定の変異遺伝型を有するゴーシェ病の治療に使用されている。 At present, ambroxol hydrochloride (mucosolvan tablet), which is widely used as an expectorant, is approved as a therapeutic agent for Gaucher disease and is used for the treatment of Gaucher disease having a specific mutant genotype.
これまで数多くの化合物が化学シャペロン化合物として研究されてきた(非特許文献1〜9)。しかしながら、上述したようなアンブロキソール塩酸塩(ムコソルバン錠)がゴーシェ病に対する治療薬として承認されているだけである。 Many compounds have been studied as chemical chaperone compounds so far (Non-Patent Documents 1 to 9). However, Ambroxol hydrochloride (mucosolvan tablets) as described above is only approved as a therapeutic agent for Gaucher disease.
そこで、発明者らは、化学シャペロン療法が、酵素補充療法に比べて、中枢神経症状への応用、免疫反応による副作用、治療費用の問題において有利であると考えられることから、さらに幅広く化学シャペロン候補化合物をスクリーニングした結果、リソソーム病の一つであるポンペ病(酸性α-グルコシダーゼ欠損症:II型糖原病)に対する化学シャペロン化合物として、イミノ糖の一種であるデオキシノジリマイシンならびにその誘導体が、ポンペ病由来変異酵素を正常高次構造の酵素タンパク質へと導き、細胞内でのプロセシングを正常化することを見いだして、本発明を完成した。 Therefore, the inventors consider that chemical chaperone therapy is more advantageous than enzyme replacement therapy in terms of application to central nervous system symptoms, side effects due to immune reactions, and treatment cost problems. As a result of screening the compounds, as a chemical chaperone compound for Pompe disease (acidic α-glucosidase deficiency: type II glycogenosis), which is one of the lysosomal diseases, deoxynojirimycin, which is a kind of imino sugar, and its derivatives are The present invention was completed by finding that a disease-derived mutant enzyme is led to an enzyme protein having a normal higher-order structure and normalizing intracellular processing.
発明者らは、上述の研究に加えて、プロテアーゼにより、遺伝性代謝病の病因酵素タンパク質の構造異常を検出することができることを確認して、この発明を完成した。 In addition to the above-mentioned studies, the inventors have confirmed that a structural abnormality of a pathogenic enzyme protein of a hereditary metabolic disease can be detected by a protease, thereby completing the present invention.
つまり、遺伝性代謝病は、遺伝子変異が原因で酵素タンパク質の正常高次構造が崩れ、それにより酵素タンパク質が正常な酵素作用を機能することができず細胞内に生体内基質が過剰蓄積して発症する疾患である。このように酵素タンパク質の高次構造の異常を検出することは、遺伝性代謝病の新規治療法の開発や既存治療法の治療効果の予測・評価ならびに診断の際に非常に有用である。 In other words, in genetic metabolic diseases, the normal higher-order structure of the enzyme protein is disrupted due to genetic mutations, which prevents the enzyme protein from functioning as a normal enzyme, resulting in excessive accumulation of substrate in the cell. It is a disease that develops. Thus, detecting abnormalities in the higher-order structure of an enzyme protein is very useful in the development of new treatment methods for hereditary metabolic diseases, prediction / evaluation of treatment effects of existing treatment methods, and diagnosis.
また、本発明者らは、本来であれば異常な高次構造を形成するはずの遺伝性代謝病の病因酵素タンパク質が、上述の化学シャペロン化合物により正常高次構造へと導かれプロセシングが促進することを、プロテアーゼに対する抵抗性を調べることで証明し、この発明を完成した。 In addition, the present inventors have promoted processing by causing the above-described chemical chaperone compound to convert a pathogenic enzyme protein of a hereditary metabolic disease that should normally form an abnormal higher-order structure into a normal higher-order structure. This was proved by examining the resistance to protease, and the present invention was completed.
さらに、本発明者らは、上述の化学シャペロン化合物と酵素補充を併用することにより、酵素補充療法により細胞内に取り込まれた酵素製剤の正常高次構造の形成・維持ならびにプロセシングを促進することを見いだした。つまり、酵素補充療法による酵素製剤と、化学シャペロン療法による化学シャペロン化合物の同時添加により、細胞内の酵素活性が相乗的に上昇することを認めて、この発明を完成した。 Furthermore, the present inventors have promoted the formation / maintenance and processing of the normal higher-order structure of an enzyme preparation incorporated into cells by enzyme replacement therapy by using the above-mentioned chemical chaperone compound and enzyme supplementation in combination. I found it. That is, the present invention was completed by recognizing that the enzyme activity in the cells synergistically increased by the simultaneous addition of the enzyme preparation by enzyme replacement therapy and the chemical chaperone compound by chemical chaperone therapy.
本発明は、化学シャペロン化合物を使用して遺伝性代謝病に関連する変異酵素タンパク質の異常構造を正常化する変異酵素タンパク質の正常化方法ならびにその解析方法を提供することを主な目的としている。 The main object of the present invention is to provide a method for normalizing a mutant enzyme protein that uses a chemical chaperone compound to normalize the abnormal structure of the mutant enzyme protein associated with an inherited metabolic disease, and a method for analyzing the same.
本発明によれば、化学シャペロン化合物による変異酵素タンパク質の高次構造の正常化のメカニズムは、変異酵素タンパク質が細胞内で合成される際に、化学シャペロン化合物が当該酵素タンパク質の活性中心に結合することで、その酵素タンパク質本来の高次構造を形成するものと考えられている。本発明は、当該酵素タンパク質の高次構造の異常を検出することで、正常なプロセシングへ導くことを証明するための基盤技術を提供することを目的としている。 According to the present invention, the mechanism of normalization of the higher-order structure of the mutant enzyme protein by the chemical chaperone compound is that the chemical chaperone compound binds to the active center of the enzyme protein when the mutant enzyme protein is synthesized in the cell. Thus, it is considered that the higher order structure of the enzyme protein is formed. An object of the present invention is to provide a basic technique for demonstrating that it leads to normal processing by detecting abnormalities in the higher-order structure of the enzyme protein.
本発明は、プロテアーゼにより、遺伝性代謝病の病因酵素タンパク質が細胞内において形成する高次構造の異常を検出することからなる酵素タンパク質構造の検出方法を提供することを次の目的としている。 An object of the present invention is to provide a method for detecting an enzyme protein structure comprising detecting an abnormality of a higher-order structure formed in a cell by a pathogenic enzyme protein of a hereditary metabolic disease using a protease.
本発明は、上述の化学シャペロン化合物を使用した遺伝性代謝病に関連する変異酵素タンパク質を正常高次構造に導くことで、遺伝性代謝病を治療する化学シャペロン療法と、患者体内で欠損した酵素を対外から補充して細胞内酵素活性を増加させ、当該酵素タンパク質に対する生体内基質を分解する酵素補充療法と上述の化学シャペロン療法を併用して遺伝性代謝病を治療する遺伝性代謝病の併用療法を提供することを更なる目的としている。 The present invention relates to a chemical chaperone therapy for treating a hereditary metabolic disease by introducing a mutant enzyme protein related to a hereditary metabolic disease using the above-described chemical chaperone compound to a normal higher-order structure, and an enzyme deficient in a patient's body. Combined use of enzyme replacement therapy that increases intracellular enzyme activity by replenishing the enzyme from the outside, and degrades the in vivo substrate for the enzyme protein, and the above-mentioned chemical chaperone therapy, and a genetic metabolic disease that treats hereditary metabolic diseases A further goal is to provide therapy.
なお、本発明で使用する用語「プロセシング」とは、細胞内で酵素などのタンパク質が合成された後に、様々なプリテアーゼの働きにより、ペプチド結合が切断され、前駆体タンパク質から中間体を経て成熟体タンパク質へと変化していく過程を意味している。通常は、最終的に生成された成熟体タンパク質が細胞内において本来の生理活性や酵素活性を発揮する。 The term “processing” used in the present invention means that after a protein such as an enzyme is synthesized in a cell, the peptide bond is cleaved by the action of various preteases, and from the precursor protein to the mature form. It means the process of changing to protein. Usually, the mature protein finally produced exhibits the original physiological activity and enzyme activity in the cell.
また、本明細書で使用する用語「化学シャペロン化合物」とは、細胞内でタンパク質が合成される際に、そのタンパク質の折りたたみを介添えする低分子化合物を意味し、この化学シャペロン化合物による折りたたみ支援により、タンパク質は正常な高次構造の形成が促進させる。本発明が開発されるまでは、目的とする酵素タンパク質が化学シャペロン化合物により細胞内で正常な高次構造を形成しているか否か解析不可能であった。しかし、本発明により、化学シャペロン化合物の働きにより、当該酵素タンパク質が正常高次構造を形成していることを初めて明らかにすることができた。なお、化学シャペロン化合物は、標的タンパク質が適切な構造と正常な機能を獲得した後は、結合している酵素タンパク質から遊離し、細胞内に過剰蓄積した生体内基質の分解を行う。 In addition, the term “chemical chaperone compound” used in the present specification means a low-molecular compound that mediates the folding of a protein when the protein is synthesized in a cell. The protein promotes the formation of normal conformation. Until the present invention was developed, it was impossible to analyze whether or not the target enzyme protein formed a normal higher-order structure in the cell by the chemical chaperone compound. However, according to the present invention, it has been clarified for the first time that the enzyme protein forms a normal higher order structure by the action of the chemical chaperone compound. The chemical chaperone compound is released from the bound enzyme protein after the target protein has acquired an appropriate structure and normal function, and decomposes the in vivo substrate accumulated excessively in the cell.
上記目的を達成するために、本発明は、ポンペ病細胞を疾患モデルとして、デオキシノジリマイシン(DNJ)ならびにその誘導体などの化学シャペロン化合物を使用して、遺伝性代謝病に関連する変異酵素タンパク質の正常高次構造の形成・維持ならびにプロセシング促進効果を解析する方法を提供する。 In order to achieve the above object, the present invention uses a Pompe cell as a disease model, and uses a chemical chaperone compound such as deoxynojirimycin (DNJ) and its derivatives, to mutate enzyme protein related to hereditary metabolic disease. The present invention provides a method for analyzing the formation / maintenance of normal higher-order structure and the effect of promoting processing.
また、本発明は、上述の化学シャペロン化合物を使用した遺伝性代謝病に関連する変異酵素タンパク質の正常高次構造の形成・維持ならびにプロセシングを正常化して遺伝性代謝病を治療する化学シャペロン療法と、更に患者体内で欠損した酵素を体外から補充して細胞内へ酵素を取り込ませる酵素補充療法と化学シャペロン療法の併用療法の治療効果を予測・判断する際の評価方法としての技術を提供する。 The present invention also relates to a chemical chaperone therapy using the above-mentioned chemical chaperone compound to treat a hereditary metabolic disease by normalizing the formation and maintenance of normal higher-order structure and processing of the mutant enzyme protein associated with the inherited metabolic disease. Further, the present invention provides a technique as an evaluation method for predicting and judging the therapeutic effect of a combination therapy of enzyme replacement therapy and chemical chaperone therapy that replenishes an enzyme deficient in a patient from outside the body and incorporates the enzyme into cells.
さらに、本発明は、プロテアーゼにより、遺伝性代謝病の病因酵素タンパク質の構造異常を検出することからなる酵素タンパク質構造の検出方法を提供する。 Furthermore, the present invention provides a method for detecting an enzyme protein structure comprising detecting a structural abnormality of a pathogenic enzyme protein of a hereditary metabolic disease using a protease.
さらにまた、本発明は、その一つの具体的な態様として、プロテアーゼにより、遺伝性代謝病の病因酵素タンパク質の正常高次構造を検出することからなる酵素タンパク質構造の検出方法を提供する。 Furthermore, the present invention provides, as one specific embodiment thereof, a method for detecting an enzyme protein structure comprising detecting a normal higher-order structure of a disease-causing enzyme protein of a hereditary metabolic disease using a protease.
