JP2017158441A - Catalase - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、微生物に由来する新規なカタラーゼに関する。具体的には、特に長期保存性に優れたカタラーゼに関する。 The present invention relates to a novel catalase derived from a microorganism. Specifically, the present invention relates to catalase that is particularly excellent in long-term storage.
カタラーゼ（ＥＣ１．１１．１．６）は、１分子あたり４個のプロトヘムを作用基とする四量体のヘム蛋白質で、過酸化水素を分解する下記反応を触媒する。
反応式（１） ２Ｈ２Ｏ２ → ２Ｈ２Ｏ＋Ｏ２
また、カタラーゼは反応式（２）で示されるペルオキシダーゼ型の活性を僅かながら持っている事も知られている。
反応式（２） ２ＡＨ２＋Ｈ２Ｏ２ → Ａ＋２Ｈ２Ｏ
Catalase (EC 1.11.1.6) is a tetrameric heme protein having four protohemes as functional groups per molecule and catalyzes the following reaction that decomposes hydrogen peroxide.
Reaction formula (1) 2H 2 O 2 → 2H 2 O + O 2
Catalase is also known to have a slight amount of peroxidase type activity represented by reaction formula (2).
Reaction formula (2) 2AH 2 + H 2 O 2 → A + 2H 2 O
カタラーゼは動物、植物、微生物の好気的な細胞中に存在し、動物では肝臓・血球・腎臓に多く含まれ、植物では葉緑体に含まれているが、同一個体中でも臓器・組織によって酵素の多様が見られている。微生物由来のカタラーゼとして、例えば、バチラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の低温での反応性に優れたカタラーゼ（特許文献１）、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属菌由来の熱安定性に優れたカタラーゼ（特許文献２）、バチラス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来の高活性で安定性の優れたカタラーゼ（特許文献３）、アスペルギルス・カーボナリウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｒｂｏｎａｒｉｕｓ）由来の強酸性ｐＨの条件下で安定性の優れたカタラーゼ（特許文献４）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アクレモニウム・アラバメンシス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ａｌａｂａｍｅｎｓｉｓ）、サーモアスカス・オーランチアカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕ）由来の耐熱性で弱アルカリ性に於ける反応性に優れたカタラーゼ（特許文献５）などが挙げられる。また、アルカリゲネス・ドゥレイア（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｄｅｌｅｙａ）、アルカリゲネス・ミクロシラ（Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｍｉｃｒｏｃｉｌｌａ）由来のカタラーゼ（特許文献６）も知られている。 Catalase is present in aerobic cells of animals, plants, and microorganisms. In animals, it is abundant in liver, blood cells, and kidneys. In plants, it is contained in chloroplasts. A variety of is seen. Examples of the catalase derived from microorganisms include, for example, a catalase excellent in reactivity at low temperatures derived from Bacillus subtilis (Patent Document 1), and a catalase excellent in thermal stability derived from Thermomyces genus (Patent Document) 2) Catalase having excellent activity and stability derived from Bacillus sp. (Patent Document 3), Catalase having excellent stability under conditions of strong acid pH derived from Aspergillus carbonarius (Patent Document 4), Aspergillus terreus, Acremonium alabamensis, Thermoscus auranticas (T a catalase (patent document 5) having excellent heat resistance and weak alkalinity derived from hermosas aurantiacu). Further, a catalase derived from Alkaligenes deleya and Alkaligenes microcilla (Patent Document 6) is also known.
このように、カタラーゼは自然界に非常に広く分布していながら、酵素の安定性・反応性・基質特異性などの性質が給源よって大きく異なり、産業上利用できるものは希少である。特に、臨床診断薬用途を始めとする生化学分野、分析化学の分野では、中性付近の緩衝液、特にグッド・バッファー中に希薄な濃度に溶解したときの安定性に優れること、カタラーゼが本質的に有しているペルオキシダーゼ型活性が極めて低い事が必要であり、従来ウシ肝臓由来のカタラーゼがこのような用途に適した特性を有していため、例えば、中性脂肪測定試薬やクレアチニン測定試薬において妨害物質の消去系の中に使用されて来た。 Thus, although catalase is very widely distributed in nature, properties such as enzyme stability, reactivity, and substrate specificity vary greatly depending on the source, and those that can be used industrially are rare. In particular, in the fields of biochemistry and analytical chemistry, including clinical diagnostic drug applications, catalase is essential because of its excellent stability when dissolved in a dilute concentration in a buffer solution near neutral, especially in Good Buffer. It is necessary that the peroxidase type activity possessed by the animal is extremely low, and catalase derived from bovine liver has characteristics suitable for such applications. For example, a neutral fat measurement reagent or a creatinine measurement reagent Has been used in the interfering substance elimination system.
しかしながら、近年、牛海面脳症（ＢＳＥ）の影響で牛の臓器を原料とする蛋白製剤・酵素製剤の取り扱いに規制が発生し、また、製造においても、牛臓器の安価で安定的な入手が困難になっている。そのような事情から、微生物由来であり、かつ安定性に優れたカタラーゼへのニーズが高まってきている。 However, due to the effects of bovine sea surface encephalopathy (BSE) in recent years, the handling of protein preparations and enzyme preparations using bovine organs as raw materials has been restricted, and it is difficult to stably obtain bovine organs inexpensively in production. It has become. Under such circumstances, there is an increasing need for catalase derived from microorganisms and having excellent stability.
本発明が解決しようとする課題は、臨床診断薬用途を始めとする生化学分野、分析化学の分野への利用に優れた特性を有する、微生物由来のカタラーゼを安価に安定的に提供する事である。 The problem to be solved by the present invention is to stably provide a low-cost microorganism-derived catalase having excellent characteristics for use in the fields of biochemistry and analytical chemistry including clinical diagnostic applications. is there.
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを用いると、分析試薬の組成中でも安定に活性を保持することができ、しかも、該カタラーゼは高純度な酵素標品を大量に調製できることが判明した。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have been able to stably maintain the activity even in the composition of the analytical reagent, when using a catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter. The catalase was found to be able to prepare a large amount of a highly pure enzyme preparation.
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
項１．下記の理化学的性質を有するカタラーゼ。
（１）サブユニットのマススペクトル法による分子量が５３４００である。
（２）至適温度が３５〜４０℃である。
（３）至適ｐＨがｐＨ７．２〜９．０である。
（４）１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、４０℃、３０分処理後の残存活性が９５％以上である。
（５）ｐＨ６．２〜８．９の範囲で、２５℃、１７時間処理を行った後の残存活性が９０％以上である。
（６）酵素の持っているペルオキシダーゼ活性が、カタラーゼ活性の４×１０−８％以下である。
項２．Ｎ末端に配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する項１に記載のカタラーゼ。
項３．３７℃，８日間の保存により５０％以上の残存活性を保持する項１または２に記載のカタラーゼ。
項４．３７℃，８日間の保存により７０％以上の残存活性を保持する項３に記載のカタラーゼ。
項５．３７℃，１４日間の保存により５０％以上の残存活性を保持する項１または２に記載のカタラーゼ。
項６．３７℃，１４日間の保存により７０％以上の残存活性を保持する項５に記載のカタラーゼ。
項７．アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物を起源とする項１〜６のいずれかに記載のカタラーゼ。
項８．測定対象物質が含まれているか、もしくは測定対象物質が含まれていると考えられる試料を用いて、少なくとも１種の酵素による反応を行った後、発色反応を行うことにより生体内に含まれる物質を比色測定する方法において、項１〜７のいずれかに記載のカタラーゼを用いて測定対象物質以外の物質が発生させる過酸化水素を分解する工程を含む生体成分の測定方法。
項９．測定対象物質が、クレアチニン、トリグリセリド、無機リン、クレアチン、コレステロールエステル、シアル酸、α−アミラーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、グアナーゼ、リン脂質よりなる群から選択されるいずれかである項８に記載の生体成分の測定方法。
項１０．下記の（ａ）から（ｅ）を少なくとも含有する生体成分測定用試薬キット。
（ａ）項１〜７のいずれかに記載のカタラーゼ、
（ｂ）ペルオキシダーゼ、
（ｃ）カタラーゼおよびペルオキシダーゼ以外の１種以上の酵素、
（ｄ）緩衝剤、および、
（ｅ）色原体
項１１．アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物を、栄養培地を用いて培養し、カタラーゼ活性を有する蛋白質を採取する工程を含む、項１〜７のいずれかに記載のカタラーゼの製造方法。
That is, the present invention has the following configuration.
