JP2017101118A - Phosphor for dopamine detection - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ドーパミン検出用蛍光物質に関する。 The present invention relates to a fluorescent substance for detecting dopamine.
近年の情報機器の急速な発展とともに、撮像技術及び画像処理技術が目覚ましく進歩し、細胞・組織の構造や生体分子の機能などに関わる種々の生命現象を可視化イメージングすることが可能となってきた。より詳細な生体機能のダイナミック挙動可視化解析のために期待されるものは、高感度画像技術などのハードウェアの開発もさることながら、新たなる発想に基づく新規可視化プローブ分子の設計、および測定法の確立が必要となってくる。
このような生体機能のダイナミック挙動可視化解析として期待される分野の一つとして脳解析の分野がある。脳は無数の神経細胞が互いの信号を伝達しあうことによって、複雑な情報処理を実現している。その伝達過程は、細胞体における電気的発火、軸索の電気的伝達、シナプスからの神経伝達物質の分泌過程から構成されており、電気信号を化学物質の信号に変えることによって、次の神経細胞に情報を伝達している。中でもドーパミンは、人間の情動・運動・意欲・学習・薬物依存に係る重要な神経伝達物質であり、現在根本的な治療法が確立していないパーキンソン病をはじめとする神経変性疾患に対してもドーパミンが関与していることが知られている。このため、ドーパミンを選択的に可視化イメージング出来る分子プローブを開発することは、ドーパミンの動的かつ局所的な挙動をリアルタイムで計測することによって脳神経に関する理解が深まると同時に、神経変性疾患の早期診断に繋がる可能性を秘めるなど極めて重要な技術である。
With the rapid development of information equipment in recent years, imaging technology and image processing technology have advanced remarkably, and it has become possible to visualize and image various life phenomena related to the structure of cells and tissues, the function of biomolecules, and the like. What is expected for visualization analysis of dynamic behavior of biological functions in more detail is not only the development of hardware such as high-sensitivity imaging technology, but also the design of new visualization probe molecules based on new ideas and the measurement method Establishment will be required.
One of the fields expected as a dynamic behavior visualization analysis of such biological functions is the field of brain analysis. The brain realizes complex information processing by countless nerve cells transmitting each other's signals. The transmission process consists of electrical firing in the cell body, electrical transmission of axons, and secretion process of neurotransmitters from synapses. By converting electrical signals into chemical signals, the next neuron Is communicating information to. Among them, dopamine is an important neurotransmitter related to human emotion, movement, motivation, learning, and drug dependence, and it is also effective against neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease for which no fundamental cure has been established. It is known that dopamine is involved. Therefore, the development of molecular probes that can selectively visualize and image dopamine deepens the understanding of cranial nerves by measuring the dynamic and local behavior of dopamine in real time, and at the same time, enables early diagnosis of neurodegenerative diseases. This is an extremely important technology, such as having the potential to connect.
in vitroおよびin vivo系における試料中のドーパミンを計測する方法として、HPLC法、マイクロダイアリシス法、電気化学法が挙げられる(非特許文献１〜３)。HPLC法では、ドーパミンを含む試料を高速液体クロマトグラフィーで分離後、UV検出器によってドーパミンを検出する方法である。この方法の欠点として、操作が煩雑である事、in vitro測定のみに限定されることが挙げられる。マイクロダイアリシス法では、半透膜を用い、試料内に灌流液を流し、逆に浸透圧で神経伝達物質を回収するという方法である。この方法は、実際に伝達物質を回収しているので、物質の同定に関しては正しく行うことができるが、灌流液を脳内に注入するため侵襲性が高いこと、ドーパミンに対する選択性が欠けること、リアルタイム計測に不向きであることが欠点である。電気化学法では、ドーパミンの酸化還元電位を用いる方法であり、リアルタイム計測が可能であるがドーパミンのみを選択的に計測することが難しいという欠点がある。
一方、蛍光光度法は、種々の化学物質を分析する慣習的な方法であり、高感度である、試料が少量ですむ、大掛かりな装置、熟練した技術を必要としないといった利点がある。
これまでにも蛍光光度法を利用したドーパミン分析の報告はある。例えば、1,2-ジフェニルエチレンジアミン(DPE)が、ドーパミンを含むカテコールアミンの測定に汎用されている。DPEは、ヘキサシアノ鉄(III)酸カリウムの存在下、緩和な条件でカテコールアミンと反応する。この反応をポストカラム蛍光誘導体化HPLCに利用してカテコールアミン及びその代謝物を一斉分析できる。しかし、ドーパミンのみに対する選択性はなく、HPLC等による試料の分離精製過程が必須であることが欠点である。
Examples of methods for measuring dopamine in samples in vitro and in vivo include HPLC, microdialysis, and electrochemical methods (Non-Patent Documents 1 to 3). In the HPLC method, a sample containing dopamine is separated by high performance liquid chromatography, and then dopamine is detected by a UV detector. Disadvantages of this method include complicated operation and limited to in vitro measurement only. In the microdialysis method, a semipermeable membrane is used, a perfusate is poured into a sample, and conversely, a neurotransmitter is collected by osmotic pressure. Since this method actually collects the transmitter substance, it can be performed correctly regarding the substance identification, but it is highly invasive because the perfusate is injected into the brain, lack of selectivity for dopamine, The disadvantage is that it is not suitable for real-time measurement. The electrochemical method uses the redox potential of dopamine and has a drawback that it is difficult to selectively measure only dopamine although real-time measurement is possible.
