JP2017155026A - Lipid metabolism-improving agent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、酒粕から生成するペプチドを含む脂質代謝改善剤、コレステロール低下剤、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼ抑制剤、及びＳＲＥＢＰ抑制剤、並びに脂質代謝改善作用を有するペプチドの製造方法に関する。 The present invention relates to a lipid metabolism improving agent, a cholesterol-lowering agent, a hydroxymethylglutaryl CoA reductase inhibitor, a SREBP inhibitor, and a method for producing a peptide having a lipid metabolism improving action, comprising a peptide produced from sake lees.
酒粕は、蒸米に麹及び酵母を作用させて得られるものであり、麹菌や酵母の生産する酵素により米の糖類が分解されて高分子化合物として蛋白質やペプチドが高比率で含まれている。これらの蛋白質やペプチドをプロテアーゼ処理して得られる低分子量のペプチドは種々の有用な生理活性を有することが期待される。また、酒粕の糖類はある程度分解されているため、酒粕をプロテアーゼ処理して得られる処理物中のペプチドは単離、精製が容易である。
例えば、特許文献１は、酒粕を原料とした新規なアンギオテンシン変換酵素阻害剤を開示している。また、特許文献２は、米蛋白の蛋白質分解酵素分解物として酒粕を用いたアンギオテンシン変換酵素阻害用経口摂取物を開示している。また、特許文献３は、酒粕をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物が抗酸化活性及び肝機能障害抑制活性を有することを開示している。
Sake lees are obtained by allowing koji and yeast to act on steamed rice, and the sugars of rice are decomposed by enzymes produced by koji molds or yeasts, so that proteins and peptides are contained in a high ratio as polymer compounds. Low molecular weight peptides obtained by protease treatment of these proteins and peptides are expected to have various useful physiological activities. In addition, since the saccharides of sake lees are decomposed to some extent, the peptides in the processed product obtained by treating the sake lees with proteases can be easily isolated and purified.
For example, Patent Document 1 discloses a novel angiotensin converting enzyme inhibitor using sake lees as a raw material. Patent Document 2 discloses an oral intake for inhibiting angiotensin converting enzyme using sake lees as a proteolytic enzyme degradation product of rice protein. Moreover, patent document 3 is disclosing that the peptide mixture obtained by protease-treating sake lees has antioxidant activity and liver dysfunction inhibitory activity.
本発明は、酒粕を原料として得られるペプチドの新たな用途を提供すること、及び酒粕を原料として得られる有用なペプチドの効率的な製造方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a new use of a peptide obtained from sake lees as a raw material, and to provide an efficient method for producing a useful peptide obtained from sake lees as a raw material.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行い、以下の知見を得た。
（i） 酒粕をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物（酒粕のプロテアーゼ処理物）は、肝細胞において、ヒドロキシメチルグルタリル（ＨＭＧ）-ＣｏＡレダクターゼ、及び転写因子ステロール レギュレトリー エレメント バインディング プロテイン（ＳＲＥＢＰ；Sterol Regulatory Element-Binding Protein）（ＳＲＥＢＰ１ｃ、ＳＲＥＢＰ２）の各遺伝子の発現を抑制する。
（ii） 酒粕をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物を、動物に経口投与すると、その動物の肝臓でのＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、転写因子ＳＲＥＢＰ（ＳＲＥＢＰ２）遺伝子、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール受容体遺伝子の発現が抑制される。また、この動物の血清総コレステロール、肝臓トリグリセリドが低減し、肝臓の脂肪滴が小さくかつ少なくなる。また、脂肪組織でも脂肪滴が少なくなる。
（iii） 酒粕をプロテアーゼ処理して得られるペプチド混合物を、動物に経口投与すると、その動物の肝臓での腫瘍壊死因子ＴＮＦ-α遺伝子の発現が抑制される。
（iv） Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＥＣＧ）（グルタチオン）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（ＩＷ）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＰＹ）は、肝細胞において、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の発現を抑制する。
（v） Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＫＰＰ）、Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＩＮ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（ＹＰ）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ（ＬＮ）、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（ＧＩ）は、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の両方の発現を抑制する。Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（ＰＷ）、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ（ＹＧ）は、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子の発現を抑制する。
（vi） これらの脂質代謝改善作用を有するジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドは、酒粕を酸性プロテアーゼ又はアルカリ性プロテアーゼで処理することにより、効率よく生成する。
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have conducted intensive research and obtained the following knowledge.
(I) A peptide mixture (protease-treated product of sake lees) obtained by subjecting sake lees to proteases is expressed in hepatocytes by hydroxymethylglutaryl (HMG) -CoA reductase and transcription factor sterol regulatory element binding protein (SREBP; Regulatory Element-Binding Protein) (SREBP1c, SREBP2) suppresses the expression of each gene.
(Ii) When a peptide mixture obtained by protease treatment of sake lees is orally administered to an animal, the HMG-CoA reductase gene, transcription factor SREBP (SREBP2) gene, low density lipoprotein (LDL) cholesterol receptor in the liver of the animal Somatic gene expression is suppressed. In addition, serum total cholesterol and liver triglycerides in this animal are reduced, and liver lipid droplets are small and small. Also, fat droplets are reduced in adipose tissue.
(Iii) When a peptide mixture obtained by protease treatment of sake lees is orally administered to an animal, expression of the tumor necrosis factor TNF-α gene in the liver of the animal is suppressed.
(Iv) Arg-Leu (RL), Val-Gln (VQ), Ile-Tyr (IY), Phe-Trp (FW), Glu-Cys-Gly (ECG) (glutathione), Ile-Trp (IW), Pro-Tyr (PY) suppresses the expression of the HMG-CoA reductase gene in hepatocytes.
(V) Arg-Leu (RL), Val-Gln (VQ), Phe-Trp (FW), Ile-Lys-Pro-Pro (IKPP), Ile-Asn (IN), Tyr-Pro (YP), Leu -Asn (LN) and Gly-Ile (GI) suppress the expression of both the SREBP1c gene and the SREBP2 gene. Pro-Arg (PR), Pro-Trp (PW), and Tyr-Gly (YG) suppress the expression of the SREBP1c gene.
(Vi) These dipeptides, tripeptides, and tetrapeptides that have an action to improve lipid metabolism are efficiently produced by treating sake lees with an acidic protease or an alkaline protease.
本発明は、上記知見に基づき完成されたものであり、以下の脂質代謝改善剤、コレステロール低下剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、及びＳＲＥＢＰ抑制剤、並びに脂質代謝改善作用を有するペプチドの製造方法を提供する。
項１． Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｇｌｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ａｓｎ、Ｇｌｙ-Ｉｌｅ、Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、及びＩｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏからなる群より選ばれる少なくとも１種のペプチドを含有する脂質代謝改善剤。
項２． 脂質代謝改善剤が、コレステロール抑制又は低減剤、ヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、又はステロール レギュレトリー エレメント バインディング プロテイン抑制剤である項１に記載の脂質代謝改善剤。
項３． (a)酒粕に中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物、又は(b)酒粕にバチルス属細菌由来の耐熱性中性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物を含有する脂質代謝改善剤。
項４． 脂質代謝改善剤が、コレステロール抑制若しくは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ヒドロキシメチルグルタリル-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、又はステロール レギュレトリー エレメント バインディング プロテイン抑制剤である項３に記載の脂質代謝改善剤。
項５． (a)の中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属細菌由来の酸性プロテアーゼである項３又は４に記載の脂質代謝改善剤。
項６． (a) 酒粕に中性プロテアーゼ及び酸性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物、又は(b)酒粕にバチルス属細菌由来の耐熱性中性プロテアーゼを作用させることにより生成するペプチド混合物を含有するＴＮＦ-α抑制剤。
項７． (a)の中性プロテアーゼがバチルス属細菌由来の中性プロテアーゼであり、酸性プロテアーゼがアスペルギルス属細菌由来の酸性プロテアーゼである項６に記載のＴＮＦ-α抑制剤。
項８． 酒粕に、酸性プロテアーゼを２４〜４８時間作用させるか、又はアルカリ性プロテアーゼを５〜２４時間作用させる工程を含む、脂質代謝改善活性を有するペプチドの製造方法。
The present invention has been completed based on the above findings, and includes the following lipid metabolism improving agent, cholesterol lowering agent, HMG-CoA reductase inhibitor, SREBP inhibitor, and a method for producing a peptide having lipid metabolism improving action. provide.
Item 1. Arg-Leu, Val-Gln, Ile-Tyr, Phe-Trp, Glu-Cys-Gly, Ile-Asn, Tyr-Pro, Leu-Asn, Gly-Ile, Pro-Arg, Pro-Trp, Tyr-Gly, A lipid metabolism improving agent comprising at least one peptide selected from the group consisting of Ile-Trp, Pro-Tyr, and Ile-Lys-Pro-Pro.
Item 2. Item 2. The lipid metabolism improving agent according to Item 1, wherein the lipid metabolism improving agent is a cholesterol suppression or reduction agent, a hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitor, or a sterol regulatory element binding protein inhibitor.
Item 3. (a) A lipid mixture containing a peptide mixture produced by allowing neutral protease and acidic protease to act on sake lees, or (b) a peptide mixture produced by acting a thermostable neutral protease derived from Bacillus bacteria on sake lees Metabolic improver.
Item 4. Item 4. The lipid metabolism improving agent according to Item 3, wherein the lipid metabolism improving agent is a cholesterol suppressing or reducing agent, a cholesterol quality improving agent, a hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibitor, or a sterol regulatory element binding protein inhibitor.
Item 5. Item 5. The lipid metabolism improving agent according to Item 3 or 4, wherein the neutral protease (a) is a neutral protease derived from Bacillus bacteria, and the acidic protease is an acidic protease derived from Aspergillus bacteria.
Item 6. (a) a peptide mixture produced by allowing neutral protease and acidic protease to act on sake lees, or (b) a TNF containing a peptide mixture produced by causing heat-resistant neutral protease derived from Bacillus bacteria to act on sake lees -α inhibitor.
Item 7. Item 7. The TNF-α inhibitor according to Item 6, wherein the neutral protease (a) is a neutral protease derived from Bacillus bacteria, and the acidic protease is an acidic protease derived from Aspergillus bacteria.
Item 8. A method for producing a peptide having lipid metabolism-improving activity, comprising a step of allowing an acidic protease to act on sake lees for 24 to 48 hours or an alkaline protease to act for 5 to 24 hours.
酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチド混合物は、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、及び転写因子ＳＲＥＢＰ（ＳＲＥＢＰ１ｃ及びＳＲＥＢＰ２）遺伝子の発現を抑制する。
体内のコレステロールは、アセチルＣｏＡを出発物質として約３０段階の酵素反応により生成するところ、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼは、コレステロール生合成経路の律速酵素である。従って、本発明のペプチド混合物は、この酵素の生成を抑制することにより、体内のコレステロール量を低減させる。
また、転写因子ＳＲＥＢＰのうちＳＲＥＢＰ１ｃは、主に、脂肪酸合成経路の諸酵素遺伝子の発現を促進する（「脂質代謝制御の中心的役割を演じる転写因子ＳＲＥＢＰの分子基盤」、佐藤隆一郎、Nutrition Review June,2008）。従って、本発明のペプチド混合物は、ＳＲＥＢＰ１ｃの生成抑制を介して、体内のトリグリセリド量を低減する。
また、転写因子ＳＲＥＢＰのうちＳＲＥＢＰ２は、コレステロール生合成経路の諸酵素の遺伝子や低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール受容体の遺伝子の転写を促進することにより、包括的に体内のコレステロールの量及び質を制御している（「脂質代謝制御の中心的役割を演じる転写因子ＳＲＥＢＰの分子基盤」、佐藤隆一郎、Nutrition Review June,2008）。従って、本発明のペプチド混合物は、ＳＲＥＢＰ２の発現を抑制することにより、体内のコレステロール量を低減し、また、細胞内に取り込まれるＬＤＬコレステロール（悪玉コレステロール）の量を低減してコレステロールの質を改善する。
酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチド混合物は、上記作用により、脂質代謝を包括的に改善する。
The peptide mixture produced by protease treatment of sake lees suppresses the expression of HMG-CoA reductase gene and transcription factor SREBP (SREBP1c and SREBP2) gene.
