JP2017127214A - 炭酸ガスインジケーターを有する容器、及びこれを用いた炭酸ガス検知方法 - Google Patents

Abstract

【課題】炭酸ガスを含むガス雰囲気であるガスバリア性の容器から炭酸ガスが漏洩した場合に、使用者が炭酸ガスの漏洩を容易に目視判定できる容器、及び該容器を用いた炭酸ガス検知方法を提供する。【解決手段】容器内が炭酸ガスを含むガス雰囲気であるガスバリア性の容器（Ａ）及び容器（Ａ）を包むガスバリア性の容器（Ｂ）を備える容器において、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）が炭酸ガス濃度０〜０．３ｖｏｌ％のガス雰囲気とされており、且つ該空間部（Ｃ）にガスインジケーターを有する容器。容器（Ｂ）の少なくとも一部透明であり、炭酸ガスインジケーターが炭酸ガスにより色変化を生じる指示薬でありメタクレゾールパープルであることが好ましい容器。容器（Ａ）が微生物培養、保存用容器である容器。該容器を用い、炭酸ガスの漏洩を目視により早期発見する炭酸ガス検知方法。【選択図】なし

Description

本発明は、炭酸ガスの濃度変化を検知するための炭酸ガスインジケーターを有する容器、及び炭酸ガス濃度が変化したことを検知する方法に関する。

生物、生殖又はバイオテクノロジーの研究分野・産業分野において実施される組織、細胞、又は微生物等の生物試料の培養では、大気雰囲気と異なるガス環境が必要とされる。
例えば動物細胞の培養は通常、培養液中の生細胞を培養温度で一定に保持するとともに培養液のｐＨも一定に保持する必要がある。その際、一般的に用いられる重炭酸塩緩衝系培養液の場合、ｐＨを７．４に保持するために炭酸ガス濃度を５ｖｏｌ％程度に保持する必要がある。
また、微生物培養においても発育の促進のために炭酸ガス濃度を一定に保持する必要がある場合がある。例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（淋菌・髄膜炎菌）やＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（インフルエンザ菌）などの炭酸ガス要求菌の培養には炭酸ガス濃度を５〜１０ｖｏｌ％、嫌気性菌の培養には炭酸ガス濃度５〜２５ｖｏｌ％、微好気性菌の培養には炭酸ガス濃度３〜１５ｖｏｌ％に保持する必要がある。

このような生物試料は、炭酸ガス濃度が一定の濃度に調製されたガスバリア性の優れた容器内に入れることにより、培養あるいは保存が可能となる。
しかし、包装容器の穴あきや、シール不良、または輸送中における容器の破壊、すなわちピンホールの発生により容器内のガス雰囲気が変化し、内容の死滅、または変質が生じることがあった。

容器内のガス雰囲気が維持されているかどうかを調べる手段として、例えば容器内の炭酸ガス濃度を検知する方法が考えられる。

炭酸ガスの濃度を検知する容器及び検知方法として、例えば、炭酸ガスインジケーターを高い炭酸ガス濃度環境下に配置し、ピンホール等が発生することにより炭酸ガス濃度が下がった場合に変色して炭酸ガスの漏洩が判定できる容器及び検知方法が知られている（特許文献１）。
しかしながら、一般的に炭酸ガスインジケーターは微小のガス濃度変化を検出するのが困難であり、例えば、炭酸ガス濃度が５．０ｖｏｌ％から４．０ｖｏｌ％に下がったとしても、ガス漏れを検知することは困難であった。

特開２００３−７２８５７号公報

本発明は、炭酸ガスを含むガス雰囲気であるガスバリア性の容器から炭酸ガスが漏洩した場合に、使用者が炭酸ガスの漏洩を容易に目視判定できる容器、及び該容器を用いた炭酸ガス検知方法を提供することにある。

本発明は、容器内が炭酸ガスを含むガス雰囲気であるガスバリア性の容器（Ａ）及び該容器（Ａ）を包むガスバリア性の容器（Ｂ）を備える容器において、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）が炭酸ガス濃度０〜０．３ｖｏｌ％のガス雰囲気とされており、且つ該空間部（Ｃ）に炭酸ガスインジケーターを有する容器、及び該容器を用いた炭酸ガス検知方法を提供する。
すなわち本発明は以下の通りである。

