JP2017178890A - Adjuvant for mucosal vaccine to activate innate immunity - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、自然免疫を活性化する粘膜ワクチン用アジュバントに関し、特に新規インフルエンザワクチンに関する。 The present invention relates to an adjuvant for mucosal vaccines that activates innate immunity, and particularly to a novel influenza vaccine.
インフルエンザをはじめとする感染症の予防には、ワクチンが最も有効な手段である。しかし、インフルエンザワクチンについて言えば、現行の皮下注射型のワクチンでは全身系の免疫に関わるIgG抗体を血液中に誘導するものの、粘膜免疫においてウイルスの感染防御に重要な役割を果たす分泌型IgA抗体を粘膜上に誘導することはできない。したがって、現行のワクチンに期待できる効果は、感染の予防ではなく、重症化の予防でしかない。 Vaccines are the most effective means of preventing influenza and other infectious diseases. However, with regard to influenza vaccines, current subcutaneous injection vaccines induce IgG antibodies related to systemic immunity in the blood, but secretory IgA antibodies that play an important role in protecting against viral infection in mucosal immunity. It cannot be induced on the mucosa. Therefore, the effect that can be expected from the current vaccine is not prevention of infection, but prevention of seriousness.
近年、ウイルス自然感染に対する宿主の防御に粘膜免疫が重要であることが再認識され、粘膜でのウイルス認識機構、インターフェロンの誘導や粘膜での分泌型IgAの産生機構が明らかにされつつある。特に、インフルエンザに代表される呼吸器感染症の感染防御において、粘膜より分泌される分泌型IgA抗体が非常に重要な役割を果たしていることが知られている。これは、IgA抗体が交叉防御能を有しており、亜型の異なるウイルスに対しても感染を防御することができるためである。インフルエンザワクチンでは、その年に流行する型を予測してワクチンを製造しているが、現行のワクチンでは、流行する株とワクチン株とが異なる場合、その効果は大きく低下し、ほとんど効果がない場合もある。これらのことから、IgGによる全身系の免疫応答の惹起に加え、粘膜免疫の活性化による分泌型IgA産生を効率よく誘導することで感染予防を可能とするワクチン開発への要望が高まり、経粘膜的にワクチンを接種する経鼻粘膜型ワクチンの有用性が注目されている。しかしながら、皮下接種型ワクチンと同じ成分を経鼻粘膜投与しても、粘膜免疫はほとんど惹起されず、分泌型IgAは誘導されにくい。そのため、本来のワクチン成分以外に、粘膜免疫を惹起する物質、すなわち、粘膜ワクチン用アジュバントが必要となり、多くの開発が進められている。 In recent years, it was recognized again that mucosal immunity is important for host defense against natural virus infection, and the mechanism of virus recognition in the mucosa, the induction of interferon and the production of secretory IgA in the mucosa are being clarified. In particular, it is known that secretory IgA antibodies secreted from the mucous membrane play a very important role in the defense of respiratory infections typified by influenza. This is because the IgA antibody has a cross-protective ability and can protect against infection even with viruses of different subtypes. In the case of influenza vaccines, vaccines are manufactured in anticipation of the type that will be prevalent in the year, but if the current vaccine is different from the prevalent strain and the vaccine strain, the effect will be greatly reduced and there will be little effect There is also. From these, in addition to the induction of systemic immune responses by IgG, there is a growing demand for the development of vaccines that can prevent infection by efficiently inducing secretory IgA production by activating mucosal immunity, transmucosal In particular, the usefulness of a nasal mucosal vaccine inoculating the vaccine is attracting attention. However, even when the same component as the subcutaneous inoculation vaccine is administered to the nasal mucosa, mucosal immunity is hardly induced and secretory IgA is hardly induced. Therefore, in addition to the original vaccine component, a substance that induces mucosal immunity, that is, an adjuvant for mucosal vaccine, is required, and many developments are in progress.
これまでに、粘膜ワクチン用のアジュバントとして、コレラ毒素や大腸菌易熱性毒素に有効性が認められてきた。しかしながら、これらワクチンのヒトでの臨床試験において、一部に顔面神経麻痺が見られ、アジュバントとの関連性が否定できないことから、安全かつ効果的な粘膜ワクチン用アジュバントの開発のために多くの研究がなされてきた。ベロ毒素１のBサブユニットの5量体（特許文献１）、二本鎖RNAのpoly(I:C)（特許文献２）、インフルエンザ以外の感染症に対するpoly(I:C)（特許文献３、４）、CpGモチーフを含む免疫刺激性オリゴヌクレオチド（特許文献５）、インターロイキン33（IL-33）（特許文献６）などが公表されている。しかしながら、これらも粘膜ワクチン用アジュバントとしての有効性は認められているものの毒性などの問題から、ヒトでの不活化インフルエンザ経鼻ワクチンへの利用には至っていない。 So far, the effectiveness of cholera toxin and Escherichia coli heat-labile toxin has been recognized as an adjuvant for mucosal vaccines. However, in clinical trials of these vaccines in humans, facial nerve palsy is partly seen and its relevance to adjuvants cannot be ruled out. Has been made. Verotoxin 1 B subunit pentamer (Patent Document 1), double-stranded RNA poly (I: C) (Patent Document 2), poly (I: C) for infections other than influenza (Patent Document 3) 4) Immunostimulatory oligonucleotides containing a CpG motif (Patent Document 5), interleukin 33 (IL-33) (Patent Document 6) and the like have been published. However, although these have been recognized as effective as adjuvants for mucosal vaccines, they have not been used for inactivated influenza nasal vaccines in humans due to problems such as toxicity.
感染症ワクチン用の粘膜アジュバントを開発するためには、ヒトがその病原体に感染した際に起こる免疫応答を理解することが重要である。ヒトにはウイルスや細菌などの外来異物の侵入を防御する機能が備わっており、この免疫機能は、自然免疫と獲得免疫に大きく分けられる。獲得免疫は、外来異物の刺激に対して後天的に形成される免疫であり、B細胞やT細胞などのリンパ球が担っている。細胞ごとに異なる遺伝子再構成により、無数の抗原特異性をもつ受容体を作り出し、あらゆる外来抗原に対処する。 In order to develop mucosal adjuvants for infectious disease vaccines, it is important to understand the immune response that occurs when a human is infected with the pathogen. Humans have a function to protect against the invasion of foreign substances such as viruses and bacteria. This immune function can be broadly divided into innate immunity and acquired immunity. Acquired immunity is an immunity that is acquired in response to the stimulation of a foreign substance, and is carried by lymphocytes such as B cells and T cells. Gene reconstitutions that vary from cell to cell create receptors with a myriad of antigen specificities to deal with any foreign antigen.
これに対し、自然免疫は、先天的に備わった免疫であり、異物であるウイルスや微生物などに固有の分子パターンを認識している。この分子パターンの認識は、主に自然免疫を担当するマクロファージ、樹状細胞などのいわゆる抗原提示細胞のToll様受容体（Toll-like receptor: TLR）と呼ばれる膜タンパク質を介して行われる。近年、ヒトを含む哺乳類では、微生物などの感染に際し、初期の自然免疫が発動しなければ獲得免疫が始動せず、TLRを介した自然免疫が獲得免疫を支配していることが明らかになっている。 In contrast, innate immunity is an innate immunity that recognizes a molecular pattern unique to foreign viruses and microorganisms. Recognition of this molecular pattern is performed mainly through a membrane protein called Toll-like receptor (TLR) of so-called antigen-presenting cells such as macrophages and dendritic cells responsible for innate immunity. In recent years, it has been clarified that in mammals including humans, acquired immunity does not start unless the initial innate immunity is activated in the infection of microorganisms, etc., and innate immunity via TLR dominates acquired immunity. Yes.
中でも、自然免疫を担う抗体である自然抗体は、病原体が侵入した際に最初に作られる抗体で、感染の初期防御に極めて重要である。さらに、自然抗体はウイルス感染やウイルスワクチン接種がない状態でも恒常的に体内に存在し、ウイルスを含む各種感染寄生体抗原や自己抗原と反応する。また、自然抗体のレパートリー形成に抗体遺伝子の再構成は必要なく、限られた抗原認識レパートリーを示す。自然抗体はインフルエンザウイルスを含む各種ウイルス抗原とも反応する（多クローン性かつ交叉反応性）ことが分かっている。自然抗体を産生できない遺伝子改変マウスにおいて、1) ウイルス感染初期のウイルス排除が遅延すること、2) ウイルス特異的なIgG抗体産生の低下、3) 二次リンパ組織へのウイルス抗原送達の障害が報告され、ウイルス感染における宿主の初期防御に自然抗体が極めて重要な役割を果たすことが明らかとなった（非特許文献１）。さらに、自然抗体の産生に異常を示すマウスにおいてワクチン接種によるウイルス抗原特異的な免疫応答が遅延し（非特許文献２）、重篤なウイルス感染症候群がみられることが報告された（非特許文献３）。これらのことより、自然抗体はウイルス感染初期のみならず、ウイルス抗原特異的な獲得免疫の成立にも重要な役割を持つことが明らかとなった。 Among them, natural antibodies, which are antibodies responsible for innate immunity, are antibodies that are first produced when a pathogen invades, and are extremely important for the initial defense against infection. Furthermore, natural antibodies are constantly present in the body even in the absence of viral infection or viral vaccination, and react with various infectious parasitic antigens including viruses and self-antigens. In addition, antibody gene rearrangement is not necessary for the formation of a repertoire of natural antibodies, indicating a limited antigen recognition repertoire. Natural antibodies are known to react with various viral antigens including influenza virus (polyclonal and cross-reactive). In genetically modified mice that cannot produce natural antibodies, 1) delayed viral clearance in the early stages of viral infection, 2) reduced virus-specific IgG antibody production, 3) impaired delivery of viral antigens to secondary lymphoid tissues It has been clarified that natural antibodies play an extremely important role in the initial defense of the host in virus infection (Non-patent Document 1). Furthermore, it was reported that a virus antigen-specific immune response by vaccination was delayed in mice showing abnormal production of natural antibodies (Non-patent Document 2), and severe viral infection syndrome was observed (Non-patent Document). 3). These facts revealed that natural antibodies have an important role not only in the early stage of virus infection but also in the establishment of acquired immunity specific to virus antigens.
本発明は、経粘膜投与型ワクチンに使用する有効かつ安全な粘膜ワクチン用アジュバントを提供することを課題とする。具体的には、自然抗体の産生を増強又は自然免疫を活性化し、ウイルスに特異的な分泌型IgA抗体を誘導する粘膜ワクチン用アジュバントを提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an effective and safe mucosal vaccine adjuvant for use in a transmucosal administration type vaccine. Specifically, an object of the present invention is to provide an adjuvant for mucosal vaccine that enhances the production of natural antibodies or activates natural immunity and induces secretory IgA antibodies specific for viruses.