Cholesterol in the body is produced by an enzyme reaction of about 30 steps starting from acetyl CoA, and HMG-CoA reductase is the rate-limiting enzyme of the cholesterol biosynthetic pathway. Therefore, the peptide mixture of the present invention reduces the amount of cholesterol in the body by suppressing the production of this enzyme.
Of the transcription factors SREBP, SREBP1c mainly promotes the expression of various enzyme genes in the fatty acid synthesis pathway ("Molecular basis of transcription factor SREBP that plays a central role in lipid metabolism control", Ryuichiro Sato, Nutrition Review June , 2008). Therefore, the peptide mixture of the present invention reduces the amount of triglyceride in the body through suppression of SREBP1c production.
Among the transcription factors SREBP, SREBP2 comprehensively promotes the transcription of genes of various enzymes of the cholesterol biosynthesis pathway and the gene of low density lipoprotein (LDL) cholesterol receptor, thereby comprehensively determining the amount and quality of cholesterol in the body. (The molecular basis of the transcription factor SREBP that plays a central role in lipid metabolism control, Ryuichiro Sato, Nutrition Review June, 2008). Therefore, the peptide mixture of the present invention reduces the amount of cholesterol in the body by suppressing the expression of SREBP2, and also improves the quality of cholesterol by reducing the amount of LDL cholesterol (bad cholesterol) taken into cells. To do.
The peptide mixture produced by protease treatment of sake lees comprehensively improves lipid metabolism by the above-mentioned action.
また、酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチド混合物は、肝臓において、腫瘍壊死因子ＴＮＦ-α遺伝子の発現を抑制する。従って、ＴＮＦ-αの過剰産生による疾患、例えば、関節リウマチや乾癬などの予防、改善、又は治療に好適に使用できる。 Moreover, the peptide mixture produced | generated by protease treatment of sake lees suppresses the expression of tumor necrosis factor TNF-α gene in the liver. Therefore, it can be suitably used for prevention, amelioration, or treatment of diseases caused by excessive production of TNF-α, such as rheumatoid arthritis and psoriasis.
本発明の酒粕ペプチド混合物は、経口摂取により体内に取り込まれて上記作用を発現するため、保健機能食品や医薬として好適に利用できる。 Since the liquor peptide mixture of the present invention is taken into the body by oral ingestion and exhibits the above action, it can be suitably used as a health functional food or a medicine.
また、酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチドであるＡｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＥＣＧ）（グルタチオン）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（ＩＷ）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＰＹ）は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の発現を抑制し、それにより、体内のコレステロール量を低減させる。
また、酒粕のプロテアーゼ処理により生成するペプチドであるＡｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＫＰＰ）、Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＩＮ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（ＹＰ）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ（ＬＮ）、ＧＩ（Ｇｌｙ−Ｉｌｅ）は、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の両方の発現を抑制し、それにより、脂質代謝を包括的に改善する。
また、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（ＰＷ）、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ（ＹＧ）は、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子の発現を抑制し、それにより、体内のトリグリセリド量を低減する。
これらのペプチドも、経口摂取により体内に取り込まれて上記作用を発現するため、機能性食品や医薬として、好適に利用できる。
Moreover, Arg-Leu (RL), Val-Gln (VQ), Ile-Tyr (IY), Phe-Trp (FW), Glu-Cys-Gly (ECG) (glutathione) which are peptides produced by protease treatment of sake lees ), Ile-Trp (IW), Pro-Tyr (PY) suppresses the expression of the HMG-CoA reductase gene, thereby reducing the amount of cholesterol in the body.
In addition, Arg-Leu (RL), Val-Gln (VQ), Phe-Trp (FW), Ile-Lys-Pro-Pro (IKPP), and Ile-Asn (IN) are peptides generated by protease treatment of sake lees. , Tyr-Pro (YP), Leu-Asn (LN), GI (Gly-Ile) suppresses the expression of both the SREBP1c gene and the SREBP2 gene, thereby comprehensively improving lipid metabolism.
Pro-Arg (PR), Pro-Trp (PW), and Tyr-Gly (YG) suppress the expression of the SREBP1c gene, thereby reducing the amount of triglyceride in the body.
Since these peptides are also taken into the body by oral ingestion and exhibit the above action, they can be suitably used as functional foods and pharmaceuticals.
本発明で使用するペプチド及びペプチド混合物は、酒粕の分解により得られるものであるため、摂取しすぎても人体に害はなく、また長期継続摂取による副作用の心配もない。よって、本発明で使用するペプチド及びペプチド混合物は、副作用や過剰摂取を気にすることなく安心して長期間服用できる。また、本発明で使用するペプチド及びペプチド混合物は、清酒製造の副産物である酒粕から製造できる点でも有用である。 Since the peptides and peptide mixtures used in the present invention are obtained by decomposition of sake lees, there is no harm to the human body even if they are consumed excessively, and there is no concern about side effects due to long-term continuous intake. Therefore, the peptide and peptide mixture used in the present invention can be taken for a long period of time without worrying about side effects and excessive intake. Moreover, the peptide and peptide mixture used by this invention are useful also at the point which can be manufactured from sake lees which are a by-product of sake manufacture.
以下、本発明を詳細に説明する。まず、本発明の各剤の有効成分であるペプチド混合物及びペプチドと、その製造方法について説明し、次いで、それを含有する本発明の剤について説明する。
（１）ペプチド混合物
原料
本発明で使用するペプチド混合物は、酒粕を原料として製造することができる。酒粕は、夾雑物である糖質が少なく蛋白質が多く含まれる点や、酒類製造の副産物であり入手し易い点で、望ましい製造原料である。酒粕は、蒸米、米麹から醸造した場合の酒粕でも、液化した米、米麹を用いる液化仕込みによって醸造した場合の液化粕でもどちらでもよい。特に、液化粕は、蛋白質含量が多く夾雑物も少ないため有効成分が濃縮されている点で、好ましい。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. First, the peptide mixture and peptide which are the active ingredients of each agent of the present invention and the production method thereof will be described, and then the agent of the present invention containing it will be described.
(1) Peptide mixture
Raw material The peptide mixture used in the present invention can be produced using sake lees as a raw material. Sake lees is a desirable raw material for production because it is low in saccharides and contains a lot of protein, and is a by-product of liquor production and is easily available. The sake lees may be either sake rice brewed from steamed rice or rice bran, or liquefied rice or liquefied rice koji brewed by liquefaction preparation using rice koji. In particular, liquefied koji is preferred because the active ingredient is concentrated because the protein content is high and the impurities are low.
糖質の除去
酒粕にプロテアーゼを作用させる前に、酒粕中の糖質をできるだけ除去しておくことで、ペプチド混合物の生成効率が良くなる。従って、本発明では、糖質除去を行うことが好ましい。例えば、酒粕にセルラーゼを作用させて糖質を除去することができる。セルラーゼは公知のセルラーゼを制限なく使用できる。セルラーゼには、セルロース鎖をランダムに切断するエンドグルカナーゼと、セルロースの還元末端から切断してセルビオースを生成するセロビオヒドロラーゼとが含まれる。いずれを使用してもよいが、両者を併用することにより、効率よくセルロースを分解することができる。
また、セルラーゼの由来は特に限定されないが、本発明方法の原料に対して機能し易い点で、トリコデルマ属菌、アスペルギルス属菌（特に、アスペルギルス ニガー）由来のセルラーゼが好ましい。
Removal of carbohydrates Before the protease is allowed to act on the sake lees, removing the carbohydrates in the sake lees as much as possible improves the efficiency of producing the peptide mixture. Therefore, in the present invention, it is preferable to perform carbohydrate removal. For example, cellulase can be allowed to act on sake lees to remove carbohydrates. As the cellulase, a known cellulase can be used without limitation. Cellulases include endoglucanases that randomly cleave cellulose chains and cellobiohydrolase that cleaves from the reducing end of cellulose to produce cellobiose. Either may be used, but cellulose can be efficiently decomposed by using both in combination.
The origin of the cellulase is not particularly limited, but a cellulase derived from Trichoderma spp. Or Aspergillus spp. (Especially Aspergillus niger) is preferred in that it easily functions on the raw material of the method of the present invention.
セルラーゼの使用量は、酒粕に対して約０．００５〜０．２重量％が好ましく、約０．０５〜０．１重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内にセルロースが十分に分解されて液体画分に可溶化される。また、反応温度と反応時間は使用する原料とセルラーゼの種類によって異なるが、反応温度は約４０〜６０℃が好ましく、反応時間は約２〜２０時間が好ましい。また、反応時のｐＨは酵素が機能し易い約３．５〜６が好ましい。上記範囲であれば、セルラーゼが失活することなく、かつその機能を十分に発揮できる。セルラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を、例えば約８０〜９０℃で、約３０〜６０分間加熱することにより停止させることができる。 The amount of cellulase used is preferably about 0.005 to 0.2% by weight, more preferably about 0.05 to 0.1% by weight, based on the sake lees. If it is the said range, a cellulose will fully be decomposed | disassembled within a practical time, and it will solubilize in a liquid fraction. Moreover, although reaction temperature and reaction time change with the raw material to be used and the kind of cellulase, about 40-60 degreeC is preferable for reaction temperature, and about 2-20 hours are preferable for reaction time. In addition, the pH during the reaction is preferably about 3.5 to 6 where the enzyme easily functions. If it is the said range, a cellulase can fully exhibit the function, without inactivating. The reaction with cellulase does not necessarily need to be stopped, but can be stopped by heating the reaction mixture at, for example, about 80 to 90 ° C. for about 30 to 60 minutes.
また、夾雑物である糖質を除去するために、セルラーゼに加えて、アミラーゼを使用することができる。アミラーゼとはデンプンを加水分解する酵素の総称であり、アミラーゼとしては、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、プルラナーゼ、イソアミラーゼなどが挙げられる。アミラーゼは、１種を単独で、または２種以上を組み合わせて使用できる。中でも、β−アミラーゼ、α−アミラーゼ、及びα−グルコシダーゼが好ましく、β−アミラーゼがより好ましく、小麦由来のβ−アミラーゼがさらにより好ましい。 In addition to cellulase, amylase can be used to remove carbohydrates that are contaminants. Amylase is a general term for enzymes that hydrolyze starch, and examples of amylase include α-amylase, β-amylase, glucoamylase, α-glucosidase, pullulanase, and isoamylase. Amylase can be used singly or in combination of two or more. Among these, β-amylase, α-amylase, and α-glucosidase are preferable, β-amylase is more preferable, and wheat-derived β-amylase is even more preferable.
アミラーゼの使用量は、酒粕に対して約０．００５〜０．２重量％が好ましく、約０．０５〜０．１重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に糖質が十分に可溶化される。反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、反応温度は約５０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。アミラーゼによる反応は、必ずしも停止させなくてもよいが、反応混合物を、例えば約８０〜９０℃で、約３０〜６０分間加熱することにより停止させることができる。反応時のｐＨは酵素が機能し易い約５〜６が好ましい。 The amount of amylase used is preferably about 0.005 to 0.2% by weight, more preferably about 0.05 to 0.1% by weight, based on sake lees. If it is the said range, carbohydrate will fully be solubilized within a practical time. Although the reaction temperature and reaction time vary depending on the type of enzyme used, the reaction temperature is preferably about 50 to 60 ° C., and the reaction time is preferably about 5 to 20 hours. The reaction with amylase does not necessarily have to be stopped, but can be stopped by heating the reaction mixture at, for example, about 80 to 90 ° C. for about 30 to 60 minutes. The pH during the reaction is preferably about 5 to 6 where the enzyme is easy to function.
液体画分の除去
糖質除去反応を行った反応液から液体画分を除去すればよい。この工程により低分子化された糖質をはじめ、主に水溶性成分が除去される。固液分離の方法としては、圧搾、ろ過、遠心分離などが挙げられるが、ある程度の水分が除去できればよい。この工程により酒粕中の蛋白質を多く含む固形分が得られる。
Removal of liquid fraction The liquid fraction may be removed from the reaction solution subjected to the carbohydrate removal reaction. The water-soluble components are mainly removed, including carbohydrates that have been reduced in molecular weight by this process. Examples of the solid-liquid separation method include squeezing, filtration, and centrifugal separation, but it is sufficient that a certain amount of water can be removed. By this step, a solid content rich in protein in sake lees is obtained.
