JP2017141229A - Neuregulin-1 partial peptide - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ニューレグリン−１部分ペプチド、そのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、ニューレグリン−１部分ペプチドに対する抗体、ニューレグリン−１部分ペプチドの認知機能障害の治療のための使用、ニューロプシン（Neuropsin; 別名 Kalikrein-related peptidase8, KLK8）の活性測定方法、それを利用した疾患の判定方法及びニューロプシン活性調節剤のスクリーニング方法、ニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質、それを含むキット等に関する。 The present invention relates to a neuregulin-1 partial peptide, a polynucleotide encoding the amino acid sequence thereof, an antibody against the neuregulin-1 partial peptide, the use of neuregulin-1 partial peptide for the treatment of cognitive dysfunction, ; Also known as Kalikrein-related peptidase8, KLK8) activity determination method, disease determination method and neuropsin activity regulator screening method using the same, fluorescent or chromogenic substrate containing neuregulin-1 partial peptide, kit containing the same Etc.
発達、成長、老化及び認知機能における神経系プロテアーゼの重要性を示唆する証拠が蓄積されてきた。このようなプロテアーゼの一つがニューロプシンである。ニューロプシンはセリンプロテアーゼの１種であり、神経系に加え、重層扁平上皮、肺、胸腺、下垂体及び子宮を含む組織で広く発現する。酵素学的に活性なニューロプシンは、ＬＴＰ（long-term potentiation）の初期段階の確立に必要であると報告されている（非特許文献１）。また、癌細胞の浸潤との関連性も報告されている（非特許文献２）。 Evidence has accumulated that suggests the importance of nervous system proteases in development, growth, aging and cognitive function. One such protease is neuropsin. Neuropsin is a kind of serine protease and is widely expressed in tissues including the stratified squamous epithelium, lungs, thymus, pituitary gland and uterus in addition to the nervous system. Enzymically active neuropsin has been reported to be necessary for the establishment of the initial stage of LTP (long-term potentiation) (Non-patent Document 1). In addition, a relationship with cancer cell invasion has been reported (Non-patent Document 2).
本発明者らは、統合失調症脆弱因子であるニューレグリン−１が、ニューロプシンによりタンパク質分解（proteolysis）されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、一つの側面（aspect）において、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるペプチドを提供する。好ましくは、本発明は、配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
The present inventors have found that neuregulin-1 which is a schizophrenia fragile factor is proteolyzed by neuropsin, and has completed the present invention.
In one aspect, the present invention provides a peptide prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin. Preferably, the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3.
本発明は、一つの側面において、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。 In one aspect, the present invention provides a polynucleotide encoding the amino acid sequence of a peptide prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin.
本発明は、一つの側面において、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるペプチドに結合する抗体であって、該ペプチドのＮ末端アミノ酸残基を特異的に結合する抗体またはその抗体断片を提供する。好ましくは、本発明は、配列番号１−３のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、そのＮ末端をエピトープとして認識する抗体またはその抗体断片を提供する。さらに好ましくは、本発明は、配列番号１−３のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドに結合し、そのＮ末端をエピトープとして結合する抗体であって、ニューレグリン−１に結合しない抗体またはその抗体断片を提供する。 In one aspect, the present invention relates to an antibody that binds to a peptide prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin, the antibody binding specifically to the N-terminal amino acid residue of the peptide, or an antibody thereof Antibody fragments are provided. Preferably, the present invention provides an antibody or an antibody fragment thereof that binds to a peptide consisting of any one of SEQ ID NOs: 1-3 and recognizes its N-terminus as an epitope. More preferably, the present invention relates to an antibody that binds to a peptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1-3 and binds the N-terminus thereof as an epitope, and does not bind to neuregulin-1, or an antibody thereof Provide a fragment.
本発明は、一つの側面において、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるペプチドを含む、認知機能障害の治療剤を提供する。
本発明は、一つの側面において、ニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を提供する。
In one aspect, the present invention provides a therapeutic agent for cognitive impairment, comprising a peptide prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin.
In one aspect, the present invention provides a fluorescent or chromogenic substrate comprising a neuregulin-1 partial peptide.
本発明は、一つの側面において、ニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を被験物質と接触させることを含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性を測定する方法を提供する。 In one aspect, the present invention measures the activity of neuropsin present in a test substance, which comprises contacting neuregulin-1, a neuregulin-1 partial peptide, or a fluorescent or chromogenic substrate containing them with the test substance. Provide a way to do it.
本発明は、一つの側面において、抗ニューロプシン抗体を支持体にコーティングすること；被験物質を添加すること；ニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を添加することを含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性を測定する方法を提供する。 In one aspect, the present invention includes coating an anti-neuropsin antibody on a support; adding a test substance; adding neuregulin-1, neuregulin-1 partial peptide, or a fluorescent substrate or chromogenic substrate containing them. A method for measuring the activity of neuropsin present in a test substance.
本発明は、一つの側面において、上記ニューロプシンの活性を測定する方法により、ヒト由来の試料中のニューロプシンの活性を測定することを含む、腫瘍細胞の浸潤性、肺癌または卵巣癌の予後、皮膚の角化、扁平上皮癌、子宮頸癌または卵巣癌を判定する方法を提供する。 The present invention, in one aspect, includes measuring the activity of neuropsin in a sample derived from a human by the method for measuring the activity of neuropsin, the prognosis of tumor cell invasiveness, lung cancer or ovarian cancer, Methods of determining skin keratinization, squamous cell carcinoma, cervical cancer or ovarian cancer are provided.
本発明は、一つの側面において、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチド、ニューロプシン及び被験物質を接触させることを含む、ニューロプシン活性調節剤のスクリーニング方法を提供する。 In one aspect, the present invention provides a screening method for a neuropsin activity modulator comprising contacting neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide, neuropsin and a test substance.
本発明は、一つの側面において、抗ニューロプシン抗体；及びニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を含む、腫瘍細胞の浸潤性、肺癌または卵巣癌の予後、皮膚の角化、扁平上皮癌、子宮頸癌または卵巣癌の判定用キットを提供する。 In one aspect, the present invention provides an anti-neuropsin antibody; and neuregulin-1, a neuregulin-1 partial peptide or a fluorescent substrate or a chromogenic substrate containing them, and the invasion of tumor cells, prognosis of lung cancer or ovarian cancer A kit for determining skin keratinization, squamous cell carcinoma, cervical cancer or ovarian cancer is provided.
１．ニューレグリン−１の部分ペプチド
本発明は、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドを提供する。
ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドは、塩または溶媒和物として提供されてもよい。
本明細書において、ニューレグリン−１は特に限定されず、いずれの起源のニューレグリン−１（例えば、ヒトニューレグリン、マウスニューレグリン、ラットニューレグリン等）を使用してもよい。本発明に使用されるニューレグリン−１は、好ましくはヒト由来のニューレグリン−１である。ニューレグリン−１には、アイソフォームが含まれる。アイソフォームの例には、ヒト由来のニューレグリン−１β１、ヒト由来のニューレグリン−１α２が挙げられる。本発明に使用する好ましいヒトニューレグリン−１は、配列番号７のアミノ酸配列からなる。
1. Neuregulin-1 Partial Peptide The present invention provides a neuregulin- 1 partial peptide prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin.
A partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin may be provided as a salt or solvate.
In this specification, neuregulin-1 is not particularly limited, and neuregulin-1 of any origin (for example, human neuregulin, mouse neuregulin, rat neuregulin, etc.) may be used. Neuregulin-1 used in the present invention is preferably human-derived neuregulin-1. Neuregulin-1 includes isoforms. Examples of isoforms include human-derived neuregulin-1β1 and human-derived neuregulin-1α2. A preferred human neuregulin-1 used in the present invention consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
本明細書において、ニューロプシンは特に限定されず、いずれの起源のニューロプシン（例えば、ヒトニューロプシン、マウスニューロプシン、ラットニューロプシン等）を使用してもよい。本発明に使用されるニューロプシンは、好ましくはヒト由来のニューロプシンである。ヒトニューロプシンはプレプロニューロプシンとして発現し、ヒトプレプロニューロプシンにはタイプ１とタイプ２がある。ヒトプレプロニューロプシンは、シグナル配列、タイプ１特異的ドメイン（ＧＨＳＲＡ：配列番号４）またはタイプ２特異的ドメイン（ＣＧＳＬＤＬＬＴＫＬＹＡＥＮＬＰＣＶＨＬＮＰＱＷＰＳＱＰＳＨＣＰＲＧＷＲＳＮＰＬＰＰＡＡＧＨＳＲＡ：配列番号５）及び活性マスキングペプチド（ＱＥＤＫ：配列番号６）が切り離されて活性型ニューロプシンとなる（図１参照）。本発明で使用するニューロプシンは、タイプ１ヒトプレプロニューロプシン、タイプ２ヒトプレプロニューロプシン、または活性型ヒトニューロプシンであり得る。本発明に使用する好ましい活性型ヒトニューロプシンは、配列番号８のアミノ酸配列からなる。 In the present specification, neuropsin is not particularly limited, and neuropsin of any origin (for example, human neuropsin, mouse neuropsin, rat neuropsin, etc.) may be used. The neuropsin used in the present invention is preferably a human-derived neuropsin. Human neuropsin is expressed as preproneuropsin, and human preproneuropsin includes type 1 and type 2. Human preproneuropsin is active with a signal sequence, type 1 specific domain (GHSRA: SEQ ID NO: 4) or type 2 specific domain (CGSLDLLTKLYAENLPPCVHLNPQWPSQPPSHCPRGWRSNPLPPAAGHSRA: SEQ ID NO: 5) and an active masking peptide (QEDK: SEQ ID NO: 6) Type neuropsin (see FIG. 1). The neuropsin used in the present invention may be type 1 human preproneuropsin, type 2 human preproneuropsin, or active human neuropsin. A preferred active human neuropsin used in the present invention consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
本明細書において、ニューレグリン−１の部分ペプチドとは、ニューレグリン−１の全長のアミノ酸配列の一部分のアミノ酸配列からなるペプチドであり得る。
ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドの例には、ヒトニューレグリン−１を活性型ヒトニューロプシンで分解することにより調製されるペプチド、及び配列番号７のアミノ酸配列からなるヒトニューレグリン−１を配列番号８のアミノ酸配列からなる活性型ヒトニューロプシンで分解することにより調製されるペプチドが挙げられる。好ましくは、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドは、ニューレグリン−１の受容体に結合できる。より好ましくは、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドは、ニューレグリン−１の受容体のアゴニストである。
ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドは、ニューレグリン−１のＥＧＦドメイン（例えば、配列番号９）を含み得る。
また、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドには、ＥＧＦドメイン（例えば、配列番号９）を含まないペプチドも含み得る。
In this specification, the partial peptide of neuregulin-1 may be a peptide consisting of a partial amino acid sequence of the full-length amino acid sequence of neuregulin-1.
Examples of neuregulin-1 partial peptides prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin include peptides prepared by degrading human neuregulin-1 with active human neuropsin, and sequences Peptides prepared by degrading human neuregulin-1 consisting of the amino acid sequence of No. 7 with active human neuropsin consisting of the amino acid sequence of SEQ ID No. 8 can be mentioned. Preferably, the neuregulin-1 partial peptide prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin can bind to the neuregulin-1 receptor. More preferably, the partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin is an agonist of the neuregulin-1 receptor.
A partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin may comprise the EGF domain of neuregulin-1 (eg, SEQ ID NO: 9).
The partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin may also include a peptide that does not contain an EGF domain (for example, SEQ ID NO: 9).
本明細書において、ニューレグリン−１の受容体は、ＥｒｂＢ３受容体またはＥｒｂＢ４受容体であり得、起源は限定されないが、好ましくはヒト由来のニューレグリン−１の受容体である。
ニューレグリン−１の受容体のアゴニストは、ＥｒｂＢ３受容体またはＥｒｂＢ４受容体をリン酸化することができる。例えば、ヒトニューレグリン−１は、ヒトＥｒｂＢ４受容体のチロシン残基をリン酸化することができる。また、ニューレグリン−１の受容体のアゴニストはfocal adhesion kinaseのチロシンのリン酸化レベルを増加させることができる。
ニューレグリン−１のＥＧＦドメインは、ニューレグリン−１の起源、アイソフォームによって、適宜決定される。例えば、配列番号７のアミノ酸配列からなるヒトニューレグリン−１では、アミノ酸残基１７７−２４１がＥＧＦドメインである。
In this specification, the receptor for neuregulin-1 can be an ErbB3 receptor or an ErbB4 receptor, and the origin is not limited, but is preferably a receptor for neuregulin-1 derived from human.
Neuregulin-1 receptor agonists can phosphorylate ErbB3 or ErbB4 receptors. For example, human neuregulin-1 can phosphorylate tyrosine residues of the human ErbB4 receptor. Also, neuregulin-1 receptor agonists can increase the tyrosine phosphorylation level of focal adhesion kinase.
The EGF domain of neuregulin-1 is appropriately determined depending on the origin and isoform of neuregulin-1. For example, in human neuregulin-1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, amino acid residues 177-241 are EGF domains.
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。これらペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列からなるヒトニューレグリン−１を配列番号８のアミノ酸配列からなる活性型ヒトニューロプシンで分解することにより調製され得る。配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、塩または溶媒和物として提供されてもよい。 In one embodiment, the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 1-3. These peptides can be prepared by degrading human neuregulin-1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with active human neuropsin consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 may be provided as a salt or solvate.