このような知見から、本発明者らは、自然免疫の活性化又は自然抗体の産生を増強しうる物質をスクリーニングにより獲得することで、感染予防に有効な粘膜ワクチン用アジュバントを新たに開発することができると考え、鋭意検討した結果、特定の化合物群を見出し、本発明を完成するに至った。 Based on these findings, the present inventors newly develop a mucosal vaccine adjuvant effective for infection prevention by obtaining a substance capable of enhancing innate immunity activation or natural antibody production by screening. As a result of intensive studies, the inventors have found a specific group of compounds and completed the present invention.
即ち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕 自然抗体の産生を増強する物質又は自然免疫を活性化する物質からなる粘膜ワクチン用アジュバントであって、該物質はB細胞の自然抗体の産生を増強する物質、IL-5の産生を増強する物質、樹状細胞を活性化する物質、インフラマソームを活性化する物質及びIFN-γ産生を増強する物質からなる群より選ばれる、粘膜ワクチン用アジュバント。
〔２〕 B細胞の自然抗体の産生を増強する物質がケンフェロール、シネンセチン、ケルセチン、ヘスペリジン、ルチン、モリン、カルミン酸、ロイフォリン、スピラエオシド及びケンフェライドであるフラボノイド化合物、PP1及びPP2であるSrcファミリーキナーゼ阻害剤、フォルスコリンであるcAMP誘導剤、PGB1及びPGF2αであるプロスタグランジン類、インゲノール3,20-ジベンゾエートであるインゲノール類、ホルボール12-ミリステート13-アセテート及び12-デオキシホルボール13-アセテートであるホルボール化合物、硫酸アトロピン、ロスコビチン、ピフィスリン-αならびにCyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val]からなる群より選ばれる、〔１〕に記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
〔３〕 IL-5の産生を増強する物質がホルボール12-ミリステート13-アセテート、ホルボール12,13-ジブチレート及び12-デオキシホルボール13-アセテートであるホルボール化合物、インゲノール3,20-ジベンゾエートであるインゲノール類、アンフォテリシンBである抗生物質、タキソール（パクリタキセル）、(S)-(-)-プロプラノロール塩酸塩、RHC-80267ならびにW7からなる群より選ばれる、〔１〕又は〔２〕に記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
〔４〕 樹状細胞を活性化する物質がFSL-1、Pam2CSK4及びPam3CSK4であるTLR2リガンドならびにLPSであるTLR4リガンドからなる群より選ばれる、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
〔５〕 インフラマソームを活性化する物質が、アンフォテリシンB、バリノマイシン及びCITCOからなる群より選ばれる、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
〔６〕 IFN-γ産生を増強する物質が、インゲノール3,20-ジベンゾエートであるインゲノール類、カルミン酸、ロイフォリン及びシネセチンであるフラボノイド化合物ならびに12-デオキシホルボール13-アセテート、ホルボール12,13-ジブチレート及びホルボール12-ミリステート13-アセテートであるホルボール化合物からなる群より選ばれる、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
〔７〕 ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と共に被験者に投与するための、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
〔８〕 粘膜ワクチン用アジュバントを２種以上併用する、〔７〕に記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
〔９〕 ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス及び風疹ウイルスからなる群より選ばれるものであり、
病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎球菌、結核菌、コレラ菌及びジフテリア菌からなる群より選ばれるものである、〔７〕又は〔８〕に記載の粘膜ワクチン用アジュバント。
〔１０〕 ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の粘膜ワクチン用アジュバントの少なくとも１種を含有する、経粘膜的に投与されるワクチン組成物。
〔１１〕 ウイルスが水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス及び風疹ウイルスからなる群より選ばれるものであり、
病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎球菌、結核菌、コレラ菌及びジフテリア菌からなる群より選ばれるものである、〔１０〕に記載のワクチン組成物。
That is, the present invention is as follows.
[1] A mucosal vaccine adjuvant comprising a substance that enhances the production of natural antibodies or a substance that activates innate immunity, which substance produces IL-5, a substance that enhances the production of natural antibodies of B cells An adjuvant for mucosal vaccine selected from the group consisting of a substance that enhances, a substance that activates dendritic cells, a substance that activates inflammasome, and a substance that enhances IFN-γ production.
[2] Inhibition of Src family kinases, which are flavonoid compounds, PP1 and PP2, which are kaempferol, sinensetin, quercetin, hesperidin, rutin, morin, carminic acid, leufoline, spiraeoside, and kaempferide as substances that enhance the production of natural antibodies in B cells Agents, cAMP inducers that are forskolin, prostaglandins that are PGB1 and PGF2α, ingenols that are ingenol 3,20-dibenzoate, phorbol 12-myristate 13-acetate and 12-deoxyphorbol 13-acetate The adjuvant for mucosal vaccine according to [1], which is selected from the group consisting of a phorbol compound, atropine sulfate, roscovitine, pifthrin-α and Cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val].
[3] Phorbol compounds whose substances that enhance IL-5 production are phorbol 12-myristate 13-acetate, phorbol 12,13-dibutyrate and 12-deoxyphorbol 13-acetate, ingenol 3,20-dibenzoate Selected from the group consisting of ingenols, which are amphotericin B, antibiotics which are amphotericin B, taxol (paclitaxel), (S)-(−)-propranolol hydrochloride, RHC-80267, and W7, according to [1] or [2] Adjuvant for mucosal vaccine.
[4] The mucosa according to any one of [1] to [3], wherein the substance that activates dendritic cells is selected from the group consisting of TSL2 ligand which is FSL-1, Pam2CSK4 and Pam3CSK4 and TLR4 ligand which is LPS Adjuvant for vaccine.
[5] The adjuvant for mucosal vaccine according to any one of [1] to [4], wherein the substance that activates inflammasome is selected from the group consisting of amphotericin B, valinomycin, and CITCO.
[6] Ingenols which are ingenol 3,20-dibenzoate, substances which enhance IFN-γ production, flavonoid compounds which are carminic acid, reifolin and cinecetin, and 12-deoxyphorbol 13-acetate, phorbol 12,13- The adjuvant for mucosal vaccine according to any one of [1] to [5], which is selected from the group consisting of phorbol compounds which are dibutyrate and phorbol 12-myristate 13-acetate.
[7] The adjuvant for mucosal vaccine according to any one of [1] to [6], which is administered to a subject together with an inactivated antigen derived from a virus or a pathogenic bacterium.
[8] The adjuvant for mucosal vaccine according to [7], wherein two or more mucosal vaccine adjuvants are used in combination.
[9] The virus is varicella virus, measles virus, mumps virus, poliovirus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, herpes virus, severe acute respiratory infection syndrome (SARS) virus, human immunodeficiency virus (HIV), human papilloma virus And selected from the group consisting of rubella virus,
The adjuvant for mucosal vaccine according to [7] or [8], wherein the pathogen is selected from the group consisting of Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, influenza b type bacteria, pneumococci, tuberculosis bacteria, cholera bacteria, and diphtheria bacteria .
[10] A vaccine composition to be administered transmucosally, comprising an inactivated antigen derived from a virus or pathogen and at least one of the adjuvants for mucosal vaccines according to any one of [1] to [6] .
[11] The virus is varicella virus, measles virus, mumps virus, poliovirus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, herpes virus, severe acute respiratory infection syndrome (SARS) virus, human immunodeficiency virus (HIV), human papilloma virus And selected from the group consisting of rubella virus,
The vaccine composition according to [10], wherein the pathogen is selected from the group consisting of Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, influenza b type bacteria, pneumococci, tuberculosis bacteria, cholera bacteria, and diphtheria bacteria.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、ウイルス感染初期及びウイルス抗原特異的な獲得免疫の成立に重要な自然抗体の産生を増強、又は自然免疫を活性化するものである。特に、自然抗体（IgM又はIgA）の産生を増強する粘膜ワクチン用アジュバントとして、フラボノイド化合物であるケンフェロール、Srcファミリーキナーゼ阻害剤であるPP2、及びcAMP誘導剤であるフォルスコリンを見出した。また、自然免疫を活性化する粘膜ワクチン用アジュバントとして、TLR2リガンドであるPam3CSK4、インフラマソームを活性化する抗生物質のアンフォテリシンB、IFN-γの産生を増強するインゲノールエステルであるインゲノール3,20-ジベンゾエートを見出した。さらに、in vivoの系において、本発明の粘膜ワクチン用アジュバント及びインフルエンザワクチン抗原を経鼻的に投与したところ、特にPam3CSK4は、鼻腔粘膜上に効率的に抗原特異的な分泌型IgAを産生することが確認された。また、Pam3CSK4とPP2とを併用した投与では、各アジュバント物質単独による効果と比較して、抗原特異的なIgA産生を増強した。このことから、本発明が提供する粘膜ワクチン用アジュバントは、自然免疫を活性化、又は自然抗体の産生を増強することにより、粘膜上への分泌型IgA産生を誘導し、ウイルス又は病原菌などの病原体による感染を防御するものであり、また、感染予防のための分泌型IgAの誘導剤と成り得るものである。 The adjuvant for mucosal vaccines of the present invention enhances the production of natural antibodies important for the establishment of acquired immunity specific to the initial stage of virus infection and virus antigens, or activates natural immunity. In particular, the flavonoid compound kaempferol, the Src family kinase inhibitor PP2, and the cAMP inducer forskolin were found as mucosal vaccine adjuvants that enhance the production of natural antibodies (IgM or IgA). In addition, as an adjuvant for mucosal vaccines that activate innate immunity, Pam3CSK4, a TLR2 ligand, amphotericin B, an antibiotic that activates inflammasome, and ingenol 3,20, an ingenol ester that enhances the production of IFN-γ -I found dibenzoate. Further, when the mucosal vaccine adjuvant and influenza vaccine antigen of the present invention were administered intranasally in an in vivo system, in particular, Pam3CSK4 efficiently produced antigen-specific secretory IgA on the nasal mucosa. Was confirmed. In addition, administration with Pam3CSK4 and PP2 enhanced antigen-specific IgA production compared to the effect of each adjuvant substance alone. Therefore, the adjuvant for mucosal vaccine provided by the present invention induces secretory IgA production on the mucosa by activating innate immunity or enhancing production of natural antibodies, and pathogens such as viruses or pathogens It can be used as a secretory IgA inducer for preventing infection.
定義
本明細書において「ワクチン」とは、身体中に投与されて、活性な免疫を生成する、抗原性部分を含む懸濁液又は溶液をいう。ワクチンを構成する抗原性部分は、微生物（例えば、ウイルス又は細菌など）又は微生物から精製された天然の産生物、合成生成物又は遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖又は同様な産生物であり得る。抗原性部分には、感染能を有する抗原と感染能を喪失した抗原とが含まれる。抗原性部分は、免疫原とも称される。
Definitions As used herein, “vaccine” refers to a suspension or solution containing an antigenic moiety that is administered into the body to produce active immunity. The antigenic part that constitutes a vaccine can be a microorganism (eg, a virus or a bacterium) or a natural product purified from a microorganism, a synthetic product or a genetically engineered protein, peptide, polysaccharide or similar product. Antigenic portions include antigens that have infectivity and antigens that have lost their infectivity. An antigenic moiety is also referred to as an immunogen.