On the other hand, the fluorometric method is a conventional method for analyzing various chemical substances, and has advantages such as high sensitivity, a small amount of sample, a large-scale apparatus, and no need for skilled techniques.
There have been reports of dopamine analysis using fluorometry. For example, 1,2-diphenylethylenediamine (DPE) is widely used for measuring catecholamines containing dopamine. DPE reacts with catecholamines under mild conditions in the presence of potassium hexacyanoferrate (III). This reaction can be used for post-column fluorescence derivatization HPLC to simultaneously analyze catecholamines and their metabolites. However, there is no selectivity for dopamine alone, and the disadvantage is that a sample separation and purification process by HPLC or the like is essential.
そこで本発明では、上記問題点を解決し、ドーパミンを選択的に高感度で検出することができる化合物を提供することにより、分析化学、生化学など様々な分野に貢献することを課題としている。 Therefore, the present invention has an object to contribute to various fields such as analytical chemistry and biochemistry by solving the above problems and providing a compound capable of selectively detecting dopamine with high sensitivity.
本発明者らは、ドーパミンと選択的に複合体を形成する構造(ドーパミン認識部位)を有する化合物を得ることを目指し鋭意検討した。その結果、当該構造として鉄(II)イオンとの錯体を形成するイミノ二酢酸またはその誘導体の構造を有する官能基の採用に着目した。さらに、当該構造によるドーパミンとの複合体形成に伴い蛍光の発光に変化を生じる部位としてシアノピラニル基などの官能基を上記ドーパミン認識部位に連結することを着想した。
このような思想に基づき合成された新規化合物の鉄錯体は、ドーパミンが反応すると当該化合物から鉄(II)イオンが解離することによって蛍光強度の変化を観察することができ、これによりドーパミンの検出を可能とするものである。
すなわち、本発明は以下の通りである。
本発明は、一態様として、
〔１〕下記一般式(Ｉ)で表される化合物またはその塩に関する：
Ａ−Ｓ−Ｂ (Ｉ)
(ここで、式(Ｉ)中、Ａは、下記の式(Ａ−１)〜(Ａ−１３)からなる群より選択されるいずれか一つを示し：
また、式(Ｉ)中、Ｂは、下記式(Ｂ)で表される：
また、式(Ｉ)中、Ｓは炭素数1〜4のアルキル基、炭素数1〜4のアルケニル基、または、炭素数1〜4のアルキニル基を示す。)
The present inventors diligently studied with the aim of obtaining a compound having a structure (dopamine recognition site) that selectively forms a complex with dopamine. As a result, attention was paid to the use of a functional group having the structure of iminodiacetic acid or a derivative thereof that forms a complex with an iron (II) ion as the structure. Furthermore, the inventors have conceived that a functional group such as a cyanopyranyl group is linked to the above dopamine recognition site as a site that causes a change in fluorescence emission due to formation of a complex with dopamine by the structure.
The iron complex of a new compound synthesized based on this concept can observe the change in fluorescence intensity due to the dissociation of iron (II) ions from the compound when dopamine reacts, thereby detecting dopamine. It is possible.
That is, the present invention is as follows.