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。これらペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列からなるヒトニューレグリン−１を配列番号８のアミノ酸配列からなる活性型ヒトニューロプシンで分解することにより調製され得る。配列番号１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、塩または溶媒和物として提供されてもよい。 In one embodiment, the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 10-12. These peptides can be prepared by degrading human neuregulin-1 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 with active human neuropsin consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8. The peptide consisting of the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 10-12 may be provided as a salt or a solvate.
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドの類縁体を提供する。類縁体は、配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドに基づいて作製できるものであれば、特に限定はされない。配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドの類縁体の例には、配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列と同一性が６０、７０、８０、９０または９５％以上のアミノ酸配列からなるペプチド、配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列において１、２、３、４または５個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。 In one embodiment, the present invention provides an analog of a peptide consisting of the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12. The analog is not particularly limited as long as it can be produced based on the peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12. Examples of analogs of the peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 include an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 having an identity of 60 , 70, 80, 90 or a peptide consisting of 95% or more amino acid sequence, 1, 2, 3, 4 or 5 amino acids deleted in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 And a polypeptide comprising a substituted or added amino acid sequence.
配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドの類縁体の他の例には、タグが付加された配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。本明細書においてタグとは、ポリペプチドの精製、検出等のためポリペプチドに付加される部分を意味し、ヒスチジン（His）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、myc、FLAGタグなどが例示される。タグが付加されたポリペプチドは、例えば、pET30a（Novagen社製）（Hisタグ用）、pGEX（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）（GSTタグ用）などの発現ベクターを用いて、適当な宿主細胞で発現させることで得られる。 Other examples of peptide analogs consisting of the amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 are shown in any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 to which a tag is added. A peptide consisting of an amino acid sequence can be mentioned. In the present specification, the tag means a portion added to a polypeptide for purification, detection, etc. of the polypeptide, such as histidine (His), glutathione-S-transferase (GST), maltose binding protein (MBP), myc. And FLAG tag. A polypeptide to which a tag is added is, for example, an appropriate host using an expression vector such as pET30a (Novagen) (for His tag), pGEX (GE Healthcare Biosciences) (for GST tag). It is obtained by expressing in cells.
配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドの類縁体のさらなる例には、ペプチド合成の分野で通常使用される置換基や保護基またはペプチドを安定化させる置換基や保護基がＮ末端やＣ末端に結合した配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。このような置換基や保護基の例としては、限定はされないが、アミド基、アセチル基、ベンジルオキシカルボニル基(Cbz基またはＺ基）、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃが挙げられる。 Further examples of analogs of the peptide consisting of the amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 include substituents or protecting groups commonly used in the field of peptide synthesis or substitutions that stabilize the peptide Examples thereof include a peptide having an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 in which a group or a protecting group is bonded to the N-terminus or C-terminus. Examples of such substituents and protecting groups include, but are not limited to, amide groups, acetyl groups, benzyloxycarbonyl groups (Cbz groups or Z groups), Boc and Fmoc.
好ましくは、配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列の類縁体は、ニューレグリン−１の受容体に結合し、より好ましくは、ヒトＥｒｂＢ４受容体のチロシン残基をリン酸化することができる。
本発明が提供するポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
Preferably, an analog of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1-3 binds to the neuregulin-1 receptor, and more preferably phosphorylates the tyrosine residue of the human ErbB4 receptor. it can.
The polypeptide provided by the present invention may be an isolated polypeptide.
本発明が提供するニューレグリン−１の部分ペプチド及びその類縁体は、通常の遺伝子工学的方法またはペプチド合成において用いられる方法によって製造することができる。例えば、以下の方法により、配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを製造できる：
配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入した発現ベクターを用いて、大腸菌または細胞等で本発明が提供するペプチドまたはその類縁体を発現させる；
Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法を用いて配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを固相合成する；または
Ｂｏｃ−アミノ酸やＺ−アミノ酸を液相合成法で逐次縮合させて配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを製造する（Ｆｍｏｃは9-フルオレニルメトキシカルボニル基、Ｂｏｃはt-ブトキシカルボニル基、Ｚはベンジルオキシカルボニル基をそれぞれ表す）。
The partial peptide of neuregulin-1 and its analogs provided by the present invention can be produced by a usual genetic engineering method or a method used in peptide synthesis. For example, a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 can be produced by the following method:
Expressing the peptide provided by the present invention or an analog thereof in Escherichia coli or cells using an expression vector into which a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 is inserted;
A peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 is solid-phase synthesized using the Fmoc method or the Boc method; or Boc-amino acids and Z-amino acids are sequentially condensed by a liquid phase synthesis method. To produce a peptide having the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 (Fmoc is a 9-fluorenylmethoxycarbonyl group, Boc is a t-butoxycarbonyl group, and Z is benzyloxycarbonyl) Each represents a group).
２．ポリヌクレオチド
本発明は、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。
2. Polynucleotide The present invention provides a polynucleotide encoding the amino acid sequence of a partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin.
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１３−１８のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを提供する。
In one embodiment, the present invention provides a polynucleotide encoding the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12.
In one embodiment, the present invention provides a peptide consisting of the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 13-18.
また、一つの実施態様において、本発明は、配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと同一性が６０、７０、８０、９０または９５％以上の塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにおいて１、２、３、４または５個の塩基が欠失、置換または付加された核酸配列からなるポリヌクレオチドを提供する。 Further, in one embodiment, the present invention provides 60, 70, 80, 90 or 95% or more identity with the polynucleotide encoding the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 1, 2, 3, 4 or 5 bases are deleted, substituted or added in the polynucleotide consisting of the base sequence, the polynucleotide encoding the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 A polynucleotide comprising the nucleic acid sequence is provided.
本発明が提供するポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドであり得る。
本発明が提供するポリヌクレオチドは、適宜、ベクターに導入され、宿主細胞で発現させることができる。
よって、一つの実施態様において、本発明は、本発明が提供するポリヌクレオチド含むベクター及び本発明が提供するポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を提供する。
また、一つの実施態様において、本発明は、本発明が提供するポリペプチドを発現するトランスジェニック動物を提供する。トランスジェニック動物の例としては、トランスジェニックマウスが挙げられる。
トランスジェニックマウスの作製方法としては、適切なプロモーターの制御下に本発明が提供するポリヌクレオチドを配置した組換えDNA断片をマイクロインジェクション法等により導入し、生き残った受精卵を偽妊娠マウスの卵管に移植し、生まれた仔マウスから上記組換えDNAを有する仔マウスを選択することによって得ることができる。目的とする組換えDNAを有する仔マウスは、例えば、マウスの尾より抽出したゲノムDNAを鋳型とし、本発明が提供するポリヌクレオチドの塩基配列の一部を有するプローブを用いたサザンハイブリダイゼーションにて、確認することができる。
The polynucleotide provided by the present invention may be an isolated polynucleotide.
The polynucleotide provided by the present invention can be appropriately introduced into a vector and expressed in a host cell.
Accordingly, in one embodiment, the present invention provides a vector containing the polynucleotide provided by the present invention and a host cell into which the polynucleotide provided by the present invention has been introduced.
In one embodiment, the present invention also provides a transgenic animal that expresses a polypeptide provided by the present invention. Examples of transgenic animals include transgenic mice.
As a method for producing a transgenic mouse, a recombinant DNA fragment in which a polynucleotide provided by the present invention is placed under the control of an appropriate promoter is introduced by a microinjection method or the like, and a surviving fertilized egg is put into the oviduct of a pseudopregnant mouse Can be obtained by selecting a pup mouse having the above recombinant DNA from a pup mouse born. A mouse pup having the target recombinant DNA can be obtained by, for example, Southern hybridization using a genomic DNA extracted from the tail of the mouse as a template and using a probe having a part of the nucleotide sequence of the polynucleotide provided by the present invention. Can be confirmed.
３．抗体
本発明は、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドに結合する抗体および抗体の断片を提供する。
3. Antibodies The present invention provides antibodies and antibody fragments that bind to a partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin.
一つの実施態様において、本発明は、調製されたニューレグリン−１の部分ペプチドのＮ末端を認識し、ニューレグリン−１の部分ペプチドに結合するが、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体を提供する。また、一つの実施態様において、本発明は、調製されたニューレグリン−１の部分ペプチドのＣ末端を認識し、ニューレグリン−１の部分ペプチドに結合するが、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体を提供する。 In one embodiment, the present invention recognizes the N-terminus of the prepared neuregulin-1 partial peptide and binds to the neuregulin-1 partial peptide but does not bind to the full-length neuregulin-1 protein. I will provide a. Further, in one embodiment, the present invention recognizes the C-terminus of the prepared neuregulin-1 partial peptide and binds to the neuregulin-1 partial peptide, but binds to the full-length neuregulin-1 protein. Provide antibodies that do not.
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体を提供する。好ましくは、本発明が提供する抗体は、配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端を認識し、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない。配列番号１−３のアミノ酸配列からなるペプチドのＮ末端の１０アミノ酸残基は、それぞれ、ＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡ（配列番号１９）、ＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬ（配列番号２０）、ＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧ（配列番号２１）である。本発明が提供する好ましい抗体の例には、ＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡ、ＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬまたはＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧのＮ末アミノ酸残基のα位のアミノ基を認識し、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体が挙げられる。他の例としては、ＧＳＧＫＫＰＥＳＡＡ、ＦＫＷＦＫＮＧＮＥＬまたはＩＮＫＡＳＬＡＤＳＧのＮ末端の＋電荷と、それらペプチドのＮ末から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基のアミノ酸配列を認識し、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体が挙げられる。更なる例としては、Ｎ末アミノ酸残基のα位のアミノ基を含むＧＳＧ、ＦＫＷまたはＩＮＫをエピトープとして認識し、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体が挙げられる。 In one embodiment, the present invention provides an antibody that binds to a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3. Preferably, the antibody provided by the present invention recognizes the N-terminus of the peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and does not bind to the full-length neuregulin-1 protein. N-terminal 10 amino acid residues of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1-3 are GSGKKPESAA (SEQ ID NO: 19), FKWFKNGNEL (SEQ ID NO: 20), and INKASLADSG (SEQ ID NO: 21), respectively. Examples of preferable antibodies provided by the present invention include antibodies that recognize the amino group at the α-position of the N-terminal amino acid residue of GSGKKPESAA, FKWFKNGNEL, or INKASLADSG and do not bind to full-length neuregulin-1 protein. Other examples include the N-terminal + charge of GSGKKPESAA, FKWFKNGNEL or INKASLADSG and the amino acid sequence of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residues from the N-terminus of these peptides. Antibodies that recognize and do not bind to full length neuregulin-1 protein. Further examples include antibodies that recognize GSG, FKW, or INK containing the α-position amino group of the N-terminal amino acid residue as an epitope and do not bind to full-length neuregulin-1 protein.
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい配列番号１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドに結合する抗体の例には、配列番号１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端を認識し、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体が挙げられる。配列番号１０−１２のアミノ酸配列からなるペプチドのＣ末端の１０アミノ酸残基は、それぞれ、ＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲ（配列番号２２）、ＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲ（配列番号２３）、ＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲ（配列番号２４）である。本発明が提供する好ましい抗体の例には、ＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲ、ＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲまたはＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲのＣ末アミノ酸残基のα位のカルボキシル基を認識し、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体が挙げられる。他の例としては、ＧＫＧＫＧＫＫＫＥＲ、ＥＴＳＳＥＹＳＳＬＲまたはＱＫＫＰＧＫＳＥＬＲのＣ末端の−電荷と、それらペプチドのＣ末から１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基のアミノ酸配列を認識し、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体が挙げられる。更なる例としては、Ｃ末アミノ酸残基のα位のカルボキシル基を含むＫＥＲ、ＳＬＲまたはＥＬＲをエピトープとして認識し、全長ニューレグリン−１タンパク質には結合しない抗体が挙げられる。 In one embodiment, the present invention provides an antibody that binds to a peptide consisting of the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 10-12. Examples of antibodies that bind to a peptide consisting of the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 10-12 preferably recognize the C-terminal of the peptide consisting of the amino acid sequence shown by any of SEQ ID NOs: 10-12, Examples include antibodies that do not bind to neuregulin-1 protein. The 10 amino acid residues at the C-terminal of the peptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 10-12 are GKGKGKKKER (SEQ ID NO: 22), ETSSEYSSLR (SEQ ID NO: 23), and QKKPGKSELR (SEQ ID NO: 24), respectively. Examples of preferred antibodies provided by the present invention include antibodies that recognize the carboxyl group at the α-position of the C-terminal amino acid residue of GKGKGKKKER, ETSSEYSSLLR, or QKKPGKSELR and do not bind to full-length neuregulin-1 protein. As another example, the C-terminal -charge of GKGKGKKKER, ETSSEYSSLR or QKKPGKSELR and the amino acid sequence of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residues from the C-terminal of those peptides Antibodies that recognize and do not bind to full length neuregulin-1 protein. Further examples include antibodies that recognize KER, SLR or ELR containing the carboxyl group at the α-position of the C-terminal amino acid residue as an epitope and do not bind to full-length neuregulin-1 protein.