本明細書において「不活化抗原」とは、ワクチン用抗原として使用される、感染能を失わせた抗原をいい、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成粒子、ウイルス非構造タンパク質、病原菌由来のタンパク質もしくは糖タンパク質、感染防御抗原、中和反応のエピトープなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において「不活化抗原」とは、感染力を失わせるが免疫原性を保持させた抗原をいい、そのような抗原がワクチンとして使用されるときは、「不活化ワクチン」という。そのような不活化抗原としては、例えば、物理的（例えば、Ｘ線照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、水銀、アルコール、塩素）などの操作により不活化されたものが挙げられるがそれらに限定されない。サブユニット抗原自体も、通常感染力を喪失していることから、不活化抗原の定義内に入る。 As used herein, “inactivated antigen” refers to an antigen that has lost its infectivity and is used as an antigen for vaccines, and is a complete virus particle virion, an incomplete virus particle, a virion component particle, or a virus nonstructural protein Examples include, but are not limited to, proteins or glycoproteins derived from pathogenic bacteria, infection protective antigens, and neutralization epitopes. As used herein, “inactivated antigen” refers to an antigen that loses infectivity but retains immunogenicity. When such an antigen is used as a vaccine, it is referred to as an “inactivated vaccine”. Examples of such inactivated antigens include those inactivated by operations such as physical (for example, X-ray irradiation, heat, ultrasound) and chemical (formalin, mercury, alcohol, chlorine). It is not limited to them. The subunit antigen itself also falls within the definition of inactivated antigen because it normally loses infectivity.
本明細書において「サブユニット抗原」とは、「成分」ともいい、そのようなサブユニット抗原は、天然のウイルス又は病原菌などの病原体から精製してもよく、合成又は組換え技術により作製してもよい。そのような方法は当該分野において周知であり、慣用されるものであり、市販される機器、試薬、ベクターなどを用いて実施できる。例えば、インフルエンザウイルスでは、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクス（Ｍ１、Ｍ２）、非構造（ＮＳ）、ポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２：塩基性ポリメラーゼ１及び２、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ））、核タンパク質（ＮＰ）などの、粒子の表面に出ている分子であることが好ましい。現在ＨＡは１６種類、ＮＡは９種類が知られている。 As used herein, “subunit antigen” is also referred to as “component”, and such a subunit antigen may be purified from a pathogen such as a natural virus or pathogen, and is produced by synthetic or recombinant techniques. Also good. Such methods are well known in the art and commonly used and can be performed using commercially available equipment, reagents, vectors, and the like. For example, in influenza virus, hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), matrix (M1, M2), non-structure (NS), polymerase (PB1, PB2: basic polymerase 1 and 2, acidic polymerase (PA)), nucleus It is preferably a molecule such as a protein (NP) that appears on the surface of the particle. Currently, 16 types of HA and 9 types of NA are known.
本明細書において「粘膜投与」とは、粘膜を経由する投与形態をいう。本明細書において「粘膜」とは、脊椎動物において、消化器、呼吸器、泌尿生殖器など特に外通性の中腔器官の内壁をいう。従って、そのような粘膜投与としては、例えば、鼻腔投与（経鼻投与）、口腔投与、膣内投与、上気道投与、肺胞投与などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、鼻腔投与が有利である。鼻腔は特に、インフルエンザウイルスなどの呼吸器系感染疾患の感染経路でもあることから、感染初期での防御を可能にするからである。 As used herein, “mucosal administration” refers to an administration form that passes through the mucosa. As used herein, the term “mucosa” refers to the inner wall of an extrinsic luminal organ such as the digestive organ, respiratory organ, urogenital organ, etc. in vertebrates. Accordingly, examples of such mucosal administration include, but are not limited to, nasal administration (nasal administration), buccal administration, intravaginal administration, upper respiratory tract administration, and alveolar administration. Preferably, nasal administration is advantageous. This is because the nasal cavity is particularly an infection route for respiratory diseases such as influenza virus, and thus enables protection in the early stage of infection.
本明細書において「アジュバント」とは、投与された免疫原に対する、免疫応答を増加、あるいは変化させる物質である。また、本明細書において「ワクチン組成物」とは「抗原性部分」と「アジュバント」とを含む組成物である。 As used herein, an “adjuvant” is a substance that increases or alters the immune response to an administered immunogen. In the present specification, the “vaccine composition” is a composition containing an “antigenic part” and an “adjuvant”.
粘膜ワクチン用アジュバント
本発明におけるアジュバントの概念を説明する。
自然抗体を産生するのは、B細胞亜集団のひとつであるB-1細胞である。腹腔や胸腔、腸管粘膜固有層に多く存在し、恒常的に交叉反応性のIgM及びIgAクラスの自然抗体を産生している。B-1細胞に直接作用し、IgM産生を増強する物質は、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントとして有効であると考えられる。さらに、感染予防に重要なIgAの産生も自然免疫により制御されており、TLRリガンドによる活性化とTransforming growth factor (TGF)-β、レチノイン酸、IL-5やIL-6などのサイトカインによる刺激が必須である。そこで、B-１細胞に直接作用し、TLR、TGF-β、IL-5を介してIgA産生を増強する物質は、粘膜ワクチン用アジュバントとなる可能性が高い。一方、リンパ組織に数多く存在するB-2細胞も腸管でのIgA産生に関与していることから、B-2細胞のIgAクラススイッチ誘導やIgA産生を増強する物質も粘膜ワクチン用アジュバントとなると考えられる。
Mucosal vaccine adjuvant The concept of the adjuvant in the present invention will be described.
B-1 cells, one of the B cell subpopulations, produce natural antibodies. It exists in the abdominal cavity, thoracic cavity, and intestinal mucosa lamina propria and constantly produces cross-reactive IgM and IgA class natural antibodies. A substance that directly acts on B-1 cells and enhances IgM production is considered to be effective as the mucosal vaccine adjuvant of the present invention. In addition, IgA production, which is important for infection prevention, is also regulated by innate immunity, and is activated by TLR ligands and stimulated by cytokines such as transforming growth factor (TGF) -β, retinoic acid, IL-5 and IL-6. It is essential. Therefore, a substance that acts directly on B-1 cells and enhances IgA production via TLR, TGF-β, and IL-5 is likely to be an adjuvant for mucosal vaccines. On the other hand, since many B-2 cells present in lymphoid tissues are also involved in IgA production in the intestinal tract, substances that enhance IgA class switch induction and IgA production in B-2 cells are considered to be adjuvants for mucosal vaccines. It is done.
また、本発明者らは、B-1細胞の生存、増殖、IgM産生の増強にIL-5が重要であることをこれまでに明らかにしており、さらにIL-5を恒常的に産生する細胞が抗原暴露や感染経験のない野生型マウスの腸管と肺に存在することを近年見出している。この細胞はc-Kit+CD3ε-細胞であり、リコンビナント（r）IL-33刺激により多量のIL-5を産生することから、本発明者らはこの細胞をIL-5産生自然リンパ球として（J. Immunol. 188:703-713, 2012）、粘膜での分泌型IgA産生における役割を検討している。そこで、IL-5産生自然リンパ球によるIL-5産生を増強する物質は、B-1細胞の生存やワクチンによる自然抗体産生を増強する粘膜ワクチン用アジュバントとなりうる。 In addition, the present inventors have previously clarified that IL-5 is important for the enhancement of survival, proliferation and IgM production of B-1 cells, and cells that constantly produce IL-5. Has recently been found to be present in the intestinal tract and lungs of wild-type mice with no antigen exposure or infection experience. Since this cell is a c-Kit + CD3ε − cell and produces a large amount of IL-5 upon stimulation with recombinant (r) IL-33, the present inventors have designated this cell as an IL-5 producing natural lymphocyte ( J. Immunol. 188: 703-713, 2012), examining the role of mucosal secretory IgA production. Thus, a substance that enhances IL-5 production by IL-5-producing natural lymphocytes can be an adjuvant for mucosal vaccine that enhances the survival of B-1 cells and the production of natural antibodies by the vaccine.
一方で、B細胞のIgA産生に必要なTGF-βやレチノイン酸は樹状細胞から放出されることが知られている。これらの他にも、樹状細胞が産生するB細胞活性化因子（B cell activating factor of TNF-family、BAFF）やそのホモログである増殖誘導リガンド（A proliferation-inducing ligand, APRIL）もB細胞のIgA産生を制御する。したがって、樹状細胞を活性化し、B細胞のIgA産生に関与する因子の産生を増強する物質は、間接的にB細胞のIgA産生を増強することから、粘膜ワクチン用アジュバントとなると考えられる。 On the other hand, it is known that TGF-β and retinoic acid necessary for B cell IgA production are released from dendritic cells. In addition to these, the B cell activating factor of TNF-family (BAFF) produced by dendritic cells and its homolog, A proliferation-inducing ligand (APRIL), are also found in B cells. Regulates IgA production. Therefore, a substance that activates dendritic cells and enhances the production of factors involved in IgA production of B cells indirectly enhances IgA production of B cells, and is considered to be an adjuvant for mucosal vaccines.
さらに、TLRを代表とする自然免疫レセプターは自然免疫系の発動に重要である。粘膜ワクチン用アジュバントとしての有効性が確認されている2本鎖RNAのpoly(I:C)がTLR3リガンドであるように、ウイルス由来のRNAやDNAはTLR3、TLR7又はTLR9を介して細胞を活性化するのみならずアジュバント活性を示すことが知られている。また、すでにワクチンアジュバントとして使用されているモノホスホリルリピドAはTLR4リガンドである。これらのことから、新たな各種TLRリガンドは、粘膜ワクチン用アジュバントとなりうる。 Furthermore, innate immune receptors such as TLR are important for the activation of the innate immune system. Virus-derived RNA and DNA activate cells via TLR3, TLR7, or TLR9, just as poly (I: C), a double-stranded RNA that has been validated as an adjuvant for mucosal vaccines, is a TLR3 ligand. It is known that it exhibits adjuvant activity as well. Monophosphoryl lipid A, which is already used as a vaccine adjuvant, is a TLR4 ligand. Therefore, various new TLR ligands can be adjuvants for mucosal vaccines.