＜１＞
容器内が炭酸ガスを含むガス雰囲気であるガスバリア性の容器（Ａ）及び該容器（Ａ）を包むガスバリア性の容器（Ｂ）を備える容器において、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）が炭酸ガス濃度０〜０．３ｖｏｌ％のガス雰囲気であり、且つ該空間部（Ｃ）に炭酸ガスインジケーターを有する容器。
＜２＞
空間部（Ｃ）の体積が、容器（Ａ）の体積の１／１００〜１である、＜１＞に記載の容器。
＜３＞
容器（Ａ）と容器（Ｂ）が接触してなる容器であって、該接触面の面積が、容器（Ａ）の表面積の１〜７０％である、＜１＞及び＜２＞のいずれかに記載の容器。
＜４＞
容器（Ｂ）の少なくとも一部が透明である、＜１＞〜＜３＞に記載の容器。
＜５＞
炭酸ガスインジケーターが、容器（Ｂ）を通して目視可能である、＜１＞〜＜４＞に記載の容器。
＜６＞
容器（Ｂ）がリジッド容器である、＜１＞〜＜５＞に記載の容器。
＜７＞
容器（Ｂ）内の圧力が、大気圧以上である、＜１＞〜＜６＞に記載の容器。
＜８＞
炭酸ガスインジケーターが、炭酸ガスにより色変化を生じる指示薬である、＜１＞〜＜７＞に記載の容器。
＜９＞
前記指示薬がメタクレゾールパープルである、＜８＞に記載の容器。
＜１０＞
前記容器（Ａ）が細胞培養・保存用の容器である、＜１＞〜＜９＞に記載の容器。
＜１１＞
前記容器（Ａ）が微生物培養・保存用の容器である、＜１＞〜＜９＞に記載の容器。
＜１２＞
＜１＞〜＜９＞のいずれかに記載の容器を用いる、炭酸ガス検知方法。

本発明によれば、容器（Ａ）内が炭酸ガス雰囲気の場合に例えばピンホールが発生し、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）に、容器（Ａ）内の炭酸ガスが漏洩した際、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）の炭酸ガス濃度の微量の変化を直ちに検出でき、容器（Ａ）の炭酸ガス漏洩の早期発見に有効である。

本発明にかかる容器の一例である。

以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
本発明は、容器内が炭酸ガスを含むガス雰囲気であるガスバリア性の容器（Ａ）及び該容器（Ａ）を包むガスバリア性の容器（Ｂ）を備える容器において、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）が炭酸ガス濃度０〜０．３ｖｏｌ％のガス雰囲気であり、且つ該空間部（Ｃ）に炭酸ガスインジケーターを有する容器、及び該容器を用いる炭酸ガス検知方法である。
本発明は、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）に配置する炭酸ガスインジケーターの表示変化により該容器（Ａ）の炭酸ガスの漏洩を検知する方法である。即ち、容器内が炭酸ガスを含むガス雰囲気であるガスバリア性の容器（Ａ）に例えばピンホールが発生すると、容器（Ａ）から炭酸ガスが容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）へ浸入し、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）の炭酸ガス濃度が上昇する。このときに炭酸ガスインジケーターが微量の炭酸ガス濃度の上昇によって変色するため、容器（Ａ）の炭酸ガスの漏洩を早期発見できる。

容器内のガス雰囲気制御のため、容器（Ａ）及び該容器（Ａ）を包む容器（Ｂ）には、ガスバリア性容器を用いる。ガスバリア性容器としては、この種の包装に用いられる公知の各種ガスバリア性を有する包装材であればいずれも利用できる。
ガスバリア性を有する包装材の具体例として、例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、エチレンビニルアルコール共重合体（ＥＶＯＨ）、ポリ塩化ビニリデン（ＰＶＤＣ）、ナイロン等の材質のものや、これらの表面に更に酸化珪素、酸化アルミニウム等の無機物を蒸着させたものや、これら各種材質の多層フィルム（ラミネートフィルム）等が挙げられる。
また、外部から後述する炭酸ガスインジケーターの表示を確認することを容易とするため、上記容器（Ｂ）の少なくとも一部は透明であることが好ましい。

本発明において、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）に有する炭酸ガスインジケーターとしては、炭酸ガスにより指示薬が色変化を生じるインジケーターが好ましい。
炭酸ガスは水に溶けて弱い酸性を呈する。雰囲気中に炭酸ガス濃度が十分に存在するとｐＨ値が低くなるが、炭酸ガス濃度が低下するに従ってｐＨ値が高くなる。そのため、炭酸ガスの検知にはｐＨ値変化に伴って指示薬が色変化を生じるｐＨ指示薬を用いるのが好ましい。