一つの実施態様において、本発明は、ニューロプシンにより認識されるニューレグリン−１の部分ペプチドに結合する抗体を提供する。そのような抗体の例には、ＫＥＲ、ＳＬＲ、ＥＬＲをエピトープとして認識し、当該ペプチドに結合する抗体が挙げられる。また、他の例としては、ＫＥＲ、ＳＬＲ、ＥＬＲまたはそれらを含むニューレグリン−１部分ペプチド（例えば、ＫＥＲＧＳＧ（配列番号２５）、ＳＬＲＦＫＷ（配列番号２６）、ＥＬＲＩＮＫ（配列番号２７））を抗原として得られる抗体が挙げられる。ＫＥＲ、ＳＬＲ、ＥＬＲを含むニューレグリン−１部分ペプチドは、当業者が適宜設定できる。例えば、ＫＥＲ、ＳＬＲ、ＥＬＲを含む４，５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０残基からなるニューレグリン−１部分ペプチドを抗原として抗体を調製してもよい。 In one embodiment, the present invention provides an antibody that binds to a partial peptide of neuregulin-1 that is recognized by neuropsin. Examples of such antibodies include antibodies that recognize KER, SLR, and ELR as epitopes and bind to the peptide. As another example, KER, SLR, ELR or a neuregulin-1 partial peptide containing them (for example, KERGSG (SEQ ID NO: 25), SLRFKW (SEQ ID NO: 26), ELLINK (SEQ ID NO: 27)) is used as an antigen. The antibody obtained is mentioned. Those skilled in the art can appropriately set neuregulin-1 partial peptides including KER, SLR, and ELR. For example, neuregulin-1 consisting of 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 residues including KER, SLR, ELR An antibody may be prepared using a partial peptide as an antigen.
本発明はまた、一つの実施態様において、本発明が提供するポリペプチドを特異的に認識する抗体の断片を提供する。 In one embodiment, the present invention also provides a fragment of an antibody that specifically recognizes the polypeptide provided by the present invention.
本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。
本明細書において、モノクローナル抗体には、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型モノクローナル抗体、例えば、キメラモノクローナル抗体、ヒト型化モノクローナル抗体や、ヒトモノクローナル抗体が含まれる。
抗体の断片は、抗原と特異的に結合する抗体の一部である。抗体の断片には、Ｆａｂ (ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｉｎｄｉｎｇ)、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、一本鎖抗体 （ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ; 以下、ｓｃＦｖと表記する)、ジスルフィド安定化抗体(ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｆｖ; 以下、ｄｓＦｖと表記する)、２量化体Ｖ領域断片 (以下、Ｄｉａｂｏｄｙと表記する)、ＣＤＲを含むペプチド等を挙げることができる（エキスパート・オピニオン・オン・テラピューティック・パテンツ、第６巻、第５号、第４４１〜４５６頁、１９９６年）。抗体および抗体の断片は、当業界にて周知の方法により調製可能である（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988、http://www.gene.mie-u.ac.jp/Protocol/Original/Antibody.html、米国特許第６３３１４１５号、米国特許第５６９３７６１号、米国特許第５２２５５３９号、米国特許第５９８１１７５号、米国特許第５６１２２０５号、米国特許第５８１４３１８号、米国特許第５５４５８０６号、米国特許第７１４５０５６号、米国特許第６４９２１６０号、米国特許第５８７１９０７号、米国特許第５７３３７４３号などを参照）。ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドのＮ末端またはＣ末端を特異的に認識する抗体は、当業界にて周知の方法により調製可能である（例えば、大海 忍、辻村邦夫、稲垣昌樹 著 細胞工学別冊実験プロトコールシリーズ 新版抗ペプチド抗体実験プロトコール 秀潤社などを参照）。例えば、ニューレグリン−１の部分ペプチドのＮ末端またはＣ末端から１０残基のペプチドを合成し、ＢＳＡ等のキャリアタンパク質にＭＢＳを用いて結合し、これをウサギへ免疫し、ニューレグリン−１の部分ペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合し、全長ニューレグリン−１に結合しない抗体を、ドットブロット法を用いて単離することにより、調製してもよい。
In this specification, the antibody includes a polyclonal antibody and a monoclonal antibody.
In the present specification, the monoclonal antibody includes a genetically modified monoclonal antibody artificially modified for the purpose of reducing heteroantigenicity to humans, such as a chimeric monoclonal antibody, a humanized monoclonal antibody, and a human monoclonal antibody. Antibodies are included.
Antibody fragments are those portions of an antibody that specifically bind to an antigen. Antibody fragments include Fab (fragment of antigen binding), F (ab ′) 2, Fab ′, single chain antibody (single chain Fv; hereinafter referred to as scFv), disulfide stabilized antibody (disulphide stabilized Fv; (Hereinafter referred to as “dsFv”), dimerized V region fragment (hereinafter referred to as “Diabody”), peptides containing CDR, etc. (Expert Opinion on Therapeutic Patents, Vol. 6, No. 5, pages 441-456, 1996). Antibodies and antibody fragments can be prepared by methods well known in the art (see, eg, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, http://www.gene.mie-u.ac. jp / Protocol / Original / Antibody.html, U.S. Patent No. 6,331,415, U.S. Patent No. 5,693,761, U.S. Patent No. 5,225,539, U.S. Patent No. 5,981,175, U.S. Patent No. 5,612,205, U.S. Patent No. 5,814,318, U.S. Pat. No. 7, U.S. Pat. No. 7,145,056, U.S. Pat. No. 6,492,160, U.S. Pat. No. 5,871,907, U.S. Pat. No. 5,733,743). An antibody that specifically recognizes the N-terminus or C-terminus of a partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin can be prepared by a method well known in the art ( (For example, see Shinobu Ohmi, Kunio Tsujimura, Masaki Inagaki, Cell Engineering Separate Volume Experiment Protocol Series, New Edition Anti-Peptide Antibody Experiment Protocol Shujunsha, etc.). For example, a 10-residue peptide is synthesized from the N-terminus or C-terminus of a neuregulin-1 partial peptide, bound to a carrier protein such as BSA using MBS, this is immunized to a rabbit, and neuregulin-1 An antibody that binds to the N-terminus or C-terminus of the partial peptide and does not bind to full-length neuregulin-1 may be prepared by isolation using dot blotting.
一つの実施態様において、本発明が提供する抗体は、ヒト体内、例えばヒト脳内に存在する配列番号１−３および１０−１２のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを認識し、当該ペプチドの分布、機能等を解析するツールとなり得る。また、１つの実施態様として、本発明が提供する抗体は、ヒト体内、例えばヒト脳内に存在するニューロプシンに切断される部位を有するニューレグリン−１の分布等を解析するツールとなり得る。 In one embodiment, the antibody provided by the present invention recognizes a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3 and 10-12 present in the human body, for example, the human brain, and the peptide Can be a tool for analyzing the distribution, function, etc. In one embodiment, the antibody provided by the present invention can be a tool for analyzing the distribution of neuregulin-1 having a site cleaved by neuropsin present in the human body, for example, the human brain.
一つの実施態様において、本発明が提供する抗体は、標識物質が結合されていてもよい。標識物質の例には、酵素、蛍光物質、放射性同位元素、ビオチン等が挙げられる。
酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ等が挙げられる。
蛍光物質の例としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＧＦＰ、ルシフェリン等が挙げられる。
放射性同位元素の例としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐ等が挙げられる。
In one embodiment, the antibody provided by the present invention may be bound with a labeling substance. Examples of labeling substances include enzymes, fluorescent substances, radioisotopes, biotin and the like.
Examples of the enzyme include alkaline phosphatase, peroxidase, glucose oxidase, tyrosinase, and acid phosphatase.
Examples of the fluorescent substance include fluorescein isothiocyanate (FITC), GFP, luciferin and the like.
Examples of radioactive isotopes include 125 I, 14 C, 32 P, and the like.
３．認知機能障害の治療剤
本発明は、ニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドを含む、認知機能障害の治療剤を提供する。
3. Therapeutic Agent for Cognitive Dysfunction The present invention provides a therapeutic agent for cognitive dysfunction comprising a partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 with neuropsin.
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含む、認知機能障害の治療剤を提供する。 In one embodiment, the present invention provides a therapeutic agent for cognitive impairment, comprising a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3.
本発明が提供するニューレグリン−１をニューロプシンで分解することにより調製されるニューレグリン−１の部分ペプチドは、好ましくは、ＬＴＰの障害を改善する。 The partial peptide of neuregulin-1 prepared by degrading neuregulin-1 provided by the present invention with neuropsin preferably improves the disorder of LTP.
ＬＴＰとは、高頻度刺激を与えることによって、神経伝達効率が増強されるようになる現象であり、学習と記憶の根底にある主要な細胞学的メカニズムの１つであると広く考えられている現象である。 LTP is a phenomenon in which nerve transmission efficiency is enhanced by applying high-frequency stimulation, and is widely considered to be one of the major cytological mechanisms underlying learning and memory. It is a phenomenon.
本明細書において、認知機能障害は、何らかの原因により記憶が困難になった状態であり得る。認知機能障害の例としては、ニューロプシンの活性が低下することにより惹起される認知機能障害、ニューレグリン−１の受容体への結合が抑制されることにより惹起される認知機能障害、ニューレグリン−１の受容体へのアゴニスト作用が抑制されることにより惹起される認知機能障害が挙げられるが、これに限定はされない。 In this specification, cognitive dysfunction may be a condition in which memory becomes difficult for some reason. Examples of cognitive dysfunction include cognitive dysfunction caused by reduced neuropsin activity, cognitive dysfunction caused by inhibition of binding of neuregulin-1 to receptors, neuregulin- Examples include, but are not limited to, cognitive dysfunction caused by suppression of agonistic action on one receptor.
本発明が提供する認知機能障害の治療剤は、本発明が提供するペプチドを使用して、適宜製剤化される。例えば、本発明が提供する認知機能障害の治療剤は、医薬品として許容できる担体（添加剤も含む）と共に製剤化することができる。医薬品として許容できる担体としては、例えば、賦形剤（例えば、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム等）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム等）、溶剤（例えば、水、食塩水、大豆油等）、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
上記認知機能障害の治療剤の投与方法は、投与対象の年齢、体重、健康状態によって、当業者により適宜選択され得る。例えば、上記認知機能障害の治療剤は静脈内投与され得る。
投与対象は、認知機能障害の治療を必要とする動物であれば特に限定されないが、例えば、ヒトである。
The therapeutic agent for cognitive impairment provided by the present invention is appropriately formulated using the peptide provided by the present invention. For example, the therapeutic agent for cognitive impairment provided by the present invention can be formulated together with a pharmaceutically acceptable carrier (including additives). Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients (eg, dextrin, hydroxypropylcellulose, polyvinylpyrrolidone, etc.), disintegrants (eg, carboxymethylcellulose), lubricants (eg, magnesium stearate), interfaces, and the like. Examples include, but are not limited to, activators (eg, sodium lauryl sulfate), solvents (eg, water, saline, soybean oil), preservatives (eg, p-hydroxybenzoate). is not.
The administration method of the therapeutic agent for cognitive dysfunction can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the age, weight, and health status of the administration subject. For example, the therapeutic agent for cognitive impairment can be administered intravenously.
The administration target is not particularly limited as long as it is an animal in need of treatment for cognitive dysfunction. For example, it is a human.
上記認知機能障害の治療剤に含まれる本発明が提供するポリペプチドの量は、本発明の効果を奏する限り、特に限定されるものではない。例えば、ヒト体重１kg当たり0.03〜300 mg、１〜100 mgまたは１〜10 mgを１回の投与量とし点滴静注とすることができる。投与方法および投与頻度も当業者が適宜設定できる。 The amount of the polypeptide provided by the present invention contained in the therapeutic agent for cognitive dysfunction is not particularly limited as long as the effect of the present invention is exhibited. For example, 0.03 to 300 mg, 1 to 100 mg or 1 to 10 mg per kg of human body weight can be used as a single dose for intravenous infusion. A person skilled in the art can appropriately set the administration method and the administration frequency.
一つの実施態様において、本発明は、認知機能障害の治療における配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドの使用を提供する。
一つの実施態様において、本発明は、配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチドを投与することを含む、認知機能障害の治療方法を提供する。
In one embodiment, the present invention provides the use of a peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1-3 in the treatment of cognitive dysfunction.
In one embodiment, the present invention provides a method for treating cognitive impairment, comprising administering a peptide consisting of the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3.
４．蛍光基質または発色基質
本発明は、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を提供する。
一つの実施態様において、本発明は、ニューロプシンの酵素活性を測定するために有用なニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を提供する。
蛍光基質または発色基質の作製には、MCA（4-Methyl-Coumaryl-7-amide）、pNA（p-nitroanilide）、AFC（7-amino-4- trifluoromethyl coumarin）及びRh110（ローダミン110: 3,6-ジアミノ-9-(2-カルボキシフェニル)キサンチリウム）等を使用することができる。例えば、MCA、pNA、AFCまたはRh110を、ニューロプシンが認識するニューレグリン−１の部分ペプチドのＣ末端に、ニューロプシンにより、AMC（7-amino-4-methyl-coumarin）、pNA、AFCまたはRh110が当該ペプチドから遊離されるように結合させて、蛍光基質または発色基質を作製してもよい。
蛍光基質または発色基質の作製に使用するニューレグリン−１の部分ペプチドのアミノ酸残基数は、特に限定はされないが、２、３、４、５、６、７、８、９または１０残基であり得る。MCA、pNA、AFCまたはRh110を含む蛍光基質または発色基質の例としては、P1-P2、P1-P3、P1-P4、P1-P5またはP1-P6に相当するアミノ酸残基から構成されるペプチドのP1部位に相当するアミノ酸のＣ末端にMCA、pNA、AFCまたはRh110を結合させて作製された蛍光基質または発色基質が挙げられる。
蛍光基質または発色基質の作製に使用するニューレグリン−１の部分ペプチドは、ペプチド合成の分野で通常使用される置換基や保護基またはペプチドを安定化させる置換基や保護基をＮ末端やＣ末端に結合させてもよい。このような置換基や保護基の例としては、限定はされないが、アミド基、アセチル基、ベンジルオキシカルボニル基(Cbz基、Ｚ基）、Ｂｏｃ及びＦｍｏｃが挙げられる。
4). Fluorescent Substrate or Chromogenic Substrate The present invention provides a fluorescent or chromogenic substrate comprising neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide.