Item 1. Catalase having the following physicochemical properties.
(1) The molecular weight of the subunit by mass spectrometry is 53400.
(2) The optimum temperature is 35-40 ° C.
(3) The optimum pH is pH 7.2 to 9.0.
(4) Residual activity after treatment for 30 minutes at 40 ° C. in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) is 95% or more.
(5) In the range of pH 6.2 to 8.9, the residual activity after treatment for 17 hours at 25 ° C. is 90% or more.
(6) The peroxidase activity of the enzyme is 4 × 10 −8 % or less of the catalase activity.
Item 2. Item 2. The catalase according to Item 1, having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 at the N-terminus.
Item 3. The catalase according to Item 1 or 2, which retains a residual activity of 50% or more by storage at 37 ° C for 8 days.
Item 4. The catalase according to Item 3, which retains 70% or more of residual activity when stored at 37 ° C for 8 days.
Item 5. The catalase according to Item 1 or 2, which retains a residual activity of 50% or more by storage at 37 ° C for 14 days.
Item 6. The catalase according to Item 5, which retains 70% or more of residual activity after storage at 37 ° C for 14 days.
Item 7. Item 7. The catalase according to any one of Items 1 to 6, which originates from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter.
Item 8. Substances that are contained in the body by performing a color reaction after performing a reaction with at least one enzyme using a sample that contains the substance to be measured or is considered to contain the substance to be measured A method for measuring a living body component, comprising the step of decomposing hydrogen peroxide generated by a substance other than the substance to be measured using the catalase according to any one of Items 1 to 7.
Item 9. Item 9. The biological component according to Item 8, wherein the substance to be measured is any one selected from the group consisting of creatinine, triglyceride, inorganic phosphorus, creatine, cholesterol ester, sialic acid, α-amylase, GOT, GPT, guanase, and phospholipid. Measuring method.
Item 10. A reagent kit for measuring a biological component containing at least the following (a) to (e):
(A) The catalase according to any one of Items 1 to 7,
(B) peroxidase,
(C) one or more enzymes other than catalase and peroxidase,
(D) a buffer, and
(E) Chromogen term 11. Item 8. The method for producing catalase according to any one of Items 1 to 7, comprising a step of culturing a microorganism of the genus Arthrobacter using a nutrient medium and collecting a protein having catalase activity.
本発明により長期保存性に優れた過酸化水素消去試薬が得られる。液状化試薬が主流である現在、これらのように液状で安定な試薬は非常に有用である。 According to the present invention, a hydrogen peroxide eliminating reagent having excellent long-term storage stability can be obtained. At present, when liquefaction reagents are mainstream, liquid and stable reagents such as these are very useful.
すなわち、本発明によれば、体液中の測定成分を測定するに当たり、
体液中に含まれる妨害物質に、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含む試薬を作用させて、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質から生成した過酸化水素を消去した後、
次いで体液中の測定成分に、該測定成分に作用して妨害物質を生成する酵素、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酵素、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む試薬を作用させて、
体液中の測定成分から妨害物質を生成させ、
該妨害物質または該妨害物質に由来する物質から過酸化水素を生成させ、
該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中の測定成分の測定法において、
各分析試薬の組成中で安定に活性を維持することができる。
That is, according to the present invention, in measuring the measurement component in the body fluid,
Acts on interfering substances contained in body fluids by a reagent containing catalase derived from microorganisms of the genus Arthrobacter and oxidase that acts on the interfering substances or substances derived from the interfering substances to generate hydrogen peroxide After removing hydrogen peroxide generated from the interfering substance or the substance derived from the interfering substance,
Next, an enzyme that acts on the measurement component in the body fluid to generate an interfering substance, an enzyme that acts on the interfering substance or a substance derived from the interfering substance to generate hydrogen peroxide, a peroxidase, and a chromogen A reagent containing
Generate interfering substances from measured components in body fluids,
Producing hydrogen peroxide from the interfering substance or a substance derived from the interfering substance;
In the method for measuring a measurement component in a body fluid, characterized by measuring the color intensity after coloring the hydrogen peroxide,
The activity can be stably maintained in the composition of each analysis reagent.
また、本発明は、
体液中に含まれる妨害物質に作用して過酸化水素を生成する酵素または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含有する第１試薬、および、
体液中の測定成分に作用して妨害物質を生成する酵素、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酵素、ペルオキシダーゼおよび色原体を含有する第２試薬
からなる体液中の測定成分測定試薬で安定に活性を維持することができる。
The present invention also provides:
An enzyme that acts on an interfering substance contained in a body fluid to produce hydrogen peroxide, or an oxidase that acts on a substance derived from the interfering substance to produce hydrogen peroxide and a microorganism of the genus Arthrobacter A first reagent containing catalase, and
A second reagent containing an enzyme that acts on a measurement component in a body fluid to generate an interfering substance, an enzyme that acts on the interfering substance or a substance derived from the interfering substance to generate hydrogen peroxide, a peroxidase, and a chromogen The activity can be stably maintained with the measurement component measurement reagent in the body fluid.
＜本発明のカタラーゼの特性＞
本発明の製法により得られたカタラーゼ活性を有する蛋白質は、以下のような性質を有することを特徴とする。
（１）サブユニットのマススペクトル法による分子量が５３４００である。
（２）至適温度が３５〜４０℃である。
（３）至適ｐＨがｐＨ７．２〜９．０である。
（４）１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、４０℃、３０分処理後の残存活性が９５％以上である。
（５）ｐＨ６．２〜８．９の範囲で、２５℃、１７時間処理を行った後の残存活性が９０％以上である。
（６）酵素の持っているペルオキシダーゼ活性が、カタラーゼ活性の４×１０−８％以下である。
<Characteristics of Catalase of the Present Invention>
A protein having catalase activity obtained by the production method of the present invention is characterized by the following properties.
(1) The molecular weight of the subunit by mass spectrometry is 53400.
(2) The optimum temperature is 35-40 ° C.
(3) The optimum pH is pH 7.2 to 9.0.
(4) Residual activity after treatment for 30 minutes at 40 ° C. in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) is 95% or more.
(5) In the range of pH 6.2 to 8.9, the residual activity after treatment for 17 hours at 25 ° C. is 90% or more.
(6) The peroxidase activity of the enzyme is 4 × 10 −8 % or less of the catalase activity.
本発明におけるカタラーゼは、熱安定性に特に優れている。具体的には、３７℃，８日間の保存により５０％以上の残存活性を保持することが好ましく、７０％以上の残存活性を保持することがより好ましい。また、３７℃，１４日間の保存により５０％以上の残存活性を保持することが好ましく、３７℃，１４日間の保存により７０％以上の残存活性を保持することがより好ましい。 Catalase in the present invention is particularly excellent in thermal stability. Specifically, it is preferable to retain a residual activity of 50% or more by storage at 37 ° C. for 8 days, and it is more preferable to retain a residual activity of 70% or more. Further, it is preferable to retain a residual activity of 50% or more by storage at 37 ° C. for 14 days, and it is more preferable to retain a residual activity of 70% or more by storage at 37 ° C. for 14 days.