上記ｐＨ指示薬としては、炭酸ガスの影響でその表示色が色調変化を伴うもの、またはアルカリ性物質の濃度変化に応じたｐＨの変動に対してその表示色が色調変化を伴うものであればどのようなものでも使用できる。検知したい炭酸ガス濃度が低濃度であるため、炭酸ガスによるアルカリの中和反応を利用するものが好ましい。したがって該ｐＨ指示薬は中性〜アルカリ性に変色域を持つ指示薬が好ましい。また明確に判定ができるようにはっきりと異なる色彩に変化するｐＨ指示薬が好ましい。さらに高温下でも使用可能となるように熱安定性が高いｐＨ指示薬が好ましい。

中性〜アルカリ性に変色域を持つｐＨ指示薬として、フェノールレッド、シアニン、α−ナフトールフタレイン、メタクレゾールパープル、チモールブルー、ｏ−クレゾールフタレイン、フェノールフタレイン等が挙げられる。この中でも変色域がアルカリ性でありｐＨ９.０で紫色から黄色に変色すること、色彩変化が大きいこと、さらには熱安定性及び化学的安定性が高いこと等の理由より、メタクレゾールパープルが好ましい。

上記ｐＨ指示薬を溶解する溶媒は、指示薬がアルカリ性の色彩を示すようにアルカリ性に調整する必要がある。

水に溶けてアルカリ性を示すアルカリ性物質としては珪酸金属塩、水酸化金属塩、亜硫酸金属塩、炭酸金属塩等が考えられる。しかし、これらの内、炭酸金属塩は炭酸ガスに対する安定性が高く、炭酸ガスが溶解してもｐＨが下がらないため使用できない場合があることから、珪酸金属塩、水酸化金属塩、亜硫酸金属塩が好ましい。

さらに、ｐＨ指示薬は、水に対する溶解性が高い方が好ましい。水に対する溶解性が低い場合、未溶解部が残留し、検知剤に必要な明確な色彩が阻害される可能性もある。

したがって、アルカリ物質は水に対して高い溶解性を持つ点から、水酸化金属塩が好ましい。また、水酸化金属塩によりアルカリ性に調整された系は、その他のアルカリ性物質に比べ炭酸ガスにより容易に中和されやすいという特徴もある。したがって炭酸ガス検知剤に添加されうるアルカリ性物質としては水酸化ナトリウムが最も好ましい。
また、ｐＨ指示薬を用いた炭酸ガスの検知には、一定量の水の存在と保持が必要である。

上記ｐＨ指示薬としてメタクレゾールパープルを用い、溶媒を水酸化金属塩によりアルカリ性に調整した場合、炭酸ガス濃度０〜０．３ｖｏｌ％のときは紫色を示す。一方、ピンホールが発生して容器（Ａ）と容器（Ｂ）の空間部（Ｃ）の炭酸ガス濃度が１ｖｏｌ％以上になると白色へ、３ｖｏｌ％以上になると黄色へと変化する。紫色から白色又は黄色への変色により、容器（Ａ）と容器（Ｂ）の空間部（Ｃ）に炭酸ガスが存在することが目視で識別可能となる。

本発明において、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）は、炭酸ガス濃度０〜０．３ｖｏｌ％のガス雰囲気である。炭酸ガス濃度が０．３ｖｏｌ％より高い場合、容器（Ａ）からの炭酸ガス漏洩がない状態でもインジケーターが変色し、容器（Ａ）からの炭酸ガス漏洩を検知することが困難、または検知が遅くなる。好ましい空間部（Ｃ）のガス雰囲気は、炭酸ガス濃度０〜０．２ｖｏｌ％、より好ましくは０〜０．１ｖｏｌ％、さらに好ましくは空気中の炭酸ガス濃度と同じ０〜０．０４ｖｏｌ％である。
尚、空間部（Ｃ）に含まれる上記炭酸ガス以外のガスの具体例として、空気、窒素、酸素等が挙げられる。

本発明において、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）の体積は、容器（Ａ）にピンホールが生じた際に、炭酸ガスが十分拡散する空間部があることが好ましい。十分な空間がなく、例えば容器（Ａ）と容器（Ｂ）が密着しているような場合、空間部（Ｃ）内でガスが拡散出来なくなるためピンホールより漏洩した炭酸ガスが炭酸ガスインジケーターまで到達しないことが考えられる。ただし、空間が広すぎると、空間部（Ｃ）の炭酸ガス濃度が低くなるため、炭酸ガスインジケーターの変色を識別するのが困難になる。好ましい空間部（Ｃ）の体積は、容器（Ａ）の体積の１／１００〜１、より好ましくは１／２０〜１／２、さらに好ましくは１／１０〜１／２である。