In one embodiment, the present invention provides a fluorescent or chromogenic substrate comprising neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide useful for measuring neuropsin enzymatic activity.
For the production of fluorescent or chromogenic substrates, MCA (4-Methyl-Coumaryl-7-amide), pNA (p-nitroanilide), AFC (7-amino-4-trifluoromethyl coumarin) and Rh110 (Rhodamine 110: 3,6 -Diamino-9- (2-carboxyphenyl) xanthylium) and the like can be used. For example, MCA, pNA, AFC, or Rh110 is added to the C-terminal of the partial peptide of neuregulin-1 recognized by neuropsin by neuropsin, so that AMC (7-amino-4-methyl-coumarin), pNA, AFC, or Rh110 May be bound so as to be released from the peptide to produce a fluorescent substrate or a chromogenic substrate.
The number of amino acid residues of the partial peptide of neuregulin-1 used for the production of the fluorescent substrate or the chromogenic substrate is not particularly limited, but is 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 residues. possible. Examples of fluorescent or chromogenic substrates containing MCA, pNA, AFC or Rh110 include peptides composed of amino acid residues corresponding to P1-P2, P1-P3, P1-P4, P1-P5 or P1-P6. Examples thereof include a fluorescent substrate or a chromogenic substrate prepared by binding MCA, pNA, AFC or Rh110 to the C-terminal of the amino acid corresponding to the P1 site.
The neuregulin-1 partial peptide used for the production of a fluorescent substrate or a chromogenic substrate is a substituent or protecting group that is usually used in the field of peptide synthesis, or a substituent or protecting group that stabilizes the peptide. May be combined. Examples of such substituents and protecting groups include, but are not limited to, amide groups, acetyl groups, benzyloxycarbonyl groups (Cbz groups, Z groups), Boc and Fmoc.
MCAを用いた、本発明が提供する蛍光基質の例としては、Ac-SLR-MCA、Boc-VPR-MCA、Ac-KDR-MCA、Ac-KER-MCA、Ac-QKR-MCA、Ac-KKK-MCA、Ac-ELR-MCA、Ac-DVR-MCA及びAc-YGR-MCA等が挙げられる。これら蛍光基質において、MCAをpNA、AFCまたはRh110に置換してもよい。 Examples of fluorescent substrates provided by the present invention using MCA include Ac-SLR-MCA, Boc-VPR-MCA, Ac-KDR-MCA, Ac-KER-MCA, Ac-QKR-MCA, Ac-KKK -MCA, Ac-ELR-MCA, Ac-DVR-MCA, Ac-YGR-MCA and the like. In these fluorescent substrates, MCA may be substituted with pNA, AFC or Rh110.
また、本発明が提供する蛍光基質の他の例には、蛍光エネルギー移動を用いた蛍光基質が挙げられる。例えば、N末端側に、蛍光性のMOCAc（(7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl）基を、C末端側にこの蛍光を消す2,4-dinitrophenyl（Dnp）基を導入した蛍光基質を作製することができる。MOCAcとDnpの組み合わせの他に、Nma（N-methylanthranilic acid）とDnpの組み合わせ、DabsylとEDANSの組み合わせが使用できる。 Another example of the fluorescent substrate provided by the present invention is a fluorescent substrate using fluorescence energy transfer. For example, a fluorescent substrate with a fluorescent MOCAc ((7-methoxycoumarin-4-yl) acetyl) group on the N-terminal side and a 2,4-dinitrophenyl (Dnp) group that extinguishes this fluorescence on the C-terminal side is prepared. can do. In addition to the combination of MOCAc and Dnp, a combination of Nma (N-methylanthranilic acid) and Dnp, and a combination of Dabsyl and EDANS can be used.
本発明が提供する蛍光基質または発色基質は、一つの実施態様において、ニューロプシンの酵素活性を測定できる。
本明細書において、ニューロプシンの酵素活性は、プロテアーゼ活性、ペプチダーゼ活性またはタンパク質分解活性であり得る。
In one embodiment, the fluorescent substrate or chromogenic substrate provided by the present invention can measure the enzyme activity of neuropsin.
As used herein, the enzyme activity of neuropsin can be protease activity, peptidase activity or proteolytic activity.
５．ニューロプシンの活性測定方法
本発明は、ニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を被験物質と接触させることを含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性及び／または量を測定する方法を提供する。
5. The present invention relates to the activity of neuropsin present in a test substance, which comprises contacting neuregulin-1, a neuregulin-1 partial peptide, or a fluorescent or chromogenic substrate containing them with the test substance, and A method for measuring the amount is provided.
一つの実施態様において、本発明は、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを被験物質と接触させることを含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性及び／または量を測定する方法を提供する。
本明細書において、被験物質は、特に限定されず、例えば、生体由来の試料、細胞培養上清、細胞溶解液、化合物、タンパク質、多糖類、植物抽出液、微生物抽出液、微生物培養液等であり得る。生体由来の試料は、ヒト由来の試料であり得、限定はされないが、例えば、ヒト由来の血液、血清、血漿、組織由来の細胞溶解液、腹水等であり得る。
被験物質にニューロプシンが存在すれば、そのプロテアーゼ活性によりニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドはタンパク質分解を受ける。その結果生じたペプチドを定量することにより、被験物質にニューロプシンが存在するか否か、存在していれば、被験物質に存在するニューロプシンの活性及び／または量を測定することができる。
被験物質に存在するニューロプシンのタンパク質分解によって、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドから生じたペプチドの量は、例えば、電気泳動、ＨＰＬＣ、当該ペプチドと特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティング等により定量することができる。
In one embodiment, the present invention provides a method for measuring the activity and / or amount of neuropsin present in a test substance, comprising contacting neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide with the test substance. To do.
In the present specification, the test substance is not particularly limited, and examples thereof include biological samples, cell culture supernatants, cell lysates, compounds, proteins, polysaccharides, plant extracts, microbial extracts, and microbial cultures. possible. A sample derived from a living body can be a sample derived from a human, and is not limited, but may be, for example, human-derived blood, serum, plasma, tissue-derived cell lysate, ascites, and the like.
If neuropsin is present in the test substance, neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide undergoes proteolysis due to its protease activity. By quantifying the resulting peptide, it is possible to determine whether or not neuropsin is present in the test substance, and if present, the activity and / or amount of neuropsin present in the test substance.
The amount of peptide produced from neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide by proteolysis of neuropsin present in the test substance was, for example, electrophoresis, HPLC, or an antibody that specifically binds to the peptide. It can be quantified by ELISA or Western blotting.
一つの実施態様において、本発明は、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を被験物質と接触させることを含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性及び／または量を測定する方法を提供する。
ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質については、上記のとおりである。ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質の例としては、Ac-SLR-MCA、Boc-VPR-MCA、Ac-KDR-MCA、Ac-KER-MCA、Ac-QKR-MCA、Ac-KKK-MCA、Ac-ELR-MCA、Ac-DVR-MCA及びAc-YGR-MCA等が挙げられる。これら蛍光基質において、MCAをpNA、AFCまたはRh110に置換してもよい。
例えば、ニューロプシンにより基質が切断されて、AMC、pNA、AFCまたはRh110が遊離されれば、AMC、pNA、AFCまたはRh110の量をマイクロプレートリーダーを用いて測定することで、ニューロプシンの活性を測定することができる。AMC、pNA、AFC及びRh110の吸光波長または励起波長及び蛍光波長は、例えば以下のとおりである：pNA; 吸光波長400nmまたは405nm、AMC; 励起波長380nm/蛍光波長460nm、AFC; 励起波長400nm/蛍光波長505nm、Rh110；励起波長496nm/蛍光波長520nm。
In one embodiment, the present invention relates to the activity of neuropsin present in a test substance and / or comprising contacting a fluorescent or chromogenic substrate comprising neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide with the test substance A method for measuring quantities is provided.
The fluorescent substrate or chromogenic substrate containing neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide is as described above. Examples of fluorescent substrates containing neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptides include Ac-SLR-MCA, Boc-VPR-MCA, Ac-KDR-MCA, Ac-KER-MCA, Ac-QKR-MCA, Examples include Ac-KKK-MCA, Ac-ELR-MCA, Ac-DVR-MCA, and Ac-YGR-MCA. In these fluorescent substrates, MCA may be substituted with pNA, AFC or Rh110.
For example, if the substrate is cleaved by neuropsin and AMC, pNA, AFC, or Rh110 is released, the amount of AMC, pNA, AFC, or Rh110 is measured using a microplate reader. Can be measured. The absorption wavelength or excitation wavelength and fluorescence wavelength of AMC, pNA, AFC and Rh110 are, for example: pNA; absorption wavelength 400 nm or 405 nm, AMC; excitation wavelength 380 nm / fluorescence wavelength 460 nm, AFC; excitation wavelength 400 nm / fluorescence Wavelength 505 nm, Rh110; excitation wavelength 496 nm / fluorescence wavelength 520 nm.
一つの実施態様において、本発明は、抗ニューロプシン抗体を支持体にコーティングすること；
被験物質を添加すること；及び
ニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を添加することを含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性及び／または量を測定する方法を提供する。
In one embodiment, the present invention coats a support with an anti-neuropsin antibody;
Measuring the activity and / or amount of neuropsin present in the test substance, comprising adding a test substance; and adding neuregulin-1, a neuregulin-1 partial peptide or a fluorescent or chromogenic substrate containing them. Provide a way to do it.
抗ニューロプシン抗体は、ニューロプシンに特異的に結合する抗体であればよく、特に限定されない。抗ニューロプシン抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。好ましくは、本発明で使用する抗ニューロプシン抗体は、活性マスキングペプチド（ＱＥＤＫ：配列番号６）が切り離された活性型ニューロプシンに結合する抗体である。より好ましくは、本発明で使用する抗ニューロプシン抗体は、配列番号８のアミノ酸配列からなる活性型ヒトニューロプシンに特異的に結合する抗体である。 The anti-neuropsin antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically binds to neuropsin. The anti-neuropsin antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. Preferably, the anti-neuropsin antibody used in the present invention is an antibody that binds to active neuropsin from which the active masking peptide (QEDK: SEQ ID NO: 6) has been cleaved. More preferably, the anti-neuropsin antibody used in the present invention is an antibody that specifically binds to active human neuropsin consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
支持体は、抗体をコーティングできる固体であればよく、特に限定されない。支持体の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、ナノ粒子等が挙げられる。 The support is not particularly limited as long as it is a solid on which the antibody can be coated. Examples of the support include microtiter plates, test tubes, beads, nanoparticles, and the like.
この実施態様において、蛍光基質または発色基質ではないニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを用いた場合、被験物質に存在するニューロプシンのタンパク質分解によってニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドから生じたペプチドの量は、例えば、電気泳動、ＨＰＬＣ、当該ペプチドと特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティング等により定量することができる。 In this embodiment, when neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide that is not a fluorescent substrate or a chromogenic substrate is used, neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide by proteolysis of neuropsin present in the test substance The amount of the peptide produced from can be quantified by, for example, electrophoresis, HPLC, ELISA using an antibody that specifically binds to the peptide, Western blotting, or the like.
この実施態様において、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を用いた場合、被験物質に存在するニューロプシンのタンパク質分解によってニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドから生じたペプチドの量は、例えば、蛍光または吸光度を適切な装置により測定することにより定量できる。適切な装置の例には、マイクロプレートリーダーが挙げられる。 In this embodiment, when a fluorescent substrate or chromogenic substrate containing neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide is used, neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide by proteolysis of neuropsin present in the test substance The amount of peptide produced from can be quantified, for example, by measuring fluorescence or absorbance with a suitable device. An example of a suitable device includes a microplate reader.
ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質として、ＳＬＲ−ＭＣＡを用いた場合の実施態様の一例の模式図を図１２に示す。９６穴マイクロタイタープレート（例えば、９６穴ポリスチレンプレート）上に、抗ニューロプシン抗体をコーティングし、そこに活性型ニューロプシンを含む被験物質を添加し、さらに、蛍光基質：ＳＬＲ−ＭＣＡを添加し、活性型ニューロプシンのプロテアーゼ活性を生じたＡＭＣの蛍光強度を定量することにより、活性型ニューロプシンの酵素活性及び酵素量を測定することができる（図１２参照）。 FIG. 12 shows a schematic diagram of an example of an embodiment when SLR-MCA is used as a fluorescent substrate containing neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide. A 96-well microtiter plate (eg, 96-well polystyrene plate) is coated with an anti-neuropsin antibody, a test substance containing active neuropsin is added thereto, and a fluorescent substrate: SLR-MCA is further added. By quantifying the fluorescence intensity of AMC that has produced the protease activity of active neuropsin, the enzyme activity and enzyme amount of active neuropsin can be measured (see FIG. 12).
一つの実施態様において、本発明は、抗ニューロプシン抗体を支持体にコーティングすること；
被験物質を添加すること；
リジルエンドペプチダーゼを添加すること；及び
ニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を添加することを含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性及び／または量を測定する方法を提供する。
In one embodiment, the present invention coats a support with an anti-neuropsin antibody;
Adding a test substance;
Adding lysyl endopeptidase; and adding neuregulin-1, a neuregulin-1 partial peptide, or a fluorescent or chromogenic substrate containing them, to determine the activity and / or amount of neuropsin present in the test substance Provide a way to measure.
