JP2017131191A - Method for screening agent for preventing and/or treating disease - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、疾患の予防及び／又は治療剤のスクリーニング方法に関する。 The present invention relates to a screening method for a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease.
特許文献１には、肥満細胞を枯渇させることができる化合物を、そのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、自己免疫疾患を治療する方法が記載されている。
しかしながら、自己免疫疾患が発症するメカニズムは未だ十分に解明されておらず、その効果的な予防又は治療方法の開発が望まれている。 However, the mechanism by which autoimmune diseases develop has not been fully elucidated, and the development of effective prevention or treatment methods is desired.
本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、疾患の予防及び／又は治療剤の効果的なスクリーニング方法を提供することをその目的の一つとする。 The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide an effective screening method for preventing and / or treating diseases.
上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る疾患の予防及び／又は治療剤のスクリーニン方法は、下記工程（１）及び（２）を含む：（１）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質を用意する工程；及び（２）前記１以上の物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を、前記有効成分として選択する工程。本発明によれば、疾患の予防及び／又は治療剤の効果的なスクリーニング方法を提供することができる。 A screening method for a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease according to an embodiment of the present invention for solving the above-mentioned problems includes the following steps (1) and (2): (1) c-Abl signaling Providing one or more substances that suppress the system; and (2) selecting one or more substances that suppress the uptake of extracellular macromolecules by cells from the one or more substances as the active ingredient. Process. According to the present invention, an effective screening method for a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease can be provided.
また、前記方法において、前記高分子は、分子量が５ｋＤａ以上、１０００ｋＤａ以下の高分子であることとしてもよい。また、前記方法において、前記高分子は、イムノグロブリン、アミロイド、サイトカイン、トランスフェリン、糖鎖及び脂質からなる群より選択される１以上であることとしてもよい。 In the method, the polymer may be a polymer having a molecular weight of 5 kDa or more and 1000 kDa or less. In the method, the polymer may be one or more selected from the group consisting of immunoglobulin, amyloid, cytokine, transferrin, sugar chain and lipid.
また、前記方法において、前記疾患は、自己免疫疾患又はアレルギーであることとしてもよい。また、この場合、前記自己免疫疾患は、天疱瘡、類天疱瘡、膜性腎症、自己免疫性網膜症、自己免疫性脳炎、重症筋無力症、強皮症、リウマチ及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される疾患であることとしてもよい。また、前記アレルギーは、アレルギー性じんましん、ぜんそく、鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー及びアナフィラキシーからなる群より選択される疾患であることとしてもよい。また、前記方法において、前記高分子は、イムノグロブリンであり、前記疾患は、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患であることとしてもよい。また、前記方法において、前記細胞は、血管内皮細胞であることとしてもよい。 In the method, the disease may be an autoimmune disease or an allergy. Also in this case, the autoimmune disease comprises pemphigus, pemphigoid, membranous nephropathy, autoimmune retinopathy, autoimmune encephalitis, myasthenia gravis, scleroderma, rheumatism and systemic lupus erythematosus It may be a disease selected from the group. The allergy may be a disease selected from the group consisting of allergic urticaria, asthma, rhinitis, conjunctivitis, atopic dermatitis, food allergy and anaphylaxis. In the method, the macromolecule is an immunoglobulin, and the disease may be a disease accompanied by transfer of an antibody via a vascular endothelial cell from a blood vessel to a tissue surrounding the blood vessel. In the method, the cell may be a vascular endothelial cell.
また、前記方法において、前記工程（２）において下記工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい：（２ａ）前記１以上の物質の各々について、前記物質の存在下及び不存在下のそれぞれで、細胞外の前記高分子の前記細胞による取り込み量を評価する工程；及び（２ｂ）前記１以上の物質の各々について、前記物質の存在下における前記取り込み量が、前記物質の不存在下における前記取り込み量より小さい場合に、前記物質を、前記有効成分として選択する工程。 In the method, the following steps (2a) and (2b) may be performed in the step (2): (2a) For each of the one or more substances, in the presence and absence of the substance. And (2b) for each of the one or more substances, the amount of uptake in the presence of the substance is equal to the absence of the substance. Selecting the substance as the active ingredient when below the uptake.
また、前記方法において、前記工程（２）において下記工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい：（２ａ）前記１以上の物質の各々について、前記物質を投与された非ヒト動物及び前記物質を投与されていない非ヒト動物のそれぞれで、血液中の前記高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価する工程；及び（２ｂ）前記１以上の物質の各々について、前記物質を投与された前記非ヒト動物における前記移行量が、前記物質を投与されていない前記非ヒト動物における前記移行量より小さい場合に、前記物質を、前記有効成分として選択する工程。 In the method, the following steps (2a) and (2b) may be carried out in the step (2): (2a) A non-human animal to which the substance is administered for each of the one or more substances And, in each of the non-human animals that have not been administered the substance, evaluating the amount of the macromolecule transferred to the perivascular tissue via the vascular endothelial cells; and (2b) of the one or more substances For each, the step of selecting the substance as the active ingredient when the transfer amount in the non-human animal that has been administered the substance is smaller than the transfer amount in the non-human animal that has not been administered the substance .
本発明によれば、疾患の予防及び／又は治療剤の効果的なスクリーニング方法を提供することができる。 According to the present invention, an effective screening method for a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease can be provided.
以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は本実施形態に限られるものではない。 Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described. Note that the present invention is not limited to the present embodiment.
本実施形態に係る疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法（以下、「本方法」という。）は、下記工程（１）及び（２）を含む：（１）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質を用意する工程；及び（２）当該１以上の物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を、前記有効成分として選択する工程。 A screening method for an active ingredient of a preventive and / or therapeutic agent for diseases according to this embodiment (hereinafter referred to as “the present method”) includes the following steps (1) and (2): (1) of c-Abl A step of preparing one or more substances that suppress a signal transduction system; and (2) one or more substances that suppress the uptake of extracellular macromolecules by cells from the one or more substances as the active ingredient Process to select.
すなわち、本方法の工程（１）では、まず、ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質（以下、「ｃ−Ａｂｌ抑制物質」という。）を用意する。本実施形態において、「ｃ−Ａｂｌ」は、チロシンキナーゼ活性を有するｃ−Ａｂｌタンパク質である。また、「ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系」は、ｃ−Ａｂｌを発現している細胞において、ｃ−Ａｂｌが関与するシグナル伝達系である。そして、ｃ−Ａｂｌ抑制物質は、ｃ−Ａｂｌ発現細胞において、ｃ−Ａｂｌが関与するシグナル伝達系を抑制する物質である。 That is, in step (1) of this method, first, one or more substances that suppress the c-Abl signal transduction system (hereinafter referred to as “c-Abl inhibitory substances”) are prepared. In this embodiment, “c-Abl” is a c-Abl protein having tyrosine kinase activity. The “c-Abl signal transduction system” is a signal transduction system involving c-Abl in cells expressing c-Abl. The c-Abl inhibitor is a substance that suppresses a signal transduction system involving c-Abl in c-Abl-expressing cells.
具体的に、工程（１）は、例えば、下記（ｉ）〜（ｖ）からなる群より選択される１以上の物質をｃ−Ａｂｌ抑制物質として用意する：（ｉ）ｃ−Ａｂｌとの相互作用によりｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害する物質；、（ｉｉ）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達に関与する、ｃ−Ａｂｌ以外のタンパク質の酵素活性を阻害する物質；、（ｉｉｉ）ｃ−Ａｂｌの遺伝子発現、又はｃ−Ａｂｌのシグナル伝達に関与する、ｃ−Ａｂｌ以外のタンパク質の遺伝子発現を阻害する物質；、（ｉｖ）ｃ−Ａｂｌとｃ−Ａｂｌ受容体との相互作用を阻害する物質；及び（ｖ）ｃ−Ａｂｌ受容体を含む複合体の形成を阻害する物質。 Specifically, in the step (1), for example, one or more substances selected from the group consisting of the following (i) to (v) are prepared as c-Abl suppressing substances: (i) Mutual interaction with c-Abl A substance that inhibits the tyrosine kinase activity of c-Abl by action; (ii) a substance that inhibits the enzyme activity of a protein other than c-Abl involved in c-Abl signaling; (iii) c-Abl A substance that inhibits gene expression of a protein other than c-Abl involved in gene expression or c-Abl signaling; (iv) a substance that inhibits the interaction between c-Abl and c-Abl receptor; And (v) a substance that inhibits formation of a complex comprising a c-Abl receptor.
なお、上記（ｉ）におけるｃ−Ａｂｌとの相互作用は、例えば、ｃ−Ａｂｌとの結合であることとしてもよい。また、上記（ｉｉ）におけるｃ−Ａｂｌのシグナル伝達に関与するタンパク質は、例えば、ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系の上流又は下流に存在し、当該ｃ−Ａｂｌの活性化に関与するシグナル伝達タンパク質であることとしてもよい。また、上記（ｉｉ）におけるタンパク質の酵素活性の阻害は、例えば、当該タンパク質との相互作用による阻害であることとしてもよく、当該タンパク質との結合による阻害であることとしてもよい。また、上記（ｉｉｉ）における遺伝子発現の阻害は、例えば、当該遺伝子のプロモーター領域への転写抑制因子及び／又は転写活性化因子の結合抑制による阻害であることとしてもよい。また、上記（ｉｖ）におけるｃ−Ａｂｌとｃ−Ａｂｌ受容体との相互作用の阻害は、例えば、当該ｃ−Ａｂｌ及び／又はｃ−Ａｂｌ受容体との結合による阻害であることとしてもよい。また、上記（ｖ）におけるｃ−Ａｂｌ受容体を含む複合体は、例えば、当該ｃ−Ａｂｌ受容体と、そのリガンド分子とを含む複合体であることとしてもよい。また、上記（ｖ）における複合体の形成の阻害は、例えば、ｃ−Ａｂｌ受容体及び／又は当該複合体を形成するｃ−Ａｂｌ受容体以外の物質との相互作用による阻害であることとしてもよく、ｃ−Ａｂｌ受容体及び／又は当該複合体を形成するｃ−Ａｂｌ受容体以外の物質との結合による阻害であることとしてもよい。 In addition, the interaction with c-Abl in the above (i) may be, for example, a bond with c-Abl. The protein involved in c-Abl signal transduction in (ii) above is, for example, a signal transduction protein that exists upstream or downstream of the c-Abl signal transduction system and is involved in the activation of c-Abl. It may be there. In addition, the inhibition of the enzyme activity of the protein in (ii) above may be, for example, inhibition by interaction with the protein or inhibition by binding to the protein. In addition, the inhibition of gene expression in (iii) above may be, for example, inhibition by suppressing the binding of a transcriptional repressing factor and / or a transcriptional activator to the promoter region of the gene. The inhibition of the interaction between c-Abl and c-Abl receptor in (iv) above may be, for example, inhibition by binding to the c-Abl and / or c-Abl receptor. In addition, the complex containing the c-Abl receptor in (v) above may be, for example, a complex containing the c-Abl receptor and its ligand molecule. In addition, the inhibition of the formation of the complex in the above (v) may be, for example, an inhibition by an interaction with a substance other than the c-Abl receptor and / or the c-Abl receptor forming the complex. The inhibition may be due to binding with a substance other than the c-Abl receptor and / or the c-Abl receptor forming the complex.