本発明におけるカタラーゼは、該カタラーゼに有するペルオキシダーゼ活性が、カタラーゼ活性の４×１０−８％以下であることを特徴とする。より好ましくは３×１０−８％以下、更に好ましくは２×１０−８％以下である。 The catalase in the present invention is characterized in that the peroxidase activity of the catalase is 4 × 10 −8 % or less of the catalase activity. More preferably, it is 3 × 10 −8 % or less, and further preferably 2 × 10 −8 % or less.
さらには、本発明におけるカタラーゼは、Ｈ２Ｏ２に対するＫｍ値が約５．５ｍＭであることが好ましい。比活性は、約３５，０００Ｕ／ｍｇ−蛋白質以上であることが好ましい。また、Ｎ末アミノ酸配列は配列番号１に示されるような、”Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−”の配列を有することが特に好ましい。 Furthermore, the catalase in the present invention preferably has a Km value for H 2 O 2 of about 5.5 mM. The specific activity is preferably about 35,000 U / mg protein or more. The N-terminal amino acid sequence particularly preferably has the sequence “Thr-Ala-Ile-Ser-Thr-Thr-Gln-Ser-Gly-Ala-” as shown in SEQ ID NO: 1.
＜本発明のカタラーゼの由来・製造方法＞
本発明に用いるカタラーゼは、微生物に由来することを特徴とする。微生物の種類は特に限定されるものではないが、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属などが挙げられる。なかでも、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物が好ましい。
<Origin and production method of catalase of the present invention>
The catalase used in the present invention is derived from a microorganism. Although the kind of microorganism is not specifically limited, Arthrobacter | genus (Arthrobacter) genus, Alkaligenes (Alcaligenes) genus, Bacillus (Bacillus) genus, etc. are mentioned. Among these, microorganisms belonging to the genus Arthrobacter are preferable.
具体的には、例えばアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを培養し、該培養物から精製することにより得られる。このような方法としては、特に限定されるものではないが、例えば特開昭６３−２０７３８４号公報に記載される方法がある。カタラーゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素物、その他必要な栄養素を適量含有するものを、合成培地、天然培地のいずれかであっても使用できる。培養は通常、振とう培養あるいは通気撹拌培養で行い、培養温度は２０〜４０℃、培養ｐＨは５〜９の範囲で行う。培養期間は１〜５日で生育し、菌体内にカタラーゼが生産蓄積される。 Specifically, for example, it is obtained by culturing a catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter and purifying the culture. Such a method is not particularly limited. For example, there is a method described in JP-A-63-207384. As a medium used for culturing catalase-producing bacteria, a medium containing an appropriate amount of a carbon source, nitrogenous substance, and other necessary nutrients that can be assimilated by the strain used can be used, whether it is a synthetic medium or a natural medium. The culture is usually performed by shaking culture or aeration and agitation culture, and the culture temperature is 20 to 40 ° C. and the culture pH is in the range of 5 to 9. The culture period grows in 1 to 5 days, and catalase is produced and accumulated in the cells.
本発明に使用するカタラーゼの精製は、例えば以下の様にして行うことができる。菌体からの抽出法として、超音波破砕、ガラスビーズなどを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤処理が挙げられる。さらに抽出液については、硫安などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノメチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。このようにして得られたカタラーゼは通常、比活性１６ｋＵ／Ａ２８０以上で得ることができる。 The catalase used in the present invention can be purified, for example, as follows. Examples of extraction methods from bacterial cells include ultrasonic crushing, mechanical crushing using glass beads and the like, a French press, and a surfactant treatment. Furthermore, for extraction solutions, salting-out methods such as ammonium sulfate, metal aggregation methods such as magnesium chloride and calcium chloride, aggregation methods such as protamine and polyethyleneimine, DEAE (diethylaminomethyl) -sepharose, CM (carboxymethyl) -sepharose It can be purified by ion exchange chromatography such as The catalase thus obtained can usually be obtained with a specific activity of 16 kU / A 280 or more.
＜本発明のカタラーゼの用途＞
本発明のカタラーゼは、種々の生体内物質を酵素反応により定量する際に有用である。その測定原理としては、特に限定されるものではないが、測定対象物質が含まれているか、もしくは測定対象物質が含まれていると考えられる試料を用いて、少なくとも１種の酵素による反応を行った後、発色反応を行うことにより生体内に含まれる物質を比色測定する方法において、一般的には、測定対象成分以外の生体内成分に由来する過酸化水素をカタラーゼで分解することにより、対象成分の正確な定量を実現するために用いられる。このような原理を用いた、本発明の生体成分測定用試薬キットは、本発明のカタラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼおよびペルオキシダーゼ以外の１種以上の酵素、緩衝剤および色原体を少なくとも含有する。
このようなカタラーゼの利用法は、いわゆる「消去系」として当技術分野で汎用される方法であり、種々の公知技術が存在する。さらにその具体的な態様を以下に例示する。
<Use of catalase of the present invention>
The catalase of the present invention is useful when quantifying various in vivo substances by enzymatic reactions. The measurement principle is not particularly limited, but a reaction with at least one enzyme is performed using a sample that contains the measurement target substance or is considered to contain the measurement target substance. Then, in a method for colorimetric measurement of substances contained in the living body by performing a color reaction, in general, by decomposing hydrogen peroxide derived from in vivo components other than the measurement target component with catalase, Used to achieve accurate quantification of target components. The reagent kit for measuring biological components of the present invention using such a principle contains at least one enzyme other than the catalase, peroxidase, catalase and peroxidase of the present invention, a buffer and a chromogen.
Such a method for utilizing catalase is a method widely used in the art as a so-called “elimination system”, and various known techniques exist. Furthermore, the specific aspect is illustrated below.
［トリグリセリドの測定］
本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する一実施態様は、体液中のトリグリセリドを測定するに当たり、体液中に含まれるグリセリンにグリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを作用させて、グリセリンから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のトリグリセリドにリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グルセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、トリグリセリドからグリセリンを生成させ、グリセリンからグリセロール−３−リン酸を生成させ、グリセロール−３−リン酸から過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のトリグリセリド測定法である。
[Measurement of triglycerides]
One embodiment of the method for measuring biological components using catalase of the present invention is to measure triglycerides in body fluids by adding glycerol kinase, glycerol-3-phosphate oxidase and Arthrobacter to glycerol contained in the body fluids. ) Catalase derived from the microorganism of the genus is allowed to act to eliminate hydrogen peroxide generated from glycerin, and then to triglycerides in body fluids, lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerol-3-phosphate oxidase, peroxidase and chromogen To produce glycerin from triglyceride, to produce glycerol-3-phosphate from glycerin, to produce hydrogen peroxide from glycerol-3-phosphate, color the hydrogen peroxide, and then develop the color Strength Triglycerides measurement in body fluids, characterized by measuring.
上記方法に使用する試薬としては、グリセロールキナーゼ、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含む第１試薬およびリポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グルセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のトリグリセリド測定試薬がある。 Examples of the reagent used in the above method include glycerol kinase, glycerol-3-phosphate oxidase, and a first reagent containing catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, lipoprotein lipase, glycerol kinase, glycerol-3-phosphorus. There is a reagent for measuring triglycerides in body fluids consisting of a second reagent containing acid oxidase, peroxidase and chromogen.
