JP2017104106A - Single species stem cells - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ドナーから採取した原料骨髄液から作られる単一種幹細胞に関する。 The present invention relates to single-type stem cells made from raw bone marrow fluid collected from a donor.
幹細胞を培養する培地と、幹細胞に対して照射エネルギーが0を超え10ジュール/cm2以下、レーザパワー密度が0.1W/cm2以下、照射エネルギーを0.1以上2.5ジュール/cm2以下の低出力の炭酸ガスレーザーの照射光をデフォーカスして培地全体に照射し、幹細胞を活性化させるレーザー照射手段とを備え、幹細胞に低出力のレーザーを照射して活性化させた後、幹細胞に所定の休止期間を設けて目標増殖数まで増殖させる幹細胞培養方法が開示されている。この幹細胞培養方法によれば、ヒト、非ヒト(動物)から採取した組織またはその細胞に存在する幹細胞を活性化させて飛躍的に増殖させることができる。 A medium for culturing stem cells, and the irradiation energy for stem cells exceeds 0 and is less than 10 joules / cm 2 , the laser power density is not more than 0.1 W / cm 2 , and the irradiation energy is not less than 0.1 and not more than 2.5 joules / cm 2 After defocusing the irradiation light of the following low-power carbon dioxide laser and irradiating the whole medium, and equipped with a laser irradiation means to activate the stem cells, after activating the stem cells by irradiating the low-power laser, A stem cell culturing method is disclosed in which a predetermined rest period is provided for a stem cell to proliferate to a target proliferation number. According to this stem cell culture method, tissue collected from humans and non-humans (animals) or stem cells present in the cells can be activated and proliferated dramatically.
ドナーから採取した組織またはその細胞には多種雑多な幹細胞が存在するから、組織または細胞に存在する幹細胞を培養したとしても多種雑多な幹細胞が増殖し、特定種類の単一種幹細胞のみを培養することができない。幹細胞は、各種の疾患(心血管疾患や中枢神経系疾患等)の治療や再生医療、非治療的用途に利用されるが、培養された多種雑多な幹細胞は、特定種類の単一種幹細胞のみからなる場合と比較し、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が小さく、各種の疾患を完治させる確立が低く、各種の組織や各種の臓器を再生させる確立が低い。なお、前記特許文献1に開示の幹細胞培養方法では、多種雑多な幹細胞が培養され、特定種類の単一種幹細胞のみを培養することができない。特許文献1に開示の幹細胞培養方法によって作られた幹細胞は、治療の効果や再生医療における再生の効果にばらつきが生じ、各種の疾患を完治させる確立や各種の組織や各種の臓器を再生させる確立が低い。 Since various stem cells are present in the tissue or cells collected from the donor, even if stem cells existing in the tissue or cells are cultured, the various stem cells will proliferate and only a single type of stem cell of a specific type will be cultured I can't. Stem cells are used for the treatment of various diseases (cardiovascular diseases, central nervous system diseases, etc.), regenerative medicine, and non-therapeutic applications, but the variegated stem cells cultured from only a single type of stem cell Compared to the case, the effect of treatment for various diseases and the effect of regeneration in regenerative medicine are small, the probability of completely curing various diseases is low, and the probability of regenerating various tissues and various organs is low. In addition, in the stem cell culture method disclosed in Patent Document 1, various stem cells are cultured, and it is not possible to culture only a specific type of single-type stem cells. Stem cells produced by the stem cell culturing method disclosed in Patent Document 1 vary in treatment effect and regeneration effect in regenerative medicine, and are established to completely cure various diseases and regenerate various tissues and organs. Is low.
本発明の目的は、多種雑多な幹細胞を含むことがなく、各種の疾患に対する治療の効果や再生医療における再生の効果が大きく、各種の疾患を完治させる確立が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確立が高い単一種幹細胞を提供することにある。 The object of the present invention is that it does not contain various stem cells, has a large therapeutic effect on various diseases and a regenerative effect in regenerative medicine, is highly established to completely cure various diseases, and various tissues and various organs. It is to provide a single-type stem cell having a high probability of regenerating.
前記課題を解決するための本発明の前提は、ドナーから採取した原料骨髄液から作られる単一種幹細胞である。 The premise of the present invention to solve the above problems is a single-type stem cell made from a raw bone marrow fluid collected from a donor.
前記前提における本発明の単一種幹細胞は、ドナーから採取した原料骨髄液を層状に分離し、層状に分離させた原料骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を抽出し、所定容量かつ所定面積の底面を有する第1培養容器に中間層骨髄液と培養液とを注入して中間層骨髄液に含まれる第1幹細胞を第1培養容器の底面に定着させ、第1幹細胞が第1培養容器の底面に定着した後、第1培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第1培養容器に注入して第1幹細胞を増殖させ、第1幹細胞が伸張して第1幹細胞の総平面面積が第1培養容器の底面面積に対して第1目標割合に達した後、第1培養容器から第1幹細胞を抽出する第1培養手段と、第1培養手段によって抽出した第1幹細胞を層状に遠心分離し、層状に分離させた第1幹細胞のうちの最下層に位置する第2幹細胞を抽出するとともに、所定容量かつ所定面積の底面を有して第1培養容器よりも大きい容量かつ大きい底面面積の第2培養容器に第2幹細胞とあらたな培養液とを注入して第2幹細胞を第2培養容器の底面に定着させ、第2幹細胞が第2培養容器の底面に定着した後、第2培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第2培養容器に注入して第2幹細胞を増殖させ、第2幹細胞が伸張して第2幹細胞の総平面面積が第2培養容器の底面面積に対して第2目標割合に達した後、第2培養容器から第2幹細胞を抽出する第2培養手段とを実施することから作られていることを特徴とする。 The single-type stem cell of the present invention in the above premise is obtained by separating a raw material bone marrow fluid collected from a donor into a layered form, extracting an intermediate layer bone marrow fluid located in an intermediate layer of the separated raw material bone marrow fluid, and having a predetermined volume In addition, the intermediate layer bone marrow fluid and the culture solution are injected into a first culture vessel having a bottom surface of a predetermined area to fix the first stem cells contained in the intermediate layer bone marrow fluid to the bottom surface of the first culture vessel, and the first stem cells are After fixing on the bottom surface of one culture vessel, a new culture solution is poured into the first culture vessel while discharging the culture solution in the first culture vessel to proliferate the first stem cells. After the total planar area of one stem cell reaches the first target ratio with respect to the bottom area of the first culture container, the first culture means for extracting the first stem cells from the first culture container and the first culture means are used for extraction. First stem cells are centrifuged in layers and separated into layers Extracting the second stem cell located in the lowest layer of the cells, and having the second stem cell in a second culture container having a predetermined volume and a predetermined area of a bottom surface and a larger capacity and a larger bottom area than the first culture container A new culture solution is injected to fix the second stem cells on the bottom surface of the second culture vessel. After the second stem cells are fixed to the bottom surface of the second culture vessel, the culture solution in the second culture vessel is discharged. A new culture solution is injected into the second culture vessel to proliferate the second stem cells, the second stem cells expand, and the total planar area of the second stem cells becomes the second target ratio with respect to the bottom area of the second culture vessel. And a second culturing means for extracting the second stem cells from the second culture container.
本発明の一例としては、単一種幹細胞が、第1培養手段を1回実施し、第2培養手段を少なくとも2回実施することから作られ、2回目からの第2培養手段では、所定容量かつ所定面積の底面を有して第2培養容器よりも大きい容量かつ大きい底面面積の第3培養容器が使用され、1回目の第2培養手段によって第2培養容器から抽出された第2幹細胞を第3培養容器に定着させるとともに、第3培養容器において前記第2幹細胞を増殖させる。 As an example of the present invention, single-type stem cells are produced by performing the first culturing means once and performing the second culturing means at least twice. In the second culturing means from the second time, a predetermined volume and A third culture container having a bottom surface with a predetermined area and a larger capacity and a larger bottom surface area than the second culture container is used, and the second stem cells extracted from the second culture container by the first second culture means are used as the first culture cells. The second stem cells are allowed to grow in the third culture container while being fixed in the three culture containers.
本発明の他の一例として、第1培養手段では、ドナーから2〜3ccの原料骨髄液を採取し、2〜3ccの原料骨髄液を上下方向へ延びる分離容器に注入し、分離容器を体温と略同一の温度で所定時間静的に放置して原料骨髄液を分離容器内において上下方向へ層状に分離させ、分離容器内において層状に分離した原料骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を注射器またはピペットによって抽出する。 As another example of the present invention, in the first culture means, 2 to 3 cc of raw bone marrow fluid is collected from a donor, and 2 to 3 cc of raw bone marrow fluid is injected into a separation container extending in the vertical direction. The intermediate layer located in the intermediate layer of the raw bone marrow fluid separated into layers in the separation container by allowing the raw material bone marrow fluid to stand statically for a predetermined time at substantially the same temperature to separate the raw material bone marrow fluid in layers in the vertical direction. Bone marrow fluid is extracted by syringe or pipette.
本発明の他の一例としては、第1培養容器の容量が約20〜30ccであり、第1培養手段では、中間層骨髄液と培養液とを第1培養容器に注入した後、第1培養容器を所定角度に傾斜させた状態で第1培養容器を体温と略同一の温度で12〜24時間静的に放置しつつ、12〜24時間の間において約1〜2時間間隔で第1培養容器内の第1幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第1幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第1幹細胞が第1培養容器の底面に定着したと判断する。 As another example of the present invention, the capacity of the first culture vessel is about 20 to 30 cc. In the first culture means, the intermediate layer bone marrow fluid and the culture solution are injected into the first culture vessel, and then the first culture is performed. While the container is inclined at a predetermined angle, the first culture container is statically left at a temperature substantially the same as the body temperature for 12 to 24 hours, and the first culture is performed at intervals of about 1 to 2 hours between 12 and 24 hours. When the deformation of the first stem cell in the container from the initial planar shape is observed and the first stem cell is deformed from the initial planar shape to a predetermined planar shape, it is determined that the first stem cell has settled on the bottom surface of the first culture container. .
本発明の他の一例としては、第1幹細胞の初期平面形状が略円形であり、第1幹細胞の変形後の平面形状が略円形を核として第1幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、第1培養手段では、第1幹細胞が不定形の扁平形状に変形した場合に第1幹細胞が第1培養容器の底面に定着したと判断する。 As another example of the present invention, the initial planar shape of the first stem cell is a substantially circular shape, and the planar shape after the deformation of the first stem cell is a flat shape in which the first stem cell extends in one direction indefinitely with a substantially circular shape as a nucleus. The first culture means determines that the first stem cells have settled on the bottom surface of the first culture container when the first stem cells are deformed into an irregular flat shape.
本発明の他の一例として、第1培養手段では、第1幹細胞が第1培養容器の底面に定着し、第1培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第1培養容器に注入した後、第1培養容器を所定角度に傾斜させた状態で第1培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で第1培養容器の底面に定着した第1幹細胞の第1培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する。 As another example of the present invention, in the first culture means, the first stem cells are fixed on the bottom surface of the first culture vessel, and the new culture solution is discharged to the first culture vessel while discharging the culture solution in the first culture vessel. After the injection, the first culture container is statically left at a temperature substantially the same as the body temperature for 36 to 48 hours with the first culture container tilted at a predetermined angle, and about 1 to about 36 to 48 hours. The total planar area with respect to the bottom area of the first culture vessel of the first stem cells fixed on the bottom surface of the first culture vessel is observed at intervals of 2 hours.
本発明の他の一例としては、第1培養容器の底面面積に対する第1幹細胞の総平面面積の第1目標割合が70〜80%である。 As another example of the present invention, the first target ratio of the total planar area of the first stem cells to the bottom area of the first culture vessel is 70 to 80%.
本発明の他の一例として、第2培養手段では、第1幹細胞を分離容器に注入し、分離容器を遠心分離器に設置して第1幹細胞を遠心分離させ、分離容器内において層状に遠心分離した第1幹細胞のうちの最下層に位置する第2幹細胞を注射器またはピペットによって抽出する。 As another example of the present invention, in the second culture means, the first stem cells are injected into a separation container, the separation container is placed in a centrifuge, the first stem cells are centrifuged, and the layers are centrifuged in layers in the separation container. The 2nd stem cell located in the lowest layer among the 1st stem cells which were done is extracted with a syringe or a pipette.
本発明の他の一例としては、第2培養容器の容量が約40〜60ccであり、第3培養容器の容量が約70〜80ccであり、第2培養手段では、第2および第3培養容器に第2幹細胞とあらたな培養液とを注入した後、第2および第3培養容器を所定角度に傾斜させた状態で第2および第3培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で第2および第3培養容器内の第2幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第2幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第2幹細胞が第2および第3培養容器の底面に定着したと判断する。 As another example of the present invention, the capacity of the second culture container is about 40-60 cc, the capacity of the third culture container is about 70-80 cc, and the second culture means uses the second and third culture containers. After injecting the second stem cells and a new culture medium into the second and third culture vessels, the second and third culture vessels are inclined at a predetermined angle, and the second and third culture vessels are at a temperature substantially the same as the body temperature for 36 to 48 hours. While standing statically, the deformation from the initial planar shape of the second stem cells in the second and third culture vessels was observed at intervals of about 1 to 2 hours during 36 to 48 hours. When the shape is changed to a predetermined planar shape, it is determined that the second stem cells have settled on the bottom surfaces of the second and third culture vessels.
本発明の他の一例としては、第2幹細胞の初期平面形状が略円形であり、第2幹細胞の変形後の平面形状が略円形を核として第2幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、第2培養手段では、第2幹細胞が不定形の扁平形状に変形した場合に第2幹細胞が第2および第3培養容器の底面に定着したと判断する。 As another example of the present invention, the initial planar shape of the second stem cell is a substantially circular shape, and the planar shape after the deformation of the second stem cell is a flat shape in which the second stem cell extends in an indefinite shape in one direction with a substantially circular shape as a nucleus. The second culture means determines that the second stem cells have settled on the bottom surfaces of the second and third culture containers when the second stem cells are deformed into an irregular flat shape.