さらにまた、本発明は、その一つの具体的な態様として、プロテアーゼとしてキモトリプシンを用いた酵素タンパク質の高次構造の検出方法を提供する。通常、生体内のタンパク質は、疎水性アミノ酸残基をタンパク質内部に内包し、タンパク質表面は親水性アミノ酸残基で覆われている。タンパク質がひとたび構造異常を起こすと、内包された疎水性アミノ酸残基がタンパク質表面に露出する。それにより、正常高次構造を失ったタンパク質同士がファンデアヴァールス力や疎水性相互作用により凝集塊を形成し、分解処理の経路へと導かれる。キモトリプシンは、ブタなどの膵臓から精製されるセリンプロテアーゼの一種で、疎水性アミノ酸を認識してタンパク質を分解する機能を持っている。本発明では、キモトリプシンのこの性質を利用し、構造異常を起こし疎水性アミノ酸残基をその表面に露出したタンパク質を分解させることを基本原理としている。 Furthermore, the present invention provides, as one specific embodiment thereof, a method for detecting a higher-order structure of an enzyme protein using chymotrypsin as a protease. In general, in vivo proteins, hydrophobic amino acid residues are encapsulated inside the protein, and the protein surface is covered with hydrophilic amino acid residues. Once the protein has a structural abnormality, the encapsulated hydrophobic amino acid residues are exposed on the protein surface. As a result, proteins that have lost their normal higher-order structure form aggregates by van der Waals force or hydrophobic interaction, and are led to the path of degradation. Chymotrypsin is a kind of serine protease purified from pancreas such as pigs, and has a function of recognizing hydrophobic amino acids and degrading proteins. The basic principle of the present invention is to use this property of chymotrypsin to decompose a protein that has a structural abnormality and exposes hydrophobic amino acid residues on its surface.
なお、膵臓には親水性アミノ酸を認識してタンパク質を加水分解するトリプシンも存在する。ブタなどからキモトリプシンを精製する際には、極微量であるがトリプシンの混入を回避することができない。そこで、本発明の具体例として使用したキモトリプシンは、Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone(TLKC)で化学修飾された酵素標品を用いた。TLKCはトリプシンの活性中心を構成するアミノ酸残基である46番ヒスチジン残基と195番セリン残基に化学結合することで、トリプシン活性だけを不可逆的に完全に阻害することができる。したがって、本発明で使用したキモトリプシンのTLKC処理は、酵素タンパク質の正常高次構造形成の有無を識別する際に極めて重要である。 The pancreas also contains trypsin that recognizes hydrophilic amino acids and hydrolyzes proteins. When purifying chymotrypsin from pigs or the like, contamination with trypsin cannot be avoided even though the amount is extremely small. Therefore, the chymotrypsin used as a specific example of the present invention was an enzyme preparation chemically modified with Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLKC). TLKC can irreversibly and completely inhibit only the trypsin activity by chemically binding to the 46th histidine residue and the 195th serine residue, which are amino acid residues constituting the active center of trypsin. Therefore, the TLKC treatment of chymotrypsin used in the present invention is extremely important in identifying the presence or absence of normal higher-order structure formation of the enzyme protein.
本発明に係る変異酵素タンパク質の高次構造の正常化方法は、中枢神経症状に対して応用できること、免疫反応による副作用を削除できること、また治療費用を大幅に軽減できることなど、酵素補充療法による単独の療法に比べて有用である。 The method for normalizing the higher-order structure of the mutant enzyme protein according to the present invention can be applied to central nervous symptoms, can eliminate side effects due to immune reactions, and can significantly reduce the treatment cost, and can be used alone. Useful compared to therapy.
また本発明に係る酵素タンパク質構造の検出方法は、遺伝性代謝病の病因酵素タンパク質の変異高次構造を検出することにより、遺伝性代謝病の早期診断や病型分類を可能にすると共に、その病因酵素タンパク質の正常高次構造を検出することにより遺伝性代謝病の予後を診断することも可能となり、遺伝性代謝病の診断ならびに治療に極めて有用である。 In addition, the method for detecting an enzyme protein structure according to the present invention enables early diagnosis and disease type classification of an inherited metabolic disease by detecting a mutant higher-order structure of the pathogenic enzyme protein of the inherited metabolic disease. By detecting the normal higher-order structure of the pathogenic enzyme protein, it becomes possible to diagnose the prognosis of the inherited metabolic disease, which is extremely useful for diagnosis and treatment of the inherited metabolic disease.
本発明の最も重要な特徴は、細胞内に存在する酵素タンパク質を特殊な精製法で精製することなく、その細胞破砕試料(ホモジネート)を用いて直接解析できる点である。細胞ホモジネートの中には種々雑多のあらゆるタンパク質が存在するが、プロテアーゼ(キモトリプシンが最も適する)による酵素反応とウエスタンブロットとを組み合わせることで、その細胞ホモジネートの中で目的とする酵素タンパク質のみを標的として、その高次構造の異常を検出できる点である。 The most important feature of the present invention is that the enzyme protein present in the cell can be directly analyzed using the cell disruption sample (homogenate) without purification by a special purification method. There are various kinds of proteins in cell homogenates, but by combining an enzyme reaction with protease (chimotrypsin is most suitable) and Western blotting, only the target enzyme protein in the cell homogenate is targeted. The abnormality of the higher order structure can be detected.
さらにまた本発明に係る遺伝性代謝病の併用療法は、上記化学シャペロン療法による効果に加えて、酵素補充療法による効果が相乗的に加わることにより遺伝性代謝病の治療をさらに改善かつ促進できるという大きな利点を有する。 Furthermore, the combination therapy of inherited metabolic diseases according to the present invention can further improve and promote the treatment of inherited metabolic diseases by synergistically adding the effects of enzyme replacement therapy in addition to the effects of the chemical chaperone therapy. Has great advantages.
遺伝性代謝病は、上述したように、細胞内の酵素タンパク質の高次構造が変異によって不安定になり、酵素自体が正常な機能を発揮することができず、本来ならば分解されるべき生体内基質や合成されるべきでない物質などが細胞内に蓄積されて細胞機能が障害されることにより発症する疾患である。 As described above, genetic metabolic diseases are caused by mutations in the high-order structure of enzyme proteins in cells, and the enzymes themselves cannot perform their normal functions. It is a disease that develops when cellular functions are impaired due to accumulation of substances in the body and substances that should not be synthesized.
本発明に係る遺伝性代謝病の化学シャペロン化合物による変異酵素タンパク質の正常高次構造への誘導の評価方法は、その一具体例としてリソソーム病の一つであるポンペ病(酸性α-グルコシダーゼ欠損症:II型糖原病)に対するデオキシノジリマイシンならびにその誘導体などの化学シャペロン化合物を使用して当該疾患細胞内の変異酵素タンパク質を正常高次構造に導きプロセシングを促進させた後、その高次構造の形成・維持効果をプロテアーゼ(一例としてキモトリプシン)により評価するものである。 The method for evaluating the induction of a mutant enzyme protein to a normal higher-order structure by a chemical chaperone compound in a genetic metabolic disease according to the present invention includes Pompe disease (acid α-glucosidase deficiency) which is one of lysosomal diseases as one specific example. : Deoxynojirimycin for type II glycogenosis) and chemical chaperone compounds such as its derivatives to induce the mutant enzyme protein in the disease cell to a normal higher-order structure and promote processing. The formation / maintenance effect is evaluated by protease (for example, chymotrypsin).
本発明の対象となる遺伝性代謝病としては、変異酵素タンパク質の高次構造の不安定化に起因する疾患であれば特に限定されるものではない。これら遺伝性代謝病のうち、リソソーム内酵素の遺伝的欠損症であるリソソーム病について簡単に説明をする。上述したように、具体的なリソソーム病としては、例えば、GM1−ガングリオシドーシス、GM2−ガングリオシドーシス、ファブリー病、ゴーシェ病、ポンペ病、ムコ多糖症などが挙げられる。 The hereditary metabolic disease that is the subject of the present invention is not particularly limited as long as it is a disease caused by destabilization of the higher-order structure of the mutant enzyme protein. Of these inherited metabolic diseases, lysosomal disease, which is a genetic deficiency of lysosomal enzymes, will be briefly described. As described above, specific lysosomal diseases include, for example, GM1-gangliosidosis, GM2-gangliosidosis, Fabry disease, Gaucher disease, Pompe disease, mucopolysaccharidosis and the like.
GM1−ガングリオシドーシスは、酵素β−ガラクトシダーゼが欠損することによりリソソーム内にGM1−ガングリオシドが生体基質として蓄積して発症する疾患である。また、GM2−ガングリオシドーシスとしては、例えば、酵素β−ヘキソサミニダーゼAが欠損することによりGM2−ガングリオシドが生体基質として蓄積して発症するテイ・サックス病、酵素β−ヘキソサミニダーゼA、Bが欠損することによりGM2−ガングリオシドなどが生体基質として蓄積して発症するサンドホフ病などがある。 GM1-gangliosidosis is a disease that develops due to accumulation of GM1-ganglioside as a biological substrate in the lysosome due to the deficiency of the enzyme β-galactosidase. Examples of GM2-gangliosidosis include Tay-Sachs disease, in which GM2-ganglioside accumulates as a biological substrate due to the lack of enzyme β-hexosaminidase A, and enzyme β-hexosaminidase A. And Sandoff's disease, in which GM2-ganglioside and the like accumulate as a biological substrate due to deficiency of B.
ファブリー病は、細胞内リソソ−ム酵素の1つであるα−ガラクトシダーゼの活性が欠損もしくは低下して生じるスフィンゴ糖脂質代謝異常病であって、リソソーム内にグロボトリアオシルセラミドが生体基質として蓄積して発症する。 Fabry disease is a glycosphingolipid metabolism disorder caused by deficiency or decrease in the activity of α-galactosidase, which is one of intracellular lysosomal enzymes, and globotriaosylceramide accumulates as a biological substrate in lysosomes. Then it develops.
ゴーシェ病は、グルコセレブロシダーゼ酵素が欠損または活性低下により糖脂質のグルコセレブロシドがセラミドに分解できずリソソーム内に蓄積される先天性代謝異常症である。 Gaucher's disease is a congenital metabolic disorder in which the glycolipid glucocerebroside cannot be decomposed into ceramide due to a deficiency or decreased activity of the glucocerebrosidase enzyme and accumulates in lysosomes.
ポンペ病は、細胞のリソソーム内で機能する酸性α-グルコシダーゼ酵素の完全欠損あるいは著しい活性低下により多糖類のグリコーゲンが分解されず、心筋、骨格金を中心に全身のさまざまな臓器・器官に蓄積して、多様な症状を引き起こすII型糖原病としても知られる疾患である。 In Pompe disease, polysaccharide glycogen is not decomposed due to complete deficiency of acid α-glucosidase enzyme functioning in lysosomes of cells or significant decrease in activity, and it accumulates in various organs and organs throughout the body, mainly in heart muscle and skeletal gold. It is also known as type II glycogenosis causing various symptoms.
また、ムコ多糖症は、遺伝的要因による先天性代謝異常症であるリソソーム病の一種であり、リソソーム内の加水分解酵素の先天的欠損あるいは以上によりムコ多糖類の一種であるグリコサミノグリカンが蓄積する疾患である。 In addition, mucopolysaccharidosis is a type of lysosomal disease that is an inborn error of metabolism due to genetic factors, and glycosaminoglycan, a type of mucopolysaccharide, due to a congenital deficiency of hydrolase in the lysosome or above. It is a disease that accumulates.
ムコ多糖症は、原因遺伝子の類型によりムコ多糖症I型とムコ多糖症II型に分類される。ムコ多糖症I型は、細胞のリソソーム内の酵素α−L−イズロニダーゼの作用不全または作用低下によりグリコサミノグリカンが分解されず、全身のさまざまな臓器・器官の細胞にムコ多糖が蓄積して、多様な症状を引き起こす疾患である。またムコ多糖症II型は、細胞のリソソーム内の酵素イズロン酸−2−スルファターゼの作用欠損または作用低下によりグリコサミノグリカンが分解されず全身の臓器・器官の細胞に蓄積されて多様な症状を引き起こす疾患である。 Mucopolysaccharidosis is classified into mucopolysaccharidosis type I and mucopolysaccharidosis type II according to the type of causative gene. In mucopolysaccharidosis type I, glycosaminoglycan is not degraded due to the insufficiency or decrease in the activity of the enzyme α-L-iduronidase in the lysosomes of cells, and mucopolysaccharide accumulates in cells of various organs and organs throughout the body. It is a disease that causes various symptoms. In addition, mucopolysaccharidosis type II has various symptoms caused by glycosaminoglycan that is not decomposed and accumulated in cells of organs and organs throughout the body due to deficiency or decreased action of the enzyme iduronic acid-2-sulfatase in the lysosomes of cells. It is a disease that causes it.
