JP2017131172A

JP2017131172A - Exosome production promoter

Info

Publication number: JP2017131172A
Application number: JP2016015081A
Authority: JP
Inventors: 俊文喜多; Toshibumi Kita; 佳也小幡; Yoshiya Obata; 法一前田; Norikazu Maeda; 下村　伊一郎; Iichiro Shimomura; 伊一郎下村
Original assignee: Osaka University NUC
Current assignee: Osaka University NUC
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2017-08-03
Anticipated expiration: 2036-01-29
Also published as: JP6618079B2

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an exosome production promoter.SOLUTION: A promoter for exosome production from a cell comprises at least one selected from the group consisting of adiponectin, adiponectin expression promoter, T-cadherin expression promoter, ADAM12 expression inhibitor, and ADAM12 activity inhibitor.SELECTED DRAWING: None

Description

本発明はエクソソーム産生促進剤に関する。 The present invention relates to an exosome production promoter.

エクソソームは、細胞から分泌される膜小胞であり、細胞内のタンパク質や遺伝情報（mRNA, microRNA等）を細胞外に運搬することにより、局所や全身における細胞間の情報伝達を担っている。その機能は多岐に亘り、例えば、感染性病原体や腫瘍に対する適応免疫応答の媒介、組織修復、神経伝達や病原性タンパク質の運搬等の機能を有することが報告されている。また、エクソソームの機能は、その由来する細胞によって異なることも示唆されている。例えば、間葉系幹細胞由来エクソソームであれば、心筋虚血再灌流障害の軽減機能や低酸素時の肺高血圧の軽減機能を有することが報告されており、心筋前駆細胞由来エクソソームであれば、心筋のアポトーシスの抑制機能を有することが報告されている（非特許文献１〜４）。このため、エクソソームの産生を促進することができれば、その生理的機能を亢進することができ、ひいては各種疾患の予防又は治療に繋げることができるといわれている。 Exosomes are membrane vesicles secreted from cells, and carry information transmission between cells locally and throughout the body by transporting intracellular proteins and genetic information (mRNA, microRNA, etc.) to the outside of the cells. It has been reported to have various functions such as mediating adaptive immune responses against infectious pathogens and tumors, tissue repair, neurotransmission, and pathogenic protein delivery. It has also been suggested that the function of exosomes varies depending on the cell from which it is derived. For example, mesenchymal stem cell-derived exosomes have been reported to have a function of reducing myocardial ischemia / reperfusion injury and a function of reducing pulmonary hypertension during hypoxia. It has been reported to have a function of suppressing apoptosis of (Non-patent Documents 1 to 4). For this reason, it is said that if the production of exosome can be promoted, its physiological function can be enhanced, which can lead to prevention or treatment of various diseases.

アディポネクチンは、脂肪細胞から分泌される分泌タンパク質であり、血中に非常に高濃度（約2〜20μg/mL）で存在している。低アディポネクチン血症によって、種々の疾患、例えば糖尿病、高血圧、脂質異常症、肝硬変、心線維化、COPD、骨粗鬆症、CKD、がん等の疾患が引き起こされるといわれている。しかし、エクソソームとの関連は知られていない。 Adiponectin is a secreted protein secreted from adipocytes and is present in blood at a very high concentration (about 2 to 20 μg / mL). Hypoadiponectinemia is said to cause various diseases such as diabetes, hypertension, dyslipidemia, cirrhosis, cardiac fibrosis, COPD, osteoporosis, CKD, and cancer. However, its association with exosomes is not known.

T-カドヘリンは、各種組織において存在する、GPIアンカー型膜タンパク質である。T-カドヘリンは、アディポネクチンとの関連が各種報告されており、例えばアディポネクチンが結合する受容体の1つであること、その遺伝子変異が心血管死と関連すること、そのSNPは血中アディポネクチン濃度と関連すること等が報告されている（非特許文献５〜８）。しかし、エクソソームとの関連は知られていない。 T-cadherin is a GPI-anchored membrane protein that exists in various tissues. T-cadherin has been reported to have various associations with adiponectin, for example, it is one of the receptors that adiponectin binds to, its genetic mutation is associated with cardiovascular death, and its SNP is related to blood adiponectin concentration Related matters have been reported (Non-Patent Documents 5 to 8). However, its association with exosomes is not known.

ADAM12はマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の一種であり、心不全等の疾患に関与することが報告されている。しかし、アディポネクチン、T-カドヘリン、及びエクソソームとの関連は知られていない。 ADAM12 is a kind of matrix metalloproteinase (MMP) and has been reported to be involved in diseases such as heart failure. However, its association with adiponectin, T-cadherin, and exosomes is not known.

Stem Cell Research (2010) 4, 214-222.Stem Cell Research (2010) 4, 214-222. Stem Cell Research (2013) 10, 301-312.Stem Cell Research (2013) 10, 301-312. Circulation. 2012;126:2601-2611.Circulation. 2012; 126: 2601-2611. Cardiovascular Research (2014) 103, 530-541.Cardiovascular Research (2014) 103, 530-541. PNAS, July 13, 2004, vol.101, no.28, 10308-10313.PNAS, July 13, 2004, vol.101, no.28, 10308-10313. DIABETES, Vol.60, September 2011, 2417-2423.DIABETES, Vol.60, September 2011, 2417-2423. HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 2, 402-410, 2012.HUMAN MUTATION, Vol. 33, No. 2, 402-410, 2012. DIABETES, Vol.62, December 2013, 4277-4283.DIABETES, Vol.62, December 2013, 4277-4283.

本発明は、エクソソーム産生促進剤を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide an exosome production promoter.

本発明者等は上記課題に鑑みて鋭意研究した結果、細胞に接触するアディポネクチン量の増加、細胞におけるT-カドヘリン発現量の増加、細胞におけるADAM12発現量の低下、及び細胞におけるADAM12活性の低下が、細胞からのエクソソームの産生を促進することを見出した。これらの知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明が完成した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors have found that an increase in the amount of adiponectin in contact with cells, an increase in the expression level of T-cadherin in cells, a decrease in the expression level of ADAM12 in cells, and a decrease in ADAM12 activity in cells. And found to promote exosome production from cells. As a result of further research based on these findings, the present invention was completed. That is, the present invention includes the following aspects.

項１．アディポネクチン、アディポネクチン発現促進剤、T-カドヘリン発現促進剤、ADAM12発現抑制剤、及びADAM12活性抑制剤からなる群より選択される少なくとも1種を含有する、細胞からのエクソソーム産生促進剤．
項２．前記細胞が、血管内皮細胞、幹細胞、及び筋細胞からなる群より選択される少なくとも1種である、項１に記載のエクソソーム産生促進剤．
項３．前記細胞が血管内皮細胞である、項１又は２に記載のエクソソーム産生促進剤．
項４．前記T-カドヘリン発現促進剤が、T-カドヘリンの発現ベクターである、項１〜３のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤．
項５．前記ADAM12発現抑制剤が、ADAM12特異的siRNA、ADAM12特異的miRNA、ADAM12特異的アンチセンス核酸、及びこれらの発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜４のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤．
項６．前記ADAM12活性抑制剤が、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、及びADAM12ドミナントネガティブ変異体の発現ベクターからなる群より選択される少なくとも1種である、項１〜５のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤．
項７．前記アディポネクチンが6量体以上のマルチマーである、項１〜６のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤．
項８．前記細胞が、in vitroにおける細胞である、項１〜７のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤．
項９．項１〜８のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤を細胞に接触させる工程を含む、細胞からのエクソソーム産生を促進する方法．
項１０．項１〜８のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤を細胞に接触させる工程、及び前記細胞から産生されるエクソソームを回収する工程を含む、エクソソームの製造方法． Item 1. A promoter for exosome production from cells, comprising at least one selected from the group consisting of adiponectin, adiponectin expression promoter, T-cadherin expression promoter, ADAM12 expression inhibitor, and ADAM12 activity inhibitor.
Item 2. Item 2. The exosome production promoter according to Item 1, wherein the cell is at least one selected from the group consisting of vascular endothelial cells, stem cells, and muscle cells.
Item 3. Item 3. The exosome production promoter according to Item 1 or 2, wherein the cell is a vascular endothelial cell.
Item 4. Item 4. The exosome production promoter according to any one of Items 1 to 3, wherein the T-cadherin expression promoter is an expression vector for T-cadherin.
Item 5. Any one of Items 1-4, wherein the ADAM12 expression inhibitor is at least one selected from the group consisting of ADAM12-specific siRNA, ADAM12-specific miRNA, ADAM12-specific antisense nucleic acid, and expression vectors thereof. The exosome production promoter as described.
Item 6. Item 6. The exosome production promoter according to any one of Items 1 to 5, wherein the ADAM12 activity inhibitor is at least one selected from the group consisting of a matrix metalloprotease inhibitor and an expression vector of an ADAM12 dominant negative mutant.
Item 7. Item 7. The exosome production promoter according to any one of Items 1 to 6, wherein the adiponectin is a hexamer or more multimer.
Item 8. Item 8. The exosome production promoter according to any one of Items 1 to 7, wherein the cell is a cell in vitro.
Item 9. Item 9. A method for promoting exosome production from a cell, comprising a step of contacting the cell with the exosome production promoter according to any one of Items 1 to 8.
Item 10. Item 9. A method for producing an exosome, comprising a step of bringing a exosome production promoter according to any one of Items 1 to 8 into contact with a cell, and a step of recovering the exosome produced from the cell.

本発明によれば、細胞からのエクソソームの産生を促進することができる。これにより、in vitroにおいてはより効率的にエクソソームを製造することができる。In vitroで製造されたエクソソーム又はエクソーム産生能が向上した細胞を生体に投与することにより、或いは生体内において（in vivoで）エクソソームの産生を促進することによって、エクソソームによる生理的機能を亢進することができ、ひいては各種疾患の予防又は治療（例えばエクソソーム療法、幹細胞療法）に繋げることができる。 According to the present invention, exosome production from cells can be promoted. Thereby, exosome can be manufactured more efficiently in vitro. Physiological functions of exosomes are enhanced by administering exosomes produced in vitro or cells with enhanced exosome production ability to the living body or by promoting exosome production in vivo (in vivo). Can be connected to prevention or treatment of various diseases (for example, exosome therapy, stem cell therapy).