プロテアーゼ処理
このようにして得られた固形分にプロテアーゼを作用させればよい。この工程では、酒粕中の蛋白質から有効成分となるペプチドを生成させるためにプロテアーゼを使用する。
本発明では、プロテアーゼとして、中性プロテアーゼ、及び酸性プロテアーゼを、それぞれ単独で使用、又は併用することができる。各プロテアーゼの由来は特に限定されない。バチルス属細菌由来、アスペルギルス属菌由来、リゾプス属菌由来のプロテアーゼなどが知られているが、中でも、バチルス属細菌由来の中性プロテアーゼ、アスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼが好ましい。バチルス属細菌由来の中性プロテアーゼの例として、それには限定されないが、バチルス属細菌由来の耐熱性の中性プロテアーゼ、中でも、バチルス サーモリシン由来の耐熱性中性プロテアーゼ、例えばサモアーゼ（大和化成社製、現在は、天野エンザイム社が販売）が挙げられる。
本発明において用いられるプロテアーゼはエンド型でもエキソ型でも、どちらでも良いが、目的とするペプチドがさらに断片化されないためにはエンド型が好ましい。
中性プロテアーゼは１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。酸性プロテアーゼも１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。
Protease treatment A protease may be allowed to act on the solid content thus obtained. In this step, a protease is used to produce a peptide as an active ingredient from the protein in sake lees.
In the present invention, neutral protease and acidic protease can be used alone or in combination, respectively. The origin of each protease is not particularly limited. Proteases derived from Bacillus bacteria, Aspergillus bacteria, Rhizopus bacteria, and the like are known, among which neutral proteases derived from Bacillus bacteria and acidic proteases derived from Aspergillus bacteria are preferred. Examples of neutral proteases derived from Bacillus bacteria include, but are not limited to, heat-resistant neutral proteases derived from Bacillus bacteria, among others, heat-resistant neutral proteases derived from Bacillus thermolysin, such as Samoaase (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd., Currently sold by Amano Enzyme).
The protease used in the present invention may be either an endo-type or an exo-type, but the endo-type is preferable so that the target peptide is not further fragmented.
A neutral protease may be used individually by 1 type, and may be used in combination of 2 or more type. One type of acidic protease may be used alone, or two or more types may be used in combination.
各プロテアーゼの使用量は、酒粕に対して、それぞれ、約０．０５〜２重量％が好ましく、約０．１〜１重量％がより好ましい。
また、酒粕から糖質除去と液体画分の除去を行う場合は、糖質分解後の圧搾物に対して約０．1〜０．８重量％が好ましく、約０．３〜０．６重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に酒粕中の蛋白質を、脂質代謝改善活性を有するペプチド（以下、「活性ペプチド」ということがある）にまで分解できる。
The amount of each protease used is preferably about 0.05 to 2% by weight, more preferably about 0.1 to 1% by weight, based on the sake lees.
In addition, when removing carbohydrates and liquid fractions from sake lees, the content is preferably about 0.1 to 0.8% by weight, and about 0.3 to 0.6% by weight based on the compressed product after decomposition of carbohydrates. % Is more preferable. If it is the said range, the protein in sake lees can be decomposed | disassembled into the peptide (henceforth an "active peptide" hereafter) which has lipid metabolism improvement activity within practical time.
反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、中性プロテアーゼの場合は、反応温度は約４０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。また、酸性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃が好ましく、反応時間は約５〜２０時間が好ましい。また、バチルス属細菌（中でも、バチルス サーモリシン）由来の耐熱性の中性プロテアーゼ、例えばサモアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６５℃が好ましく、反応時間は約５〜２４時間が好ましい。各プロテアーゼによる反応は、反応混合物を例えば約８０〜１００℃で約１０〜３０分間加熱することにより停止させればよい。プロテアーゼによる反応を停止させることにより、切り出された活性ペプチドがさらに分解されて、活性が低下することが回避される。または、活性ペプチド以外の夾雑ペプチドが切り出されることによる、活性ペプチドの純度の低下を防止できる。 Although the reaction temperature and reaction time vary depending on the type of enzyme used, in the case of a neutral protease, the reaction temperature is preferably about 40 to 60 ° C., and the reaction time is preferably about 5 to 20 hours. In the case of acidic protease, the reaction temperature is preferably about 50 to 60 ° C., and the reaction time is preferably about 5 to 20 hours. In the case of a heat-resistant neutral protease derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus (in particular, Bacillus thermolysin), for example, Samoaase, the reaction temperature is preferably about 50 to 65 ° C., and the reaction time is preferably about 5 to 24 hours. The reaction with each protease may be stopped by heating the reaction mixture at, for example, about 80 to 100 ° C. for about 10 to 30 minutes. By stopping the reaction by the protease, it is avoided that the excised active peptide is further decomposed and the activity is reduced. Alternatively, it is possible to prevent a decrease in the purity of the active peptide due to excision of contaminating peptides other than the active peptide.
反応時のｐＨは、中性プロテアーゼの場合、約６〜９が好ましく、酸性プロテアーゼの場合、約３〜５が好ましく、バチルス属細菌（中でも、バチルス サーモリシン）由来の耐熱性の中性プロテアーゼ、例えばサモアーゼの場合、約６〜７が好ましい。上記範囲であれば、各プロテアーゼが機能し易い。
中性プロテアーゼと酸性プロテアーゼは、それぞれ単独で作用させてもよく、併用しても良い。併用する場合は、いずれを先に反応させてもよいが、より活性の強いペプチド混合物を得ることができる点で、中性プロテアーゼを先に反応させるのが好ましい。また、両プロテアーゼが機能するｐＨが重複する場合は、同時に反応させてもよい。
The pH during the reaction is preferably about 6 to 9 in the case of a neutral protease, and preferably about 3 to 5 in the case of an acidic protease, and is a heat-resistant neutral protease derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus (in particular, Bacillus thermolysin), such as In the case of samoese, about 6-7 is preferred. If it is the said range, each protease will function easily.
Neutral protease and acidic protease may be allowed to act alone or in combination. When they are used in combination, any of them may be reacted first, but it is preferable to react a neutral protease first in that a more active peptide mixture can be obtained. Moreover, when the pH which both proteases function overlaps, you may make it react simultaneously.
プロテアーゼ処理により得られた混合物から固形分を除去してもよい。これにより、固体の夾雑物が除去されて、活性ペプチドが溶解した液体画分を得ることができる。固体分の除去は、例えば圧搾、ろ過、遠心分離等により行うことができる。この液体画分は、そのまま食品に添加することができ、また医薬の有効成分として用いることができる。
さらに、この液体画分を濃縮したり、乾燥させて粉末化したりすることも出来る。これにより、より長期間保存が可能で、加工しやすいペプチド混合物を得ることができる。
Solids may be removed from the mixture obtained by the protease treatment. Thereby, solid impurities can be removed and a liquid fraction in which the active peptide is dissolved can be obtained. The removal of the solid content can be performed by, for example, pressing, filtration, centrifugation, or the like. This liquid fraction can be added to food as it is, and can be used as an active ingredient of a medicine.
Further, the liquid fraction can be concentrated or dried to be powdered. Thereby, the peptide mixture which can be preserve | saved for a long period of time and is easy to process can be obtained.
本発明は、上記説明した工程を含むペプチド混合物（特に、脂質代謝改善作用を有するペプチド混合物）、又は脂質代謝改善剤の製造方法を包含する。 The present invention includes a peptide mixture comprising the steps described above (particularly, a peptide mixture having a lipid metabolism improving action) or a method for producing a lipid metabolism improving agent.
ペプチド組成
このようにして得られるペプチド混合物を本発明の剤の有効成分として用いることができる。このペプチド混合物は、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ-Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒの１種以上を含有する。
中でも、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ-Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ、及びＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒのそれぞれを０．００１重量％以上含有し、例えば、これらのそれぞれを１重量％以下、０．５重量％以下、又は０．２重量％以下含有するペプチド混合物が好ましい。
また、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ａｒｇ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ-Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ-Ｇｌｎ-Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒのそれぞれを０．００１重量％以上含有し、例えば、これらのそれぞれを１重量％以下、０．５重量％以下、０．２重量％以下、又は０．１重量％以下含有するペプチド混合物も好ましい。
Peptide composition The peptide mixture thus obtained can be used as an active ingredient of the agent of the present invention. The peptide mixture is Thr-Trp, Ile-Trp, Pro-Tyr, Val-Tyr, Asn-Trp, Phe-Phe, Ile-Tyr, Arg-Phe, Phe-Trp, Gln-Trp, Ser-Trp, Ile. -Lys-Tyr, Leu-Lys-Tyr, Leu-Gln-Pro, Ile-Tyr-Pro, Phe-Pro-Pro, Ile-Tyr-Pro-Arg-Tyr, Val-Arg-Tyr, Val-Arg-Pro , Tyr-Lys-Pro, and Tyr-Gly-Gly-Tyr.
Among them, Thr-Trp, Ile-Trp, Pro-Tyr, Val-Tyr, Asn-Trp, Phe-Phe, Ile-Tyr, Arg-Phe, Phe-Trp, Gln-Trp, Ser-Trp, Ile-Lys- Tyr, Leu-Gln-Pro, Ile-Tyr-Pro, Phe-Pro-Pro, Ile-Tyr-Pro-Arg-Tyr, Val-Arg-Tyr, Tyr-Lys-Pro, and Tyr-Gly-Gly-Tyr Peptide mixtures containing 0.001% by weight or more of each of these, for example, containing 1% by weight or less, 0.5% by weight or less, or 0.2% by weight or less of each of these are preferred.
Also, Thr-Trp, Ile-Trp, Pro-Tyr, Val-Tyr, Asn-Trp, Phe-Phe, Ile-Tyr, Arg-Phe, Phe-Trp, Gln-Trp, Ser-Trp, Ile-Lys- Contains 0.001% by weight or more of each of Tyr, Leu-Lys-Tyr, Leu-Gln-Pro, Ile-Tyr-Pro, Phe-Pro-Pro, Ile-Tyr-Pro-Arg-Tyr. Peptide mixtures containing 1% by weight or less, 0.5% by weight or less, 0.2% by weight or less, or 0.1% by weight or less are also preferred.
（２）ペプチド
ペプチド
また、Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＩＮ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（ＹＰ）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ（ＬＮ）、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（ＧＩ）、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（ＰＷ）、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ（ＹＧ）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（ＩＷ）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＰＹ）、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（ＥＣＧ）（グルタチオン）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＫＰＰ）の１種以上も、本発明の剤の有効成分として用いることができる。これらのペプチドは、脂質代謝改善活性を有する。
(2) Peptides
Peptides are also Arg-Leu (RL), Val-Gln (VQ), Ile-Tyr (IY), Phe-Trp (FW), Ile-Asn (IN), Tyr-Pro (YP), Leu-Asn (LN) ), Gly-Ile (GI), Pro-Arg (PR), Pro-Trp (PW), Tyr-Gly (YG), Ile-Trp (IW), Pro-Tyr (PY), Glu-Cys-Gly ( One or more of ECG) (glutathione) and Ile-Lys-Pro-Pro (IKPP) can also be used as an active ingredient of the agent of the present invention. These peptides have lipid metabolism improving activity.
製造方法
これらのペプチドは、合成することができる。また、酒粕のプロテアーゼ処理によっても得ることができる。
酒粕のプロテアーゼ処理により上記の活性ペプチドを得る方法について詳述すると、原料となる酒粕や、糖質除去とその後の液体画分除去を行うのが好ましいことは、ペプチド混合物の製造方法と同様である。
プロテアーゼは、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼの何れを用いてもよいが、酸性プロテアーゼ、又はアルカリ性プロテアーゼが好ましい。酸性、中性、又はアルカリ性プロテアーゼは、１種を単独で使用しても良いし、２種以上を組み合わせて使用しても良い。
各プロテアーゼの由来は特に限定されない。バチルス属細菌由来、アスペルギルス属菌由来、リゾプス属菌由来のプロテアーゼなどが知られているが、中でも、アスペルギルス属菌由来の酸性プロテアーゼ、バチルス属細菌由来のアルカリ性プロテアーゼが好ましい。本発明において用いられるプロテアーゼはエンド型でもエキソ型でも、どちらでも良いが、目的とするペプチドがさらに断片化されないためにはエンド型が好ましい。
Production Method These peptides can be synthesized. It can also be obtained by protease treatment of sake lees.