［クレアチニンの測定］
また、本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する別な実施態様は、体液中のクレアチニンを測定するに当たり、体液中に含まれるクレアチンにクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを作用させて、クレアチンから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のクレアチニンにクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、クレアチニンからクレアチンを生成させ、クレアチンからザルコシンを生成させ、ザルコシンから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のクレアチニンの測定法である。
[Measurement of creatinine]
In another embodiment of the method for measuring a biological component using the catalase of the present invention, creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase and Arthrobacter (Arthrobacter) are added to creatine contained in a body fluid when measuring creatinine in the body fluid. ) Catalase derived from microorganism of the genus is allowed to act to erase hydrogen peroxide generated from creatine, and then creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, peroxidase and chromogen are allowed to act on creatinine in the body fluid. Creatine is produced from creatinine, sarcosine is produced from creatine, hydrogen peroxide is produced from sarcosine, the hydrogen peroxide is colored, and the color intensity is measured. It is a measurement of creatinine in the liquid.
上記方法に使用する試薬としては、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含む第１試薬およびクレアチニンアミジノヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のクレアチニンの測定試薬がある。 Reagents used in the above method include a first reagent containing creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase and a catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, and creatinine amidinohydrolase, creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, peroxidase and color. There is a reagent for measuring creatinine in a body fluid consisting of a second reagent containing the drug substance.
［コレステロールエステルの測定］ さらに、本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する一実施態様は、体液中のコレステロールエステルを測定するに当たり、体液中に含まれるコレステロールにコレステロールオキシダーゼ、およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを作用させて、コレステロールから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のコレステロールエステルにリパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、コレステロールエステルからコレステロールを生成させ、コレステロールから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のコレステロールエステルの測定法である。 [Measurement of Cholesterol Ester] Furthermore, in one embodiment of the method for measuring a biological component using the catalase of the present invention, cholesterol oxidase is added to cholesterol contained in a body fluid, and Arthrobacter is used to measure cholesterol ester in the body fluid. (Arthrobacter) After the action of a catalase derived from a microorganism of the genus to eliminate hydrogen peroxide generated from cholesterol, lipase, cholesterol oxidase, peroxidase and chromogen are then allowed to act on the cholesterol ester in the body fluid. Of cholesterol ester in body fluid, characterized in that cholesterol is produced from cholesterol, hydrogen peroxide is produced from cholesterol, the hydrogen peroxide is colored, and the color development intensity is measured. It is a conventional method.
上記方法に使用する試薬としては、コレステロールにコレステロールオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含む第１試薬およびリパーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のコレステロールエステルの測定試薬がある。 As a reagent used in the above method, a body fluid comprising a first reagent containing cholesterol oxidase and a catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter in cholesterol and a second reagent containing lipase, cholesterol oxidase, peroxidase and chromogen There is a reagent for measuring cholesterol ester in it.
［リン脂質の測定］
本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する別な実施態様は、体液中のリン脂質を測定するに当たり、体液中に含まれるコリンにコリンオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを作用させて、コリンから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のリン脂質にホスフォリパーゼＤ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、リン脂質からコリンを生成させ、コリンから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のリン脂質の測定法である。
[Measurement of phospholipids]
In another embodiment of the method for measuring a biological component using the catalase of the present invention, the choline oxidase and Arthrobacter-derived microorganism derived from choline oxidase and choline contained in the body fluid are measured. After the action of catalase to eliminate hydrogen peroxide generated from choline, phospholipase D, choline oxidase, peroxidase and chromogen are then allowed to act on phospholipids in the body fluid to generate choline from phospholipids. This is a method for measuring phospholipids in body fluids, characterized in that hydrogen peroxide is produced from choline, the hydrogen peroxide is colored, and then the color intensity is measured.
上記方法に使用する試薬としては、コリンオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含む第１試薬およびホスフォリパーゼ Ｄ、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のリン脂質の測定試薬がある。 The reagent used in the above method comprises a first reagent containing choline oxidase and a catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, and a second reagent containing phospholipase D, choline oxidase, peroxidase and chromogen. There are reagents for measuring phospholipids in body fluids.
［無機リンの測定］
また、本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する一実施態様は、体液中の無機リンを測定するに当たり、体液中に含まれるヒポキサンチンにキサンチンオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを作用させて、ヒポキンチンから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中の無機リンにイノシンおよびプリンヌクレオチドフォスフォリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、無機リンからヒポキサンチンを生成させ、ヒポキサンチンから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中の無機リンの測定法である。
[Measurement of inorganic phosphorus]
One embodiment of the method for measuring a biological component using the catalase of the present invention is that when measuring inorganic phosphorus in a body fluid, hypoxanthine contained in the body fluid contains xanthine oxidase and a microorganism belonging to the genus Arthrobacter. After removing the hydrogen peroxide produced from hypokintin by the action of catalase of origin, then inosine and purine nucleotide phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase and chromogen are allowed to act on the inorganic phosphorus in the body fluid. This is a method for measuring inorganic phosphorus in body fluids, characterized in that hypoxanthine is produced from lysine, hydrogen peroxide is produced from hypoxanthine, the hydrogen peroxide is colored, and the color intensity is measured.
上記方法に使用する試薬としては、キサンチンオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含む第１試薬およびイノシンおよびプリンヌクレオチドフォフォリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中の無機リンの測定試薬がある。 The reagent used in the above method includes a first reagent containing xanthine oxidase and a catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, and a second reagent containing inosine and purine nucleotide phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase and chromogen. There are reagents for measuring inorganic phosphorus in body fluids composed of reagents.
［ＧＰＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）の測定］
本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する別な実施態様は、体液中のＧＰＴを測定するに当たり、体液中に含まれるピルビン酸にピルビン酸オキシダーゼ、およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを作用させて、ピルビン酸から生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のＧＰＴにＬ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、ＧＰＴからピルビン酸を生成させ、ピルビン酸から過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のＧＰＴの測定法である。
[Measurement of GPT (alanine aminotransferase)]
In another embodiment of the method for measuring a biological component using the catalase of the present invention, when measuring GPT in a body fluid, pyruvate contained in the body fluid is converted to pyruvate oxidase and a microorganism belonging to the genus Arthrobacter. After removing the hydrogen peroxide generated from pyruvate by allowing catalase derived from it to act, L-alanine, α-ketoglutarate, pyruvate oxidase, peroxidase and chromogen are then allowed to act on GPT in the body fluid, A method for measuring GPT in a body fluid, characterized in that pyruvic acid is generated from GPT, hydrogen peroxide is generated from pyruvic acid, the hydrogen peroxide is colored, and the color intensity is measured.
上記方法に使用する試薬としては、ピルビン酸オキシダーゼ、およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含む第１試薬およびＬ−アラニン、α−ケトグルタル酸、ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなるＧＰＴの測定試薬がある。 Examples of the reagent used in the above method include pyruvate oxidase, a first reagent containing catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, and L-alanine, α-ketoglutarate, pyruvate oxidase, peroxidase, and chromogen. There is a GPT measurement reagent comprising a second reagent containing
［αアミラーゼの測定］
本発明のカタラーゼを用いた生体成分の測定方法に関する一実施態様は、体液中のα−アミラーゼを測定するに当たり、体液中のグルコースにグルコースオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを作用させて、グルコースから生成した過酸化水素を消去した後、次いで体液中のα−アミラーゼにアミラーゼ基質、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を作用させて、α−アミラーゼからグルコースを生成させ、グルコースから過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定することを特徴とする体液中のα−アミラーゼ測定法である。
[Measurement of α-amylase]
In one embodiment of the method for measuring a biological component using the catalase of the present invention, when measuring α-amylase in a body fluid, glucose oxidase and a catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter are added to glucose in the body fluid. After erasing hydrogen peroxide generated from glucose by acting, amylase substrate, glucose oxidase, peroxidase and chromogen are allowed to act on α-amylase in the body fluid to generate glucose from α-amylase, and glucose This is a method for measuring α-amylase in a body fluid, characterized in that hydrogen peroxide is generated from lysate, and the hydrogen peroxide is colored, and then the color intensity is measured.