一方で、アルミニウム塩（アラム；alum）は日本で汎用されているアジュバントの一種である。アラムは、自然免疫のレセプターのNod like-receptor（NLR）ファミリーに属するNLRP3を含むインフラマソームと呼ばれるタンパク質複合体を活性化する。自然免疫を担当するマクロファージや樹状細胞がアラムのような粒子状物質を貪食するとインフラマソームが活性化され、Caspase-1の活性化を介して炎症性サイトカインであるIL-1β及びIL-18の産生が誘導される。NLRP3ノックアウトマウス若しくはCaspase-1ノックアウトマウスでは、アラムと共にOVAで免疫した場合に野生型マウスで認められる血中のIgG1の上昇が認められず、Th2型の炎症が起こらなかったことから、インフラマソームの活性化とアジュバント作用とは深い関連があると考えられる（Nature 453:1122-1126, 2008）。また、インフルエンザウイルスはNLRP3インフラマソームを活性化しサイトカインのIL-1βやIL-18を細胞外に分泌するが、その活性化はインフルエンザウイルスのM2タンパク質によるH+チャネル活性によるものであると報告されている（Nat. Immunol.11:404-10,2010）。不活化されたインフルエンザワクチンではM2タンパク質も不活化されているため、NLRP3インフラマソーム活性化剤を添加することでこれを補うことはワクチン効果の増強につながる。これらのことから、インフラマソームを活性化する物質はアジュバント物質となりうる。 On the other hand, an aluminum salt (alum) is a kind of adjuvant widely used in Japan. Alum activates a protein complex called inflammasome that contains NLRP3, which belongs to the Nod like-receptor (NLR) family of innate immune receptors. When macrophages and dendritic cells responsible for innate immunity engulf particulate matter such as alum, the inflammasome is activated, and inflammatory cytokines IL-1β and IL-18 are activated through activation of Caspase-1. Production is induced. In the NLRP3 knockout mouse or Caspase-1 knockout mouse, the increase in IgG1 in the blood observed in wild type mice was not observed when immunized with OVA with alum, and the inflamasome did not occur. It is considered that there is a close relationship between the activation of and the adjuvant action (Nature 453: 1122-1126, 2008). In addition, influenza virus activates NLRP3 inflammasome and secretes cytokines IL-1β and IL-18 to the outside of the cell, but the activation is reported to be due to H + channel activity by influenza virus M2 protein. (Nat. Immunol. 11: 404-10, 2010). Since the inactivated influenza vaccine also inactivates the M2 protein, supplementing this with the addition of the NLRP3 inflammasome activator leads to an enhancement of the vaccine effect. From these facts, a substance that activates inflammasome can be an adjuvant substance.
さらに、インターフェロン(IFN)-γは抗ウイルス活性を示すのみならず、ウイルス感染細胞を殺傷するT細胞（CTL)を効率よく生成することが知られている。そこで、樹状細胞に作用し、IFN-γの産生を促進する物質も粘膜ワクチン用アジュバントとして利用可能である。 Furthermore, it is known that interferon (IFN) -γ not only exhibits antiviral activity, but also efficiently generates T cells (CTL) that kill virus-infected cells. Thus, substances that act on dendritic cells and promote IFN-γ production can also be used as adjuvants for mucosal vaccines.
したがって、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、自然抗体の産生を増強する物質又は自然免疫を活性化する物質からなるものである。該物質は、B細胞の自然抗体の産生を増強する物質、IL-5の産生を増強する物質、樹状細胞を活性化する物質、インフラマソームを活性化する物質及びIFN-γ産生を増強する物質からなる群より選ばれる。 Therefore, the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention comprises a substance that enhances the production of natural antibodies or a substance that activates innate immunity. The substance enhances the production of natural antibodies of B cells, the substance that enhances the production of IL-5, the substance that activates dendritic cells, the substance that activates inflammasome, and the production of IFN-γ Selected from the group consisting of
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、実施例で示されるように、B細胞の活性化もしくはIL-5の産生増強により自然抗体（IgM又はIgA）の産生を増強する物質、又は、樹状細胞の活性化、TLRの活性化、インフラマソームの活性化、IFN-γの産生増強により自然免疫を活性化する物質の評価系を構築し、化合物ライブラリーのスクリーニングにより見出されたものであるがこれに限定されない。 As shown in the Examples, the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention is a substance that enhances the production of natural antibodies (IgM or IgA) by activating B cells or enhancing IL-5 production, or dendritic cell It was discovered by screening a compound library by constructing an evaluation system for substances that activate innate immunity through activation, TLR activation, inflammasome activation, and enhanced IFN-γ production. It is not limited to this.
B細胞の自然抗体（IgM又はIgA）の産生を増強する物質としては、ケンフェロール、シネンセチン、ケルセチン、ヘスペリジン、ルチン、モリン、カルミン酸、ロイフォリン、スピラエオシド、ケンフェライドなどのフラボノイド化合物、PP1（CAS Number:172889-26-8；IUPAC名：1-(1,1-Dimethylethyl)-3-(4-methylphenyl)-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine）、PP2（CAS Number: 172889-27-9; IUPAC名：4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(dimethylethyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine）などのSrcファミリーキナーゼ阻害剤、フォルスコリンなどのcAMP誘導剤、PGB1、PGF2αなどのプロスタグランジン類、インゲノール3, 20-ジベンゾエートなどのインゲノール類、12-デオキシホルボール13-アセテート、ホルボール12-ミリステート13-アセテートなどのホルボール化合物、硫酸アトロピン、ロスコビチン、ピフィスリン-α、Cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val]などが挙げられる。好ましくは、ケンフェロール、フォルスコリン、PP2、インゲノール3,20-ベンゾエート、12-デオキシホルボール13-アセテートである。 Substances that enhance the production of natural antibodies (IgM or IgA) in B cells include kaempferol, sinensetin, quercetin, hesperidin, rutin, morin, flavonoid compounds such as carminic acid, leuforin, spiraeoside, kaempferide, PP1 (CAS Number: 172889-26-8; IUPAC name: 1- (1,1-Dimethylethyl) -3- (4-methylphenyl) -1H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-amine), PP2 (CAS Number: 172889 -27-9; IUPAC name: Src family kinase inhibitors such as 4-amino-5- (4-chlorophenyl) -7- (dimethylethyl) pyrazolo [3,4-d] pyrimidine), cAMP inducers such as forskolin , Prostaglandins such as PGB1, PGF2α, ingenols such as ingenol 3, 20-dibenzoate, phorbol compounds such as 12-deoxyphorbol 13-acetate, phorbol 12-myristate 13-acetate, atropine sulfate, roscovitine, Pifthrin-α, Cyclo [ Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val] and the like. Kaempferol, forskolin, PP2, ingenol 3,20-benzoate, 12-deoxyphorbol 13-acetate are preferable.
IL-5の産生を増強する物質としては、ホルボール12-ミリステート13-アセテート、ホルボール12,13-ジブチレート、12-デオキシホルボール13-アセテートなどのホルボール化合物、インゲノール3,20-ジベンゾエートなどのインゲノール類、アンフォテリシンBなどの抗生物質、タキソール（パクリタキセル）、(S)-(-)-プロプラノロール塩酸塩、RHC-80267、W7などが挙げられる。好ましくは、12-デオキシホルボール13-アセテート、インゲノール3,20-ジベンゾエート、アンフォテリシンBである。 Substances that enhance IL-5 production include phorbol compounds such as phorbol 12-myristate 13-acetate, phorbol 12,13-dibutyrate, 12-deoxyphorbol 13-acetate, ingenol 3,20-dibenzoate, etc. Ingenols, antibiotics such as amphotericin B, taxol (paclitaxel), (S)-(−)-propranolol hydrochloride, RHC-80267, W7 and the like. Preferred are 12-deoxyphorbol 13-acetate, ingenol 3,20-dibenzoate and amphotericin B.
樹状細胞を活性化する物質としては、Pam2CSK4、Pam3CSK4及びFSL-1などのTLR2リガンド、LPSなどのTLR4リガンドが挙げられる。好ましくは、Pam3CSK4である。 Examples of substances that activate dendritic cells include TLR2 ligands such as Pam2CSK4, Pam3CSK4 and FSL-1, and TLR4 ligands such as LPS. Pam3CSK4 is preferable.
インフラマソームを活性化する物質としては、アンフォテリシンB、バリノマイシンなどの抗生物質、CITCOなどのCARアゴニストが挙げられる。好ましくは、アンフォテリシンBである。 Substances that activate the inflammasome include antibiotics such as amphotericin B and valinomycin, and CAR agonists such as CITCO. Amphotericin B is preferable.
IFN-γ産生を増強する物質としては、インゲノール3,20-ジベンゾエートなどのインゲノール類、カルミン酸、ロイフォリン、シネセチンなどのフラボノイド化合物、12-デオキシホルボール13-アセテート、ホルボール12,13-ジブチレート、ホルボール12-ミリステート13-アセテートなどのホルボール化合物が挙げられる。好ましくは、インゲノール3,20-ジベンゾエート、12-デオキシホルボール13-アセテート、ホルボール12,13-ジブチレート、ホルボール12-ミリステート13-アセテートである。 Substances that enhance IFN-γ production include ingenols such as ingenol 3,20-dibenzoate, flavonoid compounds such as carminic acid, leifolin, cinecetin, 12-deoxyphorbol 13-acetate, phorbol 12,13-dibutyrate And phorbol compounds such as phorbol 12-myristate 13-acetate. Ingenol 3,20-dibenzoate, 12-deoxyphorbol 13-acetate, phorbol 12,13-dibutyrate, phorbol 12-myristate 13-acetate are preferable.
本発明においては、これらのアジュバントを１種用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。２種以上を組み合わせることにより、単独使用に比べて、相加的又は相乗的なアジュバント効果が発揮されることが期待できる。好ましい組合せとしては、Srcファミリーキナーゼ阻害剤とTLR2リガンド、あるいはIFN-γの産生を増強するインゲノール類とTLR3リガンドが挙げられる。 In the present invention, one type of these adjuvants may be used, or two or more types may be used in combination. By combining two or more kinds, it can be expected that an additive or synergistic adjuvant effect is exerted as compared to single use. Preferred combinations include Src family kinase inhibitors and TLR2 ligands, or ingenols and TLR3 ligands that enhance IFN-γ production.
上記アジュバントは化合物として公知のものであり、市販品を入手可能であり、また、自体公知の製造方法又は精製方法によって製造又は精製してもよい。 The adjuvant is known as a compound, and is commercially available, and may be produced or purified by a production method or purification method known per se.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、粘膜ワクチンとともに補助剤として使用することができる。粘膜ワクチン用補助剤として使用する場合は、通常、粘膜ワクチンと共に、又は前記粘膜ワクチンの投与に前後して、経鼻投与又は経口投与など、慣用的な態様で投与することができる。特に経鼻的に投与するのが好ましい。本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは粘膜ワクチンと共に、通常、液状又は粉末状の形態で、例えば、鼻腔内又は口腔内に滴下、噴霧又はスプレーすることにより投与される。このようにして投与される本発明の粘膜ワクチン用補助剤の剤型としては、例えば、液剤、懸濁剤、粉末剤などが挙げられる。
液剤としては、精製水、緩衝液などに溶解したものなどが挙げられる。懸濁剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、カゼインなどと共に精製水、緩衝液などに懸濁させたものなどが挙げられる。粉末剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどとともによく混合したものなどが挙げられる。これらの製剤には、通常使用されている吸収促進剤、界面活性剤、保存剤、安定化剤、防湿剤、保湿剤、溶解剤などを必要に応じて添加することができる。
The adjuvant for mucosal vaccine of the present invention can be used as an adjuvant together with the mucosal vaccine. When used as an auxiliary agent for mucosal vaccine, it can be administered in a conventional manner such as nasal administration or oral administration, usually together with or before or after administration of the mucosal vaccine. It is particularly preferable to administer nasally. The adjuvant for mucosal vaccine of the present invention is usually administered together with the mucosal vaccine in a liquid or powder form, for example, by dropping, spraying or spraying into the nasal cavity or oral cavity. Examples of the dosage form of the auxiliary agent for mucosal vaccine of the present invention to be administered in this way include liquids, suspensions, powders and the like.