実施例１のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上の表中、Ctrl1＝Control siRNA1、Ctrl2＝Control siRNA2、A〜＝ADAM〜 siRNA、W＝C57Bl6j野生型マウスの血清、A＝アディポネクチン欠損マウスの血清である。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（T-cad＝T-cadherin、tubulin＝alpha-Tubulin、APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 1 is shown. In the table above, Ctrl1 = Control siRNA1, Ctrl2 = Control siRNA2, A˜ = ADAM˜siRNA, W = serum of C57Bl6j wild type mouse, A = serum of adiponectin deficient mouse. The left side of the photograph shows the primary antibodies used in Western blotting (T-cad = T-cadherin, tubulin = alpha-Tubulin, APN = Adiponectin). 実施例２のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上の表中、pMX＝cDNAを組み込んでいないpMXs-neo、A12＝ADAM12のcDNAを組み込んだpMXs-neo、EQ＝EQ変異体のcDNAを組み込んだpMXs-neo、Marima＝MMP阻害薬Marimasta、WT＝C57Bl6j野生型マウスの血清、AKO＝アディポネクチン欠損マウスの血清である。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（T-cad＝T-cadherin、tubulin＝alpha-Tubulin、APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 2 is shown. In the table above, pMX = pMXs-neo without cDNA, A12 = pMXs-neo with ADAM12 cDNA, EQ = pMXs-neo with EQ mutant cDNA, Marima = MMP inhibitor Marimasta WT = C57Bl6j wild-type mouse serum, AKO = adiponectin-deficient mouse serum. The left side of the photograph shows the primary antibodies used in Western blotting (T-cad = T-cadherin, tubulin = alpha-Tubulin, APN = Adiponectin). 実施例３のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上方において、WT＝野生型マウスの血清、AKO又はA＝アディポネクチン欠損マウスの血清、TKO＝T-カドヘリン欠損マウスの血清、siCtrl＝ネガティブコントロールsiRNA、siADAM12＝ADAM12-1 siRNAである。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（T-cad＝T-cadherin、APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 3 is shown. In the upper part of the photograph, WT = sera of wild type mice, AKO or A = sera of mice lacking adiponectin, TKO = sera of mice lacking T-cadherin, siCtrl = negative control siRNA, siADAM12 = ADAM12-1 siRNA. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting (T-cad = T-cadherin, APN = Adiponectin). 実施例４のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上の表中、siCtrl＝ネガティブコントロールsiRNA、siA12＝ADAM12-2 siRNA、WT＝C57Bl6j野生型マウスの血清、AKO＝アディポネクチン欠損マウスの血清である。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（T-cad＝T-cadherin、APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 4 is shown. In the upper table, siCtrl = negative control siRNA, siA12 = ADAM12-2 siRNA, WT = serum of C57Bl6j wild type mouse, AKO = sera of adiponectin-deficient mouse. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting (T-cad = T-cadherin, APN = Adiponectin). 実施例５のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上の表中、F2T＝T-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞、F2＝UVF-2細胞、APN＝Adiponectin、各数字＝アディポネクチン濃度を示す。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 5 is shown. In the table above the photograph, F2T = T-cadherin overexpressing UVF-2 cells, F2 = UVF-2 cells, APN = Adiponectin, each number = adiponectin concentration. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting (APN = Adiponectin). 実施例５のウェスタンブロッティングの結果をグラフ化したものである。グラフの縦軸は、各タンパク質（T-cad＝T-cadherin、Syntenin、CD63、及びMFG-E8）の量の相対値を示す。横軸は、アディポネクチン濃度を示す。横軸中、F2T＝T-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞、F2＝UVF-2細胞である。The result of the western blotting of Example 5 is graphed. The vertical axis of the graph represents the relative value of the amount of each protein (T-cad = T-cadherin, Syntenin, CD63, and MFG-E8). The horizontal axis shows the adiponectin concentration. In the horizontal axis, F2T = T-cadherin overexpressing UVF-2 cells and F2 = UVF-2 cells. 実施例６の粒子数計測結果を示す。縦軸は粒子数の相対値を示す。横軸は、アディポネクチン（APN）濃度を示す。The particle number measurement result of Example 6 is shown. The vertical axis represents the relative value of the number of particles. The horizontal axis indicates adiponectin (APN) concentration. 実施例７のアセチルコリンエステラーゼ測定結果を示す。縦軸はアセチルコリンエステラーゼ活性を示す。横軸中、WT＝野生型マウスの血清を用いた場合、AKO＝アディポネクチン欠損マウスの血清を用いた場合である。The acetylcholinesterase measurement result of Example 7 is shown. The vertical axis represents acetylcholinesterase activity. In the horizontal axis, when WT = wild-type mouse serum is used, AKO = adiponectin-deficient mouse serum is used. 実施例８のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上の表中、null＝pMXs-puroレトロウイルス、mT-cad＝T-カドヘリンをコードするDNAをを組み込んだpMXs-puroレトロウイルス、WT＝野生型マウスの血清、AKO＝アディポネクチン欠損マウスの血清である。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 8 is shown. In the table above, null = pMXs-puro retrovirus, mT-cad = pMXs-puro retrovirus incorporating DNA encoding T-cadherin, WT = wild-type mouse serum, AKO = adiponectin-deficient mouse Serum. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting (APN = Adiponectin). 実施例９のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上方において、F2 cells＝pMXs-puroレトロウイルスを導入したUVF-2細胞、F2T cells＝T-カドヘリンをコードするDNAを組み込んだpMXs-puroレトロウイルスを導入したUVF-2細胞、siT-cad1＝T-カドヘリン siRNA、siCtrl＝ネガティブコントロールsiRNA、null＝siRNA未処理、WT＝野生型マウスの血清、AKO＝アディポネクチン欠損マウスの血清である。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（T-cad＝T-cadherin、APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 9 is shown. In the upper part of the photo, F2 cells = UVF-2 cells introduced with pMXs-puro retrovirus, F2T cells = UVF-2 cells introduced with pMXs-puro retrovirus incorporating DNA encoding T-cadherin, siT-cad1 = T-cadherin siRNA, siCtrl = negative control siRNA, null = siRNA untreated, WT = wild type mouse serum, AKO = adiponectin deficient mouse serum. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting (T-cad = T-cadherin, APN = Adiponectin). 実施例１０のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上方の各数字は、各画分における密度（g/mL）を示す。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（T-cad＝T-cadherin、APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 10 is shown. Each number above the photograph indicates the density (g / mL) in each fraction. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting (T-cad = T-cadherin, APN = Adiponectin). 実施例１１のウェスタンブロッティングの結果を示す。写真の上方において、F〜＝フラクション番号、AKO＝アディポネクチン欠損マウスの血清、WT＝野生型マウスの血清、TKO＝T-カドヘリン欠損マウスの血清である。写真の左には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す（T-cad＝T-cadherin、APN＝Adiponectin）。The result of the western blotting of Example 11 is shown. In the upper part of the photograph, F˜ = fraction number, AKO = adiponectin-deficient mouse serum, WT = wild-type mouse serum, TKO = T-cadherin-deficient mouse serum. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting (T-cad = T-cadherin, APN = Adiponectin). 上段がウェスタンブロッティングの結果を示す写真であり、下段が該写真のバンドの濃さを定量して、グラフ化したものである。写真の上方において、Wild＝野生型マウスの血清、APN-KO＝アディポネクチン欠損マウスの血清、W1〜5＝野生型マウスの血清から調製された粗エクソソーム画分サンプル、A1〜5＝アディポネクチン欠損マウスの血清から調製された粗エクソソーム画分サンプルである。写真の左側には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す。グラフの縦軸は、粗エクソソーム画分におけるMFG-E8（左側のグラフ）又はSyntenin（右側のグラフ）の存在量の相対値を示す。グラフの横軸において、WT＝野生型マウスの血清、AKO＝アディポネクチン欠損マウスの血清である。The upper row is a photograph showing the results of Western blotting, and the lower row is a graph obtained by quantifying the band density of the photograph. In the upper part of the photograph, Wild = serum of wild type mouse, APN-KO = adiponectin deficient mouse serum, W1-5 = crude exosome fraction sample prepared from wild type mouse serum, A1-5 = adiponectin deficient mouse A crude exosome fraction sample prepared from serum. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting. The vertical axis of the graph represents the relative value of the abundance of MFG-E8 (left graph) or Syntenin (right graph) in the crude exosome fraction. On the horizontal axis of the graph, WT = wild-type mouse serum and AKO = adiponectin-deficient mouse serum. 上段がウェスタンブロッティングの結果を示す写真であり、下段が該写真のバンドの濃さを定量して、グラフ化したものである。写真の上方及びグラフの横軸において、AKO+mA＝アディポネクチン欠損マウスにアディポネクチンをコードするアデノウイルスを投与した例、AKO+bGal＝アディポネクチン欠損マウスにβガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスを投与した例、DKO+mA＝アディポネクチン・T-カドヘリンダブル欠損マウスにアディポネクチンをコードするアデノウイルスを投与した例、DKO+bGal＝アディポネクチン・T-カドヘリンダブル欠損マウスにβガラクトシダーゼをコードするアデノウイルスを投与した例である。写真の左側には、ウェスタンブロッティングにおいて用いた一次抗体を示す。グラフの縦軸は、粗エクソソーム画分におけるMFG-E8又はSynteninの存在量（任意単位）を示す。The upper row is a photograph showing the results of Western blotting, and the lower row is a graph obtained by quantifying the band density of the photograph. In the upper part of the photograph and the horizontal axis of the graph, AKO + mA = Adiponectin-deficient mouse was administered with an adenovirus encoding adiponectin, AKO + bGal = Adiponectin-deficient mouse was administered with an adenovirus encoding β-galactosidase, DKO + mA = An example in which an adiponectin / T-cadherin double deficient mouse was administered with an adenovirus encoding adiponectin, and DKO + bGal = an adiponectin / T-cadherin double deficient mouse was administered with an adenovirus encoding β-galactosidase. The left side of the photograph shows the primary antibody used in Western blotting. The vertical axis of the graph indicates the abundance (arbitrary unit) of MFG-E8 or Syntenin in the crude exosome fraction.

１．定義
本明細書において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。 1. Definitions In this specification, the expressions “containing” and “including” include the concepts of “containing”, “including”, “consisting essentially of”, and “consisting only of”.

本明細書において、アミノ酸配列の『同一性』とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対する同一のアミノ酸配列の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の同一性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、KarlinおよびAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS， Altschul SF．“Methods for assessing the statisticalsignificance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc．Natl Acad Sci USA．87:2264−2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statisticsfor multipl
e high−scoringsegments in molecular sequences．”NatlAcad Sci USA．90:5873−7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、NationalCenter of BiotechnologyInformation（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。 In this specification, “identity” of amino acid sequences refers to the degree of amino acid sequences of two or more comparable amino acid sequences with respect to each other. Therefore, the higher the identity of two amino acid sequences, the higher the identity or similarity of those sequences. The level of amino acid sequence identity is determined, for example, using FASTA, a sequence analysis tool, using default parameters. Alternatively, the algorithm BLAST (KarlinS, Altschul SF. “Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes” Proc. Natl Acad Sci USA. 87: 2264-2268 (1990), Karlin S, Altschul SF. “Applications and statisticsfor multipl
e high-scoring segments in molecular sequences. "NatlAcad Sci USA. 90: 5873-7 (1993)). A program called BLASTX based on such BLAST algorithm has been developed. Specific methods of these analysis methods are publicly known. The National Center of Biotechnology Information (NCBI) website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) may be referred to.

本明細書において、保存的置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換技術にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ−分枝側鎖を有するアミノ酸残基、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。 As used herein, conservative substitution means that an amino acid residue is substituted with an amino acid residue having a similar side chain. For example, substitution with amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine is a conservative substitution technique. In addition, amino acid residues having acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid; amino acid residues having non-charged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, and cysteine; alanine, valine, leucine, isoleucine, Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, and tryptophan; amino acid residues with β-branched side chains such as threonine, valine, and isoleucine, and aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, and histidine Similarly, substitutions between amino acid residues are conservative substitutions.

本明細書において、「細胞からのエクソソーム産生促進剤」とは、細胞から産生されるエクソソーム量を、増加させるための剤を意味する。 In the present specification, the “promoter for exosome production from cells” means an agent for increasing the amount of exosomes produced from cells.

２．エクソソーム産生促進剤
本発明は、アディポネクチン、アディポネクチン発現促進剤、T-カドヘリン発現促進剤、ADAM12発現抑制剤、及びADAM12活性抑制剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有する、細胞からのエクソソーム産生促進剤（本明細書において、「本発明のエクソソーム産生促進剤」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。 2. Exosome production promoter The present invention relates to an exosome from a cell comprising at least one selected from the group consisting of adiponectin, adiponectin expression promoter, T-cadherin expression promoter, ADAM12 expression inhibitor, and ADAM12 activity inhibitor. The present invention relates to a production promoter (also referred to herein as “the exosome production promoter of the present invention”). This will be described below.

アディポネクチンとしては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のアディポネクチンを採用することができる。中でも、エクソソーム産生促進対象細胞が由来する生物種のアディポネクチンが好ましい。 As adiponectin, for example, adiponectin derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, rabbits and the like can be employed. Among them, adiponectin of a biological species from which the exosome production promotion target cell is derived is preferable.

種々の生物種由来アディポネクチンのアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトアディポネクチンとしては配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_001171271.1又はNP_004788.1）が挙げられ、マウスアディポネクチンとしては配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_033735.3）等が挙げられる。また、アディポネクチンは、N末シグナルペプチドが欠失したものであってもよい。 The amino acid sequences of various species-derived adiponectin are known. Specifically, for example, human adiponectin includes a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (NCBI Reference Sequence: NP_001171271.1 or NP_004788.1), and mouse adiponectin includes the amino acid shown in SEQ ID NO: 2. Examples thereof include a protein consisting of a sequence (NCBI Reference Sequence: NP_033735.3). Further, adiponectin may be one in which the N-terminal signal peptide is deleted.

アディポネクチンは、T-カドヘリン結合能を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。変異としては、T-カドヘリン結合能がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。 Adiponectin may have mutations such as amino acid substitution, deletion, addition and insertion as long as it has T-cadherin binding ability. The mutation preferably includes substitution, more preferably conservative substitution, from the viewpoint that the ability to bind T-cadherin is less likely to be impaired.

アディポネクチンの好ましい具体例としては、下記（a）に記載するタンパク質及び下記（b）に記載するタンパク質：
（a）配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（b）配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つT-カドヘリン結合能を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。 Preferred specific examples of adiponectin include the protein described in the following (a) and the protein described in the following (b):
(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and (b) an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2, and T-cadherin binding And at least one selected from the group consisting of functional proteins.

上記（b）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上である。 In the above (b), the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more.

T-カドヘリン結合能の有無は、公知の方法に従って又は準じて判定することができる。例えば、T-カドヘリンを過剰発現する細胞、及びT-カドヘリンをノックダウンした細胞に、判定対象タンパク質（アディポネクチン変異体）を接触させた後、細胞を洗浄してから溶解し、溶解液に含まれる判定対象タンパク質の量を測定した結果、該量が細胞のT-カドヘリンの量に依存していれば、判定対象タンパク質はT-カドヘリン結合能を有すると判定することができる。 The presence or absence of T-cadherin binding ability can be determined according to or according to a known method. For example, a target protein (adiponectin mutant) is brought into contact with a cell overexpressing T-cadherin and a cell knocked down with T-cadherin, and the cell is washed and lysed. As a result of measuring the amount of the protein to be determined, if the amount depends on the amount of T-cadherin in the cell, it can be determined that the protein to be determined has T-cadherin binding ability.

上記（b）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（b’）配列番号1又は2に示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つT-カドヘリン結合能を有するタンパク質が挙げられる。 As an example of the protein described in the above (b), for example, (b ′) an amino acid in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 Examples of the protein include a sequence and a T-cadherin binding ability.

上記（b’）において、複数個とは、例えば2〜30個であり、好ましくは2〜20個であり、より好ましくは2〜15個であり、よりさらに好ましくは2〜10個であり、よりさらに好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。 In the above (b ′), the plurality is, for example, 2 to 30, preferably 2 to 20, more preferably 2 to 15, and still more preferably 2 to 10, More preferably, it is 2-5, and still more preferably 2 or 3.

血中において、アディポネクチンは、通常、3量体、6量体、18量体の3種類の分子種として存在していることが知られている。本発明において、アディポネクチンには、これらのマルチマーも包含される。なお、限定的な解釈を望むものではないが、アディポネクチンによるエクソソーム産生促進は、細胞膜上のT-カドヘリンへのアディポネクチンの結合により該結合部を中心とした凝集が起こることに起因すると考えられる。この観点から、アディポネクチンは、より凝集を起こし易いと考えられる比較的大きな分子集合体であることが好ましく、例えば6量体、18量体、より好ましくは18量体である。 It is known that adiponectin usually exists as three types of molecular species in the blood: trimer, hexamer, and 18mer. In the present invention, adiponectin also includes these multimers. Although a limited interpretation is not desired, it is considered that the promotion of exosome production by adiponectin is caused by aggregation centering on the binding site due to the binding of adiponectin to T-cadherin on the cell membrane. From this viewpoint, adiponectin is preferably a relatively large molecular assembly that is considered to be more likely to cause aggregation, for example, a hexamer, an 18-mer, and more preferably an 18-mer.

アディポネクチンは、T-カドヘリン結合能を有する限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。 Adiponectin may be chemically modified as long as it has T-cadherin binding ability.

アディポネクチンは、C末端がカルボキシル基（−COOH）、カルボキシレート（−COO⁻）、アミド（−CONH₂）またはエステル（−COOR）の何れであってもよい。 Adiponectin may have any of a carboxyl group (—COOH), a carboxylate (—COO ⁻ ), an amide (—CONH ₂ ), or an ester (—COOR) at the C-terminus.

ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、n−ブチルなどのC₁₋₆アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC₃₋₈シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのC₆₋₁₂アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−C₁₋₂アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C₁₋₂アルキル基などのC₇₋₁₄アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。 Here, as R in the ester, for example, a C _1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl; for example, a C _3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl; C _6-12 aryl groups such as α-naphthyl; phenyl-C _1-2 alkyl groups such as benzyl and phenethyl; C _7- such as α-naphthyl-C _1-2 alkyl groups such as α-naphthylmethyl; ₁₄ aralkyl group; pivaloyloxymethyl group is used.

アディポネクチンは、Ｃ末端以外のカルボキシル基（またはカルボキシレート）が、アミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。 In adiponectin, a carboxyl group (or carboxylate) other than the C-terminus may be amidated or esterified. As the ester in this case, for example, the above C-terminal ester or the like is used.

さらに、アディポネクチンには、N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC₁₋₆アルカノイルなどのC₁₋₆アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC₁₋₆アルカノイル基などのC₁₋₆アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。 Furthermore, in adiponectin, the amino group of the amino acid residue at the N-terminal is protected with a protecting group (for example, a C _1-6 acyl group such as C _1-6 alkanoyl such as formyl group, acetyl group, etc.), N-terminal glutamine residue that can be cleaved in vivo is pyroglutamine oxidized, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, indole group, A guanidino group or the like protected with an appropriate protecting group (for example, a C _1-6 acyl group such as a C _1-6 alkanoyl group such as a formyl group or an acetyl group), or a so-called sugar having a sugar chain bound thereto Complex proteins such as proteins are also included.

アディポネクチンは、T-カドヘリン結合能を有する限りにおいて、公知のタンパク質タグが付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばヒスチジンタグ、FLAGタグ、GSTタグ等が挙げられる。 Adiponectin may have a known protein tag added as long as it has T-cadherin binding ability. Examples of protein tags include histidine tags, FLAG tags, GST tags, and the like.