The method for obtaining the above active peptide by protease treatment of sake lees will be described in detail. It is the same as the method for producing a peptide mixture that it is preferable to remove the liquor as a raw material and the removal of carbohydrate and the subsequent liquid fraction. .
As the protease, any of acidic protease, neutral protease, and alkaline protease may be used, but acidic protease or alkaline protease is preferable. One kind of acidic, neutral, or alkaline protease may be used alone, or two or more kinds may be used in combination.
The origin of each protease is not particularly limited. Proteases derived from Bacillus bacteria, Aspergillus bacteria, Rhizopus bacteria, and the like are known. Among them, acidic proteases derived from Aspergillus bacteria and alkaline proteases derived from Bacillus bacteria are preferable. The protease used in the present invention may be either an endo-type or an exo-type, but the endo-type is preferable so that the target peptide is not further fragmented.
各プロテアーゼの使用量は、酒粕に対して、それぞれ、約０．０５〜２重量％が好ましく、約０．１〜１重量％がより好ましい。また、酒粕から糖質除去と液体画分の除去を行う場合は、糖質分解後の圧搾物に対して約０．1〜０．８重量％が好ましく、約０．３〜０．６重量％がより好ましい。上記範囲であれば、実用的な時間内に酒粕中の蛋白質を、脂質代謝改善活性を有するペプチドにまで分解できる。 The amount of each protease used is preferably about 0.05 to 2% by weight, more preferably about 0.1 to 1% by weight, based on the sake lees. In addition, when removing carbohydrates and liquid fractions from sake lees, the content is preferably about 0.1 to 0.8% by weight, and about 0.3 to 0.6% by weight based on the compressed product after decomposition of carbohydrates. % Is more preferable. If it is the said range, the protein in sake lees can be decomposed | disassembled into the peptide which has lipid metabolism improvement activity within practical time.
反応温度と反応時間は使用する酵素の種類によって異なるが、酸性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃が好ましい。また、反応時間は５時間以上が好ましく、６時間以上がより好ましく、２４時間以上がさらにより好ましく、３８時間以上が特に好ましい。また、７２時間以下が好ましく、６０時間以下がより好ましく、４８時間以下がさらにより好ましく、４５時間以下が特に好ましい。
また、アルカリ性プロテアーゼの場合は、反応温度は約５０〜６０℃が好ましい。また、反応時間は３時間以上が好ましく、４時間以上がより好ましく、５時間以上がさらにより好ましい。また、４８時間以下が好ましく、２４時間以下がより好ましく、８時間以下がさらにより好ましく、６時間以下が特に好ましい。
各プロテアーゼによる反応は、反応混合物を例えば約８０〜１００℃で約１０〜３０分間加熱することにより停止させればよい。プロテアーゼによる反応を停止させることにより、切り出された活性ペプチドがさらに分解されて、活性が低下することが回避される。または、活性ペプチド以外の夾雑ペプチドが切り出されることによる、活性ペプチドの純度の低下を防止できる。
Although the reaction temperature and reaction time vary depending on the type of enzyme used, in the case of an acidic protease, the reaction temperature is preferably about 50 to 60 ° C. The reaction time is preferably 5 hours or longer, more preferably 6 hours or longer, even more preferably 24 hours or longer, and particularly preferably 38 hours or longer. Moreover, 72 hours or less are preferable, 60 hours or less are more preferable, 48 hours or less are still more preferable, 45 hours or less are especially preferable.
In the case of alkaline protease, the reaction temperature is preferably about 50 to 60 ° C. The reaction time is preferably 3 hours or longer, more preferably 4 hours or longer, and even more preferably 5 hours or longer. Moreover, 48 hours or less are preferable, 24 hours or less are more preferable, 8 hours or less are still more preferable, and 6 hours or less are especially preferable.
The reaction with each protease may be stopped by heating the reaction mixture at, for example, about 80 to 100 ° C. for about 10 to 30 minutes. By stopping the reaction by the protease, it is avoided that the excised active peptide is further decomposed and the activity is reduced. Alternatively, it is possible to prevent a decrease in the purity of the active peptide due to excision of contaminating peptides other than the active peptide.
反応時のｐＨは、中性プロテアーゼの場合、約６〜９が好ましく、酸性プロテアーゼの場合、約３〜５が好ましく、アルカリ性プロテアーゼの場合、約８〜１０が好ましい。上記範囲であれば、各プロテアーゼが機能し易い。 The pH during the reaction is preferably about 6 to 9 for neutral proteases, preferably about 3 to 5 for acidic proteases, and preferably about 8 to 10 for alkaline proteases. If it is the said range, each protease will function easily.
プロテアーゼ処理により得られた混合物から固形分を除去してもよい。これにより、固体の夾雑物が除去されて、活性ペプチドが溶解した液体画分を得ることができる。固体分の除去は、例えば圧搾、ろ過、遠心分離等により行うことができる。この液体画分から、各種クロマトグラフィーにより目的ペプチドを単離すればよい。 Solids may be removed from the mixture obtained by the protease treatment. Thereby, solid impurities can be removed and a liquid fraction in which the active peptide is dissolved can be obtained. The removal of the solid content can be performed by, for example, pressing, filtration, centrifugation, or the like. The target peptide may be isolated from this liquid fraction by various chromatography.
本発明は、上記説明した工程を含むペプチド（特に、脂質代謝改善作用を有するペプチド）、又は脂質代謝改善剤の製造方法を包含する。 The present invention includes a peptide (particularly a peptide having an action of improving lipid metabolism) or a method for producing a lipid metabolism improving agent comprising the steps described above.
（３）ペプチド混合物・ペプチドの用途
本発明の第１の脂質代謝改善剤は、上記説明した本発明のペプチド混合物を含み、特に、有効成分として含むことができる。
第１の脂質代謝改善剤は、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ、転写因子ＳＲＥＢＰ（中でも、ＳＲＥＢＰ１ｃ、及び／又はＳＲＥＢＰ２）、及び／又は低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール受容体を抑制ないしは低減することにより、脂質代謝を改善する。特に、これらの酵素、転写因子、受容体蛋白質の遺伝子発現を抑制することで、その生成を抑制ないしは低減する。従って、本発明の第１の脂質代謝改善剤は、コレステロール（特に、悪玉コレステロールであるＬＤＬコレステロール）抑制ないしは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、ＳＲＥＢＰ抑制剤を包含する。
(3) Use of peptide mixture / peptide The first lipid metabolism-improving agent of the present invention includes the peptide mixture of the present invention described above, and can be included as an active ingredient.
The first lipid metabolism improving agent suppresses or reduces HMG-CoA reductase, transcription factor SREBP (among others, SREBP1c and / or SREBP2), and / or low density lipoprotein (LDL) cholesterol receptor, Improve metabolism. In particular, by suppressing gene expression of these enzymes, transcription factors, and receptor proteins, their production is suppressed or reduced. Therefore, the first lipid metabolism improving agent of the present invention includes cholesterol (particularly LDL cholesterol which is bad cholesterol) inhibitor or reducer, cholesterol quality improver, HMG-CoA reductase inhibitor, SREBP inhibitor. .
本発明の第２の脂質代謝改善剤は、上記説明した本発明のペプチドの１種以上を含み、特に、有効成分として含むことができる。
第２の脂質代謝改善剤も、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ、転写因子ＳＲＥＢＰ（中でも、ＳＲＥＢＰ１ｃ、及び／又はＳＲＥＢＰ２）、及び／又は低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロール受容体を、特に遺伝子発現を抑制することにより、抑制ないしは低減し、その結果、脂質代謝を改善する。従って、本発明の第２の脂質代謝改善剤は、コレステロール（特に、悪玉コレステロールであるＬＤＬコレステロール）抑制ないしは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、ＳＲＥＢＰ抑制剤を包含する。
特に、Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（ＩＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（ＩＷ）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ＰＹ）、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ（ＧＳＨ）は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ抑制剤として好適に使用できる。
また、Ａｒｇ−Ｌｅｕ（ＲＬ）、Ｖａｌ−Ｇｌｎ（ＶＱ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（ＦＷ）、Ｉｌｅ−Ａｓｎ（ＩＮ）、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（ＹＰ）、Ｌｅｕ−Ａｓｎ（ＬＮ）、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ（ＧＩ）、Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＰＲ）、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（ＰＷ）、Ｔｙｒ-Ｇｌｙ（ＹＧ）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＩＫＰＰ）は、ＳＲＥＢＰ抑制剤として好適に使用できる。
The second lipid metabolism improving agent of the present invention contains one or more of the peptides of the present invention described above, and in particular can be included as an active ingredient.
The second lipid metabolism-improving agent also suppresses HMG-CoA reductase, transcription factor SREBP (especially SREBP1c and / or SREBP2), and / or low density lipoprotein (LDL) cholesterol receptor, particularly gene expression. Suppresses or reduces, resulting in improved lipid metabolism. Accordingly, the second lipid metabolism improving agent of the present invention includes cholesterol (particularly LDL cholesterol which is bad cholesterol) inhibitor or reducer, cholesterol quality improver, HMG-CoA reductase inhibitor, SREBP inhibitor. .
In particular, Arg-Leu (RL), Val-Gln (VQ), Ile-Tyr (IY), Phe-Trp (FW), Ile-Trp (IW), Pro-Tyr (PY), Gly-Ser-His ( GSH) can be suitably used as an HMG-CoA reductase inhibitor.
Arg-Leu (RL), Val-Gln (VQ), Phe-Trp (FW), Ile-Asn (IN), Tyr-Pro (YP), Leu-Asn (LN), Gly-Ile (GI) Pro-Arg (PR), Pro-Trp (PW), Tyr-Gly (YG), and Ile-Lys-Pro-Pro (IKPP) can be suitably used as the SREBP inhibitor.
また、本発明のＴＮＦ-α抑制剤は、本発明のペプチド混合物を含み、特に、有効成分として含むことができる。本発明のペプチド混合物は、特に、ＴＮＦ-αの遺伝子発現を抑制することにより、ＴＮＦ-αの生成を抑制、ないしはその量を低減する。従って、本発明のペプチド混合物は、ＴＮＦ-αの過剰又は過活性化が原因となる疾患、例えば、関節リウマチ、乾癬などの予防、改善、又は治療剤として使用できる。 Moreover, the TNF-α inhibitor of the present invention includes the peptide mixture of the present invention, and can be included as an active ingredient. The peptide mixture of the present invention suppresses the production of TNF-α or reduces the amount thereof, particularly by suppressing the gene expression of TNF-α. Therefore, the peptide mixture of the present invention can be used as a preventive, ameliorating, or therapeutic agent for diseases caused by excess or overactivation of TNF-α, such as rheumatoid arthritis and psoriasis.
（４）製剤
医薬組成物
本発明のペプチド混合物又はペプチドを医薬組成物の有効成分として使用する場合、ペプチドは、そのまま又はジペプチドやアミノ酸にまで分解されて容易に吸収されることから、これらの医薬品は各種の経口投与形態を有する製剤とすることができる。固形製剤としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、タブレット剤、丸剤、カプセル剤、チュアブル剤などが挙げられ、液体製剤としては、乳剤、液剤、シロップ剤などが挙げられる。
(4) Formulation
Pharmaceutical composition When the peptide mixture or peptide of the present invention is used as an active ingredient of a pharmaceutical composition, the peptide is easily absorbed as it is or after being decomposed into a dipeptide or an amino acid. It can be set as the formulation which has a dosage form. Examples of solid preparations include powders, granules, tablets, tablets, pills, capsules, chewable agents, and the like, and examples of liquid preparations include emulsions, solutions, syrups and the like.