The present invention, as one aspect,
[1] relates to a compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof:
A-S-B (I)
(In the formula (I), A represents any one selected from the group consisting of the following formulas (A-1) to (A-13):
In the formula (I), B is represented by the following formula (B):
In the formula (I), S represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 4 carbon atoms, or an alkynyl group having 1 to 4 carbon atoms. )
また、本発明の化合物またはその塩は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の化合物またはその塩であって、
前記式(Ｉ)中、Ａが、下記の式(Ａ−５)または(Ａ−７)である、ことを特徴とする：
また、本発明の化合物は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の化合物であって、鉄イオンと錯体を形成していることを特徴とする。
In one embodiment, the compound of the present invention or a salt thereof is
[2] The compound according to [1] above or a salt thereof,
In the formula (I), A is the following formula (A-5) or (A-7):
Moreover, the compound of the present invention, in one embodiment,
[3] The compound according to [1] or [2] above, wherein the compound forms a complex with an iron ion.
また、本発明は、別の態様において、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の化合物またはその塩を含む蛍光試薬に関する。
また、本発明の蛍光試薬は、一実施の形態において、
〔５〕ドーパミン検出用蛍光試薬である、ことを特徴とする。
また、本発明は、別の態様において、
〔６〕上記〔１〕に記載の化合物またはその塩の中間体化合物であって、下記式(ＩＩ)に示される化合物に関する：
[4] A fluorescent reagent containing the compound or salt thereof according to any one of [1] to [3].
Further, the fluorescent reagent of the present invention, in one embodiment,
[5] A fluorescent reagent for detecting dopamine.
In another aspect, the present invention provides:
[6] An intermediate compound of the compound according to [1] above or a salt thereof, which relates to a compound represented by the following formula (II):
また、本発明は、別の態様において、
〔７〕式(ＩＩ)で示される化合物の製造方法であって、
(ａ)下記式(ＩＩＩ)で示される化合物、パラホルムアルデヒド、および、炭素数2〜4のアルコールを含む溶媒中に4-ヒドロキシベンズアルデヒドを溶解させる工程を含む、製造方法に関する：
〔８〕式(Ｉ)で示される化合物の製造方法であって、
(ａ)下記式(ＩＩＩ)で示される化合物、パラホルムアルデヒド、および、炭素数2〜4のアルコールを含む溶媒中に4-ヒドロキシベンズアルデヒドを溶解させる工程と
(ｂ)前記工程(ａ)により得られた化合物および蛍光色素を、炭素数1〜4のアルコールと第二級アミンまたは第三級アミンとを含む溶媒中で反応させる工程と
(ｃ)前記工程(ｂ)で得られた化合物の保護基を、塩基性条件下で脱保護する工程と
を含む、製造方法に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔９〕上記〔４〕または〔５〕に記載の蛍光試薬を用いてドーパミンを検出または測定する方法であって、ドーパミンと前記蛍光試薬とを反応させて、前記蛍光試薬の蛍光強度の変化を測定する工程を含む方法に関する。
また、本発明は、別の態様において、
〔１０〕生体において神経細胞から放出されたドーパミンを検出または測定する方法であって、
ドーパミンを測定したい部位に請求項４または５に記載の蛍光試薬を投与する工程と
当該蛍光試薬の蛍光を測定する工程と
を含む、方法に関する。
In another aspect, the present invention provides:
[7] A method for producing a compound represented by the formula (II),
(a) It relates to a production method including a step of dissolving 4-hydroxybenzaldehyde in a solvent containing a compound represented by the following formula (III), paraformaldehyde, and an alcohol having 2 to 4 carbon atoms:
[8] A method for producing a compound represented by formula (I), comprising:
(a) dissolving 4-hydroxybenzaldehyde in a solvent containing a compound represented by the following formula (III), paraformaldehyde, and an alcohol having 2 to 4 carbon atoms;
(b) reacting the compound obtained in the step (a) and the fluorescent dye in a solvent containing an alcohol having 1 to 4 carbon atoms and a secondary amine or tertiary amine;
(c) a step of deprotecting the protecting group of the compound obtained in the step (b) under basic conditions.
In another aspect, the present invention provides:
[9] A method for detecting or measuring dopamine using the fluorescent reagent according to [4] or [5] above, wherein dopamine is reacted with the fluorescent reagent to change the fluorescence intensity of the fluorescent reagent. The present invention relates to a method including a measuring step.
In another aspect, the present invention provides:
[10] A method for detecting or measuring dopamine released from nerve cells in a living body,
The present invention relates to a method comprising the step of administering the fluorescent reagent according to
本発明の化合物によれば、鉄イオンの存在下、ドーパミンと選択的に反応することで蛍光の発光強度に変化を生じるため、ドーパミンを蛍光光度法により検出することを可能とする。
このように本発明の化合物を用いることでドーパミンを蛍光光度法により検出できるため、ドーパミンの高感度かつ高選択的な測定が可能となり、迅速にかつ簡便にターゲットとなるドーパミンの分析を行うことが出来る。しかも従来のような高価な装置と熟練した技術は必要としない。また使用する分析試薬は、容易に合成できることから、試薬にかかるコストは低減することができる。
According to the compound of the present invention, since the fluorescence emission intensity is changed by selectively reacting with dopamine in the presence of iron ions, dopamine can be detected by a fluorometric method.