アディポネクチンは、酸または塩基との薬学的に許容される塩の形態であってもよい。塩は、薬学的に許容される塩である限り特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。例えば酸性塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、塩基性塩の例として、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。 Adiponectin may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base. The salt is not particularly limited as long as it is a pharmaceutically acceptable salt, and either an acidic salt or a basic salt can be employed. Examples of acid salts include inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, apple Organic acid salts such as acid salts, citrate salts, methanesulfonate salts, paratoluenesulfonate salts; and amino acid salts such as aspartate salts and glutamate salts. Examples of basic salts include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts.

アディポネクチンは、溶媒和物の形態であってもよい。溶媒は、薬学的に許容されるものであれば特に限定されず、例えば水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。 Adiponectin may be in the form of a solvate. The solvent is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.

アディポネクチンは、公知の方法に従って、例えば化学合成、哺乳動物の細胞又は組織（例えば血清等）からの精製、アディポネクチンをコードするポリヌクレオチドを含有する形質転換体からの精製等によって得ることができる。形質転換体からの精製により得る場合、形質転換体としては、アディポネクチンをコードするポリヌクレオチドからアディポネクチンを発現させることができる細胞である限り特に限定されず、大腸菌などの細菌、昆虫細胞、哺乳類細胞等の種々の細胞を利用することができる。 Adiponectin can be obtained according to known methods, for example, by chemical synthesis, purification from mammalian cells or tissues (for example, serum), purification from a transformant containing a polynucleotide encoding adiponectin, and the like. When obtained by purification from a transformant, the transformant is not particularly limited as long as it is a cell capable of expressing adiponectin from a polynucleotide encoding adiponectin, and bacteria such as E. coli, insect cells, mammalian cells, etc. A variety of cells can be used.

昆虫細胞としては、例えば、Sf細胞、MG1細胞、High Five^TM細胞、BmN細胞などが用いられる。Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。 As insect cells, for example, Sf cells, MG1 cells, High Five ^™ cells, BmN cells and the like are used. As Sf cells, for example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells and the like are used.

動物細胞としては、例えば、サルCOS−7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター細胞CHO、マウスL細胞、マウスAtT−20細胞、マウスミエローマ細胞、ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などが用いられる。 Examples of animal cells include monkey COS-7 cells, monkey Vero cells, Chinese hamster cells CHO, mouse L cells, mouse AtT-20 cells, mouse myeloma cells, rat GH3 cells, and human FL cells.

アディポネクチン発現促進剤は、細胞から分泌されるアディポネクチン量を増加させることができる限りにおいて特に制限されない。 The adiponectin expression promoter is not particularly limited as long as it can increase the amount of adiponectin secreted from cells.

アディポネクチン発現促進剤としては、例えばアディポネクチンの発現ベクターが挙げられる。アディポネクチンの発現ベクターは、アディポネクチンが発現可能な状態で組み込まれている限りにおいて特に限定されない。典型的には、アディポネクチンの発現ベクターは、プロモーター配列、及びアディポネクチンコード配列（必要に応じて、さらに転写終結シグナル配列）を含むポリヌクレオチドを含む。 Examples of the adiponectin expression promoter include an adiponectin expression vector. The adiponectin expression vector is not particularly limited as long as it is incorporated in a state in which adiponectin can be expressed. Typically, an adiponectin expression vector comprises a promoter sequence and a polynucleotide comprising an adiponectin coding sequence (and optionally a transcription termination signal sequence).

発現ベクターは、特に制限されず、例えば動物細胞発現プラスミド等のプラスミドベクター；レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター等が挙げられる。 The expression vector is not particularly limited, and examples thereof include plasmid vectors such as animal cell expression plasmids; virus vectors such as retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, herpesviruses, and Sendai viruses.

プロモーターは、特に制限されず、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター、hTERTプロモーター、βアクチンプロモーター、CAGプロモーター等が挙げられる。 The promoter is not particularly limited, and examples thereof include CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter, hTERT promoter, β-actin promoter, CAG promoter and the like.

発現ベクターは、上記以外にも、発現ベクターが含み得る他のエレメントを含んでいてもよい。他のエレメントとしては、例えば複製基点や薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。薬剤耐性遺伝子は、特に制限されないが、例えばクロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。 In addition to the above, the expression vector may contain other elements that the expression vector can contain. Examples of other elements include a replication base and a drug resistance gene. The drug resistance gene is not particularly limited, but for example, chloramphenicol resistance gene, tetracycline resistance gene, neomycin resistance gene, erythromycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, hygromycin resistance gene, puromycin resistance gene, etc. Is mentioned.

アディポネクチンの発現ベクターは、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に得ることができる。例えば、PCR、制限酵素切断、DNA連結技術等を利用して作製することができる。 An adiponectin expression vector can be easily obtained according to a known genetic engineering technique. For example, it can be prepared using PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, and the like.

アディポネクチン発現促進剤の別の例としては、アディポネクチンの転写活性化因子（例えばPPARγ）及びその発現ベクター、アディポネクチンの転写を活性化できる低分子化合物（例えば、PPARγ転写活性化能を有するチアゾリジン誘導体等）等が挙げられる。発現ベクターの態様については、上記アディポネクチンの発現ベクターと同様である。 As another example of an adiponectin expression promoter, adiponectin transcription activator (eg, PPARγ) and its expression vector, low molecular weight compound capable of activating transcription of adiponectin (eg, thiazolidine derivative having PPARγ transcription activation ability, etc.) Etc. The embodiment of the expression vector is the same as that of the adiponectin expression vector.

T-カドヘリン発現促進剤は、エクソソーム産生促進対象細胞が発現するT-カドヘリン量を増加させることができる限りにおいて特に制限されない。 The T-cadherin expression promoter is not particularly limited as long as the amount of T-cadherin expressed by the exosome production promotion target cell can be increased.

T-カドヘリンとしては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類由来のT-カドヘリンを採用することができる。中でも、エクソソーム産生促進対象細胞が由来する生物種のT-カドヘリンが好ましい。 As T-cadherin, for example, T-cadherins derived from various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats and rabbits can be employed. Among them, T-cadherin, a biological species from which the exosome production promotion target cell is derived, is preferable.

種々の生物種由来T-カドヘリンのアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトT-カドヘリンとしては配列番号3〜8のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_001207417.1、NP_001207418.1、NP_001207419.1、NP_001207420.1、NP_001207421.1、又はNP_001248.1）が挙げられ、マウスT-カドヘリンとしては配列番号9に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_062681.2）等が挙げられる。また、T-カドヘリンは、N末シグナルペプチドが欠失したものであってもよい。 The amino acid sequences of T-cadherin derived from various species are known. Specifically, for example, human T-cadherin is a protein consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 8 (NCBI Reference Sequence: NP_001207417.1, NP_001207418.1, NP_001207419.1, NP_001207420.1, NP_001207421.1 or NP_001248.1), and examples of mouse T-cadherin include a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 (NCBI Reference Sequence: NP_062681.2). Further, T-cadherin may be one lacking the N-terminal signal peptide.

T-カドヘリンは、アディポネクチン結合能を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。変異としては、アディポネクチン結合能がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。 T-cadherin may have mutations such as amino acid substitution, deletion, addition, and insertion as long as it has adiponectin binding ability. The mutation preferably includes substitution, more preferably conservative substitution, from the viewpoint that the adiponectin binding ability is less likely to be impaired.

T-カドヘリンの好ましい具体例としては、下記（c）に記載するタンパク質及び下記（d）に記載するタンパク質：
（c）配列番号3〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（d）配列番号3〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つアディポネクチン結合能を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。 Preferred specific examples of T-cadherin include the proteins described in the following (c) and the proteins described in the following (d):
(C) a protein comprising the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 9, and (d) an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 3 to 9 And at least one selected from the group consisting of proteins having adiponectin binding ability.

上記（d）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上である。 In the above (d), the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more.

アディポネクチン結合能の有無は、公知の方法に従って又は準じて判定することができる。例えば、T-カドヘリンノックアウト細胞、及び該細胞に判定対象タンパク質（T-カドヘリン変異体）を過剰発現させた細胞に、アディポネクチンを接触させた後、細胞を洗浄してから溶解し、溶解液に含まれるアディポネクチンの量を測定した結果、該量が細胞の判定対象タンパク質（T-カドヘリン変異体）の量に依存していれば、判定対象タンパク質はアディポネクチン結合能を有すると判定することができる。 The presence or absence of adiponectin binding ability can be determined according to or according to a known method. For example, adiponectin is contacted with T-cadherin knockout cells and cells overexpressed with the target protein (T-cadherin mutant), and the cells are washed and lysed. As a result of measuring the amount of adiponectin to be determined, if the amount depends on the amount of the protein to be determined (T-cadherin mutant), it can be determined that the protein to be determined has adiponectin binding ability.

上記（d）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（d’）配列番号3〜9のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つアディポネクチン結合能を有するタンパク質が挙げられる。 As an example of the protein described in the above (d), for example, (d ′) one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 3 to 9 And a protein having an adiponectin binding ability.

上記（d’）において、複数個とは、例えば2〜100個であり、好ましくは2〜50個であり、より好ましくは2〜15個であり、よりさらに好ましくは2〜10個であり、よりさらに好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。 In the above (d ′), the plurality is, for example, 2 to 100, preferably 2 to 50, more preferably 2 to 15, and still more preferably 2 to 10, More preferably, it is 2-5, and still more preferably 2 or 3.

T-カドヘリン発現促進剤としては、例えばT-カドヘリンの発現ベクターが挙げられる。 Examples of T-cadherin expression promoters include T-cadherin expression vectors.

T-カドヘリン発現促進剤の別の例としては、T-カドヘリンの転写活性化因子、その発現ベクター、T-カドヘリンの転写を活性化できる低分子化合物等が挙げられる。発現ベクターの態様については、上記アディポネクチンの発現ベクターと同様である。 Other examples of T-cadherin expression promoters include T-cadherin transcription activators, expression vectors thereof, and low molecular weight compounds that can activate T-cadherin transcription. The embodiment of the expression vector is the same as that of the adiponectin expression vector.

ADAM12発現抑制剤は、エクソソーム産生促進対象細胞が発現するADAM12量を減少させることができる限りにおいて特に制限されない。 The ADAM12 expression inhibitor is not particularly limited as long as the amount of ADAM12 expressed by the exosome production promotion target cell can be reduced.

ADAM12は、エクソソーム産生促進対象細胞が発現しているADAM12である。よって、該細胞が由来する生物種に応じて、ADAM12が由来する生物種も変わる。該生物種としては、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類が挙げられる。 ADAM12 is ADAM12 expressed in exosome production target cells. Therefore, the biological species from which ADAM12 is derived varies depending on the biological species from which the cells are derived. Examples of the biological species include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits.

種々の生物種由来ADAM12のアミノ酸配列は公知である。具体的には、例えば、ヒトADAM12としては配列番号10〜14のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_001275902.1、NP_001275903.1、NP_001275904.1、NP_003465.3、又はNP_067673.2）が挙げられ、マウスADAM12としては配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（NCBI Reference Sequence：NP_031426.2）等が挙げられる。また、ADAM12は、N末シグナルペプチドが欠失したものであってもよい。 The amino acid sequences of ADAM12 derived from various biological species are known. Specifically, for example, human ADAM12 is a protein consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10 to 14 (NCBI Reference Sequence: NP_001275902.1, NP_001275903.1, NP_001275904.1, NP_003465.3, or NP_067673 2), and examples of mouse ADAM12 include a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 (NCBI Reference Sequence: NP — 031426.2). ADAM12 may be one in which the N-terminal signal peptide is deleted.

ADAM12は、マトリックスメタロプロテアーゼ活性を有する限りにおいて、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異を有していてもよい。変異としては、マトリックスメタロプロテアーゼ活性がより損なわれ難いという観点から、好ましくは置換、より好ましくは保存的置換が挙げられる。 ADAM12 may have mutations such as amino acid substitution, deletion, addition, and insertion as long as it has matrix metalloprotease activity. The mutation preferably includes substitution, more preferably conservative substitution, from the viewpoint that the matrix metalloprotease activity is less likely to be impaired.

ADAM12の好ましい具体例としては、下記（e）に記載するタンパク質及び下記（f）に記載するタンパク質：
（e）配列番号10〜15のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（f）配列番号10〜15のいずれかに示されるアミノ酸配列と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つマトリックスメタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質
からなる群より選択される少なくとも１種が挙げられる。 Preferred specific examples of ADAM12 include proteins described in (e) below and proteins described in (f) below:
(E) a protein comprising the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10 to 15, and (f) an amino acid sequence having 85% or more identity with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10 to 15 And at least one selected from the group consisting of proteins having matrix metalloprotease activity.

上記（f）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上である。 In the above (f), the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.

メタロプロテアーゼ活性の有無は、公知の方法に従って又は準じて判定することができる。 The presence or absence of metalloprotease activity can be determined according to or according to a known method.

上記（f）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（f’）配列番号10〜15のいずれかに示されるアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つマトリックスメタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。 As an example of the protein described in the above (f), for example, (f ′) one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 10 to 15 And a protein having a matrix metalloprotease activity.

上記（f’）において、複数個とは、例えば2〜130個であり、好ましくは2〜70個であり、より好ましくは2〜30個であり、よりさらに好ましくは2〜10個であり、よりさらに好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。 In the above (f ′), the plurality is, for example, 2 to 130, preferably 2 to 70, more preferably 2 to 30, even more preferably 2 to 10, More preferably, it is 2-5, and still more preferably 2 or 3.

ADAM12発現抑制剤としては、例えばADAM12特異的siRNA、ADAM12特異的miRNA、ADAM12特異的アンチセンス核酸、これらの発現ベクター等が挙げられる。 Examples of the ADAM12 expression inhibitor include ADAM12-specific siRNA, ADAM12-specific miRNA, ADAM12-specific antisense nucleic acid, and expression vectors thereof.