Examples of the liquid agent include those dissolved in purified water, buffer solution and the like. Examples of the suspending agent include those suspended in purified water, buffer solution and the like together with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gelatin, casein and the like. Examples of the powder include those mixed well with methylcellulose, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose and the like. In these preparations, absorption promoters, surfactants, preservatives, stabilizers, moisture-proofing agents, moisturizing agents, solubilizing agents and the like that are usually used can be added as necessary.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントの投与量は、アジュバントの種類、投与対象、投与方法、投与形態等によって適宜決定することができる。投与対象である被験者は、粘膜ワクチンに含まれる抗原物質の種類に応じて適宜決定することができ、例えばヒト及びヒトを除く哺乳動物が挙げられる。ヒトを除く哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、オランウータン、チンパンジー等が挙げられる。本発明の粘膜ワクチン用アジュバントの投与量は、いわゆる当業者により慣用的に決定することができる。 The dosage of the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention can be appropriately determined depending on the type of adjuvant, the subject of administration, the administration method, the dosage form, and the like. The subject to be administered can be appropriately determined according to the type of antigenic substance contained in the mucosal vaccine, and examples thereof include humans and mammals other than humans. Examples of mammals other than humans include mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, pig, cow, goat, horse, sheep, dog, cat, monkey, orangutan, chimpanzee and the like. The dose of the mucosal vaccine adjuvant of the present invention can be routinely determined by a so-called person skilled in the art.
ここで、粘膜ワクチンとは、経粘膜感染病原体由来の抗原を含み、粘膜免疫システムを利用したワクチンをいい、いわゆる当業者が用いる一般的な意味で定義される。本発明の粘膜ワクチンに含まれる抗原は、経粘膜感染病原体由来であればよく特に限定されないが、天然物由来であっても良いし、遺伝子組換等の手法により人為的に作製されたものであっても良い。経粘膜感染病原体は特に限定されないが、ウイルス又は病原菌が挙げられる。 Here, the mucosal vaccine refers to a vaccine containing an antigen derived from a transmucosal infectious agent and utilizing a mucosal immune system, and is defined in a general sense used by a person skilled in the art. The antigen contained in the mucosal vaccine of the present invention is not particularly limited as long as it is derived from a transmucosal infectious agent, but may be derived from a natural product or artificially prepared by a technique such as gene recombination. There may be. The transmucosal infectious agent is not particularly limited, and examples thereof include viruses and pathogenic bacteria.
ウイルスとしては、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、重症急性呼吸器感染症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトパピローマウイルス、風疹ウイルスなどが挙げられ、好ましくはインフルエンザウイルス又はヒト免疫不全ウイルスであり、最も好適にはインフルエンザウイルスである。 As viruses, varicella virus, measles virus, mumps virus, polio virus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, herpes virus, severe acute respiratory infection syndrome (SARS) virus, human immunodeficiency virus (HIV), human papilloma virus, Examples include rubella virus and the like, preferably influenza virus or human immunodeficiency virus, and most preferably influenza virus.
病原菌としては、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎球菌、結核菌、コレラ菌、ジフテリア菌などが挙げられる。 Examples of pathogenic bacteria include Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, influenza b type bacteria, pneumococci, tuberculosis bacteria, cholera bacteria, and diphtheria bacteria.
経粘膜感染病原体由来の抗原は、安全性の観点から、上記ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原であることが望ましい。 The antigen derived from a transmucosal infectious agent is preferably an inactivated antigen derived from the above virus or pathogen from the viewpoint of safety.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、経粘膜感染病原体由来の抗原を含む粘膜ワクチンと共に投与した場合、自然抗体及び抗原特異的IgA抗体を分泌させ得る。 The adjuvant for mucosal vaccines of the present invention can secrete natural antibodies and antigen-specific IgA antibodies when administered together with mucosal vaccines containing antigens derived from transmucosal infectious agents.
粘膜ワクチンに含まれる抗原の量は、抗原特異的分泌型IgAを産生するのに十分な量であれば特に限定されるものではなく、併用するアジュバントとの比率も勘案して適宜設定することができる。例えば、抗原としてインフルエンザウイルスのＨＡサブユニット抗原を用いた場合、その濃度が10〜500 μg HA/mL（HA換算）であることが好ましく、30〜400 μg HA/mL （HA換算）がより好ましい。前記濃度は、HAタンパク質の濃度を一元放射免疫拡散試験法やHA含量法などの、WHOや国の基準で定められた試験法で測定することにより得られる値である。 The amount of antigen contained in the mucosal vaccine is not particularly limited as long as it is sufficient to produce antigen-specific secretory IgA, and may be set as appropriate in consideration of the ratio with the adjuvant used together. it can. For example, when an influenza virus HA subunit antigen is used as the antigen, the concentration is preferably 10 to 500 μg HA / mL (HA equivalent), more preferably 30 to 400 μg HA / mL (HA equivalent). . The concentration is a value obtained by measuring the concentration of HA protein by a test method defined by WHO or national standards, such as a one-way radioimmunodiffusion test method or HA content method.
粘膜ワクチン用アジュバントは、分泌型IgAを産生するに十分な濃度で存在する。 そのような濃度は、アジュバントの種類などによって変動するが、当業者により慣用的に決定することができる。 The mucosal vaccine adjuvant is present at a concentration sufficient to produce secretory IgA. Such concentration varies depending on the type of adjuvant and the like, but can be routinely determined by those skilled in the art.
ワクチン組成物
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、粘膜ワクチンと組み合わせて用いるために、ウイルス又は病原菌由来の不活化抗原と、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントの少なくとも１種とを含有し、粘膜投与されるワクチン組成物の剤形とすることができ、かかる組成物を提供する。本発明のワクチン組成物に含まれる不活化抗原と粘膜ワクチン用アジュバントとの重量比は、1：1〜1：50が推奨される。
Vaccine Composition The mucosal vaccine adjuvant of the present invention contains an inactivated antigen derived from a virus or a pathogen and at least one mucosal vaccine adjuvant of the present invention for use in combination with a mucosal vaccine, and is administered to the mucosa. A vaccine composition dosage form is provided, and such a composition is provided. The weight ratio between the inactivated antigen and the mucosal vaccine adjuvant contained in the vaccine composition of the present invention is recommended to be 1: 1 to 1:50.
本発明のワクチン組成物は、基本的には、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントとウイルス又は病原菌由来の不活化抗原とを液状又は粉末状の形態で、粘膜上に滴下、噴霧又はスプレーすることにより投与される。本発明のワクチン組成物の剤型としては、例えば、液剤、懸濁剤、粉末剤などが挙げられる。液剤、懸濁剤、粉末剤の製剤については、粘膜ワクチン用アジュバントについて上述した通りである。 The vaccine composition of the present invention is basically obtained by dripping, spraying or spraying the mucosal vaccine adjuvant of the present invention and an inactivated antigen derived from a virus or pathogen on the mucous membrane in a liquid or powder form. Be administered. Examples of the dosage form of the vaccine composition of the present invention include solutions, suspensions, powders and the like. The liquid, suspension, and powder preparations are as described above for the adjuvant for mucosal vaccine.
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further in detail, this invention is not limited at all by these examples.
実施例１：B-1細胞による自然抗体産生を増強する物質
BCL1細胞は、BALB/cマウスに放射線照射して自然発症した慢性 B 白血病細胞株であり、B-1a細胞と同様の細胞表面抗原を発現し、IL-5やLPS に応答してIgM産生細胞に分化する。このBCL1細胞を用いて、B-1細胞の自然抗体産生を増強する物質を粘膜ワクチン用アジュバントとしてスクリーニングした。市販の天然物ライブラリー（Natural Products Library、BioMol社）及び生理活性物質ライブラリー（ICCB Known Bioactives Library、BioMol社）から選択した化合物について、下記の方法でIgM産生増強効果を調べた。
BALB/cマウスに BCL1 細胞（1×105個）を腹腔内投与し、約1ヶ月後に脾臓を採取して細胞を凍結保存した。凍結保存細胞を融解し、ビオチン化抗マウスThy1.2抗体、抗マウスCD4及びCD8 抗体を作用させた後にストレプトアビジン結合磁気ビーズを作用させ、磁気細胞分離装置（IMagシステム）で磁気ビーズに結合したT細胞を除き実験に使用した（80-90%がCD5+ CD19+ BCL1細胞）。このBCL1細胞（1.5×105個/200 μl）を化合物単独（1 μM、0.1 μM又は500 ng/ml）、化合物とIL-5（1 ng/ml）、又は化合物とLPS（1 μg/ml）の組み合わせで培養した。3日後の培養上清中のIgM抗体をELISA法で測定した。
Natural Products Libraryからは、単独でIgM抗体産生を増強する物質として、インゲノール3, 20-ジベンゾエート及び12-デオキシホルボール13-アセテートを見出した。さらに、LPSとの共培養でIgM抗体産生を増強する物質として、フォルスコリン、ケンフェロール、及びカルミン酸を見出した。IL-5との共培養でIgM抗体産生を増強する物質として、硫酸アトロピン、フォルスコリン、及びロイフォリンを見出した。
ICCB Known Bioactives Libraryからは、単独でIgM 抗体産生を増強する物質として、ホルボール12-ミリステート13-アセテートを見出した。さらに、LPS との共培養でIgM 抗体産生を増強する物質として、ピフィスリン-α、Cyclo[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val]及びSrcファミリーキナーゼ阻害剤のPP1、PP2を見出した。また、IL-5 との共培養でIgM 抗体産生を増強する物質として、ロスコビチン、Srcファミリーキナーゼ阻害剤のPP1及びPP2を見出した。
Example 1: Substance that enhances natural antibody production by B-1 cells
BCL1 cells are a chronic B leukemia cell line that spontaneously develops after irradiation of BALB / c mice, express cell surface antigens similar to B-1a cells, and respond to IL-5 and LPS with IgM-producing cells To differentiate. Using this BCL1 cell, a substance that enhances natural antibody production of B-1 cells was screened as an adjuvant for mucosal vaccine. With respect to compounds selected from a commercially available natural product library (Natural Products Library, BioMol) and a bioactive substance library (ICCB Known Bioactives Library, BioMol), the IgM production enhancing effect was examined by the following method.
BCL1 cells (1 × 10 5 cells) were intraperitoneally administered to BALB / c mice, and after about 1 month, the spleen was collected and the cells were stored frozen. Cryopreserved cells were thawed, biotinylated anti-mouse Thy1.2 antibody, anti-mouse CD4 and CD8 antibodies were allowed to act, then streptavidin-conjugated magnetic beads were allowed to act, and were bound to magnetic beads using a magnetic cell separator (IMag system) T cells were used for experiments (80-90% were CD5 + CD19 + BCL1 cells). This BCL1 cell (1.5 × 10 5 cells / 200 μl) is compounded alone (1 μM, 0.1 μM or 500 ng / ml), compound and IL-5 (1 ng / ml), or compound and LPS (1 μg / ml) ). The IgM antibody in the culture supernatant after 3 days was measured by ELISA.