工程（１）においては、既にｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制することが知られている物質を、ｃ−Ａｂｌ抑制物質として用意することとしてもよい。また、工程（１）においては、ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を阻害することは知られていない物質が、ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を阻害するか否かを評価し、その結果、当該物質がｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を阻害することが新たに確認された場合に、当該物質を、ｃ−Ａｂｌ抑制物質として用意することとしてもよい。また、工程（１）においては、複数の物質の中から、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質を選択することにより、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質を用意することとしてもよい。 In step (1), a substance that is already known to suppress the c-Abl signal transduction system may be prepared as a c-Abl inhibitory substance. In the step (1), it is evaluated whether a substance that is not known to inhibit the c-Abl signal transduction system inhibits the c-Abl signal transduction system. Is newly confirmed to inhibit the c-Abl signal transduction system, the substance may be prepared as a c-Abl inhibitory substance. In step (1), one or more c-Abl inhibitory substances may be prepared by selecting one or more c-Abl inhibitory substances from a plurality of substances.
次に、本方法の工程（２）においては、上記工程（１）で用意された１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を選択する。なお、工程（２）における高分子の細胞による取り込みは、例えば、当該細胞のエンドサイトーシス及び／又はトランスサイトーシスによる当該高分子の取り込みであることとしてもよい。 Next, in step (2) of the present method, one or more substances that suppress the uptake of extracellular macromolecules from cells among the one or more c-Abl inhibitors prepared in step (1) above. Select. The macromolecular uptake in the step (2) may be, for example, the macromolecular uptake by endocytosis and / or transcytosis of the cell.
高分子は、疾患に関与する高分子であって、細胞により、その細胞内に取り込まれ得るものであれば特に限られない。高分子は、例えば、分子量が５ｋＤａ以上、１０００ｋＤａ以下の高分子であることとしてもよい。具体的に、高分子は、例えば、イムノグロブリン、アミロイド、サイトカイン、トランスフェリン、糖鎖及び脂質からなる群より選択される１以上であってもよい。また、高分子は、例えば、蛍光色素、ラジオアイソトープ（ＲＩ）、非蛍光色素、又は酵素で標識された高分子であることとしてもよい。 The polymer is not particularly limited as long as it is a polymer involved in a disease and can be taken into cells by cells. The polymer may be, for example, a polymer having a molecular weight of 5 kDa or more and 1000 kDa or less. Specifically, the polymer may be one or more selected from the group consisting of immunoglobulin, amyloid, cytokine, transferrin, sugar chain and lipid, for example. The polymer may be, for example, a fluorescent dye, a radioisotope (RI), a non-fluorescent dye, or a polymer labeled with an enzyme.
細胞は、上記高分子を取り込み得る細胞であれば特に限られない。細胞は、動物の細胞であることが好ましく、哺乳類の細胞であることが特に好ましい。具体的に、上記細胞は、ヒト、サル、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモットからなる群より選択されるげっ歯類）、ウサギ、イヌ及びブタからなる群より選択される哺乳類の細胞であることとしてもよく、ヒト、サル及びげっ歯類からなる群より選択される哺乳類の細胞であることが好ましく、ヒトの細胞であることが特に好ましい。 The cell is not particularly limited as long as the cell can take up the polymer. The cell is preferably an animal cell, particularly preferably a mammalian cell. Specifically, the cells are humans, monkeys, rodents (eg, rodents selected from the group consisting of mice, rats, hamsters and guinea pigs), mammals selected from the group consisting of rabbits, dogs and pigs. Preferably, the cells are mammalian cells selected from the group consisting of humans, monkeys and rodents, and particularly preferably human cells.
細胞は、初代細胞であってもよいし、株化細胞であってもよい。細胞は、体細胞であってもよいし、幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞及び間葉系幹細胞からなる群より選択される）であってもよいし、当該幹細胞から誘導された分化細胞であってもよい。 The cell may be a primary cell or a cell line. The cells may be somatic cells, stem cells (eg, selected from the group consisting of iPS cells, ES cells, and mesenchymal stem cells), or differentiated cells derived from the stem cells. There may be.
細胞が体細胞、又は幹細胞から誘導された分化細胞である場合、当該細胞は、例えば、血管内皮細胞であることが好ましい。血管内皮細胞は、血管に由来する細胞であれば特に限られないが、例えば、臍帯静脈、皮膚組織内血管、脳微小血管、網膜微小血管及び腎血管からなる群より選択される血管に由来する細胞であることが好ましい。 When the cell is a somatic cell or a differentiated cell derived from a stem cell, the cell is preferably, for example, a vascular endothelial cell. The vascular endothelial cell is not particularly limited as long as it is a cell derived from a blood vessel. A cell is preferred.
工程（２）において、ｃ−Ａｂｌ抑制物質が、高分子の細胞による取り込みを抑制するか否かを評価する方法は、特に限られず、例えば、当該高分子の当該細胞による取り込みを直接的に評価する方法であってもよいし、間接的に評価する方法であってもよい。 In the step (2), the method for evaluating whether the c-Abl inhibitor suppresses the uptake of the polymer by the cell is not particularly limited. For example, the uptake of the polymer by the cell is directly evaluated. Or a method of indirectly evaluating.
すなわち、工程（２）においては、例えば、次の工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい：（２ａ）工程（１）で用意された１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質の各々について、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下及び不存在下のそれぞれで、細胞外の高分子の細胞による取り込み量を評価する工程；及び（２ｂ）当該１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質の各々について、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下における当該取り込み量が、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下における当該取り込み量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する工程。この場合、本方法は、上記工程（１）及び（２）に代えて、上記工程（１）、（２ａ）及び（２ｂ）を含むこととしてもよい。 That is, in step (2), for example, the following steps (2a) and (2b) may be performed: (2a) Each of one or more c-Abl inhibitors prepared in step (1) And (2b) for each of the one or more c-Abl inhibitors, in the presence and absence of the c-Abl inhibitor, respectively, in the presence and absence of the c-Abl inhibitor When the uptake amount in the presence of the c-Abl inhibitory substance is smaller than the uptake amount in the absence of the c-Abl inhibitory substance, the c-Abl inhibitory substance is treated as a disease prevention and / or treatment. Selecting as an active ingredient of the agent. In this case, the method may include the steps (1), (2a) and (2b) instead of the steps (1) and (2).
より具体的に、例えば、工程（２ａ）においては、ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下及び不存在下のそれぞれで、培養液中の高分子の培養細胞による取り込み量を評価することとしてもよい。すなわち、この場合、工程（２ａ）では、細胞、ｃ−Ａｂｌ抑制物質及び高分子を含む培養液中（当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下）における当該高分子の当該細胞による取り込み量を評価するとともに、当該細胞及び当該高分子を含み当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を含まない培養中（当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下）における当該高分子の当該細胞による取り込み量を評価する。培養細胞は、上述のとおり特に限られないが、培養血管内皮細胞であることが好ましい。 More specifically, for example, in step (2a), the amount of macromolecules taken up by cultured cells in the culture solution may be evaluated in the presence and absence of the c-Abl inhibitory substance. That is, in this case, in step (2a), the amount of the macromolecule taken up by the cell in the culture solution containing the cell, the c-Abl inhibitory substance and the polymer (in the presence of the c-Abl inhibitory substance) is evaluated. At the same time, the amount of the macromolecule taken up by the cell in the culture containing the cell and the macromolecule but not the c-Abl inhibitor (in the absence of the c-Abl inhibitor) is evaluated. The cultured cells are not particularly limited as described above, but are preferably cultured vascular endothelial cells.
また、例えば、工程（２ａ）においては、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物及び当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物のそれぞれで、体液中の高分子の細胞による取り込み量を評価することとしてもよい。 In addition, for example, in the step (2a), in each of a non-human animal administered with a c-Abl inhibitory substance and a non-human animal not administered with the c-Abl inhibitory substance, it depends on the macromolecular cells in the body fluid. The amount of uptake may be evaluated.
すなわち、この場合、工程（２ａ）では、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物（当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下）における、体液中の高分子の細胞による取り込み量を評価するとともに、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物（当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下）における、当該体液中の当該高分子の当該細胞による取り込み量を評価する。 That is, in this case, in the step (2a), in addition to evaluating the amount of macromolecular uptake in the body fluid in the non-human animal (in the presence of the c-Abl inhibitor) administered with the c-Abl inhibitor. The amount of uptake of the polymer in the body fluid by the cells in a non-human animal that has not been administered the c-Abl inhibitor (in the presence of the c-Abl inhibitor) is evaluated.
体液は、上述した高分子を含むものであれば、特に限られず、例えば、血液又は組織間質液であることとしてもよい。細胞は、上述のとおり特に限られないが、血管内皮細胞であることが好ましい。すなわち、例えば、上記体液が血液である場合、上記細胞は血管内皮細胞であることが好ましい。非ヒト動物は、ヒト以外の哺乳類であれば特に限られず、例えば、サル、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター及びモルモットからなる群より選択されるげっ歯類）、ウサギ、イヌ及びブタからなる群より選択される哺乳類であることとしてもよく、げっ歯類であることが特に好ましい。 The body fluid is not particularly limited as long as it contains the above-described polymer, and may be, for example, blood or tissue interstitial fluid. The cells are not particularly limited as described above, but are preferably vascular endothelial cells. That is, for example, when the body fluid is blood, the cells are preferably vascular endothelial cells. The non-human animal is not particularly limited as long as it is a mammal other than a human. For example, monkeys, rodents (for example, rodents selected from the group consisting of mice, rats, hamsters, and guinea pigs), rabbits, dogs, and pigs It may be a mammal selected from the group consisting of and is particularly preferably a rodent.
工程（２ａ）において高分子の細胞による取り込み量を評価する方法は、工程（２ｂ）においてｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下での当該取り込み量と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下での当該取り込み量とを比較できる方法であれば特に限られないが、フローサイトメトリーにより当該取り込み量を評価することが好ましい。 In the step (2a), the method for evaluating the amount of macromolecular uptake by the cells is the step of (2b) in the presence of the c-Abl inhibitory substance and in the absence of the c-Abl inhibitory substance. The method is not particularly limited as long as it is a method capable of comparing the uptake amount, but it is preferable to evaluate the uptake amount by flow cytometry.
すなわち、この場合、蛍光色素で標識された高分子を細胞に取り込ませ、又は細胞に取り込まれた高分子を蛍光色素で標識し、当該細胞に取り込まれた高分子の蛍光色素に由来する蛍光量をフローサイトメトリーで定量することにより、当該高分子の当該細胞による取り込み量を評価する。 That is, in this case, a polymer labeled with a fluorescent dye is taken into a cell, or a polymer taken into a cell is labeled with a fluorescent dye, and the amount of fluorescence derived from the polymer fluorescent dye taken into the cell Is quantified by flow cytometry to evaluate the uptake of the polymer by the cells.