上記方法に使用する試薬としては、グルコースオキシダーゼおよびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを含む第１試薬およびα−アミラーゼ基質、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む第２試薬からなる体液中のα−アミラーゼ測定試薬がある。基質としては、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘプタオースなどのオリゴ糖やそれらの非還元末端修飾オリゴ糖などがある。 The reagent used in the above method comprises a first reagent containing glucose oxidase and a catalase derived from a microorganism belonging to the genus Arthrobacter, and a second reagent containing an α-amylase substrate, glucose oxidase, peroxidase and a chromogen. There is a reagent for measuring α-amylase in body fluids. Examples of the substrate include oligosaccharides such as maltotetraose, maltopentaose and maltoheptaose, and non-reducing end-modified oligosaccharides thereof.
本発明における試料としては、尿、血清、唾液、膵液などの体液がある。また、分析対象物としては、その試料中に対象物以外の物質に起因して過酸化水素を発生するものを含有するものであれば、何でも適用可能である。例えばクレアチニン、トリグリセリド、無機リンが代表的であるが、他にクレアチン、コレステロールエステル、シアル酸、α−アミラーゼ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、グアナーゼ、リン脂質などを挙げることができる。 Samples in the present invention include body fluids such as urine, serum, saliva and pancreatic juice. Further, any analysis object can be applied as long as the sample contains a substance that generates hydrogen peroxide due to a substance other than the object. For example, creatinine, triglyceride, and inorganic phosphorus are representative, but other examples include creatine, cholesterol ester, sialic acid, α-amylase, GOT, GPT, guanase, and phospholipid.
本発明に用いる妨害物質に作用して過酸化水素を生成する酵素としては、例えばコレステロールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼなどがある。 Examples of the enzyme that acts on the interfering substance used in the present invention to generate hydrogen peroxide include cholesterol oxidase, glucose oxidase, xanthine oxidase, choline oxidase, sarcosine oxidase, and pyruvate oxidase.
本発明において妨害物質に由来する物質とは、妨害物質に酵素または基質および他の物質を作用させて生成する物質であって、該物質は該物質に作用する酵素によって過酸化水素を生成するものである。例えばグリセロール−３−リン酸、ザルコシン、キサンチンなどが挙げられる。 In the present invention, a substance derived from an interfering substance is a substance produced by causing an enzyme or a substrate and other substances to act on the interfering substance, and the substance generates hydrogen peroxide by an enzyme that acts on the substance. It is. For example, glycerol-3-phosphate, sarcosine, xanthine and the like can be mentioned.
本発明において妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酵素としては、グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウリカーゼ、グリセロールオキシダーゼなどがあり、過酸化水素を発生する酸化酵素であれば、いかなる起源のものでも良い。 In the present invention, glycerol-3-phosphate oxidase, sarcosine oxidase, cholesterol oxidase, xanthine oxidase, choline oxidase, pyruvate oxidase, glucose oxidase are enzymes that act on substances derived from interfering substances to generate hydrogen peroxide. , Uricase, glycerol oxidase and the like, and any oxidase that generates hydrogen peroxide may be of any origin.
本発明に使用する測定成分に作用して妨害物質を生成する酵素としては、グリロキナーゼ、リパーゼ、リポプロテインリパーゼ、ホスフォリパーゼＤ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、プリンヌクレオチドフォスフォリラーゼなどが挙げられる。 Examples of the enzyme that acts on the measurement component used in the present invention to generate an interfering substance include glylokinase, lipase, lipoprotein lipase, phospholipase D, creatinine amide hydrolase, creatine amidinohydrolase, purine nucleotide phosphorylase and the like. It is done.
本発明に使用するペルオキシダーゼとしては、西洋ワサビをはじめとする植物や各種微生物由来のものがある。 The peroxidase used in the present invention includes plants such as horseradish and various microorganisms.
本発明に使用する色原体としては、過酸化水素により分光学的に吸収の変化を生じさせるものであればいかなるものでもよい。ペルオキシダーゼの存在下、４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体、４−アミノアンチピリンとフェノール誘導体、３−メチル−２−ベンゾチアゾリンとアニリン誘導体または４−アミノアンチピリン単独、アニリン誘導体単独、フェノール誘導体単独が考えられる。アニリン誘導体としては、アニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−トルジン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−スルホプロピル−３，５−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジンなどがある。フェノール誘導体としては、フェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，３，４−トリクロロフェノールなどがある。 As the chromogen used in the present invention, any chromogen may be used as long as it causes a change in absorption spectroscopically by hydrogen peroxide. In the presence of peroxidase, 4-aminoantipyrine and aniline derivatives, 4-aminoantipyrine and phenol derivatives, 3-methyl-2-benzothiazoline and aniline derivatives or 4-aminoantipyrine alone, aniline derivatives alone, and phenol derivatives alone are considered. Examples of aniline derivatives include aniline, N, N-dimethylaniline, N, N-diethylaniline, N, N-diethyl-m-toludin, N, N-dimethyl-m-anisidine, N-ethyl- (3-methylphenyl). ) -N′-acetylethylenediamine, N-ethyl-N- (β-hydroxyethyl) -m-toluidine, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfoethyl) -m-toluidine, N-ethyl-N -Sulfopropyl-m-toluidine, N-ethyl-sulfopropyl-3,5-methoxyaniline, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline, N-ethyl- N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine and the like. Examples of phenol derivatives include phenol, p-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol, 2,4-dibromophenol, 2,3,4-trichlorophenol.
本発明では、まず、体液中の測定成分を測定するに当たり、体液中に含まれる妨害物質に、該妨害物質に作用して過酸化水素を生成する酵素およびアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼを作用させて、または該妨害物質から他の物質を誘導し、該物質に作用して過酸化水素を生成する酵素および該カタラーゼを作用させて、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質から生成した過酸化水素を消去する。次いで、体液中の測定成分に、該測定成分に作用して妨害物質を生成する酵素、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質に作用して過酸化水素を生成する酵素、ペルオキシダーゼおよび色原体を含む試薬を作用させて、体液中の測定成分から妨害物質を生成させ、該妨害物質または該妨害物質に由来する物質から過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定する。 In the present invention, first, when measuring a measurement component in a bodily fluid, an interfering substance contained in the bodily fluid, an enzyme that acts on the interfering substance to generate hydrogen peroxide, and a microorganism belonging to the genus Arthrobacter Derived from the interfering substance or the interfering substance by acting the catalase of or other substances derived from the interfering substance and acting on the substance to generate hydrogen peroxide and the catalase Eliminates hydrogen peroxide generated from the material. Next, an enzyme that acts on the measurement component to produce an interfering substance, an enzyme that acts on the interfering substance or a substance derived from the interfering substance, generates peroxidase, a peroxidase, and a chromogen After causing a reagent containing the body to act, generating a disturbing substance from the measurement component in the body fluid, generating hydrogen peroxide from the disturbing substance or a substance derived from the disturbing substance, and coloring the hydrogen peroxide, The color intensity is measured.
過酸化水素を発色させた後、その発色強度を測定する方法としては、生成したキノン色素の測定に、通常５４０〜６５０ｎｍの波長の吸光度測定で行う。測定法としては、エンド法もしくはレート法で行う。 As a method of measuring the color intensity after coloring hydrogen peroxide, the absorbance of the quinone dye produced is usually measured by measuring the absorbance at a wavelength of 540 to 650 nm. As a measuring method, an end method or a rate method is used.