本発明の他の一例として、第2培養手段では、第2幹細胞が第2および第3培養容器の底面に定着し、第2および第3培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第2および第3培養容器に注入した後、第2および第3培養容器を所定角度に傾斜させた状態で第2および第3培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で第2および第3培養容器の底面に定着した第2幹細胞の第2および第3培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する。 As another example of the present invention, in the second culture means, the second stem cells are fixed on the bottom surfaces of the second and third culture vessels, and a new culture solution is discharged while discharging the culture solution in the second and third culture vessels. Is injected into the second and third culture vessels, and the second and third culture vessels are statically kept at the same temperature as the body temperature for 36 to 48 hours with the second and third culture vessels inclined at a predetermined angle. The total planar area of the second stem cells fixed to the bottom surfaces of the second and third culture vessels at intervals of about 1 to 2 hours during 36 to 48 hours with respect to the bottom surface areas of the second and third culture vessels Observe.
本発明の他の一例としては、第2および第3培養容器の底面面積に対する第2幹細胞の総平面面積の第2目標割合が88〜92%である。 As another example of the present invention, the second target ratio of the total planar area of the second stem cells to the bottom area of the second and third culture vessels is 88 to 92%.
本発明の他の一例としては、第1および第2幹細胞が間葉系幹細胞である。 As another example of the present invention, the first and second stem cells are mesenchymal stem cells.
本発明にかかる単一種幹細胞によれば、層状に分離させた原料骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を抽出し、中間層骨髄液を培養液とともに培養して第1幹細胞を第1培養容器の底面に定着させ、第1幹細胞の総平面面積が第1培養容器の底面面積に対して第1目標割合に達した場合、第1培養容器から第1幹細胞を抽出し、層状に分離させた第1幹細胞のうちの最下層に位置する第2幹細胞を抽出するとともに、第2幹細胞を培養液とともに培養して第2幹細胞を第2培養容器の底面に定着させ、第2幹細胞の総平面面積が第2培養容器の底面面積に対して第2目標割合に達した場合、第2培養容器から第2幹細胞を抽出することから作られているから、多種雑多な幹細胞が含まれることはなく、多種雑多な幹細胞が含まれている場合と比較し、各種の疾患を完治させる確立が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確立が高く、各種疾患の治療に好適に使用することができ、各種組織や各種臓器を再生に好適に使用することができる。単一種幹細胞は、層状に分離させた原料骨髄液から特定の中間層骨髄液を抽出し、層状に分離させた第1幹細胞から特定の第2幹細胞を抽出することで、不要な幹細胞が除去されたピュア(純粋)な幹細胞であり、単一種幹細胞に多種雑多な幹細胞が含まれることがないから、各種疾患の治療の効果や再生医療における再生の効果が安定し、各種疾患を早期かつ確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を早期かつ確実に再生させることができる。 According to the single-type stem cell according to the present invention, the intermediate layer bone marrow fluid located in the intermediate layer of the raw material bone marrow fluid separated into layers is extracted, and the intermediate layer bone marrow fluid is cultured with the culture solution to obtain the first stem cell. When the total planar area of the first stem cells reaches the first target ratio with respect to the bottom area of the first culture container, the first stem cells are extracted from the first culture container and layered. The second stem cells located in the lowermost layer of the first stem cells separated into the second stem cells are cultured, and the second stem cells are cultured together with the culture solution so that the second stem cells are fixed on the bottom surface of the second culture vessel. When the total plane area of the second culture container reaches the second target ratio with respect to the bottom surface area of the second culture container, it is made from extracting the second stem cells from the second culture container, so that various stem cells are included. Never contain miscellaneous stem cells Compared to cases, there is a high probability of complete cure of various diseases and a high probability of regeneration of various tissues and organs, which can be used favorably for the treatment of various diseases. It can be preferably used. Single-species stem cells are extracted by extracting specific intermediate layer bone marrow fluid from the raw material bone marrow fluid separated in layers, and by extracting specific second stem cells from the first stem cells separated in layers, unnecessary stem cells are removed. Because pure stem cells do not contain a variety of stem cells in a single type of stem cell, the effect of treating various diseases and the effect of regeneration in regenerative medicine are stable, and various diseases can be treated early and reliably. It can be completely cured, and various tissues and various organs can be regenerated early and reliably.
第1培養手段を1回実施し、第2培養手段を少なくとも2回実施することから単一種幹細胞が作られ、2回目からの前記第2培養手段において、所定容量かつ所定面積の底面を有して第2培養容器よりも大きい容量かつ大きい底面面積の第3培養容器が使用され、1回目の第2培養手段によって第2培養容器から抽出された第2幹細胞を第3培養容器に定着させるとともに、第3培養容器において第2幹細胞を増殖させる単一種幹細胞は、第2培養手段を少なくとも2回実施し、2回目からの第2培養手段において第3培養容器を利用して多量の単一種幹細胞を作ることができ、多数の患者の疾患の完治に利用することができるとともに、多数の患者の組織や臓器の再生に利用することができる。 A single-type stem cell is produced by performing the first culturing means once and the second culturing means at least twice, and the second culturing means from the second time has a bottom surface with a predetermined volume and a predetermined area. A third culture vessel having a larger capacity and a larger bottom area than the second culture vessel is used, and the second stem cells extracted from the second culture vessel by the first second culture means are fixed in the third culture vessel. The single-type stem cells for proliferating the second stem cells in the third culture vessel are subjected to the second culture means at least twice, and a large amount of single-type stem cells are used in the second culture means from the second time using the third culture vessel. It can be used for the complete cure of diseases of many patients and can be used for regeneration of tissues and organs of many patients.
第1培養手段において、ドナーから2〜3ccの原料骨髄液を採取し、2〜3ccの原料骨髄液を上下方向へ延びる分離容器に注入し、分離容器を体温と略同一の温度で所定時間静的に放置して原料骨髄液を分離容器内において上下方向へ層状に分離させ、分離容器内において層状に分離した原料骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を注射器またはピペットによって抽出する単一種幹細胞は、多種雑多な幹細胞を含む原料骨髄液を体温と略同一の温度で所定時間静的に放置して上下方向へ層状に分離させることで、原料骨髄液から特定の中間層骨髄液が確実に抽出され、不要な幹細胞が除去されるから、各種疾患の治療の効果や再生医療における再生の効果が安定し、各種疾患を早期かつ確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を早期かつ確実に再生させることができる。単一種幹細胞は、ドナーから採取された2〜3ccの少量の原料骨髄液から作られるから、原料骨髄液の採取時にドナーにかかる負担を最小限にすることができる。 In the first culturing means, 2 to 3 cc of raw bone marrow fluid is collected from a donor, and 2 to 3 cc of raw bone marrow fluid is injected into a separation container extending in the vertical direction, and the separation container is kept at a temperature substantially the same as the body temperature for a predetermined time. The bone marrow fluid is separated into layers in the vertical direction in the separation container, and the middle layer bone marrow fluid located in the middle layer of the raw material bone marrow fluid separated into layers in the separation container is extracted with a syringe or pipette Single-species stem cells consist of a specific intermediate layer bone marrow from the source bone marrow fluid by separating the raw bone marrow fluid containing various stem cells statically at a temperature substantially the same as the body temperature for a predetermined time and separating it in layers in the vertical direction. Since the fluid is reliably extracted and unnecessary stem cells are removed, the effect of treating various diseases and the effect of regeneration in regenerative medicine are stabilized, and various diseases can be cured quickly and reliably. It can be regenerated seed organs early and reliably. Since single-type stem cells are made from a small amount of raw bone marrow fluid of 2-3 cc collected from the donor, the burden on the donor can be minimized when collecting the raw bone marrow fluid.
第1培養容器の容量が約20〜30ccであり、第1培養手段において、中間層骨髄液と培養液とを第1培養容器に注入した後、第1培養容器を所定角度に傾斜させた状態で第1培養容器を体温と略同一の温度で12〜24時間静的に放置しつつ、12〜24時間の間において約1〜2時間間隔で第1培養容器内の第1幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第1幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第1幹細胞が第1培養容器の底面に定着したと判断する単一種幹細胞は、第1培養容器の容量が30ccを超過すると、第1幹細胞が第1培養容器の底面に定着し難くなるとともに第1幹細胞の増殖が遅くなるが、前記容量の第1培養容器を使用することで、第1幹細胞が第1培養容器の底面に早期かつ容易に定着し、第1培養容器において第1幹細胞が素早く増殖することで、単一種幹細胞が短い期間で作られるから、各種疾患の治療にタイムリーに利用することができる。単一種幹細胞は、第1培養容器を体温と略同一の温度で12〜24時間静的放置しつつ、12〜24時間の間において約1〜2時間間隔で第1培養容器内の第1幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第1幹細胞の第1培養容器の底面に対する定着が適宜に確認され、第1幹細胞の定着を確認した後、第1培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第1培養容器に注入することで、第1幹細胞の増殖が確実に促進され、単一種幹細胞が短い期間で作られるから、それを各種疾患の治療にタイムリーに利用することができる。単一種幹細胞は、第1培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置することで、第1培養容器の底面に第1幹細胞を確実に定着させることができる。 The first culture vessel has a capacity of about 20 to 30 cc, and in the first culture means, after the intermediate layer bone marrow fluid and the culture solution are injected into the first culture vessel, the first culture vessel is inclined at a predetermined angle. The initial culture plane of the first stem cells in the first culture container at intervals of about 1 to 2 hours between 12 and 24 hours while the first culture container is statically left at a temperature substantially the same as the body temperature for 12 to 24 hours. When the first stem cell is observed to be deformed from the shape and the first stem cell is deformed from the initial planar shape to the predetermined planar shape, it is determined that the first stem cell is fixed on the bottom surface of the first culture vessel. When the capacity of the first stem cell exceeds 30 cc, the first stem cell becomes difficult to settle on the bottom surface of the first culture container and the growth of the first stem cell is slowed down. By using the first culture container of the capacity, the first stem cell Quickly and easily settles on the bottom of the first culture vessel By first stem cells in the first culture vessel to quickly grow, because a single type stem cells are made in a short period, it can be utilized in a timely manner for the treatment of various diseases. The single-type stem cells are the first stem cells in the first culture container at intervals of about 1 to 2 hours between 12 and 24 hours while the first culture container is statically left at a temperature substantially the same as the body temperature for 12 to 24 hours. After the deformation from the initial planar shape of the first stem cells was observed, the first stem cells were properly fixed on the bottom surface of the first culture container, and after confirming the first stem cells were fixed, the culture medium in the first culture container was discharged. By injecting a new culture solution into the first culture vessel, the growth of the first stem cells is surely promoted, and single-type stem cells are produced in a short period of time, so that they can be used in a timely manner for the treatment of various diseases. be able to. Single-type stem cells can be firmly fixed on the bottom surface of the first culture container by statically leaving the first culture container in a state where the first culture container is inclined at a predetermined angle for a predetermined time.
第1幹細胞の初期平面形状が略円形であり、第1幹細胞の変形後の平面形状が略円形を核として第1幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、第1培養手段において、第1幹細胞が不定形の扁平形状に変形した場合に第1幹細胞が第1培養容器の底面に定着したと判断する単一種幹細胞は、第1幹細胞の第1培養容器の底面に対する定着が正確に判断され、第1幹細胞の定着を確認した後、第1培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第1培養容器に注入することで、第1幹細胞の増殖が確実に促進され、単一種幹細胞が短い期間で作られるから、それを各種疾患の治療にタイムリーに利用することができる。 The initial planar shape of the first stem cell is a substantially circular shape, and the planar shape after the deformation of the first stem cell is a flat shape in which the first stem cell extends in an indefinite shape in one direction with the substantially circular shape as a nucleus. The single-type stem cell that determines that the first stem cell has settled on the bottom surface of the first culture container when the first stem cell is deformed into an irregular flat shape is accurately fixed to the bottom surface of the first culture container. After confirming the establishment of the first stem cells, the growth of the first stem cells is surely promoted by injecting a new culture solution into the first culture vessel while discharging the culture solution in the first culture vessel. Since single-type stem cells are produced in a short period of time, it can be used in a timely manner for the treatment of various diseases.
第1培養手段において、第1幹細胞が第1培養容器の底面に定着し、第1培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第1培養容器に注入した後、第1培養容器を所定角度に傾斜させた状態で第1培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で第1培養容器の底面に定着した第1幹細胞の第1培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する単一種幹細胞は、約1〜2時間間隔で総平面面積を観察することで、第1幹細胞の第1培養容器の底面面積に対する総平面面積が正確に確認され、第1培養容器から抽出した第1幹細胞を層状に遠心分離することで不要な幹細胞を除去した第2幹細胞が抽出されるから、単一種幹細胞に多種雑多な幹細胞が含まれることがなく、各種疾患の治療の効果や再生医療における再生の効果が安定し、各種疾患を早期かつ確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を早期かつ確実に再生させることができる。単一種幹細胞は、第1培養容器の底面に第1幹細胞が定着した後、第1培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第1培養容器に注入するとともに第1培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置することで、第1幹細胞の増殖を確実に促進することができる。 In the first culture means, the first stem cells are fixed on the bottom surface of the first culture container, and after the culture medium in the first culture container is discharged, a new culture liquid is injected into the first culture container, and then the first culture container The first culture vessel is allowed to stand at a temperature substantially the same as the body temperature for 36 to 48 hours while being inclined at a predetermined angle, while the first culture vessel is about 1 to 2 hours apart during 36 to 48 hours. The single-type stem cell that observes the total planar area of the first stem cells that have settled on the bottom surface of the first culture cell with respect to the bottom area of the first culture vessel observes the total planar area at intervals of about 1 to 2 hours. Since the total planar area with respect to the bottom surface area of the culture container is accurately confirmed, the second stem cell from which unnecessary stem cells are removed is extracted by centrifuging the first stem cells extracted from the first culture container in a single layer. Stem cells may contain a variety of stem cells Ku, the effect of regeneration in effect and regenerative medicine treatment of various diseases is stable, the various diseases early and reliably can be cured, it is possible to reproduce the various tissues and various organs early and reliably. After the first stem cells have settled on the bottom surface of the first culture vessel, the single-type stem cells are poured into the first culture vessel while discharging the culture solution in the first culture vessel, and the first culture vessel is The static growth of the first stem cell can be surely promoted by statically leaving it for a predetermined time in a state inclined at a predetermined angle.