なお、工程（２ａ）においては、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）、非蛍光色素、又は酵素で標識された高分子を使用し、当該ＲＩに由来する放射線量、当該非蛍光色素に由来する染色量、又は当該酵素と基質との化学反応生成物に由来する蛍光量又は染色量に基づき、当該高分子の細胞による取り込み量を評価することとしてもよい。 In step (2a), for example, a radioisotope (RI), a non-fluorescent dye, or a polymer labeled with an enzyme is used, and the radiation dose derived from the RI, the staining amount derived from the non-fluorescent dye. Alternatively, the amount of the polymer taken up by the cells may be evaluated based on the amount of fluorescence or staining derived from the chemical reaction product of the enzyme and the substrate.
そして、工程（２ｂ）においては、ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下における第一の取り込み量と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下における第二の取り込み量とを比較し、当該第一の取り込み量が当該第二の取り込み量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。 In step (2b), the first uptake amount in the presence of the c-Abl inhibitory substance is compared with the second uptake amount in the absence of the c-Abl inhibitory substance, When the uptake amount is smaller than the second uptake amount, the c-Abl inhibitory substance is selected as an active ingredient of a disease prevention and / or treatment agent.
すなわち、例えば、高分子の細胞による取り込み量をフローサイトメトリーで評価する場合、ｃ−Ａｂｌ抑制物質の存在下における取り込み量に対応して測定される第一の蛍光量（例えば、第一の平均蛍光強度）と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質の不存在下における取り込み量に対応して測定される第二の蛍光量（例えば、第二の平均蛍光強度）とを比較し、当該第一の蛍光量が当該第二の蛍光量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。 That is, for example, when the amount of macromolecular uptake by cells is evaluated by flow cytometry, the first fluorescence amount (for example, the first average amount) measured corresponding to the amount of uptake in the presence of the c-Abl inhibitory substance. Fluorescence intensity) and a second fluorescence amount (for example, second average fluorescence intensity) measured corresponding to the amount of uptake in the absence of the c-Abl inhibitor, and the first fluorescence When the amount is smaller than the second fluorescence amount, the c-Abl inhibitory substance is selected as an active ingredient of a disease prevention and / or treatment agent.
また、工程（２）においては、例えば、次の工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい：（２ａ）工程（１）で用意された１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質の各々について、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物及び当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物のそれぞれで、血液中の高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価する工程；及び（２ｂ）当該１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質の各々について、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された当該非ヒト動物における当該移行量が、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない当該非ヒト動物における当該移行量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する工程。この場合、本方法は、上記工程（１）及び（２）に代えて、上記工程（１）、（２ａ）及び（２ｂ）を含むこととしてもよい。 In step (2), for example, the following steps (2a) and (2b) may be performed: (2a) Each of one or more c-Abl inhibitors prepared in step (1) In each of a non-human animal administered with the c-Abl inhibitory substance and a non-human animal not administered with the c-Abl inhibitory substance, to the perivascular tissue via the vascular endothelial cells of macromolecules in blood And (2b) for each of the one or more c-Abl inhibitors, the amount of migration in the non-human animal administered with the c-Abl inhibitor is the c-Abl inhibitor. A step of selecting the c-Abl inhibitory substance as an active ingredient of a disease preventive and / or therapeutic agent when the amount is smaller than the transferred amount in the non-human animal not administered with the substance. In this case, the method may include the steps (1), (2a) and (2b) instead of the steps (1) and (2).
すなわち、まず工程（２ａ）では、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物における、血液中の高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価するとともに、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物における、血液中の当該高分子の血管内皮細胞を介した当該血管周囲組織への移行量を評価する。 That is, first, in the step (2a), in the non-human animal administered with the c-Abl inhibitory substance, the amount of macromolecules in blood passing through the vascular endothelial cells to the tissue surrounding the blood vessel is evaluated, and the c- In a non-human animal that has not been administered an Abl inhibitory substance, the amount of the macromolecule in the blood transferred to the tissue surrounding the blood vessel via vascular endothelial cells is evaluated.
具体的に、工程（２ａ）では、例えば、非ヒト動物の血管内の血液中から、当該血管の内壁を構成する当該血管内皮細胞を介して、当該血管の周囲の組織に移行した当該高分子の量を評価する。この場合、非ヒト動物の血管内の血液中から、当該血管の周囲の組織に含まれる細胞に移行した高分子の量を評価することとしてもよい。 Specifically, in the step (2a), for example, the polymer transferred from the blood in the blood vessel of the non-human animal to the tissue around the blood vessel via the blood vessel endothelial cells constituting the inner wall of the blood vessel. Evaluate the amount of. In this case, the amount of the macromolecule transferred from the blood in the blood vessel of the non-human animal to the cells contained in the tissue surrounding the blood vessel may be evaluated.
血管周囲組織は、血管を含む組織であれば特に限られず、例えば、皮膚、脳、眼、腎臓、筋肉、関節及び甲状腺からなる群より選択される１以上の血管周囲組織であることとしてもよく、皮膚の血管周囲組織であることが好ましい。 The perivascular tissue is not particularly limited as long as it includes a blood vessel, and may be, for example, one or more perivascular tissues selected from the group consisting of skin, brain, eye, kidney, muscle, joint, and thyroid gland. Preferably, it is the perivascular tissue of the skin.
すなわち、例えば、工程（２ａ）では、非ヒト動物の皮膚の血管内の血液中から、当該血管の内壁を構成する血管内皮細胞を介して、当該血管の周囲の組織（例えば、当該皮膚の表皮組織及び／又は真皮組織）に移行した当該高分子の量を評価することとしてもよい。この場合、例えば、非ヒト動物の皮膚の血管内の血液中から、当該血管の周囲の組織に含まれる細胞（例えば、当該皮膚の表皮細胞及び／又は真皮細胞）に移行した高分子の量を評価することとしてもよい。 That is, for example, in the step (2a), a tissue surrounding the blood vessel (for example, the epidermis of the skin) is obtained from the blood in the blood vessel of the skin of the non-human animal via the vascular endothelial cells constituting the inner wall of the blood vessel. It is good also as evaluating the quantity of the said polymer | macromolecule which transferred to the structure | tissue and / or dermal tissue. In this case, for example, the amount of macromolecule transferred from the blood in the blood vessel of the skin of the non-human animal to the cells (for example, epidermal cells and / or dermal cells of the skin) contained in the tissue surrounding the blood vessel. It may be evaluated.
また、工程（２ａ）においては、恒常的条件（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で非ヒト動物おける血液中の高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することとしてもよい。この場合、高分子としては、非病原性の高分子（例えば、非病原性のイムノグロブリン）を使用することが好ましい。 Further, in the step (2a), the amount of macromolecules in the blood in the non-human animal transferred to the tissue surrounding the blood vessel through the vascular endothelial cells may be evaluated under a homeostatic condition. In this case, it is preferable to use a non-pathogenic polymer (for example, a non-pathogenic immunoglobulin) as the polymer.
工程（２ａ）において高分子の移行量を評価する方法は、工程（２ｂ）においてｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物での当該移行量と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物での当該移行量とを比較できる方法であれば特に限られないが、フローサイトメトリーにより当該移行量を評価することが好ましい。 In the method of evaluating the amount of migration of the polymer in the step (2a), the amount of migration in the non-human animal administered with the c-Abl inhibitory substance in the step (2b) and the c-Abl inhibitory substance are administered. The transfer amount is not particularly limited as long as it can be compared with the transfer amount in a non-human animal, but it is preferable to evaluate the transfer amount by flow cytometry.
すなわち、この場合、蛍光色素で標識された高分子を非ヒト動物に投与し、又は血管周囲組織から採取された細胞に移行した高分子を蛍光色素で標識し、当該細胞に移行した高分子の蛍光色素に由来する蛍光量をフローサイトメトリーで定量することにより、当該高分子の当該細胞への移行量を評価する。 That is, in this case, a polymer labeled with a fluorescent dye is administered to a non-human animal, or a polymer transferred to a cell collected from a tissue surrounding a blood vessel is labeled with a fluorescent dye, and the polymer transferred to the cell The amount of the macromolecule transferred to the cells is evaluated by quantifying the amount of fluorescence derived from the fluorescent dye by flow cytometry.
なお、工程（２ａ）においては、例えば、ラジオアイソトープ（ＲＩ）、非蛍光色素、又は酵素で標識された高分子を非ヒト動物に投与し、当該ＲＩに由来する放射線量、当該非蛍光色素に由来する染色量、又は当該酵素と基質との化学反応生成物に由来する蛍光量又は染色量に基づき、血管周囲組織中の細胞への当該高分子の移行量を評価することとしてもよい。 In the step (2a), for example, a radioisotope (RI), a non-fluorescent dye, or a polymer labeled with an enzyme is administered to a non-human animal, and the radiation dose derived from the RI is applied to the non-fluorescent dye. Based on the amount of staining derived or the amount of fluorescence or staining derived from the chemical reaction product of the enzyme and the substrate, the amount of transfer of the polymer to cells in the tissue surrounding the blood vessel may be evaluated.
そして、工程（２ｂ）においては、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物における第一の移行量と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物における第二の移行量とを比較し、当該第一の移行量が当該第二の移行量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。 In the step (2b), the first transfer amount in the non-human animal administered with the c-Abl inhibitory substance, and the second transfer amount in the non-human animal not administered with the c-Abl inhibitory substance, When the first transfer amount is smaller than the second transfer amount, the c-Abl inhibitory substance is selected as an active ingredient of a disease prevention and / or treatment agent.
すなわち、例えば、血管周囲組織中の細胞への高分子の移行量をフローサイトメトリーで評価する場合、ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与された非ヒト動物における移行量に対応して測定される第一の蛍光量（例えば、第一の平均蛍光強度）と、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を投与されていない非ヒト動物における移行量に対応して測定される第二の蛍光量（例えば、第二の平均蛍光強度）とを比較し、当該第一の蛍光量が当該第二の蛍光量より小さい場合に、当該ｃ−Ａｂｌ抑制物質を、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。 That is, for example, when evaluating the amount of macromolecule transferred to cells in the tissue surrounding the blood vessel by flow cytometry, the first measured in accordance with the amount transferred in the non-human animal administered with the c-Abl inhibitory substance. Fluorescence amount (for example, the first average fluorescence intensity) and the second fluorescence amount (for example, the second fluorescence amount) measured in response to the amount transferred in the non-human animal not administered with the c-Abl inhibitor. When the first fluorescence amount is smaller than the second fluorescence amount, the c-Abl inhibitory substance is selected as an active ingredient of a disease prevention and / or treatment agent.