Thus, since the compound of the present invention can be used to detect dopamine by a fluorometric method, highly sensitive and selective measurement of dopamine is possible, and target dopamine can be analyzed quickly and easily. I can do it. Moreover, conventional expensive equipment and skilled techniques are not required. Moreover, since the analysis reagent to be used can be easily synthesized, the cost for the reagent can be reduced.
本発明の化合物は、鉄錯体の形成時、ドーパミンと選択的に反応することで蛍光に変化が生じる化合物であり、当該蛍光の変化によりドーパミンを検出可能とするものである。本発明の化合物は、例えば、以下の式(Ｉ)により示すことができる：
Ａ−Ｓ−Ｂ (Ｉ)
ここで、上記式(Ｉ)における「Ａ」は、励起光の照射により蛍光を生じる構造であり、かつ、「Ｂ」の構造における鉄錯体の形成の有無により、当該蛍光に変化が生じる構造を含む。「Ｂ」は、鉄イオン(２価)との錯体を形成可能な構造であり、かつ、ドーパミンを認識する特定の構造を含む。「Ｓ」はＡとＢとを連結するためのスペーサーであり、Ｂで認識した情報をＡに伝達するための役割を有する。
The compound of the present invention is a compound that changes in fluorescence by selectively reacting with dopamine during the formation of an iron complex, and allows detection of dopamine by the change in fluorescence. The compounds of the invention can be represented, for example, by the following formula (I):
A-S-B (I)
Here, “A” in the above formula (I) is a structure that generates fluorescence when irradiated with excitation light, and a structure in which the fluorescence changes depending on whether or not an iron complex is formed in the structure of “B”. Including. “B” is a structure capable of forming a complex with an iron ion (divalent) and includes a specific structure that recognizes dopamine. “S” is a spacer for linking A and B, and has a role for transmitting information recognized by B to A.
上記式(Ｉ)における「Ａ」は、上述のように、式(Ｉ)で示される化合物の一部を構成する際に励起光の吸収により蛍光を生じる構造であって、かつ、式(Ｉ)の化合物が鉄錯体を形成の有無に依存して、当該蛍光の発光および消光が起こる構造であればよい。式(Ｉ)で示される化合物は、ドーパミンの存在下では鉄錯体の形成が阻害されるため、これにより、再び蛍光を生じることができる。このような「Ａ」の構造としては、例えば、ナフタレン、アントラセン、ピレン、ビフェニル、クマリン、ベンゾチアゾ−ル、フルオレセイン、ローダミン、ビピリジン、キノリン、フェナントロリン、シアノピラニル、ピリジンなどの多環芳香族化合物、複素環化合物の構造を採用することができる。
また、上記式(Ｉ)における「Ａ」は、例えば、以下に示される式(Ａ−１)〜(Ａ−１３)からなる群より選択されるいずれか一つとすることができる：
Further, “A” in the above formula (I) can be any one selected from the group consisting of the following formulas (A-1) to (A-13):
式(Ｉ)における「Ａ」としては、一実施の形態として、下記の式(Ａ−５)または(Ａ−７)とすることができる：
また、好ましい一実施の形態において、上記式(Ａ−１)〜(Ａ−１３)に含まれる化合物としては具体的に下記の化合物を挙げることができる：
なお、式(ａ−１)〜(ａ−１５)の構造は、可視光において励起され、蛍光を発光することが可能である。従って、生体の試料を用いてドーパミンの検出または測定を行う際に、紫外線のような有害な励起光を使用することなく、ドーパミンの検出または測定を行うことを可能とする。
In a preferred embodiment, specific examples of the compounds contained in the above formulas (A-1) to (A-13) include the following compounds:
Note that the structures of the formulas (a-1) to (a-15) can be excited by visible light to emit fluorescence. Therefore, when detecting or measuring dopamine using a biological sample, it is possible to detect or measure dopamine without using harmful excitation light such as ultraviolet rays.