第1培養容器の底面面積に対する第1幹細胞の総平面面積の第1目標割合が70〜80%である単一種幹細胞は、第1培養容器の底面面積に対する第1幹細胞の総平面面積が80%を超過して第1幹細胞が増殖すると、第1幹細胞の活性が次第に失われるが、第1培養容器の底面面積に対して第1幹細胞の総平面面積が70〜80%に増殖したときに、第1幹細胞を第1培養容器から抽出することで、第1幹細胞の活性を保持されるから、単一種幹細胞が活性を失うことがなく、活性を有する単一種幹細胞を利用することで、各種疾患を確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を確実に再生させることができる。 Single-type stem cells in which the first target ratio of the total planar area of the first stem cells to the bottom area of the first culture container is 70 to 80% has a total planar area of the first stem cells of 80% to the bottom area of the first culture container. When the first stem cells proliferate beyond this, the activity of the first stem cells is gradually lost, but when the total planar area of the first stem cells grows to 70-80% with respect to the bottom area of the first culture vessel, By extracting the first stem cell from the first culture vessel, the activity of the first stem cell is retained, so that the single seed stem cell does not lose its activity, and by using the active single seed stem cell, various diseases Can be cured completely, and various tissues and organs can be reliably regenerated.
第2培養手段において、前記第1幹細胞を分離容器に注入し、前記分離容器を遠心分離器に設置して該第1幹細胞を遠心分離させ、前記分離容器内において層状に遠心分離した前記第1幹細胞のうちの最下層に位置する前記第2幹細胞を注射器またはピペットによって抽出する単一種幹細胞は、不要な幹細胞を含む第1幹細胞を遠心分離によって層状に分離させ、層状に遠心分離した第1幹細胞のうちの最下層に位置する第2幹細胞を抽出するから、単一種幹細胞に多種雑多な幹細胞が含まれることがなく、各種疾患の治療の効果や再生医療における再生の効果が安定し、各種疾患を早期かつ確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を早期かつ確実に再生させることができる。 In the second culturing means, the first stem cells are injected into a separation container, the separation container is placed in a centrifuge, the first stem cells are centrifuged, and the first stem cells are centrifuged in layers in the separation container. The single stem cell from which the second stem cell located in the lowest layer among the stem cells is extracted by a syringe or pipette is separated into layers by centrifugation of the first stem cells containing unnecessary stem cells, and the first stem cells centrifuged in layers Since the second stem cell located in the lowermost layer is extracted, a single kind of stem cell does not contain a variety of stem cells, the effect of treating various diseases and the effect of regeneration in regenerative medicine are stable, and various diseases Can be cured quickly and reliably, and various tissues and organs can be regenerated early and reliably.
第2培養容器の容量が約40〜60ccであり、第3培養容器の容量が約70〜80ccであり、第2培養手段において、第2および第3培養容器に第2幹細胞とあらたな培養液とを注入した後、第2および第3培養容器を所定角度に傾斜させた状態で第2および第3培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で第2および第3培養容器内の第2幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第2幹細胞が初期平面形状から所定の平面形状に変形した場合、第2幹細胞が第2および第3培養容器の底面に定着したと判断する単一種幹細胞は、第2培養容器の容量が60ccを超過し、第3培養容器の容量が80ccを超過すると、第2幹細胞が第2および第3培養容器の底面に定着し難くなるとともに第2幹細胞の増殖が遅くなるが、前記容量の第2および第3培養容器を使用することで、第2幹細胞が第2および第3培養容器の底面に早期かつ容易に定着し、第2および第3培養容器において第2幹細胞が素早く増殖することで、単一種幹細胞が短い期間で作られるから、各種疾患の治療にタイムリーに利用することができる。単一種幹細胞は、第2および第3培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で第2および第3培養容器内の第2幹細胞の初期平面形状からの変形を観察し、第2幹細胞の第2および第3培養容器の底面に対する定着が適宜に確認され、第2幹細胞の定着を確認した後、第2および第3培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第2および第3培養容器に注入することで、第2幹細胞の増殖が確実に促進され、単一種幹細胞が短い期間で作られるから、それを各種疾患の治療にタイムリーに利用することができる。単一種幹細胞は、第2培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置することで、第2培養容器の底面に第2幹細胞を確実に定着させることができる。 The volume of the second culture vessel is about 40 to 60 cc, the volume of the third culture vessel is about 70 to 80 cc, and in the second culturing means, the second stem cell and a new culture solution are added to the second and third culture vessels. And injecting the second and third culture vessels statically at a temperature substantially the same as the body temperature for 36 to 48 hours with the second and third culture vessels inclined at a predetermined angle, During the 48 hours, the deformation of the second stem cells in the second and third culture vessels from the initial planar shape was observed at intervals of about 1 to 2 hours, and the second stem cells were deformed from the initial planar shape to a predetermined planar shape. In the case, the single-type stem cell that determines that the second stem cell has settled on the bottom surface of the second and third culture containers, when the capacity of the second culture container exceeds 60 cc and the capacity of the third culture container exceeds 80 cc, The second stem cell of the second and third culture vessel It becomes difficult to settle on the surface and the growth of the second stem cell is slow, but by using the second and third culture vessels having the above-mentioned capacity, the second stem cell can be quickly and easily attached to the bottom surfaces of the second and third culture vessels. Since the second stem cells proliferate quickly in the second and third culture vessels and single seed stem cells are produced in a short period of time, they can be used in a timely manner for the treatment of various diseases. Single-type stem cells are obtained by second and third cultures at intervals of about 1 to 2 hours between 36 and 48 hours, while the second and third culture vessels are statically left for 36 to 48 hours at approximately the same temperature as the body temperature. After observing the deformation of the second stem cells in the container from the initial planar shape, the second stem cells are appropriately fixed on the bottom surfaces of the second and third culture containers, and the second stem cells are confirmed to be fixed. Injecting a new culture solution into the second and third culture vessels while draining the culture solution in the third culture vessel surely promotes the growth of the second stem cells, so that single-type stem cells can be produced in a short period of time. Therefore, it can be used in a timely manner for the treatment of various diseases. The single-type stem cells can be firmly fixed on the bottom surface of the second culture container by leaving the second culture container statically for a predetermined time with the second culture container inclined at a predetermined angle.
第2幹細胞の初期平面形状が略円形であり、第2幹細胞の変形後の平面形状が略円形を核として第2幹細胞が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、第2培養手段において、第2幹細胞が不定形の扁平形状に変形した場合に第2幹細胞が第2および第3培養容器の底面に定着したと判断する単一種幹細胞は、第2幹細胞の第2および第3培養容器の底面に対する定着が正確に判断され、第2幹細胞の定着を確認した後、第2および第3培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第2および第3培養容器に注入することで、第2幹細胞の増殖が確実に促進され、単一種幹細胞が短い期間で作られるから、それを各種疾患の治療にタイムリーに利用することができる。 The initial planar shape of the second stem cell is a substantially circular shape, and the deformed planar shape of the second stem cell is a flat shape in which the second stem cell extends in an indefinite shape in one direction with the substantially circular shape as a nucleus. The single-type stem cell that determines that the second stem cell has settled on the bottom surfaces of the second and third culture vessels when the second stem cell is deformed into an irregular flat shape is the second and third culture vessels of the second stem cell. After the establishment of the second stem cells has been confirmed, the new culture solution is injected into the second and third culture vessels while discharging the culture solution in the second and third culture vessels. As a result, the proliferation of the second stem cells is surely promoted, and single-type stem cells are produced in a short period of time, so that it can be used in a timely manner for the treatment of various diseases.
第2培養手段において、第2幹細胞が第2および第3培養容器の底面に定着し、第2および第3培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第2および第3培養容器に注入した後、第2および第3培養容器を所定角度に傾斜させた状態で第2および第3培養容器を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で第2および第3培養容器の底面に定着した第2幹細胞の第2および第3培養容器の底面面積に対する総平面面積を観察する単一種幹細胞は、約1〜2時間間隔で総平面面積を観察することで、第2幹細胞の第2および第3培養容器の底面面積に対する総平面面積が正確に確認され、第2および第3培養容器から不要な幹細胞を除去した第2幹細胞が抽出されるから、単一種幹細胞に多種雑多な幹細胞が含まれることがなく、各種疾患の治療の効果や再生医療における再生の効果が安定し、各種疾患を早期かつ確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を早期かつ確実に再生させることができる。単一種幹細胞は、第2培養容器の底面に第2幹細胞が定着した後、第2培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を第2培養容器に注入するとともに第2培養容器を所定角度に傾斜させた状態で所定時間静的に放置することで、第2幹細胞の増殖を確実に促進することができる。 In the second culture means, the second stem cells are fixed on the bottom surfaces of the second and third culture vessels, and the new culture solution is discharged while the second and third culture vessels are discharged. 36-48, while the second and third culture vessels are tilted at a predetermined angle, the second and third culture vessels are statically left at the same temperature as the body temperature for 36-48 hours. A single-type stem cell that observes the total planar area of the second stem cells established on the bottom surfaces of the second and third culture vessels at intervals of about 1 to 2 hours over time relative to the bottom area of the second and third culture vessels is about By observing the total planar area at intervals of 1 to 2 hours, the total planar area with respect to the bottom area of the second and third culture vessels of the second stem cells can be accurately confirmed, and unnecessary stem cells from the second and third culture vessels Because the second stem cell from which A variety of stem cells are not included in one type of stem cell, the effect of treatment of various diseases and the effect of regeneration in regenerative medicine are stable, and various diseases and organs can be cured quickly and reliably. It can be regenerated early and reliably. After the second stem cells have settled on the bottom surface of the second culture vessel, the single-type stem cells are poured into the second culture vessel while discharging the culture solution in the second culture vessel, and the second culture vessel is The static growth of the second stem cell can be surely promoted by statically leaving it for a predetermined time in a state inclined at a predetermined angle.
第2および第3培養容器の底面面積に対する第2幹細胞の総平面面積の第2目標割合が88〜92%である単一種幹細胞は、第2および第3培養容器の底面面積に対する第2幹細胞の総平面面積が92%を超過して第2幹細胞が増殖すると、第2幹細胞の活性が次第に失われるが、第2および第3培養容器の底面面積に対して第2幹細胞の総平面面積が88〜92%に増殖したときに、第2幹細胞を第2および第3培養容器から抽出することで、第2幹細胞の活性を保持されるから、単一種幹細胞が活性を失うことがなく、活性を有する単一種幹細胞を利用することで、各種疾患を確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を確実に再生させることができる。 A single-type stem cell in which the second target ratio of the total planar area of the second stem cells to the bottom area of the second and third culture vessels is 88 to 92% is the second stem cell relative to the bottom area of the second and third culture vessels. When the total planar area exceeds 92% and the second stem cells proliferate, the activity of the second stem cells is gradually lost, but the total planar area of the second stem cells is 88 with respect to the bottom area of the second and third culture vessels. Since the activity of the second stem cell is retained by extracting the second stem cell from the second and third culture vessels when proliferating to ˜92%, the single-type stem cell does not lose its activity, and the activity is maintained. By utilizing the single-type stem cells, various diseases can be completely cured, and various tissues and organs can be reliably regenerated.
第1および第2幹細胞が間葉系幹細胞である単一種幹細胞は、層状に分離させた原料骨髄液から特定の中間層骨髄液を抽出し、層状に分離させた第1間葉系幹細胞から特定の第2間葉系幹細胞を抽出することで、不要な間葉系幹細胞が除去され、単一種幹細胞に多種雑多な間葉系幹細胞が含まれることがないから、各種疾患の治療の効果や再生医療における再生の効果が安定し、各種疾患を早期かつ確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を早期かつ確実に再生させることができる。 Single-species stem cells in which the first and second stem cells are mesenchymal stem cells are identified from the first mesenchymal stem cells that have been extracted from the intermediate bone marrow fluid that has been separated into layers and then separated into layers. By extracting the second mesenchymal stem cells, unnecessary mesenchymal stem cells are removed, and a single kind of stem cell does not contain a variety of mesenchymal stem cells. The effect of regeneration in medicine is stable, various diseases can be cured quickly and reliably, and various tissues and organs can be regenerated early and reliably.