リジルエンドペプチダーゼは、前駆体ニューロプシンを活性型ニューロプシンに変換する活性を有していれば特に限定されない。
本明細書において、前駆体ニューロプシンとは、活性マスキングペプチド（ＱＥＤＫ：配列番号６）を含んだニューロプシンであり得、例えば、ヒトタイプ１またはヒトタイプ２プレプロニューロプシンから、シグナル配列、タイプ１特異的ドメイン（ＧＨＳＲＡ：配列番号４）またはＴ２はタイプ２特異的ドメイン（ＣＧＳＬＤＬＬＴＫＬＹＡＥＮＬＰＣＶＨＬＮＰＱＷＰＳＱＰＳＨＣＰＲＧＷＲＳＮＰＬＰＰＡＡＧＨＳＲＡ：配列番号５）が切り離されたヒトプロニューロプシン（図１の「Type 1 proneuropsin」に相当する）であり得る。前駆体ニューロプシンは、活性型ニューロプシンに比較し、プロテアーゼ活性が抑制されている。
The lysyl endopeptidase is not particularly limited as long as it has an activity of converting the precursor neuropsin into an active neuropsin.
In the present specification, the precursor neuropsin may be a neuropsin containing an active masking peptide (QEDK: SEQ ID NO: 6), for example, a signal sequence, type 1 from human type 1 or human type 2 preproneuropsin. The specific domain (GHSRA: SEQ ID NO: 4) or T2 can be a human proneuropsin (corresponding to “Type 1 proneuropsin” in FIG. 1) from which the type 2 specific domain (CGSLDLLTKLYAENLPPCVHLNPQWPSQPPSHCPRGWRSNPLPPAAGHSRA: SEQ ID NO: 5) has been cleaved. The precursor neuropsin has a suppressed protease activity compared to the active neuropsin.
この実施態様において、蛍光基質または発色基質ではないニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを用いた場合、被験物質に存在するニューロプシンのタンパク質分解によってニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドから生じたペプチドの量は、例えば、電気泳動、ＨＰＬＣ、当該ペプチドと特異的に結合する抗体を用いたＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロッティング等により定量することができる。 In this embodiment, when neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide that is not a fluorescent substrate or a chromogenic substrate is used, neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide by proteolysis of neuropsin present in the test substance The amount of the peptide produced from can be quantified by, for example, electrophoresis, HPLC, ELISA using an antibody that specifically binds to the peptide, Western blotting, or the like.
この実施態様において、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を用いた場合、被験物質に存在するニューロプシンのタンパク質分解によってニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドから生じたペプチドの量は、例えば、蛍光または吸光度を適切な装置により測定することにより定量できる。適切な装置の例には、マイクロプレートリーダーが挙げられる。
被験物質に前駆体ニューロプシンのみが含まれる場合は、リジルエンドペプチダーゼを添加して活性型ニューロプシンに変換すれば、ニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を用いて前駆体ニューロプシンの量を測定することができる。
この実施態様において、被験物質に前駆体ニューロプシンと活性型ニューロプシンの両方が含まれる場合は、リジルエンドペプチダーゼを添加して前駆体ニューロプシンを活性型ニューロプシンに変換した場合とリジルエンドペプチダーゼを添加せずに前駆体ニューロプシンを活性型ニューロプシンに変換しない場合の両方の場合のニューロプシン活性を定量することにより、被験物質中の前駆体ニューロプシンと活性型ニューロプシンの量を測定することができる。
In this embodiment, when a fluorescent substrate or chromogenic substrate containing neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide is used, neuregulin-1 or neuregulin-1 partial peptide by proteolysis of neuropsin present in the test substance The amount of peptide produced from can be quantified, for example, by measuring fluorescence or absorbance with a suitable device. An example of a suitable device includes a microplate reader.
When the test substance contains only the precursor neuropsin, it can be converted to active neuropsin by adding lysyl endopeptidase, and then neuregulin-1, neuregulin-1 partial peptide, or a fluorescent or chromogenic substrate containing them Can be used to measure the amount of precursor neuropsin.
In this embodiment, when the test substance contains both precursor neuropsin and active neuropsin, lysyl endopeptidase is added to convert precursor neuropsin to active neuropsin and lysyl endopeptidase is added. Measure the amount of precursor neuropsin and active neuropsin in the test substance by quantifying the neuropsin activity in both cases when the precursor neuropsin is not converted to active neuropsin without addition Can do.
ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質として、ＳＬＲ−ＭＣＡを用いた場合の実施態様の一例の模式図を図１３に示す。９６穴マイクロタイタープレート（例えば、９６穴ポリスチレンプレート）上に、抗ニューロプシン抗体をコーティングし、そこに活性型ニューロプシン及び前駆体ニューロプシンの両方を含む被験物質を添加し、さらに、蛍光基質：ＳＬＲ−ＭＣＡを添加し、活性型ニューロプシンのプロテアーゼ活性を生じたＡＭＣの蛍光強度を定量することにより、被験物質に存在した活性型ニューロプシン及び被験物質に存在した前駆体ニューロプシンから変換された活性型ニューロプシンの両方を合わせたニューロプシンの活性及び／または量を測定することができる（図１３参照）。 FIG. 13 shows a schematic diagram of an example of an embodiment in which SLR-MCA is used as a fluorescent substrate containing neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide. A 96-well microtiter plate (for example, 96-well polystyrene plate) is coated with an anti-neuropsin antibody, to which a test substance containing both active neuropresin and precursor neuropsin is added, and a fluorescent substrate: Conversion from active neuropsin present in the test substance and precursor neuropsin present in the test substance was performed by adding SLR-MCA and quantifying the fluorescence intensity of AMC that produced the protease activity of active neuropsin. The activity and / or amount of neuropsin combined with both active neuropsins can be measured (see FIG. 13).
６．腫瘍細胞の浸潤性、肺癌または卵巣癌の予後、皮膚の角化、扁平上皮癌、子宮頸癌または卵巣癌を判定する方法
本発明は、上記ニューロプシンの活性を測定する方法により、ヒト由来の試料中のニューロプシンの活性を測定することを含む、腫瘍細胞の浸潤性、肺癌または卵巣癌の予後、皮膚の角化、扁平上皮癌、子宮頸癌または卵巣癌を判定する方法を提供する。
ヒトにおいて、ニューロプシンの活性は、腫瘍細胞の浸潤（invasiveness）を抑制することに重要な役割を果たしている（Yuh-Pyng Sher, et al., Cancer Res., 2006;66:(24):11769頁左欄１−２行参照）。
よって、腫瘍細胞でのニューロプシン活性を測定すれば、腫瘍細胞の浸潤性を判定することができる。
6). Method for determining tumor cell invasion, lung cancer or ovarian cancer prognosis, skin keratinization, squamous cell carcinoma, cervical cancer or ovarian cancer The present invention provides a method for measuring the activity of neuropsin as described above. A method is provided for determining tumor cell invasiveness, lung or ovarian cancer prognosis, skin keratinization, squamous cell carcinoma, cervical cancer or ovarian cancer comprising measuring the activity of neuropsin in a sample.
In humans, neuropsin activity plays an important role in suppressing tumor cell invasiveness (Yuh-Pyng Sher, et al., Cancer Res., 2006; 66: (24): 11769 (See page 1-2, line 1-2).
Therefore, if the neuropsin activity in a tumor cell is measured, the invasiveness of the tumor cell can be determined.
一つの実施態様において、本発明は、上記ニューロプシンの活性を測定する方法により、ヒト由来の試料中のニューロプシンの活性を測定することを含む、腫瘍細胞の浸潤性を判定する方法を提供する。 In one embodiment, the present invention provides a method for determining invasiveness of tumor cells, comprising measuring the activity of neuropsin in a human-derived sample by the method for measuring the activity of neuropsin. .
この実施態様において、ヒト由来の試料は、癌患者由来の試料、正常人由来の試料であり得、例えば、癌患者から摘出した腫瘍組織由来の細胞溶解液、正常人の組織由来の細胞溶解液、癌患者由来の体液、正常人由来の体液等が挙げられる。
この実施態様において、腫瘍細胞の例としては、限定はされないが、乳癌細胞（breast cancer cells）、結腸癌細胞（colon cancer cells）、卵巣癌細胞（ovarian cancer cells）、膀胱癌細胞（bladder cancer cells）または肺癌細胞（lung cancer cells）が挙げられる。
この実施態様において、癌患者の例としては、限定はされないが、乳癌（breast cancer）、結腸癌（colon cancer）、卵巣癌（ovarian cancer）、膀胱癌（bladder cancer）または肺癌（lung cancer）が挙げられる。肺癌の例としては、非小細胞肺癌が挙げられる。
この実施態様において、癌患者由来の試料に存在するニューロプシンの酵素活性が、正常人由来の試料に存在するニューロプシンの酵素活性より高い場合は、腫瘍細胞の浸潤性が低いと判定することができる。
In this embodiment, the human-derived sample can be a sample derived from a cancer patient, a sample derived from a normal person, for example, a cell lysate derived from a tumor tissue extracted from a cancer patient, a cell lysate derived from a tissue of a normal person And body fluids derived from cancer patients, body fluids derived from normal persons, and the like.
In this embodiment, examples of tumor cells include, but are not limited to, breast cancer cells, colon cancer cells, ovarian cancer cells, bladder cancer cells. ) Or lung cancer cells.
In this embodiment, examples of cancer patients include, but are not limited to, breast cancer, colon cancer, ovarian cancer, bladder cancer, or lung cancer. Can be mentioned. Examples of lung cancer include non-small cell lung cancer.
In this embodiment, when the enzyme activity of neuropsin present in a sample derived from a cancer patient is higher than the enzyme activity of neuropsin present in a sample derived from a normal person, it is determined that the invasion property of tumor cells is low. it can.
一つの実施態様において、本発明は、上記ニューロプシンの活性を測定する方法により、ヒト由来の試料中のニューロプシンの活性を測定することを含む、肺癌の予後を判定する方法を提供する。
この実施態様において、ヒト由来の試料は、癌患者由来の試料、正常人由来の試料であり得、例えば、癌患者から摘出した腫瘍組織由来の細胞溶解液、正常人の組織由来の細胞溶解液、癌患者由来の体液、正常人由来の体液等が挙げられる。
この実施態様において、肺癌の例としては、非小細胞肺癌が挙げられ、International System for Staging of Lung Cancerの規準に基づいて、ステージＩの非小細胞肺癌、ステージＩＩの非小細胞肺癌、ステージＩ及びＩＩの非小細胞肺癌またはステージＩＩＩの非小細胞肺癌であり得る。
この実施態様において、肺癌組織におけるニューロプシンの酵素活性が高い場合は、肺癌再発の危険性が低いと判定できる。例えば、ステージＩ及びＩＩの非小細胞肺癌を有する患者が肺癌摘出手術を受け、その摘出組織でのニューロプシンの酵素活性が高い場合は、手術３０ヶ月後における肺癌再発の危険性が低いと判定できる。
In one embodiment, the present invention provides a method for determining prognosis of lung cancer, comprising measuring the activity of neuropsin in a sample derived from a human by the method for measuring the activity of neuropsin.
In this embodiment, the human-derived sample can be a sample derived from a cancer patient, a sample derived from a normal person, for example, a cell lysate derived from a tumor tissue extracted from a cancer patient, a cell lysate derived from a tissue of a normal person And body fluids derived from cancer patients, body fluids derived from normal persons, and the like.
In this embodiment, examples of lung cancer include non-small cell lung cancer, and based on International System for Staging of Lung Cancer criteria, stage I non-small cell lung cancer, stage II non-small cell lung cancer, stage I And II non-small cell lung cancer or stage III non-small cell lung cancer.
In this embodiment, when the neuropsin enzyme activity in the lung cancer tissue is high, it can be determined that the risk of recurrence of the lung cancer is low. For example, if a patient with stage I and II non-small cell lung cancer has undergone surgery to remove lung cancer and the enzyme activity of neuropsin in the removed tissue is high, the risk of recurrence of lung cancer 30 months after surgery is determined to be low it can.
一つの実施態様において、本発明は、上記ニューロプシンの活性を測定する方法により、ヒト由来の試料中のニューロプシンの活性を測定することを含む、卵巣癌の予後を判定する方法を提供する。
この実施態様において、ヒト由来の試料は、癌患者由来の試料、正常人由来の試料であり得、例えば、癌患者から摘出した腫瘍組織由来の細胞溶解液、正常人の組織由来の細胞溶解液、癌患者由来の体液、正常人由来の体液等が挙げられる。体液の例としては、限定はされないが、血清、腹水が挙げられる。
この実施態様において、卵巣癌組織または腹水におけるニューロプシンの酵素活性が高い場合は、卵巣癌再発の危険性が低いと判定される。例えば、卵巣癌を有する患者が卵巣癌摘出手術を受け、その摘出組織または腹水でのニューロプシンの酵素活性が高い場合は、手術４２ヶ月後における卵巣癌再発の危険性が低いと判定できる。また、例えば、卵巣癌を有する患者が卵巣癌摘出手術を受け、その摘出組織でのニューロプシンの酵素活性が高い場合は、手術４２ヶ月後における生存率が高いと判定できる。
In one embodiment, the present invention provides a method for determining the prognosis of ovarian cancer, comprising measuring the activity of neuropsin in a sample derived from a human by the method for measuring the activity of neuropsin.
In this embodiment, the human-derived sample can be a sample derived from a cancer patient, a sample derived from a normal person, for example, a cell lysate derived from a tumor tissue extracted from a cancer patient, a cell lysate derived from a tissue of a normal person And body fluids derived from cancer patients, body fluids derived from normal persons, and the like. Examples of body fluids include, but are not limited to, serum and ascites.