また、上記式(Ｉ)における「Ｂ」は、鉄イオンと鉄錯体を形成することができる。また、ドーパミンの存在下においては、ドーパミン選択的にドーパミンと複合体を形成し、鉄イオンが脱離され、これにより鉄錯体の形成が阻害される。このように、ドーパミンの存在下においては、「Ｂ」の構造における鉄錯体の形成が阻害されると「Ａ」の構造における蛍光に変化が生じることになる。このような「Ｂ」の構造としては、例えば、下記式(Ｂ)で示すことができる：
式(Ｉ)における「Ｂ」の構造としては、式(Ｂ)に示すように、イミノ二酢酸またはその誘導体と水酸基とを互いにオルト位でベンゼン環の側鎖に有することがより好ましい。ここで、イミノ二酢酸またはその誘導体と水酸基とは、鉄イオンの存在下で鉄錯体を形成する。一方で、ドーパミンの存在下では特異的に鉄イオンの脱離が生じ、鉄錯体の形成は阻害される。このような、イミノ二酢酸またはその誘導体と水酸基との構造における鉄錯体の形成の変化により、「Ｂ」と連結している「Ａ」からの蛍光に変化が生じ、ドーパミンを特異的に検出することができる。 As the structure of “B” in the formula (I), as shown in the formula (B), it is more preferable that iminodiacetic acid or a derivative thereof and a hydroxyl group have an ortho position in the side chain of the benzene ring. Here, iminodiacetic acid or a derivative thereof and a hydroxyl group form an iron complex in the presence of iron ions. On the other hand, in the presence of dopamine, iron ions are specifically eliminated and the formation of iron complexes is inhibited. Such a change in the formation of an iron complex in the structure of iminodiacetic acid or a derivative thereof and a hydroxyl group causes a change in fluorescence from “A” linked to “B”, and specifically detects dopamine. be able to.
なお、式(Ｉ)における「Ｂ」の好ましい一実施の形態としては、例えば、下記式(ｂ−１)を挙げることができる：
また、式(Ｉ)における「Ｓ」は、「Ｂ」における鉄錯体形成の有無の情報を「Ａ」に伝え、「Ａ」の蛍光に変化を生じさせる構造であればよい。また、Sは炭素数1〜4のアルキル基、炭素数1〜4のアルケニル基、または、炭素数1〜4のアルキニル基を示す。 Further, “S” in the formula (I) may be any structure as long as it transmits information on the presence or absence of iron complex formation in “B” to “A” and causes a change in the fluorescence of “A”. S represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 4 carbon atoms, or an alkynyl group having 1 to 4 carbon atoms.
本発明の化合物は、上記に列挙した「Ａ」、「Ｂ」、「Ｓ」の全ての組み合わせの形態を含む。好ましい組み合わせの例としては、以下に限定されないが、表１に記載の組み合わせを挙げることができる。
また、本発明の化合物として、好ましい具体例としては、例えば表２に記載の組み合わせを挙げることができるが、これに限定されない。
また、本発明の化合物は塩の形態とすることができる。塩の形態は、特に限定されず、臭化物塩、塩化物塩、ヨウ化物塩を挙げることができる。 Moreover, the compound of this invention can be made into the form of a salt. The form of the salt is not particularly limited, and examples thereof include bromide salts, chloride salts, and iodide salts.
また、本発明は、式(ＩＩ)で示される化合物の製造方法を提供する。当該製造方法は、(ａ)下記式(ＩＩＩ)で示される化合物を含むパラホルムアルデヒド、および、炭素数2〜4のアルコールを含む溶媒中に4-ヒドロキシベンズアルデヒドを溶解させる工程を含む。なお、溶媒に用いる炭素数2〜4のアルコールとしては、例えば、エタノール、n-プロピルアルコール、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール等を用いることができる。
なお、R4およびR5で示される保護基としては、エチル基、メチル基、または、tert-ブチル基等を用いることができる。
パラホルムアルデヒド、および、炭素数2〜4のアルコールを含む溶媒としては、パラホルムアルデヒド、および、イソプロピルアルコールを含む溶媒を使用することが好ましい。また、式(ＩＩＩ)で示される化合物は、予めパラホルムアルデヒド、および、炭素数2〜4のアルコールを含む溶媒中に、窒素気流下で溶解させておくことが好ましい。このときの温度は、70〜90℃とすることができ、30〜60分間反応させることが好ましい。また、得られた溶媒(式(ＩＩＩ)で示される化合物を含む溶媒)に4-ヒドロキシベンズアルデヒドを溶解させる工程は、例えば、一晩還流することにより行うことができる。このようにして製造される式(ＩＩ)で示される化合物は、本発明の化合物の中間体であり、本発明の化合物の製造に用いることができる。
The present invention also provides a method for producing the compound represented by the formula (II). The production method includes (a) dissolving 4-hydroxybenzaldehyde in a solvent containing paraformaldehyde containing a compound represented by the following formula (III) and an alcohol having 2 to 4 carbon atoms. In addition, as C2-C4 alcohol used for a solvent, ethanol, n-propyl alcohol, n-butyl alcohol, isobutyl alcohol etc. can be used, for example.