なお、血管内の血液中の高分子の血管周囲組織への移行が、まず当該血液中の高分子が当該血管の内壁を構成する血管内皮細胞の細胞内に取り込まれ、次いで、当該高分子が当該血管内皮細胞から当該血管周囲組織へ放出されることにより起こる場合（すなわち、当該血管内皮細胞のトランスサイトーシスによって当該高分子が当該血液中から当該血管周囲組織へ移行する場合）、当該血液中の高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することで、当該高分子の当該血管内皮細胞による取り込みを間接的に評価することとなる。 In addition, the transition of the macromolecule in the blood in the blood vessel to the tissue surrounding the blood vessel first takes in the macromolecule in the blood into the cells of the vascular endothelial cells constituting the inner wall of the blood vessel, When it occurs by being released from the vascular endothelial cell to the perivascular tissue (that is, when the polymer is transferred from the blood to the perivascular tissue by transcytosis of the vascular endothelial cell), in the blood By evaluating the amount of the polymer transferred to the tissue surrounding the blood vessel via the vascular endothelial cells, the uptake of the polymer by the vascular endothelial cells is indirectly evaluated.
本方法によれば、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を効果的にスクリーニングすることができる。本方法に係る疾患は、細胞外の高分子の細胞による取り込みが関与する疾患であれば特に限られない。 According to this method, the active ingredient of the preventive and / or therapeutic agent for diseases can be effectively screened. The disease according to this method is not particularly limited as long as it is a disease involving uptake of extracellular macromolecules by cells.
すなわち、本方法に係る疾患は、自己免疫疾患又はアレルギーであることとしてもよい。本方法に係る自己免疫疾患は、特に限られないが、例えば、天疱瘡、類天疱瘡、膜性腎症、自己免疫性網膜症、自己免疫性脳炎、重症筋無力症、強皮症、リウマチ及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される疾患であることとしてもよい。また、本方法に係るアレルギーは、特に限られないが、例えば、アレルギー性じんましん、ぜんそく、鼻炎、結膜炎、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー及びアナフィラキシーからなる群より選択される疾患であることとしてもよい。 That is, the disease according to the present method may be an autoimmune disease or an allergy. The autoimmune disease according to this method is not particularly limited, but for example, pemphigus, pemphigoid, membranous nephropathy, autoimmune retinopathy, autoimmune encephalitis, myasthenia gravis, scleroderma, rheumatism And a disease selected from the group consisting of systemic lupus erythematosus. In addition, the allergy according to this method is not particularly limited, and may be, for example, a disease selected from the group consisting of allergic urticaria, asthma, rhinitis, conjunctivitis, atopic dermatitis, food allergy and anaphylaxis. .
また、本方法に係る疾患に関与する高分子はイムノグロブリンであり、当該疾患は、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患であることとしてもよい。 In addition, the macromolecule involved in the disease according to the present method is immunoglobulin, and the disease may be a disease accompanied by the transfer of an antibody via a vascular endothelial cell from a blood vessel to a tissue surrounding the blood vessel.
この場合、本方法は、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法であって、工程（２）において、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、細胞外のイムノグロブリンの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込みを抑制する１以上の物質を、当該有効成分として選択する。 In this case, the present method is a screening method for an active ingredient of a preventive and / or therapeutic agent for a disease involving transfer of an antibody via vascular endothelial cells from a blood vessel to a tissue surrounding the blood vessel, and in step (2), Among the one or more c-Abl inhibitory substances, one or more substances that suppress the uptake of extracellular immunoglobulin by cells (preferably vascular endothelial cells) are selected as the active ingredient.
具体的に、工程（２）においては、上述した工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい。すなわち、上述した工程（２ａ）において、細胞外のイムノグロブリンの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込み量を評価することとしてもよいし、血液中のイムノグロブリンの血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することとしてもよい。 Specifically, in the step (2), the steps (2a) and (2b) described above may be performed. That is, in the above-described step (2a), the amount of extracellular immunoglobulin taken up by cells (preferably vascular endothelial cells) may be evaluated, or the surrounding blood vessels of blood immunoglobulin through vascular endothelial cells It is good also as evaluating the transfer amount to an organization.
血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患は、例えば、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う自己免疫疾患又はアレルギーであることとしてもよく、自己抗体介在疾患（自己抗体の過剰な産生に関連して発症する疾患）であることとしてもよい。 The disease involving the transfer of antibodies through vascular endothelial cells from the blood vessel to the perivascular tissue is, for example, an autoimmune disease or allergy involving the transfer of antibodies through the vascular endothelial cells from the blood vessel to the perivascular tissue. Alternatively, it may be an autoantibody-mediated disease (a disease that develops in connection with excessive production of autoantibodies).
この場合、本方法は、自己免疫疾患又はアレルギーの予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法であって、工程（２）において、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、細胞外のイムノグロブリンの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込みを抑制する１以上の物質を、当該有効成分として選択することとしてもよい。 In this case, the present method is a screening method for an active ingredient of an agent for preventing and / or treating autoimmune diseases or allergies, and in step (2), an extracellular substance is selected from one or more c-Abl inhibitors. One or more substances that suppress the uptake of immunoglobulin by cells (preferably vascular endothelial cells) may be selected as the active ingredient.
すなわち、例えば、工程（２）において、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡからなる群より選択される１以上の細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込みを抑制する１以上の物質を、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。また、例えば、工程（２）において、１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質のうちから、ＩｇＥ及び／又はＩｇＧの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込みを抑制する１以上の物質を、アレルギーの予防及び／又は治療剤の有効成分として選択する。 That is, for example, in step (2), uptake by one or more cells (preferably vascular endothelial cells) selected from the group consisting of IgG, IgM and IgA among one or more c-Abl inhibitors is suppressed. One or more substances are selected as active ingredients of the preventive and / or therapeutic agent for autoimmune diseases. In addition, for example, in step (2), one or more substances that suppress the uptake of IgE and / or IgG by cells (preferably vascular endothelial cells) out of one or more c-Abl inhibitors are used to prevent allergy. And / or selected as an active ingredient of a therapeutic agent.
具体的に、工程（２）においては、上述した工程（２ａ）及び（２ｂ）を実施することとしてもよい。すなわち、本方法が自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法である場合、上述した工程（２ａ）において、細胞外のＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡからなる群より選択される１以上の細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込み量を評価することとしてもよいし、血液中のＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡからなる群より選択される１以上の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することとしてもよい。また、本方法がアレルギーの予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法である場合、上述した工程（２ａ）において、細胞外のＩｇＥ及び／又はＩｇＧの細胞（好ましくは血管内皮細胞）による取り込み量を評価することとしてもよいし、血液中のＩｇＥ及び／又はＩｇＧの血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価することとしてもよい。 Specifically, in the step (2), the steps (2a) and (2b) described above may be performed. That is, when this method is a method for screening an active ingredient of a prophylactic and / or therapeutic agent for autoimmune diseases, in the above-described step (2a), one or more selected from the group consisting of extracellular IgG, IgM and IgA It is good also as evaluating the uptake | capture amount by the cell (preferably vascular endothelial cell), and to the perivascular tissue via one or more vascular endothelial cells selected from the group which consists of IgG, IgM, and IgA in blood. It is good also as evaluating migration amount. In addition, when this method is a method for screening an active ingredient of an agent for preventing and / or treating allergies, extracellular IgE and / or IgG uptake by cells (preferably vascular endothelial cells) in the step (2a) described above. The amount may be evaluated, or the amount of IgE and / or IgG in the blood transferred to the perivascular tissue via vascular endothelial cells may be evaluated.
また、本方法に係る疾患に関与する高分子はアミロイドであり、当該疾患は、アミロイドーシスであることとしてもよい。また、本方法に係る疾患に関与する高分子はサイトカイン、糖鎖及び脂質からなる群より選択される１以上であり、当該疾患は、動脈硬化症であることとしてもよい。また、本方法に係る疾患に関与する高分子は脂質であり、当該疾患は、脂質異常症であることとしてもよい。 In addition, the polymer involved in the disease according to the present method is amyloid, and the disease may be amyloidosis. Moreover, the polymer involved in the disease according to the present method is one or more selected from the group consisting of cytokines, sugar chains and lipids, and the disease may be arteriosclerosis. In addition, the polymer involved in the disease according to the present method is a lipid, and the disease may be dyslipidemia.
本方法は、疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分のスクリーニング方法であるが、例えば、当該疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の候補物質のスクリーニング方法であることとしてもよい。また、本方法は、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する物質のスクリーニング方法であることとしてもよい。この場合、本方法は、細胞外のイムノグロブリンの血管内皮細胞による取り込みを抑制する物質のスクリーニング方法であることとしてもよいし、血液中のイムノグロブリンの血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行を抑制する物質のスクリーニング方法であることとしてもよいし、血管内の血液中から、当該血管の周囲の組織に含まれる細胞へのイムノグロブリンの移行を抑制する物質のスクリーニング方法であることとしてもよい。 This method is a method for screening an active ingredient of a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease, and may be a method for screening a candidate substance for an active ingredient of a prophylactic and / or therapeutic agent for the disease. In addition, this method may be a screening method for a substance that suppresses uptake of extracellular macromolecules by cells. In this case, the present method may be a screening method for a substance that suppresses the uptake of extracellular immunoglobulin by vascular endothelial cells, or the immunoglobulin in the blood is introduced into the perivascular tissue via the vascular endothelial cells. It may be a screening method for a substance that suppresses migration, or it may be a screening method for a substance that suppresses the transfer of immunoglobulin from blood in a blood vessel to cells contained in tissues surrounding the blood vessel. Also good.
なお、本方法に係る疾患の予防及び／又は治療剤は、当該疾患の予防のため、及び／又は治療のために使用される医薬組成物である。具体的に、本方法に係る疾患の予防及び／又は治療剤は、例えば、当該疾患の予防のため、及び／又は治療のために、当該疾患を発症し得る患者又は当該疾患を既に発症している患者に投与される医薬組成物である。 In addition, the preventive and / or therapeutic agent of the disease which concerns on this method is a pharmaceutical composition used for the prevention and / or treatment of the said disease. Specifically, the prophylactic and / or therapeutic agent for a disease according to the present method is, for example, a patient who can develop the disease or has already developed the disease for the prevention and / or treatment of the disease. A pharmaceutical composition administered to a patient.
本方法に係る予防及び／又は治療剤は、本方法により選択される１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質を有効成分として含む。本方法に係る予防及び／又は治療剤は、本方法により選択される１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質からなる医薬組成物であることとしてもよいし、当該１以上のｃ−Ａｂｌ抑制物質（有効成分）と、薬理学的に許容される担体とを含む医薬組成物であることとしてもよい。 The preventive and / or therapeutic agent according to this method contains one or more c-Abl inhibitory substances selected by this method as an active ingredient. The prophylactic and / or therapeutic agent according to this method may be a pharmaceutical composition comprising one or more c-Abl inhibitory substances selected by this method, or the one or more c-Abl inhibitory substances (effective It is good also as a pharmaceutical composition containing a component) and a pharmacologically acceptable carrier.
次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。 Next, specific examples according to the present embodiment will be described.