また、容器（Ａ）と容器（Ｂ）が接触する場合、接触面積が大きいとガス拡散が阻害されるため、ピンホールが生じた際に、容器（Ａ）内の炭酸ガスが炭酸ガスインジケーターに到達することが阻害されてしまい、インジケーターが変色せず、炭酸ガスの漏洩を検知することが困難、または検知が遅くなる。また、容器（Ａ）と容器（Ｂ）の接触部分にピンホールが生じた際も同様に、容器（Ａ）内の炭酸ガスが炭酸ガスインジケーターに到達することが阻害されてしまう。上記の理由から容器（Ａ）と容器（Ｂ）の接触面積は、容器（Ａ）の表面積の１〜７０％が好ましく、より好ましくは１〜５０％、さらに好ましくは１〜２０％である。また、容器（Ａ）に足やつっぱり部分を付与することにより、接触部分を１〜５％にすることがとりわけ好ましい。

上記の容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側に炭酸ガスが十分拡散する空間部を確保する方法として、容器（Ｂ）をカップ或いはトレイのように輸送や保存時に容易につぶされない硬さがあるリジッド容器とすることが好ましい。リジッド容器としては、ガスバリア性のリジッド容器を用いてもよいし、ガスバリア性のないリジッド容器にガスバリア性フィルムをコーティングした容器でも良い。リジッド容器にした場合は、容器（Ｂ）のピンホール発生の問題が生じ難いためである。

上記の容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）に炭酸ガスが十分拡散する空間を確保する方法として、容器（Ｂ）内の圧力を大気圧以上とすることが好ましい。この手法では容器（Ｂ）が膨らむため、容器（Ａ）と容器（Ｂ）の空間部（Ｃ）を適度に調整することが可能である。

上記容器（Ａ）が包装する対象は、特に制限はないが、細胞や微生物に適用できる。本願記載の容器（Ａ）は、細胞培養・保存用又は微生物培養・保存用の容器であることが好ましい。
本発明における被包装物として例えば、細胞や微生物などの生物試料が挙げられる。
細胞は、培養や保存時に炭酸ガス濃度を一定に保持する必要がある細胞である。その具体例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ細胞やヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ細胞等が挙げられる。
微生物は、培養や保存時に炭酸ガス濃度を一定に保持する必要がある微生物である。微生物の例として、炭酸ガス要求菌であるＮｅｉｓｓｅｒｉａ（淋菌・髄膜炎菌）やＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（インフルエンザ菌）、嫌気性菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ブドウ球菌、グラム陽性球菌）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム属、グラム陽性桿菌）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属（リステリア属、グラム陽性桿菌）、大腸菌（エシェリキア属、グラム陰性桿菌）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属（ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、破傷風菌）等、微好気性菌であるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ等が挙げられる。

本発明の容器（Ａ）内には炭酸ガスを含む。細胞や微生物を容器（Ａ）で包装する場合、容器（Ａ）内の炭酸ガス濃度は、容器（Ａ）で包装する細胞や培地、微生物の種類に応じて好ましくは１〜２５ｖｏｌ％、より好ましくは５〜２０ｖｏｌ％に調整する。

上記炭酸ガスを含むガス雰囲気は、容器に入れる細胞や微生物の種類に応じて、例えば任意の混合比の炭酸ガスと空気の混合ガス等の炭酸ガスを含むガスを容器内に封入するか、あるいは例えばエージレスＧ（商品名、三菱瓦斯化学（株）製）等の炭酸ガス発生型脱酸素剤を容器内に封入することにより得られる。後者の場合、容器内の例えば酸素等の炭酸ガス発生源の濃度を調整することにより、容器内の炭素ガス濃度を制御し得る。

本発明において、容器（Ａ）の炭酸ガスの漏洩を検知する方法は、容器（Ａ）に例えば細胞や微生物等の生物試料を入れ、包装材内部のガス雰囲気を調整する。その後、容器（Ａ）を容器（Ｂ）で体積が１／１００〜１、より好ましくは１／２０〜１／２、さらに好ましくは１／１０〜１／２になるように包む。このとき、容器（Ａ）と容器（Ｂ）の空間部（Ｃ）に炭酸ガスインジケーターを封入する。万が一、容器（Ａ）にピンホールが生じた際には、炭酸ガスインジケーターが空間部（Ｃ）中の微量の炭酸ガス濃度の変化を検出するため、直ちに目視にて異常を発見することができる。尚、炭酸ガスインジケーターの位置は、検知を容易とするため外部から炭酸ガスインジケーターが容器（Ｂ）を通して目視可能である位置に配置することが好ましい。

次に本発明の方法を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は要旨を超えない限り以下の実施例によって限定されるものではない。