一例として示す幹細胞培養システム10の概略構成図である図1等の添付の図面を参照し、本発明にかかる単一種幹細胞の詳細を説明すると、以下のとおりである。なお、図2は、第1培養手段を形成する骨髄液分離手段の一例を示す説明図であり、図3は、図2から続く骨髄液分離手段の説明図である。図4は、図3から続く骨髄液分離手段の説明図である。
The details of the single-type stem cell according to the present invention will be described below with reference to the accompanying drawings such as FIG. 1 which is a schematic configuration diagram of the stem
単一種幹細胞は、複数のドナー(人)から採取した原料骨髄液を利用し、幹細胞培養システム10によって第1培養手段と第2培養手段とを実施することから作られる。第1培養手段は、骨髄液分離手段、骨髄液抽出手段、幹細胞第1観察手段、幹細胞第2観察手段、幹細胞第1抽出手段から形成されている。第2培養手段は、幹細胞分離手段、幹細胞第2抽出手段、幹細胞第3観察手段、幹細胞第4観察手段、幹細胞第3抽出手段から形成されている。システム10は、原料骨髄液に含まれる複数種類の間葉系幹細胞の中から特定種類の単一種間葉系幹細胞(単一種幹細胞)を培養(製造)する。
The single-type stem cells are produced by performing the first culture means and the second culture means by the stem
幹細胞培養システム10は、コンピュータ11とバーコードリーダ12と電子顕微鏡13とから形成されている。コンピュータ11は、中央処理装置(CPUや仮想CPU)と記憶装置(メモリや仮想メモリ)と大容量記憶領域(ハードディスクや仮想ハードディスク等)とを備え、物理的なOS(オペレーティングシステム)や仮想OS(仮想オペレーティングシステム)によって動作する。コンピュータ11には、キーボード14やマウス15等の入力装置、ディスプレイ16やプリンタ(図示せず)等の出力装置がインターフェイス(無線または有線)を介して接続されている。
The stem
骨髄培養システム10では、ドナーデータ(ドナー特定情報)がQRコード(登録商標)を利用して管理される。ドナーデータには、ドナーの氏名、住所、電話番号、生年月日、性別、血液型、身長、体重、メールアドレス等がある。システム10では、二次元コードとしてQRコードを使用しているが、QRコードの他に、マトリックス式のSPコード、ベリコード(VeriCode)、マキシコード(MaxiCode)、CPコード、DataMatrix、Code1、AztecCode、インタクタコード、カードeを使用することができる。なお、システム10で使用する二次元コードには、今後開発されるすべてのそれが含まれる。
In the bone
第1培養手段を形成する骨髄液分離手段では、ドナーから採取した原料骨髄液19を層状に分離させる。骨髄液採取では、それらドナーの胸骨または腸骨(骨盤)から2〜3cc(2〜3ml)の原料骨髄液19が採取される。原料骨髄液19は、ドナーに局所麻酔をかけた後、骨髄を穿刺して骨髄液(骨髄血)を吸引する「骨髄穿刺」(マルク)によって採取される。医師や看護師、研究者等の担当者は、原料骨髄液19の採取と同時に、コンピュータ11においてシステム10を起動し、キーボード14やマウス15等の入力装置を利用してドナーデータをコンピュータ11に入力する。また、ドナーデータ(ドナー特定情報)をICタグ(ICチップ)によって管理することもできる。
In the bone marrow fluid separation means forming the first culture means, the raw material
コンピュータ11は、ドナーデータが入力される度毎(ドナーから原料骨髄液19を採取する度毎)に各ドナーを特定するユニークなドナー識別子を生成し、ドナーデータをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納(記憶)する(ドナーデータ記憶手段)。コンピュータ11は、入力されたドナーデータを二次元コードライター機能によってQRコード(二次元コード)に変換し(二次元コード(QRコード)変換手段)、QRコードが印字された第1および第2コード用紙18a,18bを出力するとともに(二次元コード(QRコード)出力手段)、そのQRコードを各ドナーを特定するドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納(記憶)する(二次元コード(QRコード)記憶手段)。
The
なお、NO1が印字された第1コード用紙18aに印字されたQRコードには、第1培養手段(骨髄液分離手段、骨髄液抽出手段、骨髄液分離手段、骨髄液抽出手段、幹細胞第1観察手段、幹細胞第2観察手段、幹細胞第1抽出手段)の番号1が格納され、NO2が印字された第2コード用紙18bに印字されたQRコードには、第2培養手段(幹細胞分離手段、幹細胞第2抽出手段、幹細胞第3観察手段、幹細胞第4観察手段、幹細胞第3抽出手段)の番号2が格納されている。コンピュータ11は、骨髄液分離手段から幹細胞第3抽出手段の各手段を実施する度毎に、記憶領域に格納したドナーデータとバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較する。
The QR code printed on the
ドナーから採取された2〜3ccの原料骨髄液19は、図2に示すように、上下方向へ延びるガラス試験管20(分離容器)内に注入(収容)される。なお、2〜3ccの原料骨髄液19には、0.5〜1ml(約5×107(cells/ml))の複数種類の間葉系幹細胞が含まれる。原料骨髄液19を注入するガラス試験管20の外周面には、第1コード用紙18aが貼付されている。原料骨髄液19を注入したガラス試験管20は、図3に示すように、試験管立て21にセットされ、試験管立て21とともに恒温槽22内に収容される。
As shown in FIG. 2, 2 to 3 cc of raw
医師や看護師、研究者等の担当者は、ガラス試験管20の外周面にQRコードが印字された第1コード用紙18aを貼付した後、ガラス試験管20のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。バーコードリーダ12は、インターフェイス(有線または無線)を介してコンピュータ11に接続されている。バーコードリーダ12は、読み取ったQRコードをコンピュータ11に送信する。
A person in charge such as a doctor, a nurse, or a researcher attaches the
コンピュータ11は、バーコードリーダ12から送信されたQRコードが示す番号1およびドナーデータを記憶領域から抽出してキャッシュメモリに読み出すとともに、第1培養第1表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第1培養第1表示画面には、番号1およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離ボタン、骨髄液抽出ボタン、幹細胞第1観察ボタン、幹細胞第2観察ボタン、幹細胞第1抽出ボタン、ログアウトボタンが表示される。第1培養を行わない場合、ログアウトボタンをクリックする。ログアウトボタンをクリックすると、コンピュータ11においてシステム10が停止する。
The
担当者は、ディスプレイ16に表示された骨髄液分離ボタンをクリックした後、注射器からガラス試験管20に原料骨髄液19を注入し、原料骨髄液19を注入したガラス試験管20を試験管立て21に挿入(セット)する。担当者は、図3に示すように、試験管立て21を恒温槽22内に収容し、原料骨髄液19を注入したガラス試験管20を恒温槽22において所定時間(約2時間)静的に放置(動かすことなく静かに放置)する。恒温槽22内の温度は、体温と略同一の約37℃に保持されている。コンピュータ11は、第1コード用紙18aに印字されたQRコードが示す番号1およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、骨髄液分離実施中メッセージと骨髄液分離終了ボタンとをディスプレイ16に表示する。
The person in charge clicks the bone marrow fluid separation button displayed on the
ガラス試験管20を恒温槽22に所定時間(約2時間)静的に放置することで、図4に示すように、試験管20に注入された原料骨髄液19が試験管20内において上下方向へ何層か(3層)の層状に分離する。幹細胞の培養には通常150〜200cc(150〜200ml)の骨髄液が必要とされているが、幹細胞培養システム10は、ドナーから採取された2〜3ccの少量の原料骨髄液19から単一種幹細胞が作られるから、ドナーから2〜3ccの少量の原料骨髄液19を採取すればよく、原料骨髄液19の採取時にドナーにかかる負担を最小限にすることができる。
By leaving the
原料骨髄液19を層状に分離させた骨髄液分離手段の後、骨髄液抽出手段が行われる。骨髄液抽出手段では、層状に分離した原料骨髄液19から中間層骨髄液23を抽出する。担当者は、原料骨髄液19が層状に分離したことを確認した後、ディスプレイ16に表示された骨髄液分離終了ボタンをクリックする。骨髄液分離終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第1培養第2表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第1培養第2表示画面には、番号1およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出ボタン、幹細胞第1観察ボタン、幹細胞第2観察ボタン、幹細胞第1抽出ボタンが表示される。
Bone marrow fluid extraction means is performed after the bone marrow fluid separation means in which the raw
担当者は、第1培養第2表示画面の骨髄液抽出ボタンをクリックし、ガラス試験管20のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号1およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出実施中メッセージ、骨髄液抽出終了ボタンをディスプレイに表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge clicks on the bone marrow extract button on the first culture second display screen to cause the
担当者は、恒温槽22内から試験管立て21を取り出し、試験管立て21からガラス試験管20を引き抜き、層状に分離した原料骨髄液19の特定の層に存在する中間層骨髄液23を抽出する。担当者は、注射器(図示せず)を利用して層状に分離した原料骨髄液19のうちの中間層に位置する3〜4mmの層厚みの中間層骨髄液23を抽出(吸引)する。または、ピペット(図示せず)を利用して層状に分離した原料骨髄液19のうちの中間層に位置する3〜4mmの層厚みの中間層骨髄液23を抽出(吸引)する。幹細胞培養システム10では、多種雑多な間葉系幹細胞を含む原料骨髄液19を上下方向へ層状に分離させた後、注射器またはピペットを利用することで、原料骨髄液19から特定の中間層骨髄液23を確実に抽出することができ、原料骨髄液19に含まれる不要な間葉系幹細胞を除去することができる。
The person in charge takes out the
図5は、第1扁平培養容器25(第1培養容器)の斜視図であり、図6は、第1扁平培養容器25(第1培養容器)の側面図である。図7は、第1間葉系幹細胞27の平面形状の一例を示す部分拡大図であり、図8は、第1間葉系幹細胞27の平面形状の他の一例を示す部分拡大図である。図7,8は、電子顕微鏡13によって撮影された第1間葉系幹細胞27の平面形状の拡大画像を示す。
FIG. 5 is a perspective view of the first flat culture vessel 25 (first culture vessel), and FIG. 6 is a side view of the first flat culture vessel 25 (first culture vessel). FIG. 7 is a partially enlarged view showing an example of the planar shape of the first
原料骨髄液19から中間層に位置する特定の中間層骨髄液23を抽出した骨髄液抽出手段の後、幹細胞第1観察手段が行われる。幹細胞第1観察手段では、中間層骨髄液23および培養液24を第1扁平培養容器25(第1培養容器)に注入(収容)し、培養容器25内を体温と略同一の温度(約36〜37℃)に保持しつつ、12〜24時間静的に放置(動かすことなく静かに放置)し、12〜24時間の間において約1〜2時間間隔で培養容器25内の中間層骨髄液23に含まれる第1間葉系幹細胞27(第1幹細胞)の初期平面形状からの変形を電子顕微鏡13で観察し、幹細胞27が培養容器25の底面28に定着したか否かを判断する。中間層骨髄液23および培養液24を注入する培養容器25の底面28(底壁外面)には、ドナーを特定するQRコードを印字した第1コード用紙18aが貼付されている。
After the bone marrow fluid extraction means for extracting the specific middle layer
医師や看護師、研究者等の担当者は、原料骨髄液19から特定の中間層骨髄液23を抽出した後、ディスプレイ16に表示された骨髄液抽出終了ボタンをクリックする。骨髄液抽出終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第1培養第3表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第1培養第3表示画面には、番号1およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、幹細胞第1観察ボタン、幹細胞第2観察ボタン、幹細胞第1抽出ボタンが表示される。
A person in charge such as a doctor, a nurse, or a researcher extracts a specific intermediate layer
担当者は、QRコードが印字された第1コード用紙18aを第1扁平培養容器25の底面28(底壁外面)に貼付する。次に、第1培養第3表示画面の幹細胞第1観察ボタンをクリックし、培養容器25のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号2およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、幹細胞第1観察実施中メッセージ、幹細胞第1観察終了ボタンをディスプレイに表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge affixes the
担当者は、注射器またはピペットに吸引された中間層骨髄液23を培養容器25に注入(収容)するとともに、注射器またはピペットに吸引された培養液24を培養容器25に注入(収容)する。第1扁平培養容器25(第1培養容器)は、透明なガラスまたは透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面28を有する平面形状が略正四角形の扁平な容器である。第1扁平培養容器25は、頂部32および底部34と頂底部32,34の間に位置する中央部33と、頂部32に形成された注入口35とを有する。注入口35は、蓋36によって水密に閉塞されている。幹細胞第1観察手段で使用される第1扁平培養容器25は、その容量が約20〜30cc(好ましくは、25cc)であり、その底面面積が約25〜36mm2である。培養容器25は、その一辺の長さが5〜6mmである。なお、第1扁平培養容器25として小容量かつ所定面積の底面28を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。
The person in charge injects (accommodates) the intermediate layer
担当者は、注入口35から蓋36を取り外し、注射器またはピペットに吸引された中間層骨髄液23を第1扁平培養容器25の注入口35から培養容器25の内部に注入(収容)するとともに、注射器またはピペットに吸引された培養液24を培養容器25の注入口35から培養容器25の内部に注入(収容)し、蓋36によって注入口36を閉塞する。
The person in charge removes the
培養液24には、ペニシリン(約100U/ml)、アムホテリシン(約100ng/ml)、ストレプトマイシン(約100mkg/ml)、L−グルタミン(約2〜4ml)、20%ウシ胎児血清を添加したミネラル塩溶液およびアミノ酸が含まれる。第1扁平培養容器25に注入された中間層骨髄液23に含まれる第1間葉系幹細胞27は、時間の経過とともに培養容器25の底面28に定着しつつ、培養液24によって培養され、培養容器25の底面28において次第に増殖(分化)してコロニーを形成する。
The
担当者は、中間層骨髄液23および培養液24を第1扁平培養容器25に注入した後、培養容器25を電子顕微鏡13の試料ホルダ37に設置(セット)する。なお、電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第1扁平培養容器25の底部34との間にスペーサー39を介在させ、培養容器25の底部34をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器25の底部34が上となり培養容器25の頂部32(注入口35)が下となるように、培養容器25を所定角度に傾斜させた状態に保持する。なお、電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第1扁平培養容器25の頂部32との間にスペーサー39を介在させ、培養容器25の頂部32をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器25の頂部32が上となり培養容器25の底部34が下となるように、培養容器25を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ37の上面38に対する第1扁平培養容器25の傾斜角度α1は、2〜5°の範囲にあり、好ましくは、2〜3°の範囲にある。
The person in charge injects the intermediate layer
幹細胞培養システム10は、試料ホルダ37の上面38に対して第1扁平培養容器25を前記傾斜角度で傾斜させることで、第1扁平培養容器25内において中間層骨髄液23および培養液24が培養容器25の頂部32の側(または底部34の側)に偏り、培養容器25の頂部32の側(または底部34の側)において中間層骨髄液23と培養液24との水圧が大きくなって第1間葉系幹細胞27が培養容器25の底面28の側に集中し、それによって第1間葉系幹細胞27どうしの活性が高まり、培養容器25の底面28において第1間葉系幹細胞27を容易かつ迅速に定着させることができる。
The stem
電子顕微鏡13は、インターフェイス(有線または無線)を介してコンピュータ11に接続されている。電子顕微鏡13は、撮像素子によって被写体の拡大画像を撮影する画像撮影機能を有するとともに、その拡大画像をコンピュータ11に送信する画像送信機能を有する。電子顕微鏡13は、第1扁平培養容器25に注入された中間層骨髄液23に含まれる第1間葉系幹細胞27の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞27の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔でコンピュータ11に送信する。電子顕微鏡13における画像撮影間隔や画像送信間隔は、キーボード14やマウス15等の入力装置によって1〜2時間の間で自由に設定することができる。
The
コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された第1間葉系幹細胞27の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納(記憶)する(幹細胞画像記憶手段)。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された幹細胞28の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ16に表示する。担当者は、ディスプレイ16に表示された幹細胞27の平面形状の拡大画像を12〜24時間の間において約1〜2時間間隔で確認(視認)し、中間層骨髄液23に含まれる幹細胞27の平面形状の変化を観察する。なお、担当者が電子顕微鏡13の観察窓から第1間葉系幹細胞27の平面形状の変化を12〜24時間の間において約1〜2時間間隔で直接観察してもよい。
The
第1間葉系幹細胞27の初期平面形状は略円形であり、幹細胞27の平面形状が略円形の場合、幹細胞27が第1扁平培養容器25の底面28(底壁内面)に定着しておらず、幹細胞27が増殖(分化)を開始していない。第1間葉系幹細胞27の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として幹細胞27が一方向(所定方向)へ不定形に伸張(拡張)した扁平形状であり、幹細胞27が培養容器25の底面28(底壁内面)に定着し、幹細胞27が増殖(分化)を開始している。
The initial planar shape of the first
担当者は、幹細胞第1観察手段における観察の結果、図7に示すように、ディスプレイ16に表示された第1間葉系幹細胞27の平面形状の拡大画像が略円形のまま観察される場合、幹細胞27が培養容器25の底面28(底壁内面)に定着していないと判断し、幹細胞27の平面形状の変化を約1〜2時間間隔で継続して観察する。担当者は、幹細胞第1観察手段における観察の結果、図8に示すように、ディスプレイ16に表示された第1間葉系幹細胞27の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、幹細胞27が培養容器25の底面28に定着したと判断する。
As shown in FIG. 7, the person in charge observes the enlarged image of the planar shape of the first
第1間葉系幹細胞27の定着時に容量が30ccを超過するとともに底面面積が36mm2を超過する大きな培養容器を使用すると、幹細胞27が容器の底面に定着し難くなるとともに幹細胞27の増殖が遅くなるが、幹細胞培養システム10は、前記容量かつ前記底面面積の第1扁平培養容器25を使用することで、幹細胞27を培養容器25の底面28に容易に定着させることができ、培養容器25において幹細胞27を素早く増殖させることができる。
When a large culture container having a capacity exceeding 30 cc and a bottom area exceeding 36 mm 2 is used when the first
幹細胞培養システム10は、第1扁平培養容器25を体温と略同一の温度で12〜24時間静的放置しつつ、12〜24時間の間において約1〜2時間間隔で培養容器25内の第1間葉系幹細胞27の初期平面形状からの変形を観察するから、幹細胞27の変形を見逃すことはなく、幹細胞27の培養容器25の底面28に対する定着を正確に確認することができる。
The stem
図9は、第1間葉系幹細胞27の平面形状の他の一例を示す部分拡大図である。図9は、電子顕微鏡13によって撮影された第1間葉系幹細胞27の平面形状の拡大画像を示す。幹細胞第1観察手段における観察の結果、第1間葉系幹細胞27(第1幹細胞)が略円形(初期平面形状)から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、幹細胞27の第1扁平培養容器25(第1培養容器)の底面28への定着を確認した幹細胞第1観察手段の後、幹細胞第2観察手段が行われる。
FIG. 9 is a partially enlarged view showing another example of the planar shape of the first
幹細胞第2観察手段では、第1扁平培養容器25内に注入されている培養液24を培養容器25から排出し、培養容器25内にあらたな培養液24を注入(収容)する。次に、第1扁平培養容器25を体温と略同一の温度(約36〜37℃)で36〜48時間静的に放置(動かすことなく静かに放置)しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で培養容器25の底面28に定着した第1間葉系幹細胞27の培養容器25の底面面積に対する総平面面積を電子顕微鏡13で観察し、幹細胞27の総平面面積が培養容器25の底面面積に対して第1目標割合に達したか否かを判断する。培養容器25の底面面積に対する第1間葉系幹細胞27の総平面面積の第1目標割合は、70〜80%(70〜80%コンフルエント)である。
In the stem cell second observation means, the
医師や看護師、研究者等の担当者は、中間層骨髄液23に含まれる第1間葉系幹細胞27の培養容器25の底面28に対する定着を確認した後、ディスプレイ16に表示された幹細胞第1観察終了ボタンをクリックする。幹細胞第1観察終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第1培養第4表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第1培養第4表示画面には、番号1およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、幹細胞第1観察終了メッセージ、幹細胞第2観察ボタン、幹細胞第1抽出ボタンが表示される。
After confirming that the first
担当者は、第1培養第4表示画面の幹細胞第2観察ボタンをクリックし、培養容器25を電子顕微鏡16の試料ホルダから取り外すとともに、培養容器25のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号2およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、幹細胞第1観察終了メッセージ、幹細胞第2観察実施中メッセージ、幹細胞第2観察終了ボタンをディスプレイ16に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge clicks the second stem cell observation button on the first culture fourth display screen, removes the
担当者は、幹細胞第1観察手段において培養容器25に注入した培養液24を注射器またはピペットを利用して培養容器25から排出し、注射器またはピペットに吸引されたあらたな培養液24を培養容器25に注入(収容)する。あらたな培養液24は、幹細胞第1観察手段において注入されたそれと同一である。担当者は、あらたな培養液24を培養容器25に注入した後、培養容器25を電子顕微鏡13の試料ホルダ37に設置(セット)する。
The person in charge discharges the
なお、電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第1扁平培養容器25の底部34との間にスペーサー39を介在させ、培養容器25の底部34をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器25の底部34が上となり培養容器25の頂部32(注入口35)が下となるように、培養容器25を所定角度に傾斜させた状態に保持する(図6参照)。なお、電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第1扁平培養容器25の頂部32との間にスペーサー39を介在させ、培養容器25の頂部32をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器25の頂部32が上となり培養容器25の底部34が下となるように、培養容器25を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ37の上面38に対する第1扁平培養容器25の傾斜角度α1は、2〜5°の範囲にあり、好ましくは、2〜3°の範囲にある。
A
幹細胞培養システム10は、第1間葉系幹細胞27の定着を確認した後、培養容器25の培養液24を排出しつつあらたな培養液24を培養容器25に注入することで、幹細胞27の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養システム10は、試料ホルダ37の上面38に対して第1扁平培養容器25を前記傾斜角度で傾斜させることで、培養容器25内において第1間葉系幹細胞27および培養液24が培養容器25の頂部32の側(または底部34の側)に偏り、培養容器25の頂部32の側(または底部34の側)において第1間葉系幹細胞27と培養液24との水圧が大きくなって第1間葉系幹細胞27が培養容器25の底面28の側に集中し、それによって第1間葉系幹細胞27どうしの活性が高まり、培養容器25の底面28において第1間葉系幹細胞27を容易かつ迅速に増殖(分化)させることができる。
The stem
電子顕微鏡13は、第1扁平培養容器25内の第1間葉系幹細胞27の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞27の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔でコンピュータ11に送信する。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された幹細胞27の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納(記憶)する(幹細胞画像記憶手段)。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された幹細胞27の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ16に表示する。
The
担当者は、ディスプレイ16に表示された第1間葉系幹細胞27の平面形状の拡大画像を36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で確認(視認)し、第1扁平培培養容器25の底面28に定着した幹細胞27の培養容器25の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、幹細胞27の総平面面積が培養容器25の底面面積に対して第1目標割合(70〜80%コンフルエント)に達したか否かを判断する。なお、担当者が電子顕微鏡13の観察窓から第1間葉系幹細胞27の培養容器25の底面面積に対する総平面面積を36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で直接観察し、幹細胞27の総平面面積が培養容器25の底面面積に対して第1目標割合(70〜80%コンフルエント)に達したか否かを判断してもよい。
The person in charge confirms (views) the enlarged image of the planar shape of the first
担当者は、幹細胞第2観察手段における観察の結果、図8に示すように、ディスプレイ16に表示された第1間葉系幹細胞27の第1扁平培養容器25の底面面積に対する総平面面積が第1目標割合(70〜80%コンフルエント)に達していない場合、幹細胞27の培養容器25の底面面積に対する総平面面積を約1〜2時間間隔で継続して観察する。なお、ディスプレイ16に表示された拡大画像の全面積に対して第1間葉系幹細胞27の総平面面積が第1目標割合に達した場合に、幹細胞27の培養容器25の底面面積に対する総平面面積が第1目標割合に達したものとする。
As a result of the observation by the second stem cell observation means, the person in charge has a total plane area of the first
幹細胞第2観察手段における観察の結果、第1間葉系幹細胞27が培養容器25の底面28(底壁内面)において増殖して幹細胞27がコロニーを形成し、幹細胞27の平面形状が拡張することで、図9に示すように、ディスプレイ16に表示された幹細胞27の培養容器25の底面面積に対する総平面面積が第1目標割合(70〜80%コンフルエント)に達した場合、培養容器25から幹細胞27を抽出する幹細胞第1抽出手段が行われる。幹細胞第1抽出手段では、培養容器25内において増殖(分化)した第1間葉系幹細胞27を培養容器25から抽出する。
As a result of observation by the second stem cell observation means, the first
医師や看護師、研究者等の担当者は、第1間葉系幹細胞27の第1扁平培養容器25の底面面積に対する総平面面積が第1目標割合に達したことを確認した後、ディスプレイ16に表示された幹細胞第2観察終了ボタンをクリックする。幹細胞第2観察終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第1培養第5表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第1培養第5表示画面には、番号1およびドナーデータが表示されるとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、幹細胞第1観察終了メッセージ、幹細胞第2観察終了メッセージ、幹細胞第1抽出ボタンが表示される。
After confirming that the total planar area of the first
担当者は、第1培養第5表示画面の幹細胞第1抽出ボタンをクリックし、培養容器25のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号1およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、骨髄液分離終了メッセージ、骨髄液抽出終了メッセージ、幹細胞第1観察終了メッセージ、幹細胞第2観察終了メッセージ、幹細胞第1抽出実施中メッセージ、幹細胞第1抽出終了ボタンをディスプレイ16に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge clicks the first stem cell extraction button on the first culture fifth display screen, and causes the
担当者は、第1扁平培養容器25に注入されている幹細胞第2観察時の培養液24を注射器またはピペットを利用して培養容器25から排出し、培養容器25内をPBSで洗浄した後、注射器またはピペットに吸引されたトリプシン液を培養容器25内に注入する。培養容器25にトリプシン液を注入すると、培養容器25の底面28に定着した第1間葉系幹細胞27がトリプシン液によって底面28から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。担当者は、ピペットを利用して幹細胞27を吸引し、幹細胞27をピペット内に収容する。
The person in charge discharges the
幹細胞培養システム10は、約1〜2時間間隔で総平面面積を観察することで、第1間葉系幹細胞27の第1扁平培養容器25の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、培養容器25の底面面積に対して幹細胞27の総平面面積が第1目標割合に達したことを確実に把握することができる。
The stem
図10は、第2培養手段を形成する幹細胞分離手段の一例を示す説明図である。培養容器25から第1間葉系幹細胞27を抽出した幹細胞第1抽出手段の後、第2培養手段を形成する幹細胞分離手段が行われる。幹細胞分離手段では、幹細胞第1抽出手段によって抽出された第1間葉系幹細胞27を遠心分離器29によって層状に遠心分離する。医師や看護師、研究者等の担当者は、第1間葉系幹細胞27を培養容器25からピペットに吸引した後、ディスプレイ16に表示された幹細胞第1抽出終了ボタンをクリックする。
FIG. 10 is an explanatory view showing an example of the stem cell separating means forming the second culturing means. After the first stem cell extraction means for extracting the first
幹細胞第1抽出終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第2培養第1表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第2培養第1表示画面には、番号1およびドナーデータが表示されるとともに、幹細胞分離ボタン、幹細胞第2抽出ボタン、幹細胞第3観察ボタン、幹細胞第4観察ボタン、幹細胞第3抽出ボタン、第1培養再開ボタン、ログアウトボタンが表示される。
When the stem cell first extraction end button is clicked, the
第1培養手段を再び行う場合、第1培養再開ボタンをクリックし、図2から図8に示す既述の骨髄液分離手段、骨髄液抽出手段、幹細胞第1観察手段、幹細胞第2観察手段、幹細胞第1抽出手段を再び実施する。第2培養を行わない場合、ログアウトボタンをクリックする。ログアウトボタンをクリックすると、コンピュータ11においてシステム10が停止する。
When the first culture means is performed again, the first culture resumption button is clicked, and the bone marrow fluid separation means, bone marrow fluid extraction means, stem cell first observation means, stem cell second observation means described above shown in FIGS. The stem cell first extraction means is performed again. Click the logout button if you do not want to perform the second culture. When the logout button is clicked, the
担当者は、QRコードが印字された第2コード用紙18bを第1間葉系幹細胞27を注入するガラス試験管30の外周面に貼付する。次に、第2培養第1表示画面の幹細胞分離ボタンをクリックし、ガラス試験管30のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号3およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、幹細胞分離実施中メッセージ、幹細胞分離終了ボタンをディスプレイ16に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge affixes the
担当者は、ピペット内の第1間葉系幹細胞27をそのガラス試験管30に注入(収容)し、ガラス試験管30を遠心分離器29に設置(セット)する。担当者は、幹細胞27を遠心分離器29によって所定時間遠心分離した後、ガラス試験管30を遠心分離器29から取り出す。ガラス試験管30内の第1間葉系幹細胞27は、遠心分離器29によって上下方向へ2層の層状に分離する。
The person in charge injects (accommodates) the first
図11は、幹細胞第2抽出手段に使用されるガラス試験管30の斜視図である。第1間葉系幹細胞27を層状に分離させた幹細胞分離手段の後、幹細胞第2抽出手段が行われる。幹細胞第2抽出手段では、層状に分離した第1間葉系幹細胞27から下層(最下層)に位置する第2間葉系幹細胞31を抽出する。医師や看護師、研究者等の担当者は、遠心分離器29によって第1間葉系幹細胞27を上下方向へ層状に分離させた後、ガラス試験管30を遠心分離器29から取り出し、ディスプレイ16に表示された幹細胞分離終了ボタンをクリックする。