ｃ−Ａｂｌ抑制物質が、培養液中のイムノグロブリンの培養細胞による取り込みを抑制することを確認した。ｃ−Ａｂｌ抑制物質としては、ｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害することが知られているイマチニブ（イマチニブメシル酸塩、和光純薬工業株式会社）又はニロチニブ（Ｃａｙｍａｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を使用した。血管内皮細胞としては、ヒト皮膚血管内皮細胞（ＨＤＢＥＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を使用した。イムノグロブリンとしては、蛍光色素で標識したＩｇＧであるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４標識ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を使用した。 It was confirmed that the c-Abl inhibitory substance suppresses the uptake of immunoglobulin in the culture medium by cultured cells. As the c-Abl inhibitor, imatinib (imatinib mesylate, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or nilotinib (Caymane Chemical), which is known to inhibit the tyrosine kinase activity of c-Abl, was used. Human vascular endothelial cells (HDBEC, PromoCell) were used as vascular endothelial cells. As the immunoglobulin, Alexa Fluor (registered trademark) 594-labeled human IgG (Jackson ImmunoResearch), which is IgG labeled with a fluorescent dye, was used.
まずＨＤＢＥＣを、内皮細胞増殖培地ＭＶ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７０％〜８０％コンフルエントに到達するまで培養した。次いで、培地を、５μＭのイマチニブ又はニロチニブを含む培地に交換し、当該イマチニブ又はニロチニブを含む培地中でＨＤＢＥＣを２４時間培養した。なお、イマチニブ又はニロチニブを含む培地は、当該イマチニブ又はニロチニブをＰＢＳに溶解して添加剤を調製し、当該添加剤を新たな培地に添加することにより調製した。その後、イマチニブ又はニロチニブを含む培地に、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４標識ヒトＩｇＧを添加し、当該培地中でＨＤＢＥＣを１時間インキュベートした。 First, HDBEC was cultured in endothelial cell growth medium MV (PromoCell) at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere until reaching 70% to 80% confluence. Subsequently, the medium was replaced with a medium containing 5 μM imatinib or nilotinib, and HDBEC was cultured in the medium containing imatinib or nilotinib for 24 hours. The medium containing imatinib or nilotinib was prepared by dissolving the imatinib or nilotinib in PBS to prepare an additive, and adding the additive to a new medium. Thereafter, 10 μg / mL Alexa Fluor® 594-labeled human IgG was added to a medium containing imatinib or nilotinib, and HDBEC was incubated in the medium for 1 hour.
一方、対照例１では、イマチニブ及びニロチニブは添加せず、イマチニブ及びニロチニブを含まない溶媒（ＰＢＳ）のみを添加した。また、対照例２では、イマチニブ、ニロチニブ、溶媒及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４標識ヒトＩｇＧのいずれも添加しなかった。 On the other hand, in Control Example 1, imatinib and nilotinib were not added, and only a solvent (PBS) not containing imatinib and nilotinib was added. In Control Example 2, neither imatinib, nilotinib, solvent, or Alexa Fluor (registered trademark) 594-labeled human IgG was added.
そして、蛍光顕微鏡（ＢＺ−９００、ＫＥＹＥＮＣＥ社）下で、ＨＤＢＥＣの蛍光画像を取得し、当該蛍光画像に基づいて、当該ＨＤＢＥＣに取り込まれたＩｇＧの量を評価した。すなわち、コンピュータにインストールされた画像処理ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用して、取得された蛍光画像中の１０個の細胞の各々の細胞質領域を手動で特定し、当該細胞質領域内のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４標識ヒトＩｇＧに由来するシグナルの平均蛍光強度（Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ：ＭＦＩ）（Ａ５９４−ＭＦＩ）を測定した。さらに、Ａ５９４−ＭＦＩからバックグラウンドのＭＦＩを差し引くことで、ΔＡ５９４−ＭＦＩを算出した。 And the fluorescence image of HDBEC was acquired under the fluorescence microscope (BZ-900, KEYENCE company), and the quantity of IgG taken in by the HDBEC was evaluated based on the fluorescence image. That is, using the image processing software ImageJ installed in a computer, the cytoplasmic region of each of 10 cells in the acquired fluorescent image is manually specified, and Alexa Fluor (registered trademark) 594 in the cytoplasmic region is specified. Mean fluorescence intensity (MFI) (A594-MFI) of signals derived from labeled human IgG was measured. Further, ΔA594-MFI was calculated by subtracting the background MFI from A594-MFI.
図１には、ΔＡ５９４−ＭＦＩの算出結果を示す。図１の横軸において、左端の「Ｖｅｈ」は対照例２を示し、「Ｖｅｈ／Ａ５９４−ＩｇＧ」は対照例１を示し、「Ｉｍａｔｉｎｉｂ／Ａ５９４−ＩｇＧ」はイマチニブを添加した例を示し、「Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ／Ａ５９４−ＩｇＧ」はニロチニブを添加した例を示す。 FIG. 1 shows the calculation result of ΔA594-MFI. In the horizontal axis of FIG. 1, “Veh” at the left end represents Control Example 2, “Veh / A594-IgG” represents Control Example 1, “Imatinib / A594-IgG” represents an example in which imatinib was added, “Nilotinib / A594-IgG” indicates an example in which nilotinib is added.
図１に示すように、ＩｇＧとの接触前に予め血管内皮細胞をイマチニブ又はニロチニブで処理した例のΔＡ５９４−ＭＦＩは、対照例１のそれより顕著に低く、対照例２のそれと同程度であった。すなわち、イマチニブ及びニロチニブのそれぞれが、血管内皮細胞によるＩｇＧの取り込みを抑制することが確認された。 As shown in FIG. 1, ΔA594-MFI of the example in which the vascular endothelial cells were previously treated with imatinib or nilotinib before contact with IgG was significantly lower than that of Control Example 1 and comparable to that of Control Example 2. It was. That is, it was confirmed that imatinib and nilotinib each suppress the uptake of IgG by vascular endothelial cells.
なお、ＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込みは、当該ＨＤＢＥＣを、カベオラ介在性エンドサイトーシス（ｃａｖｅｏｌａｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の選択的阻害剤であるナイスタチンで処理することによっても抑制された。 The uptake of IgG by HDBEC was also suppressed by treating the HDBEC with nystatin, which is a selective inhibitor of caveolae-mediated endocytosis.
すなわち、まずＨＤＢＥＣを、内皮細胞増殖培地ＭＶ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社）中、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で７０％〜８０％コンフルエントに到達するまで培養した。次いで、ＨＤＢＥＣを、５０μｇ／ｍＬのナイスタチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む培地中で３０分培養した。なお、培地へのナイスタチンの添加は、当該ナイスタチンをＰＢＳに溶解して添加剤を調製し、当該添加剤を培地に添加することにより行った。その後、ＨＤＢＥＣを、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４標識ヒトＩｇＧを含む培地中で１時間インキュベートした。一方、対照例では、ナイスタチンの添加に代えて、ナイスタチンを含まない溶媒のみを添加した。 That is, first, HDBEC was cultured in endothelial cell growth medium MV (PromoCell) at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere until reaching 70% to 80% confluence. HDBEC was then incubated for 30 minutes in medium containing 50 μg / mL nystatin (Sigma Aldrich). The nystatin was added to the medium by dissolving the nystatin in PBS to prepare an additive and adding the additive to the medium. HDBEC was then incubated for 1 hour in medium containing 10 μg / mL Alexa Fluor® 594-labeled human IgG. On the other hand, in the control example, only the solvent containing no nystatin was added instead of the addition of nystatin.
そして、上述のイマチニブ及びニロチニブの例と同様に、ＨＤＢＥＣに取り込まれたＩｇＧの量を評価した。その結果、ナイスタチンによってＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込みが顕著に抑制されることが確認された。 Then, the amount of IgG incorporated into HDBEC was evaluated in the same manner as in the examples of imatinib and nilotinib described above. As a result, it was confirmed that the uptake of IgG by HDBEC was remarkably suppressed by nystatin.
また、ＨＤＢＥＣを、１０μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ５９４標識ヒトＩｇＧを含む培地中で１時間インキュベートし、次いで、当該ＨＤＢＥＣを固定化し、さらに透明化処理し、その後、当該ＨＤＢＥＣを抗マウスカベオリン−１抗体（Ａｂｃａｍ）とともに４℃で一晩インキュベートした。さらに翌日、ＨＤＢＥＣを抗ウサギＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８標識抗体とともに室温で３０分インキュベートし、次いで、退色防止用封入材（ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標） Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ）で封入した。そして、ＨＤＢＥＣを蛍光顕微鏡（ＢＺ−９００、ＫＥＹＥＮＣＥ）下で観察した。その結果、ＨＤＢＥＣの細胞内のＩｇＧの多くはカベオリン−１に隣接して観察された。 In addition, HDBEC was incubated for 1 hour in a medium containing 10 μg / mL Alexa Fluor® 594-labeled human IgG, and then the HDBEC was fixed and further clarified, and then the HDBEC was anti-mouse Incubated overnight at 4 ° C. with caveolin-1 antibody (Abcam). The next day, HDBEC was incubated with anti-rabbit Alexa Fluor® 488-labeled antibody for 30 minutes at room temperature, and then encapsulated with antifade encapsulant (ProLong® Diamond Antifant Mount with DAPI). HDBEC was observed under a fluorescence microscope (BZ-900, KEYENCE). As a result, most of the intracellular IgG of HDBEC was observed adjacent to caveolin-1.
ここで、公知文献“Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃａｖｅｏｌｉｎ−１ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃ−Ａｂｌ ａｎｄ Ｐｒｄｘ１ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８８， ２０５８１−２０５９１ （２０１３）”及び“Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉ， Ａ．Ｒ． ＆ Ｍａｓｔｉｃｋ， Ｃ．Ｃ． ｃ−Ａｂｌ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｖｅｏｌｉｎ−１ ｏｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ １４． Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １５， ２８９−２９８ （２００３）”では、カベオリン−１のリン酸化は、カベオリン介在性エンドサイトーシスにおける重要なステップであること、及びｃ−Ａｂｌチロシンキナーゼは、その過程で主要な役割を果たしていることが報告されている。
Here, it is known in the literature "Takeuchi, K., et al. AMP-dependent kinase inhibits oxidative stress-induced caveolin-1 phosphorylation and endocytosis by suppressing the dissociation between c-Abl and Prdx1 proteins in endothelial cells. J Biol Chem 288, 20581 -20591 (2013) "and" Sanguinetti, AR & Mastic, CC c-Abl is required for oxidative stress-induced phosphorate. In ion of caveolin-1 on tyrosine 14.
したがって、上述したＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込みには、ｃ−Ａｂｌを介したカベオリン介在性エンドサイトーシスが関与しており、当該ｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害するイマチニブ及びニロチニブが、当該ＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込みを阻害したものと考えられた。 Therefore, cbeolin-mediated endocytosis via c-Abl is involved in the above-mentioned IgG uptake by HDBEC, and imatinib and nilotinib that inhibit the tyrosine kinase activity of c-Abl are converted into IgG by HDBEC. It was thought that it inhibited the uptake of.