実施例１
容器（Ａ）にはＰＥＴ製の炭酸ガスバリア性袋、容器（Ｂ）には透明なＰＥＴ製のガスバリア性リジッド容器を用いた。
容器（Ａ）に細胞とともにガス濃度調整剤としてカルチャーパルＣＯ_２ ０．５Ｌ（商品名、三菱瓦斯化学（株）製）と空気５００ｍＬを入れ、炭酸ガス濃度を５ｖｏｌ％、酸素濃度を１５ｖｏｌ％に調整した。
容器（Ａ）と容器（Ｂ）の空間部（Ｃ）の体積が５０ｍＬ（空間部（Ｃ）の体積は容器（Ａ）の体積の１／１０）、容器（Ｂ）の圧力が大気圧以上となるように空気を入れ、該空間部（Ｃ）に炭酸ガスインジケーターを封入した。容器（Ａ）と容器（Ｂ）の接触面の面積は、容器（Ａ）の表面積の４％であった。
炭酸ガスインジケーターは、ｐＨ指示薬にメタクレゾールパープルを利用し、保水材としてグリセリンを含み、添加したｐＨ指示薬がアルカリ色を示すように調整されたリン酸ナトリウム水溶液を含浸させた基材を水蒸気透過度が２０ｇ／ｍ^２／２４ｈｒｓ以下の小袋内に封入したものを用いた。

容器（Ａ）にピンホールが発生していない正常な状態で３５℃にて３時間保存したとき、炭酸ガスインジケーターは初期と変わらず紫色を示していた。これは炭酸ガス濃度０ｖｏｌ％であることを示している。
容器（Ａ）に、注射針（テルモ（株）製、注射針ネオラス ２７Ｇ）で、直径０．５ｍｍのピンホールを故意に開けて３５℃にて３時間保存したとき、炭酸ガスインジケーターは紫色から白色へ変色し、これは炭酸ガス濃度が上昇したことを示しており、炭酸ガスの漏洩を目視で判断できた。

比較例１
炭酸ガスインジケーターを封入しない以外は、実施例１と同様に細胞を包装した。
容器（Ａ）にピンホールが発生していない正常な状態で３５℃にて３時間保存したときと容器（Ａ）にピンホールを故意に開けて３５℃にて３時間保存したとき、目視では違いが分からず容器（Ａ）の炭酸ガスの漏洩を判断できなかった。

比較例２
容器（Ａ）と容器（Ｂ）の空間部（Ｃ）に炭酸ガス濃度１００ｖｏｌ％のガスを入れる以外は、実施例１と同様に細胞を包装した。
容器（Ａ）にピンホールが発生していない正常な状態で３５℃にて３時間保存したときと容器（Ａ）にピンホールを故意に開けて３５℃にて３時間保存したとき、目視では違いが分からず炭酸ガスの漏洩を判断できなかった。

１…細胞又は微生物
２…容器（Ａ）
３…容器（Ｂ）
４…炭酸ガスインジケーター
５…空間部（Ｃ）、炭酸ガス濃度０〜０．３ｖｏｌ％のガス雰囲気
６…炭酸ガスを含むガス雰囲気

Claims (12)

1. 容器内が炭酸ガスを含むガス雰囲気であるガスバリア性の容器（Ａ）及び該容器（Ａ）を包む容器（Ｂ）を備える容器において、容器（Ａ）の外側と容器（Ｂ）の内側の空間部（Ｃ）が炭酸ガス濃度０〜０．３ｖｏｌ％のガス雰囲気であり、且つ該空間部（Ｃ）に炭酸ガスインジケーターを有する容器。
2. 空間部（Ｃ）の体積が、容器（Ａ）の体積の１／１００〜１である、請求項１に記載の容器。
3. 容器（Ａ）と容器（Ｂ）が接触してなる容器であって、該接触面の面積が、容器（Ａ）の表面積の１〜７０％である、請求項１又は２に記載の容器。
4. 容器（Ｂ）の少なくとも一部が透明である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の容器。
5. 炭酸ガスインジケーターが、容器（Ｂ）を通して目視可能である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の容器。
6. 容器（Ｂ）がリジッド容器である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の容器。
7. 容器（Ｂ）内の圧力が、大気圧以上である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の容器。
8. 炭酸ガスインジケーターが、炭酸ガスにより色変化を生じる指示薬である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の容器。
9. 前記指示薬がメタクレゾールパープルである、請求項８に記載の容器。
10. 前記容器（Ａ）が細胞培養・保存用の容器である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の容器。
11. 前記容器（Ａ）が微生物培養・保存用の容器である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の容器。
12. 請求項１〜９のいずれか一項に記載の容器を用いる、炭酸ガス検知方法。

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