本発明の測定試薬は通常、２試薬系から成り、色原体が４−アミノアンチピリンまたは３−メチル−２−ベンゾチアゾリルノンヒドラジン等とアニリン誘導体またはフェノール誘導体から構成されている場合、その内の１種、好ましくはアニリン誘導体またはフェノール誘導体は、必ず第２試薬に含まれなければならないが、他の１種は第１試薬または第２試薬のどちらかに含まれていても良い。 The measurement reagent of the present invention usually comprises a two-reagent system, and the chromogen is composed of 4-aminoantipyrine or 3-methyl-2-benzothiazolylnonhydrazine and the like, and an aniline derivative or a phenol derivative. One of these, preferably an aniline derivative or a phenol derivative, must be contained in the second reagent, but the other one may be contained in either the first reagent or the second reagent.
本発明において２試薬系の場合には、第１試薬および第２試薬には前記成分に加えてペルオキシダーゼ、緩衝液および必要により測定成分に作用して過酸化水素を生成する酸化酵素、ペルオキシダーゼ以外の酵素、これらの酵素の基質、界面活性剤、安定化剤、各種妨害物質等を含んでいても良い。ペルオキシダーゼは第１、第２試薬どちらに含まれても良いが、好ましくは第１試薬の方が良い。 In the case of the two-reagent system in the present invention, the first reagent and the second reagent include, in addition to the above components, peroxidase, a buffer solution and, if necessary, an oxidase that acts on the measurement component to generate hydrogen peroxide, other than peroxidase. Enzymes, substrates of these enzymes, surfactants, stabilizers, various interfering substances and the like may be included. Peroxidase may be contained in either the first or second reagent, but preferably the first reagent is better.
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
＜カタラーゼの活性測定法＞
実施例中、カタラーゼの活性測定は、寺西らの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３８，１２１３（１９７４））を改良して以下のようにして行なった。
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
<Method of measuring the activity of catalase>
In the examples, the activity of catalase was measured as follows by improving the method of Teranishi et al. (Agric. Biol. Chem., 38, 1213 (1974)).
まず、試験管に０．２５ｍＬの基質溶液（１６ｍＭ Ｈ２Ｏ２となるように１０ｍＭ リン酸緩衝液；ｐＨ７．０で希釈したもの）を取り、２５℃で約５分間予備加温する。次いで酵素溶液０．２５ｍＬを加え反応を開始し、２５℃で正確に５分間反応させた後、チタン溶液（１ｇの酸化チタンと１０ｇの硫酸カリウムを１５０ｍＬの濃硫酸に溶解し、１８０〜２２０℃で２〜３時間加温した後、蒸留水で１．５Ｌに希釈したもの）２．５ｍＬを加えて反応を停止する。この反応停止液の４１０ｎｍにおける吸光度を測定する（ΔＯＤｔｅｓｔ）。一方、盲検は酵素液の代わりに酵素希釈液（０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液；ｐＨ７．４）を添加し、上記と同様の方法にて吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より分解された過酸化水素量を算出し、カタラーゼ活性を算出した。上記条件で１分間に１マイクロモルの過酸化水素を分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。 First, 0.25 mL of a substrate solution (10 mM phosphate buffer solution diluted to 16 mM H 2 O 2 ; diluted with pH 7.0) is taken in a test tube, and pre-warmed at 25 ° C. for about 5 minutes. Next, 0.25 mL of the enzyme solution was added to start the reaction, and the reaction was performed at 25 ° C. for exactly 5 minutes. Then, a titanium solution (1 g of titanium oxide and 10 g of potassium sulfate was dissolved in 150 mL of concentrated sulfuric acid, 2 to 3 hours and then diluted to 1.5 L with distilled water) 2.5 mL is added to stop the reaction. The absorbance at 410 nm of this reaction stop solution is measured (ΔODtest). On the other hand, in the blind test, an enzyme diluent (0.1 M potassium phosphate buffer; pH 7.4) is added instead of the enzyme solution, and the absorbance is measured by the same method as described above (ΔODblank). The amount of hydrogen peroxide decomposed was calculated from the difference in absorbance between ΔODtest and ΔODblank, and the catalase activity was calculated. The amount of enzyme capable of decomposing 1 micromole of hydrogen peroxide per minute under the above conditions is defined as 1 unit (U). The calculation formula is as follows.
Ｕ／ｍＬ＝｛ΔＯＤ（ΔＯＤｂｌａｎｋ−ΔＯＤｔｅｓｔ）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（Ｆ×ｔ×１．０×Ｖｓ） ・・・（Ｉ）
Ｖｔ：トータル液量（３．０ｍＬ）
Ｖｓ：サンプル液量（３．０ｍＬ）
Ｆ：酸化チタンのミリモル分子吸光係数（０．７）
ｔ：反応時間（５分）
ｄｆ：希釈倍率
１．０：セル光路長（１ｃｍ）
U / mL = {ΔOD (ΔODblank−ΔODtest) × Vt × df} / (F × t × 1.0 × Vs) (I)
Vt: Total liquid volume (3.0 mL)
Vs: Sample liquid volume (3.0 mL)
F: millimolar molecular extinction coefficient of titanium oxide (0.7)
t: Reaction time (5 minutes)
df: dilution factor 1.0: cell optical path length (1 cm)
＜カタラーゼの有するペルオキシダーゼ様活性の測定方法＞
また、カタラーゼの有するペルオキシダーゼ様活性の測定は、以下の方法により実施した。蒸留水１４ｍＬ、５％ ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を順次混合した後、２０℃にて５分間予備温調し、サンプル溶液１ｍＬを加え、酵素反応を開始した。２０秒間反応を行った後、２Ｎ 硫酸水溶液１ｍＬを加えることにより反応を停止し、生成したプルプロガリンをエーテル１５ｍＬにて５回抽出した。抽出液を合わせた後、全量１００ｍＬとし、波長４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。一方、盲検は蒸留水１４ｍＬ、５％ ピロガロール水溶液２ｍＬ、０．１４７Ｍ 過酸化水素水１ｍＬ及び１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を順次混合した後、２Ｎ 硫酸水溶液１ｍＬを加えて混和し、酵素液次いでサンプル溶液１ｍＬを加えて調製する。この液につき、上記と同様にエーテル抽出を行って吸光度を測定する（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ΔＯＤｔｅｓｔ及びΔＯＤｂｌａｎｋの吸光度の差より生成するプルプロガリン量を算出し、ペルオキシダーゼ活性を算出した。上記条件で２０秒間に１．０ｍｇのプルプロガリンを生成する酵素量を１プルプロガリン単位（Ｕ）とする。計算式は、以下に示す通りである。
<Method for measuring peroxidase-like activity of catalase>
The peroxidase-like activity of catalase was measured by the following method. Distilled water (14 mL), 5% pyrogallol aqueous solution (2 mL), 0.147 M hydrogen peroxide solution (1 mL) and 100 mM phosphate buffer solution (pH 6.0) were mixed in order, and preliminarily adjusted at 20 ° C. for 5 minutes. In addition, the enzyme reaction was started. After reacting for 20 seconds, the reaction was stopped by adding 1 mL of 2N aqueous sulfuric acid solution, and the resulting purpurogallin was extracted 5 times with 15 mL of ether. After the extracts were combined, the total volume was 100 mL, and the absorbance at a wavelength of 420 nm was measured. On the other hand, in the blind test, 14 mL of distilled water, 2 mL of 5% pyrogallol aqueous solution, 1 mL of 0.147M hydrogen peroxide solution and 100 mM phosphate buffer (pH 6.0) were mixed in order, and then 1 mL of 2N sulfuric acid aqueous solution was added and mixed. Prepare by adding enzyme solution and then 1 mL of sample solution. About this liquid, ether extraction is performed in the same manner as described above, and the absorbance is measured (ΔOD blank). The amount of purpurogallin produced from the difference in absorbance between ΔODtest and ΔODblank was calculated, and the peroxidase activity was calculated. The amount of enzyme that produces 1.0 mg of purpurogallin in 20 seconds under the above conditions is defined as 1 purpurogallin unit (U). The calculation formula is as follows.