From the Natural Products Library, ingenol 3, 20-dibenzoate and 12-deoxyphorbol 13-acetate were found as substances that alone enhance IgM antibody production. Furthermore, forskolin, kaempferol, and carminic acid were found as substances that enhance IgM antibody production in co-culture with LPS. As substances that enhance IgM antibody production in co-culture with IL-5, atropine sulfate, forskolin and leuforin were found.
From the ICCB Known Bioactives Library, phorbol 12-myristate 13-acetate was found as a substance that alone enhances IgM antibody production. Furthermore, as a substance that enhances IgM antibody production by co-culture with LPS, we discovered pifthrin-α, Cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val], and Src family kinase inhibitors PP1 and PP2. In addition, roscovitine and Src family kinase inhibitors PP1 and PP2 were found as substances that enhance IgM antibody production in co-culture with IL-5.
実施例２：B-2細胞のIgA産生を増強する物質
Natural Products Library及びICCB Known Bioactives Libraryから選択した化合物についてIgA産生増強作用を調べた。B-2細胞はBALB/cマウス（7〜9週令、雌性）から採取した脾臓細胞をビオチン標識抗マウスCD43抗体で標識し、ストレプトアビジンがラベルされた磁気ビーズに吸着させ、IMagシステムによりCD43陰性細胞を採取した。この細胞をB-2細胞（純度約95%）として、以下の実験に使用した。
B-2細胞を用いたIgA産生評価系は、LPSとTGF-β又はレチノイン酸（retinoic acid; RA）との共刺激によりB-2細胞にIgAクラススイッチ組換えが誘導され、さらにIL-5刺激により抗体産生量が増大するという知見（J Exp Med 170: 1415-1420, 1989; Cell Immunol 166:247-253, 1995）に基づいて構築した。さらに、poly(I:C)及びIL-5存在下、RAの濃度依存的にIgA産生が誘導されることを見出し、LPS刺激系と同様の条件検討を行うことでpoly(I:C)刺激によるIgA産生評価系を構築した。
LPS刺激系では、10% FBS、100 U/mlのペニシリン、0.1 mg/mlのストレプトマイシン及び55 μMの2-メルカプトエタノールを含むPRMI 1640培地中、TGF-β0.1 ng/ml又はRA 1 nMの存在下及び非存在下、LPS 2 μg/ml、IL-5 1 ng/ml及びライブラリーから選択した化合物（2、10 μM）を添加し、96ウェル丸底培養プレートに2.0×105cells/wellとなるように細胞を播種した。7日間培養の後、培養上清中のIgA濃度をELISA法により測定した。陽性対照としてライブラリーから選択した化合物の代わりにコレラトキシン（1 ng/ml: cholera toxin; CT）による処置群を設けた。
Poly(I:C)刺激系では、B-2細胞にpoly(I:C) 5 μg/ml、IL-5 5 ng/ml、RA 1 nM及びライブラリーから選択した化合物（2、10 μM）を添加し、96ウェル平底培養プレートを用いて同様に7日間培養し、培養上清中のIgA濃度をELISA法で測定した。
Natural Products Libraryからは、LPS刺激評価系では、LPS/IL-5系、LPS/TGF-β/IL-5系及びLPS/RA/IL-5系のすべての系においてIgA産生を増強する物質として、フォルスコリン、プロスタグランジン(PG) B1及びPGF2α、フラボノイド化合物であるケンフェロールを見出した。また、2つの系においてIgA産生を増強する物質として、フラボノイド化合物であるシネンセチン、ケルセチン、及びへスペリジンを、LPS/RA/IL-5系においてIgA産生を増強する物質として、ルチンを見出した。
Poly(I:C)刺激評価系にてIgA産生を増強する化合物として、ケンフェロール、モリン、スピラエオシド、ケンフェライドを見出した。
ICCB Known Bioactives Libraryからは、poly(I:C)刺激評価系にてIgA産生を増強する化合物として、Srcファミリーキナーゼ阻害剤であるPP1及びPP2を見出した。
Example 2: Substance that enhances IgA production in B-2 cells
The compounds selected from Natural Products Library and ICCB Known Bioactives Library were examined for IgA production enhancing action. For B-2 cells, spleen cells collected from BALB / c mice (7-9 weeks old, female) were labeled with biotin-labeled anti-mouse CD43 antibody, adsorbed on magnetic beads labeled with streptavidin, and CD43 was detected by IMag system. Negative cells were collected. These cells were used as B-2 cells (purity of about 95%) for the following experiments.
In the IgA production evaluation system using B-2 cells, IgA class switch recombination is induced in B-2 cells by costimulation with LPS and TGF-β or retinoic acid (RA). It was constructed based on the finding that antibody production increases upon stimulation (J Exp Med 170: 1415-1420, 1989; Cell Immunol 166: 247-253, 1995). Furthermore, in the presence of poly (I: C) and IL-5, it was found that IgA production was induced in a concentration-dependent manner with RA, and poly (I: C) stimulation was performed by examining the same conditions as the LPS stimulation system An IgA production evaluation system was constructed.
In the LPS stimulation system, TGF-β 0.1 ng / ml or RA 1 nM in PRMI 1640 medium containing 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin and 55 μM 2-mercaptoethanol. In the presence and absence, LPS 2 μg / ml, IL-5 1 ng / ml and a compound selected from the library (2, 10 μM) were added and added to a 96-well round bottom culture plate at 2.0 × 10 5 cells / Cells were seeded to be well. After culturing for 7 days, the IgA concentration in the culture supernatant was measured by ELISA. As a positive control, a treatment group with cholera toxin (1 ng / ml: cholera toxin; CT) was provided instead of the compound selected from the library.
In the Poly (I: C) stimulation system, B-2 cells have poly (I: C) 5 μg / ml, IL-5 5 ng / ml, RA 1 nM and compounds selected from the library (2, 10 μM) Was added and cultured in a 96-well flat-bottom culture plate for 7 days in the same manner, and the IgA concentration in the culture supernatant was measured by ELISA.
From the Natural Products Library, the LPS stimulation evaluation system is a substance that enhances IgA production in all systems LPS / IL-5, LPS / TGF-β / IL-5 and LPS / RA / IL-5. Forskolin, prostaglandin (PG) B1 and PGF2α, kaempferol, a flavonoid compound, was found. In addition, the flavonoid compounds sinensetin, quercetin, and hesperidin were found as substances that enhance IgA production in the two systems, and rutin was found as a substance that enhances IgA production in the LPS / RA / IL-5 system.
Kaempferol, morin, spiraeoside, and kaempferide were found as compounds that enhance IgA production in the Poly (I: C) stimulation evaluation system.
From the ICCB Known Bioactives Library, PP1 and PP2 which are Src family kinase inhibitors were found as compounds which enhance IgA production in a poly (I: C) stimulation evaluation system.
実施例３：IL-5産生を増強する物質
IL-5産生自然リンパ球は肺組織に最も多く存在する。そこで、IL-5遺伝子が蛍光タンパク質Venusの遺伝子に置換されたIL-5/Venusノックインマウス（J. Immunol. 188:703-713, 2012）から採取した肺組織細胞に化合物を添加し、IL-5産生細胞の増加の程度をフローサイトメトリー法により検出する評価系を構築した。この評価系を用い、Natural Products Library及びICCB Known Bioactives Libraryから選択した化合物について、下記の方法でIL-5産生の増強効果を調べた。
IL-5/Venusノックインマウスの肺全葉を採取後、ミンスし、1 mlのRPMI1640に10%FCS、1 mg/mlコラゲナーゼA、100 μg/ml DNase Iを加えた培養液で、37℃、30分間CO2インキュベーターで培養した。その後70 μmのメッシュに通したものを肺組織細胞懸濁液とした。得られた肺組織細胞2×105個を平底96ウェルプレートに撒き、ライブラリーから選択した化合物（10 μM）を添加し、4日間培養した。培養液はRPMI1640に10%FCS、50 μM 2-ME、100 U/mlペニシリン、0.1 mg/mlストレプトマイシンを加えたものを用いた。陰性コントロールとして0.1% DMSOを、陽性コントロールとして培養液にrIL-33（10 ng/ml）を加えたウェルを用意した。4日後、フローサイトメーターでVenusの発現量を測定した。細胞毒性による細胞死は、7AAD（7-Amino-Actinomycin D）によって評価した。
陰性コントロールでは約0.7%のVenus陽性細胞が、陽性コントロールでは約8%（陰性コントロールの11.4倍）のVenus陽性細胞が検出された。陰性コントロールを1とし、陰性コントロールに比べて1.5倍以上のVenus陽性細胞が検出された物質を、以下の表1、２にまとめる。
Example 3: Substance that enhances IL-5 production
IL-5 producing natural lymphocytes are most abundant in lung tissue. Therefore, a compound was added to lung tissue cells collected from IL-5 / Venus knock-in mice (J. Immunol. 188: 703-713, 2012) in which the IL-5 gene was replaced with the gene for the fluorescent protein Venus. An evaluation system for detecting the degree of increase of 5 producing cells by flow cytometry was constructed. Using this evaluation system, the IL-5 production enhancement effect was examined for the compounds selected from the Natural Products Library and the ICCB Known Bioactives Library by the following method.
After collecting all lungs of IL-5 / Venus knock-in mice, mince, and add 1% RPMI1640 with 10% FCS, 1 mg / ml collagenase A, 100 μg / ml DNase I at 37 ° C. Incubated for 30 minutes in a CO 2 incubator. Then, the one passed through a 70 μm mesh was used as a lung tissue cell suspension. 2 × 10 5 lung tissue cells obtained were seeded in a flat bottom 96-well plate, a compound selected from the library (10 μM) was added, and the cells were cultured for 4 days. The culture solution was RPMI1640 supplemented with 10% FCS, 50 μM 2-ME, 100 U / ml penicillin, 0.1 mg / ml streptomycin. Wells were prepared in which 0.1% DMSO was added as a negative control, and rIL-33 (10 ng / ml) was added to the culture medium as a positive control. Four days later, the expression level of Venus was measured with a flow cytometer. Cell death due to cytotoxicity was evaluated by 7AAD (7-Amino-Actinomycin D).
About 0.7% of Venus positive cells were detected in the negative control, and about 8% (11.4 times the negative control) of Venus positive cells were detected in the positive control. Substances in which Venus positive cells of 1.5 times or more compared to the negative control are detected are shown in Tables 1 and 2 below.