ｃ−Ａｂｌ抑制物質が、非ヒト動物において、血液中から血管周囲組織へのイムノグロブリンの移行を抑制すること、及び自己免疫疾患の発症を抑制することを確認した。非ヒト動物としては、８週齢〜９週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（ＳＬＣ）を使用した。 It was confirmed that the c-Abl inhibitory substance suppresses the transfer of immunoglobulin from blood to the tissue surrounding blood vessels and the onset of autoimmune disease in non-human animals. As non-human animals, female C57BL / 6N mice (SLC) aged 8 to 9 weeks were used.
そして、非ヒト動物の自己免疫疾患モデルとして、マウス天疱瘡モデルを作製した。ここで、天疱瘡は、自己免疫疾患の一つ（より具体的には、自己抗体介在疾患（ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の一つ）であり、自己の細胞が有するデスモグレイン（Ｄｓｇ）３に対する抗体（抗Ｄｓｇ３自己抗体）の大量産生により発症する疾患である。天疱瘡患者においては、明らかな局所的炎症なしに自己抗体の血管周囲組織への沈着が認められる。抗Ｄｓｇ３自己抗体は表皮細胞の解離を引き起こし、その結果、天疱瘡患者の皮膚においては、水泡形成や脱毛が発生する。 Then, a mouse pemphigus model was prepared as an autoimmune disease model for non-human animals. Here, pemphigus is one of autoimmune diseases (more specifically, one of autoantibody-mediated disorders), and an antibody against desmoglein (Dsg) 3 possessed by its own cells. It is a disease that develops due to mass production of (anti-Dsg3 autoantibodies). In patients with pemphigus, autoantibody deposition in the perivascular tissue is observed without obvious local inflammation. Anti-Dsg3 autoantibodies cause epithelial cell dissociation, resulting in blister formation and hair loss in the skin of patients with pemphigus.
マウス天疱瘡モデルは、抗Ｄｓｇ３自己抗体を使用して作製した。すなわち、まず、マウスＩｇＧ１サブタイプに属する、抗Ｄｓｇ３モノクローナル抗体を作製した。具体的に、公知文献”Ｔｓｕｎｏｄａ， Ｋ．， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｂｙ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｏｆ ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ ３． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０， ２１７０−２１７８ （２００３）”の記載に従って、病原性抗マウスＤｓｇ３モノクローナル抗体（ＡＫ２３）を産生するハイブリドーマ細胞と、非病原性抗マウスＤｓｇ３モノクローナル抗体（ＡＫ１８）を産生するハイブリドーマ細胞とを作製した。 A mouse pemphigus model was created using anti-Dsg3 autoantibodies. That is, first, an anti-Dsg3 monoclonal antibody belonging to the mouse IgG1 subtype was prepared. Specifically, according to the publicly known document “Tsunoda, K., et al. Induction of pemphigus phenotype by a amouse monobodies in the three-ahead of 170. Hybridoma cells producing pathogenic anti-mouse Dsg3 monoclonal antibody (AK23) and hybridoma cells producing non-pathogenic anti-mouse Dsg3 monoclonal antibody (AK18) were prepared.
次いで、これらのハイブリドーマ細胞をＧＩＴ培地（和光純薬工業株式会社）中、３７℃で１４日培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨｉＴｒａｐ ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して培養上清中に産生されたＩｇＧを精製することにより、ＡＫ２３及びＡＫ１８を得た。 Subsequently, these hybridoma cells were cultured in GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 37 ° C. for 14 days, and IgG produced in the culture supernatant was purified using Protein G HiTrap column (GE Healthcare). As a result, AK23 and AK18 were obtained.
病原性のＡＫ２３を１００μｇ、マウスの尾静脈に投与すると、投与後１０日の当該マウスの背中には顕著な脱毛が認められた。一方、局所炎症を引き起こす表皮細胞の解離を回避して、恒常的条件（ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で血管周囲組織へのＩｇＧの移行動態を正確に評価する上では、非病原性のＡＫ１８が有用であった。
When 100 μg of pathogenic AK23 was administered to the tail vein of a mouse, remarkable hair loss was observed on the back of the
すなわち、ＰＢＳに溶解した１００μｇのＡＫ１８をマウスの尾静脈に投与し、当該投与の２４時間後に当該マウスの耳の皮膚組織を採取した。次いで、この皮膚組織を５ｍｇ／ｍＬのディスパーゼＩＩ（合同酒精株式会社）及び１０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、３７℃で３０分インキュベートした。その後、ピンセットを使用して、皮膚組織から表皮を分離した。さらに、表皮を０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液中、３７℃で８分インキュベートし、７０μｍナイロンメッシュでろ過した。 That is, 100 μg of AK18 dissolved in PBS was administered to the tail vein of a mouse, and the ear skin tissue of the mouse was collected 24 hours after the administration. Next, this skin tissue was incubated at 37 ° C. for 30 minutes in RPMI 1640 medium (Invitrogen) containing 5 mg / mL Dispase II (Godoshu Seiki Co., Ltd.) and 10% fetal bovine serum. Thereafter, the epidermis was separated from the skin tissue using tweezers. Furthermore, the epidermis was incubated at 37 ° C. for 8 minutes in a 0.25% trypsin-EDTA solution and filtered through a 70 μm nylon mesh.
得られた細胞懸濁液に、ＡＰＣ標識抗マウスＩｇＧ１抗体、ＰＢ標識抗マウスＣＤ４５抗体及びＦＩＴＣ標識抗マウスＥ−カドヘリン抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加した。そして、フローサイトメトリーを行った。フローサイトメトリーには、フローサイトメーター（ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、コンピュータにインストールされた解析ソフト（ＦｌｏｗＪｏ、Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）により分析した。 APC-labeled anti-mouse IgG1 antibody, PB-labeled anti-mouse CD45 antibody and FITC-labeled anti-mouse E-cadherin antibody (BD Bioscience) were added to the obtained cell suspension. Then, flow cytometry was performed. For flow cytometry, a flow cytometer (LSR Fortessa, BD Bioscience) was used, and analysis was performed with analysis software (FlowJo, Tree Star) installed in a computer.
一方、対照例１では、ＡＫ１８に代えて、Ｄｓｇ３には結合しない非病原性のマウスＩｇＧ１（Ｃｔｒｌ ＩｇＧ１）をマウスに投与した。また、対照例２では、ＡＫ１８に代えて、ＰＢＳのみをマウスに投与した。 On the other hand, in Control Example 1, a non-pathogenic mouse IgG1 (Ctrl IgG1) that does not bind to Dsg3 was administered to mice instead of AK18. In Control Example 2, instead of AK18, only PBS was administered to the mice.
図２Ａには、フローサイトメトリーによって、ＣＤ４５−／Ｅ−カドヘリン＋細胞（表皮細胞）のＩｇＧ１に由来する平均蛍光強度（ＩｇＧ１−ＭＦＩ）を測定した結果を示す。図２Ａの横軸において、「ＰＢＳ」は対照例２を示し、「Ｃｔｒｌ ＩｇＧ１」は対照例１を示し、「ＡＫ１８」はＡＫ１８を投与した例を示す。 FIG. 2A shows the results of measuring the average fluorescence intensity (IgG1-MFI) derived from IgG1 of CD45 − / E-cadherin + cells (epidermal cells) by flow cytometry. 2A, “PBS” represents Control Example 2, “Ctrl IgG1” represents Control Example 1, and “AK18” represents an example in which AK18 was administered.
図２Ａに示すように、ＡＫ１８を投与した例のＩｇＧ１−ＭＦＩは、対照例１及び対照例２のそれらに比べて顕著に大きかった。すなわち、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウスの耳の表皮には、対照例１，２に比べて顕著な量のＩｇＧ１が沈着していることが確認された。
As shown in FIG. 2A, the IgG1-MFI of the example administered with AK18 was significantly larger than those of Control Example 1 and Control Example 2. That is, it was confirmed that a significant amount of IgG1 was deposited on the epidermis of the ears of
図２Ｂには、同様にして、ＡＫ１８の投与直後、投与から１時間後、３時間後、６時間後及び２４時間後のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図２Ｂに示すように、表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは、投与後１時間以内に上昇し始め、投与後６時間にはほぼプラトーに達した。 FIG. 2B shows the measurement results of IgG1-MFI immediately after administration of AK18, 1 hour, 3 hours, 6 hours and 24 hours after administration. As shown in FIG. 2B, the IgG1-MFI level in the epidermis began to rise within 1 hour after administration and reached a plateau almost 6 hours after administration.
図２Ｃには、同様にして、ＡＫ１８の投与量を変えて、投与から２４時間後のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図２Ｃに示すように、表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩレベルと、ＡＫ１８の投与量とには強い正の相関が認められた。
FIG. 2C shows the results of measuring IgG1-
次に、ＡＫ１８の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてイマチニブを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ１８の投与前に、イマチニブ（５〜１５０ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１日２回、２日続けて尾静脈に投与した。イマチニブの投与は、イマチニブメシル酸塩をＰＢＳで溶解して調製した溶液を投与することにより行った。 Next, imatinib was administered as a c-Abl inhibitor before administration of AK18. That is, imatinib (5-150 mg / kg-body weight / day) was administered to the tail vein twice a day for two consecutive days before administration of AK18 to mice. Imatinib was administered by administering a solution prepared by dissolving imatinib mesylate in PBS.
図３Ａには、イマチニブの投与量を変えて、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウス耳表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図３Ａの横軸において、「ＰＢＳ」はイマチニブを投与せず、溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、ＡＫ１８も投与しなかった例を示し、「−／ＡＫ１８」はイマチニブ及び溶媒のいずれも投与せず、ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示し、「２００／Ｉｍａｔｉｎｉｂ（μｇ）／ＡＫ１８」、「６００／Ｉｍａｔｉｎｉｂ（μｇ）／ＡＫ１８」、「２０００／Ｉｍａｔｉｎｉｂ（μｇ）／ＡＫ１８」及び「６０００／Ｉｍａｔｉｎｉｂ（μｇ）／ＡＫ１８」は、それぞれ予めイマチニブを２００μｇ、６００μｇ、２０００μｇ及び６０００μｇ投与し、その後、ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示す。
FIG. 3A shows the results of measurement of IgG1-MFI of
図３Ａに示すように、イマチニブの投与量の増加に伴って、ＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは低下した。すなわち、予めイマチニブを投与することによって、ＡＫ１８のマウス耳表皮への沈着が顕著に抑制された。 As shown in FIG. 3A, IgG1-MFI levels decreased with increasing dose of imatinib. That is, pre-administration of imatinib significantly suppressed the deposition of AK18 on the mouse ear epidermis.