Ｕ／ｍＬ＝｛ΔＯＤ（ΔＯＤｂｌａｎｋ−ΔＯＤｔｅｓｔ）×Ｖｔ×ｄｆ｝／（Ｆ×ｔ×１．０×Ｖｓ） ・・・（Ｉ）
Ｖｔ：トータル液量（３．０ｍＬ）
Ｖｓ：サンプル液量（３．０ｍＬ）
Ｆ：酸化チタンのミリモル分子吸光係数（０．７）
ｔ：反応時間（５分）
ｄｆ：希釈倍率
１．０：セル光路長（１ｃｍ）
U / mL = {ΔOD (ΔODblank−ΔODtest) × Vt × df} / (F × t × 1.0 × Vs) (I)
Vt: Total liquid volume (3.0 mL)
Vs: Sample liquid volume (3.0 mL)
F: millimolar molecular extinction coefficient of titanium oxide (0.7)
t: Reaction time (5 minutes)
df: dilution factor 1.0: cell optical path length (1 cm)
＜アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物からのカタラーゼの精製＞
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物を、をＬＢ（１％ ポリペプトン，０．５％ 酵母エキス，１％ ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）寒天培地にて培養した後、滅菌した５０ｍＬの種培地（１．６％ ポリペプトン，０．２％ 酵母エキス，０．５％，肉エキス，０．２２％ リン酸１カリウム，０．５８％ リン酸２カリウム，０．１％ 硫酸マグネシウム，４．４％ 塩化コリン）に一白金耳を植菌し、３０℃で２４時間培養をした。次に、この培養液を滅菌した本生産培地（１．６％ ポリペプトン，０．２％ 酵母エキス，２．５％，肉エキス，０．２２％ リン酸１カリウム，０．５８％ リン酸２カリウム，０．１％ 硫酸マグネシウム，４．４％ 塩化コリン，０．０８％ アデカノール）に全量植菌して、３０℃にて３０〜４０時間通気・攪拌培養し、カタラーゼ活性の生産量の増加が停止した時点で培養を終了し、遠心分離により菌体を回収した。この時の生産性は約４，０００Ｕ／ｍＬ−ｂであった。回収された菌体は５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁し、以後の精製に供した。
<Purification of catalase from microorganisms of the genus Arthrobacter>
A microorganism belonging to the genus Arthrobacter was cultured in LB (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl; pH 7.5) agar medium, and then sterilized in 50 mL of seed medium (1. 6% Polypeptone, 0.2% Yeast extract, 0.5%, Meat extract, 0.22% 1 potassium phosphate, 0.58% 2 potassium phosphate, 0.1% Magnesium sulfate, 4.4% Choline chloride ) Was inoculated with one platinum loop and cultured at 30 ° C. for 24 hours. Next, this culture medium was sterilized in this production medium (1.6% polypeptone, 0.2% yeast extract, 2.5%, meat extract, 0.22% potassium phosphate, 0.58% phosphate 2 Potassium, 0.1% Magnesium sulfate, 4.4% Choline chloride, 0.08% Adecanol), inoculated and cultured at 30 ° C for 30-40 hours with aeration and stirring to increase the production of catalase activity When the culture stopped, the culture was terminated, and the cells were collected by centrifugation. The productivity at this time was about 4,000 U / mL-b. The collected cells were suspended in 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.4) and subjected to subsequent purification.
回収した菌体からの精製は、以下の通りに実施した。上記菌体懸濁液をダイノミル破砕し、遠心分離により上清液を回収した。選られた粗酵素抽出液にポリエチレンイミン溶液を添加して除核酸処理を行ない遠心分離して上清液を回収した。得られた上清液を硫安分画した後、セファデックスＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）ゲル濾過により脱塩し、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）カラムクロマトグラフィーにより精製し、２回目の硫安分画、２回目のセファデックスＧ−２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）ゲル濾過を実施して、精製酵素標品を得た。該方法により得られたカタラーゼ標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ均一なバンドを示し、この時の比活性は約１８，０００Ｕ／Ａ２８０であった。また、得られたカタラーゼ標品は同一サブユニットから構成される四量体であり、サブユニットの分子量をマススペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析）にて測定したところ、５３４００であった。 Purification from the collected cells was performed as follows. The cell suspension was dynomilled and the supernatant was collected by centrifugation. A polyethyleneimine solution was added to the selected crude enzyme extract, subjected to nucleic acid removal treatment, and centrifuged to recover the supernatant. The obtained supernatant was fractionated with ammonium sulfate, desalted by Sephadex G-25 (GE Healthcare Bioscience) gel filtration, and DEAE Sepharose CL-6B (GE Healthcare Bioscience) column chromatography. Purified and subjected to second ammonium sulfate fractionation and second Sephadex G-25 (GE Healthcare Bioscience) gel filtration to obtain a purified enzyme preparation. The catalase preparation obtained by this method showed an almost uniform band on SDS-PAGE, and the specific activity at this time was about 18,000 U / A280. Further, the obtained catalase preparation was a tetramer composed of the same subunit, and the molecular weight of the subunit was measured by mass spectrum (MALDI-TOF MS analysis), which was 53400.
＜実施例１で得られたカタラーゼの酵素特性の取得＞
先に記載したカタラーゼ活性の測定方法を用いて、実施例１で得られたカタラーゼの至適温度（図１）と、ｐＨ反応性（図２）を定法により調べた。
また、実施例１で得られたカタラーゼの熱安定性（図３）は、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液，（ｐＨ７．０）にて２００Ｕ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を各温度で３０分処理した後に、その残存活性を測定することにより調べた。同様に、ｐＨ安定性（図４）は、各ｐＨの１０ｍＭ緩衝液にて２５℃，２００Ｕ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を１７時間処理した後の残存活性を測定することにより調べた。
カタラーゼの至適温度は、上記試験において相対活性が９５％以上である温度範囲として定義でき、図１においては少なくとも３５〜４０℃の範囲であれば至適であると判断できる。
カタラーゼの至適ｐＨは、上記試験において相対活性が９５％以上であるｐＨ範囲として定義でき、図２においては少なくともｐＨ７．２〜９．０の範囲であれば至適であると判断できる。
カタラーゼの熱安定性については、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液，（ｐＨ７．０）にて２００Ｕ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を各温度で３０分処理した後の残存活性が９５％以上である温度範囲として定義でき、図３においては、４０℃では９５％以上であるが４５℃では９５％を下回るため、少なくとも４０℃以下では良好な熱安定性を示すと判断できる。
カタラーゼのｐＨ安定性については、各ｐＨの１０ｍＭ緩衝液にて２５℃，２００Ｕ／ｍＬに希釈した精製酵素溶液を１７時間処理した後の残存活性が９０％以上である温度範囲として定義でき、図４においては、測定した各ｐＨにおいて９０％以上であるため、少なくともｐＨ６．２〜８．９では良好なｐＨ安定性を示すと判断できる。
<Acquisition of enzyme characteristics of catalase obtained in Example 1>
Using the method for measuring catalase activity described above, the optimum temperature (FIG. 1) and pH reactivity (FIG. 2) of the catalase obtained in Example 1 were examined by conventional methods.