固形製剤は、有効成分であるペプチド混合物又はペプチドに、薬学的に許容される担体や添加剤を配合して調製される。例えば、白糖、乳糖、ブドウ糖、でんぷん、マンニットのような賦形剤；アラビアゴム、ゼラチン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースのような結合剤；カルメロース、デンプンのような崩壊剤；無水クエン酸、ラウリン酸ナトリウム、グリセロールのような安定剤などが配合される。さらに、ゼラチン、白糖、アラビアゴム、カルナバロウなどでコーティングしたり、カプセル化したりしてもよい。また、液体製剤は、例えば、本発明のペプチド混合物又はペプチドを、水、エタノール、グリセリン、単シロップ、又はこれらの混液などに、溶解又は分散させることにより調製される。これらの製剤には、甘味料、防腐剤、粘滑剤、希釈剤、緩衝剤、着香剤、着色剤のような添加剤が添加されていてもよい。 A solid preparation is prepared by blending a pharmaceutically acceptable carrier or additive with a peptide mixture or peptide as an active ingredient. For example, excipients such as sucrose, lactose, glucose, starch, mannitol; binders such as gum arabic, gelatin, crystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, methylcellulose; disintegrants such as carmellose, starch; anhydrous citric acid Stabilizers such as sodium laurate and glycerol are blended. Further, it may be coated or encapsulated with gelatin, white sugar, gum arabic, carnauba wax or the like. The liquid preparation is prepared, for example, by dissolving or dispersing the peptide mixture or peptide of the present invention in water, ethanol, glycerin, simple syrup, or a mixture thereof. In these preparations, additives such as sweeteners, preservatives, demulcents, diluents, buffers, flavoring agents, and coloring agents may be added.
脂質代謝改善剤（コレステロール抑制ないしは低減剤、コレステロールの質の改善剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、ＳＲＥＢＰ抑制剤を含む。）中の上記ペプチド又はペプチド混合物の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤又は組成物の全体に対して、約０．００１〜１００重量％が好ましく、約１〜９５重量％がより好ましく、約１０〜９０重量％がさらにより好ましく、約３０〜８５重量％がさらにより好ましい。 The content of the peptide or peptide mixture in the lipid metabolism improver (including cholesterol suppressant or reducer, cholesterol quality improver, HMG-CoA reductase inhibitor, SREBP inhibitor) is calculated in terms of dry weight. , Preferably about 0.001 to 100% by weight, more preferably about 1 to 95% by weight, still more preferably about 10 to 90% by weight, and about 30 to 85% by weight relative to the whole preparation or composition. Even more preferred.
また、ＴＮＦ-α抑制剤、及びＴＮＦ-αの過剰又は過活性化が原因となる疾患の予防、改善、又は治療剤中の上記ペプチド又はペプチド混合物の含有量は、乾燥重量に換算して、製剤又は組成物の全体に対して、約０．００１〜１００重量％が好ましく、約１〜９５重量％がより好ましく、約１０〜９０重量％がさらにより好ましく、約３０〜８５重量％がさらにより好ましい。 In addition, the content of the peptide or peptide mixture in the TNF-α inhibitor and the preventive, ameliorative, or therapeutic agent for diseases caused by excess or overactivation of TNF-α is converted to dry weight, About 0.001 to 100% by weight, preferably about 1 to 95% by weight, more preferably about 10 to 90% by weight, and further about 30 to 85% by weight, based on the total formulation or composition. More preferred.
食品組成物
本発明のペプチド混合物又はペプチドを食品組成物の有効成分として使用する場合、この食品組成物は、上記ペプチド混合物又はペプチドを、乾燥重量に換算して、食品組成物全体に対して、例えば約０．００１〜１００重量％、好ましくは約１〜９５重量％、より好ましくは約１０〜９０重量％、さらにより好ましくは約３０〜８５重量％含んでいればよい。
この食品組成物は、栄養補助食品（サプリメント）、健康補助食品、栄養調整食品といった一般食品として用いるのに適している。また、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品）として好適に使用できる。この食品組成物は、本発明のペプチド混合物又はペプチドを上記範囲で含むことにより、無理なく摂取できる食品量中に、十分な活性を示すペプチド混合物又はペプチドが含まれることになる。
Food composition When the peptide mixture or peptide of the present invention is used as an active ingredient of a food composition, the food composition is obtained by converting the peptide mixture or peptide into a dry weight, with respect to the whole food composition. For example, it may contain about 0.001 to 100% by weight, preferably about 1 to 95% by weight, more preferably about 10 to 90% by weight, and still more preferably about 30 to 85% by weight.
This food composition is suitable for use as a general food such as a nutritional supplement (supplement), a health supplement, and a nutritionally adjusted food. Moreover, it can be conveniently used as a health functional food (food for specified health use, nutritional functional food, functional indication food). By including the peptide mixture or peptide of the present invention in the above range, this food composition contains the peptide mixture or peptide exhibiting sufficient activity in the amount of food that can be taken without difficulty.
この食品組成物は、食品に通常用いられる賦形剤または添加剤を配合して、錠剤、タブレット剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、カプセル剤、水和剤、乳剤、液剤、エキス剤、またはエリキシル剤等の剤型に調製することができる。中でも、ペプチド粉末の劣化を防止できる点で、カプセル剤が好ましい。
食品に通常用いられる賦形剤としては、シロップ、アラビアゴム、ショ糖、乳糖、粉末還元麦芽糖、セルロース糖、マンニトール、マルチトール、デキストラン、デンプン類、ゼラチン、ソルビット、トラガント、ポリビニルピロリドンのような結合剤；ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコールのような潤沢剤；ジャガイモ澱粉のような崩壊剤；ラウリル硫酸ナトリウムのような湿潤剤等が挙げられる。添加剤としては、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。
This food composition is blended with excipients or additives usually used in foods, tablets, tablets, pills, granules, powders, powders, capsules, wettable powders, emulsions, liquids, extracts. Or a dosage form such as an elixir. Among these, capsules are preferable in that the deterioration of the peptide powder can be prevented.
Common excipients used in food include syrup, gum arabic, sucrose, lactose, powdered reduced maltose, cellulose sugar, mannitol, maltitol, dextran, starches, gelatin, sorbit, tragacanth, polyvinylpyrrolidone Agents; sucrose fatty acid esters, glycerin fatty acid esters, magnesium stearate, calcium stearate, talc, polyethylene glycol, etc .; disintegrants such as potato starch; wetting agents such as sodium lauryl sulfate. Examples of additives include fragrances, buffers, thickeners, colorants, stabilizers, emulsifiers, dispersants, suspending agents, preservatives, and the like.
（５）使用方法
本発明の脂質代謝改善剤（コレステロール抑制ないしは低減剤、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ抑制剤、ＳＲＥＢＰ抑制剤を含む。）、ＴＮＦ-α抑制剤、及びＴＮＦ-αの過剰又は過活性化が原因となる疾患の予防、改善、又は治療剤の１日使用量は、対象者の症状又は状態、体重、性別などによって異なるが、有効成分であるペプチド混合物又はペプチドの乾燥重量に換算した１日使用量が、例えば約０．１〜２０ｇ、好ましくは約０．５〜１０ｇ、より好ましくは約１〜５ｇになるようにすればよい。この量を、例えば、１日に約１〜１、２、３、４、又は５回に分けて使用すればよい。また、投与期間は、対象者の症状又は状態によって異なるが、例えば、約１４日以上、中でも約２８日以上、中でも約５６日以上とすることができる。本発明のペプチド混合物又はペプチドは、長期にわたり摂取しても副作用はないが、本発明の各剤の投与期間は、例えば、１年以下、中でも約３６０日以下、中でも約１８０日以下、中でも約１００日以下とすることができる。
また、本発明の各剤は、通常、経口投与される。
(5) Method of use Lipid metabolism improving agent of the present invention (including cholesterol inhibitor or reducing agent, HMG-CoA reductase inhibitor, SREBP inhibitor), TNF-α inhibitor, and excess or overactivation of TNF-α The daily use amount of the preventive, ameliorating, or therapeutic agent for the disease caused by the symptom varies depending on the subject's symptom or condition, body weight, gender, etc., but is converted to the dry weight of the active ingredient peptide mixture or peptide 1 The daily use amount may be, for example, about 0.1 to 20 g, preferably about 0.5 to 10 g, more preferably about 1 to 5 g. This amount may be used, for example, in about 1-1, 2, 3, 4, or 5 times a day. The administration period varies depending on the subject's symptom or condition, and can be, for example, about 14 days or more, especially about 28 days or more, and especially about 56 days or more. Although the peptide mixture or peptide of the present invention has no side effects even when ingested over a long period of time, the administration period of each agent of the present invention is, for example, 1 year or less, especially about 360 days or less, especially about 180 days or less, especially about It can be 100 days or less.
Each agent of the present invention is usually administered orally.
（６）対象となる疾患又は状態
脂質代謝異常症（脂質異常症）は、コレステロール（特に、ＬＤＬコレステロール）の過多と、中性脂肪であるトリグリセリドの過多に大別される。このような脂質異常は、高脂血症、肥満（特に、脂肪肝などの内臓脂肪型の肥満）などを特徴とするメタボリックシンドロームを招き、それが、高脂血症、高血圧、糖尿病、動脈硬化などの生活習慣病を引き起こす。
本発明のペプチド混合物又はペプチドは、体内のコレステロール、特に、疾患の原因となる悪玉コレステロールであるＬＤＬコレステロール、及び中性脂肪の量を低減させるため、本発明の脂質代謝改善剤は、脂質代謝異常症（脂質異常症）、高脂血症、肥満（特に、脂肪肝などの内臓脂肪型の肥満）、メタボリックシンドローム、高脂血症、高血圧、糖尿病、動脈硬化などの患者、又はこのような症状を有する未病状態のヒトが好適な対象となる。従って、本発明の脂質代謝改善剤は、これらの疾患における脂質代謝改善剤として使用することができる。また、本発明のペプチド混合物又はペプチドは、これらの疾患の予防、改善、又は治療剤の有効成分として使用できる。
また、本発明のＴＮＦ-α抑制剤、及びＴＮＦ-αの過剰又は過活性化が原因となる疾患の予防、改善、又は治療剤は、関節リウマチ、乾癬の患者、又はこのような症状を有する未病状態のヒトが好適な対象となる。従って、本発明のペプチド混合物又はペプチドは、関節リウマチ、乾癬の予防、改善、又は治療剤の有効成分として使用できる。
(6) Diseases or conditions to be treated Lipid metabolism disorders (dyslipidemia) are broadly classified into an excess of cholesterol (particularly LDL cholesterol) and an excess of triglycerides, which are neutral fats. Such lipid abnormalities lead to metabolic syndrome characterized by hyperlipidemia, obesity (especially visceral fat type obesity such as fatty liver), which is hyperlipidemia, hypertension, diabetes, arteriosclerosis Causes lifestyle-related diseases such as
Since the peptide mixture or peptide of the present invention reduces the amount of cholesterol in the body, in particular, LDL cholesterol, which is a bad cholesterol causing disease, and neutral fat, the lipid metabolism improving agent of the present invention is used for abnormal lipid metabolism. Patients with dyslipidemia, hyperlipidemia, obesity (especially visceral fat type obesity such as fatty liver), metabolic syndrome, hyperlipidemia, hypertension, diabetes, arteriosclerosis, or such symptoms Non-disease humans with a suitable target. Therefore, the lipid metabolism improving agent of the present invention can be used as a lipid metabolism improving agent in these diseases. Moreover, the peptide mixture or peptide of the present invention can be used as an active ingredient of a preventive, ameliorating or therapeutic agent for these diseases.
In addition, the TNF-α inhibitor of the present invention and the preventive, ameliorating, or therapeutic agent for diseases caused by excess or overactivation of TNF-α have rheumatoid arthritis, psoriasis patients, or such symptoms. An unaffected human is a suitable subject. Therefore, the peptide mixture or peptide of the present invention can be used as an active ingredient of an agent for preventing, improving or treating rheumatoid arthritis and psoriasis.
[実施例]
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（１）ペプチド混合物の製造
（1-1）ペプチドＲ
酒粕６０ｋｇ（湿重量、固形分５８．４％）に水１２０Ｌを添加し十分に攪拌した。この混合物を５０℃に保温した状態でセルラーゼ（トリコデルマ属由来、セルロシンＴ２；エイチビィアイ社製）３０ｇとβ−アミラーゼ（麦芽由来、ビオザイムＭ；天野エンザイム社製）３０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した。分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株）；ＯＮＳ自動圧濾圧搾機500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、蛋白高含有酒粕４１．９ｋｇ（湿重量、固形分５６．８％）を得た。
[Example]
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example, this invention is not limited to these Examples.