ADAM12特異的siRNAは、ADAM12をコードする遺伝子の発現を特異的に抑制する二本鎖RNA分子である限り特に制限されない。一実施形態において、siRNAは、例えば、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、又は21塩基以上の長さであることが好ましい。siRNAは、例えば、25塩基以下、24塩基以下、23塩基以下、又は22塩基以下の長さであることが好ましい。ここに記載するsiRNAの長さの上限値及び下限値は任意に組み合わせることが想定される。例えば、下限が18塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ、下限が19塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ、下限が20塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さ、下限が21塩基であり、上限が25塩基、24塩基、23塩基、又は22塩基である長さが想定される。 The ADAM12-specific siRNA is not particularly limited as long as it is a double-stranded RNA molecule that specifically suppresses the expression of the gene encoding ADAM12. In one embodiment, the siRNA is preferably 18 or more bases, 19 or more bases, 20 or more bases, or 21 or more bases in length, for example. For example, the siRNA preferably has a length of 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, or 22 bases or less. It is assumed that the upper limit value and the lower limit value of the siRNA length described here are arbitrarily combined. For example, the lower limit is 18 bases, the upper limit is 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases, the lower limit is 19 bases, and the upper limit is 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases Length, lower limit is 20 bases, upper limit is 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 bases, lower limit is 21 bases, upper limit is 25 bases, 24 bases, 23 bases, or 22 A length that is a base is assumed.

siRNAは、shRNA(small hairpin RNA)であっても良い。shRNAは、その一部がステムループ構造を形成するように設計することができる。例えば、shRNAは、ある領域の配列を配列aとし、配列aに対する相補鎖を配列bとすると、配列a、スペーサー、配列bの順になるようにこれらの配列が一本のRNA鎖に存在するようにし、全体で45〜60塩基の長さとなるように設計することができる。配列aは、標的となるADAM12をコードする塩基配列の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されず、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列aの長さは19〜25塩基、好ましくは19〜21塩基である。 The siRNA may be shRNA (small hairpin RNA). shRNA can be designed so that a part thereof forms a stem-loop structure. For example, if the sequence of a certain region is a sequence a and the complementary strand to the sequence a is a sequence b, these sequences are present in a single RNA strand in the order of sequence a, spacer, and sequence b. And can be designed to have a total length of 45-60 bases. The sequence a is a sequence of a partial region of the base sequence encoding ADAM12 as a target, and the target region is not particularly limited, and any region can be a candidate. The length of the sequence a is 19 to 25 bases, preferably 19 to 21 bases.

ADAM12特異的siRNAは、5’又は3’末端に、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常2〜4塩基程度である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いると核酸の安定性を向上させることができる場合がある。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 ADAM12-specific siRNA may have additional bases at the 5 'or 3' end. The length of the additional base is usually about 2 to 4 bases. The additional base may be DNA or RNA, but the use of DNA may improve the stability of the nucleic acid. Examples of such additional base sequences include ug-3 ', uu-3', tg-3 ', tt-3', ggg-3 ', guuu-3', gttt-3 ', ttttt-3 Examples include, but are not limited to, ', uuuuu-3'.

siRNAは、3'末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、具体的には、dTdT（dTはデオキシリボ核酸を表わす）を付加したものが挙げられる。また、末端付加がない平滑末端（ブラントエンド）であってもよい。siRNAは、センス鎖とアンチセンス鎖が異なる塩基数であってもよく、例えば、アンチセンス鎖が3'末端及び5'末端に突出部配列（オーバーハング）を有している「aiRNA」を挙げることができる。典型的なaiRNAは、アンチセンス鎖が21塩基からなり、センス鎖が15塩基からなり、アンチセンス鎖の両端で各々３塩基のオーバーハング構造をとる。 The siRNA may have a protruding portion sequence (overhang) at the 3 ′ end, and specifically includes those to which dTdT (dT represents deoxyribonucleic acid) is added. Further, it may be a blunt end (blunt end) without end addition. The siRNA may have a different number of bases in the sense strand and the antisense strand, for example, “aiRNA” in which the antisense strand has a protruding sequence (overhang) at the 3 ′ end and the 5 ′ end. be able to. A typical aiRNA has an antisense strand consisting of 21 bases, a sense strand consisting of 15 bases, and has an overhang structure of 3 bases at each end of the antisense strand.

ADAM12特異的siRNAの標的配列の位置は特に制限されるわけではないが、一実施形態において、5’-UTR及び開始コドンから約50塩基まで、並びに3’-UTR以外の領域から標的配列を選択することが望ましい。選択された標的配列の候補群について、標的以外のmRNAにおいて16-17塩基の連続した配列に相同性がないかどうかを、BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）等のホモロジー検索ソフトを用いて調べ、選択した標的配列の特異性を確認することが好ましい。特異性が確認された標的配列について、AA（もしくはNA）以降の19-21塩基にTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するセンス鎖と、該19−21塩基に相補的な配列及びTTもしくはUUの3’末端オーバーハングを有するアンチセンス鎖とからなる2本鎖RNAをsiRNAとして設計してもよい。また、siRNAの前駆体であるショートヘアピンRNA（shRNA）は、ループ構造を形成しうる任意のリンカー配列（例えば、5-25塩基程度）を適宜選択し、上記センス鎖とアンチセンス鎖とを該リンカー配列を介して連結することにより設計することができる。 The position of the target sequence of the ADAM12-specific siRNA is not particularly limited, but in one embodiment, the target sequence is selected from the 5′-UTR and the start codon to about 50 bases and from a region other than the 3′-UTR. It is desirable to do. For the selected target sequence candidate group, whether or not there is homology in the 16-17 base sequence in the non-target mRNA is determined by BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ It is preferable to check the specificity of the selected target sequence by using a homology search software such as For the target sequence whose specificity has been confirmed, a sense strand having a 3 ′ end overhang of TT or UU at 19-21 bases after AA (or NA), a sequence complementary to the 19-21 bases and TT or A double-stranded RNA consisting of an antisense strand having a 3 ′ end overhang of UU may be designed as an siRNA. In addition, for short hairpin RNA (shRNA) which is a precursor of siRNA, an arbitrary linker sequence (for example, about 5-25 bases) capable of forming a loop structure is appropriately selected, and the sense strand and the antisense strand are combined with each other. It can be designed by linking via a linker sequence.

siRNA及び／又はshRNAの配列は、種々のwebサイト上に無料で提供される検索ソフトを用いて検索が可能である。このようなサイトとしては、例えば、以下を挙げることができる。
Ambionが提供するsiRNA Target Finder
（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/siRNA_finder.html）pSilencer（登録商標）Expression Vector用インサートデザインツール（http://www.ambion.com/jp/techlib/misc/psilencer_converter.html）RNAi Codexが提供するGeneSeer
（http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi）。 The sequence of siRNA and / or shRNA can be searched using search software provided free of charge on various websites. Examples of such sites include the following.
SiRNA Target Finder provided by Ambion
(Http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html) Insert design tool for pSilencer (R) Expression Vector (http://www.ambion.com/techlib/misc/psilencer_converter .html) GeneSeer provided by RNAi Codex
(Http://codex.cshl.edu/scripts/newsearchhairpin.cgi).

siRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これを、ダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。 siRNA is synthesized by each of the sense strand and antisense strand of the target sequence on the mRNA with a DNA / RNA automatic synthesizer, denatured at about 90 to about 95 ° C. for about 1 minute in an appropriate annealing buffer, It can be prepared by annealing at about 30 to about 70 ° C. for about 1 to about 8 hours. It can also be prepared by synthesizing a short hairpin RNA (shRNA) serving as a precursor of siRNA and cleaving it with a dicer.

ADAM12特異的miRNAは、ADAM12をコードする遺伝子の翻訳を阻害する限り任意である。例えば、miRNA（マイクロRNA）は、siRNAのように標的mRNAを切断するのではなく、標的の3’非翻訳領域（UTR）に対合してその翻訳を阻害してもよい。miRNAは、pri-miRNA（primary miRNA）、pre-miRNA、及び成熟miRNAのいずれでもよい。miRNAの長さは特に制限されず、pri-miRNAの長さは通常数百〜数千塩基であり、pre-miRNAの長さは通常50〜80塩基であり、成熟miRNAの長さは通常18〜30塩基である。一実施形態において、ADAM12特異的miRNAは、好ましくはpre-miRNA又は成熟miRNAであり、より好ましくは成熟miRNAである。このようなADAM12特異的miRNAは、公知の手法で合成してもよく、合成RNAを提供する会社から購入してもよい。 ADAM12-specific miRNA is optional as long as it inhibits translation of the gene encoding ADAM12. For example, miRNA (microRNA) may pair with the 3 'untranslated region (UTR) of the target and inhibit its translation, rather than cleaving the target mRNA like siRNA. The miRNA may be any of pri-miRNA (primary miRNA), pre-miRNA, and mature miRNA. The length of miRNA is not particularly limited, the length of pri-miRNA is usually several hundred to several thousand bases, the length of pre-miRNA is usually 50 to 80 bases, and the length of mature miRNA is usually 18 ~ 30 bases. In one embodiment, the ADAM12 specific miRNA is preferably a pre-miRNA or a mature miRNA, more preferably a mature miRNA. Such ADAM12-specific miRNA may be synthesized by a known technique or purchased from a company that provides synthetic RNA.

ADAM12特異的アンチセンス核酸とは、ADAM12をコードする遺伝子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含む核酸であって、該mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、ADAM12タンパク質合成を抑制する機能を有する核酸である。アンチセンス核酸はDNA、RNA、DNA/RNAキメラのいずれでもよい。アンチセンス核酸がDNAの場合、標的RNAとアンチセンスDNAとによって形成されるRNA:DNAハイブリッドは、内在性RNase Hに認識されて標的RNAの選択的な分解を引き起こす。したがって、RNase Hによる分解を指向するアンチセンスDNAの場合、標的配列は、mRNA中の配列だけでなく、ADAM12遺伝子の初期翻訳産物におけるイントロン領域の配列であってもよい。イントロン配列は、ゲノム配列と、ADAM12遺伝子のcDNA塩基配列とをBLAST、FASTA等のホモロジー検索プログラムを用いて比較することにより、決定することができる。 An ADAM12-specific antisense nucleic acid is a nucleic acid comprising a base sequence complementary to or substantially complementary to the base sequence of mRNA of the gene encoding ADAM12 or a part thereof, which is specific and stable to the mRNA. It is a nucleic acid having a function of suppressing ADAM12 protein synthesis by forming a double chain and binding. The antisense nucleic acid may be any of DNA, RNA, and DNA / RNA chimera. When the antisense nucleic acid is DNA, the RNA: DNA hybrid formed by the target RNA and the antisense DNA is recognized by endogenous RNase H and causes selective degradation of the target RNA. Therefore, in the case of antisense DNA directed to degradation by RNase H, the target sequence may be not only the sequence in mRNA but also the sequence of the intron region in the initial translation product of ADAM12 gene. The intron sequence can be determined by comparing the genomic sequence and the cDNA base sequence of the ADAM12 gene using a homology search program such as BLAST or FASTA.

ADAM12特異的アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてADAM12タンパク質への翻訳が阻害されるものであればその長さは制限されない。ADAM12特異的アンチセンス核酸は、ADAM12をコードするmRNAの全配列であっても部分配列であってもよい。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、これらに限定されない。具体的には、ADAM12遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域または3’端ヘアピンループなどをアンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。 The length of the target region of the ADAM12-specific antisense nucleic acid is not limited as long as the antisense nucleic acid hybridizes and as a result, translation into the ADAM12 protein is inhibited. The ADAM12-specific antisense nucleic acid may be the entire sequence or partial sequence of mRNA encoding ADAM12. In view of easiness of synthesis, antigenicity, intracellular migration, and the like, an oligonucleotide consisting of about 10 to about 40 bases, particularly about 15 to about 30 bases is preferable, but is not limited thereto. Specifically, 5 'end hairpin loop of ADAM12 gene, 5' end untranslated region, translation start codon, protein coding region, ORF translation stop codon, 3 'end untranslated region, 3' end palindromic region or 3 ' An end hairpin loop or the like can be selected as a preferred target region of the antisense nucleic acid, but is not limited thereto.

ADAM12特異的アンチセンス核酸は、ADAM12遺伝子のmRNAや初期転写産物とハイブリダイズしてタンパク質への翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるこれらの遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、RNAへの転写を阻害し得るもの（アンチジーン）であってもよい。 ADAM12-specific antisense nucleic acids not only hybridize with ADAM12 gene mRNA and early transcription products to inhibit translation into proteins, but also bind to these double-stranded DNA genes to form triplex (triplex). ) And can inhibit transcription to RNA (antigene).

上記したADAM12特異的siRNA、ADAM12特異的miRNA、及びADAM12特異的アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、安定性（化学的および／または対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含んでもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス核酸を構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS)、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各ヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（R=CH3（2’-O-Me）、CH2CH2OCH3（2’-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、又はCH2CH2CN等）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換等を施してもよい。また、siRNAやmiRNAを構成するヌクレオチド分子の一部は、天然型のDNAに置換されていてもよい。 The nucleotide molecules that make up the ADAM12-specific siRNA, ADAM12-specific miRNA, and ADAM12-specific antisense nucleic acid improve stability (chemical and / or enzyme) and specific activity (affinity with RNA). Therefore, various chemical modifications may be included. For example, in order to prevent degradation by a hydrolase such as nuclease, the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide constituting the antisense nucleic acid is chemically modified, for example, phosphorothioate (PS), methylphosphonate, phosphorodithionate, etc. It can be substituted with a phosphate residue. In addition, the 2′-position hydroxyl group of the sugar (ribose) of each nucleotide is represented by —OR (R = CH 3 (2′-O-Me), CH 2 CH 2 OCH 3 (2′-O-MOE), CH 2 CH 2 NHC (NH) NH 2, CH 2 CONHCH 3, Or CH2CH2CN, etc.). Furthermore, the base moiety (pyrimidine, purine) may be chemically modified, for example, introduction of a methyl group or cationic functional group at the 5-position of the pyrimidine base, or substitution of the carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl, etc. May be applied. Moreover, a part of nucleotide molecules constituting siRNA or miRNA may be replaced with natural DNA.

ADAM12特異的siRNA、ADAM12特異的miRNA、及びADAM12特異的アンチセンス核酸等は、ADAM12遺伝子のcDNA配列もしくはゲノミックDNA配列に基づいてmRNAもしくは初期転写産物の標的配列を決定し、市販のDNA/RNA自動合成機を用いて、これに相補的な配列を合成することにより調製することができる。また、上記した各種修飾を含むアンチセンス核酸も、いずれも自体公知の手法により、化学的に合成することができる。 ADAM12-specific siRNA, ADAM12-specific miRNA, ADAM12-specific antisense nucleic acid, etc., determine the target sequence of mRNA or initial transcript based on the cDNA sequence or genomic DNA sequence of ADAM12 gene, and commercial DNA / RNA automatic It can be prepared by synthesizing a sequence complementary to this using a synthesizer. In addition, any of the above-described antisense nucleic acids containing various modifications can be chemically synthesized by a method known per se.

ADAM12特異的siRNA、ADAM12特異的miRNA、又はADAM12特異的アンチセンス核酸の発現ベクターについては、上記アディポネクチンの発現ベクターと同様である。なお、発現ベクターのプロモーターとしては、アディポネクチンの発現ベクターのようにpolII系プロモーターを使用することもできるが、短いRNAの転写を正確に行わせるために、polIII系プロモーターを使用することが好ましい。polIII系プロモーターとしては、例えばマウスおよびヒトのU6-snRNAプロモーター、ヒトH1-RNase P RNAプロモーター、ヒトバリン-tRNAプロモーター等が挙げられる。 The expression vector for ADAM12-specific siRNA, ADAM12-specific miRNA, or ADAM12-specific antisense nucleic acid is the same as the adiponectin expression vector. As the promoter of the expression vector, a polII promoter can be used as in the adiponectin expression vector, but it is preferable to use a polIII promoter in order to accurately transcribe short RNAs. Examples of the polIII promoter include mouse and human U6-snRNA promoter, human H1-RNase P RNA promoter, human valine-tRNA promoter, and the like.