FIG. 11 is a perspective view of a
幹細胞分離終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第2培養第2表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第2培養第2表示画面には、番号2およびドナーデータが表示されるとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出ボタン、幹細胞第3観察ボタン、幹細胞第4観察ボタン、幹細胞第3抽出ボタンが表示される。
When the stem cell separation end button is clicked, the
担当者は、第2培養第2表示画面の幹細胞第2抽出ボタンをクリックし、ガラス試験管30のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号2およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出実施中メッセージ、幹細胞第2抽出終了ボタンをディスプレイ16に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge clicks the stem cell second extraction button on the second culture second display screen, and causes the
担当者は、ガラス試験管30において層状に分離した第1間葉系幹細胞27のうちの下層(最下層)に存在する第2間葉系幹細胞31を抽出する。担当者は、注射器を利用して層状に分離した第1間葉系幹細胞27のうちの下層(最下層)に位置する第2間葉系幹細胞31を抽出(吸引)する。または、ピペットを利用して層状に分離した第1間葉系幹細胞27のうちの下層(最下層)に位置する第2間葉系幹細胞31を抽出(吸引)する。
The person in charge extracts the second
幹細胞培養システム10は、不要な幹細胞を含む第1間葉系幹細胞27を遠心分離器29で遠心分離して上下方向へ層状に分離させ、層状に遠心分離した幹細胞27のうちの下層(最下層)に位置する第2間葉系幹細胞31を抽出することで、幹細胞27から特定の第2間葉系幹細胞31を確実に抽出することができ、幹細胞27から不要な間葉系幹細胞を除去することができる。
The stem
幹細胞培養システム10は、第1扁平培養容器25(第1培養容器)の底面面積に対する第1間葉系幹細胞27の総平面面積が80%を超過して幹細胞27が増殖すると、幹細胞27の活性が次第に失われるが、培養容器25の底面面積に対して幹細胞27の総平面面積が70〜80%に増殖したときに、幹細胞27を培養容器25から抽出するから、幹細胞27の活性を保持することができ、活性を保持した状態で幹細胞27を増殖させることができるとともに、幹細胞27から活性を有する第2間葉系幹細胞31を抽出することができる。
When the total planar area of the first
図12は、第2扁平培養容器26(第2培養容器)の斜視図であり、図13は、第2扁平培養容器26(第2培養容器)の側面図である。図14は、第2間葉系幹細胞31の平面形状の一例を示す部分拡大図であり、図15は、第2間葉系幹細胞31の平面形状の他の一例を示す部分拡大図である。図14,15は、電子顕微鏡13によって撮影された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像を示す。
FIG. 12 is a perspective view of the second flat culture vessel 26 (second culture vessel), and FIG. 13 is a side view of the second flat culture vessel 26 (second culture vessel). FIG. 14 is a partially enlarged view showing an example of the planar shape of the second
第1間葉系幹細胞27から下層(最下層)に位置する特定の第2間葉系幹細胞31を抽出した幹細胞第2抽出手段の後、幹細胞第3観察手段が行われる。幹細胞第3観察手段では、第2間葉系幹細胞31および培養液24を第2扁平培養容器26(第2培養容器)に注入(収容)し、培養容器26を体温と略同一の温度(約36〜37℃)で36〜48時間静的に放置(動かすことなく静かに放置)しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で培養容器26内の第2間葉系幹細胞31(第2幹細胞)の初期平面形状からの変形を電子顕微鏡13で観察し、幹細胞31が培養容器26の底面28に定着したか否かを判断する。第2間葉系幹細胞31および培養液24を注入する培養容器26の底面28(底壁外面)には、ドナーを特定するQRコードを印字した第2コード用紙18bが貼付されている。
After the second stem cell extraction means for extracting specific second
医師や看護師、研究者等の担当者は、第1間葉系幹細胞27から特定の第2間葉系幹細胞31を抽出した後、ディスプレイ16に表示された幹細胞第2抽出終了ボタンをクリックする。幹細胞第2抽出終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第2培養第3表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第2培養第3表示画面には、番号2およびドナーデータが表示されるとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出終了メッセージ、幹細胞第3観察ボタン、幹細胞第4観察ボタン、幹細胞第3抽出ボタンが表示される。
A person in charge such as a doctor, a nurse, or a researcher extracts a specific second
担当者は、QRコードが印字された第2コード用紙18bを第2扁平培養容器26の底面28(底壁外面)に貼付する。次に、第2培養第3表示画面の幹細胞第3観察ボタンをクリックし、培養容器26のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号2およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出終了メッセージ、幹細胞第3観察実施中メッセージ、幹細胞第3観察終了ボタンをディスプレイ16に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge attaches the
担当者は、注射器またはピペットに吸引された第2間葉系幹細胞31を第2扁平培養容器26に注入(収容)するとともに、注射器またはピペットに吸引された培養液24を培養容器26に注入(収容)する。第2扁平培養容器26(第2培養容器)は、透明なガラスまたは透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面40を有する平面形状が略四角形の扁平な容器であり、底面40の面積が第1扁平培養容器25(第1培養容器)のそれよりも大きく、底面40の面積が第1扁平培養容器25の約2倍である。第2扁平培養容器26は、頂部41および底部43と頂底部41,43の間に位置する中央部42と、頂部41に形成された注入口44とを有する。注入口44は、蓋45によって水密に閉塞されている。第2扁平培養容器26として小容量かつ所定面積の底面40を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。
The person in charge injects (accommodates) the second
幹細胞第3観察手段で使用される第2扁平培養容器26(第2培養容器)は、その容量が約40〜60cc(好ましくは、50cc)であり、その底面面積が約50〜72mm2である。培養容器26は、その一辺の長さが約7〜8.5mmである。培養液24は、幹細胞第1観察において注入されたそれと同一である。培養容器26に注入された第2間葉系幹細胞31は、時間の経過とともに培養容器26の底面28に定着しつつ、培養液24によって培養され、培養容器26の底面28において次第に増殖(分化)してコロニーを形成する。
The second flat culture vessel 26 (second culture vessel) used in the stem cell third observation means has a capacity of about 40 to 60 cc (preferably 50 cc) and a bottom surface area of about 50 to 72 mm 2 . . The
担当者は、注入口44から蓋45を取り外し、ピペットに吸引された第2間葉系幹細胞31を第2扁平培養容器26の注入口44から培養容器26の内部に注入(収容)するとともに、注射器またはピペットに吸引された培養液24を培養容器26の注入口44から培養容器26の内部に注入(収容)し、蓋45によって注入口44を閉塞する。担当者は、第2間葉系幹細胞31および培養液24を第2扁平培養容器26に注入した後、培養容器26を電子顕微鏡13の試料ホルダ37に設置(セット)する。
The person in charge removes the
電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第2扁平培養容器26の底部43との間にスペーサー39を介在させ、培養容器26の底部43をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器26の底部43が上となり培養容器26の頂部41(注入口44)が下となるように、培養容器26を所定角度に傾斜させた状態に保持する。なお、電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第2扁平培養容器26の頂部41との間にスペーサー39を介在させ、培養容器26の頂部41をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器26の頂部41が上となり培養容器26の底部43が下となるように、培養容器26を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ37の上面38に対する第2扁平培養容器26の傾斜角度α2は、2〜5°の範囲にあり、好ましくは、2〜3°の範囲にある。
A
幹細胞培養システム10は、試料ホルダ37の上面38に対して第2扁平培養容器26を前記傾斜角度で傾斜させることで、培養容器26内において第2間葉系幹細胞31および培養液24が培養容器26の頂部41の側(または底部43の側)に偏り、培養容器26の頂部41の側(または底部43の側)において第2間葉系幹細胞31と培養液24との水圧が大きくなって第2間葉系幹細胞31が培養容器34の底面40の側に集中し、それによって第2間葉系幹細胞31どうしの活性が高まり、培養容器26の底面40において第2間葉系幹細胞31を容易かつ迅速に定着させることができる。
The stem
電子顕微鏡13は、培養容器26に注入された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞31の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔でコンピュータ11に送信する。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納(記憶)する(幹細胞画像記憶手段)。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された幹細胞31の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ16に表示する。担当者は、ディスプレイ16に表示された幹細胞31の平面形状の拡大画像を36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で確認(視認)し、幹細胞31の平面形状の変化を観察する。なお、担当者が電子顕微鏡13の観察窓から幹細胞31の平面形状の変化を36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で直接観察してもよい。
The
第2間葉系幹細胞31の初期平面形状は略円形であり、幹細胞31の平面形状が略円形の場合、幹細胞31が培養容器26の底面40(底壁内面)に定着しておらず、幹細胞31が増殖(分化)を開始していない。第2間葉系幹細胞31の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として幹細胞31が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、幹細胞31が培養容器26の底面40(底壁内面)に定着し、幹細胞31が増殖(分化)を開始している。
The initial planar shape of the second
担当者は、幹細胞第3観察手段における観察の結果、図14に示すように、ディスプレイ16に表示された第2間葉系幹細胞31の平面形状が略円形のまま観察される場合、幹細胞31が培養容器26の底面40(底壁内面)に定着していないと判断し、幹細胞31の平面形状の変化を約1〜2時間間隔で継続して観察する。担当者は、幹細胞第3観察手段における観察の結果、図15に示すように、ディスプレイ16に表示された第2間葉系幹細胞31の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合、幹細胞31が培養容器26の底面40に定着したと判断する。
As shown in FIG. 14, when the person in charge observes the planar shape of the second
第2間葉系幹細胞31の定着時に容量が60ccを超過するとともに底面面積が72mm2を超過する大きな培養容器を使用すると、幹細胞31が容器の底面に定着し難くなるとともに幹細胞31の増殖が遅くなるが、幹細胞培養システム10は、前記容量かつ前記底面面積の第2扁平培養容器26を使用することで、幹細胞31を培養容器26の底面40に容易に定着させることができ、培養容器26において幹細胞31を素早く増殖させることができる。
When a large culture container having a capacity exceeding 60 cc and a bottom area exceeding 72 mm 2 is used when the second
幹細胞培養システム10は、第2扁平培養容器26を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で培養容器26内の第2間葉系幹細胞31の初期平面形状からの変形を観察するから、幹細胞31の変形を見逃すことはなく、幹細胞31の培養容器26の底面40に対する定着を正確に確認することができる。
The stem
図16は、第2間葉系幹細胞31の平面形状の他の一例を示す部分拡大図であり、図17は、第2間葉系幹細胞31の保存の一例を示す図である。図16は、電子顕微鏡13によって撮影された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像を示す。幹細胞第3観察手段における観察の結果、第2間葉系幹細胞31(第2幹細胞)が略円形(初期平面形状)から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、幹細胞31の第2扁平培養容器26(第2培養容器)の底面40への定着を確認した幹細胞第3観察手段の後、幹細胞第4観察手段が行われる。
FIG. 16 is a partially enlarged view showing another example of the planar shape of the second
幹細胞第4観察手段では、培養容器26内に注入されている培養液24を培養容器26から排出し、培養容器26にあらたな培養液24を注入(収容)する。次に、培養容器26を体温と略同一の温度(約36〜37℃)で36〜48時間静的に放置(動かすことなく静かに放置)しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で培養容器26の底面40に定着した第2間葉系幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積を電子顕微鏡13で観察し、幹細胞31の総平面面積が培養容器26の底面面積に対して第2目標割合に達したか否かを判断する。培養容器26の底面面積に対する第2間葉系幹細胞31の総平面面積の第2目標割合は、88〜92%(88〜92%コンフルエント)である。
In the fourth stem cell observation means, the
医師や看護師、研究者等の担当者は、第2間葉系幹細胞31の培養容器26の底面40に対する定着を確認した後、ディスプレイ16に表示された幹細胞第3観察終了ボタンをクリックする。幹細胞第3観察終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第2培養第4表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第2培養第4表示画面には、番号2およびドナーデータが表示されるとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出終了メッセージ、幹細胞第3観察終了メッセージ、幹細胞第4観察ボタン、幹細胞第3抽出ボタンが表示される。
A person in charge such as a doctor, nurse, or researcher confirms that the second
担当者は、第2培養第4表示画面の幹細胞第4観察ボタンをクリックし、培養容器26を電子顕微鏡13の試料ホルダから取り外すとともに、培養容器26のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダによって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号2およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出終了メッセージ、幹細胞第3観察終了メッセージ、幹細胞第4観察実施中メッセージ、幹細胞第4観察終了ボタンをディスプレイ16に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge clicks the fourth stem cell observation button on the second culture fourth display screen, removes the
担当者は、幹細胞第3観察手段において培養容器26内に注入した培養液24を注射器またはピペットを利用して培養容器26から排出し、注射器またはピペットに吸引されたあらたな培養液24を培養容器26に注入(収容)する。あらたな培養液24は、幹細胞第1観察手段において注入されたそれと同一である。担当者は、あらたな培養液24を培養容器26に注入した後、培養容器26を電子顕微鏡13の試料ホルダ37に設置(セット)する。
The person in charge discharges the
電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第2扁平培養容器26の底部43との間にスペーサー39を介在させ、培養容器26の底部43をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器26の底部43が上となり培養容器26の頂部41(注入口44)が下となるように、培養容器26を所定角度に傾斜させた状態に保持する(図13参照)。なお、電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第2扁平培養容器26の頂部41との間にスペーサー39を介在させ、培養容器26の頂部41をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器26の頂部41が上となり培養容器26の底部43が下となるように、培養容器26を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ37の上面38に対する第2扁平培養容器26の傾斜角度α2は、2〜5°の範囲にあり、好ましくは、2〜3°の範囲にある。