実施例４：樹状細胞の活性化を介したIgA産生を増強する物質
スクリーニング物質としてNatural Product LibraryとICCB Known Bioactives Libraryから選択した化合物あるいはTLRリガンドを用いた。BALB/cマウス大腿骨及び脛骨より骨髄細胞を採取し、ACK処理にて赤血球を除去した細胞浮遊液を得た。24 ウェルプレートに 1×106cells/mLで100 ng/mL FLT3リガンドを添加したRPMI1640培地にて７日間培養し、骨髄由来樹状細胞（BMDC）を誘導した。また、BALB/cマウスの脾臓からIMagシステムを利用した細胞分離によりT細胞と樹状細胞を除去したThy1.2陰性CD11c陰性B細胞を単離した。2×105 cells/wellのB細胞に対し、5×104 cells/wellの樹状細胞を加え1 ng/mLのIL-5存在下、ライブラリーから選択した化合物あるいはTLRリガンドで刺激して７日間培養し、培養上清中のIgAをELISA法で測定した。
その結果、TLR2リガンドのPam2CSK4、Pam3CSK4及びFSL-1又はTLR4リガンドのLPSが、B細胞のみと比較し樹状細胞とB細胞との共培養でより多くのIgA産生を誘導した。
Example 4: Substance that enhances IgA production through activation of dendritic cells A compound selected from the Natural Product Library and the ICCB Known Bioactives Library or a TLR ligand was used as a screening substance. Bone marrow cells were collected from the femur and tibia of BALB / c mice, and a cell suspension from which red blood cells were removed by ACK treatment was obtained. Cultured in RPMI1640 medium supplemented with 100 ng / mL FLT3 ligand at 1 × 10 6 cells / mL in a 24-well plate for 7 days to induce bone marrow-derived dendritic cells (BMDC). In addition, Thy1.2 negative CD11c negative B cells from which T cells and dendritic cells were removed were isolated from BALB / c mouse spleens by IMag system. Add 2 × 10 4 cells / well dendritic cells to 2 × 10 5 cells / well B cells and stimulate with a compound selected from the library or TLR ligand in the presence of 1 ng / mL IL-5. After culturing for 7 days, IgA in the culture supernatant was measured by ELISA.
As a result, TLR2 ligands Pam2CSK4, Pam3CSK4 and FSL-1 or TLR4 ligand LPS induced more IgA production in co-culture of dendritic cells and B cells compared to B cells alone.
実施例５：TLR4、TLR7、及びTLR9を活性化する物質
TLR4/MD-2又はTLR7、TLR9を強発現させたBa/F3細胞株に、さらに緑色蛍光タンパク（GFP）のプロモーター部位にNF-κB結合部位を持つプラスミドをトランスフェクトしたBa/F3細胞株を使用した。これらの細胞を96ウェルプレートに1×105 cells/well で播種し、スクリーニング物質としてNatural Product Library及びICCB Known Bioactives Library から選択した化合物を添加し、37℃、5% CO2下で培養した。培養18時間後、細胞を回収し、フローサイトメトリーを用いてNF-κBの活性化をGFPの発現でモニターすることで候補物質のTLR活性化作用を検討した。陰性コントロールと比較して、GFPの発現強度が増加したものを陽性とした。
また、上記試験により、TLR4活性化効果を認めた化合物については、TLR4の反応を阻害する抗マウスTLR4/MD-2モノクローナル抗体（クローンMTS510）を20 μg/mlで30分間前処置した後に候補化合物を添加し、TLR4に対する特異性を検証した。
TLR4の活性化については、タキソールに有効性を認めた。
Example 5: Substances that activate TLR4, TLR7, and TLR9
A Ba / F3 cell line in which TLR4 / MD-2 or TLR7 or TLR9 is strongly expressed and a plasmid having an NF-κB binding site in the promoter region of green fluorescent protein (GFP) is further transfected. used. These cells were seeded in a 96-well plate at 1 × 10 5 cells / well, compounds selected from the Natural Product Library and ICCB Known Bioactives Library were added as screening substances, and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 . After 18 hours of culture, the cells were collected, and the activation of NF-κB was monitored by the expression of GFP using flow cytometry to examine the TLR activation action of the candidate substance. Those in which the expression intensity of GFP increased compared to the negative control was regarded as positive.
In addition, for compounds that showed TLR4 activation by the above test, candidate compounds were prepared after pretreatment with anti-mouse TLR4 / MD-2 monoclonal antibody (clone MTS510) that inhibits TLR4 reaction at 20 μg / ml for 30 minutes. Was added to verify specificity for TLR4.
Taxol was found to be effective for TLR4 activation.
実施例６：インフラマソームを活性化する物質
スクリーニング物質としてNatural Product LibraryとICCB Known Bioactives Libraryから選択した化合物を用いた。マウス骨髄由来マクロファージを96ウェルプレートに1×105 cells/well で播種し、37℃、5% CO2下で2時間培養することで細胞をウェルに接着させた。その後、IL-1β産生のpriming stepとしてLPSを1 μg/ml添加した。3時間培養後、細胞をPBSで2回洗浄した後、ライブラリーから選択した化合物を添加した。16時間培養後、上清を回収し、上清中のIL-1β量をELISA法で測定した。また、陽性コントロールとしてライブラリーから選択した化合物の代わりにATP 2 mMを添加し、ATPによって誘導されるIL-1β産生量の1/4以上認められたものを陽性と判定した。
スクリーニングの結果、抗生物質であるアンフォテリシンB、バリノマイシン及びCITCOがIL-1βの産生を誘導した。濃度依存性を検討したところ、アンフォテリシンBは10 μMで産生が強く認められ、30 μMに濃度を上げてもそれ以上の増加は認められなかった。バリノマイシンは1、5 μg/mlで濃度依存的にIL-1βの産生を増強し、25 μg/mlではそれ以上の増加は認められなかった。CITCOは1、5、25 μg/mlで濃度依存的にIL-1βの産生を増強した。
Example 6: Substance that activates inflammasome A compound selected from the Natural Product Library and the ICCB Known Bioactives Library was used as a screening substance. Mouse bone marrow-derived macrophages were seeded in a 96-well plate at 1 × 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 hours to adhere the cells to the wells. Thereafter, 1 μg / ml of LPS was added as a priming step for IL-1β production. After culturing for 3 hours, the cells were washed twice with PBS, and then a compound selected from the library was added. After culturing for 16 hours, the supernatant was collected, and the amount of IL-1β in the supernatant was measured by ELISA. Further, as a positive control, ATP 2 mM was added instead of the compound selected from the library, and those in which 1/4 or more of the IL-1β production induced by ATP was observed were determined to be positive.
As a result of the screening, the antibiotics amphotericin B, valinomycin and CITCO induced the production of IL-1β. When concentration dependency was examined, amphotericin B was strongly produced at 10 μM, and no further increase was observed even when the concentration was increased to 30 μM. Valinomycin enhanced IL-1β production in a concentration-dependent manner at 1 and 5 μg / ml, and no further increase was observed at 25 μg / ml. CITCO enhanced IL-1β production in a concentration-dependent manner at 1, 5, and 25 μg / ml.
実施例７：IFN-γ産生を増強する物質
IFN-γは活性化T細胞やNK 細胞から分泌されるサイトカインで様々な免疫応答や炎症反応を調節する。IFN-γは Th1 応答を誘導するだけでなく抗腫瘍活性や抗ウイルス活性を持つことも知られている。結核菌が分泌する蛋白のひとつであるAg85Bは、マウスとヒトでTh1応答を誘導できる。マウスのAg85B 特異的Th1が認識する主なエピトープはPeptide-25（P25）である。そこで、P25特異的T細胞受容体（TCR）を発現させたトランスジェニックマウス（P25 TCR-Tg）の脾臓細胞をP25で刺激し、P25単独よりもIFN-γ産生を増強する天然物をスクリーニングした。スクリーニング物質としてNatural Product LibraryとICCB Known Bioactives Libraryから選択した化合物を用いた。
P25 TCR-Tg脾臓細胞（5×105個/ml）をP25（10 μg/ml）とライブラリーから選択した化合物（10 μM又は10 μg/ml）で刺激し、200 μlずつ96ウェルプレートで培養した。一部の化合物は0.1 - 10 μM 又は0.1 - 10 μg/mlでも刺激した。刺激後3日目に培養上清を採取し、ELISA法を用いて培養上清中のIFN-γを測定した。P25 + 化合物の値 = A、P25のみの値 = B、未刺激の値 = Cとして、（A - C）／（B - C）= 1.3以上を増強と判定した。
その結果、P25によるIFN-γ産生を増強させる化合物として、インゲノール3,20-ジベンゾエート、12-デオキシホルボール13-アセテート、カルミン酸、ロイフォリン、シネンセチン、ホルボール12,13-ジブチレート、ホルボール12-ミリステート13-アセテートを見出した。
また、IFN-γを増強した物質について、卵白アルブミン（ovalbumin, OVA）を腫瘍代理抗原として用い、OVA 特異的細胞傷害（CTL）活性を増強できるかどうか検討した。
P25 TCR-Tg脾臓細胞より、CD4 T細胞（P25 CD4+ T細胞）を精製し、C57BL/6マウス脾臓細胞より抗原提示細胞（APC）を精製した。精製したP25 CD4+ T細胞, APC, P25, OVA, ライブラリーから選択した化合物の混和物（200 μl）を96ウェルプレートで一晩培養し、洗浄後10-5 % グルタールアルデヒド溶液で処理してさらに洗浄した。一方、OT-I Tg (OVA特異的TCR Tg)の脾臓細胞より精製したCD8+ T細胞をCFSEでラベルし、洗浄後CFSE-OT-I CD8+ T細胞として使用した。グルタールアルデヒド処理した細胞にCFSE-OT-I CD8+ T細胞を加えて3日間培養した。3日後にCFSE-OT-I CD8+ T細胞のCFSEの輝度をFACS解析して、細胞の増殖を測定し、CTL 活性の有無を判定した。
その結果、OVA特異的CTL活性を強く増強する物質として、インゲノール類のインゲノール3,20-ジベンゾエート及び、ホルボールエステル類の12-デオキシホルボール13-アセテート、ホルボール12,13-ジブチレート、ホルボール12-ミリステート13-アセテートを見出した。
Example 7: Substance that enhances IFN-γ production
IFN-γ is a cytokine secreted from activated T cells and NK cells and regulates various immune and inflammatory responses. IFN-γ is known not only to induce Th1 response but also to have antitumor and antiviral activities. Ag85B, a protein secreted by Mycobacterium tuberculosis, can induce a Th1 response in mice and humans. The major epitope recognized by mouse Ag85B-specific Th1 is Peptide-25 (P25). Therefore, spleen cells of transgenic mice (P25 TCR-Tg) expressing P25-specific T cell receptor (TCR) were stimulated with P25 and screened for natural products that enhanced IFN-γ production over P25 alone. . As screening substances, compounds selected from the Natural Product Library and the ICCB Known Bioactives Library were used.
P25 TCR-Tg spleen cells (5 × 10 5 cells / ml) were stimulated with P25 (10 μg / ml) and a compound selected from the library (10 μM or 10 μg / ml) and 200 μl each in a 96-well plate Cultured. Some compounds were also stimulated with 0.1-10 μM or 0.1-10 μg / ml. On the third day after stimulation, the culture supernatant was collected, and IFN-γ in the culture supernatant was measured using ELISA. Assuming that the value of P25 + compound = A, the value of P25 only = B, and the value of unstimulated = C, (A−C) / (B−C) = 1.3 or more was determined to be enhancement.
As a result, as compounds that enhance IFN-γ production by P25, ingenol 3,20-dibenzoate, 12-deoxyphorbol 13-acetate, carminic acid, reifolin, sinensetin, phorbol 12,13-dibutyrate, phorbol 12- I found myristate 13-acetate.