ADAM12発現抑制剤の別の例としては、ADAM12特異的リボザイム等が挙げられる。「リボザイム」とは、狭義には、核酸を切断する酵素活性を有するRNAを意味するが、本書では配列特異的な核酸切断活性を有する限りDNAをも包含する。リボザイム核酸として最も汎用性の高いものは、ウイロイドやウイルソイド等の感染性RNAに見られるセルフスプライシングRNAがあり、ハンマーヘッド型やヘアピン型等が知られている。ハンマーヘッド型は約40塩基程度で酵素活性を発揮し、ハンマーヘッド構造をとる部分に隣接する両端の数塩基ずつ（合わせて約10塩基程度）をmRNAの所望の切断部位と相補的な配列にすることにより、標的mRNAのみを特異的に切断することが可能である。このタイプのリボザイム核酸は、RNAのみを基質とするので、ゲノムDNAを攻撃することがないという利点を有する。ADAM12遺伝子のmRNAが自身で二本鎖構造をとる場合には、RNAヘリカーゼと特異的に結合し得るウイルス核酸由来のRNAモチーフを連結したハイブリッドリボザイムを用いることにより、標的配列を一本鎖にすることができる［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98(10): 5572-5577 (2001)］。さらに、リボザイムを、それをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で使用する場合には、転写産物の細胞質への移行を促進するために、tRNAを改変した配列をさらに連結したハイブリッドリボザイムとすることもできる［Nucleic Acids Res., 29(13): 2780-2788 (2001)］。 Another example of the ADAM12 expression inhibitor includes ADAM12-specific ribozyme. “Ribozyme” in a narrow sense means RNA having an enzymatic activity to cleave a nucleic acid, but in this specification, DNA is also included as long as it has a sequence-specific nucleic acid cleaving activity. The most versatile ribozyme nucleic acid is self-splicing RNA found in infectious RNA such as viroid and virusoid, and hammerhead type and hairpin type are known. The hammerhead type exhibits enzyme activity at about 40 bases, and several bases at both ends (about 10 bases in total) adjacent to the part having the hammerhead structure are made complementary to the desired cleavage site of mRNA. By doing so, it is possible to specifically cleave only the target mRNA. This type of ribozyme nucleic acid has an advantage that it does not attack genomic DNA because it uses only RNA as a substrate. When the ADAM12 mRNA itself has a double-stranded structure, the target sequence is made single-stranded by using a hybrid ribozyme linked to an RNA motif derived from a viral nucleic acid that can specifically bind to an RNA helicase. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98 (10): 5572-5577 (2001)]. Furthermore, when ribozymes are used in the form of expression vectors containing the DNA that encodes them, they should be hybrid ribozymes in which tRNA-modified sequences are further linked in order to promote the transfer of transcripts to the cytoplasm. [Nucleic Acids Res., 29 (13): 2780-2788 (2001)].

ADAM12活性抑制剤は、エクソソーム産生促進対象細胞が発現するADAM12のマトリックスメタロプロテアーゼ活性を低下させることができる限りにおいて特に制限されない。 The ADAM12 activity inhibitor is not particularly limited as long as it can reduce the matrix metalloprotease activity of ADAM12 expressed by the exosome production promotion target cell.

ADAM12活性抑制剤としては、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、ADAM12ドミナントネガティブ変異体の発現ベクター、ADAM12中和抗体、ADAM12プロドメインからなるタンパク質及びその発現ベクター等が挙げられる。 Examples of the ADAM12 activity inhibitor include matrix metalloprotease inhibitors, ADAM12 dominant negative mutant expression vectors, ADAM12 neutralizing antibodies, ADAM12 prodomain proteins, and expression vectors thereof.

マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、特に制限されない。該阻害剤としては、例えば、マリマスタット（Marimastat（BB-2516））、AG3340、CGS27023A、Bay 12-9566、Neovastat、BMS 275-291、テトラサイクリン類、Matristatin（三共）、カテキン等が挙げられる。これらの物質は、公知文献に記載された合成方法を参照し、あるいは通常の合成法を用いることにより製造することができ、また、これらの物質の製造、販売、開発会社等から入手することもできる。 The matrix metalloprotease inhibitor is not particularly limited. Examples of the inhibitor include Marimastat (Marimastat (BB-2516)), AG3340, CGS27023A, Bay 12-9566, Neovastat, BMS 275-291, tetracyclines, Matristatin (Sankyo), catechin and the like. These substances can be produced by referring to synthesis methods described in known literature or by using ordinary synthesis methods, and can also be obtained from the manufacture, sales, development companies, etc. of these substances. it can.

ADAM12ドミナントネガティブ変異体は、特に制限されない。該変異体となる変異としては、例えばマウスの場合であれば、配列番号15において349番目のグルタミン酸のグルタミンへの置換が挙げられ、例えばヒトの場合であれば、配列番号10において348番目のグルタミン酸のグルタミンへの置換が挙げられる。ADAM12ドミナントネガティブ変異体は、N末シグナルペプチドが欠失したものであってもよい。 The ADAM12 dominant negative mutant is not particularly limited. Examples of the mutation to be a mutant include substitution of glutamine with the 349th glutamic acid in SEQ ID NO: 15 in the case of a mouse, for example, the 348th glutamic acid in SEQ ID NO: 10 with a human. To glutamine. The ADAM12 dominant negative mutant may have an N-terminal signal peptide deleted.

ADAM12ドミナントネガティブ変異体は、上記以外にも、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異（好ましくは保存的置換）を有していてもよい。 In addition to the above, the ADAM12 dominant negative mutant may have mutations (preferably conservative substitutions) such as amino acid substitution, deletion, addition, and insertion.

ADAM12ドミナントネガティブ変異体の好ましい具体例としては、下記（g）に記載するタンパク質及び下記（h）に記載するタンパク質：
（g）配列番号10において348番目のグルタミン酸がグルタミンへ置換したアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号15において349番目のグルタミン酸がグルタミンへ置換したアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（h）上記（g）のタンパク質と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。 Preferred specific examples of the ADAM12 dominant negative mutant include proteins described in (g) below and proteins described in (h) below:
(G) a protein consisting of an amino acid sequence in which the 348th glutamic acid is substituted with glutamine in SEQ ID NO: 10, a protein consisting of an amino acid sequence in which the 349th glutamic acid is substituted with glutamine in SEQ ID NO: 15, and (h) the above (g) Examples include at least one selected from the group consisting of proteins consisting of amino acid sequences having 85% or more identity with proteins.

上記（h）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上である。 In the above (h), the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.

上記（h）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（h’）上記（g）のタンパク質のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つマトリックスメタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。 Examples of the protein described in (h) above include, for example, (h ′) an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence of the protein in (g) And a protein having matrix metalloprotease activity.

上記（h’）において、複数個とは、例えば2〜130個であり、好ましくは2〜70個であり、より好ましくは2〜30個であり、よりさらに好ましくは2〜10個であり、よりさらに好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。 In the above (h ′), the plurality is, for example, 2 to 130, preferably 2 to 70, more preferably 2 to 30, and still more preferably 2 to 10, More preferably, it is 2-5, and still more preferably 2 or 3.

ADAM12ドミナントネガティブ変異体の発現ベクターの態様については、上記アディポネクチンの発現ベクターと同様である。 The aspect of the expression vector of the ADAM12 dominant negative mutant is the same as that of the above-described adiponectin expression vector.

ADAM12中和抗体は、ADAM12に結合することにより、その抗原が本来有していた機能又は活性を阻害する性質を有する抗体を意味する。ADAM12に対する中和抗体とは、ADAM12に結合することによりADAM12が有するマトリックスメタロプロテアーゼ活性を阻害する性質を有する抗体を言う。 ADAM12 neutralizing antibody means an antibody having the property of inhibiting the function or activity originally possessed by the antigen by binding to ADAM12. The neutralizing antibody against ADAM12 refers to an antibody having a property of inhibiting the matrix metalloprotease activity of ADAM12 by binding to ADAM12.

ADAM12プロドメインからなるタンパク質は、ADAM12の活性を抑制できる限りにおいて特に限定されない。このようなタンパク質は公知であり、例えばScientific Reports | 5:15150 | DOI: 10.1038/srep15150に記載されている。ADAM12プロドメインからなるタンパク質の一例としては、例えばヒトの場合であれば、配列番号13における29〜206番目のアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。 The protein consisting of the ADAM12 prodomain is not particularly limited as long as ADAM12 activity can be suppressed. Such proteins are known and are described, for example, in Scientific Reports | 5: 15150 | DOI: 10.1038 / srep15150. An example of a protein consisting of the ADAM12 prodomain is a protein consisting of the 29th to 206th amino acid sequence in SEQ ID NO: 13, for example, in the case of humans.

ADAM12プロドメインからなるタンパク質は、その機能を保持する限りにおいて、上記以外にも、アミノ酸の置換、欠失、付加、挿入等の変異（好ましくは保存的置換）を有していてもよい。 In addition to the above, the protein comprising the ADAM12 prodomain may have mutations (preferably conservative substitutions) such as amino acid substitutions, deletions, additions, and insertions, as long as it retains its function.

ADAM12プロドメインからなるタンパク質の好ましい具体例としては、下記（i）に記載するタンパク質及び下記（j）に記載するタンパク質：
（i）配列番号13における29〜206番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び
（j）上記（i）のタンパク質と85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質
からなる群より選択される少なくとも1種が挙げられる。 Preferred specific examples of the protein comprising the ADAM12 prodomain include the proteins described in (i) below and the proteins described in (j) below:
(I) a protein consisting of the 29th to 206th amino acid sequence in SEQ ID NO: 13, and (j) at least selected from the group consisting of a protein consisting of an amino acid sequence having 85% or more identity with the protein of (i) above One type is mentioned.

上記（j）において、同一性は、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、さらに好ましくは98％以上である。 In the above (j), the identity is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.

上記（j）に記載するタンパク質の一例としては、例えば
（j’）上記（i）のタンパク質のアミノ酸配列に対して1若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つマトリックスメタロプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。 As an example of the protein described in the above (j), for example, (j ′) an amino acid sequence in which one or a plurality of amino acids are substituted, deleted, added, or inserted into the amino acid sequence of the protein of (i) And a protein having matrix metalloprotease activity.

上記（j’）において、複数個とは、例えば2〜20個であり、好ましくは2〜10個であり、より好ましくは2〜5個であり、よりさらに好ましくは2又は3個である。 In the above (j ′), the number is, for example, 2 to 20, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 5, and further preferably 2 or 3.

本発明のエクソソーム産生促進剤の対象細胞は、in vitroにおける細胞（すなわち、生体外で培養されている細胞）であってもよいし、in vivoにおける細胞（すなわち、生体内に存在している細胞）であってもよい。 The target cell of the exosome production promoter of the present invention may be a cell in vitro (that is, a cell cultured in vitro) or a cell in vivo (that is, a cell existing in vivo). ).

本発明のエクソソーム産生促進剤の対象生物は、特に限定されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の種々の哺乳類が挙げられる。 The target organism of the exosome production promoter of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include various mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits.

本発明のエクソソーム産生促進剤の対象細胞の細胞種は、エクソソームを産生し得る細胞種である限り特に限定されず、例えば血管内皮細胞、内皮前駆細胞、幹細胞（例えば、骨髄由来幹細胞、脂肪組織由来幹細胞、間葉系幹細胞、多能性幹細胞（iPS細胞、ES細胞等）等）、筋細胞（骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞）、筋前駆細胞（例えば、心筋前駆細胞、筋芽細胞等）、神経細胞等が挙げられる。 The cell type of the target cell of the exosome production promoter of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell type that can produce exosomes. For example, vascular endothelial cells, endothelial progenitor cells, stem cells (for example, bone marrow-derived stem cells, adipose tissue-derived) Stem cells, mesenchymal stem cells, pluripotent stem cells (iPS cells, ES cells, etc.), muscle cells (skeletal muscle cells, smooth muscle cells, cardiomyocytes), muscle progenitor cells (eg, cardiomyocyte precursor cells, myoblasts) Etc.) and nerve cells.

本発明のエクソソーム産生促進剤は、上記成分に加え、任意の担体や添加剤、例えば医薬上許容される担体および添加剤を含むことができる。 The exosome production promoter of the present invention can contain arbitrary carriers and additives such as pharmaceutically acceptable carriers and additives in addition to the above components.

医薬上許容される担体および添加剤としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑沢剤；クエン酸、メントール等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、生理食塩水等の希釈剤；ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。 Examples of pharmaceutically acceptable carriers and additives include excipients such as sucrose and starch; binders such as cellulose and methylcellulose; disintegrants such as starch and carboxymethylcellulose; lubricants such as magnesium stearate and aerosil Agents: Fragrances such as citric acid and menthol; Preservatives such as sodium benzoate and sodium bisulfite; Stabilizers such as citric acid and sodium citrate; Suspending agents such as methylcellulose and polyvinylpyrrolide; Surfactants and the like Dispersants; diluents such as water and saline; base waxes and the like, but are not limited thereto.

本発明のエクソソーム産生促進剤は、使用用途（in vitro又はin vivo）や投与形態において、適切な剤形、例えば錠剤、丸剤、散剤、液剤、注射剤、懸濁剤、乳剤
、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の剤形を採ることができる。 The exosome production promoter of the present invention is suitable for use (in vitro or in vivo) or administration form, such as tablets, pills, powders, solutions, injections, suspensions, emulsions, powders, The dosage form such as granules and capsules can be taken.

本発明のエクソソーム産生促進剤をin vivoにおける細胞に使用する場合、その投与量は、投与対象となる被験者の体重や年齢、並びに病気の重篤度等によって異なり、一概に設定することはできないが、例えば、成人１日あたり有効成分量として数mg〜数十mg／kg体重を挙げることができ、これを１日１回〜数回に分けて投与することができる。 When the exosome production promoter of the present invention is used for cells in vivo, the dosage varies depending on the body weight and age of the subject to be administered, the severity of the disease, etc., and cannot be generally set. For example, several mg to several tens mg / kg body weight can be mentioned as the amount of active ingredient per day for an adult, and this can be administered once to several times a day.

本発明のエクソソーム産生促進剤を後述の本発明のエクソソーム産生促進方法のように用いることにより、細胞からのエクソソーム産生を促進することができる。また、本発明のエクソソーム産生促進剤を後述の本発明のエクソソームの製造方法のように用いることにより、エクソソームを従来よりも効率的に製造することができる。 By using the exosome production promoter of the present invention as in the exosome production promotion method of the present invention described later, exosome production from cells can be promoted. Further, by using the exosome production promoter of the present invention as in the method for producing exosome of the present invention described later, exosome can be produced more efficiently than before.

３．エクソソーム産生促進方法
本発明は、本発明のエクソソーム産生促進剤を細胞に接触させる工程を含む、細胞からのエクソソーム産生を促進する方法（本明細書において、「本発明のエクソソーム産生促進方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。 3. Method for promoting exosome production The present invention is a method for promoting exosome production from a cell, comprising the step of contacting the cell with the exosome production promoter of the present invention (hereinafter referred to as "the method for promoting exosome production of the present invention"). Sometimes). This will be described below.