本発明に係る遺伝性代謝病の変異酵素タンパク質の高次構造を正常化する方法に使用できる化学シャペロン化合物は、それぞれの遺伝性代謝病で原因となる固有の酵素タンパク質の特定のドメインに親和性が高く、可逆的かつ競合的阻害作用を有するような基質類似体(アナログ)であるのがよい。 The chemical chaperone compound that can be used in the method for normalizing the higher order structure of the mutant enzyme protein of the inherited metabolic disease according to the present invention has an affinity for a specific domain of the unique enzyme protein that causes each inherited metabolic disease. It is preferable to be a substrate analog (analog) having a high reversible and competitive inhibitory action.
かかる化学シャペロン化合物としては、例えば、デオキシノジリマイシン(DNJ)ならびにその誘導体などが挙げられる。デオキシノジリマイシンの誘導体としては、例えば、低級C1-C6アルキルもしくは高級オキシC7-C12アルキル誘導体などが挙げられる。具体的には、N−低級C1-C6アルキル基が、例えば、N−メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基もしくはヘキシル基であるN−低級C1-C6アルキルデオキシノジリマイシンであり、またN−オキソ高級C7-C12アルキル基がN−7−オキソデシル基もしくはN−8−オキシドデシル基であるN−(オキソ高級C7-C12アルキル)デオキシノジリマイシンなどが挙げられる。 Examples of such chemical chaperone compounds include deoxynojirimycin (DNJ) and derivatives thereof. Deoxynojirimycin derivatives include, for example, lower C1-C6 alkyl or higher oxy C7-C12 alkyl derivatives. Specifically, the N-lower C1-C6 alkyl group is, for example, an N-lower C1-C6 alkyldeoxynojirimycin wherein the N-methyl group, ethyl group, propyl group, butyl group, pentyl group or hexyl group is used. And N- (oxo-higher C7-C12 alkyl) deoxynojirimycin, wherein the N-oxo higher C7-C12 alkyl group is N-7-oxodecyl group or N-8-oxidedecyl group.
上述したように、遺伝性代謝病においては、その病因変異酵素タンパク質の高次構造が変異により不安定になりその酵素タンパク質が正常の機能を発揮することが出来なくて、組織や器官の細胞内に、本来であればその酵素により分解されるべき物質が分解されずに蓄積され、または本来ならば合成されるべき物質が合成されずに欠損するなどにより、重篤な細胞障害が惹起され様々な臨床症状を発症する。 As described above, in hereditary metabolic diseases, the higher-order structure of the pathogenic mutant enzyme protein becomes unstable due to the mutation, and the enzyme protein cannot perform its normal function. In addition, substances that should be decomposed by the enzyme are accumulated without being decomposed, or substances that are originally synthesized are lost without being synthesized. Develops clinical symptoms.
例えば、遺伝性代謝病の一種であるポンペ病においては、リソソーム細胞中の酵素タンパク質である酸性α−グルコシダーゼ(AαGlu)が遺伝子変異により、正常な触媒機能を持った酵素タンパク質を合成することができないために、細胞中の生体基質であるグリコーゲンを分解できずに過剰蓄積されることによって全身に様々な症状を呈する。 For example, in Pompe disease, a type of inherited metabolic disease, acid α-glucosidase (AαGlu), an enzyme protein in lysosomal cells, cannot synthesize enzyme proteins with normal catalytic functions due to genetic mutations. For this reason, glycogen, which is a biological substrate in cells, cannot be decomposed and excessively accumulated, thereby causing various symptoms throughout the body.
AαGluはDNAより翻訳されたペプチドが細胞内器官で糖鎖等の修飾を受け、AαGlu前駆体、AαGlu中間体、AαGlu成熟体とプロセシングされ、最終的にAαGlu成熟体はリソソームへと輸送され、グリコーゲンの加水分解を行う。 AαGlu is a peptide translated from DNA that undergoes sugar chain modification in intracellular organs, and is processed with AαGlu precursor, AαGlu intermediate, and AαGlu mature, and finally AαGlu mature is transported to lysosomes and glycogen. Hydrolysis.
リソソーム細胞内では、AαGlu前駆体及びAαGlu中間体の状態ではグリコーゲンの分解活性は認められず、グリコーゲンを分解するためのAαGlu活性が認められるのはAαGlu成熟体のみである。 In lysosomal cells, glycogen degradation activity is not observed in the state of AαGlu precursor and AαGlu intermediate, and only AαGlu matured body has AαGlu activity for degrading glycogen.
つまり、ポンペ病患者由来の細胞内においては、AαGlu酵素タンパク質が全く作られない、作られても正常の高次構造を有していない、あるいは酵素前駆体の状態で存在している場合が考えられる。それにより、グリコーゲンが分解されずに細胞内リソソームに過剰蓄積されている。 In other words, in cells derived from patients with Pompe disease, AαGlu enzyme protein may not be produced at all, may not have normal higher order structure, or may exist in the state of an enzyme precursor. It is done. As a result, glycogen is excessively accumulated in intracellular lysosomes without being degraded.
なお、本明細書において、「AαGlu」とは、酸性α-グルコシダーゼを意味する。「AαGlu前駆体」とは、DNAより翻訳されたペプチドが粗面小胞体で糖鎖等の修飾を受けた状態で存在するものあり、110kDaの酵素前駆体を意味する。「AαGlu中間体」とはAαGlu前駆体が粗面小胞体からゴルジ体に輸送される過程で限定分解された95kDaの酵素中間体を意味する。「AαGlu成熟体」とは、AαGlu中間体がリソソームまで輸送される過程でさらにプロセシングをうけ、76kDaあるいは70kDaのグリコーゲン分解能を有する活性型AαGlu酵素を意味する。 In the present specification, “AαGlu” means acid α-glucosidase. “AαGlu precursor” refers to a 110 kDa enzyme precursor in which a peptide translated from DNA exists in a rough endoplasmic reticulum with a sugar chain or the like modified. “AαGlu intermediate” means a 95 kDa enzyme intermediate that is limitedly decomposed during the process of transporting the AαGlu precursor from the rough endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus. The “AαGlu matured body” means an active AαGlu enzyme that is further processed during the process of transporting the AαGlu intermediate to the lysosome and has a glycogen resolution of 76 kDa or 70 kDa.
本発明においては、ポンペ病患者由来の培養線維芽細胞を実験モデルとして、化学シャペロン候補化合物であるデオキシノジリマイシン(DNJ)を細胞培養液に添加し、患者細胞内のAαGlu活性ならびに同じリソソーム酵素の一つであるβ-ヘキソサミニダーゼ(β-Hex)活性を測定した。その結果、2種類の患者細胞(Y455F/Y455FおよびP545L/P545L)において、AαGluの活性上昇が認められた。同時に測定したリソソーム酵素の一つであるβ-Hex活性では変化が認められなかったことから、DNJの効果はAαGluに特異的なものであることが明らかとなった(図1)。 In the present invention, a cultured fibroblast derived from a patient with Pompe disease is used as an experimental model, deoxynojirimycin (DNJ), which is a chemical chaperone candidate compound, is added to the cell culture medium, and AαGlu activity in the patient cell as well as the same lysosomal enzyme One β-hexosaminidase (β-Hex) activity was measured. As a result, increased activity of AαGlu was observed in two types of patient cells (Y455F / Y455F and P545L / P545L). Since no change was observed in β-Hex activity, which is one of the lysosomal enzymes measured simultaneously, it was revealed that the effect of DNJ is specific to AαGlu (FIG. 1).
次に、デオキシノジリマイシン(DNJ)を含む5種類の化学シャペロン化合物の内、どの化合物が化学シャペロンとして細胞内AαGlu活性を最も上昇させる機能があるか検証するため、5種類の化学シャペロン候補化合物をそれぞれ添加した培養液で患者由来の培養線維芽細胞を培養後、細胞内のAαGlu活性を測定した。その結果、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)が最も高い活性上昇効果を示した(図2)。この結果より、ポンペ病に対する化学シャペロンの効果に関する実験にはNB-DNJを使用することとした。 Next, in order to verify which of the five chemical chaperone compounds including deoxynojirimycin (DNJ) has the function to increase the intracellular AαGlu activity most as a chemical chaperone, five chemical chaperone candidate compounds were selected. After culturing patient-derived cultured fibroblasts with each of the added culture solutions, intracellular AαGlu activity was measured. As a result, N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) showed the highest activity increasing effect (FIG. 2). Based on these results, we decided to use NB-DNJ for experiments on the effects of chemical chaperones on Pompe disease.
そこで、本発明者らは、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)を化学シャペロン化合物として用いて細胞内でのAαGlu酵素タンパク質のプロセシングについて解析した。正常ならびにポンペ病患者由来の培養線維芽細胞の培養液に異なる濃度のNB-DNJを添加し、4日間培養後、細胞試料をウエスタンブロットにより解析し、酵素前駆体(110kDa)、酵素中間体(95kDa)、酵素成熟体(76kDA)の存在を観察した(図3)。その結果、NB-DNJは正常酵素のプロセシングには影響を与えないが、患者細胞中の変異酵素に対してはNBDNJ濃度依存的にプロセシングを促進し、グリコーゲン分解活性を有するAαGlu成熟体量は顕著に増加した。 Therefore, the present inventors analyzed the processing of AαGlu enzyme protein in cells using N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) as a chemical chaperone compound. Different concentrations of NB-DNJ were added to the culture broth of cultured fibroblasts derived from normal and Pompe disease patients. After culturing for 4 days, the cell samples were analyzed by Western blot, and the enzyme precursor (110 kDa), enzyme intermediate ( 95 kDa) and the presence of mature enzyme (76 kDA) was observed (FIG. 3). As a result, NB-DNJ does not affect the processing of normal enzymes, but it promotes processing in a NBDNJ concentration-dependent manner for mutant enzymes in patient cells, and the amount of mature AαGlu with glycogenolytic activity is significant. Increased to.
細胞内での分解処理系から免れプロセシングが促進したAαGluが本体の局在部位であるリソソームへ輸送されているか否か検討した(図4)。図4は免疫二重染色によりAαGluタンパク質が細胞のどの部位に位置しているか調べたものである。左図のシグナルがAαGluの局在位置を示し、中央図のシグナルがリソソームの位置を示す。正常酵素では、図4Dと図4Eのシグナルが完全に重なったシグナル(図4F)として観察されたことから、正常酵素は間違いなくリソソームに到達していることが分かった。一方、化学シャペロンとしてNB-DNJを培養液に入れていない変異酵素では、図4Gと図4Hのシグナルは同一な場所に局在していないことから、変異型AαGluはリソソームに到達していないことが分かった。しかし、化学シャペロンであるNB-DNJを添加した場合には、変異型AαGluのシグナル(図4J)とリソソームのシグナル(図4L)が完全に一致して黄色のシグナルとなっていることから、変異型AαGluはリソソームに到達していることが証明された。 It was examined whether AαGlu, which was freed from the intracellular degradation processing system and promoted processing, was transported to the lysosome, which is the localization site of the main body (FIG. 4). FIG. 4 shows the location of AαGlu protein located in the cell by immunodouble staining. The signal on the left shows the location of AαGlu, and the signal on the center shows the location of lysosomes. In the normal enzyme, the signals of FIG. 4D and FIG. 4E were observed as a completely overlapped signal (FIG. 4F), and thus it was found that the normal enzyme definitely reached the lysosome. On the other hand, the mutant AαGlu does not reach the lysosome because the signals of FIG. 4G and FIG. 4H are not located at the same place in the mutant enzyme that does not contain NB-DNJ as a chemical chaperone. I understood. However, when the chemical chaperone NB-DNJ was added, the mutant AαGlu signal (FIG. 4J) and the lysosomal signal (FIG. 4L) were completely matched to give a yellow signal. Type AαGlu has been demonstrated to reach the lysosome.