In this embodiment, when the enzyme activity of neuropsin in ovarian cancer tissue or ascites is high, it is determined that the risk of recurrence of ovarian cancer is low. For example, if a patient with ovarian cancer undergoes ovarian cancer removal surgery and the enzyme activity of neuropsin in the removed tissue or ascites is high, it can be determined that the risk of recurrence of ovarian cancer after 42 months of surgery is low. In addition, for example, when a patient having ovarian cancer has undergone ovarian cancer removal surgery and the neuropsin enzyme activity in the removed tissue is high, it can be determined that the survival rate after 42 months of surgery is high.
一つの実施態様において、本発明は、上記ニューロプシンの活性を測定する方法により、ヒト由来の試料中のニューロプシンの活性を測定することを含む、皮膚の角化、扁平上皮癌または子宮頸癌を判定する方法を提供する。
この実施態様において、ヒト由来の試料は、皮膚疾患を有する患者由来の試料、癌患者由来の試料、正常人由来の試料であり得、例えば、皮膚疾患を有する患者の皮膚の細胞溶解液、癌患者から摘出した腫瘍組織由来の細胞溶解液、正常人の組織由来の細胞溶解液、癌患者由来の体液、正常人由来の体液等が挙げられる。
この実施態様において、皮膚の角化の例としては、限定はされないが、脂漏性角化症、尋常性乾癬、扁平苔癬、褥瘡性潰瘍等が挙げられる。
この実施態様において、組織におけるニューロプシンの酵素活性が高い場合は、皮膚の角化、扁平上皮癌または子宮頸癌に罹患している危険性があると判定できる。
In one embodiment, the present invention includes measuring the activity of neuropsin in a sample derived from a human by the above-described method for measuring the activity of neuropsin, comprising skin keratinization, squamous cell carcinoma or cervical cancer A method for determining
In this embodiment, the human-derived sample may be a sample from a patient having a skin disease, a sample from a cancer patient, a sample from a normal person, for example, a cell lysate of skin of a patient having a skin disease, cancer Examples include cell lysates derived from tumor tissues excised from patients, cell lysates derived from normal human tissues, body fluids derived from cancer patients, body fluids derived from normal persons, and the like.
In this embodiment, examples of skin keratin include, but are not limited to, seborrheic keratosis, psoriasis vulgaris, lichen planus, pressure ulcers, and the like.
In this embodiment, if the enzyme activity of neuropsin in the tissue is high, it can be determined that there is a risk of suffering from skin keratinization, squamous cell carcinoma or cervical cancer.
一つの実施態様において、本発明は、上記ニューロプシンの活性を測定する方法により、ヒト由来の試料中のニューロプシンの活性を測定することを含む、卵巣癌を判定する方法を提供する。
この実施態様において、ヒト由来の試料は、癌患者由来の試料、正常人由来の試料であり得、例えば、癌患者から摘出した腫瘍組織由来の細胞溶解液、正常人の組織由来の細胞溶解液、癌患者の血液由来の試料、正常人の血液由来の試料、癌患者の腹水等が挙げられる。血液由来の試料の例としては、血清、血漿等が挙げられる。
この実施態様において、組織または血清におけるニューロプシンの酵素活性が正常人の組織または血清より高い場合は卵巣癌に罹患している危険性が高いと判定できる。
また、腹水におけるニューロプシンの酵素活性が高い場合は、卵巣癌に罹患している可能性があると判定できる。
In one embodiment, the present invention provides a method for determining ovarian cancer, comprising measuring the activity of neuropsin in a sample derived from a human by the method for measuring the activity of neuropsin.
In this embodiment, the human-derived sample can be a sample derived from a cancer patient, a sample derived from a normal person, for example, a cell lysate derived from a tumor tissue extracted from a cancer patient, a cell lysate derived from a tissue of a normal person Samples derived from blood of cancer patients, samples derived from blood of normal persons, ascites of cancer patients, and the like. Examples of blood-derived samples include serum and plasma.
In this embodiment, if the neuropsin enzyme activity in tissue or serum is higher than that in normal human tissue or serum, it can be determined that the risk of suffering from ovarian cancer is high.
Moreover, when the enzyme activity of neuropsin in ascites is high, it can be determined that there is a possibility of suffering from ovarian cancer.
７．ニューロプシン活性調節剤のスクリーニング方法
本発明は、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１の部分ペプチド、ニューロプシン及び被験物質を接触させることを含む、ニューロプシンの活性調節剤のスクリーニング方法を提供する。
ニューロプシンの活性調節剤の例としては、限定はされないが、ニューロプシンの酵素活性を阻害する物質または、ニューロプシンの酵素活性を活性化する物質が挙げられる。
一つの実施態様において、本発明は、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチド、ニューロプシン及び被験物質を接触させることを含む、ニューロプシン活性調節剤のスクリーニング方法を提供する。
一つの実施態様において、本発明は、ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質、ニューロプシン及び被験物質を接触させることを含む、ニューロプシン活性調節剤のスクリーニング方法を提供する。
一つの実施態様において、本発明は、抗ニューロプシン抗体を支持体にコーティングすること；
ニューロプシンを含む試料を添加すること；
ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を添加すること；
被験物質を添加すること；及び
蛍光または吸光度を測定することを含む、ニューロプシン活性調節剤のスクリーニング方法を提供する。
一つの実施態様において、本発明は、抗ニューロプシン抗体を支持体にコーティングすること；
ニューロプシンを含む試料を添加すること；
リジルエンドペプチダーゼを添加すること；
ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を添加すること；
被験物質を添加すること；及び
蛍光または吸光度を測定すること含む、ニューロプシン活性調節剤のスクリーニング方法を提供する。
7). Method for Screening Neuropsin Activity Modulator The present invention provides a method for screening a neuropsin activity modulator, which comprises contacting neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide, neuropsin and a test substance.
Examples of the neuropsin activity regulator include, but are not limited to, a substance that inhibits neuropsin enzyme activity or a substance that activates neuropsin enzyme activity.
In one embodiment, the present invention provides a screening method for a neuropsin activity modulator comprising contacting neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide, neuropsin and a test substance.
In one embodiment, the present invention provides a method for screening a neuropsin activity modulator comprising contacting a fluorescent or chromogenic substrate comprising neuroregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide, neuropsin and a test substance. provide.
In one embodiment, the present invention coats a support with an anti-neuropsin antibody;
Adding a sample containing neuropsin;
Adding a fluorescent or chromogenic substrate comprising neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide;
Provided is a method for screening a neuropsin activity modulator comprising adding a test substance; and measuring fluorescence or absorbance.
In one embodiment, the present invention coats a support with an anti-neuropsin antibody;
Adding a sample containing neuropsin;
Adding lysyl endopeptidase;
Adding a fluorescent or chromogenic substrate comprising neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide;
Provided is a method for screening a neuropsin activity modulator comprising adding a test substance; and measuring fluorescence or absorbance.
上記実施態様において、ニューロプシンを含む試料の例としては、限定はされないが、ニューロプシンを発現させた細胞の培養上清、ニューロプシンを発現させた細胞の細胞溶解液等が挙げられる。 In the above embodiment, examples of a sample containing neuropsin include, but are not limited to, a culture supernatant of cells expressing neuropsin, a cell lysate of cells expressing neuropsin, and the like.
当業者は、上述した「ニューロプシンの活性測定方法」の開示を参考にして、上記実施態様に係る発明を実施することができる。 A person skilled in the art can implement the invention according to the above embodiment with reference to the disclosure of the above-mentioned “method for measuring the activity of neuropsin”.
８．疾患判定用キット
本発明は、抗ニューロプシン抗体；及びニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を含む、腫瘍細胞の浸潤性、肺癌または卵巣癌の予後、皮膚の角化、扁平上皮癌、子宮頸癌または卵巣癌の判定用キットを提供する。
一つの実施態様において、本発明は、ニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を含む、腫瘍細胞の浸潤性、肺癌または卵巣癌の予後、皮膚の角化、扁平上皮癌、子宮頸癌または卵巣癌の判定用キットを提供する。
ニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質の例としては、限定はされないが、Ac-SLR-MCA、Boc-VPR-MCA、Ac-KDR-MCA、Ac-KER-MCA、Ac-QKR-MCA、Ac-KKK-MCA、Ac-ELR-MCA、Ac-DVR-MCA及びAc-YGR-MCA等が挙げられる。
8). The present invention relates to an anti-neuropsin antibody; and neuregulin-1, a neuregulin-1 partial peptide, or a fluorescent substrate or a chromogenic substrate containing them, the invasion of tumor cells, the prognosis of lung cancer or ovarian cancer, A kit for determining skin keratinization, squamous cell carcinoma, cervical cancer or ovarian cancer is provided.
In one embodiment, the present invention relates to tumor cell invasion, lung or ovarian cancer prognosis, skin keratinization, squamous cell carcinoma, cervical cancer comprising a fluorescent or chromogenic substrate comprising a neuregulin-1 partial peptide A kit for determining cancer or ovarian cancer is provided.
Examples of fluorescent substrates containing neuregulin-1 partial peptides include, but are not limited to, Ac-SLR-MCA, Boc-VPR-MCA, Ac-KDR-MCA, Ac-KER-MCA, Ac-QKR-MCA, Examples include Ac-KKK-MCA, Ac-ELR-MCA, Ac-DVR-MCA, and Ac-YGR-MCA.
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further, this invention is not limited to these.
実施例１：変異型ニューロプシンは細胞外でタンパク質複合体を形成する
（１）目的 ニューロプシンの確実なターゲット基質を同定するために、変異体ニューロプシンと結合する蛋白質を探索した。
（２）方法 酵素-基質結合時に分解・解離せず、複合体を維持する変異体マウスニューロプシン（PreneuropsinC208S：配列番号２８のＤＮＡ配列を有する）を発現するプラスミドを構築した。分泌後、速やかに基質に到達できるように活性マスキングに対する配列（Q29GSK：配列番号２９）は除去した。このプラスミドを海馬初代培養細胞に導入した。遺伝子導入1日後、抗ニューロプシン抗体（１:１，０００）を培養上清に投与し、４℃で１時間反応させた。結合していない抗体を除去した後、４％ＰＦＡ/４％スクロース溶液で１５分間固定後、二次抗体を１．５時間室温で反応させ、スライドガラスに張り付け、封入した。
（３）結果 変異体ニューロプシンが導入された海馬培養細胞で、細胞体や突起の周囲で、点状のニューロプシン陽性反応が観察された（図２）。しかしながら、野生型ニューロプシンでは、陽性反応は確認できなかった（図２）。
Example 1: Mutant neuropsin forms a protein complex extracellularly (1) Purpose In order to identify a reliable target substrate of neuropsin, a protein that binds to mutant neuropsin was searched.
(2) Method A plasmid expressing a mutant mouse neuropsin (Preneuropsin C208S : having the DNA sequence of SEQ ID NO: 28) that maintains the complex without being decomposed or dissociated upon enzyme-substrate binding was constructed. After secretion, the sequence for activity masking (Q 29 GSK: SEQ ID NO: 29) was removed so that the substrate could be reached quickly. This plasmid was introduced into hippocampal primary culture cells. One day after gene transfer, an anti-neuropsin antibody (1: 1,000) was administered to the culture supernatant and allowed to react at 4 ° C. for 1 hour. After removing the unbound antibody, it was fixed with 4% PFA / 4% sucrose solution for 15 minutes, and then the secondary antibody was reacted at room temperature for 1.5 hours, attached to a glass slide and sealed.
(3) Results In the hippocampal cultured cells into which the mutant neuropsin was introduced, a punctate neuropsin-positive reaction was observed around the cell bodies and processes (FIG. 2). However, a positive reaction could not be confirmed with wild-type neuropsin (FIG. 2).
実施例２：ニューロプシンはニューレグリン−１のヘパリン結合ドメインとＥＧＦドメインの間を切断する
（１）目的 ニューロプシンによるニューレグリン−１の切断サイトを同定した。
（２）方法 組換えヒトニューロプシン（R&D Systemsより入手）と組換えヒトニューレグリン−１（R&D Systemsより入手）を３７℃で１時間反応させた後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。ゲルをＰＶＤＦ膜に転写した後、CBB染色を行った。切断されたニューレグリン−１フラグメントのバンドを切り出し、Pricise 492 cLC シーケンサーを用いて、Ｅｄｍａｎ法によりアミノ酸配列を決定した。
（３）結果 切断フラグメントのN末端配列はそれぞれ32-kDa(G19SGKKP：配列番号３０)、28-kDa(F68KWFKN：配列番号３１)、19-kDa(I99NKASL：配列番号３２)であった。これら切断サイトの１つは、免疫グロブリンドメインとヘパリン結合ドメインの間に、他２つは、免疫グロブリンドメイン内であった（図３）。
Example 2: Neuropsin cleaves between heparin-binding domain and EGF domain of neuregulin-1 (1) Purpose The site of neuregulin-1 cleavage by neuropsin was identified.
(2) Method Recombinant human neuropsin (obtained from R & D Systems) and recombinant human neuregulin-1 (obtained from R & D Systems) were reacted at 37 ° C. for 1 hour, and then subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. . After transferring the gel to the PVDF membrane, CBB staining was performed. The band of the cleaved neuregulin-1 fragment was excised, and the amino acid sequence was determined by Edman method using a Price 492 cLC sequencer.