Moreover, the thermal stability (FIG. 3) of the catalase obtained in Example 1 was obtained by treating a purified enzyme solution diluted to 200 U / mL with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) at each temperature for 30 minutes. Then, the residual activity was measured by measuring. Similarly, pH stability (FIG. 4) was examined by measuring the residual activity after treating a purified enzyme solution diluted to 25 U and 200 U / mL with 10 mM buffer solution at each pH for 17 hours.
The optimum temperature of catalase can be defined as a temperature range in which the relative activity is 95% or more in the above test. In FIG. 1, it can be judged that the optimum temperature is at least 35 to 40 ° C.
The optimum pH of catalase can be defined as a pH range in which the relative activity is 95% or more in the above test. In FIG. 2, it can be judged that the optimum pH is at least in the range of pH 7.2 to 9.0.
Regarding the thermal stability of catalase, a temperature at which the residual activity after treating a purified enzyme solution diluted to 200 U / mL with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) for 30 minutes at each temperature is 95% or more. In FIG. 3, it is 95% or higher at 40 ° C. but lower than 95% at 45 ° C., and therefore it can be determined that good thermal stability is exhibited at least at 40 ° C. or lower.
The pH stability of catalase can be defined as a temperature range in which the residual activity after treating a purified enzyme solution diluted to 200 U / mL at 25 ° C. and 200 U / mL with 10 mM buffer at each pH for 17 hours is 90% or more. In No. 4, since it is 90% or more at each measured pH, it can be judged that at least pH 6.2 to 8.9 shows good pH stability.
＜実施例１で得られたカタラーゼと牛肝臓由来カタラーゼの保存安定性の比較＞
アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の微生物由来のカタラーゼ（以下、ＮＥＷ−ＣＡＯと示す。）と、従来から常用されてきた牛の肝臓由来のカタラーゼ（東洋紡製：ＣＡＯ−５０９）の液状安定性を３７℃保存にて比較した。図５に示すように、牛肝臓由来のカタラーゼは８日間保存において、その残存活性が４６％まで低下していたが、ＮＥＷ−ＣＡＯにおいては、約８０％の活性が維持されており、液状の保存安定性において、明らかな優位性が認められた。さらに、牛肝臓由来のカタラーゼは１４日間保存において、その残存活性が３９％まで低下していたが、ＮＥＷ−ＣＡＯにおいては、約７８％の活性が維持されていた。
<Comparison of preservation stability of catalase obtained in Example 1 and catalase derived from cattle liver>
The liquid stability of catalase derived from microorganisms of the genus Arthrobacter (hereinafter referred to as NEW-CAO) and catalase derived from cattle liver which has been conventionally used (Toyobo: CAO-509) is 37. Comparison was made by storage at ° C. As shown in FIG. 5, the catalase derived from cattle liver had its residual activity reduced to 46% after storage for 8 days, but in NEW-CAO, the activity of about 80% was maintained, A clear advantage in storage stability was observed. Furthermore, the catalase derived from cattle liver had its residual activity reduced to 39% after 14 days of storage, but about 78% of the activity was maintained in NEW-CAO.
＜実施例１で得られたカタラーゼと牛肝臓由来カタラーゼのペルオキシダーゼ型活性の比較＞
先に記載したカタラーゼ（ＣＡＯ）とペルオキシダーゼ（ＰＥＯ）の活性測定方法を用いて、実施例１で得られたカタラーゼと牛肝臓由来カタラーゼのペルオキシダーゼ様活性の存在比を比較した。表２に示す通り、実施例１で得られたカタラーゼのペルオキシダーゼ様活性は、汎用されてきた牛肝臓由来のカタラーゼと比べて、１／３以下の割合であった。酵素の持っているペルオキシダーゼ活性をカタラーゼ活性で割った値は、牛肝臓由来カタラーゼが４．８×１０−１０であったのに対し、実施例１で得られたカタラーゼは１．５×１０−１０であり、４×１０−１０（４×１０−８％）を下回った。本発明におけるカタラーゼは、体外診断薬の検出系で使用されるペルオキシダーゼ本来の反応に対する影響をより低減するものであり、牛肝臓由来のカタラーゼよりも体外診断薬用途に相応しいものであると考えられる。
<Comparison of peroxidase type activity of catalase obtained in Example 1 and catalase derived from cattle liver>
Using the catalase (CAO) and peroxidase (PEO) activity measurement methods described above, the abundance ratios of the peroxidase-like activity of catalase obtained in Example 1 and cattle liver-derived catalase were compared. As shown in Table 2, the peroxidase-like activity of the catalase obtained in Example 1 was a ratio of 1/3 or less compared to catalase derived from cattle liver which has been widely used. Value Peroxidase activity was divided by the catalase activity have the enzyme, bovine liver contrast from the catalase was 4.8 × 10 -10, Example 1 Catalase obtained in the 1.5 × 10 - 10 and below 4 × 10 −10 (4 × 10 −8 %). The catalase in the present invention reduces the influence on the original reaction of peroxidase used in the detection system for in vitro diagnostic agents, and is considered to be more suitable for in vitro diagnostic use than catalase derived from bovine liver.
現在、体外臨床診断薬は、その大半が溶液状態で製品化・流通・保存されており、本発明のカタラーゼは、保存安定性・反応性に優れた体外診断薬を提供するうえで特に有用であると考えられる。 Currently, most in vitro clinical diagnostics are commercialized, distributed and stored in solution, and the catalase of the present invention is particularly useful for providing in vitro diagnostics with excellent storage stability and reactivity. It is believed that there is.
Claims (11)
（１）サブユニットのマススペクトル法による分子量が５３４００である。
（２）至適温度が３５〜４０℃である。
（３）至適ｐＨがｐＨ７．２〜９．０である。
（４）１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、４０℃、３０分処理後の残存活性が９５％以上である。
（５）ｐＨ６．２〜８．９の範囲で、２５℃、１７時間処理を行った後の残存活性が９０％以上である。
（６）酵素の持っているペルオキシダーゼ活性が、カタラーゼ活性の４×１０−８％以下である。 Catalase having the following physicochemical properties (1) to (7):
(1) The molecular weight of the subunit by mass spectrometry is 53400.
(2) The optimum temperature is 35-40 ° C.
(3) The optimum pH is pH 7.2 to 9.0.
(4) Residual activity after treatment for 30 minutes at 40 ° C. in 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) is 95% or more.
(5) In the range of pH 6.2 to 8.9, the residual activity after treatment for 17 hours at 25 ° C. is 90% or more.
(6) The peroxidase activity of the enzyme is 4 × 10 −8 % or less of the catalase activity.
（ａ）請求項１〜７のいずれかに記載のカタラーゼ、
（ｂ）ペルオキシダーゼ、
（ｃ）カタラーゼおよびペルオキシダーゼ以外の１種以上の酵素、
（ｄ）緩衝剤、および、
（ｅ）色原体 A reagent kit for measuring a biological component containing at least the following (a) to (e):
(A) The catalase according to any one of claims 1 to 7,
(B) peroxidase,
(C) one or more enzymes other than catalase and peroxidase,
(D) a buffer, and
(E) Chromogen
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019194162A (en) * | 2018-05-01 | 2019-11-07 | ツァ ギャリー | Ventilation material comprising whitening and heating function by oxygen supply to skin |
| JP7571418B2 (en) | 2020-08-17 | 2024-10-23 | 東洋紡株式会社 | Catalase |
| WO2025105401A1 (en) * | 2023-11-14 | 2025-05-22 | 東洋紡株式会社 | Method for stabilizing heme protein |
-
2016
- 2016-03-07 JP JP2016043284A patent/JP2017158441A/en active Pending
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