この化学シャペロン化合物としてのNB-DNJがどの程度の種類のアミノ酸置換型AαGlu酵素タンパク質に効果を発揮するかを検証するため、ポンペ病で同定された37種類のアミノ酸置換型AαGluを発現させ、NB-DNJによる活性上昇効果を観察した。その結果、37例中13のみ(約35%)の変異酵素の活性が上昇を示した(図5)。このことから、ポンペ病においては化学シャペロン療法が適応できる患者は限定されることが分かった。 In order to verify how many kinds of amino acid-substituted AαGlu enzyme proteins NB-DNJ as this chemical chaperone compound exerts, 37 types of amino acid-substituted AαGlu identified in Pompe disease were expressed, and NB -The activity increase effect by DNJ was observed. As a result, only 13 (about 35%) of the 37 cases showed increased activity of the mutant enzyme (FIG. 5). This indicates that patients with Pompe disease are limited to patients who can be treated with chemical chaperone therapy.
酵素補充療法は現行の治療法としては最も治療効果が高いとして注目され、実際に臨床応用されている。しかし、本治療法は、酵素製剤自体が極めて高額であることや抗体産生による副作用の問題も残されている。一方、化学シャペロン療法は酵素補充療法に代わる治療戦略として期待されているが、本発明者らが示したごとくポンペ病などでは適応可能な患者は限られるなどの問題がある。そこで、互いの問題点を補完することで、より良好な治療効果を得るために酵素補充と化学シャペロンの併用療法の可能性に関して更なる検討を行った。 Enzyme replacement therapy has been attracting attention as the most current therapeutic method and has been clinically applied. However, this treatment method still has the problem that the enzyme preparation itself is very expensive and side effects due to antibody production. On the other hand, although the chemical chaperone therapy is expected as a treatment strategy that replaces the enzyme replacement therapy, there are problems such as the limited number of patients that can be applied in Pompe disease and the like as shown by the present inventors. Therefore, in order to obtain a better therapeutic effect by complementing each other's problems, further studies were conducted regarding the possibility of combined therapy with enzyme supplementation and chemical chaperone.
ポンペ病患者由来の培養線維芽細胞5種類を対象として、組換え酵素製剤(rAαGlu)ならびに化学シャペロン化合物としてNB-DNJを同時あるいは別々に細胞培養液に添加して4日間培養後、細胞内のAαGlu活性を測定した(図6)。その結果、全ての細胞でrAαGluとNB-DNJを同時に添加した場合に、細胞内のAαGlu活性は最も高い値を示した。特に、興味深いのは、NB-DNJに反応し細胞内酵素活性が上昇するP545L/P545L細胞においては、rAαGlu単独の活性とNB-DNJ単独の活性の総和よりも、両者を同時添加した際の活性の方が顕著に高い活性を示したことである。すなわち、rAαGluとNB-DNJは相乗的に働き細胞内AαGlu活性を上昇させることが明らかとなった。 In 5 types of cultured fibroblasts derived from patients with Pompe disease, recombinant enzyme preparation (rAαGlu) and NB-DNJ as a chemical chaperone compound were added simultaneously or separately to the cell culture medium and cultured for 4 days. AαGlu activity was measured (FIG. 6). As a result, when rAαGlu and NB-DNJ were added simultaneously in all cells, the intracellular AαGlu activity showed the highest value. In particular, in P545L / P545L cells where intracellular enzyme activity increases in response to NB-DNJ, the activity when both are added simultaneously rather than the sum of the activities of rAαGlu alone and NB-DNJ alone. No. 2 showed significantly higher activity. That is, it became clear that rAαGlu and NB-DNJ act synergistically to increase intracellular AαGlu activity.
この酵素補充と化学シャペロン化合物の併用療法の分子メカニズムを解明するため、内因性のAαGluを全く有しないポンペ病患者細胞に対する組換え酵素製剤(rAαGlu)とN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)の効果をウエスタンブロットにより解析し、AαGluの酵素前駆体、酵素中間体ならびに酵素成熟体の量的変化を調べた(図7)。その結果、一定量のrAαGluを培養液に添加したにも関わらす、NB-DNJが存在しない場合にはAαGlu成熟体は少量認められるだけであったが、NB-DNJ濃度依存的に酵素成熟体へのプロセシングが促進し、AαGlu成熟体量は顕著に増加した。 Recombinant enzyme preparation (rAαGlu) and N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) for patients with Pompe disease without any endogenous AαGlu to elucidate the molecular mechanism of this combination of enzyme replacement and chemical chaperone compounds Was analyzed by Western blotting, and quantitative changes in the AαGlu enzyme precursor, enzyme intermediate and enzyme mature were examined (FIG. 7). As a result, although a certain amount of rAαGlu was added to the culture medium, in the absence of NB-DNJ, only a small amount of mature AαGlu was observed, but the matured enzyme was dependent on the concentration of NB-DNJ. The amount of mature AαGlu increased significantly.
化学シャペロンであるNB-DNJに反応しAαGlu活性が上昇するP545L/P545L細胞と内在性のAαGluを全く有さないC103X/C103X細胞を用いて、組換え酵素製剤(rAαGlu)とN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)の併用による酵素製剤のプロセシング効果を調べた(図8)。その結果、P545L/P545L細胞に対してはNB-DNJだけでもプロセシングが促進し、酵素成熟体は増加したが、rAαGluとNB-DNJを併用した方が遥かに酵素成熟体量の増加は顕著であった。 Recombinant enzyme preparation (rAαGlu) and N-butyldeoxynosyliri using P545L / P545L cells that have increased AαGlu activity in response to the chemical chaperone NB-DNJ and C103X / C103X cells that have no endogenous AαGlu. The processing effect of the enzyme preparation by the combined use of mycin (NB-DNJ) was examined (FIG. 8). As a result, the processing of P545L / P545L cells was promoted by NB-DNJ alone, and the number of mature enzyme was increased. However, when rAαGlu and NB-DNJ were used in combination, the amount of mature enzyme was significantly increased. there were.
ポンペ病に対する化学シャペロン化合物であるN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)は、内在性の変異酵素のみならず外部から細胞内に取り込まれた組換え酵素製剤(rAαGlu)に対しても酵素タンパク質のプロセシングを促進させた。このことから、外部から細胞内に取り込まれたrAαGluは凝集塊などのような異常構造塊を形成しており、それにより正常なプロセシングを受けることができないのではないかと考え、細胞内に取り込まれたrAαGlu酵素タンパク質の凝集塊の形成とそれに対するNB-DNJの効果を解析した(図9)。その結果、当初予想したごとく、細胞内取り込まれたrAαGlu酵素タンパク質は凝集塊を形成していた。NB-DNJは濃度依存的にその凝集塊形成を抑制した。 N-Butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ), a chemical chaperone compound for Pompe disease, is an enzyme protein not only for endogenous mutant enzymes but also for recombinant enzyme preparations (rAαGlu) incorporated into cells from outside. Promoted the processing of This suggests that rAαGlu taken into the cell from the outside forms an abnormally structured mass such as an agglomerate, and thus cannot be normally processed. The formation of aggregates of rAαGlu enzyme protein and the effect of NB-DNJ on it were analyzed (FIG. 9). As a result, as initially expected, the rAαGlu enzyme protein incorporated into the cells formed an aggregate. NB-DNJ suppressed the aggregate formation in a concentration-dependent manner.
細胞内においては、タンパク質が凝集塊を形成する際にはジスルフィド(S-S)結合が形成され、より強固な高分子凝集塊になることが知られている。そこで、この凝集塊形成へのS-S結合の関与と、S-S結合による高分子凝集塊に対するN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)の効果を解析した(図10)。その結果、細胞内に取り込まれたrAαGlu酵素タンパク質はS-S結合による強固な高分子凝集塊を形成していることが明らかとなった。また、このS-S結合による高分子凝集塊の形成は、NB−DNJ濃度依存的に抑制された。 In cells, it is known that when proteins form aggregates, disulfide (S-S) bonds are formed, resulting in stronger polymer aggregates. Therefore, the involvement of S—S bonds in this aggregate formation and the effect of N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) on polymer aggregates due to S—S bonds were analyzed (FIG. 10). As a result, it was clarified that the rAαGlu enzyme protein incorporated into the cells formed a strong polymer aggregate due to the S—S bond. Moreover, the formation of polymer aggregates due to this S—S bond was suppressed depending on the NB-DNJ concentration.
前述のごとく、一般に細胞内でタンパク質が凝集塊を形成する場合には、その前駆段階としてそのタンパク質の正常高次構造の破綻が引き金となっていることが知られている。そこで、本発明者らは、細胞内のAαGlu酵素タンパク質の高次構造の異常を検出する方法の確立を試みた。細胞内のタンパク質、特にリソソーム内のような親水性環境の中ではタンパク質はその疎水性アミノ酸残基を内包し、タンパク質表面は親水性アミノ酸残基で覆われ、お互いに凝集することなく、その環境の中で拡散している。ところが、何らかの原因でその高次構造が崩れると内部の疎水性アミノ酸残基が蛋白表面に露出し、凝集塊を形成することとなる。本発明者らは、この高次構造が崩れた際にタンパク質表面に暴露される疎水性アミノ酸に着目し、その疎水性アミノ酸を特異的に認識しタンパク質加水分解するキモトリプシンの機能を利用することで正常高次構造と構造異常のタンパク質を識別できるのではないかと考えた。 As described above, it is generally known that when a protein forms an aggregate in a cell, the normal higher-order structure of the protein is triggered as a precursor stage. Therefore, the present inventors tried to establish a method for detecting abnormalities in the higher-order structure of the intracellular AαGlu enzyme protein. In a hydrophilic environment such as intracellular proteins, especially in lysosomes, proteins contain their hydrophobic amino acid residues, and the protein surface is covered with hydrophilic amino acid residues, and the environment does not aggregate with each other. Spreading in. However, if the higher order structure collapses for some reason, the internal hydrophobic amino acid residues are exposed on the protein surface, and aggregates are formed. The present inventors paid attention to a hydrophobic amino acid exposed to the protein surface when this higher-order structure collapses, and by utilizing the function of chymotrypsin that specifically recognizes the hydrophobic amino acid and hydrolyzes it. We thought that normal higher-order structure and structural abnormality protein could be distinguished.
キモトリプシンはブタなどの膵臓から精製されて市販されているが、その中には極微量であるが親水性アミノ酸残基を認識するトリプシンも不純物として含まれている。そこで、本発明に使用するキモトリプシンは、Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone(TLKC)で化学修飾された酵素標品を用いた。TLKCはトリプシンの活性中心を化学結合することで、トリプシン活性だけを不可逆的に完全に阻害することができる。したがって、本発明で使用したキモトリプシンのTLKC処理は、酵素タンパク質の正常高次構造形成の有無を識別する際に極めて重要である。 Chymotrypsin is purified from the pancreas such as pigs and is commercially available, but it contains trace amounts of trypsin that recognizes hydrophilic amino acid residues as impurities. Therefore, an enzyme preparation chemically modified with Tosyl-L-lysine chloromethyl ketone (TLKC) was used as the chymotrypsin used in the present invention. TLKC can irreversibly completely inhibit only trypsin activity by chemically binding the active center of trypsin. Therefore, the TLKC treatment of chymotrypsin used in the present invention is extremely important in identifying the presence or absence of normal higher-order structure formation of the enzyme protein.
酵素タンパク質の正常高次構造を検出する方法を開発するため、正常高次構造を有するAαGluと正常高次構造を失ったAαGluを作製し、両酵素タンパク質に対するTLKC処理されたキモトリプシンの反応性を調べた(図11)。両酵素タンパク質に内在性のAαGluを全く持たないC103X/C103X細胞の細胞抽出液をタンパク質濃度が0.5mg/mlとなるように添加後、キモトリプシンと反応させ、その反応産物をウエスタンブロットにより解析した。その結果、正常高次構造を有するAαGlu(Active AαGlu)ではキモトリプシン活性0〜200mu/mlまで全く分解されることなく明瞭なバンドとして認められた。一方、正常高次構造を失ったAαGlu(Inactive AαGlu)では、キモトリプシン活性80mu/mlで完全にAαGluタンパク質は分解されており、その分解断片が認められた。そこで、本発明では、分解断片の残存量などを考慮し、キモトリプシン活性160mu/mlを至適活性と決定し、キモトリプシンアッセイによってAαGlu酵素タンパク質の高次構造の異常を検出した。 In order to develop a method to detect the normal conformation of enzyme proteins, AαGlu with normal conformation and AαGlu with loss of normal conformation were prepared, and the reactivity of TLKC-treated chymotrypsin against both enzyme proteins was investigated. (FIG. 11). A cell extract of C103X / C103X cells having no endogenous AαGlu in both enzyme proteins was added to a protein concentration of 0.5 mg / ml, and then reacted with chymotrypsin, and the reaction product was analyzed by Western blot. As a result, AαGlu (Active AαGlu) having a normal higher-order structure was recognized as a clear band without any degradation of chymotrypsin activity from 0 to 200 mu / ml. On the other hand, in AαGlu (Inactive AαGlu) that lost the normal higher-order structure, the AαGlu protein was completely degraded with chymotrypsin activity of 80 mu / ml, and the degraded fragment was observed. Therefore, in the present invention, considering the remaining amount of the degradation fragment and the like, chymotrypsin activity of 160 mu / ml was determined as the optimal activity, and abnormality in the higher-order structure of the AαGlu enzyme protein was detected by chymotrypsin assay.