Moreover, about the substance which enhanced IFN-gamma, using ovalbumin (Ovalbumin, OVA) as a tumor surrogate antigen, it was examined whether OVA specific cytotoxicity (CTL) activity could be enhanced.
CD4 T cells (P25 CD4 + T cells) were purified from P25 TCR-Tg spleen cells, and antigen-presenting cells (APC) were purified from C57BL / 6 mouse spleen cells. A mixture of purified P25 CD4 + T cells, APC, P25, OVA, and a library selected from the library (200 μl) is incubated overnight in a 96-well plate, washed and treated with 10-5% glutaraldehyde solution. Further washing was performed. On the other hand, CD8 + T cells purified from spleen cells of OT-I Tg (OVA-specific TCR Tg) were labeled with CFSE, washed and used as CFSE-OT-I CD8 + T cells. CFSE-OT-I CD8 + T cells were added to the glutaraldehyde-treated cells and cultured for 3 days. Three days later, the brightness of CFSE of CFSE-OT-I CD8 + T cells was analyzed by FACS, the proliferation of the cells was measured, and the presence or absence of CTL activity was determined.
As a result, ingenols such as ingenol 3,20-dibenzoate and phorbol esters 12-deoxyphorbol 13-acetate, phorbol 12,13-dibutyrate, phorbol as substances that strongly enhance OVA-specific CTL activity. We found 12-myristate 13-acetate.
実施例８：Pam3CSK4のin vivoにおけるIgA産生誘導能の評価
BALB/cマウス（7〜8週令、雌性）に、インフルエンザHAタンパク質抗原ワクチン（A/California/7/2009 (H1N1)）（一般財団法人 阪大微生物病研究会製）1 μgを、アジュバントとして10 μgのPam3CSK4とともにマウスの鼻に13 μL（片鼻に6.5 μLずつ）接種し、その2週間後、同量のワクチンとアジュバントを経鼻接種した。さらに、2週間後、鼻腔洗浄液、血漿を回収し、鼻腔洗浄液中のワクチン抗原に特異的なIgA及び血漿中のワクチン抗原に特異的なIgGをELISA法により測定した。その結果、図１で示すようにPam3CSK4 10 μgにより鼻腔洗浄液中に顕著にIgAが誘導された。また、図２で示すように血漿中のIgGも顕著に誘導された。
Example 8: Evaluation of the ability of Pam3CSK4 to induce IgA production in vivo
BALB / c mice (7-8 weeks old, female) with 1 μg of influenza HA protein antigen vaccine (A / California / 7/2009 (H1N1)) (general foundation of Osaka University Microbial Disease Research Association) as an adjuvant Mice were inoculated with 13 μL (10 μg of Pam3CSK4) into the nose (6.5 μL per nose), and two weeks later, the same amount of vaccine and adjuvant were inoculated intranasally. Further, two weeks later, nasal lavage fluid and plasma were collected, and IgA specific to vaccine antigen in nasal lavage fluid and IgG specific to vaccine antigen in plasma were measured by ELISA. As a result, as shown in FIG. 1, IgA was remarkably induced in the nasal wash with 10 μg of Pam3CSK4. Further, as shown in FIG. 2, IgG in plasma was also significantly induced.
実施例９：Pam3CSK4とPP2の併用でのin vivoにおけるIgA産生誘導能の評価
BALB/cマウス（7〜8週令、雌性）に、インフルエンザHAタンパク質抗原ワクチン（A/California/7/2009 (H1N1)）1μgを、アジュバントとしてPam3CSK4 10 μg及びPP2 1.3 nmolとともにマウスの鼻に13 μL （片鼻に6.5 μLずつ）接種し、その2週間後、同量のワクチンとアジュバントを経鼻接種した。さらに、2週間後、鼻腔洗浄液、血漿を回収し、鼻腔洗浄液中のワクチン抗原に特異的なIgA及び血漿中のワクチン抗原に特異的なIgGをELISA法により測定した。IgA産生の結果を図１にIgG産生の結果を図２に示す。
粘膜ワクチン用アジュバントとして、PP2とPam3CSK4とを併用した群では、鼻腔粘膜上に誘導されたワクチン抗原特異的なIgA量は、ワクチン単独あるいはPam3CSK4処置群と比較すると、有意に増加した。PP2の併用により、血漿中のIgGもPam3CSK4処置群と比較して増加する傾向にあった。このことから、候補となるアジュバント物質の組合せを検討することにより、より効果的にIgA産生を誘導する粘膜ワクチン用アジュバントを得られる可能性が示唆された。
Example 9: Evaluation of the ability to induce IgA production in vivo with a combination of Pam3CSK4 and PP2
BALB / c mice (7-8 weeks old, female), 1 μg of influenza HA protein antigen vaccine (A / California / 7/2009 (H1N1)), 13 μg of Pam3CSK4 and PP2 1.3 nmol as adjuvants in the nose of mice μL (6.5 μL per nose) was inoculated, and two weeks later, the same amount of vaccine and adjuvant were inoculated intranasally. Further, two weeks later, nasal lavage fluid and plasma were collected, and IgA specific to vaccine antigen in nasal lavage fluid and IgG specific to vaccine antigen in plasma were measured by ELISA. The results of IgA production are shown in FIG. 1, and the results of IgG production are shown in FIG.
In the group using PP2 and Pam3CSK4 in combination as an adjuvant for mucosal vaccine, the amount of vaccine antigen-specific IgA induced on the nasal mucosa was significantly increased compared to the vaccine alone or Pam3CSK4 treatment group. With the combined use of PP2, plasma IgG also tended to increase compared to the Pam3CSK4-treated group. This suggests the possibility of obtaining an adjuvant for mucosal vaccine that induces IgA production more effectively by examining combinations of candidate adjuvant substances.
実施例１０：インゲノール3,20-ジベンゾエートのin vivoにおけるIgA産生誘導能の評価
BALB/cマウス（7〜8週令、雌性）に、インフルエンザHAタンパク質抗原ワクチン（A/California/7/2009 (H1N1)）1 μgを、アジュバントとしてインゲノール3,20-ジベンゾエート 0.13 nmol、又はインゲノール3,20-ジベンゾエート 0.13 nmolとpoly(I:C) 1 μgとを混合したものとともにマウスの鼻に13 μL（片鼻に6.5 μLずつ）接種し、その2週間後、同量のワクチンとアジュバントを経鼻接種した。さらに、2週間後、鼻腔洗浄液、血漿を回収し、鼻腔洗浄液中のワクチン抗原に特異的なIgA及び血漿中のワクチン抗原に特異的なIgGをELISA法により測定した。
その結果を図３に示す。ワクチン単独の処置群と比較して、インゲノール3,20-ジベンゾエートは鼻腔洗浄液中のIgA産生を誘導した。また、アジュバントとしてインゲノール3,20-ジベンゾエートとpoly(I:C)とを併用した群では、鼻腔粘膜上に誘導されたワクチン抗原特異的なIgA量は、poly(I:C)処置群と比較し、約2倍に増加した。
IgG産生の結果を図４に示す。血漿中のIgGは、ワクチン単独の処置群と比較して、インゲノール3,20-ジベンゾエートにより約3.7倍に増加した。インゲノール3,20-ジベンゾエートとpoly(I:C)との併用では、poly(I:C)処置群と比較し、増加する傾向にあった。
Example 10: Evaluation of in vivo IgA production inducing ability of ingenol 3,20-dibenzoate
BALB / c mice (7-8 weeks old, female) with 1 μg of influenza HA protein antigen vaccine (A / California / 7/2009 (H1N1)) as an adjuvant, ingenol 3,20-dibenzoate 0.13 nmol, or ingenol Inoculate the mouse nose with 13 μL of 3,20-dibenzoate 0.13 nmol and poly (I: C) 1 μg (6.5 μL per nose). Two weeks later, the same amount of vaccine Adjuvant was nasally inoculated. Further, two weeks later, nasal lavage fluid and plasma were collected, and IgA specific to vaccine antigen in nasal lavage fluid and IgG specific to vaccine antigen in plasma were measured by ELISA.
The result is shown in FIG. Ingenol 3,20-dibenzoate induced IgA production in the nasal lavage fluid compared to the vaccine alone treatment group. In addition, in the group where ingenol 3,20-dibenzoate and poly (I: C) were used in combination as an adjuvant, the amount of IgA specific to the vaccine antigen induced on the nasal mucosa was different from that in the poly (I: C) treatment group. Compared, it increased about twice.
The result of IgG production is shown in FIG. Plasma IgG was increased approximately 3.7-fold by ingenol 3,20-dibenzoate compared to the vaccine alone treatment group. The combination of ingenol 3,20-dibenzoate and poly (I: C) tended to increase compared to the poly (I: C) treatment group.
本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、ウイルス感染初期及びウイルス抗原特異的な獲得免疫の成立に重要な自然抗体の産生を増強、あるいは自然免疫を活性化するものである。したがって、本発明の粘膜ワクチン用アジュバントは、粘膜上への分泌型IgA産生を誘導し、ウイルス又は病原菌などの病原体による感染を防御するものであり、また、感染予防のための分泌型IgAの誘導剤となりうるものであり、ウイルス又は病原菌の抗原と組み合わせることにより、様々な粘膜ワクチンを提供することができる。 The adjuvant for mucosal vaccines of the present invention enhances the production of natural antibodies important for the establishment of acquired immunity in the early stages of virus infection and virus antigens, or activates natural immunity. Therefore, the adjuvant for mucosal vaccine of the present invention induces secretory IgA production on the mucosa, protects against infection by pathogens such as viruses or pathogens, and induces secretory IgA for infection prevention Various mucosal vaccines can be provided by combining with antigens of viruses or pathogenic bacteria.
Claims (11)
病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎球菌、結核菌、コレラ菌及びジフテリア菌からなる群より選ばれるものである、請求項７又は８に記載の粘膜ワクチン用アジュバント。 Viruses are varicella virus, measles virus, mumps virus, polio virus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, herpes virus, severe acute respiratory infection syndrome (SARS) virus, human immunodeficiency virus (HIV), human papilloma virus and rubella virus Is selected from the group consisting of
The adjuvant for mucosal vaccine according to claim 7 or 8, wherein the pathogenic bacteria are selected from the group consisting of Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, influenza b type bacteria, pneumococci, tuberculosis bacteria, cholera bacteria, and diphtheria bacteria.
病原菌が百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎球菌、結核菌、コレラ菌及びジフテリア菌からなる群より選ばれるものである、請求項１０に記載のワクチン組成物。 Viruses are varicella virus, measles virus, mumps virus, polio virus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, herpes virus, severe acute respiratory infection syndrome (SARS) virus, human immunodeficiency virus (HIV), human papilloma virus and rubella virus Is selected from the group consisting of
The vaccine composition according to claim 10, wherein the pathogen is selected from the group consisting of Bordetella pertussis, Neisseria meningitidis, influenza b-type, pneumococci, tuberculosis, cholera, and diphtheria.
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