本発明のエクソソーム産生促進剤、対象細胞等については、上記「２．エクソソーム産生促進剤」における説明と同様である。 The exosome production promoter, target cell and the like of the present invention are the same as described in “2. Exosome production promoter” above.

細胞に接触させる態様は、本発明のエクソソーム産生促進剤の有効成分（アディポネクチン、アディポネクチン発現促進剤、T-カドヘリン発現促進剤、ADAM12発現抑制剤、ADAM12活性抑制剤）が、細胞に作用してエクソソーム産生を促進できる態様である限りにおいて、特に限定されない。細胞に接触させる方法は、有効成分の種類に応じて、公知の方法に従って又は準じた方法を採用することができる。 In the mode of contacting with cells, the active ingredient of the exosome production promoter of the present invention (adiponectin, adiponectin expression promoter, T-cadherin expression promoter, ADAM12 expression inhibitor, ADAM12 activity inhibitor) acts on the exosome. There is no particular limitation as long as the production can be promoted. As a method of contacting the cells, a known method or a similar method can be adopted depending on the type of the active ingredient.

例えば、有効成分がアディポネクチンである場合は、細胞に接触させる態様は、アディポネクチンが対象細胞表面に接触できる態様である限り、特に限定されない。アディポネクチンが細胞表面上のT-カドヘリンに結合することによって、エクソソーム産生が促進される。In vitroの場合であれば、例えばアディポネクチンを培地に添加することによって、対象細胞表面にアディポネクチンを接触させることができる。 For example, when the active ingredient is adiponectin, the mode of contacting the cells is not particularly limited as long as the adiponectin can contact the target cell surface. The binding of adiponectin to T-cadherin on the cell surface promotes exosome production. In the case of in vitro, for example, adiponectin can be brought into contact with the target cell surface by adding adiponectin to the medium.

例えば、有効成分が、プラスミドベクター、siRNA、miRNA、アンチセンス核酸等の核酸である場合は、細胞に接触させる態様は、これらの核酸が対象細胞内に導入されるような態様である限り、特に限定されない。対象細胞内に導入されることにより、その機能（T-カドヘリン発現、ADAM12抑制等）が発揮され、これによってエクソソーム産生が促進される。核酸の導入は、公知の方法に従って又は準じて行うことができ、例えばリポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、及びウイルスベクター法等により核酸を導入することができる。 For example, when the active ingredient is a nucleic acid such as a plasmid vector, siRNA, miRNA, antisense nucleic acid, etc., the mode of contacting with the cell is not limited as long as these nucleic acids are introduced into the target cell. It is not limited. When introduced into a target cell, its functions (T-cadherin expression, ADAM12 suppression, etc.) are exhibited, thereby promoting exosome production. Nucleic acid can be introduced according to or according to a known method. For example, the nucleic acid can be introduced by a lipofection method, an electroporation method, a calcium phosphate method, a microinjection method, a virus vector method, or the like.

これらの核酸を細胞に接触させる際には、核酸導入試薬を併用することが望ましい。核酸導入試薬の具体例としては、ポリマー系核酸導入試薬；jetPRIME(PPU社)、jetPEI(PPU 社)、jetPEI-HUVEC(PPU 社)：脂質系核酸導入試薬；Lipofectamine 3000（Invitrogen社）、Lipofectamine 2000（Invitrogen社）、Lipofectamine LTX（Invitrogen社）、Invivofectamine 2.0（Invitrogen社）、Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen社）、ScreenFect (和光純薬社)、 INTERFERin(PPU 社)、INTERFERin HTS(PPU 社)、Lullaby(OZB 社)、GeneSilencer Reagent(GTS 社)、LipoMag Kit(OZB 社)、GenePORTER Gold Transfection Reagent(GTS 社)；DreamFect Gold(OZB 社)、DreamFect(OZB 社)、EcoTransfect(OZB 社)、GenePORTER 3000(GTS 社)、GenePORTER 1/2(GTS 社)、GenePORTER H(GTS 社)、RmesFect(OZB 社)：磁気粒子系核酸導入試薬；SilenceMag(OZB 社)、FluoMag-S(OZB 社)、PolyMag Neo(OZB 社)、PolyMag(OZB 社)、CombiMag(OZB 社)、FluoMag-P/FuloMag-C(OZB 社)、Magnetofectamine Kit(OZB 社)等が挙げられる。 When these nucleic acids are brought into contact with cells, it is desirable to use a nucleic acid introduction reagent in combination. Specific examples of nucleic acid introduction reagents include polymer nucleic acid introduction reagents: jetPRIME (PPU), jetPEI (PPU), jetPEI-HUVEC (PPU): lipid nucleic acid introduction reagents; Lipofectamine 3000 (Invitrogen), Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Lipofectamine LTX (Invitrogen), Invivofectamine 2.0 (Invitrogen), Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), ScreenFect (Wako Pure Chemicals), INTERFERin (PPU), INTERFERin HTS (PPU), Lullaby (OZB) ), GeneSilencer Reagent (GTS), LipoMag Kit (OZB), GenePORTER Gold Transfection Reagent (GTS); DreamFect Gold (OZB), DreamFect (OZB), EcoTransfect (OZB), GenePORTER 3000 (GTS) ), GenePORTER 1/2 (GTS), GenePORTER H (GTS), RmesFect (OZB): Nucleic acid nucleic acid introduction reagent: SilenceMag (OZB), FluoMag-S (OZB), PolyMag Neo (OZB) ), PolyMag (OZB), CombiMag (OZB), FluoMag-P / FuloMag-C (OZB), Magnetofectamine Kit (OZB) and the like.

４．エクソソームの製造方法
本発明は、本発明のエクソソーム産生促進剤を細胞に接触させる工程、及び前記細胞から産生されるエクソソームを回収する工程を含む、エクソソームの製造方法（本明細書において、「本発明のエクソソームの製造方法」と示すこともある。）に関する。以下、これについて説明する。 4). Exosome production method The present invention comprises a step of contacting a cell with the exosome production promoter of the present invention and a step of recovering the exosome produced from the cell (herein, the present invention It may also be indicated as “a method for producing exosomes”. This will be described below.

本発明のエクソソーム産生促進剤、対象細胞等については、上記「２．エクソソーム産生促進剤」における説明と同様である。また、細胞に接触させる工程については、上記「３．エクソソーム産生促進方法」における説明と同様である。 The exosome production promoter, target cell and the like of the present invention are the same as described in “2. Exosome production promoter” above. The step of contacting the cells is the same as described in the above “3. Method for promoting exosome production”.

エクソソームは、培地中に分泌されるので、単に培地を回収することによってエクソソームを回収することができる。 Since exosomes are secreted into the medium, exosomes can be recovered simply by recovering the medium.

回収した培地は、必要に応じてエクソソーム精製工程に供してもよい。エクソソーム精製方法は、特に限定されず、公知の方法に従った又は準じた方法を採用することができる。例えば、培養液を、遠心力を段階的に上げながら（例えば600〜1000 g→10000〜15000 g→100000〜150000 g）、複数回、遠心して上清の回収する工程を繰り返し、最後に得られた沈殿を回収することによって、エクソソームを精製することができる。 The collected medium may be subjected to an exosome purification step as necessary. The exosome purification method is not particularly limited, and a method according to or according to a known method can be employed. For example, the step of collecting the supernatant by centrifuging the culture solution a plurality of times while gradually increasing the centrifugal force (for example, 600 to 1000 g → 10000 to 15000 g → 100,000 to 150000 g) is finally obtained. The exosome can be purified by collecting the collected precipitate.

以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited to these examples.

特に断りの無い限り、以下の実施例において、T-カドヘリン過剰発現内皮細胞株の作成、エクソソーム画分の精製、SDS電気泳動とウェスタンブロッティング、及びノックダウンは、以下のように行った。 Unless otherwise noted, in the following examples, the generation of T-cadherin-overexpressing endothelial cell line, purification of exosome fraction, SDS electrophoresis and Western blotting, and knockdown were performed as follows.

T-カドヘリン過剰発現内皮細胞株の作成
マウスT-カドヘリンをコードするDNAをレトロウイルスベクターpMXs-puroに組み込み、PLAT-E細胞にトランスフェクトした。トランフェクト後24〜48時間の間に産生された培養上清に含まれるレトロウイルスを回収し、これをマウス内皮細胞株UVF-2細胞、及びヒト内皮細胞株HMEC-1細胞に感染させた。感染後、それぞれピューロマイシン2μg/ml及び0.1μg/mlの濃度で薬剤選択することで、安定的にマウスT-カドヘリンを発現する細胞を得た。 Preparation of T-cadherin-overexpressing endothelial cell line DNA encoding mouse T-cadherin was incorporated into the retroviral vector pMXs-puro and transfected into PLAT-E cells. Retrovirus contained in the culture supernatant produced during 24-48 hours after transfection was collected and infected with mouse endothelial cell line UVF-2 cells and human endothelial cell line HMEC-1 cells. After infection, cells that stably express mouse T-cadherin were obtained by selecting drugs at concentrations of puromycin of 2 μg / ml and 0.1 μg / ml, respectively.

エクソソーム画分の精製
マウス血清を濃度20%となるようにDMEM培地に混合し、得られた混合液を100,000 g で14時間超遠心して上清を回収した。この上清を0.221μm PVDFフィルターに通した後、DMEM培地で1/4に希釈し、エクソソーム除去マウス血清（5%）培地を得た。これを細胞に作用させ、24時間及び48時間後の培養上清を800 gで10分間遠心して上清を得た。これを12,000 gで30分間遠心し、得られた上清をさらに110,000 gにて2時間超遠心して、沈殿物を得た。この沈殿物をエクソソーム画分として使用した。 Purified mouse serum of the exosome fraction was mixed in DMEM medium to a concentration of 20%, and the resulting mixture was ultracentrifuged at 100,000 g for 14 hours to recover the supernatant. The supernatant was passed through a 0.221 μm PVDF filter and then diluted 1/4 with DMEM medium to obtain exosome-removed mouse serum (5%) medium. This was allowed to act on the cells, and the culture supernatant after 24 and 48 hours was centrifuged at 800 g for 10 minutes to obtain a supernatant. This was centrifuged at 12,000 g for 30 minutes, and the resulting supernatant was further centrifuged at 110,000 g for 2 hours to obtain a precipitate. This precipitate was used as the exosome fraction.

SDS電気泳動とウェスタンブロッティング
細胞試料をPBS(+)にて洗浄後、1%NP-40、1%Triton-X-100、及びタンパク分解酵素阻害剤（Compltete^TM、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を含むTris緩衝液で溶解した。溶解液を200,000 g 15分間遠心して、得られた上清をサンプルとして用いた。サンプルのタンパク濃度をBCAタンパクアッセイ試薬を用いて定量し、定量値に基づいてサンプルのタンパク濃度を同一濃度に合わせた。このサンプルに6%SDSを含むSDS-sample bufferを1/2容混合し、98℃で5分間加熱変性した。加熱変性後のサンプルを4〜20%TGX SDS-pageゲル（BioRad）にて泳動分離し、ニトロセルロース膜に転写し、ウェスタンブロッティングを行った。 After washing SDS electrophoresis and Western blotting cell samples with PBS (+), 1% NP-40, 1% Triton-X-100, and protease inhibitor (Compltete ^™ , manufactured by Roche Diagnostics) ) In Tris buffer solution. The lysate was centrifuged at 200,000 g for 15 minutes, and the resulting supernatant was used as a sample. The protein concentration of the sample was quantified using the BCA protein assay reagent, and the protein concentration of the sample was adjusted to the same concentration based on the quantitative value. This sample was mixed with 1/2 volume of SDS-sample buffer containing 6% SDS and denatured by heating at 98 ° C. for 5 minutes. Samples after heat denaturation were separated by electrophoresis on a 4-20% TGX SDS-page gel (BioRad), transferred to a nitrocellulose membrane, and subjected to Western blotting.

エクソソーム試料は、6%SDSを含むSDS-sample bufferに溶解し、98℃で5分間加熱変性し、細胞試料と同様にウェスタンブロッティングを行った。 The exosome sample was dissolved in SDS-sample buffer containing 6% SDS, denatured by heating at 98 ° C. for 5 minutes, and subjected to Western blotting in the same manner as the cell sample.

用いた一次抗体は、Syntenin：ab19903 (Abcam)、MFG-E8：AF2805（R&D）、CD63：263-3（MBL）、T-cadherin：AF3264（R&D）、Adiponectin：AF1119（R&D）、及びalpha-Tubulin：#2144（Cell Signaling）である。 The primary antibodies used were Syntenin: ab19903 (Abcam), MFG-E8: AF2805 (R & D), CD63: 263-3 (MBL), T-cadherin: AF3264 (R & D), Adiponectin: AF1119 (R & D), and alpha- Tubulin: # 2144 (Cell Signaling).

ノックダウン
siRNAは、トランスフェクション試薬としてLipofectamine RNAiMAX reagentを用いて、終濃度5nMにて導入した。 knock down
siRNA was introduced at a final concentration of 5 nM using Lipofectamine RNAiMAX reagent as a transfection reagent.

用いたsiRNAは、マウスT-cadherin：Gene Solution siRNA 2831661_10、Control：Gene Solution siRNA 1027281、マウスADAM9：Silencer(R) Select s232236、マウスADAM10：Silencer(R) Select s61946、ADAM12-1：Silencer(R) Select s61951、ADAM12-2：Silencer(R) Select s61953、ADAM12-3：Silencer(R) Select s61952、ADAM15：Silencer(R) Select s61955、ADAM17：Silencer(R) Select s61957、ADAM19：Silencer(R) Select s61961、Control siRNA1：Negative Control No. 1 siRNA AM4611、及びControl siRNA2：Negative Control No. 2 siRNA AM4613である。 The siRNA used is mouse T-cadherin: Gene Solution siRNA 2831661_10, Control: Gene Solution siRNA 1027281, mouse ADAM9: Silencer (R) Select s232236, mouse ADAM10: Silencer (R) Select s61946, ADAM12-1: Silencer (R) Select s61951, ADAM12-2: Silencer (R) Select s61953, ADAM12-3: Silencer (R) Select s61952, ADAM15: Silencer (R) Select s61955, ADAM17: Silencer (R) Select s61957, ADAM19: Silencer (R) Select s61961, Control siRNA1: Negative Control No. 1 siRNA AM4611, and Control siRNA2: Negative Control No. 2 siRNA AM4613.