(1) Production of peptide mixture
(1-1) Peptide R
To 60 kg of sake lees (wet weight, solid content 58.4%), 120 L of water was added and sufficiently stirred. While maintaining this mixture at 50 ° C., 30 g of cellulase (derived from Trichoderma, cellulosin T2; manufactured by HIBI) and 30 g of β-amylase (derived from malt, Biozyme M; manufactured by Amano Enzyme) were added, and the mixture was stirred at 50 ° C. for 16 hours. Disassembled. After the decomposition, the reaction was stopped by heating at 90 ° C. for 10 minutes. It is squeezed at 5 kg / cm 2 for 3 hours with a press (NSK Engineering Co., Ltd .; ONS automatic press filter press 500 type) to obtain 41.9 kg (wet weight, solid content 56.8%) of sake lees with high protein content. It was.
次いで、得られた蛋白高含有酒粕４１．９ｋｇに水１８０Ｌを加え、ＫＯＨでｐＨ６．８に調製し、よく攪拌した。５０℃に保温した状態で、中性プロテアーゼ（バチルス属細菌由来、プロテアーゼＮアマノＧ；天野エンザイム社製）２１０ｇを添加し、５０℃で１６時間分解した。さらに、ＨＣｌでｐＨ４．２に調製し、よく攪拌した後、酸性プロテアーゼ（アスペルギルス属菌由来、スミチームＡＰ；新日本化学工業社製）２５０ｇを添加して６０℃で２２時間さらに分解した。分解終了後、９０℃で１０分間加熱して反応を停止した。圧搾機（ＮＳＫエンジニアリング（株）、ＯＮＳ自動圧濾圧搾機 500型）にて５kg/ｃｍ２で３時間圧搾し、ＡＣＥ阻害作用を有するペプチド混合液２００Ｌを得た。
得られたペプチド混合物を減圧濃縮法で濃縮し、さらにフリーズドライ法で粉末化した。減圧濃縮はロータリーエバポレーター（日本ビュッヒ株式会社製 RE121 Rotavapor：湯浴温度50℃、100rpm）とアスピレーター（ヤマト科学製 Neocool Aspirator BP-51：冷却温度5℃）を用いて行なった。フリーズドライは凍結乾燥機（EYELA 東京理化器械株式会社製 FDU-2100）を用いてマイナス８０℃、真空度０．４Paで粉末になるまで除湿乾燥させることにより行った。
得られたペプチド混合物をペプチドＲと命名した。
Next, 180 L of water was added to 41.9 kg of the resulting protein-rich sake lees, and the pH was adjusted to 6.8 with KOH, followed by thorough stirring. While maintaining the temperature at 50 ° C., 210 g of neutral protease (derived from the genus Bacillus, protease N Amano G; manufactured by Amano Enzyme) was added and decomposed at 50 ° C. for 16 hours. Furthermore, after adjusting to pH 4.2 with HCl and stirring well, 250 g of acidic protease (derived from Aspergillus sp., Sumiteam AP; manufactured by Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.) was added and further decomposed at 60 ° C. for 22 hours. After the decomposition, the reaction was stopped by heating at 90 ° C. for 10 minutes. The mixture was squeezed at 5 kg / cm 2 for 3 hours with a squeezing machine (NSK Engineering Co., Ltd., ONS automatic squeezing press 500 type) to obtain 200 L of a peptide mixture having an ACE inhibitory action.
The obtained peptide mixture was concentrated by a vacuum concentration method, and further powdered by a freeze-dry method. Concentration under reduced pressure was performed using a rotary evaporator (RE121 Rotavapor manufactured by Nihon Büch Co., Ltd .: hot water bath temperature 50 ° C., 100 rpm) and an aspirator (Neocool Aspirator BP-51 manufactured by Yamato Scientific Co., Ltd .: cooling temperature 5 ° C.). Freeze-drying was performed by dehumidifying and drying to a powder at −80 ° C. and a vacuum degree of 0.4 Pa using a freeze dryer (EYELA Tokyo Rika Kikai Co., Ltd. FDU-2100).
The resulting peptide mixture was named Peptide R.
（1-2）ペプチドＳ
液化液による清酒醸造法により米から清酒を醸造したときの酒粕（水分３６％）１０ｇを０．２ｌの水に懸濁し、大和化成製（現在は、天野エンザイム社が販売）蛋白分解酵素（サモアーゼ）を０．２ｇ加え、３７℃で反応させた。その後沸騰水浴中で１０分間加熱した後５０００回転１０分間の遠心分離により溶解物を得、凍結乾燥によりペプチド画分を得た。
得られたペプチド混合物をペプチドＳと命名した。
(1-2) Peptide S
10g of sake lees (moisture 36%) when brewing sake from rice by the liquor brewing method is suspended in 0.2 liters of water and manufactured by Daiwa Kasei (currently sold by Amano Enzyme). Proteolytic enzyme (Samoase) ) Was added and reacted at 37 ° C. Thereafter, the mixture was heated in a boiling water bath for 10 minutes, then centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes to obtain a lysate, and freeze-dried to obtain a peptide fraction.
The obtained peptide mixture was named peptide S.
（２）ペプチド混合物中のペプチドの定量
上記ペプチドＲ及びペプチドＳ中に含まれるペプチドをＬＣ／ＭＳ分析法により定量した。分析条件を以下に示す。
（2-1）ペプチド標準試料の測定
(i)ペプチド標準溶液の調製
分取した各ペプチド、Ｔｈｒ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｉｌｅ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（シグマ社製）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ（シグマ社製）、Ａｓｎ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（シグマ社製）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（東レリサーチセンター社製）、Ａｒｇ−Ｐｈｅ（シグマ社製）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ（国産化学社製）、Ｇｌｎ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｓｅｒ−Ｔｒｐ（東レリサーチセンター社製）、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（国産化学社製）、Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（国産化学社製）、Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（ペプチド合成装置により自社製造）、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ（国産化学社製）、Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ（国産化学社製）、及びＴｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ（東レリサーチセンター社製）、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ペプチド合成装置により自社製造）１０ｍｇをそれぞれ量り取り、水または0.1N塩酸水溶液を加え完全に溶解させ、１ｍｌに定容し、各々のペプチド標準溶液を作成した。
(2) Quantification of peptide in peptide mixture Peptides contained in peptide R and peptide S were quantified by LC / MS analysis. The analysis conditions are shown below.
(2-1) Measurement of peptide standard samples
(i) Preparation of peptide standard solution Each of the collected peptides, Thr-Trp (manufactured by Toray Research Center), Ile-Trp (manufactured by Toray Research Center), Pro-Tyr (manufactured by Sigma), Val-Tyr (Sigma) ), Asn-Trp (manufactured by Toray Research Center), Phe-Phe (manufactured by Sigma), Ile-Tyr (manufactured by Toray Research Center), Arg-Phe (manufactured by Sigma), Phe-Trp (domestic chemistry) Gln-Trp (manufactured by Toray Research Center), Ser-Trp (manufactured by Toray Research Center), Ile-Lys-Tyr (manufactured by Kokusan Kagaku), Leu-Lys-Tyr (manufactured by Kokusan Kagaku), Ile-Gln-Pro (manufactured by Toray Research Center), Leu-Gln-Pro (manufactured by Toray Research Center), Ile-Tyr-Pro Toray Research Center), Phe-Pro-Pro (Toray Research Center), Ile-Tyr-Pro-Arg-Tyr (manufactured by a peptide synthesizer), Val-Arg-Tyr (made by Kokusan Kagaku) Weigh 10 mg of Val-Arg-Pro (manufactured by Kokusan Kagaku Co., Ltd.), Tyr-Lys-Pro (manufactured by Toray Research Center), and Tyr-Gly-Gly-Tyr (manufactured by a peptide synthesizer) in water or 0.1 N hydrochloric acid aqueous solution was added and dissolved completely, and the volume was adjusted to 1 ml to prepare each peptide standard solution.
(ii)内部標準物質溶液の調製
Ｎ−ｃａｒｂａｍｙｌ−Ｌ−Ａｒｇ（ＳＩＧＭＡ社製）１０ｍｇを量り取り、０．０６Ｎ塩酸水溶液１ｍｌで完全に溶解させ、内部標準原液とした。
(iii)標準溶液の調製
ペプチド標準溶液と内部標準原液を混合し、ペプチドと内部標準物質が各0.0１ｍｇ／ｍｌ、0.1ｍｇ／ｍｌになるよう各々のペプチド標準溶液を調製した。下記のＬＣ／ＭＳ分析条件により、ペプチドのＭＳピーク面積を測定した。
装置：Waters Alliance 2695-2996-ZQ4000(LC-フォトダイオードアレイ検出器-MS検出器)
カラム： Imtakt UK-C18 4.6×75mm
移動相：A液：0.05% HCOOH/水、B液：アセトニトリル（0-25%/0-7.5分、100%/7.5-8.5分）
注入量：10 μＬ
流速：1.0ｍｌ/分
カラム温度：35℃
検出条件：UV 190-300 nm
MS エレクトロスプレーイオン（ESI）法 positive ＳＩＲモード ＋25V
(ii) Preparation of internal standard substance solution 10 mg of N-carbamyl-L-Arg (manufactured by SIGMA) was weighed and completely dissolved in 1 ml of 0.06N aqueous hydrochloric acid solution to obtain an internal standard stock solution.
(iii) Preparation of standard solution The peptide standard solution and the internal standard stock solution were mixed, and each peptide standard solution was prepared so that the peptide and the internal standard substance would be 0.01 mg / ml and 0.1 mg / ml, respectively. The MS peak area of the peptide was measured under the following LC / MS analysis conditions.
Equipment: Waters Alliance 2695-2996-ZQ4000 (LC-photodiode array detector-MS detector)
Column: Imtakt UK-C18 4.6 × 75mm
Mobile phase: Liquid A: 0.05% HCOOH / water, liquid B: Acetonitrile (0-25% / 0-7.5 minutes, 100% / 7.5-8.5 minutes)
Injection volume: 10 μL
Flow rate: 1.0 ml / min Column temperature: 35 ° C
Detection condition: UV 190-300 nm
MS electrospray ion (ESI) method positive SIR mode + 25V
（2-2）ペプチドの定量
ペプチドＲ及びペプチドＳの各１０ｍｇを純水1ｍｌに溶解し、ペプチド水溶液とした。
ペプチド水溶液と内部標準原液と混合し、酒粕ペプチドと内部標準物質が各0.002ｇ／ｍｌ、0.1ｍｇ／ｍｌになるよう試料溶液を調製し、標準溶液の場合と同様に各ペプチドのMSピーク面積を測定した。
得られたペプチドのMSピーク面積より、以下の式に従ってペプチド含有量を算出した。
試料のペプチド含有量（ｍｇ/g）＝
［標準溶液のペプチド濃度（mｇ/ml）×（試料溶液のペプチドピーク面積/試料のＩＳピーク面積）/（標準溶液のペプチドピーク面積/標準溶液のＩＳピーク面積）/試料のペプチド濃度（ｇ/ml）］
(2-2) Determination of peptide 10 mg each of peptide R and peptide S was dissolved in 1 ml of pure water to obtain a peptide aqueous solution.
Mix the peptide aqueous solution and the internal standard stock solution, and prepare sample solutions so that the sake liquor peptide and internal standard substance are 0.002 g / ml and 0.1 mg / ml, respectively. It was measured.
The peptide content was calculated from the MS peak area of the obtained peptide according to the following formula.