(3) Results The N-terminal sequences of the cleaved fragments are 32-kDa (G 19 SGKKP: SEQ ID NO: 30), 28-kDa (F 68 KWFKN: SEQ ID NO: 31), and 19-kDa (I 99 NKASL: SEQ ID NO: 32), respectively. Met. One of these cleavage sites was between the immunoglobulin domain and the heparin binding domain, and the other two were within the immunoglobulin domain (Figure 3).
実施例３：ニューロプシンによるニューレグリン−１の切断はＥｒｂＢ受容体のリン酸化を誘導する
（１）目的 ニューレグリン−１のヘパリン結合ドメインは、ヘパラン硫酸プロテオグリカンと結合することが知られており、この状態では、ＥｒｂＢ受容体のリガンドとして機能できない。ニューロプシンによるヘパリン結合ドメインの除去が、ＥｒｂＢ受容体を活性化するかどうかを調べた。
（２）方法 ヘパリンに結合しているニューレグリン−１はＥｒｂＢ受容体をリン酸化することができないので、ＥｒｂＢ受容体を含むｐ１８５のチロシンリン酸化は、ニューレグリン−１が遊離したことを示す。ＣＯＳ−７細胞にマウスニューレグリン−１遺伝子（配列番号３３）を導入し、２０時間後、培地に組換えニューロプシンを添加した。その培地をＭＣＦ−７細胞に添加し、２０分間３７℃でインキュベートした。培地を除去した後、ＭＣＦ−７細胞を可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ニトロセルロース膜に転写した。抗チロシンリン酸化抗体で（ＥｒｂＢ受容体を含む）ｐ１８５のリン酸化を検出した。
（３）結果 ニューロプシンの酵素活性レベル依存的にｐ１８５のリン酸化が増大した（図４、図５）。また反応時間０−６０分の間では、ｐ１８５のリン酸化レベルが直線的に増大した。これらｐ１８５リン酸化の増加パターンは、ニューロプシンによって切断されたニューレグリン−１の32-kDa切断フラグメントの出現変化と一致していた。
Example 3: Cleavage of neuregulin-1 by neuropsin induces phosphorylation of ErbB receptor (1) Purpose The heparin-binding domain of neuregulin-1 is known to bind to heparan sulfate proteoglycans, In this state, it cannot function as a ligand for the ErbB receptor. We examined whether removal of the heparin-binding domain by neuropsin activates the ErbB receptor.
(2) Method Since neuregulin-1 bound to heparin cannot phosphorylate the ErbB receptor, tyrosine phosphorylation of p185 containing the ErbB receptor indicates that neuregulin-1 was released. The mouse neuregulin-1 gene (SEQ ID NO: 33) was introduced into COS-7 cells, and 20 hours later, recombinant neuropsin was added to the medium. The medium was added to MCF-7 cells and incubated for 20 minutes at 37 ° C. After removing the medium, MCF-7 cells were solubilized and subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane. Phosphorylation of p185 (including ErbB receptor) was detected with an anti-tyrosine phosphorylated antibody.
(3) Results The phosphorylation of p185 increased depending on the enzyme activity level of neuropsin (FIGS. 4 and 5). Moreover, between reaction times 0-60 minutes, the phosphorylation level of p185 increased linearly. These increased patterns of p185 phosphorylation were consistent with changes in the appearance of the neuregulin-1 32-kDa cleavage fragment cleaved by neuropsin.
実施例４：神経活動依存的にニューロプシンは活性化する
（１）目的 ニューロプシンは不活性型で分泌されるので、ニューロプシンのプロテアーゼ活性が神経活動依存的に増大するかを調べた。
（２）方法 麻酔下マウスの海馬で、シータバースト刺激を与えＬＴＰを誘発する。その後、様々なタイムコースでマウスを断頭後、海馬を取り出し、ホモジナイズする。これに抗ニューロプシン抗体を加え、４℃で１２時間攪拌後、ＰＧＳを加え、４℃でさらに４時間攪拌した。この免疫沈降サンプルに対して、合成基質PFR-MCAを用いて、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）反応液中でニューロプシンの酵素活性を測定した。
（３）結果 シータバースト刺激後、５−６分後に速やかにニューロプシンの酵素活性が上昇し、７分後には減弱したが、その後、弱い活性レベルが少なくとも６０分間持続した（図６）。
Example 4: Neuropsin is activated depending on nerve activity (1) Purpose Since neuropsin is secreted in an inactive form, it was investigated whether the protease activity of neuropsin increased depending on nerve activity.
(2) Method In the anesthetized mouse hippocampus, theta burst stimulation is applied to induce LTP. Then, after decapitation of mice at various time courses, the hippocampus is removed and homogenized. An anti-neuropsin antibody was added thereto, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 12 hours. The enzyme activity of neuropsin was measured for this immunoprecipitation sample in a 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) reaction solution using a synthetic substrate PFR-MCA.
(3) Result After theta burst stimulation, the enzyme activity of neuropsin increased rapidly after 5-6 minutes and was attenuated after 7 minutes, but then a weak activity level persisted for at least 60 minutes (FIG. 6).
実施例５：ニューロプシン遺伝子欠損動物はワーキングメモリーが障害されている
（１）目的 ニューロプシンが海馬依存的な学習に関与しているかを調べるために、ニューロプシン遺伝子欠損マウスのＹ迷路の学習レベルを評価した。
（２）方法 ３つのアームからなるＹ迷路にマウスを８分間自由に行動させる。その間、マウスの後肢が完全にアームに侵入した回数を調べた。自発的交替行動は、アームに侵入したトータル数から２を引いた値に対するAlternationの数の割合として算出した。Alternationは異なる３つのアームに連続して進入する数として定義した。
（３）結果 野生型マウスは有意な自発的交替行動を示したが、ニューロプシン遺伝子欠損マウスおよびヘテロマウスの自発的交替行動は、ほぼチャンスレベルであり、新規のアームを優先的に選ばなかった（図７）。
Example 5: Neuropsin gene-deficient animals have impaired working memory (1) Purpose In order to examine whether neuropsin is involved in hippocampal-dependent learning, learning level of Y-maze in neuropsin gene-deficient mice Evaluated.
(2) Method The mouse is allowed to move freely in the Y maze consisting of three arms for 8 minutes. Meanwhile, the number of times that the hind limb of the mouse completely entered the arm was examined. Spontaneous alternation behavior was calculated as the ratio of the number of alternations to the value obtained by subtracting 2 from the total number of intrusions into the arm. Alternation was defined as the number of consecutive entries into three different arms.
(3) Results Wild-type mice showed significant spontaneous alternation behavior, but spontaneous alternation behavior of neuropsin gene-deficient mice and heterozygous mice was almost at the chance level, and new arms were not preferentially selected. (FIG. 7).
実施例６：ニューロプシン遺伝子欠損動物はＬＴＰが障害されている
（１）目的 ニューロプシンのシナプスでの効果を調べるために、ニューロプシン遺伝子欠損マウスにおける海馬ＬＴＰを評価した。
（２）方法 麻酔下のマウス海馬ＣＡ１領域において、双極ステンレス電極でSchaffer-collateralを刺激し、誘発されるシナプス後電位を単極のタングステン電極で記録した。単一のテタヌス刺激を与え、初期ＬＴＰを誘発し、その後のＬＴＰレベルを評価した。
（３）結果 野生型マウスでは、テタヌス刺激後、少なくとも６０分間は安定な初期ＬＴＰが確認されたが、ニューロプシン遺伝子欠損マウスでは、テタヌス刺激数分後に速やかにシナプス後電位がベースラインまで戻った。このようにニューロプシン遺伝子欠損マウスでは、初期ＬＴＰが障害されていた（図９）。
Example 6: Neuropsin gene-deficient animals have impaired LTP (1) Purpose To examine the effect of neuropsin at synapses, hippocampal LTP in neuropsin gene-deficient mice was evaluated.
(2) Method In the mouse hippocampal CA1 region under anesthesia, Schaffer-collateral was stimulated with a bipolar stainless electrode, and the induced post-synaptic potential was recorded with a monopolar tungsten electrode. A single tetanus stimulus was given to induce initial LTP and subsequent LTP levels were assessed.
(3) Results In wild-type mice, stable initial LTP was confirmed for at least 60 minutes after tetanus stimulation, but in neuropsin gene-deficient mice, the post-synaptic potential quickly returned to baseline several minutes after tetanus stimulation. . Thus, in the neuropsin gene-deficient mice, the initial LTP was impaired (FIG. 9).
実施例７：ニューロプシンによって切断されたニューレグリン−１ペプチドの投与は、LTP障害を回復させる
（１）目的 ニューロプシン遺伝子欠損マウスは初期ＬＴＰが障害されており、これは組換えニューロプシンを短時間投与するだけで救済することができる。初期LTPのこのニューロプシンの効果がニューロプシンによるニューレグリン−１の切断によって遊離した（ＥＧＦ機能ドメインを含む）切断フラグメントであるならば、ニューレグリン−１の切断フラグメントはニューロプシン遺伝子欠損マウスの初期ＬＴＰを回復させるはずである。そこで、ニューロプシン遺伝子欠損マウスの初期ＬＴＰ障害が組換えニューレグリン−１の切断フラグメントの投与によって救済できるかどうかを調べた。
（２）方法 ニューロプシン遺伝子欠損マウスの海馬スライスを作製し、双極ステンレス電極でSchaffer-collateralを刺激し、誘発されるシナプス後電位をガラス電極で記録した。安定なベースラインを獲得後、０．５ｎＭの組換えニューレグリン−１の切断フラグメントをテタヌス刺激の前後35分間投与した。コントロールとして溶媒を投与した。
（３）結果 ニューロプシン遺伝子欠損マウスの初期ＬＴＰは野生型に比べて有意に減弱したが、組換えニューレグリン−１の切断フラグメントを投与した遺伝子欠損マウスでは、野生型レベルまで初期ＬＴＰが回復した（図１０）。
Example 7: Administration of neuregulin-1 peptide cleaved by neuropsin restores LTP damage (1) Purpose Neuropsin gene-deficient mice have impaired initial LTP, which is a result of shortening recombinant neuropsin. It can be remedied by just administering for a time. If the effect of this neuropsin on early LTP is a cleavage fragment (including the EGF functional domain) released by the cleavage of neuregulin-1 by neuropsin, then the cleavage fragment of neuregulin-1 will be the early of a neuropsin gene-deficient mouse. LTP should be restored. Therefore, it was examined whether or not the initial LTP disorder in neuropsin gene-deficient mice can be remedied by administration of a recombinant neuregulin-1 cleavage fragment.
(2) Method Hippocampal slices of neuropsin gene-deficient mice were prepared, Schaffer-collateral was stimulated with a bipolar stainless steel electrode, and the induced post-synaptic potential was recorded with a glass electrode. After obtaining a stable baseline, 0.5 nM recombinant neuregulin-1 cleavage fragment was administered for 35 minutes before and after tetanus stimulation. A solvent was administered as a control.
(3) Results The initial LTP of neuropsin gene-deficient mice was significantly attenuated compared to the wild type, but in the gene-deficient mice administered with the recombinant neuregulin-1 cleavage fragment, the initial LTP was recovered to the wild-type level. (FIG. 10).
実施例８：ニューロプシン活性測定用合成ペプチドの作製と酵素反応パラメーターの測定
（１）目的 ニューロプシンによるニューレグリン−１の切断サイトに対応する合成ペプチドを用いて、ニューロプシンに対する酵素キネティックスを明らかとする。
（２）方法 組換えマウスニューロプシンの酵素活性とキネティックスパラメーターはMCA合成基質を用いて、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）反応液中で３０℃で決定した。AMCの遊離は、マイクロプレートリーダー（Mitras LB940;ex355nm, em460nm）によって測定した。酵素濃度に依存したニューロプシンの反応速度は、Hanes-Woolf plotによって決定したが、Ac-KER-MCAとAc-DVR-MCAに対してはV=VmaxEh/(Eh+Km h)関数を用いてシグモイド曲線をフィットした。Vmaxは、最大反応速度、Kmは、反応速度がVmaxの半分になるときの基質濃度、hは、ヒル係数を示す。
（３）結果 組換えマウスニューロプシンと反応後最初に現れた32-kDaフラグメントに一致する切断サイトであるKER-MCA（ヒト）またはKDR-MCA（マウス）は効果的に切断された。ニューレグリン−１の免疫グロブリンドメイン内の切断サイトであるSLR-MCAは、ポジティブコントロールとして用いたα-トロンビンに対する合成基質であるVPR-MCAよりも効率良く切断された。高濃度のニューロプシンと反応させたときに現れた19-kDaフラグメントに一致するELR-MCAは組換えニューロプシンに対して低い酵素活性を示した。このように、ニューロプシンが求核攻撃を行うアミノ酸配列は、ニューレグリン−１のSLR、KER、ELRの３つのサイトにおいて確認された。しかしながら、Attwood（２０１１）やShimizu（１９９８）らによって推定されたニューロプシンによるフィブロネクチンやEphB2の切断サイトであるDVR-MCAやYGR-MCAに対しては、ニューロプシンの切断活性はほとんど観察されなかった（図１１）。
Example 8 Preparation of Synthetic Peptide for Measuring Neuropsin Activity and Measurement of Enzyme Reaction Parameters (1) Purpose Using the synthetic peptide corresponding to the cleavage site of neuroregin-1 by neuropsin, the enzyme kinetics for neuropsin is revealed. And
(2) Method Enzyme activity and kinetic parameters of recombinant mouse neuropsin were determined at 30 ° C. in a 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) reaction solution using an MCA synthetic substrate. AMC release was measured by a microplate reader (Mitras LB940; ex355 nm, em460 nm). The reaction rate of neuropsin depending on the enzyme concentration was determined by Hanes-Woolf plot, but for Ac-KER-MCA and Ac-DVR-MCA, V = V max E h / (E h + K m h ) Function was used to fit the sigmoid curve. V max is the maximum reaction rate, Km is the substrate concentration when the reaction rate is half of V max , and h is the Hill coefficient.