実施例１：ADAM12遺伝子ノックダウンによる細胞T-カドヘリン蛋白の増加とアディポネクチン集積の増加
＜方法＞マウスT-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞に、ADAM9, 10, 15, 17, 19, 12及びネガティブコントロールのsiRNAをリポフェクション法によりトランスフェクトした。トランスフェクトから12時間後に、培地を、C57Bl6j野生型マウス或いはアディポネクチン欠損マウスの血清を5%含めたDMEM培地に交換し、2日間培養した。またMMP阻害薬Marimastatは10μMの濃度で2日間作用させた。細胞試料におけるT-cad、tubulin、及びAPNの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図１に示す。 Example 1 : Increase in cellular T-cadherin protein and adiponectin accumulation by ADAM12 gene knockdown <Method> In mouse T-cadherin overexpressing UVF-2 cells, ADAM 9, 10, 15, 17, 19, 12 and negative control SiRNA was transfected by lipofection method. Twelve hours after transfection, the medium was replaced with DMEM medium containing 5% of serum of C57B16j wild-type mice or adiponectin-deficient mice, and cultured for 2 days. MMP inhibitor Marimastat was allowed to act at a concentration of 10 μM for 2 days. The abundance of T-cad, tubulin, and APN in the cell samples was examined by SDS-page and Western blotting. The result of Western blotting is shown in FIG.

＜結果＞Marimastatを作用させた場合と同様に、ADAM12-1 siRNA又はADAM12-2 siRNAを作用させた場合において、T-cadherin蛋白の増加とアディポネクチン集積の増加が認められた。このことから、ADAM12発現量が、T-cadherin蛋白存在量、及びアディポネクチン集積量を調節していることが示唆された。 <Results> In the same manner as when Marimastat was allowed to act, when ADAM12-1 siRNA or ADAM12-2 siRNA was allowed to act, an increase in T-cadherin protein and an increase in adiponectin accumulation were observed. This suggests that ADAM12 expression level regulates T-cadherin protein abundance and adiponectin accumulation.

実施例２：活性消失型変異ADAM12の過剰発現によるT-カドヘリン蛋白の増加
＜方法＞マウスADAM12遺伝子（NM_007400.2）のcDNA、又はそのアミノ酸349番目のグルタミン酸（E）がグルタミン（Q）に変異した変異ADAM12（EQ変異体）のcDNAを、レトロウイルスベクターpMXs-neoに組み、PLAT-E細胞にトランスフェクトした。トランフェクト後24〜48時間の間に産生された培養上清に含まれるレトロウイルスを回収しし、T-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞に導入した。導入後、G418濃度1mg/mlで薬剤選択し、安定的にADAM12或いはEQ変異体を発現する細胞を作成した。これらの細胞をC57Bl6j野生型マウスあるいはアディポネクチン欠損マウスの血清を5%含めたDMEM培地で２日間培養した。細胞試料におけるT-cad、tubulin、及びAPNの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図２に示す。 Example 2 : Increase in T-cadherin protein by overexpression of loss-of-activity mutant ADAM12 <Method> cDNA of mouse ADAM12 gene (NM_007400.2) or glutamic acid (E) at amino acid 349 is mutated to glutamine (Q) The cDNA of the mutant ADAM12 (EQ mutant) was assembled into the retroviral vector pMXs-neo and transfected into PLAT-E cells. Retroviruses contained in the culture supernatant produced during 24-48 hours after transfection were collected and introduced into T-cadherin overexpressing UVF-2 cells. After the introduction, drugs were selected at a G418 concentration of 1 mg / ml, and cells that stably express ADAM12 or EQ mutants were prepared. These cells were cultured for 2 days in a DMEM medium containing 5% of serum of C57Bl6j wild-type mice or adiponectin-deficient mice. The abundance of T-cad, tubulin, and APN in the cell samples was examined by SDS-page and Western blotting. The results of Western blotting are shown in FIG.

＜結果＞EQ変異体の過剰発現によって細胞のT-カドヘリン蛋白が増加し、アディポネクチンの集積も増加した。このことから、ADAM12のプロテアーゼ活性がT-カドヘリン蛋白存在量、及びアディポネクチン集積量を調節していることが示唆された。 <Results> Overexpression of the EQ mutant increased cell T-cadherin protein and increased adiponectin accumulation. This suggests that the ADAM12 protease activity regulates the T-cadherin protein abundance and adiponectin accumulation.

実施例３：ADAM12阻害による切断遊離T-カドヘリンの減少
＜方法＞T-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞の細胞表面タンパクをSulfo-NHS-S-S-Biotin （Pierce）によってビオチン修飾した。得られた細胞を、血清（野生型マウス（WT）血清、アディポネクチン欠損マウス（AKO）血清、又はT-カドヘリン欠損マウス（TKO）血清）を5％含有するDMEM培地、或いは該培地にさらにMarimastat（終濃度10μM）、ネガティブコントロールsiRNA、又はADAM12 siRNAを含有する培地で24時間培養した。なお、siRNAは培養開始24時間前に添加した。培養上清を110,000 gで2時間超遠心して上清を得た。この上清をStreptavidin-agarose（sigma）と混合し、Streptavidinに結合するタンパクを回収した。回収物におけるT-cad及びAPNの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。結合するタンパクは細胞表面にあり、24時間の培養によって上清中に遊離したタンパクと考えられる。ウェスタンブロッティングの結果を図３に示す。 Example 3 Reduction of Cleaved Free T-Cadherin by ADAM12 Inhibition <Method> Cell surface protein of UVF-2 cells overexpressing T-cadherin was modified with biotin by Sulfo-NHS-SS-Biotin (Pierce). The obtained cells were treated with DMEM medium containing 5% of serum (wild-type mouse (WT) serum, adiponectin-deficient mouse (AKO) serum, or T-cadherin-deficient mouse (TKO) serum), or Marimastat ( The cells were cultured in a medium containing a final concentration of 10 μM), negative control siRNA, or ADAM12 siRNA for 24 hours. In addition, siRNA was added 24 hours before the start of culture. The culture supernatant was ultracentrifuged at 110,000 g for 2 hours to obtain a supernatant. This supernatant was mixed with Streptavidin-agarose (sigma) to recover a protein that binds to Streptavidin. The abundance of T-cad and APN in the recovered material was examined by SDS-page and Western blotting. The protein to be bound is on the cell surface and is considered to be a protein released into the supernatant after 24 hours of culture. The results of Western blotting are shown in FIG.

＜結果＞細胞膜蛋白であるT-カドヘリンは24時間の培養の間に上清中に遊離すること、及びMMP阻害剤やADAM12のノックダウンによってT-カドヘリンの遊離が顕著に抑制されることが示された。このことからADAM12のプロテアーゼ活性によりT-カドヘリンを切断遊離していることが示唆された。 <Results> It is shown that T-cadherin, a cell membrane protein, is released into the supernatant during 24 hours of culture, and that T-cadherin release is significantly suppressed by knockdown of MMP inhibitor and ADAM12. It was done. This suggests that ADAM12 protease activity cleaves and releases T-cadherin.

実施例４：ADAM12ノックダウンによるエクソソーム産生の促進作用
＜方法＞T-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞にネガティブコントロールsiRNA（siCtrl）或いはADAM12のsiRNA（ADAM12-2：Silencer(R) Select s61953）を導入した。導入から12時間後に、培地を、野生型マウスの血清又はアディポネクチン欠損マウスの血清から調整したエクソソーム除去マウス血清（5%）培地に置換し、さらに24時間培養した。培養後の培養上清よりエクソソーム画分を精製した。エクソソーム画分におけるT-cad、APN、Syntenin、及びFlot2の存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図４に示す。 Example 4 : Promoting action of exosome production by ADAM12 knockdown <Method> Introduction of negative control siRNA (siCtrl) or ADAM12 siRNA (ADAM12-2: Silencer (R) Select s61953) into T-cadherin-overexpressing UVF-2 cells did. Twelve hours after introduction, the medium was replaced with exosome-removed mouse serum (5%) medium prepared from the serum of wild-type mice or adiponectin-deficient mice, and further cultured for 24 hours. The exosome fraction was purified from the culture supernatant after culture. The abundance of T-cad, APN, Syntenin, and Flot2 in the exosome fraction was examined by SDS-page and Western blotting. The result of Western blotting is shown in FIG.

＜結果＞ADAM12のノックダウンによって、エクソソームの構成因子として分泌されるT-カドヘリンが増加した。また、アディポネクチン欠損マウス血清を用いた場合、エクソソームの構成因子として分泌されるT-カドヘリンが減少した。さらに、エクソソームマーカーであるSynteninは、ADAM12のノックダウンによって増加し、アディポネクチン欠損マウス血清を用いた場合には減少した。これらのことから、ADAM12は細胞のT-カドヘリン蛋白量を負に調節しており、その阻害によるT-カドヘリン蛋白の増加と、アディポネクチンは、相加相乗的にエクソソーム産生を促進していることが示唆された。 <Results> ADAM12 knockdown increased T-cadherin secreted as a component of exosomes. In addition, when adiponectin-deficient mouse serum was used, T-cadherin secreted as an exosome component decreased. Furthermore, Syntenin, an exosome marker, was increased by ADAM12 knockdown and decreased when adiponectin-deficient mouse serum was used. From these facts, ADAM12 negatively regulates the amount of T-cadherin protein in cells, and the increase in T-cadherin protein due to its inhibition and adiponectin promoted exosome production synergistically. It was suggested.

実施例５：T-カドヘリンとアディポネクチンの用量依存的エクソソーム産生制御
＜方法＞アディポネクチン欠損マウスに、タイターの等しいアデノウイルスを用いてマウスアディポネクチン或いはβガラクトシダーゼを発現させた。このマウスの血清を超遠心してエクソソーム除去血清を得た。この血清中のアディポネクチン濃度をELISAによって定量し、両者を（アディポネクチン発現マウスのエクソソーム除去血清、及びβガラクトシダーゼ発現マウスのエクソソーム除去血清を）混合することで、アディポネクチン濃度が0,1,3,10,30μg/mlのエクソソーム除去マウス血清（5%）培地を作成した。これらのエクソソーム除去マウス血清（5%）培地中で、UVF-2細胞とT-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞を、48時間培養した。培養後の培地から、エクソソーム画分を精製した。エクソソーム画分におけるT-cadherin、MFG-E8、Syntenin、CD63、及びAPNの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図５に示す。図５の結果をグラフ化したものを図６に示す。 Example 5 : Dose-dependent exosome production control of T-cadherin and adiponectin <Method> Mouse adiponectin or β-galactosidase was expressed in an adiponectin-deficient mouse using an adenovirus having the same titer. The mouse serum was ultracentrifuged to obtain exosome-free serum. The adiponectin concentration in this serum was quantified by ELISA, and both were mixed (exasome-removed serum of adiponectin-expressing mice and exosome-removed serum of β-galactosidase-expressing mice), so that the adiponectin concentration was 0,1,3,10, A 30 μg / ml exosome-free mouse serum (5%) medium was prepared. In these exosome-removed mouse serum (5%) medium, UVF-2 cells and T-cadherin-overexpressing UVF-2 cells were cultured for 48 hours. The exosome fraction was purified from the cultured medium. The abundance of T-cadherin, MFG-E8, Syntenin, CD63, and APN in the exosome fraction was examined by SDS-page and Western blotting. The result of Western blotting is shown in FIG. FIG. 6 shows a graph of the results of FIG.

＜結果＞アディポネクチンの血中濃度変動域である1〜30μg/mlにおいて、用量依存的なエクソソーム産生の増加が示された。また、T-カドヘリン過剰発現細胞UVF-2細胞、及びT-カドヘリン発現量が比較的低いUVF-2細胞の両方において、アディポネクチンによるエクソソーム産生増加が示された。さらに、T-カドヘリン過剰発現細胞UVF-2細胞の方が、UVF-2細胞よりも、エクソソーム産生量が高かった。 <Results> A dose-dependent increase in exosome production was shown at 1-30 μg / ml, which is the blood concentration fluctuation range of adiponectin. In addition, both T-cadherin-overexpressing cells UVF-2 cells and UVF-2 cells having relatively low T-cadherin expression levels showed increased exosome production by adiponectin. Furthermore, T-cadherin-overexpressing cells UVF-2 cells produced higher exosome production than UVF-2 cells.

実施例６：ブラウン運動軌跡解析による、アディポネクチンのエクソソーム産生促進作用の解析
＜方法＞アディポネクチン欠損マウスに、タイターの等しいアデノウイルスを用いてマウスアディポネクチン或いはβガラクトシダーゼを発現させた。このマウスの血清を超遠心してエクソソーム除去血清を得た。この血清中のアディポネクチン濃度をELISAによって定量し、両者を（アディポネクチン発現マウスのエクソソーム除去血清、及びβガラクトシダーゼ発現マウスのエクソソーム除去血清を）混合することで、アディポネクチン濃度が0, 10μg/mlのエクソソーム除去マウス血清（5%）培地を作成した。これらのエクソソーム除去マウス血清（5%）培地中で、UVF-2細胞とT-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞を、48時間培養した。培養後の培地から、エクソソーム画分を精製した。ナノサイトLM-10（Malvern）を用いて、ブラウン運動軌跡解析から、エクソソーム画分中のエクソソーム粒子数を計測した。結果を図７に示す。 Example 6 : Analysis of adiponectin exosome production promoting action by Brownian motion trajectory analysis <Method> Mouse adiponectin or β-galactosidase was expressed in an adiponectin-deficient mouse using an adenovirus having the same titer. The mouse serum was ultracentrifuged to obtain exosome-free serum. The adiponectin concentration in this serum is quantified by ELISA, and both are mixed (exosome-removed serum from adiponectin-expressing mice and exosome-removed serum from β-galactosidase-expressing mice) to remove adiponectin at a concentration of 0, 10 μg / ml Mouse serum (5%) medium was prepared. In these exosome-removed mouse serum (5%) medium, UVF-2 cells and T-cadherin-overexpressing UVF-2 cells were cultured for 48 hours. The exosome fraction was purified from the cultured medium. Using nanosite LM-10 (Malvern), the number of exosome particles in the exosome fraction was measured from Brownian motion trajectory analysis. The results are shown in FIG.

＜結果＞アディポネクチンはエクソソーム粒子数を増大させることが示された。 <Results> Adiponectin was shown to increase the number of exosome particles.

実施例７：エクソソームのアセチルコリンエステラーゼ活性を指標とした、アディポネクチンのエクソソーム産生促進効果の解析
＜方法＞C57Bl6j野生型マウス或いはアディポネクチン欠損マウスの血清から、エクソソーム除去マウス血清（5%）培地を作成した。この培地中で、T-カドヘリン過剰発現UVF-2細胞を48時間培養した。培養後の培地から、エクソソーム画分を精製した。PBSに懸濁したエクソソーム画分のアセチルコリンエステラーゼ活性を、アセチルコリンエステラーゼ（C3389,Sigma）を標品として、アセチルチオコリン（A5626 Sigma）を基質としたElman’s反応によって測定した。結果を図８に示す。 Example 7 : Analysis of exosome production promoting effect of adiponectin using exosome acetylcholinesterase activity as an index <Method> An exosome-removed mouse serum (5%) medium was prepared from the serum of C57Bl6j wild-type mice or adiponectin-deficient mice. In this medium, T-cadherin-overexpressing UVF-2 cells were cultured for 48 hours. The exosome fraction was purified from the cultured medium. The acetylcholinesterase activity of the exosome fraction suspended in PBS was measured by Elman's reaction using acetylcholinesterase (C3389, Sigma) as a standard and acetylthiocholine (A5626 Sigma) as a substrate. The results are shown in FIG.