Sample peptide content (mg / g) =
[Peptide concentration of standard solution (mg / ml) × (peptide peak area of sample solution / IS peak area of sample) / (peptide peak area of standard solution / IS peak area of standard solution) / peptide concentration of sample (g / ml)]
（2-3）結果
ペプチドＲ及びペプチドＳ中の各ペプチドの含有量（重量％）を以下の表２に示す。
（３）ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ産生抑制（Ｎｏ．１）
（3-1）方法
ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＨＳ研究資源バンク製）を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２濃度で２４時間培養した。その後、培地を捨て、各被験ペプチドを最終濃度０．１％になるように、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地とともに細胞に添加し、４８時間後、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子の発現量を測定した。
(3) Suppression of HMG-CoA reductase production (No. 1)
(3-1) Method A human liver cancer-derived cell line HepG2 (manufactured by HS Research Resource Bank) was cultured in a DMEM medium containing 10% FBS at 37 ° C. and 5% CO 2 concentration for 24 hours. Thereafter, the medium was discarded, and each test peptide was added to the cells together with the DMEM medium not containing FBS so that the final concentration was 0.1%. After 48 hours, the expression level of the HMG-CoA reductase gene was measured.
細胞を回収してホモジナイズし、ISOGEN (NIPPON GENE Co., LTD, Tokyo, Japan)を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収したのちReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO CO., LTD., Osaka, Japan)で逆転写反応を行いｃＤＮＡを生成した。その後、So Fast Eva Green(Bio-Rad)を使用し、7500/7500Fast Real-Time System (Applied Biosystem, Japan)にてＲｅａｌ-Ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析により、ｃＤＮＡの定量を行った。用いたプライマーは以下の通りである。
HMG-CoA レダクターゼ (ヒト)
F-5’-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3’ （配列番号１）
R-5’-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3’（配列番号２）
Cells were collected and homogenized, and total RNA was collected using ISOGEN (NIPPON GENE Co., LTD, Tokyo, Japan), then reversed with ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO CO., LTD., Osaka, Japan) A photoreaction was performed to generate cDNA. Thereafter, cDNA was quantified by Real-Time PCR analysis using 7700/7500 Fast Real-Time System (Applied Biosystem, Japan) using So Fast Eva Green (Bio-Rad). The primers used are as follows.
HMG-CoA reductase (human)
F-5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3 '(SEQ ID NO: 1)
R-5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3 '(SEQ ID NO: 2)
被験物質として、ペプチドＲ、ペプチドＳ、及び下記表３、表４に示すペプチドを用いた。コントロールはペプチドを使用しなかったものである。 As test substances, peptide R, peptide S, and peptides shown in Tables 3 and 4 below were used. The control was one that did not use a peptide.
（3-2）結果
各ペプチド存在下でのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現量を、コントロールのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現量に対する百分率で表した結果を、以下の表３、表４に示す。
ペプチドＲ、ペプチドＳ、Ａｒｇ-Ｌｅｕ、Ｖａｌ-Ｇｌｎに、強いＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現抑制活性が認められた。また、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｇｌｕ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ（グルタチオン）にも、やや強いＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現抑制活性が認められた。また、Ｐｒｏ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｔｒｐにも、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子発現抑制活性が認められた。 Peptide R, peptide S, Arg-Leu, and Val-Gln were found to have strong HMG-CoA reductase gene expression inhibitory activity. Ile-Tyr, Phe-Trp, and Glu-Cys-Gly (glutathione) also showed a slightly strong HMG-CoA reductase gene expression inhibitory activity. Moreover, HMG-CoA reductase gene expression inhibitory activity was also observed in Pro-Tyr and Ile-Trp.
（４）ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ産生抑制（Ｎｏ．２）
（4-1）方法
ペプチドＲ、ペプチドＳがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの発現を抑制することを、蛋白質レベルでも確認した。具体的には、ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＨＳ研究資源バンク製）を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２濃度で２４時間培養した。その後、培地を捨て、各被験ペプチドを最終濃度０．１％になるように、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地とともに細胞に添加し、４８時間後、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ蛋白質をウエスタンブロッティング法で観察した。得られた細胞を破砕溶解して、細胞溶解緩衝液を用いて単離したタンパク質３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に供して分離した。電気泳動後ＰＶＤＦ膜に転写し、これを５％スキムミルクを含むＴＢＳＴブロッキング剤で1時間処理した後、抗ＨＭＧ−ＣoＡ還元酵素−ウサギポリクローナル抗体（抗-ＨＭＧＣＲ ａｂｃａｍ社製）を1：10000で室温で1時間反応させた。次いで得られたＰＶＤＦ膜をＴＢＳＴで軽く5分間洗浄し、HRP結合-抗ウサギIgG（Santacruz Biotechnology）で60分間インキュベーションした。タンパク質のバンドを、化学発光試薬：Amersham ECL (ECL Western Blotting Detection System;GE Healthcare社製）を用いて検出した。
（4-2）結果
ウェスタンブロッティングの結果を図１に示す。ペプチドＲ、ペプチドＳの存在により、ＨＭＧ-ＣｏＡレダクターゼ量は大きく低減した。
(4) Inhibition of HMG-CoA reductase production (No. 2)
(4-1) Method It was also confirmed at the protein level that peptide R and peptide S suppress the expression of HMG-CoA reductase. Specifically, a human liver cancer-derived cell line HepG2 (manufactured by HS Research Resource Bank) was cultured for 24 hours at 37 ° C. with a CO 2 concentration of 5% using a DMEM medium containing 10% FBS. Thereafter, the medium was discarded, and each test peptide was added to the cells together with a DMEM medium containing no FBS so that the final concentration was 0.1%. After 48 hours, the HMG-CoA reductase protein was observed by Western blotting. The obtained cells were disrupted and lysed, and 30 μg of protein isolated using a cell lysis buffer was subjected to SDS-PAGE electrophoresis and separated. After electrophoresis, it was transferred to a PVDF membrane, treated with a TBST blocking agent containing 5% skim milk for 1 hour, and then anti-HMG-CoA reductase-rabbit polyclonal antibody (anti-HMGCR abcam) was used at 1: 10000 at room temperature. For 1 hour. The resulting PVDF membrane was then gently washed with TBST for 5 minutes and incubated with HRP-conjugated anti-rabbit IgG (Santacruz Biotechnology) for 60 minutes. Protein bands were detected using a chemiluminescent reagent: Amersham ECL (ECL Western Blotting Detection System; manufactured by GE Healthcare).
(4-2) Results The results of Western blotting are shown in FIG. The presence of peptide R and peptide S greatly reduced the amount of HMG-CoA reductase.
（５）転写因子ＳＲＥＢＰ産生抑制
（5-1）方法
ヒト肝癌由来細胞株ＨｅｐＧ２（ＨＳ研究資源バンク製）を、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて３７℃、５％のＣＯ２濃度で２４時間培養した。その後、培地を捨て、各被験ペプチドを最終濃度０．１％になるように、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ培地とともに細胞に添加し、４８時間後、ＳＲＥＢＰ遺伝子の発現量を測定した。
(5) Inhibition of transcription factor SREBP production
(5-1) Method The human liver cancer-derived cell line HepG2 (manufactured by HS Research Resource Bank) was cultured in a DMEM medium containing 10% FBS at 37 ° C. and a CO 2 concentration of 5% for 24 hours. Thereafter, the medium was discarded, and each test peptide was added to the cells together with the DMEM medium not containing FBS so that the final concentration was 0.1%. After 48 hours, the expression level of the SREBP gene was measured.
細胞を回収してホモジナイズし、ISOGEN (NIPPON GENE Co., LTD, Tokyo, Japan)を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡを回収した後、ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO CO., LTD., Osaka, Japan)で逆転写反応を行いｃＤＮＡを生成した。その後、Go Taqを用いてＰＣＲ解析を行った。
用いたプライマーは以下の通りである。
Cells were collected and homogenized, and total RNA was collected using ISOGEN (NIPPON GENE Co., LTD, Tokyo, Japan), and then ReverTra Ace qPCR RT Kit (TOYOBO CO., LTD., Osaka, Japan) Reverse transcription was performed to generate cDNA. Thereafter, PCR analysis was performed using Go Taq.
The primers used are as follows.
SREBP1c（ヒト）
F-5’-GTGGCGGCTGCATTGAGAGTGAAG-３’（配列番号３）
R-5’-AGGTACCCGAGGGCATCCGAGAAT-３’（配列番号４）
SREBP2（ヒト）
F-5’-TGGGAGAGTTCCCTGACTTGT-３’（配列番号５）
R-5’-TGAATGACCGTTGCACTGAAG-３’（配列番号６）
SREBP1c (human)
F-5'-GTGGCGGCTGCATTGAGAGTGAAG-3 '(SEQ ID NO: 3)
R-5'-AGGTACCCGAGGGCATCCGAGAAT-3 '(SEQ ID NO: 4)
SREBP2 (human)
F-5'-TGGGAGAGTTCCCTGACTTGT-3 '(SEQ ID NO: 5)
R-5'-TGAATGACCGTTGCACTGAAG-3 '(SEQ ID NO: 6)
（5-2）被験物質
被験物質として、ペプチドＲ、及び下記表５、表６に示すペプチドを用いた。コントロールはペプチドを使用しなかったものである。
(5-2) Test substance Peptide R and the peptides shown in Tables 5 and 6 below were used as test substances. The control was one that did not use a peptide.
（5-3）結果
各ペプチド存在下でのＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の各発現量を、コントロールの遺伝子発現量に対する百分率で表した結果を、以下の表５、表６に示す。
ペプチドＲ、Ａｒｇ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ、Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏは、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の両方の発現を強く抑制した。Ｉｌｅ−Ａｓｎ、Ｔｙｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ-Ａｓｎ、Ｇｌｙ−Ｉｌｅも、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子及びＳＲＥＢＰ２遺伝子の両方の発現を抑制した。また、Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｔｙｒ−Ｇｌｙは、ＳＲＥＢＰ１ｃ遺伝子の発現を抑制した。 Peptide R, Arg-Leu, Val-Gln, Phe-Trp, and Ile-Lys-Pro-Pro strongly suppressed the expression of both the SREBP1c gene and the SREBP2 gene. Ile-Asn, Tyr-Pro, Leu-Asn, and Gly-Ile also suppressed the expression of both the SREBP1c gene and the SREBP2 gene. Pro-Arg, Pro-Trp, and Tyr-Gly suppressed the expression of the SREBP1c gene.
（６）高脂肪食マウスの脂質代謝に及ぼす影響
（6-1）方法
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｊ）の実験マウス６週齢を２２± ２℃、昼夜１２時間サイクル（約午前8:00〜午後8:00)の環境下で飼育した。全てのマウスを４週間の肥育期間を設けて肥育した後、通常食/水(R/DW:Regular/distilled water)、高脂肪食/水(HF/DW:High Fat/distilled water)、高脂肪食/ペプチド(HF/P:High Fat/Peptide)の摂餌方法ごとに３グループに分け、各摂餌法で４週間飼育した。期間中のペプチド投与は１７５ｍｇのペプチドＲを含むペプチド水をゾンデにより経口投与を行った。対照として通常食/水、高脂肪食/水のグループには蒸留水を同量与えた。高脂肪食はＨｉｇｈ Ｆａｔ Ｄｉｅｔ ３２(CLEA Japan, Inc.)を使用した。飼育期間の最終日に１６時間の絶食時間を設けた後に、解剖し、血液、肝臓、精巣上体周囲部脂肪組織を採取した。血液は３,０００ｇ、４℃、１０分間の条件で遠心分離をかけ血清を分離し、肝臓は重量を計測し、−８０℃で冷凍保存した。
(6) Effects on lipid metabolism in high-fat diet mice
(6-1) Method C57BL / 6 (J) Experimental mice 6-week-old were reared in an environment of 22 ± 2 ° C., 12 hours day and night cycle (about 8:00 am to 8:00 pm). After fattening all mice for a period of 4 weeks, regular / distilled water (R / DW), high fat / distilled water (HF / DW), high fat The food / peptide (HF / P: High Fat / Peptide) feeding method was divided into 3 groups, and each feeding method was raised for 4 weeks. Peptide administration during the period was orally administered with a probe water containing 175 mg of peptide R. As controls, the same amount of distilled water was given to the normal diet / water and high fat diet / water groups. The high fat diet used High Fat Diet 32 (CLEA Japan, Inc.). After a fasting time of 16 hours on the last day of the breeding period, the animals were dissected and blood, liver, and epididymal fat tissue were collected. The blood was centrifuged at 3,000 g, 4 ° C. for 10 minutes to separate the serum, and the liver was weighed and stored frozen at −80 ° C.