As the protecting group represented by R 4 and R 5 , an ethyl group, a methyl group, a tert-butyl group, or the like can be used.
As the solvent containing paraformaldehyde and an alcohol having 2 to 4 carbon atoms, it is preferable to use a solvent containing paraformaldehyde and isopropyl alcohol. Further, the compound represented by the formula (III) is preferably dissolved in advance in a solvent containing paraformaldehyde and an alcohol having 2 to 4 carbon atoms under a nitrogen stream. The temperature at this time can be 70-90 degreeC, and it is preferable to make it react for 30-60 minutes. In addition, the step of dissolving 4-hydroxybenzaldehyde in the obtained solvent (the solvent containing the compound represented by the formula (III)) can be performed, for example, by refluxing overnight. The compound represented by the formula (II) thus produced is an intermediate of the compound of the present invention and can be used for the production of the compound of the present invention.
また、本発明は、式(Ｉ)で示される化合物の製造方法を提供する。当該方法は、上記(ａ)の工程の後に、(ｂ)前記工程(ａ)により得られた化合物および蛍光色素を、炭素数1〜4のアルコールと第二級アミンまたは第三級アミンとを含む溶媒中で反応させる工程と(ｃ)前記工程(ｂ)で得られた化合物の保護基を、塩基性条件下で脱保護する工程とを含む。
工程(ｂ)において、「蛍光色素」とは、本明細書中の式(Ｉ)における「Ａ」の構造となる化合物を指す。すなわち、蛍光色素としては、上述した「Ａ」として使用可能な化合物を用いることができる。「工程(ａ)により得られた化合物と蛍光色素」との反応は、炭素数1〜4のアルコール、および、第二級アミンまたは第三級アミンを含む溶媒中において、窒素気流下、還流を行うことで反応させることができる。なお、炭素数1〜4のアルコールとしては、メタノール、エタノール、n-プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、n-ブチルアルコール、または、sec-ブチルアルコール等を挙げることができる。また、第二級アミンまたは第三級アミンとしては、ピペリジン、トリエチルアミン、または、ジイソプロピルエチルアミン等を挙げることができる。
次いで、工程(ｃ)として、工程(ｂ)で得られた化合物の保護基をpH10〜14の塩基性条件下におくことで脱保護することができる。具体的な脱保護のための塩基性条件は、例えば、1N KOH水溶液5.0mL、エタノール25mLを含む溶液中、約12時間攪拌することで行うことができる。このようにして、本発明の化合物を製造することができる。
The present invention also provides a process for producing the compound represented by formula (I). In the method, after the step (a), (b) the compound and the fluorescent dye obtained in the step (a) are mixed with an alcohol having 1 to 4 carbon atoms and a secondary or tertiary amine. And (c) a step of deprotecting the protecting group of the compound obtained in the step (b) under basic conditions.
In the step (b), the “fluorescent dye” refers to a compound having the structure of “A” in the formula (I) in the present specification. That is, as the fluorescent dye, a compound that can be used as “A” described above can be used. The reaction of the “compound obtained in step (a) with a fluorescent dye” is carried out under reflux in a nitrogen stream in a solvent containing an alcohol having 1 to 4 carbon atoms and a secondary amine or tertiary amine. It can be made to react by doing. Examples of the alcohol having 1 to 4 carbon atoms include methanol, ethanol, n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, and the like. Further, examples of the secondary amine or tertiary amine include piperidine, triethylamine, diisopropylethylamine, and the like.
Next, as step (c), the protecting group of the compound obtained in step (b) can be deprotected by placing it under basic conditions of pH 10-14. Specific basic conditions for deprotection can be performed, for example, by stirring for about 12 hours in a solution containing 5.0 mL of 1N KOH aqueous solution and 25 mL of ethanol. In this way, the compound of the present invention can be produced.