＜結果＞アディポネクチン欠損マウスの血清（AKO）ではエクソソームのアセチルコリンエステラーゼ活性が低かった。このように、エクソソームに相互作用する酵素（アセチルコリンエステラーゼ）の活性値の観点からも、アディポネクチンがエクソソーム産生を促進することが示された。 <Results> The serum (AKO) of adiponectin-deficient mice had low exosome acetylcholinesterase activity. Thus, from the viewpoint of the activity value of an enzyme (acetylcholinesterase) that interacts with exosomes, it was shown that adiponectin promotes exosome production.

実施例８：ヒト内皮細胞株HMEC-1細胞におけるアディポネクチンによるエクソソーム産生促進
＜方法＞T-カドヘリンをコードするDNAを組み込んだpMXs-puroレトロウイルスを導入したHMEC-1細胞（mT-cad）、又はpMXs-puroレトロウイルスを導入したHMEC-1細胞（null）を用いた。C57Bl6j野生型マウス或いはアディポネクチン欠損マウスの血清から、エクソソーム除去マウス血清（5%）培地を作成した。この培地中で、上記HMEC-1細胞を48時間培養した。培養後の培地から、エクソソーム画分を精製した。エクソソーム画分におけるT-cadherin、Syntenin、CD63及びAPNの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図９に示す。 Example 8 : Promotion of exosome production by adiponectin in human endothelial cell line HMEC-1 cells <Method> HMEC-1 cells (mT-cad) into which pMXs-puro retrovirus incorporating DNA encoding T-cadherin is introduced, or HMEC-1 cells (null) introduced with pMXs-puro retrovirus were used. Exosome-free mouse serum (5%) medium was prepared from the serum of C57Bl6j wild-type mice or adiponectin-deficient mice. The HMEC-1 cells were cultured in this medium for 48 hours. The exosome fraction was purified from the cultured medium. The abundance of T-cadherin, Syntenin, CD63 and APN in the exosome fraction was examined by SDS-page and Western blotting. The result of Western blotting is shown in FIG.

＜結果＞マウスT-カドヘリン過剰発現HMEC-1細胞では、アディポネクチンによって、エクソソーム産生マーカー（Syntenin、及びCD63）が増加していた。このことから、HMEC-1細胞においても、アディポネクチンによるエクソソーム産生促進作用が示された。 <Results> In mouse T-cadherin overexpressing HMEC-1 cells, exosome production markers (Syntenin and CD63) were increased by adiponectin. From this, also in HMEC-1 cell, the exosome production promotion effect by adiponectin was shown.

実施例９：アディポネクチンによるエクソソーム産生促進効果のT-カドヘリン依存性
＜方法＞pMXs-puroレトロウイルスを導入したUVF-2細胞（F2 cells）、又はT-カドヘリンをコードするDNAを組み込んだpMXs-puroレトロウイルスを導入したUVF-2細胞（F2T cells）を用いた。F2 cellsにT-カドヘリン siRNA又はネガティブコントロールsiRNAをトランスフェクトし、24時間後に、培地を、C57Bl6j野生型マウス或いはアディポネクチン欠損マウスの血清から調製したエクソソーム除去マウス血清（5%）培地に置換し、さらに48時間培養した。F2T cellsは、siRNAをトランスフェクトしない以外は、F2 cellsと同様に処理した。培養後の培地から、エクソソーム画分を精製した。エクソソーム画分におけるT-cadherin、MFG-E8、Syntenin、CD63及びAPNの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図１０に示す。 Example 9 : T-cadherin dependence of the exosome production promoting effect by adiponectin <Method> pMXs-puro retrovirus-introduced UVF-2 cells (F2 cells), or pMXs-puro incorporating T-cadherin-encoding DNA UVF-2 cells (F2T cells) introduced with retrovirus were used. F2 cells were transfected with T-cadherin siRNA or negative control siRNA, and 24 hours later, the medium was replaced with exosome-removed mouse serum (5%) medium prepared from the serum of C57Bl6j wild-type mice or adiponectin-deficient mice. Cultured for 48 hours. F2T cells were treated in the same manner as F2 cells except that siRNA was not transfected. The exosome fraction was purified from the cultured medium. The abundance of T-cadherin, MFG-E8, Syntenin, CD63 and APN in the exosome fraction was examined by SDS-page and Western blotting. The result of Western blotting is shown in FIG.

＜結果＞アディポネクチンによるエクソソーム産生促進効果は、T-カドヘリンのノックダウンによって消失し、T-カドヘリンを過剰発現することで顕著になった。これらのことから、アディポネクチンによるエクソソーム産生促進はT-カドヘリンに依存することが示された。 <Results> The exosome production promoting effect by adiponectin disappeared by knockdown of T-cadherin, and became prominent by overexpressing T-cadherin. These results indicate that the promotion of exosome production by adiponectin depends on T-cadherin.

実施例１０：血中エクソソーム画分の解析
＜方法＞C57Bl6j野生型マウスの血清より、段階的遠心と2段階超遠心により、エクソソーム画分を得た。得られたエクソソーム画分を、40,20,10,5% OptiPrep^TMで構成した段階密度勾配に重層し、100,000 gで18時間超遠心し、12の密度の異なる画分に分離した。各画分に含まれるエクソソームをさらに超遠心により回収した。各回収物におけるT-cadherin、MFG-E8、Syntenin、及びAPNの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図１１に示す。 Example 10 : Analysis of blood exosome fraction <Method> From the serum of C57Bl6j wild-type mice, an exosome fraction was obtained by stepwise centrifugation and two-stage ultracentrifugation. The obtained exosome fraction was layered on a step density gradient composed of 40, 20, 10, 5% OptiPrep ^™ , ultracentrifuged at 100,000 g for 18 hours, and separated into 12 fractions with different densities. The exosome contained in each fraction was further collected by ultracentrifugation. The abundance of T-cadherin, MFG-E8, Syntenin, and APN in each collection was examined by SDS-page and Western blotting. The result of Western blotting is shown in FIG.

＜結果＞エクソソームが分布するとされる比重1.07〜1.11の画分に、代表的エクソソームマーカーであるSynteninと一致して、T-カドヘリン及びアディポネクチンが検出された。このことから少なくとも一部のアディポネクチンはT-カドヘリンとともにエクソソームに存在することが明らかになった。 <Results> T-cadherin and adiponectin were detected in a fraction having a specific gravity of 1.07 to 1.11 where exosomes were distributed, in agreement with Syntenin, which is a representative exosome marker. This revealed that at least some adiponectin exists in exosomes along with T-cadherin.

実施例１１：アディポネクチン欠損マウス、T-カドヘリン欠損マウスの血中エクソソーム画分の解析
＜方法＞アディポネクチン欠損マウス、T-カドヘリン欠損マウス、及びC57Bl6j野生型マウスの血清より、エクソソーム画分を調製した。得られたエクソソーム画分を、40,20,10,5% OptiPrep^TMで構成した段階密度勾配に重層し、100,000 gで18時間超遠心し、12の密度の異なる画分に分離した。画分（フラクション番号1〜12）をF1-3、F4-6、F7-10、F11-12に分け、それぞれに含まれるエクソソームを超遠心によって回収した。各回収物におけるT-cadherin、MFG-E8、Syntenin、及びAPNの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図１２に示す。 Example 11 : Analysis of blood exosome fraction of adiponectin-deficient mice and T-cadherin-deficient mice <Method> Exosome fractions were prepared from sera of adiponectin-deficient mice, T-cadherin-deficient mice, and C57Bl6j wild-type mice. The obtained exosome fraction was layered on a step density gradient composed of 40, 20, 10, 5% OptiPrep ^™ , ultracentrifuged at 100,000 g for 18 hours, and separated into 12 fractions with different densities. Fractions (fraction numbers 1 to 12) were divided into F1-3, F4-6, F7-10, and F11-12, and exosomes contained in each were collected by ultracentrifugation. The abundance of T-cadherin, MFG-E8, Syntenin, and APN in each collection was examined by SDS-page and Western blotting. The result of Western blotting is shown in FIG.

＜結果＞エクソソームマーカーであるMFG-E8やSynteninは、アディポネクチン欠損マウス及びT-カドヘリン欠損マウスでは減少していた。このことから、アディポネクチン−T-カドヘリン系は、血中のエクソソームレベルを制御していることが示唆された。 <Results> MFG-E8 and Syntenin, which are exosome markers, decreased in adiponectin-deficient mice and T-cadherin-deficient mice. This suggested that the adiponectin-T-cadherin system controls the exosome level in blood.

実施例１２：アディポネクチン欠損マウスの血清エクソソームレベル解析
＜方法＞アディポネクチン欠損マウス（13週齢の雄）、及びC57Bl6j野生型マウス（13週齢の雄）の血清中のエクソソームを、ポリマー系沈殿剤ExoQuick^TMによって沈殿させた。沈殿をPBSに溶解した後に、110,000 gで2時間超遠心した。沈殿を再度PBSに溶解して超遠心により粗エクソソーム画分を得た。粗エクソソーム画分におけるMFG-E8とSynteninの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図１３に示す。なお、MFG-E8は2つのバンド（45kDaと55Kda）が検出されるが、55Kdaのバンドは共沈してくる夾雑蛋白の影響で十分に検出できていないと考えられるため、グラフ化に際しては45KDaのバンドについて定量処理した。 Example 12 : Analysis of serum exosomes in adiponectin-deficient mice <Method> Exosomes in serum of adiponectin-deficient mice (13-week-old male) and C57Bl6j wild-type mice (13-week-old male) were converted into polymer-based precipitants. Precipitated by ExoQuick ^™ . The precipitate was dissolved in PBS and then ultracentrifuged at 110,000 g for 2 hours. The precipitate was dissolved again in PBS and a crude exosome fraction was obtained by ultracentrifugation. The abundance of MFG-E8 and Syntenin in the crude exosome fraction was examined by SDS-page and Western blotting. The results of Western blotting are shown in FIG. MFG-E8 detects two bands (45 kDa and 55 Kda), but the 55 Kda band is not fully detected due to the co-precipitated contaminating protein. Quantitative processing was performed on the bands.

＜結果＞アディポネクチン欠損マウス由来の血清サンプルのエクソソームにおけるMFG-E8とSynteninの存在量は、野生型マウス由来の血清の場合の存在量の約60%程度であった。このことより、アディポネクチンの欠損により、血清中のエクソソームレベルが低下していると考えられた。 <Results> The abundance of MFG-E8 and Syntenin in the exosomes of serum samples derived from adiponectin-deficient mice was about 60% of that in the case of serum derived from wild-type mice. From this, it was considered that the exosome level in serum was lowered due to the deficiency of adiponectin.

実施例１３：生体におけるアディポネクチン過剰発現による血中エクソソームの増加作用
＜方法＞アディポネクチン欠損マウス（AKO）及びアディポネクチン・T-カドヘリンダブル欠損マウス（DKO）に、アディポネクチンをコードするアデノウイルス（mA）あるいはβガラクトシダーゼをコードするアデノウイルス（bGal）を、ウイルスタイターを揃えた上で、尾静脈より投与した。投与から4日後に全採血を行い、血清を得た。各6匹のマウス血清をプールし、血清中エクソソームをポリマー系沈殿剤ExoQuickTMによって沈殿させた。沈殿をPBSに溶解した後に、110,000 gで2時間超遠心した。沈殿を再度PBSに溶解して超遠心により粗エクソソーム画分を得た。粗エクソソーム画分におけるMFG-E8とSynteninの存在量を、SDS-page及びウェスタンブロッティングによって調べた。ウェスタンブロッティングの結果を図１４に示す。 Example 13 : Increased effect of blood exosomes by overexpression of adiponectin in vivo <Method> Adenovirus (mA) or β encoding adiponectin in adiponectin-deficient mice (AKO) and adiponectin-T-cadherin double-deficient mice (DKO) Adenovirus (bGal) encoding galactosidase was administered from the tail vein after aligning the virus titer. Four days after administration, whole blood was collected to obtain serum. Six mouse sera were pooled, and exosomes in the serum were precipitated with a polymer-based precipitant ExoQuick ™. The precipitate was dissolved in PBS and then ultracentrifuged at 110,000 g for 2 hours. The precipitate was dissolved again in PBS and a crude exosome fraction was obtained by ultracentrifugation. The abundance of MFG-E8 and Syntenin in the crude exosome fraction was examined by SDS-page and Western blotting. The result of Western blotting is shown in FIG.

＜結果＞アディポネクチンをコードするアデノウイルス投与によって、血中アディポネクチンレベルはAKOマウスで755μg/ml、DKOマウスで840μg/mlにまで増加した。この時、AKOマウスではβガラクトシダーゼに比して、アディポネクチンによる血中エクソソームのマーカーであるMFG-E8とSynteninが顕著に増加した。T-カドヘリンが欠損しているDKOマウスに比しても2倍程度の増加を示した。以上から、アディポネクチンがT-カドヘリンを介してエクソソーム産生を増加する作用は、生体においても認められた。 <Results> Administration of an adenovirus encoding adiponectin increased blood adiponectin levels to 755 μg / ml in AKO mice and 840 μg / ml in DKO mice. At this time, MFG-E8 and Syntenin, which are markers of blood exosomes by adiponectin, were significantly increased in AKO mice compared to β-galactosidase. Even when compared with DKO mice lacking T-cadherin, the increase was about twice. From the above, the action of adiponectin to increase exosome production via T-cadherin was also observed in the living body.

Claims

An exosome production promoter from cells, comprising at least one selected from the group consisting of adiponectin, adiponectin expression promoter, T-cadherin expression promoter, ADAM12 expression inhibitor, and ADAM12 activity inhibitor.

The exosome production promoter according to claim 1, wherein the cell is at least one selected from the group consisting of vascular endothelial cells, endothelial precursor cells, stem cells, muscle cells, and muscle precursor cells.

The exosome production promoter according to claim 1 or 2, wherein the cells are vascular endothelial cells.

The exosome production promoter according to any one of claims 1 to 3, wherein the T-cadherin expression promoter is a T-cadherin expression vector.

The ADAM12 expression inhibitor is at least one selected from the group consisting of ADAM12-specific siRNA, ADAM12-specific miRNA, ADAM12-specific antisense nucleic acid, and expression vectors thereof. The exosome production promoter described in 1.

The exosome production promoter according to any one of claims 1 to 5, wherein the ADAM12 activity inhibitor is at least one selected from the group consisting of a matrix metalloprotease inhibitor and an expression vector of an ADAM12 dominant negative mutant. .

The exosome production promoter according to any one of claims 1 to 6, wherein the adiponectin is a hexamer or more multimer.

The exosome production promoter according to any one of claims 1 to 7, wherein the cell is a cell in vitro.

A method for promoting exosome production from a cell, comprising a step of contacting the cell with the exosome production promoter according to any one of claims 1 to 8.

A method for producing an exosome, comprising a step of bringing the exosome production promoter according to any one of claims 1 to 8 into contact with a cell, and a step of recovering the exosome produced from the cell.