＜血清総コレステロール＞
BioMajesty (JCA-BM2250) (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)を用いて、血清中の総コレステロールを測定した。
<Serum total cholesterol>
Total cholesterol in serum was measured using BioMajesty (JCA-BM2250) (JEOL Ltd., Tokyo, Japan).
＜肝臓トリグリセリド＞
マウスの肝臓(40-60 mg)をホモジナイズしたのちクロロホルム/メタノール(2:1)混合液を加え、１５分のボルテックスを行ったのち一晩常温で放置した。その抽出液から固形成分を取り除き０．５ｍＬの蒸留水を加え３０分静置したのち、８０００ｇ、４℃、１０分の条件下で遠心分離を行った。分離後の下層(有機層)を採取しさらに０．６ｍＬのクロロホルム/メタノール/蒸留水(2:1:3)混合液を加え30分間ボルテックスし、さらに３０分静置した後、８０００ｇ、４℃、１０分で遠心分離した。その下層(有機層)を採取し、窒素置換気において液体成分を蒸発させ、残った固形成分を１ｍＬのイソプロパノール/Triton X-100(19/1)混合液で溶解してサンプルを調製し、 BioMajesty (JCA-BM2250) (JEOL Ltd., Tokyo, Japan)を用いて、肝臓中のトリグリセリドを測定した。
<Liver triglyceride>
After homogenizing mouse liver (40-60 mg), chloroform / methanol (2: 1) mixture was added, vortexed for 15 minutes, and allowed to stand overnight at room temperature. The solid component was removed from the extract, 0.5 mL of distilled water was added, and the mixture was allowed to stand for 30 minutes, and then centrifuged at 8000 g, 4 ° C., and 10 minutes. The lower layer (organic layer) after separation was collected, 0.6 mL of a chloroform / methanol / distilled water (2: 1: 3) mixture was added, vortexed for 30 minutes, allowed to stand for another 30 minutes, and then 8000 g, 4 ° C. Centrifuged for 10 minutes. The lower layer (organic layer) is collected, the liquid component is evaporated in a nitrogen atmosphere, the remaining solid component is dissolved in 1 mL of isopropanol / Triton X-100 (19/1) mixture, and a sample is prepared. Triglycerides in the liver were measured using (JCA-BM2250) (JEOL Ltd., Tokyo, Japan).
＜遺伝子発現量＞
下記プライマーを用いた他は、「（5-2）ＳＲＥＢＰ遺伝子発現量の測定」と同様にして、肝臓中のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＳＲＥＢＰ２、ＴＮＦ−α、及び低密度リポコレステロール（ＬＤＬ）レセプターの遺伝子発現量を測定した。
HMG-CoAレダクターゼ (マウス)
F-5’-GTTCTTTCCGTGCTGTGTTCTGGA-3’ （配列番号７）
R-5’-CTGATATCTTTAGTGCAGAGTGTGGCAC-3’（配列番号８）
SREBP2 (マウス)
F-5’-AGAGAGGCGGACAACACACAATATC-3’（配列番号９）
R-5’-CCTTCCTCAGAACGCCAGAC-3’ （配列番号１０）
TNF-α（マウス）
F-5’-GATCTCAAAGACAACCAACTAGTG-3’（配列番号１１）
R-5’-CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3’（配列番号１２）
LDLコレステロールレセプター (マウス)
F-5’-ACTCAGGCAGCAGGAACGAG-3’（配列番号１３）
R-5’-GTCATTTTCAAGTCTACCT-3’ （配列番号１４）
<Gene expression level>
Other than using the following primers, HMG-CoA reductase, SREBP2, TNF-α, and low density lipocholesterol (LDL) receptor in the liver were analyzed in the same manner as in “(5-2) Measurement of SREBP gene expression level”. The gene expression level was measured.
HMG-CoA reductase (mouse)
F-5'-GTTCTTTCCGTGCTGTGTTCTGGA-3 '(SEQ ID NO: 7)
R-5'-CTGATATCTTTAGTGCAGAGTGTGGCAC-3 '(SEQ ID NO: 8)
SREBP2 (mouse)
F-5'-AGAGAGGCGGACAACACACAATATC-3 '(SEQ ID NO: 9)
R-5'-CCTTCCTCAGAACGCCAGAC-3 '(SEQ ID NO: 10)
TNF-α (mouse)
F-5'-GATCTCAAAGACAACCAACTAGTG-3 '(SEQ ID NO: 11)
R-5'-CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG-3 '(SEQ ID NO: 12)
LDL cholesterol receptor (mouse)
F-5'-ACTCAGGCAGCAGGAACGAG-3 '(SEQ ID NO: 13)
R-5'-GTCATTTTCAAGTCTACCT-3 '(SEQ ID NO: 14)
＜病理組織学的解析＞
精巣上体周囲部脂肪組織と肝臓を採取し、ホルマリン固定後、パラフィン包埋を行った。包埋処理を行った組織は滑走式ミクロトーム(Yamato Kohki Industrial Co., Ltd., Saitama, Japan)を用いて厚さ4μmの切片に薄切した。薄切した切片にヘマトキシリン・エオジン染色を行った。また、肝臓はOTC compound (Sakura Finetek Japan Co., Ltd., Tokyo, Japan)に包埋し-80°Cで凍結させ凍結切片も作成した。その後、クリオスタット(Leica CM1900)(Leica Microsystems K.K., Tokyo, Japan)を用いて4μmの切片に切り出し、オイルレッドO染色を行った。各種染色後の切片は光学顕微鏡を用いて観察し撮影した(×200)。
<Histopathological analysis>
Epididymal adipose tissue and liver were collected, fixed in formalin, and embedded in paraffin. The embedded tissue was sliced into 4 μm thick sections using a sliding microtome (Yamato Kohki Industrial Co., Ltd., Saitama, Japan). The sliced sections were stained with hematoxylin and eosin. The liver was embedded in OTC compound (Sakura Finetek Japan Co., Ltd., Tokyo, Japan) and frozen at -80 ° C to prepare frozen sections. Then, it was cut into 4 μm sections using a cryostat (Leica CM1900) (Leica Microsystems KK, Tokyo, Japan), and oil red O staining was performed. The sections after various staining were observed and photographed using an optical microscope (× 200).
（6-2）結果
結果を図２〜図７に示す。
ペプチドＲは、高脂肪食を与えたマウスにおいて、血清総コレステロール、肝臓トリグリセリドを明らかに低下させ、また、高脂肪食を与えたマウスの肝臓で、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、ＳＲＥＢＰ２、ＴＮＦ−α、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロールレセプターの各遺伝子発現量を明らかに抑制した。
また、肝臓組織の染色像を図８〜１０に示す。ペプチドＲは、高脂肪食を与えたマウスの肝臓組織の脂肪滴の大きさと数を明らかに低減させ、また、高脂肪食を与えたマウスの脂肪組織の脂肪滴の数を明らかに低減させた。
(6-2) Results The results are shown in FIGS.
Peptide R clearly reduced serum total cholesterol and liver triglycerides in mice fed a high fat diet, and HMG-CoA reductase, SREBP2, TNF-α, low in mice fed a high fat diet. The expression level of each gene of density lipoprotein (LDL) cholesterol receptor was clearly suppressed.
In addition, stained images of liver tissue are shown in FIGS. Peptide R clearly reduced the size and number of lipid droplets in the liver tissue of mice fed a high fat diet, and clearly reduced the number of fat droplets in the fat tissue of mice fed a high fat diet. .
（７）酒粕素材中のペプチドの定量
（7-1）方法
「（２）ペプチド混合物中のペプチドの定量」の項目と同じ方法で、酒粕ペプチド、液化粕、及び酒粕蛋白質画分中に含まれるペプチドを定量した。
ここで用いた酒粕ペプチドは、ペプチドＲである。また、液化粕は、原料米を液化酵素により液化処理しアルコール発酵させることにより製造される清酒製造において得たものである。また、酒粕蛋白質画分は、液化粕を０．５％ ＮａＯＨあるいは２５ｍＭ ＫＯＨで洗浄後、クエン酸を添加しｐＨを４〜５に調整後、液体を取り除いて再度水で洗浄後、乾燥し得たものである。
(7) Quantification of peptides in sake lees
(7-1) Method The peptides contained in the sake lees peptide, liquefied lees, and sake lees protein fraction were quantified in the same manner as in the item “(2) Quantification of peptides in peptide mixture”.
The sake lees peptide used here is peptide R. The liquefied koji is obtained in sake production, which is produced by liquefaction of raw rice with a liquefaction enzyme and alcohol fermentation. The sake lees protein fraction can be dried after washing the liquefied koji with 0.5% NaOH or 25 mM KOH, adding citric acid to adjust the pH to 4-5, removing the liquid, washing with water again. It is a thing.
（7-2）結果
結果を表７に示す。表７中の濃度は、固形分中のペプチド濃度（重量％）である。
脂質代謝改善作用を有するペプチドは、酒粕及び酒粕の蛋白質画分には含まれておらず、酒粕の蛋白質画分をプロテアーゼ処理することにより生成することが分かる。
(7-2) The results are shown in Table 7. The concentration in Table 7 is the peptide concentration (% by weight) in the solid content.
It can be seen that the peptide having lipid metabolism-improving action is not contained in the protein fraction of sake lees and sake lees and is produced by treating the protein fraction of sake lees with protease.
（８）脂質代謝改善作用を有するペプチドの製造条件の検討
（8-1）方法
液化粕９０ｇに、水３６０ｍＬ、アスペルギルス ニガー由来のセルラーゼであるセルロシン（ＨＩＢ社、ＡＣ４０）４５ｍｇを混合し、バッフル付き３００ｍＬ容三角フラスコ３個に分注し、５０℃、１２０ｒｐｍで、２時間分解した。分解液を各プロテアーゼに適したｐＨに調整した後、バッフル付き１２５ｍＬ容三角フラスコに、各分解液４０ｍＬとプロテアーゼ１０ｍｇを入れ、５０℃、１５０ｒｐｍで分解した。分解開始６時間、２４時間、４５時間後にサンプリングし、遠心分離して得た上清をAmicon Ultra Centrifugal Filter Units 0.5mL 3Kを用いて遠心ろ過した。ろ液中のＲＬ及びＶＱ濃度を定量した。
プロテアーゼとして、酸性プロテアーゼのオリエンターゼＡＹ、及びアルカリ性プロテアーゼのオリエンターゼ２２ＢＦを用い、反応液のｐＨは、それぞれ、４及び８．８とした。
(8) Examination of production conditions for peptides having lipid metabolism improving action
(8-1) Method 90 ml of liquefied rice cake was mixed with 360 mL of water and 45 mg of cellulosin (HIB, AC40), a cellulase derived from Aspergillus niger, and dispensed into three 300 mL Erlenmeyer flasks with baffles, 50 ° C., 120 rpm And decomposed for 2 hours. After adjusting the decomposition solution to a pH suitable for each protease, 40 mL of each decomposition solution and 10 mg of protease were placed in a 125 mL Erlenmeyer flask with baffle and decomposed at 50 ° C. and 150 rpm. The supernatant obtained by sampling and centrifuging 6 hours, 24 hours, and 45 hours after the start of the decomposition was subjected to centrifugal filtration using Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 0.5 mL 3K. RL and VQ concentrations in the filtrate were quantified.
As protease, acidic protease orientase AY and alkaline protease orientase 22BF were used, and the pH of the reaction solution was 4 and 8.8, respectively.
（8-2）結果
結果を表８に示す。表８中の濃度は、固形分中のペプチド濃度（重量％）である。
Ａｒｇ−Ｌｅｕは、オリエンターゼ２２ＢＦで６時間の分解反応により、最も効率よく生成した。Ｖａｌ−Ｇｌｎは、オリエンターゼＡＹで４５時間の分解反応により、最も効率よく生成した。
(8-2) Table 8 shows the results. The concentration in Table 8 is the peptide concentration (% by weight) in the solid content.
Arg-Leu was most efficiently produced by a 6 hour degradation reaction with orientase 22BF. Val-Gln was most efficiently produced by the degradation reaction with orientase AY for 45 hours.
本発明で使用するペプチドは、脂質代謝を効果的に改善するので、医薬、保健機能食品などとして好適に使用できる。 Since the peptide used in the present invention effectively improves lipid metabolism, it can be suitably used as a pharmaceutical, health functional food or the like.
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