A
幹細胞培養システム10は、第2間葉系幹細胞31の定着を確認した後、培養容器26内の培養液24を排出しつつあらたな培養液24を培養容器26に注入することで、第2間葉系幹細胞31の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養システム10は、試料ホルダ37の上面38に対して第2扁平培養容器26を前記傾斜角度で傾斜させることで、培養容器26内において第2間葉系幹細胞31および培養液24が培養容器26の頂部41の側(または底部43の側)に偏り、培養容器26の頂部41の側(または底部43の側)において第2間葉系幹細胞31と培養液24との水圧が大きくなって第2間葉系幹細胞31が培養容器26の底面40の側に集中し、それによって第2間葉系幹細胞31どうしの活性が高まり、培養容器26の底面40において第2間葉系幹細胞31を容易かつ迅速に増殖(分化)させることができる。
After confirming the establishment of the second
電子顕微鏡13は、第2扁平培養容器26内の第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞31の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔でコンピュータ11に送信する。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納(記憶)する(幹細胞画像記憶手段)。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ16に表示する。
The
担当者は、ディスプレイ16に表示された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像を36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で確認(視認)し、培養容器26の底面40に定着した幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、幹細胞31の総平面面積が培養容器26の底面面積に対して第2目標割合(82〜92%コンフルエント)に達したか否かを判断する。なお、担当者が電子顕微鏡13の観察窓から第2間葉系幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積を36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で直接観察し、幹細胞31の総平面面積が培養容器26の底面面積に対して第2目標割合(88〜92%コンフルエント)に達したか否かを判断してもよい。
The person in charge checks (views) the enlarged image of the planar shape of the second
担当者は、幹細胞第4観察手段における観察の結果、図15に示すように、ディスプレイ16に表示された第2間葉系幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積が第2目標割合(88〜92%コンフルエント)に達していない場合、幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積を約1〜2時間間隔で継続して観察する。なお、ディスプレイ16に表示された拡大画像の全面積に対して第2間葉系幹細胞31の総平面面積が第2目標割合に達した場合に、幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積が第2目標割合に達したものとする。
As a result of the observation by the stem cell fourth observation means, the person in charge, as shown in FIG. 15, determines that the total planar area of the second
幹細胞第4観察手段における観察の結果、第2間葉系幹細胞31が第2扁平培養容器26(第2培養容器)の底面40(底壁内面)において増殖して幹細胞31がコロニーを形成し、幹細胞31の平面形状が拡張することで、図16に示すように、ディスプレイ16に表示された幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積が第2目標割合(88〜92%コンフルエント)に達した場合、培養容器26から幹細胞31を抽出する幹細胞第3抽出工程が行われる。幹細胞第3抽出工程では、培養容器26内において増殖(分化)した第2間葉系幹細胞31を培養容器26から抽出する。
As a result of the observation by the stem cell fourth observation means, the second
幹細胞培養システム10は、約1〜2時間間隔で総平面面積を観察することで、第2間葉系幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、培養容器26の底面面積に対して幹細胞31の総平面面積が第2目標割合に達したことを確実に把握することができる。
The stem
医師や看護師、研究者等の担当者は、第2間葉系幹細胞31の培養容器26の底面面積に対する総平面面積が第2目標割合に達したことを確認した後、ディスプレイ16に表示された幹細胞第4観察終了ボタンをクリックする。幹細胞第4観察終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11は、第2培養第5表示画面(図示せず)をディスプレイ16に表示する。第2培養第5表示画面には、番号2およびドナーデータが表示されるとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出終了メッセージ、幹細胞第3観察終了メッセージ、幹細胞第4観察終了メッセージ、幹細胞第3抽出ボタンが表示される。
A person in charge such as a doctor, nurse or researcher confirms that the total planar area of the second
担当者は、第2培養第5表示画面の幹細胞第3抽出ボタンをクリックし、培養容器26のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせる。QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号2およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出終了メッセージ、幹細胞第3観察終了メッセージ、幹細胞第4観察終了メッセージ、幹細胞第3抽出終了ボタンをディスプレイ16に表示する。それらドナーデータが不一致の場合、コンピュータ11は、エラーメッセージおよび培養中止メッセージをディスプレイ16に表示する。
The person in charge clicks the third stem cell extraction button on the second culture fifth display screen, and causes the
担当者は、幹細胞第4観察手段において培養容器26内に注入した培養液24を注射器またはピペットを利用して培養容器26から排出し、培養容器26内をPBSで洗浄した後、注射器またはピペットに吸引されたトリプシン液を培養容器26内に注入する。培養容器26にトリプシン液を注入すると、培養容器26の底面40に定着した第2間葉系幹細胞31がトリプシン液によって底面40から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。
The person in charge discharges the
担当者は、ピペットを利用して第2間葉系幹細胞31を吸引し、幹細胞31をピペットから保存容器32に注入(収容)する。保存容器32に注入された第2間葉系幹細胞31は、不要な間葉系幹細胞が除去された活性を有する培養対象の特定種類の単一種間葉系幹細胞33(単一種幹細胞)である。担当者は、第2間葉系幹細胞31(単一種間葉系幹細胞33)をピペットから保存容器32に注入した後、QRコードが印字された第1コード用紙18aまたは第2コード用紙18bを保存容器32の外周面に貼付する。
The person in charge uses the pipette to aspirate the second
担当者は、ディスプレイ16に表示された第2培養第5表示画面の幹細胞第3抽出終了ボタンをクリックし、保存容器32のQRコードをバーコードリーダ12に読み取らせた後、第2間葉系幹細胞31を注入した保存容器32を冷蔵庫33に収納する。第2間葉系幹細胞31(単一種間葉系幹細胞33)は、冷蔵庫33において約3〜4℃で保存される。
The person in charge clicks the stem cell third extraction end button on the second culture / fifth display screen displayed on the
QRコードがバーコードリーダ12からコンピュータ11に送信されると、コンピュータ11は、ディスプレイ16に表示されたドナーデータ(メモリに読み出したドナーデータ)とバーコードリーダ12によって読み取られたQRコードが示すドナーデータとを比較し、それらドナーデータが一致した場合、番号2およびドナーデータをディスプレイ16に表示するとともに、幹細胞分離終了メッセージ、幹細胞第2抽出終了メッセージ、幹細胞第3観察終了メッセージ、幹細胞第4観察終了メッセージ、幹細胞第3抽出終了メッセージ、培養終了ボタン、第2培養再開ボタンをディスプレイ16に表示する。第2培養を終了する場合、培養終了ボタンをクリックする。培養終了ボタンをクリックすると、コンピュータ11においてシステム10が停止する。
When the QR code is transmitted from the
幹細胞培養システム10は、第2扁平培養容器26(第2培養容器)の底面面積に対する第2間葉系幹細胞31の総平面面積が92%を超過して幹細胞31が増殖すると、幹細胞31の活性が次第に失われるが、培養容器26の底面面積に対して幹細胞31の総平面面積が88〜92%に増殖したときに、幹細胞31を培養容器26から抽出するから、幹細胞31の活性を保持することができ、活性を保持した状態で幹細胞31を増殖させることができる。
When the total planar area of the second
図18は、第3扁平培養容器46(第3培養容器)の側面図である。第2培養手段を再び行う場合(第2培養手段を2回以上行う場合)、第2培養再開ボタンをクリックし、図10〜図17に示す既述の幹細胞第3観察手段、幹細胞第4観察手段、幹細胞第3抽出手段を再び実施する。単一種幹細胞は、第1培養手段を1回実施し、第2培養手段を1回または第2培養手段を2回以上実施することから作られる。第2培養手段を再び行う場合、2回目以降の第2培養手段では、所定容量かつ所定面積の底面を有して第2扁平培養容器26よりも大きい容量の第3扁平培養容器46(第3培養容器)が使用される。
FIG. 18 is a side view of the third flat culture vessel 46 (third culture vessel). When the second culturing means is performed again (when the second culturing means is performed twice or more), the second culturing restart button is clicked, and the already described stem cell third observation means and stem cell fourth observation shown in FIGS. Means and stem cell third extraction means are carried out again. Single-type stem cells are produced by performing the first culture means once, performing the second culture means once, or performing the second culture means twice or more. When the second culturing means is performed again, in the second and subsequent second culturing means, the third flat culture vessel 46 (third) having a bottom surface with a predetermined volume and a predetermined area and having a capacity larger than that of the second
担当者は、1回目の第2培養手段によって培養(製造)した第2間葉系幹細胞31を第3扁平培養容器46に注入(収容)するとともに、培養液24を培養容器46に注入(収容)する。第3扁平培養容器46は、透明なガラスまたは透明なプラスチックから作られ、小容量かつ所定面積の底面47を有する平面形状が略四角形の扁平な容器であり、底面47の面積が第2扁平培養容器26(第2培養容器)のそれよりも大きい。第3扁平培養容器46は、頂部48および底部50と頂底部48,50の間に位置する中央部49と、頂部48に形成された注入口51とを有する。注入口51は、蓋52によって水密に閉塞されている。第3扁平培養容器46として小容量かつ所定面積の底面47を有する平面形状が円形や楕円形の扁平な容器を使用することもできる。
The person in charge injects (accommodates) the second
第3扁平培養容器46(第3培養容器)は、その容量が約70〜80cc(好ましくは、75cc)であり、その底面面積が約75〜108mm2である。第3扁平培養容器は、その一辺の長さが約8.7〜10.4mmである。培養液24は、幹細胞第1観察において注入されたそれと同一である。培養容器46に注入された第2間葉系幹細胞31は、時間の経過とともに培養容器46の底面47に定着しつつ、培養液24によって培養され、培養容器46の底面47において次第に増殖(分化)してコロニーを形成する。
The third flat culture vessel 46 (third culture vessel) has a capacity of about 70 to 80 cc (preferably 75 cc) and a bottom surface area of about 75 to 108 mm 2 . The third flat culture vessel has a side length of about 8.7 to 10.4 mm. The
担当者は、注入口51から蓋52を取り外し、ピペットに吸引された第2間葉系幹細胞31を第3扁平培養容器46の注入口51から培養容器46の内部に注入(収容)するとともに、注射器またはピペットに吸引された培養液24を培養容器46の注入口51から培養容器46の内部に注入(収容)し、蓋52によって注入口51を閉塞する。担当者は、第2間葉系幹細胞31および培養液24を第3扁平培養容器46に注入した後、培養容器46を電子顕微鏡13の試料ホルダ37に設置(セット)する。
The person in charge removes the
電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第3扁平培養容器46の底部50との間にスペーサー39を介在させ、培養容器46の底部50をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器46の底部50が上となり培養容器46の頂部48(注入口51)が下となるように、培養容器46を所定角度に傾斜させた状態に保持する。なお、電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第3扁平培養容器46の頂部48との間にスペーサー39を介在させ、培養容器46の頂部48をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器46の頂部48が上となり培養容器46の底部50が下となるように、培養容器46を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ37の上面38に対する第3扁平培養容器46の傾斜角度α2は、2〜5°の範囲にあり、好ましくは、2〜3°の範囲にある。
A
幹細胞培養システム10は、試料ホルダ37の上面38に対して第3扁平培養容器46を前記傾斜角度で傾斜させることで、培養容器46内において第2間葉系幹細胞31および培養液24が培養容器46の頂部48の側(または底部50の側)に偏り、培養容器46の頂部48の側(または底部50の側)において第2間葉系幹細胞31と培養液24との水圧が大きくなって第2間葉系幹細胞31が培養容器34の底面47の側に集中し、それによって第2間葉系幹細胞31どうしの活性が高まり、培養容器46の底面470において第2間葉系幹細胞31を容易かつ迅速に定着させることができる。
The stem
電子顕微鏡13は、培養容器46に注入された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞31の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔でコンピュータ11に送信する。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納(記憶)する(幹細胞画像記憶手段)。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された幹細胞31の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ16に表示する。担当者は、ディスプレイ16に表示された幹細胞31の平面形状の拡大画像を36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で確認(視認)し、幹細胞31の平面形状の変化を観察する。
The
第2間葉系幹細胞31の初期平面形状は略円形であり、幹細胞31の平面形状が略円形の場合、幹細胞31が培養容器46の底面47(底壁内面)に定着しておらず、幹細胞31が増殖(分化)を開始していない。第2間葉系幹細胞31の変形後の平面形状は定着前の略円形を核として幹細胞31が一方向へ不定形に伸張した扁平形状であり、幹細胞31が培養容器46の底面47(底壁内面)に定着し、幹細胞31が増殖(分化)を開始している。
The initial planar shape of the second
担当者は、幹細胞第3観察手段における観察の結果、ディスプレイ16に表示された第2間葉系幹細胞31の平面形状が略円形のまま観察される場合(図14援用)、幹細胞31が培養容器46の底面47(底壁内面)に定着していないと判断し、幹細胞31の平面形状の変化を約1〜2時間間隔で継続して観察する。担当者は、幹細胞第3観察手段における観察の結果、ディスプレイ16に表示された第2間葉系幹細胞31の平面形状が略円形から略円形を核として不定形の扁平形状に変形した場合(図15援用)、幹細胞31が培養容器46の底面47に定着したと判断する。
When the person in charge observes the second
第2間葉系幹細胞31の定着時に容量が80ccを超過するとともに底面面積が108mm2を超過する大きな培養容器を使用すると、幹細胞31が容器の底面に定着し難くなるとともに幹細胞31の増殖が遅くなるが、幹細胞培養システム10は、前記容量かつ前記底面面積の第3扁平培養容器46を使用することで、幹細胞31を培養容器46の底面47に容易に定着させることができ、培養容器46において幹細胞31を素早く増殖させることができる。
When a large culture container with a capacity exceeding 80 cc and a bottom area exceeding 108 mm 2 is used when the second