本発明は、従来のように細胞抽出液から特殊な方法で目的とするタンパク質を精製することなく、目的のタンパク質が含まれる細胞ホモジネートをそのまま用いて、目的タンパク質の高次構造の異常を検出することができる。このことから、本発明を用いることで簡便かつ迅速にタンパク質の構造異常の検出が可能となり、遺伝性代謝病に対する治療効果の判定や予測、また診断や予後判定、遺伝性代謝病の治療薬の提供など、多岐にわたる基礎研究や臨床への応用が可能である。 The present invention detects a higher-order structure abnormality of a target protein using a cell homogenate containing the target protein as it is without purifying the target protein from the cell extract by a special method as in the prior art. be able to. From this, it becomes possible to detect protein structural abnormalities simply and quickly by using the present invention, determination and prediction of therapeutic effects on hereditary metabolic diseases, diagnosis and prognosis, and therapeutic drugs for inherited metabolic diseases. A wide range of basic research and clinical applications are possible.
本発明者らが開発したキモトリプシンアッセイを用いて、ポンペ病患者由来の培養線維芽細胞を対象に、培養液に異なる濃度のN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)を添加し培養後、その細胞試料を用いてキモトリプシンアッセイを行った(図12)。その結果、先行研究で示されたごとく、AαGlu酵素タンパク質のプロセシングはNB-DNJ濃度依存的に促進し、酵素成熟体が顕著に増加した。キモトリプシンを反応させたものでは、酵素前駆体はほとんど消失し、中間体と成熟体のみが存在した。このことから、内在性のAαGlu酵素タンパク質に対するNB-DNJの効果は、酵素の正常高次構造を形成・維持することによりプロセシングを促進させ、中間体や成熟体の高次構造の維持に関与することが初めて明らかとなった。 Using the chymotrypsin assay developed by the present inventors, N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) with different concentrations was added to the culture solution for cultured fibroblasts derived from patients with Pompe disease. A chymotrypsin assay was performed using cell samples (FIG. 12). As a result, as shown in the previous study, the processing of AαGlu enzyme protein was promoted in an NB-DNJ concentration-dependent manner, and the number of mature enzyme forms was significantly increased. In the reaction with chymotrypsin, most of the enzyme precursor disappeared, and only the intermediate and mature substance were present. From this, the effect of NB-DNJ on endogenous AαGlu enzyme protein promotes processing by forming and maintaining the normal higher order structure of the enzyme, and is involved in maintaining the higher order structure of intermediates and mature forms. It became clear for the first time.
さらに本発明者らは、酵素補充と化学シャペロンの併用療法の効果について、キモトリプシンアッセイを用いて解析を行った(図13)。その結果、外部から細胞内に取り込まれたAαGluに対してもNB-DNJによりプロセシングが促進し、増加した成熟体は正常な高次構造を有していることが証明された。特に注目すべきことは、NB-DNJによりプロセシングが促進し、正常高次構造の成熟体はNB-DNJ濃度依存的に10倍以上まで増加することである。このことは、論理的に考えて酵素補充と化学シャペロンを併用すれば、現在使用している組換え酵素製剤の量を10分の1程度に減量できることを意味しており、ひいては薬価の低減、抗体産生の抑制につながるものと期待される。 Furthermore, the present inventors analyzed the effect of combination therapy of enzyme supplementation and chemical chaperone using a chymotrypsin assay (FIG. 13). As a result, it was proved that NB-DNJ promotes the processing of AαGlu taken into cells from the outside, and that the increased matured body has a normal higher-order structure. Of particular note is that processing is promoted by NB-DNJ, and mature bodies of normal higher-order structures are increased up to 10-fold or more depending on the concentration of NB-DNJ. This means that if you use a logical combination of enzyme supplementation and chemical chaperone, you can reduce the amount of the recombinant enzyme preparation currently used to about one-tenth. It is expected to lead to suppression of antibody production.
以上のごとく、本発明において使用できるプロテアーゼは、酵素タンパク質の表面に露出した疎水性アミノ酸残基を標的として加水分解酵素であればいずれでもよいが、特にキモトリプシンが好ましい。なお、本発明においては、キモトリプシンとしては、疎水性アミノ酸のC末端を加水分解するが、僅かではあるが親水性アミノ酸のC末端を加水分解するトリプシン活性を有しているので、このトリプシン活性を完全に抑制したTLCK処理したキモトリプシンを使用することが必要である。 As described above, the protease that can be used in the present invention may be any hydrolase that targets a hydrophobic amino acid residue exposed on the surface of the enzyme protein, but chymotrypsin is particularly preferable. In the present invention, chymotrypsin has a trypsin activity that hydrolyzes the C-terminus of hydrophobic amino acids, but slightly hydrolyzes the C-terminus of hydrophilic amino acids. It is necessary to use completely suppressed TLCK-treated chymotrypsin.
つまり、本発明で使用するプロテアーゼ、例えばキモトリプシンは、AαGluの構造異常を認識して酵素タンパク質を分解する(図11)。一方、AαGluの高次構造が正常ならば、そのプロテアーゼはAαGlu酵素タンパク質表面の疎水性アミノ酸残基を認識することができず、酵素タンパク質を分解することはできない。 That is, the protease used in the present invention, such as chymotrypsin, recognizes the structural abnormality of AαGlu and degrades the enzyme protein (FIG. 11). On the other hand, if the higher order structure of AαGlu is normal, the protease cannot recognize the hydrophobic amino acid residue on the surface of the AαGlu enzyme protein and cannot degrade the enzyme protein.
本発明では、プロテアーゼを使用して、化学シャペロン化合物によりプロセシングが促進された変異AαGluの正常高次構造が形成・維持されていることを確認することができる(図12)。 In the present invention, protease can be used to confirm that the normal higher-order structure of mutant AαGlu whose processing has been promoted by a chemical chaperone compound is formed and maintained (FIG. 12).
さらに、本発明では、プロテアーゼを使用して、化学シャペロン化合物が外部から細胞内に取り込まれたAαGluの折り畳み構造異常を抑制することを確認することができる(図13)。 Furthermore, in the present invention, it is possible to confirm that a chemical chaperone compound suppresses an abnormal folding structure of AαGlu incorporated into cells from the outside using a protease (FIG. 13).
本実施例では、先ず化学シャペロン候補化合物の一つであるデオキシノジリマイシン(DNJ)がポンペ病患者細胞に対して化学シャペロン化合物として機能するか否か確認するための実験を行った(図1)。すなわち、ポンペ病患者由来の培養線維芽細胞(Y455F/Y455F、P545L/P545L、525del/R600C、D645E/R845X、525del/525del)の培養液にDNJを添加し4日間培養後、酸性α-グルコシダーゼ(AαGlu)活性ならびに同じリソソーム酵素であるβ-ヘキソサミニダーゼ(β-Hex)活性を測定した。AαGlu 活性とβ-Hex 活性を同時に測定したのは、NB-DNJの効果がAαGluに特異的なものか否か検証するためである。なお、525del/525delは細胞内に内在性のAαGluを持たない陰性コントロールである。 In this example, first, an experiment was conducted to confirm whether deoxynojirimycin (DNJ), which is one of chemical chaperone candidate compounds, functions as a chemical chaperone compound for Pompe disease patient cells (FIG. 1). . That is, DNJ was added to a culture solution of cultured fibroblasts derived from a patient with Pompe disease (Y455F / Y455F, P545L / P545L, 525del / R600C, D645E / R845X, 525del / 525del), cultured for 4 days, and then treated with acid α-glucosidase ( AαGlu) activity as well as β-hexosaminidase (β-Hex) activity, the same lysosomal enzyme, were measured. The reason why AαGlu activity and β-Hex activity were measured simultaneously is to verify whether the effect of NB-DNJ is specific to AαGlu. 525del / 525del is a negative control that does not have endogenous AαGlu in the cells.
その結果、図1に示すように、DNJを培養液に添加することによりY455F/Y455F細胞とP545L/P545L細胞においてAαGluの活性上昇が認められた。 As a result, as shown in FIG. 1, increased activity of AαGlu was observed in Y455F / Y455F cells and P545L / P545L cells by adding DNJ to the culture medium.
このことからDNJは化学シャペロン化合物としての機能を有していることが明らかとなった。一方、β-Hex活性では変化は認められなかったことから、DNJの効果はAαGluに特異的であることが立証された。 This revealed that DNJ has a function as a chemical chaperone compound. On the other hand, since no change was observed in β-Hex activity, it was proved that the effect of DNJ was specific to AαGlu.
本実施例は、デオキシノジリマイシン(DNJ)を含めた5種類のポンペ病に対する化学シャペロン候補化合物の中で、どれが最も化学シャペロン化合物として有望であるかどうかを調べたものである。 This example is to examine which of the five chemical chaperone candidate compounds for Pompe disease including deoxynojirimycin (DNJ) is most promising as a chemical chaperone compound.
実験は、ポンペ病患者由来の培養線維芽細胞でDNJに反応してAαGlu活性が上昇した2種類の細胞(Y455F/Y455F細胞とP545L/P545L細胞)を用い、化学シャペロン候補化合物としてはデオキシノジリマイシン(DNJ)、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)、N-(7-オクタデシル)デオキシノジリマイシン(NO-DNJ)、N-(n-ノニル)デオキシノジリマイシン(NN-DNJ)、N-デドシルデオキシノジリナイシン(ND-DNJ)を用いた。この5種類の化学シャペロン候補化合物を異なる濃度となるように上述の2種類の患者細胞の培養液に添加し、4日間培養後に細胞内のAαGlu活性を測定した。 The experiment uses two types of cells (Y455F / Y455F cells and P545L / P545L cells) that have increased AαGlu activity in response to DNJ in cultured fibroblasts from Pompe disease patients, and deoxynojirimycin as a chemical chaperone candidate compound. (DNJ), N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ), N- (7-octadecyl) deoxynojirimycin (NO-DNJ), N- (n-nonyl) deoxynojirimycin (NN-DNJ), N- Dedosyldeoxynojirinisin (ND-DNJ) was used. These five kinds of chemical chaperone candidate compounds were added to the above-mentioned two types of patient cell culture solutions at different concentrations, and intracellular AαGlu activity was measured after culturing for 4 days.
その結果、図2に示すごとく、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)が2つの細胞において最も高いAαGlu活性上昇効果を示した。 As a result, as shown in FIG. 2, N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) showed the highest AαGlu activity increasing effect in the two cells.
このことから、5種類の化学シャペロン化合物の内、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)が最も化学シャペロンとしての機能が高いことが分かり、実験では主にNB-DNJを化学シャペロン化合物として使用することとした。 This indicates that N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) has the highest function as a chemical chaperone among the five types of chemical chaperone compounds, and NB-DNJ is mainly used as a chemical chaperone compound in experiments. It was decided to.
本実施例では、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)が正常細胞に存在するするAαGlu酵素タンパク質およびポンペ病患者由来細胞に存在するアミノ酸置換型変異AαGlu酵素タンパク質のプロセシングを正常化するかどうかを調べた。変異型AαGluタンパク質としては、先行実験によりNB-DNJにより細胞内AαGlu活性が上昇することが確認されているY455Fホモ接合体細胞およびP545Lホモ接合体細胞を実験に供した。 In this example, whether N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) normalizes the processing of AαGlu enzyme protein present in normal cells and amino acid substitution mutant AαGlu enzyme protein present in cells derived from patients with Pompe disease I investigated. As the mutant AαGlu protein, Y455F homozygous cells and P545L homozygous cells whose intracellular AαGlu activity was confirmed to be increased by NB-DNJ in the previous experiment were used for the experiment.