また、本発明の化合物は鉄錯体の形態として提供することもできる。本発明の化合物の鉄錯体を得る方法は、HEPESなどの緩衝液中で、本発明の化合物と鉄を含む塩(例えば、塩化鉄(ＩＩ))とを混合すればよい。
また、本発明の化合物もしくはその塩、または、本発明の化合物の鉄錯体は、ドーパミン検出用の蛍光試薬として使用することができる。本発明の化合物またはその塩をドーパミン検出用の蛍光試薬として使用する際には、使用時に鉄錯体が形成されるように調製して用いることが好ましい。よって、蛍光試薬には、鉄を含む塩を含んでいてもよく、また、ドーパミンの検出を阻害しない限りにおいて、他の成分を含むことができる。
The compounds of the present invention can also be provided in the form of iron complexes. In order to obtain the iron complex of the compound of the present invention, the compound of the present invention and a salt containing iron (for example, iron (II) chloride) may be mixed in a buffer solution such as HEPES.
In addition, the compound of the present invention or a salt thereof, or the iron complex of the compound of the present invention can be used as a fluorescent reagent for detecting dopamine. When the compound of the present invention or a salt thereof is used as a fluorescent reagent for detecting dopamine, it is preferably prepared and used so that an iron complex is formed during use. Therefore, the fluorescent reagent may contain a salt containing iron, and may contain other components as long as it does not inhibit the detection of dopamine.
また、本発明は、上記蛍光試薬を用いたドーパミンの検出方法を提供する。本発明のドーパミンの検出方法は、ドーパミンと前記蛍光試薬とを反応させて、前記蛍光試薬の蛍光強度の変化を測定する工程を含む。
ドーパミンを測定する際の溶媒、または、蛍光試薬の溶媒としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス−グリシン緩衝液、トリス緩衝液、HEPESなど適当な溶媒を用いることができる。測定温度は、20℃〜40℃であり、好ましくは25℃〜30℃である。また、本発明の化合物は、固相に固定化されていても良い。本発明の化合物を固定化するための固相は、その上でドーパミンとの相互作用により生じる蛍光変化を検出または測定できるものであれば特に制限されない。このような固相としては、例えば、セルロース、ニトロセルロース、セファロース、アガロース、金属、ガラス、セラミック、樹脂などを挙げることができる。
The present invention also provides a method for detecting dopamine using the fluorescent reagent. The method for detecting dopamine of the present invention comprises a step of reacting dopamine and the fluorescent reagent to measure a change in fluorescence intensity of the fluorescent reagent.
As a solvent for measuring dopamine or a solvent for a fluorescent reagent, an appropriate solvent such as a phosphate buffer, a citrate buffer, a glycine buffer, a tris-glycine buffer, a tris buffer, or HEPES may be used. it can. The measurement temperature is 20 ° C to 40 ° C, preferably 25 ° C to 30 ° C. In addition, the compound of the present invention may be immobilized on a solid phase. The solid phase for immobilizing the compound of the present invention is not particularly limited as long as it can detect or measure the fluorescence change caused by the interaction with dopamine. Examples of such a solid phase include cellulose, nitrocellulose, sepharose, agarose, metal, glass, ceramic, resin, and the like.
本発明の化合物により検出または測定の対象となるドーパミンは、特に限定されず、in vitroおよびin vivoの両方におけるドーパミンの検出に使用することができる。例えば、測定対象の試料として、生体内にある動物の脳やその他の身体の一部に存在する神経細胞を用いることもできるし、脳もしくはその一部(組織、細胞)または他の身体の組織を生体より取り出したもの、または、それらを培養したものに含まれる神経細胞等に対して行うこともできる。また、幹細胞等から培養により分化した神経細胞や幹細胞等の培養により形成した組織(例えば、脳(様)組織)に含まれる神経細胞に対して行うこともできる。 The dopamine to be detected or measured by the compound of the present invention is not particularly limited, and can be used for detecting dopamine both in vitro and in vivo. For example, as a sample to be measured, it is possible to use a nerve cell present in the brain of an animal or other body in vivo, or the brain or a part thereof (tissue, cell) or other body tissue. Can also be performed on nerve cells or the like contained in those extracted from living organisms or those cultured. It can also be carried out on nerve cells differentiated by culturing from stem cells or the like, or on nerve cells contained in tissue (eg, brain (like) tissue) formed by culturing stem cells or the like.