幹細胞培養システム10は、第3扁平培養容器46を体温と略同一の温度で36〜48時間静的に放置しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で培養容器46内の第2間葉系幹細胞31の初期平面形状からの変形を観察するから、幹細胞31の変形を見逃すことはなく、幹細胞31の培養容器46の底面47に対する定着を正確に確認することができる。
The stem
幹細胞第3観察手段における観察の結果、第2間葉系幹細胞31(第2幹細胞)が略円形(初期平面形状)から略円形を核として不定形の扁平形状に変形し、幹細胞31の第3扁平培養容器46(第3培養容器)の底面47への定着を確認した幹細胞第3観察手段の後、幹細胞第4観察手段が行われる。
As a result of the observation by the third stem cell observation means, the second mesenchymal stem cell 31 (second stem cell) is deformed from a substantially circular shape (initial planar shape) to an indeterminate flat shape with the substantially circular shape as a nucleus, and the third of the
幹細胞第4観察手段では、培養容器46内に注入されている培養液24を培養容器46から排出し、培養容器46にあらたな培養液24を注入(収容)する。次に、培養容器46を体温と略同一の温度(約36〜37℃)で36〜48時間静的に放置(動かすことなく静かに放置)しつつ、36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で培養容器46の底面47に定着した第2間葉系幹細胞31の培養容器46の底面面積に対する総平面面積を電子顕微鏡13で観察し、幹細胞31の総平面面積が培養容器46の底面面積に対して第2目標割合に達したか否かを判断する。培養容器46の底面面積に対する第2間葉系幹細胞31の総平面面積の第2目標割合は、88〜92%(88〜92%コンフルエント)である。
In the fourth stem cell observation means, the
医師や看護師、研究者等の担当者は、第2間葉系幹細胞31の培養容器46の底面47に対する定着を確認した後、幹細胞第3観察手段において培養容器46内に注入した培養液24を注射器またはピペットを利用して培養容器26から排出し、注射器またはピペットに吸引されたあらたな培養液24を培養容器46に注入(収容)する。あらたな培養液24は、幹細胞第1観察手段において注入されたそれと同一である。担当者は、あらたな培養液24を培養容器46に注入した後、培養容器46を電子顕微鏡13の試料ホルダ37に設置(セット)する。
After confirming that the second
電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第3扁平培養容器46の底部50との間にスペーサー39を介在させ、培養容器46の底部50をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器46の底部50が上となり頂部48(注入口51)が下となるように、培養容器46を所定角度に傾斜させた状態に保持する。なお、電子顕微鏡13の試料ホルダ37の上面38と第3扁平培養容器46の頂部48との間にスペーサー39を介在させ、培養容器46の頂部48をスペーサー39によって持ち上げた状態に保持し、培養容器46の頂部48が上となり底部50が下となるように、培養容器46を所定角度に傾斜させた状態に保持してもよい。試料ホルダ37の上面38に対する第3扁平培養容器46の傾斜角度α2は、2〜5°の範囲にあり、好ましくは、2〜3°の範囲にある。
A
幹細胞培養システム10は、第2間葉系幹細胞31の定着を確認した後、培養容器46内の培養液24を排出しつつあらたな培養液24を培養容器46に注入することで、第2間葉系幹細胞31の増殖を確実に促進することができる。幹細胞培養システム10は、試料ホルダ37の上面38に対して第3扁平培養容器46を前記傾斜角度で傾斜させることで、培養容器46内において第2間葉系幹細胞31および培養液24が培養容器46の頂部48の側(または底部50の側)に偏り、培養容器46の頂部48の側(または底部50の側)において第2間葉系幹細胞31と培養液24との水圧が大きくなって第2間葉系幹細胞31が培養容器46の底面47の側に集中し、それによって第2間葉系幹細胞31どうしの活性が高まり、培養容器46の底面47において第2間葉系幹細胞31を容易かつ迅速に増殖(分化)させることができる。
The stem
電子顕微鏡13は、第3扁平培養容器46内の第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔で撮影し、撮影した幹細胞31の平面形状の拡大画像を約1〜2時間間隔でコンピュータ11に送信する。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像と撮影時間とをドナー識別子に関連付けた状態で記憶領域に格納(記憶)する(幹細胞画像記憶手段)。コンピュータ11は、電子顕微鏡13から送信された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像と撮影時間とをディスプレイ16に表示する。
The
担当者は、ディスプレイ16に表示された第2間葉系幹細胞31の平面形状の拡大画像を36〜48時間の間において約1〜2時間間隔で確認(視認)し、培養容器46の底面47に定着した幹細胞31の培養容器46の底面面積に対する総平面面積を観察しつつ、幹細胞31の総平面面積が培養容器46の底面面積に対して第2目標割合(82〜92%コンフルエント)に達したか否かを判断する。
The person in charge checks (views) the enlarged image of the planar shape of the second
担当者は、幹細胞第4観察手段における観察の結果、ディスプレイ16に表示された第2間葉系幹細胞31の培養容器46の底面面積に対する総平面面積が第2目標割合(88〜92%コンフルエント)に達していない場合(図15援用)、幹細胞31の培養容器46の底面面積に対する総平面面積を約1〜2時間間隔で継続して観察する。なお、ディスプレイ16に表示された拡大画像の全面積に対して第2間葉系幹細胞31の総平面面積が第2目標割合に達した場合に、幹細胞31の培養容器46の底面面積に対する総平面面積が第2目標割合に達したものとする。
As a result of the observation by the stem cell fourth observation means, the person in charge is the second target ratio (88 to 92% confluent) with respect to the total planar area of the second
幹細胞第4観察手段における観察の結果、第2間葉系幹細胞31が第3扁平培養容器46の底面47(底壁内面)において増殖して幹細胞31がコロニーを形成し、幹細胞31の平面形状が拡張することで、ディスプレイ16に表示された幹細胞31の培養容器46の底面面積に対する総平面面積が第2目標割合(88〜92%コンフルエント)に達した場合(図16援用)、培養容器46から幹細胞31を抽出する幹細胞第3抽出工程が行われる。幹細胞第3抽出工程では、培養容器46内において増殖(分化)した第2間葉系幹細胞31を培養容器46から抽出する。
As a result of the observation by the stem cell fourth observation means, the second
幹細胞培養システム10は、約1〜2時間間隔で総平面面積を観察することで、第2間葉系幹細胞31の培養容器46の底面面積に対する総平面面積を正確に確認することができ、培養容器46の底面面積に対して幹細胞31の総平面面積が第2目標割合に達したことを確実に把握することができる。
The stem
担当者は、幹細胞第4観察手段において培養容器46内に注入した培養液24を注射器またはピペットを利用して培養容器46から排出し、培養容器46内をPBSで洗浄した後、注射器またはピペットに吸引されたトリプシン液を培養容器46内に注入する。培養容器46にトリプシン液を注入すると、培養容器46の底面47に定着した第2間葉系幹細胞31がトリプシン液によって底面47から剥離し、トリプシン液の水面に浮上する。
The person in charge discharges the
担当者は、ピペットを利用して第2間葉系幹細胞31を吸引し、幹細胞31をピペットから保存容器32に注入(収容)する。保存容器32に注入された第2間葉系幹細胞31は、不要な間葉系幹細胞が除去された活性を有する培養対象の特定種類の単一種間葉系幹細胞33(単一種幹細胞)である。担当者は、第2間葉系幹細胞31(単一種間葉系幹細胞33)をピペットから保存容器32に注入した後、QRコードが印字された第1コード用紙18aまたは第2コード用紙18bを保存容器32の外周面に貼付し、第2間葉系幹細胞31を注入した保存容器32を冷蔵庫33に収納する。第2間葉系幹細胞31(単一種間葉系幹細胞33)は、冷蔵庫33において約3〜4℃で保存される。
The person in charge uses the pipette to aspirate the second
幹細胞培養システム10は、第3扁平培養容器46(第3培養容器)の底面面積に対する第2間葉系幹細胞31の総平面面積が92%を超過して幹細胞31が増殖すると、幹細胞31の活性が次第に失われるが、培養容器46の底面面積に対して幹細胞31の総平面面積が88〜92%に増殖したときに、幹細胞31を培養容器46から抽出するから、幹細胞31の活性を保持することができ、活性を保持した状態で幹細胞31を増殖させることができる。
The stem
幹細胞培養システム10によって製造された単一種間葉系幹細胞33(単一種幹細胞)は、層状に分離させた原料骨髄液19のうちの中間層に位置する中間層骨髄液23を抽出し、中間層骨髄液23を培養液24とともに培養して第1幹細胞27を第1培養容器25の底面28に定着させ、第1幹細胞27の総平面面積が第1培養容器25の底面面積に対して第1目標割合に達した場合、第1培養容器25から第1幹細胞27を抽出し、層状に分離させた第1幹細胞27のうちの下層(最下層)に位置する第2幹細胞31を抽出するとともに、第2幹細胞31を培養液24とともに培養して第2幹細胞31を第2培養容器26の底面28に定着させ、第2幹細胞31の総平面面積が第2培養容器26の底面面積に対して第2目標割合に達した場合、第2培養容器26から第2幹細胞31を抽出することから作られているから、多種雑多な幹細胞が含まれることはなく、多種雑多な幹細胞が含まれている場合と比較し、各種の疾患を完治させる確立が高いとともに各種の組織や各種の臓器を再生させる確立が高く、各種疾患の治療に好適に使用することができ、各種組織や各種臓器を再生に好適に使用することができる。
Single-type mesenchymal stem cells 33 (single-type stem cells) produced by the stem
幹細胞培養システム10によって製造された単一種間葉系幹細胞33は、層状に分離させた原料骨髄液19から特定の中間層骨髄液23を抽出し、層状に分離させた第1幹細胞27から特定の第2幹細胞31を抽出することで、不要な幹細胞が除去されたピュア(純粋)な幹細胞であり、単一種間葉系幹細胞33に多種雑多な幹細胞が含まれることがないから、各種疾患の治療の効果や再生医療における再生の効果が安定し、各種疾患を早期かつ確実に完治させることができ、各種組織や各種臓器を早期かつ確実に再生させることができる。
The single-species
幹細胞培養システム10によって製造された単一種間葉系幹細胞33は、第1培養手段を1回実施し、第2培養手段を少なくとも2回実施することから作られる場合、2回目からの第2培養手段において、所定容量かつ所定面積の底面を有して第2培養容器26よりも大きい容量の第3培養容器が使用され、第3培養容器によって多量の単一種間葉系幹細胞33を作ることができ、多数の患者の疾患の完治に利用することができるとともに、多数の患者の組織や臓器の再生に利用することができる。
When the single-type
10 幹細胞培養システム
11 コンピュータ
12 バーコードリーダ
13 電子顕微鏡
14 キーボード
15 マウス
16 ディスプレイ
18a 第1コード用紙
18b 第2コード用紙
19 原料骨髄液
20 ガラス試験管
21 試験管立て
22 恒温槽
23 中間層骨髄液
24 培養液
25 第1扁平培養容器(第1培養容器)
26 第2扁平培養容器(第2培養容器)
27 第1間葉系幹細胞(第1幹細胞)
28 底面
29 遠心分離器
30 ガラス試験管
31 第2間葉系幹細胞(第2幹細胞)
32 頂部
33 中央部
34 底部
35 注入口
36 蓋
37 試料ホルダ
38 上面
39 スペーサー
40 底面
41 頂部
42 中央部
43 底部
44 注入口
45 蓋
46 第3扁平培養容器(第3培養容器)
47 底面
48 頂部
49 中央部
50 底部
51 注入口
52 蓋
DESCRIPTION OF
26 Second flat culture vessel (second culture vessel)
27 First mesenchymal stem cell (first stem cell)
28
32
47
Claims (13)
前記単一種幹細胞が、前記ドナーから採取した原料骨髄液を層状に分離し、層状に分離させた前記原料骨髄液のうちの中間層に位置する中間層骨髄液を抽出し、所定容量かつ所定面積の底面を有する第1培養容器に前記中間層骨髄液と培養液とを注入して該中間層骨髄液に含まれる第1幹細胞を該第1培養容器の底面に定着させ、前記第1幹細胞が前記第1培養容器の底面に定着した後、前記第1培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第1培養容器に注入して前記第1幹細胞を増殖させ、前記第1幹細胞が伸張して該第1幹細胞の総平面面積が前記第1培養容器の底面面積に対して第1目標割合に達した後、前記第1培養容器から前記第1幹細胞を抽出する第1培養手段と、前記第1培養手段によって抽出した前記第1幹細胞を層状に遠心分離し、層状に分離させた前記第1幹細胞のうちの最下層に位置する第2幹細胞を抽出するとともに、所定容量かつ所定面積の底面を有して前記第1培養容器よりも大きい容量かつ大きい底面面積の第2培養容器に前記第2幹細胞とあらたな培養液とを注入して該第2幹細胞を該第2培養容器の底面に定着させ、前記第2幹細胞が前記第2培養容器の底面に定着した後、前記第2培養容器内の培養液を排出しつつあらたな培養液を該第2培養容器に注入して前記第2幹細胞を増殖させ、前記第2幹細胞が伸張して該第2幹細胞の総平面面積が前記第2培養容器の底面面積に対して第2目標割合に達した後、前記第2培養容器から前記第2幹細胞を抽出する第2培養手段とを実施することから作られていることを特徴とする単一種幹細胞。 In single-type stem cells made from raw bone marrow fluid collected from donors,
The single-type stem cells separate the raw material bone marrow fluid collected from the donor into layers, and extract the intermediate layer bone marrow fluid located in the intermediate layer of the raw material bone marrow fluid separated into layers, with a predetermined volume and a predetermined area Injecting the intermediate layer bone marrow fluid and the culture solution into a first culture vessel having a bottom surface of the first layer causes the first stem cells contained in the intermediate layer bone marrow fluid to settle on the bottom surface of the first culture vessel, After fixing on the bottom surface of the first culture vessel, a new culture solution is poured into the first culture vessel while discharging the culture solution in the first culture vessel to proliferate the first stem cells. A first culture in which the first stem cells are extracted from the first culture container after the stem cells have expanded and the total planar area of the first stem cells has reached a first target ratio with respect to the bottom area of the first culture container. And the first stem cell extracted by the first culture means The second stem cells located in the lowermost layer of the first stem cells separated by layered centrifugation are extracted, and have a bottom surface with a predetermined volume and a predetermined area and are larger than the first culture vessel. The second stem cells and a new culture solution are injected into a second culture vessel having a large volume and a bottom area to fix the second stem cells on the bottom surface of the second culture vessel, and the second stem cells are in the second culture. After fixing on the bottom surface of the container, a new culture solution is poured into the second culture vessel while discharging the culture solution in the second culture vessel to proliferate the second stem cells, and the second stem cells expand. And a second culturing means for extracting the second stem cells from the second culture container after the total planar area of the second stem cells reaches a second target ratio with respect to the bottom area of the second culture container. Single species characterized by being made from Cell.
The single-type stem cell according to any one of claims 1 to 12, wherein the first and second stem cells are mesenchymal stem cells.
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