正常細胞においては、AαGlu酵素タンパク質のプロセシングが正常に行われておりグリコーゲン分解能を有するAαGlu酵素成熟体が大量に存在していることから、グリコーゲンを完全に分解して細胞内に蓄積されることはない。したがって、化学シャペロン化合物であるNB-DNJを作用させてもAαGluのプロセシングに全く影響を及ぼしておらず、NB-DNJ存在下でもプロセシングが正常に行われていることを示している。 In normal cells, AαGlu enzyme protein is processed normally and there are a large number of mature AαGlu enzymes with glycogen degradability, so that glycogen is completely degraded and accumulated in the cells. Absent. Therefore, even when NB-DNJ, which is a chemical chaperone compound, is allowed to act, it has no influence on the processing of AαGlu, indicating that processing is normally performed even in the presence of NB-DNJ.
一方、患者由来の培養線維芽細胞においては、NB-DNJ非存在下ではAαGluは酵素前駆体だけに認められ、AαGlu中間体ならびにグリコーゲン分解能を有するAαGlu成熟体は全く認められなかった。つまり、ポンペ病患者由来細胞では、グリコーゲンが細胞内で分解されずに蓄積されていることが容易に推察される。 On the other hand, in cultured fibroblasts derived from patients, AαGlu was found only in the enzyme precursor in the absence of NB-DNJ, and AαGlu intermediates and mature AαGlu having glycogen resolution were not found at all. That is, it is easily inferred that glycogen is accumulated in cells derived from patients with Pompe disease without being degraded in the cells.
このような患者由来の培養線維芽細胞に化学シャペロン化合物であるNB-DNJを作用させると、AαGlu前駆体がAαGlu中間体を介してAαGlu成熟体へとプロセシングされ、グリコーゲン分解能を有する酵素成熟体量が顕著に増加した。つまり、このことは、増加した酵素成熟体により細胞内でグリコーゲンが分解され過剰蓄積されないものと思われる。 When NB-DNJ, a chemical chaperone compound, is allowed to act on cultured fibroblasts derived from such patients, the amount of enzyme matured body that has glycogen-degrading ability is processed from AαGlu precursor to AαGlu matured body via AαGlu intermediate Increased significantly. In other words, this seems to be because glycogen is degraded and not excessively accumulated in the cell by the increased matured enzyme.
本実施例では、患者細胞内でプリセシングが促進し、増加したAαGlu成熟体が本来の局在部位であるリソソームに到達しているか否か調べたものである。 In this example, it was examined whether or not the increased AαGlu matured body reached the lysosome, which is the original localized site, by promoting pre-processing in patient cells.
本実施例では、正常酵素を発現する細胞とN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)でAαGlu活性が上昇することが確認されているY455F変異酵素を発現する細胞を用いて、免疫二重染色を行いNB-DNJによりプロセシングが促進し、AαGlu酵素成熟体が増加したY455F変異酵素の細胞内局在を解析した。図4に示すごとく、シグナルがAαGluの存在位置を示し(左図)、赤色のシグナルがリソソームの位置を示す(中央図)。両者を重ねて2種類のシグナルが完全に一致したシグナルとなった場合には(右図)、AαGluがリソソームに到達していることを意味する。 In this example, immunostaining was performed using cells expressing a normal enzyme and cells expressing a Y455F mutant enzyme that was confirmed to have increased AαGlu activity in N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ). And the intracellular localization of the Y455F mutant enzyme in which processing was promoted by NB-DNJ and AαGlu enzyme matured body was increased was analyzed. As shown in FIG. 4, the signal indicates the position of AαGlu (left figure), and the red signal indicates the position of lysosome (middle figure). When the two signals overlap with each other and the signals are completely matched (right figure), it means that AαGlu has reached the lysosome.
図4に示すごとく、正常細胞ではシグナル(図4D)とシグナル(図4E)が完全に一致しており(図4C)、AαGluはリソソームに到達していることを示している。一方、変異酵素では、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)非存在下において、シグナル(図4G)とシグナル(図4H)は一致しておらず(図4I)、AαGluはリソソームに到達していない。しかし、NB-DNJを添加した変異酵素では、シグナル(図4J)とシグナル(図4K)は完全に一致しており(図4L)、変異AαGluはリソソームに到達していることを示している。 As shown in FIG. 4, in normal cells, the signal (FIG. 4D) and the signal (FIG. 4E) are completely identical (FIG. 4C), indicating that AαGlu has reached the lysosome. On the other hand, in the mutant enzyme, in the absence of N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ), the signal (FIG. 4G) and the signal (FIG. 4H) do not match (FIG. 4I), and AαGlu reaches the lysosome. Not. However, in the mutant enzyme to which NB-DNJ was added, the signal (FIG. 4J) and the signal (FIG. 4K) were completely matched (FIG. 4L), indicating that the mutant AαGlu had reached the lysosome.
この実験成果より、NB-DNJによりプロセシングが促進された患者細胞内のAαGluは、本来の局在部位であるリソソームに到達していることが証明された。このことは、NB-DNJを用いることで患者細胞内のAαGluのプロセシングを促進させ、AαGlu成熟体をリソソームへと輸送することで、リソソーム内でのグリコーゲン分解を促進することが可能であるものと推察される。 From this experimental result, it was proved that AαGlu in patient cells whose processing was promoted by NB-DNJ reached the lysosome, which is the original localization site. This means that NB-DNJ can be used to promote the processing of AαGlu in patient cells, and by transporting mature AαGlu to lysosomes, it is possible to promote glycogenolysis in lysosomes. Inferred.
本実施例では、化学シャペロン化合物としてのN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)が、どのくらいの種類の変異酵素に適応可能かどうかを調べるために、ポンペ病患者から同定された37例のアミノ酸置換型AαGlu変異酵素に対するNB-DNJの効果を調べたものである。 In this example, 37 amino acids identified from patients with Pompe disease were examined in order to examine how many kinds of mutant enzymes can be applied to N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) as a chemical chaperone compound. The effect of NB-DNJ on substitutional AαGlu mutant enzyme was investigated.
本実験では、これまでにポンペ病患者から同定された37種類のアミノ酸置換型AαGlu酵素を発現する細胞を用いて、培養液中にNB-DNJ存在/非存在下で培養し、細胞内のAαGlu活性を測定した(図5)。NB-DNJの効果はNB-DNJ非存在下のAαGlu活性に対するNB-DNJ存在下でのAαGlu活性の灯を求めて評価した。その結果、37例中13例(約35%)の変異酵素においてAαGlu活性の上昇が認められた。 In this experiment, cells expressing 37 types of amino acid-substituted AαGlu enzymes previously identified from patients with Pompe disease were cultured in the presence / absence of NB-DNJ in the culture medium, and intracellular AαGlu Activity was measured (Figure 5). The effect of NB-DNJ was evaluated by determining the light of AαGlu activity in the presence of NB-DNJ relative to AαGlu activity in the absence of NB-DNJ. As a result, an increase in AαGlu activity was observed in 13 cases (about 35%) of 37 cases.
本実験に成果から、化学シャペロン化合物であるNB-DNJが適応できる変異酵素には限界があり、ポンペ病においては化学シャペロンだけでは、全ての患者に応用できないことが判明した。このことから、現在行われている酵素補充療法の問題点を補完するために、本発明者らは酵素補充と化学シャペロンの併用療法の有用性に関して更に実験を進めた。 From the results of this experiment, it was found that there is a limit to the mutant enzymes to which NB-DNJ, which is a chemical chaperone compound, can be applied, and in Pompe disease, it is not possible to apply it to all patients with a chemical chaperone alone. Therefore, in order to complement the problems of the enzyme replacement therapy currently performed, the present inventors further advanced experiments on the usefulness of the combination therapy of enzyme replacement and chemical chaperone.
本実施例では、酵素補充と化学シャペロンの併用療法の有用性を検証するために、ポンペ病患者由来の5種類の培養線維芽細胞を用いて、組換え酵素製剤(rAαGlu)とN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)を細胞培養液に添加して細胞内AαGlu活性の変化を調べた。 In this example, in order to verify the usefulness of combination therapy of enzyme supplementation and chemical chaperone, recombinant enzyme preparation (rAαGlu) and N-butyldeoxy were used using five types of cultured fibroblasts derived from patients with Pompe disease. Nojirimycin (NB-DNJ) was added to the cell culture medium to examine changes in intracellular AαGlu activity.
本実験では、ポンペ病患者由来の5種類の培養線維芽細胞を対象として実験を行った(図6)。(1)NB-DNJに反応し細胞内AαGlu活性が上昇するP545L/P545L細胞、(2)細胞内に内在性のAαGlu酵素タンパク質が全く存在しなしC103X/C103X細胞、(3)細胞内に内在性のAαGlu酵素タンパク質は存在するが、活性が全くなく、NB-DNJに反応しないM439K/W746X細胞、(4)同様に、AαGlu酵素タンパク質は存在するが、NB-DNJに反応しないR437C/R437C細胞、(5)同様に、AαGlu酵素タンパク質は存在するが、NB-DNJに反応しない525del/R600C細胞の培養液にrAαGluならびにNB-DNJを同時にあるいはそれぞれ単独で添加し、4日間培養後、細胞内AαGlu活性を測定した。 In this experiment, an experiment was conducted on five types of cultured fibroblasts derived from patients with Pompe disease (FIG. 6). (1) P545L / P545L cells whose intracellular AαGlu activity increases in response to NB-DNJ, (2) No endogenous AαGlu enzyme protein in the cells C103X / C103X cells, (3) Endogenous in the cells M439K / W746X cells that do not react to NB-DNJ but have active AαGlu enzyme protein, (4) Similarly, R437C / R437C cells that have AαGlu enzyme protein but do not react to NB-DNJ (5) Similarly, rAαGlu and NB-DNJ are added simultaneously or individually to the culture medium of 525del / R600C cells that do not react with NB-DNJ although AαGlu enzyme protein exists, and after 4 days of culture, AαGlu activity was measured.
図6に示すごとく、5種類全ての細胞においてrAαGluとNB-DNJを同時に添加した場合に、細胞内AαGlu活性は最も高い値を示した。特に、NB-DNJに反応して酵素活性を増加させるP545L/P545L細胞においては、rAαGlu単独添加時の活性とNB-DNJ単独添加時の活性の総和よりも、両者を同時に添加した際の活性が明らかに高値を示した。このことから、rAαGluとNB-DNJの併用によるAαGluの活性上昇は、両者の相乗的な効果によることが示された。 As shown in FIG. 6, the intracellular AαGlu activity showed the highest value when rAαGlu and NB-DNJ were added simultaneously in all five types of cells. In particular, in P545L / P545L cells that increase enzyme activity in response to NB-DNJ, the activity when both were added simultaneously was greater than the sum of the activity when rAαGlu was added alone and the activity when NB-DNJ was added alone. It was clearly high. From this, it was shown that the activity increase of AαGlu by the combined use of rAαGlu and NB-DNJ is due to the synergistic effect of both.
この実験成果から、酵素補充療法単独よりも化学シャペロン療法との併用療法の方が、より効果的な治療成果を得ることができることが立証された。 From this experimental result, it was proved that combination therapy with chemical chaperone therapy can achieve more effective treatment results than enzyme replacement therapy alone.
本実施例では、実施例6で示された細胞内AαGlu活性の上昇がどのようなメカニズムで生じているかを調べるため、ポンペ病患者由来の培養線維芽細胞を用いて、組換え酵素製剤(rAαGlu)とN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)を培養液に添加し、ウエスタンブロットにより細胞内酵素タンパク質の挙動を解析した。 In this example, in order to examine the mechanism by which the increase in intracellular AαGlu activity shown in Example 6 occurred, a recombinant enzyme preparation (rAαGlu was used using cultured fibroblasts derived from a patient with Pompe disease. ) And N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) were added to the culture solution, and the behavior of the intracellular enzyme protein was analyzed by Western blot.