図３Ｂには、ＡＫ１８の投与量を変えて、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウス耳表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図３Ｂの横軸において、「ＰＢＳ」はイマチニブを投与せず、溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、ＡＫ１８も投与しなかった例を示し、「５０／ＡＫ１８（μｇ）」、「１００／ＡＫ１８（μｇ）」及び「２００／ＡＫ１８（μｇ）」の白抜き丸印（「Ｖｅｈｉｃｌｅ」）は、それぞれ予め溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、その後ＡＫ１８を５０μｇ、１００μｇ及び２００μｇ投与した例を示し、「５０／ＡＫ１８（μｇ）」、「１００／ＡＫ１８（μｇ）」及び「２００／ＡＫ１８（μｇ）」の黒塗り丸印（「Ｉｍａｔｉｎｉｂ」）は、予めイマチニブを６０００μｇ投与し、その後、それぞれＡＫ１８を５０μｇ、１００μｇ及び２００μｇ投与した例を示す。
FIG. 3B shows the results of measurement of IgG1-MFI of
図３Ｂに示すように、ＰＢＳの投与後にＡＫ１８を投与した例（「Ｖｅｈｉｃｌｅ」）では、ＡＫ１８の投与量の増加に伴って、ＩｇＧ１−ＭＦＩレベルも増加したのに対し、イマチニブの投与後にＡＫ１８を投与した例（「Ｉｍａｔｉｎｉｂ」）では、ＡＫ１８の投与量にかかわらず、ＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは低く抑えられた。すなわち、予めイマチニブを投与することによって、ＡＫ１８のマウス耳表皮への沈着が顕著に抑制された。 As shown in FIG. 3B, in the example in which AK18 was administered after administration of PBS (“Vehicle”), the IgG1-MFI level increased as the dose of AK18 increased, whereas AK18 increased after administration of imatinib. In the administered case (“Imatinib”), the IgG1-MFI level was kept low regardless of the dose of AK18. That is, pre-administration of imatinib significantly suppressed the deposition of AK18 on the mouse ear epidermis.
また、ＡＫ１８の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてニロチニブを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ１８の投与前に、ニロチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１回、経口投与した。 In addition, nilotinib was administered as a c-Abl inhibitor before administration of AK18. That is, nilotinib (200 mg / kg-body weight / day) was orally administered once before administration of AK18 to mice.
図３Ｃには、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウス耳表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図３Ｃの横軸において、「ＰＢＳ」はニロチニブを投与せず、溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、ＡＫ１８も投与しなかった例を示し、「Ｖｅｈ／ＡＫ１８」はニロチニブを投与せず、予め溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、その後ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示し、「Ｎｉｌｏｔｉｎｉｂ／ＡＫ１８」は、予めニロチニブを投与し、その後ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示す。
FIG. 3C shows the results of measuring IgG1-MFI of
図３Ｃに示すように、ＡＫ１８の投与前にニロチニブを投与した例のＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは、ＡＫ１８の投与前にニロチニブを投与しなかった例のそれより顕著に低かった。すなわち、予めニロチニブを投与することによって、ＡＫ１８のマウス耳表皮への沈着が顕著に抑制された。 As shown in FIG. 3C, the IgG1-MFI level of the example where nilotinib was administered before administration of AK18 was significantly lower than that of the example where nilotinib was not administered before administration of AK18. That is, pre-administration of nilotinib significantly suppressed the deposition of AK18 on the mouse ear epidermis.
また、ＡＫ１８の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてＡＩＣＡＲ（５−ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ−４−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ１８の投与前に、ＡＩＣＡＲ（Ｔｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（０．５−０．７５ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１回、皮下投与した。なお、ＡＩＣＡＲは、ＡＭＰ（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）を活性化することによりｃ−Ａｂｌリン酸化反応を阻害することが知られている。 In addition, AICAR (5-aminoimidazole-4-carbamide ribonucleotide) was administered as a c-Abl inhibitor before administration of AK18. That is, AICAR (Toronto Research Chemicals) (0.5-0.75 mg / kg-body weight / day) was subcutaneously administered once before administration of AK18 to mice. AICAR is known to inhibit c-Abl phosphorylation by activating AMP (adenosine monophosphate) activated protein kinase (AMPK).
図３Ｄには、ＡＫ１８の投与から２４時間後のマウス耳表皮のＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した結果を示す。図３Ｄの横軸において、「ＰＢＳ」はＡＩＣＡＲを投与せず、溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、ＡＫ１８も投与しなかった例を示し、「Ｖｅｈ／ＡＫ１８」はＡＩＣＡＲを投与せず、予め溶媒（ＰＢＳ）のみを投与し、その後ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示し、「１０／ＡＩＣＡＲ（ｍｇ）／ＡＫ１８」及び「１５／ＡＩＣＡＲ（ｍｇ）／ＡＫ１８」は、それぞれ予めＡＩＣＡＲを１０ｍｇ及び１５ｍｇ投与し、その後ＡＫ１８を１００μｇ投与した例を示す。
FIG. 3D shows the results of measuring IgG1-MFI of
図３Ｄに示すように、ＡＫ１８の投与前にＡＩＣＡＲを投与した例のＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは、ＡＫ１８の投与前にＡＩＣＡＲを投与しなかった例のそれより顕著に低かった。また、ＡＩＣＡＲの投与量の増加に伴って、ＩｇＧ１−ＭＦＩレベルは低下した。すなわち、予めＡＩＣＡＲを投与することによって、ＡＫ１８のマウス耳表皮への沈着が顕著に抑制された。 As shown in FIG. 3D, the IgG1-MFI level of the example in which AICAR was administered before administration of AK18 was significantly lower than that in the example in which AICAR was not administered before administration of AK18. In addition, the IgG1-MFI level decreased with increasing AICAR dose. That is, by pre-administering AICAR, the deposition of AK18 on the mouse ear epidermis was significantly suppressed.
次に、ＡＫ２３の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてイマチニブを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ２３の投与前に、イマチニブ（５〜１５０ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１日２回、２日続けて尾静脈に投与した。 Next, imatinib was administered as a c-Abl inhibitor before administration of AK23. That is, imatinib (5-150 mg / kg-body weight / day) was administered to the tail vein twice a day for two consecutive days before administration of AK23 to mice.
図４Ａには、ＡＫ２３を投与してから１０日後のマウスを背中側から撮影した写真を示す。図４Ａにおいて、「−」の３匹は、予めイマチニブを投与することなくＡＫ２３を投与されたマウスであり、「＋」の３匹は、イマチニブを投与した後にＡＫ２３を投与されたマウスである。 FIG. 4A shows a photograph of a mouse taken 10 days after administration of AK23 from the back side. In FIG. 4A, three “−” mice are mice that have been previously administered AK23 without administration of imatinib, and three “+” mice are mice that have been administered AK23 after administration of imatinib.
図４Ａに示すように、イマチニブを投与しなかったマウスの背中には顕著な脱毛が生じたのに対し、予めイマチニブを投与したマウスには脱毛が認められなかった。すなわち、予めイマチニブを投与することによって、ＡＫ２３によってマウスに引き起こされる脱毛が顕著に抑制された。 As shown in FIG. 4A, significant hair loss occurred on the back of the mice that did not receive imatinib, whereas hair loss was not observed in the mice that were previously administered imatinib. That is, by preliminarily administering imatinib, hair loss caused to mice by AK23 was significantly suppressed.
また、ＡＫ２３の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてニロチニブを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ２３の投与前に、ニロチニブ（２００ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１日１回、７日続けて経口投与した。 In addition, nilotinib was administered as a c-Abl inhibitor before administration of AK23. That is, nilotinib (200 mg / kg-body weight / day) was orally administered once a day for 7 consecutive days before administration of AK23 to mice.
図４Ｂには、ＡＫ２３を投与してから１０日後のマウスを背中側から撮影した写真を示す。図４Ｂにおいて、「−」の４匹は、予めニロチニブを投与することなくＡＫ２３を投与されたマウスであり、「＋」の４匹は、ニロチニブを投与した後にＡＫ２３を投与されたマウスである。 FIG. 4B shows a photograph of a mouse taken 10 days after administration of AK23 from the back side. In FIG. 4B, the four “−” mice are mice that have been administered AK23 without prior administration of nilotinib, and the four “+” mice are mice that have been administered AK23 after administration of nilotinib.
図４Ｂに示すように、ニロチニブを投与しなかったマウスの背中には顕著な脱毛が生じたのに対し、予めニロチニブを投与したマウスにはほとんど脱毛が認められなかった。すなわち、予めニロチニブを投与することによって、ＡＫ２３によってマウスに引き起こされる脱毛が顕著に抑制された。 As shown in FIG. 4B, significant hair loss occurred on the back of mice that did not receive nilotinib, whereas almost no hair loss was observed in mice that had previously received nilotinib. That is, by previously administering nilotinib, hair loss caused to mice by AK23 was remarkably suppressed.
また、ＡＫ２３の投与前に、ｃ−Ａｂｌ抑制物質としてＡＩＣＡＲを投与した。すなわち、マウスに対するＡＫ１８の投与前に、ＡＩＣＡＲ（０．５−０．７５ｍｇ／ｋｇ−ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ／ｄａｙ）を１日１回、４日続けて皮下投与した。 In addition, AICAR was administered as a c-Abl inhibitor before administration of AK23. That is, before administration of AK18 to mice, AICAR (0.5-0.75 mg / kg-body weight / day) was subcutaneously administered once a day for 4 consecutive days.
図４Ｃには、ＡＫ２３を投与してから１０日後のマウスを背中側から撮影した写真を示す。図４Ｃにおいて、「−」の３匹は、予めＡＩＣＡＲを投与することなくＡＫ２３を投与されたマウスであり、「＋」の３匹は、ＡＩＣＡＲを投与した後にＡＫ２３を投与されたマウスである。 FIG. 4C shows a photograph of the mouse taken 10 days after administration of AK23 from the back side. In FIG. 4C, three “−” mice are mice that have been administered AK23 without prior administration of AICAR, and three “+” mice are mice that have been administered AK23 after administration of AICAR.
図４Ｃに示すように、ＡＩＣＡＲを投与しなかったマウスの背中には顕著な脱毛が生じたのに対し、予めＡＩＣＡＲを投与したマウスには僅かな脱毛しか認められなかった。すなわち、予めＡＩＣＡＲを投与することによって、ＡＫ２３によってマウスに引き起こされる脱毛が顕著に抑制された。 As shown in FIG. 4C, significant hair loss occurred on the back of the mice not administered with AICAR, whereas only slight hair loss was observed in the mice previously administered with AICAR. That is, by previously administering AICAR, hair loss caused to mice by AK23 was remarkably suppressed.
なお、イマチニブ及びニロチニブは、Ｐｄｇｆｒ−α、Ｐｄｇｆｒ−β及びｃ−Ｋｉｔといった他のチロシンキナーゼをも阻害することが知られているため、当該他のチロシンキナーゼの関与についても確認した。 In addition, since imatinib and nilotinib are also known to inhibit other tyrosine kinases such as Pdgfr-α, Pdgfr-β and c-Kit, the involvement of the other tyrosine kinases was also confirmed.