(3) Results KER-MCA (human) or KDR-MCA (mouse), which is a cleavage site corresponding to the 32-kDa fragment that first appeared after reaction with recombinant mouse neuropsin, was effectively cleaved. SLR-MCA, a cleavage site in the immunoglobulin domain of neuregulin-1, was cleaved more efficiently than VPR-MCA, which is a synthetic substrate for α-thrombin used as a positive control. ELR-MCA, which corresponds to the 19-kDa fragment that appeared when reacted with high concentrations of neuropsin, showed low enzyme activity against recombinant neuropsin. Thus, the amino acid sequence that neuropsin performs nucleophilic attack was confirmed at three sites of SLR, KER, and ELR of neuregulin-1. However, almost no neuropsin cleavage activity was observed against DVR-MCA and YGR-MCA, which are fibronectin and EphB2 cleavage sites by neuropsin estimated by Attwood (2011) and Shimizu (1998). (FIG. 11).
実施例９：ニューロプシンによる切断によって産生されたニューレグリン−１フラグメントはパルブアルブミン陽性細胞に局在しているＥｒｂＢ４受容体に結合する
（１）目的 ニューロプシンによるニューレグリン−１の切断がどのような機能を発揮するのかを明らかとするために、ニューロプシンによる切断によって産生されたニューレグリン−１フラグメントの局在を調べた。
（２）方法 ニューロプシンとビオチン標識したニューレグリン−１を３７℃で２０分間反応させた。ニューレグリン−１の切断は、抗ビオチン抗体（１：１０，０００希釈）および抗N末端ニューレグリン−１抗体（１：４００希釈）を用いたウエスタンブロット法により確認した。３２ｋＤａにバンドが認められたことから（図３）、これはニューレグリン−１のヘパリン結合ドメインが除去されたフラグメント（ＮＲＧ−１ΔＨＢ）であると考えられる（図１４Ａ）。マウスを麻酔後、ビオチン化ＮＲＧ−１ΔＨＢを右海馬ＣＡ１領域（ＡＰ＝２．０６ｍｍ、ＭＬ＝１．５ｍｍ、ＤＶ＝１．５ｍｍ）へシリンジポンプによって駆動するハミルトンシリンジを用いて、０．０５μｌ／ｍｉｎの速度で１５分間投与した。投与部位は１．５％ のＣＨＩＣＡＧＯ ＳＫＹ Ｂｌｕｅ ６Ｂを用いて確認した（図１４Ｂ）。ＮＲＧ−１ΔＨＢ投与１時間後に海馬を摘出し、ビオチン、ＥｒｂＢ４、パルブアルブミン、リン酸化チロシンに対する抗体を用いた免疫組織化学染色を行った。
（３）結果 多くのＥｒｂＢ４はパルブアルブミン陽性細胞と共局在した（図１５、白矢印）。ＮＲＧ−１ΔＨＢは、パルブアルブミン陽性細胞上のＥｒｂＢ４と共局在した（図１６、上図）。またＮＲＧ−１ΔＨＢ結合細胞は、チロシンリン酸化を誘導した（図１６、下図）。
Example 9: Neuregulin-1 Fragment Produced by Cleavage with Neuropsin Binds to ErbB4 Receptor Localized in Parvalbumin-Positive Cells (1) Purpose What is the cleavage of neuregulin-1 by neuropsin? In order to clarify whether these functions are exerted, the localization of the neuregulin-1 fragment produced by cleavage with neuropsin was examined.
(2) Method Neuropsin and biotin-labeled neuregulin-1 were reacted at 37 ° C. for 20 minutes. Cleavage of neuregulin-1 was confirmed by Western blotting using an anti-biotin antibody (1: 10,000 dilution) and an anti-N-terminal neuregulin-1 antibody (1: 400 dilution). Since a band was observed at 32 kDa (FIG. 3), this is considered to be a fragment (NRG-1ΔHB) from which the heparin-binding domain of neuregulin-1 was removed (FIG. 14A). After anesthetizing the mouse, biotinylated NRG-1ΔHB was added to the right hippocampal CA1 region (AP = 2.06 mm, ML = 1.5 mm, DV = 1.5 mm) using a Hamilton syringe driven by a syringe pump at 0.05 μl / It was administered at a rate of min for 15 minutes. The administration site was confirmed using 1.5% CHICAGO SKY Blue 6B (FIG. 14B). One hour after administration of NRG-1ΔHB, the hippocampus was excised and immunohistochemically stained using antibodies against biotin, ErbB4, parvalbumin, and phosphorylated tyrosine.
(3) Results Many ErbB4 colocalized with parvalbumin positive cells (FIG. 15, white arrows). NRG-1ΔHB colocalized with ErbB4 on parvalbumin positive cells (FIG. 16, upper panel). NRG-1ΔHB-binding cells induced tyrosine phosphorylation (FIG. 16, lower panel).
実施例１０：ニューロプシン遺伝子欠損動物は抑制性伝達が障害されている
（１）目的 ニューロプシンが抑制性伝達に関与しているかを調べるために、ニューロプシン遺伝子欠損マウスにおけるＰａｉｒｅｄ−Ｐｕｌｓｅ−Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（ＰＰＩ）を評価した。
（２）方法 双極ステンレス電極で、１０ミリ秒間隔で２回連続した刺激を海馬Ｓｃｈａｆｆｅｒ−ｃｏｌｌａｔｅｒａｌに与え、誘発される集合スパイクをガラス電極によって海馬錐体細胞から記録した（図１７）。またニューロプシン遺伝子欠損マウスに０．５ｎＭのＮＲＧ−１１７７−２４６を２０分間投与した。
（３）結果 野生型マウスでは、ＧＡＢＡ伝達の結果として、２番目のスパイクが強く抑制されたＰＰＩが観察されたが、ニューロプシン遺伝子欠損マウスでは、ＰＰＩの効果が野生型と比べて有意に低かった。またこのＰＰＩの障害は、ＮＲＧ−１１７７−２４６によって完全に回復した（図１８）。このようにニューロプシン−ニューレグリン−１システムの破綻は抑制性伝達の障害を引き起こす（図１９）。
Example 10: Neuropsin gene-deficient animals have impaired inhibitory transmission (1) Objective To examine whether neuropsin is involved in inhibitory transmission, Paired-Pulse-Inhibition in neuropsin gene-deficient mice ( PPI) was evaluated.
(2) Method A bipolar stainless steel electrode was applied to the hippocampus Schaffer-collateral by two successive stimulations at 10 millisecond intervals, and the induced aggregate spike was recorded from the hippocampal pyramidal cells with a glass electrode (FIG. 17). Also, 0.5 nM NRG-1 177-246 was administered to neuropsin gene-deficient mice for 20 minutes.
(3) Results In wild-type mice, PPI in which the second spike was strongly suppressed was observed as a result of GABA transmission, but in neuropsin gene-deficient mice, the effect of PPI was significantly lower than in wild-type mice. It was. This PPI failure was completely recovered by NRG-1 177-246 (FIG. 18). Thus, disruption of the neuropsin-neuregulin-1 system causes impaired inhibitory transmission (FIG. 19).
実施例１１：ニューロプシンによって切断されたニューレグリン−１ペプチドによるＬＴＰの回復は、ＥｒｂＢ４およびＧＡＢＡ Ａ 受容体を介する
（１）目的 組換えニューレグリン−１の切断フラグメントの投与によるＬＴＰ障害の回復がどのようなメカニズムによるものかを調べた。
（２）方法 ニューロプシン遺伝子欠損マウスの海馬スライスを作製し、０．５ｎＭのＮＲＧ−１１７７−２４６とＥｒｂＢ４受容体阻害剤（ＡＧ１４７８）またはＧＡＢＡＡ阻害剤（Ｂｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ）を投与し、双極ステンレス電極で、Ｓｃｈａｆｆｅｒ−ｃｏｌｌａｔｅｒａｌを高頻度に刺激し、ＬＴＰを誘発した。
（３）結果 ニューロプシン遺伝子欠損マウスで見られるＮＲＧ−１１７７−２４６によるＬＴＰの回復効果がＡＧ１４７８で阻害された（図２０）。またＢｉｃｕｃｕｌｌｉｎｅ存在下では、野生型およびニューロプシン遺伝子欠損マウス海馬のＬＴＰに有意な差は見られず、ＮＲＧ−１１７７−２４６はＬＴＰにほとんど影響を与えなかった（図２１）。
Example 11: Recovery of LTP by neuregulin-1 peptide cleaved by neuropsin is mediated by Erb B 4 and GABA A receptors (1) Purpose of LTP damage by administration of a cleaved fragment of recombinant neuregulin-1 We investigated the mechanism of recovery.
(2) Method A hippocampal slice of a neuropsin gene-deficient mouse was prepared, 0.5 nM NRG-1 177-246 and an ErbB4 receptor inhibitor (AG1478) or GABA A inhibitor (Bicculline) were administered, and a bipolar stainless steel electrode Then, Schaffer-collatal was stimulated with high frequency to induce LTP.
(3) Results The recovery effect of LTP by NRG-1 177-246 seen in neuropsin gene-deficient mice was inhibited by AG1478 (FIG. 20). In addition, in the presence of Biculculline, there was no significant difference in LTP between wild-type and neuropsin gene-deficient mouse hippocampus, and NRG-1 177-246 had little effect on LTP (FIG. 21).
Claims (17)
（a）配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるペプチド、
（b）配列番号１−３のいずれかで示されるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、ＥｒｂＢ４受容体に結合するペプチド。 An antibody that binds to the peptide described in (a) or (b) below, or an antibody fragment that specifically recognizes the N-terminal amino acid residue of the peptide, wherein the amino acid sequence of the peptide 3 residues at the N-terminus are GSG, FKW or INK;
(A) a peptide comprising the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOs: 1-3,
(B) A peptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1-3 and binding to the ErbB4 receptor.
被験物質を添加すること；
ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質を添加すること、ここで、ニューレグリン−１部分ペプチドは、SLR、KDR、KER、QKR、KKKおよびELRから選択されるペプチド、または、Ｃ末端の３残基がSLR、KDR、KER、QKR、KKKおよびELRから選択されるニューレグリン−１の部分ペプチドである；及び
蛍光を測定することを含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性を測定する方法。 Coating the support with an anti-neuropsin antibody;
Adding a test substance;
Adding a fluorescent substrate comprising neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide, wherein the neuregulin-1 partial peptide is a peptide selected from SLR, KDR, KER, QKR, KKK and ELR, or Neuropsin activity present in the test substance, including a neuregulin-1 partial peptide in which the C-terminal three residues are selected from SLR, KDR, KER, QKR, KKK and ELR; and measuring fluorescence How to measure.
被験物質を添加すること；
リジルエンドペプチダーゼを添加すること；
ニューレグリン−１またはニューレグリン−１部分ペプチドを含む蛍光基質または発色基質を添加すること、ここで、ニューレグリン−１部分ペプチドは、SLR、KDR、KER、QKR、KKKおよびELRから選択されるペプチド、または、Ｃ末端の３残基がSLR、KDR、KER、QKR、KKKおよびELRから選択されるニューレグリン−１の部分ペプチドである；及び
蛍光または吸光度を測定すること含む、被験物質に存在するニューロプシンの活性を測定する方法。 Coating the support with an anti-neuropsin antibody;
Adding a test substance;
Adding lysyl endopeptidase;
Adding a fluorescent or chromogenic substrate comprising neuregulin-1 or a neuregulin-1 partial peptide, wherein the neuregulin-1 partial peptide is a peptide selected from SLR, KDR, KER, QKR, KKK and ELR Or a C-terminal 3 residue is a partial peptide of neuregulin-1 selected from SLR, KDR, KER, QKR, KKK and ELR; and present in the test substance, including measuring fluorescence or absorbance A method for measuring the activity of neuropsin.
ニューレグリン−１、ニューレグリン−１部分ペプチドまたはそれらを含む蛍光基質または発色基質を含む、腫瘍細胞の浸潤性の判定用キット、ここで、ニューレグリン−１部分ペプチドは、SLR、KDR、KER、QKR、KKKおよびELRから選択されるペプチド、または、Ｃ末端の３残基がSLR、KDR、KER、QKR、KKKおよびELRから選択されるニューレグリン−１の部分ペプチドである。 A kit for determining invasiveness of tumor cells, comprising an anti-neuropsin antibody; and neuregulin-1, a neuregulin-1 partial peptide or a fluorescent substrate or a chromogenic substrate containing the same, wherein the neuregulin-1 partial peptide is A peptide selected from SLR, KDR, KER, QKR, KKK and ELR, or a neuregulin-1 partial peptide in which the C-terminal 3 residues are selected from SLR, KDR, KER, QKR, KKK and ELR .
The kit according to claim 16, wherein the fluorescent substrate is Ac-SLR-MCA, Ac-KDR-MCA, Ac-KER-MCA, Ac-QKR-MCA, Ac-KKK-MCA or Ac-ELR-MCA. .
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| EISSA A. ET AL.: "Kallikrein-related peptidase-8 (KLK8) is an active serine protease in human epidermis and sweat and", J. BIOL. CHEM., vol. Vol. 286, No. 1, JPN6016000059, 7 January 2011 (2011-01-07), pages p. 687-706 * |
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