本実験では、細胞内に内在性のAαGluを全く持たないC103X/C103X細胞を用いて、細胞培養液に一定量のrAαGluと様々な濃度のNB-DNJを添加し、4日間培養後、その細胞ホモジネートを用いてウエスタンブロットにより、細胞内に取り込まれたAαGluの挙動を解析した(図7)。 In this experiment, using C103X / C103X cells that do not have any endogenous AαGlu in the cells, a certain amount of rAαGlu and various concentrations of NB-DNJ were added to the cell culture medium, and the cells were cultured after 4 days. The behavior of AαGlu incorporated into the cells was analyzed by Western blot using a homogenate (FIG. 7).
図7に示すごとく、細胞に取り込まれたAαGluは、NB-DNJ濃度依存的にプロセシングが促進し、結果的にグリコーゲンの分解能を有するAαGlu酵素成熟体の量が顕著に増加を示した。しかも、3種類の酵素タンパク質の総量もNB-DNJ存在下の方が増加傾向を示した。 As shown in FIG. 7, the processing of AαGlu incorporated into cells was accelerated depending on the concentration of NB-DNJ, and as a result, the amount of AαGlu enzyme matured substance having glycogen resolution was remarkably increased. Moreover, the total amount of the three types of enzyme proteins also showed an increasing tendency in the presence of NB-DNJ.
このことから、NB-DNJは外部から細胞内に取り込まれたAαGluの細胞内安定性に関与し、酵素タンパク質の分解処理を抑制すると共にプロセシングを促進することで、グリコーゲン分解能を有するAαGlu酵素成熟体の量を増加させることが示された。この実験により、実施例5で示した酵素補充と化学シャペロンの併用による細胞内AαGlu酵素活性上昇の分子メカニズムの一端が明らかとなった。 From this, NB-DNJ is involved in the intracellular stability of AαGlu taken into the cell from the outside, suppresses the degradation process of the enzyme protein and promotes processing, thereby matured AαGlu enzyme with glycogen resolution It was shown to increase the amount of. This experiment revealed one end of the molecular mechanism of the increase in intracellular AαGlu enzyme activity by the combined use of enzyme supplementation and chemical chaperone shown in Example 5.
本実施例では、2種類のポンペ病患者由来の培養線維芽細胞を対象として、組換え酵素製剤(rAαGlu)とN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)との併用効果をウエスタンブロットにより調べた。 In this example, the combined effect of a recombinant enzyme preparation (rAαGlu) and N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) was examined by Western blot for cultured fibroblasts derived from two types of Pompe disease patients. .
本実験は、(1)内在性のAαGluを全く有しないC103X/C103X細胞と(2)内在性のAαGluを有しNB-DNJに反応して細胞内酵素活性が上昇するP545L/P545L細胞を用い、その培養液にrAαGluならびにNB-DNJを同時添加あるいはそれぞれ別に添加し4日間培養した。その後、細胞ホモジネートを用いてウエスタンブロットにより、細胞内に取り込まれたAαGluの挙動を解析した(図8)。 This experiment uses (1) C103X / C103X cells that have no endogenous AαGlu and (2) P545L / P545L cells that have endogenous AαGlu and increase intracellular enzyme activity in response to NB-DNJ. Then, rAαGlu and NB-DNJ were added simultaneously or separately to the culture solution and cultured for 4 days. Thereafter, the behavior of AαGlu incorporated into the cells was analyzed by Western blotting using cell homogenates (FIG. 8).
その結果、図8に示すごとく、P545L/P545L細胞ではNB-DNJを単独で添加した場合でもAαGlu成熟体へのプロセシングの促進が観察された。また、rAαGlu単独でもある程度のAαGlu成熟体が観察されたが、NB-DNJと併用することで、遥かに多くのAαGlu成熟体が観察された。このことからも、酵素補充療法と化学シャペロン療法単独の治療よりも、両者の併用療法の方が遥かに効果的な治療効果が得られることが立証された。 As a result, as shown in FIG. 8, in the P545L / P545L cells, promotion of processing into AαGlu matured bodies was observed even when NB-DNJ was added alone. A certain amount of matured AαGlu was also observed with rAαGlu alone, but far more AαGlu matured bodies were observed when combined with NB-DNJ. This also proved that the combined therapy of both the enzyme replacement therapy and the chemical chaperone therapy can provide a much more effective therapeutic effect.
本実施例で示されたように、外部から細胞内に取り込まれたrAαGluは、十分なプロセシングを受けることなく、酵素前駆体のままで存在していることが分かる。この原因として考えられることとしては、取り込まれたrAαGluが正常な高次構造を形成することができず、細胞内で凝集塊を形成していることである。すなわち、細胞内に取り込まれたrAαGluは、正常な高次構造が崩れることで酵素タンパク質内部に内包していた疎水性アミノ酸がタンパク質表面に露出し、その疎水性基同士によるファンデアヴァールス力や疎水性相互作用により構造異常の酵素タンパク質同士が会合することで最終的に凝集塊を形成し、それが細胞内タンパク質分解系(粗面小胞体関連分解など)により処理されていることが予想された。 As shown in this Example, it can be seen that rAαGlu taken into cells from the outside is present as an enzyme precursor without undergoing sufficient processing. A possible cause of this is that the incorporated rAαGlu cannot form a normal higher order structure and forms an aggregate in the cell. In other words, rAαGlu incorporated into cells is exposed to the hydrophobic amino acids encapsulated in the enzyme protein due to the disruption of the normal higher-order structure, and the van der Waals force and hydrophobicity due to the hydrophobic groups. It was expected that enzyme proteins with structural abnormalities associated with each other due to sexual interaction would eventually form aggregates that were processed by intracellular proteolytic systems (such as rough endoplasmic reticulum-related degradation). .
本実施例では、実施例8の結果から考察された仮説を立証するために、細胞内に取り込まれた組換え酵素製剤(rAαGlu)の凝集塊の形成とそれに対すとN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)の効果を、ポンペ病患者由来の培養線維芽細胞を用いて解析した。 In this example, in order to verify the hypothesis discussed from the results of Example 8, the formation of aggregates of recombinant enzyme preparation (rAαGlu) incorporated into cells and N-butyldeoxynojirimycin (in contrast to that) NB-DNJ) was analyzed using cultured fibroblasts derived from patients with Pompe disease.
本実験では、内在性のAαGluを全く有していないC103X/C103X細胞を用いて、一定量のrAαGluと異なる量のNB-DNJを細胞培養液に添加して4日間培養後、細胞ホモジネートを回収した。回収した細胞ホモジネートを遠心処理し、沈殿物を洗浄したものを不溶性画分(凝集塊が存在する画分)、上清部分を可溶性画分とし、それぞれをウエスタンブロットにより解析した(図9)。 In this experiment, using C103X / C103X cells that have no endogenous AαGlu, add a certain amount of NB-DNJ different from rAαGlu to the cell culture and culture for 4 days, and then recover the cell homogenate. did. The collected cell homogenate was centrifuged, and the precipitate washed was the insoluble fraction (the fraction in which aggregates existed) and the supernatant portion was the soluble fraction, and each was analyzed by Western blotting (FIG. 9).
その結果、図9に示すごとく、NB-DNJ非存在下では不溶性画分にAαGlu前駆体のバンドが明瞭に観察され、その凝集塊はNB-DNJ濃度依存的に消失していった。このことから、当初予想したごとく細胞内に取り込まれたrAαGluは凝集塊を形成していることが立証された。これがプロセシングを抑制している原因と考えられた。また、NB-DNJはこの凝集塊の形成を抑制することも明らかになった。 As a result, as shown in FIG. 9, the band of AαGlu precursor was clearly observed in the insoluble fraction in the absence of NB-DNJ, and the aggregate disappeared depending on the NB-DNJ concentration. From this, it was proved that rAαGlu incorporated into the cells as initially expected formed an aggregate. This was thought to be the cause of suppressing processing. Moreover, it became clear that NB-DNJ suppresses formation of this aggregate.
本実施例により、細胞内に取り込まれたrAαGluが凝集塊を形成していることが示されたが、通常、細胞内でタンパク質が凝集塊を形成する際には、より強固な凝集塊とするためにジスルフィド(S-S)結合が形成されることが知られている。そこで、この仮説を立証するために、細胞内で形成されたAαGlu酵素タンパク質の凝集塊形成にS-S結合が関与しているかどうかを解析した。 This example showed that rAαGlu incorporated into cells formed aggregates, but when proteins form aggregates in cells, they usually have stronger aggregates. Therefore, it is known that a disulfide (SS) bond is formed. To verify this hypothesis, we analyzed whether S-S bonds are involved in the formation of aggregates of AαGlu enzyme proteins formed in cells.
本実施例では、細胞内に取り込まれた組換え酵素製剤(rAαGlu)が凝集塊を形成する際にS-S結合が関与しているか否か、更にその形成に対するN-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)の効果を調べるために、電気泳動を非還元性条件下(S-S結合を保持したままの条件)で行い、ウエスタンブロットにより解析した。 In this example, the recombinant enzyme preparation (rAαGlu) incorporated into cells forms an aggregate, whether or not SS binding is involved, and further N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) ) Was conducted under non-reducing conditions (conditions retaining SS binding) and analyzed by Western blot.
本実験では、内在性のAαGluを全く有しないC103X/C103X細胞を用い、一定量のrAαGluと異なる量のNB-DNJを培養液に添加し、4日間培養後、細胞ホモジネートを試料とし、S-S結合を切断するメルカプトエタノールを試料希釈液から除去して、非還元性条件下でS-S結合を保持したまま電気泳動した。その後、ウエスタンブリットにより、AαGluによる高分子凝集塊の有無を確認した(図10)。 In this experiment, C103X / C103X cells without any endogenous AαGlu were used, a certain amount of rAαGlu and a different amount of NB-DNJ were added to the culture, and after 4 days of culture, the cell homogenate was used as a sample, and SS binding The mercaptoethanol that cleaves was removed from the sample diluent and electrophoresed while retaining the SS bond under non-reducing conditions. Thereafter, the presence or absence of polymer aggregates due to AαGlu was confirmed by Western blitting (FIG. 10).
その結果、図10に示すごとく、電気泳動の上段(高分子領域)にAαGluの高分子複合体が観察された。このことから、当初予想していたごとく、細胞内に取り込まれたrAαGluの凝集塊形成にはS-S結合が関与していることが示された。また、このS-S結合によるAαGlu高分子凝集塊の形成はNB-DNJを共存することで抑制できることも明らかとなった。 As a result, as shown in FIG. 10, a polymer complex of AαGlu was observed in the upper stage (polymer region) of electrophoresis. From this, it was shown that S—S bond was involved in the formation of aggregates of rAαGlu incorporated into cells as originally expected. It was also revealed that the formation of AαGlu polymer aggregates due to the S—S bond can be suppressed by the coexistence of NB-DNJ.
実施例9ならびに10の実験成果より、外部から細胞内に取り込まれたrAαGluは、細胞内において高分子凝集塊を形成していることが明らかとなり、またその形成にはS-S結合が関与していることが示された。さらに、その凝集塊の形成をNB-DNJが抑制することも立証された。これが細胞内に取り込まれたAαGluのプロセシングを阻止している原因と考えられた。 From the experimental results of Examples 9 and 10, it is clear that rAαGlu taken into the cell from the outside forms a polymer aggregate in the cell, and SS bond is involved in the formation. It was shown that. Furthermore, it was proved that NB-DNJ suppresses the formation of the aggregate. This was thought to be the cause of blocking the processing of AαGlu incorporated into cells.
上述のごとく、細胞内でタンパク質が凝集塊を形成する場合には、先ず、最初にそのタンパク質自体の正常高次構造が崩れ、内部に内包されていた疎水性アミノ酸がタンパク質表面に露出することが引き金となることが知られている。そこで、本発明者らは、この酵素タンパク質の構造異常を何らかの方法で検出する方法の開発を試みることとした。 As described above, when a protein forms an aggregate in a cell, first, the normal higher-order structure of the protein itself is destroyed, and the hydrophobic amino acid contained therein is exposed on the protein surface. It is known to trigger. Therefore, the present inventors decided to develop a method for detecting the structural abnormality of the enzyme protein by some method.