まず抗マウスＰｄｇｆｒ−α抗体、抗マウスＰｄｇｆｒ−β抗体及び抗マウスｃ−Ｋｉｔ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、フローサイトメトリーにより、マウス耳の皮膚血管内皮細胞を分析した結果、当該血管内皮細胞は、Ｐｄｇｆｒ−αを発現していたが、Ｐｄｇｆｒ−β及びｃ−Ｋｉｔは発現していなかった。 First, skin vascular endothelial cells of the mouse ear were analyzed by flow cytometry using anti-mouse Pdgfr-α antibody, anti-mouse Pdgfr-β antibody and anti-mouse c-Kit antibody (BD Bioscience). The cells expressed Pdgfr-α but not Pdgfr-β and c-Kit.
そこで、マウスにＡＫ１８を投与する前に、抗Ｐｄｇｆｒ−α阻害抗体であるＡＰ５（公知文献“Ｓａｎｏ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｅｔａ ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｆ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｉｂｒｏｕｓ ｃａｐ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０３， ２９５５−２９６０ （２００１）”）を投与し、ＩｇＧ１−ＭＦＩを測定した。しかしながら、ＡＰ５を投与した例のＩｇＧ１−ＭＦＩと、ＡＰ５を投与しなかった例のＩｇＧ１−ＭＦＩとで、ＡＫ１８の沈着量は変わらなかった。 Therefore, prior to administration of AK18 to mice, AP5, which is an anti-Pdgfr-α-inhibiting antibody (known literature “Sano, H., et al. Functional blockade of platelet-derivative-bactor-bench-pump-bet-receptor-beta-baptor-bet-baptor-bet. Vascular smooth muscle cell accumulation in fibrocaps capsions in apolipoprotein E-defense mice. Circulation 103, 2955-2960 (2001) ”was measured, and IgG1-M was measured. However, the amount of AK18 deposited did not change between the IgG1-MFI in the case where AP5 was administered and the IgG1-MFI in the case where AP5 was not administered.
また、培養ＨＤＢＥＣを無血清培地中で５時間培養し、次いで、５０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む培地中で１時間培養し、Δ５９４−ＭＦＩを測定した。しかしながら、ＰＤＧＦの存在下におけるΔ５９４−ＭＦＩと、ＰＤＧＦの不存在下におけるΔ５９４−ＭＦＩとで、ＨＤＢＥＣによるＩｇＧの取り込み量は変わらなかった。したがって、ＩｇＧの取り込みにおけるＰｄｇｆｒ−αの関与は小さいと考えられた。 In addition, cultured HDBEC was cultured in a serum-free medium for 5 hours, and then cultured in a medium containing 50 ng / mL PDGF (Sigma Aldrich) for 1 hour, and Δ594-MFI was measured. However, the uptake of IgG by HDBEC did not change between Δ594-MFI in the presence of PDGF and Δ594-MFI in the absence of PDGF. Therefore, the involvement of Pdgfr-α in the uptake of IgG was considered to be small.
また、ｃ−Ｋｉｔの関与を確認するため、血管に沿って存在し、活性化によって血管の透過性を制御することのできる肥満細胞について検討した。すなわち、Ｍａｓ−ＴＲＥＣＫマウスの腹腔内に２５０ｎｇのジフテリア毒素を５日続けて投与することにより、肥満細胞欠損マウスを作製した（公知文献“Ｏｔｓｕｋａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｋｉｎ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｃｏｎｔａｃｔ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６， ｅ２５５３８ （２０１１）”）。 In addition, in order to confirm the involvement of c-Kit, we examined mast cells that exist along blood vessels and can control blood vessel permeability by activation. In other words, mast cell-deficient mice were prepared by administering 250 ng of diphtheria toxin intraperitoneally into Mas-TRECK mice for 5 days (known literature “Otsuka, A., et al. Requirements of interaction between mass cells and skin dendritic cells to establish contact hypersensitivity. PLoS One 6, e25538 (2011) ").
しかしながら、肥満細胞欠損マウスにおける皮膚へのＡＫ１８の沈着は、ジフテリア毒素を投与されていないマウスのそれに比べて、僅かに抑制されただけであった。したがって、ＩｇＧの沈着における肥満細胞の関与は小さいと考えられた。 However, the deposition of AK18 on the skin in mast cell-deficient mice was only slightly suppressed compared to that in mice not receiving diphtheria toxin. Therefore, the involvement of mast cells in IgG deposition was considered to be small.
以上より、イマチニブ及びニロチニブは、主に血管内皮細胞におけるｃ−Ａｂｌのチロシンキナーゼ活性を阻害することにより、血管を介した血液中から血管周囲組織へのＩｇＧの移行を抑制していると考えられた。 Based on the above, it is considered that imatinib and nilotinib suppress the transfer of IgG from blood to blood vessels through blood vessels by mainly inhibiting c-Abl tyrosine kinase activity in vascular endothelial cells. It was.
また、上述の結果は、ｃ−Ａｂｌ抑制物質であるイマチニブ、ニロチニブ及びＡＩＣＡＲの、自己免疫疾患（例えば、自己抗体介在疾患、又は天疱瘡、類天疱瘡、膜性腎症、自己免疫性網膜症、自己免疫性脳炎、重症筋無力症、強皮症、リウマチ及び全身性エリテマトーデスからなる群より選択される疾患）の予防及び／又は治療剤の有効成分としての使用を裏付けるものであるともいえる。 In addition, the above results indicate that the c-Abl inhibitors imatinib, nilotinib and AICAR are autoimmune diseases (eg, autoantibody-mediated diseases, or pemphigus, pemphigoid, membranous nephropathy, autoimmune retinopathy) It can also be said to support the use as an active ingredient of a preventive and / or therapeutic agent for autoimmune encephalitis, myasthenia gravis, scleroderma, rheumatism and systemic lupus erythematosus).
Claims (10)
（１）ｃ−Ａｂｌのシグナル伝達系を抑制する１以上の物質を用意する工程；及び
（２）前記１以上の物質のうちから、細胞外の高分子の細胞による取り込みを抑制する１以上の物質を、前記有効成分として選択する工程。 A screening method for an active ingredient of a prophylactic and / or therapeutic agent for a disease comprising the following steps (1) and (2):
(1) a step of preparing one or more substances that suppress the c-Abl signal transduction system; and (2) one or more of the one or more substances that suppress uptake of extracellular macromolecules by cells Selecting a substance as the active ingredient.
請求項１に記載のスクリーニング方法。 The polymer is a polymer having a molecular weight of 5 kDa or more and 1000 kDa or less.
The screening method according to claim 1.
請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。 The polymer is one or more selected from the group consisting of immunoglobulin, amyloid, cytokine, transferrin, sugar chain and lipid.
The screening method according to claim 1 or 2.
請求項１乃至３のいずれかに記載のスクリーニング方法。 The disease is an autoimmune disease or an allergy,
The screening method according to any one of claims 1 to 3.
請求項４に記載のスクリーニング方法。 The autoimmune disease is selected from the group consisting of pemphigus, pemphigoid, membranous nephropathy, autoimmune retinopathy, autoimmune encephalitis, myasthenia gravis, scleroderma, rheumatism and systemic lupus erythematosus Is a disease,
The screening method according to claim 4.
請求項４に記載のスクリーニング方法。 The screening method according to claim 4, wherein the allergy is a disease selected from the group consisting of allergic urticaria, asthma, rhinitis, conjunctivitis, atopic dermatitis, food allergy and anaphylaxis.
前記疾患は、血管内から血管周囲組織への血管内皮細胞を介した抗体の移行を伴う疾患である、
請求項１乃至６のいずれかに記載のスクリーニング方法。 The polymer is an immunoglobulin,
The disease is a disease involving the transfer of antibodies through vascular endothelial cells from the blood vessel to the perivascular tissue.
The screening method according to any one of claims 1 to 6.
請求項１乃至７のいずれかに記載のスクリーニング方法。 The cell is a vascular endothelial cell;
The screening method according to any one of claims 1 to 7.
（２ａ）前記１以上の物質の各々について、前記物質の存在下及び不存在下のそれぞれで、細胞外の前記高分子の前記細胞による取り込み量を評価する工程；及び
（２ｂ）前記１以上の物質の各々について、前記物質の存在下における前記取り込み量が、前記物質の不存在下における前記取り込み量より小さい場合に、前記物質を、前記有効成分として選択する工程。 The screening method according to any one of claims 1 to 8, wherein the following steps (2a) and (2b) are performed in the step (2):
(2a) for each of the one or more substances, evaluating the amount of extracellular macromolecules taken up by the cells in the presence and absence of the substance; and (2b) the one or more substances For each of the substances, when the uptake amount in the presence of the substance is smaller than the uptake amount in the absence of the substance, the substance is selected as the active ingredient.
（２ａ）前記１以上の物質の各々について、前記物質を投与された非ヒト動物及び前記物質を投与されていない非ヒト動物のそれぞれで、血液中の前記高分子の血管内皮細胞を介した血管周囲組織への移行量を評価する工程；及び
（２ｂ）前記１以上の物質の各々について、前記物質を投与された前記非ヒト動物における前記移行量が、前記物質を投与されていない前記非ヒト動物における前記移行量より小さい場合に、前記物質を、前記有効成分として選択する工程。 The screening method according to any one of claims 1 to 8, wherein the following steps (2a) and (2b) are performed in the step (2):
(2a) For each of the one or more substances, blood vessels via blood vessel endothelial cells of the polymer in blood in each of a non-human animal administered with the substance and a non-human animal not administered with the substance And (2b) for each of the one or more substances, the amount of transfer in the non-human animal that has been administered the substance is the non-human that has not been administered the substance. The step of selecting the substance as the active ingredient when it is smaller than the migration amount in an animal.
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005056597A1 (en) * | 2003-12-09 | 2005-06-23 | Riken | IMMUNOGLOBULIN Fc RECEPTOR PROTEIN |
| JP2007517491A (en) * | 2003-12-29 | 2007-07-05 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | Methods for identifying immunomodulators, immunomodulators, and uses thereof |
| JP2008504022A (en) * | 2004-06-21 | 2008-02-14 | プロティオーム・サイエンシィズ・ピーエルシー | Screening method |
| WO2015103480A1 (en) * | 2014-01-02 | 2015-07-09 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Treating ocular neovascularization |
-
2016
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005056597A1 (en) * | 2003-12-09 | 2005-06-23 | Riken | IMMUNOGLOBULIN Fc RECEPTOR PROTEIN |
| JP2007517491A (en) * | 2003-12-29 | 2007-07-05 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | Methods for identifying immunomodulators, immunomodulators, and uses thereof |
| JP2008504022A (en) * | 2004-06-21 | 2008-02-14 | プロティオーム・サイエンシィズ・ピーエルシー | Screening method |
| WO2015103480A1 (en) * | 2014-01-02 | 2015-07-09 | Massachusetts Eye & Ear Infirmary | Treating ocular neovascularization |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "Takeuchi K., et al., "AMP-dependent kinase inhibits oxidative stress-induced caveolin-1 phosphorylat", J BIOL CHEM., 2013 JUL 12 (EPUB 2013 MAY 30.), VOL. 288, NO. 28, PP. 20581-20591., JPN6019033461, ISSN: 0004225851 * |
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