本実施例では、構造異常を起こしたタンパク質がその表面に露出する疎水性アミノ酸残基に着目し、かつ、プロテアーゼの中でも疎水性アミノ酸残基を認識してタンパク質を分解するセリンプロテアーゼの一種であるキモトリプシンの特性を利用して、正常高次構造と正常高次構造を失ったAαGluを識別できるかどうかを、TLKC処理キモトリプシンを用いて検証した。 In this example, attention is paid to the hydrophobic amino acid residue exposed on the surface of the protein having a structural abnormality, and among the proteases, it is a kind of serine protease that recognizes the hydrophobic amino acid residue and degrades the protein. Using characteristics of chymotrypsin, it was verified using TLKC-treated chymotrypsin whether AαGlu that lost normal higher-order structure or normal higher-order structure could be distinguished.
本実験では、組換え酵素製剤(rAαGlu)を酵素試料として用い、中性pHの保存液で4℃と37℃でインキュベート後、4℃保存では充分活性があることから正常高次構造を有するAαGlu(Active AαGlu)とし、37℃で保存したものは完全に失活していることから高次構造を失ったAαGlu(Inactive AαGlu)として実験に供した。また、Active AαGluとInactive AαGluには、内在性のAαGluを全く有していないC103X/C103X培養線維芽細胞の細胞ホモジネートを総タンパク質濃度が0.5mg/mlとなるように添加し、通常の細胞ホモジネートと同じ環境となるように調整した。この2つの酵素試料にTLKC処理キモトリプシンを0〜200mu/mlとなるように混和し、37℃、20分間反応後、95℃5分間加熱して酵素反応を止め、ウエスタンブロットにより、両AαGluタンパク質の分解の有無を観察した(図11)。 In this experiment, a recombinant enzyme preparation (rAαGlu) was used as an enzyme sample, incubated at 4 ° C and 37 ° C in a neutral pH storage solution, and stored at 4 ° C. (Active AαGlu), which was stored at 37 ° C., was completely inactivated, so it was subjected to the experiment as AαGlu (Inactive AαGlu) having lost its higher order structure. In addition, the cell homogenate of C103X / C103X cultured fibroblasts without any endogenous AαGlu was added to Active AαGlu and Inactive AαGlu so that the total protein concentration was 0.5 mg / ml. It adjusted so that it might become the same environment. TLKC-treated chymotrypsin was mixed with these two enzyme samples so as to be 0 to 200 mu / ml, reacted at 37 ° C. for 20 minutes, then heated at 95 ° C. for 5 minutes to stop the enzyme reaction. By Western blotting, both AαGlu proteins were mixed. The presence or absence of decomposition was observed (FIG. 11).
結果は図11に示したごとく、正常高次構造を有しているActive AαGluは、本実施例での実験条件では全く分解されておらず、部分的な分解断片も一切観察されなかった。一方、正常高次構造を失ったInactive AαGluは、キモトリプシン活性80mu/mlで完全に酵素タンパク質が消失し、低分子領域に分解断片が認められた。 As a result, as shown in FIG. 11, Active AαGlu having a normal higher order structure was not decomposed at all under the experimental conditions in this example, and no partial decomposition fragments were observed. On the other hand, Inactive AαGlu, which has lost its normal higher order structure, had its chymotrypsin activity of 80 mu / ml, the enzyme protein completely disappeared, and a degradation fragment was observed in the low molecular region.
この実験成果は本発明の根幹をなす重要な知見を含んでいる。先ず、最も重要な知見は、高次構造を有する酵素タンパク質と高次構造を失った酵素タンパク質の違いを、キモトリプシン活性に対する抵抗性/感受性の有無で識別できることである。次に、その違いの識別が細胞ホモジネートの存在下で可能であることである。細胞ホモジネート中には種々雑多なタンパク質が含まれていることから、キモトリプシンのプロテアーゼ活性を競合阻害することが予想されたが、キモトリプシンは多くのタンパク質が存在する中にあっても、AαGluの高次構造の異常を認識し、正常高次構造の酵素タンパク質は全く分解することなく、正常高次構造を失った酵素タンパク質を選択的に分解した。このことは、通常の細胞ホモジネートを試料としてその中に含まれるタンパク質の構造異常を簡便に検出することができることを意味している。 This experimental result includes important knowledge that forms the basis of the present invention. First, the most important finding is that the difference between an enzyme protein having a higher order structure and an enzyme protein having lost the higher order structure can be identified by the presence / absence of resistance / sensitivity to chymotrypsin activity. Second, the difference can be identified in the presence of cell homogenates. Since cell homogenates contain various proteins, it was expected to competitively inhibit the protease activity of chymotrypsin, but chymotrypsin is a higher-order protein of AαGlu even in the presence of many proteins. The enzyme protein that lost the normal higher order structure was selectively decomposed without recognizing the abnormal structure and completely decomposing the normal higher order enzyme protein. This means that a structural abnormality of the protein contained in a normal cell homogenate can be easily detected.
本実施例では、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)によりAαGluのプロセシングが促進した2種類のポンペ病患者由来の培養線維芽細胞を用いて、プロセシング促進により増加した酵素成熟体が正常高次構造を有しているか否かをキモトリプシンアッセイを用いて解析した。 In this example, the mature enzyme body increased by the promotion of processing using normal fibroblasts derived from two types of Pompe disease patients whose AαGlu processing was promoted by N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ). It was analyzed using a chymotrypsin assay whether it has the following structure.
本実験では、NB-DNJによりAαGluのプロセシングが促進したP5454L/P545L細胞とY455F/Y455F細胞を対象に、細胞培養液に様々な濃度のNB-DNJを添加し、4日間培養後、その細胞ホモジネートを総タンパク質濃度0.5mg/mlに調整し160mu/mlのキモトリプシンと反応させ、その反応産物をウエスタンブロットにより解析した(図12)。 In this experiment, P5454L / P545L cells and Y455F / Y455F cells whose AαGlu processing was promoted by NB-DNJ were added, and various concentrations of NB-DNJ were added to the cell culture. Was adjusted to a total protein concentration of 0.5 mg / ml, reacted with 160 mu / ml chymotrypsin, and the reaction product was analyzed by Western blot (FIG. 12).
図12に示すごとく、両細胞共にNB-DNJによりAαGluのプロセシングは促進し、NB-DNJ非存在下では認められなかった酵素成熟体が、NB-DNJ濃度依存的に増加した。キモトリプシンを反応させたものでは、酵素前駆体は完全に消失し、酵素中間体と酵素成熟体は残存した。このことから、患者細胞に内在する変異AαGlu酵素タンパク質に対して、NB-DNJはその正常構造の形成・維持を促進し、正常なプロセシングへ導くことが示され、それによって増加した細胞内の酵素成熟体は正常な高次構造を有していることが立証された。 As shown in FIG. 12, the processing of AαGlu was promoted by NB-DNJ in both cells, and enzyme matures that were not observed in the absence of NB-DNJ increased in a NB-DNJ concentration-dependent manner. In the reaction with chymotrypsin, the enzyme precursor disappeared completely, and the enzyme intermediate and enzyme matured substance remained. From this, it was shown that NB-DNJ promotes the formation and maintenance of its normal structure and leads to normal processing against the mutated AαGlu enzyme protein inherent in patient cells, thereby increasing intracellular enzymes The mature body was proved to have a normal conformation.
本実施例では、外部から細胞内に取り込まれた組換え酵素製剤(rAαGlu)が正常な高次構造を有しているか否か、また、N-ブチルデオキシノジリマイシン(NB-DNJ)によりプロセシングが促進し、酵素成熟体となったAαGlu酵素タンパク質が正常な高次構造を有しているか否かを調べるために、ポンペ病由来の培養線維芽をキモトリプシンアッセイを用いて検証した。 In this example, whether or not the recombinant enzyme preparation (rAαGlu) taken into the cell from the outside has a normal higher-order structure, and is processed by N-butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ). In order to investigate whether the AαGlu enzyme protein that was promoted and became an enzyme mature form has a normal higher-order structure, cultured fibroblasts derived from Pompe disease were verified using a chymotrypsin assay.
本実験には、内在性のAαGluを全く有しないC103X/C103X細胞を用い、細胞培養液に一定量のrAαGluと様々な濃度のNB-DNJを添加し、4日間培養後、細胞ホモジネートは総タンパク質濃度を0.5mg/mlに調整し、160mu/mlのキモトリプシンを反応させ、その反応産物をウエスタンブロットにより解析した(図13)。 In this experiment, C103X / C103X cells without any endogenous AαGlu were used, and a certain amount of rAαGlu and various concentrations of NB-DNJ were added to the cell culture. After 4 days of culture, the cell homogenate was the total protein. The concentration was adjusted to 0.5 mg / ml, 160 mu / ml chymotrypsin was reacted, and the reaction product was analyzed by Western blot (FIG. 13).
実験結果は、図13に示すごとく、細胞内部に取り込まれたAαGlu酵素タンパク質は、NB-DNJによりプロセシングが促進し、酵素成熟体が増加した。増加した酵素成熟体は、キモトリプシンアッセイにより、正常な高次構造を有していることが初めて証明された。特に、プロセシング促進により増加した正常高次構造のAαGlu成熟体量は、MB-DNJ濃度依存的に顕著な増加傾向を示し、NB-DNJ非存在下と比べると10倍以上にも増加した。 As shown in FIG. 13, the experimental results showed that the AαGlu enzyme protein incorporated into the cell was promoted by NB-DNJ and the matured enzyme was increased. Increased enzyme matures were first demonstrated to have normal conformation by chymotrypsin assay. In particular, the amount of AαGlu matured body having a normal higher-order structure increased by the promotion of processing showed a remarkable increasing tendency depending on the MB-DNJ concentration, and increased more than 10 times compared with the absence of NB-DNJ.
この実験成果もまた、極めて重要な意味を持っており、本発明の根幹をなすものである。すなわち、(1)細胞内に取り込まれたrAαGlu酵素タンパク質は、化学シャペロンであるNB-DNJによりプロセシングが促進し、酵素成熟体が増加すること、(2)さらに、増加した酵素成熟体は本発明によるキモトリプシンアッセイにより、正常な高次構造を有していることを証明できたことである。 This experimental result also has a very important meaning and forms the basis of the present invention. That is, (1) the rAαGlu enzyme protein taken up into the cell is accelerated by the chemical chaperone NB-DNJ to increase the number of mature enzyme, and (2) the increased mature enzyme is the present invention. The chymotrypsin assay by can prove that it has a normal conformation.
本発明の一つであるキモトリプシンアッセイは、リソソーム病を含む他の遺伝性代謝病のみならず細胞内タンパク質の高次構造の異常が原因となる、いわゆる「タンパク質折りたたみ異常症」のための治療法開発や、診断ならびに病型診断、予後の予測などに応用が可能である。 The chymotrypsin assay which is one of the present invention is a therapeutic method for so-called "protein folding disorder" caused by abnormalities in the higher-order structure of intracellular proteins as well as other inherited metabolic diseases including lysosomal diseases It can be applied to development, diagnosis, diagnosis of disease type, and prediction of prognosis.
本発明によれば、遺伝性代謝病を化学シャペロン化合物によって治療する場合の治療効果の予測・判定ができるとともに、現行の酵素補充と化学シャペロン化合物による併用療法の治療効果の予測・判定が行える。これにより、新たな治療法の開発が加速的に進展することが期待できる。 According to the present invention, it is possible to predict / determine a therapeutic effect when a hereditary metabolic disease is treated with a chemical chaperone compound, and to predict / determine a therapeutic effect of a combination therapy using an existing enzyme replacement and a chemical chaperone compound. This can be expected to accelerate the development of new treatments.
また、プロテアーゼによるアッセイによって、遺伝性代謝病の診断、病型や予後の判定を可能にすると共に、化学シャペロン療法ならびに化学シャペロン療法と酵素補充療法との併用療法の治療効果を予測・判定できることから、遺伝性代謝病を含む「タンパク質折りたたみ異常症」の診断ならびに治療法開発に極めて有用である。 Protease-based assays enable the diagnosis and diagnosis of inherited metabolic diseases and the determination of disease type and prognosis, as well as the prediction and determination of the therapeutic effects of chemical chaperone therapy and combination therapy of chemical chaperone therapy and enzyme replacement therapy. It is extremely useful for diagnosis and treatment development of “protein folding disorders” including inherited metabolic diseases.
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