本発明の化合物から生じる蛍光の検出および／または測定は、市販の通常用いられる機器を用いて行うことができる。例えば、マイクロプレートリーダー、蛍光分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光スキャナー、感光性フィルムなどを挙げることができる。また、生体の試料(例えば、脳)におけるドーパミンを検出する際には、オプティカルレコーディング法に使用される公知の装置を用いることが好ましい。 Detection and / or measurement of the fluorescence generated from the compound of the present invention can be performed using commercially available and commonly used equipment. Examples thereof include a microplate reader, a fluorescence spectrophotometer, a fluorescence microscope, a fluorescence scanner, and a photosensitive film. In addition, when detecting dopamine in a biological sample (for example, brain), it is preferable to use a known device used in the optical recording method.
また、本発明は、in vivoにおいてドーパミンを検出または測定する方法として、以下の態様を含む：
生体において神経細胞から放出されたドーパミンを検出または測定する方法であって、ドーパミンを測定したい部位に本発明の蛍光試薬を投与する工程と、当該蛍光試薬の蛍光を測定する工程とを含む方法。
また、本発明は、より具体的に、in vivoにおいてドーパミンをイメージングする方法として、以下の態様を含む：
神経細胞から神経細胞外空間に放出されたドーパミンのイメージング方法であって、
測定対象とする神経細胞外空間に蛍光試薬を投与する工程であって、前記神経細胞外空間に放出されたドーパミンと前記蛍光試薬とを反応させる工程と、
前記蛍光試薬の蛍光を測定する工程であって、前記ドーパミンと反応した蛍光試薬が励起する励起光を前記測定対象の神経細胞外空間に照射し、これにより生じた蛍光を測定する工程とを含み、
ここで、前記蛍光を測定する工程が、神経細胞外空間に放出されるドーパミンを経時的、かつ、空間的にイメージングするものである、方法。
ここで、蛍光試薬を、ドーパミンを測定したい部位または神経細胞外空間に投与するとは、露出している脳表面や脳組織、神経細胞等に直接蛍光試薬を添加して浸透させることもできるし、当該試薬を注入しても良い。なお、ヒト個体を対象とする場合には、好ましい形態として、神経伝達物質検出用試薬の投与方法は組織等に物理的な損傷が生じない方法により行われる。また、神経細胞外の空間とは、神経細胞から神経伝達物質が放出される空間のことを意味し、シナプス間隙に限定されない。
The present invention also includes the following embodiments as a method for detecting or measuring dopamine in vivo:
A method for detecting or measuring dopamine released from a nerve cell in a living body, comprising a step of administering the fluorescent reagent of the present invention to a site where dopamine is to be measured, and a step of measuring the fluorescence of the fluorescent reagent.
The present invention more specifically includes the following embodiments as a method for imaging dopamine in vivo:
A method for imaging dopamine released from a neuron into an extracellular space,
A step of administering a fluorescent reagent to the extracellular space to be measured, wherein the fluorescent reagent is reacted with dopamine released into the extracellular space;
Measuring the fluorescence of the fluorescent reagent, irradiating excitation light excited by the fluorescent reagent reacted with the dopamine to the extracellular space of the measurement target, and measuring the fluorescence generated thereby ,
Here, the step of measuring fluorescence is a method of imaging dopamine released into the extracellular space of a neuron over time and spatially.
Here, when the fluorescent reagent is administered to a site where dopamine is to be measured or to the extracellular space, it can be directly permeated by adding the fluorescent reagent to the exposed brain surface, brain tissue, nerve cells, etc. The reagent may be injected. In the case of targeting human individuals, as a preferred form, the administration method of the neurotransmitter detection reagent is performed by a method that does not cause physical damage to tissues or the like. Further, the space outside the nerve cell means a space from which a neurotransmitter is released from the nerve cell, and is not limited to the synaptic gap.
また、本発明の化合物は、ドーパミンに対して一定の割合で反応するために、既知濃度のドーパミンが含まれる標準試料を用いて得られた蛍光強度を利用して検量線を作成することにより、試料中に含まれるドーパミンの量を簡便に定量することができるものである。すなわち、本発明は、以下の態様も含む：
試料中に存在するドーパミンの濃度を測定する方法であって、蛍光試薬を当該試料に添加して、当該試料中のドーパミンと当該蛍光試薬との反応により生じた蛍光を測定する工程と、当該蛍光の測定工程により得られた蛍光強度の値を、予め決定した蛍光強度およびドーパミン濃度の検量線と比較して試料中のドーパミンの濃度を決定する工程と、を含む方法。
なお、当業者であれば、予め本発明の蛍光試薬の蛍光強度とドーパミン濃度との関係を検量線として作成することができ、これに基づき測定対象の試料中のドーパミン濃度が測定可能となる。
In addition, since the compound of the present invention reacts with dopamine at a certain ratio, by creating a calibration curve using the fluorescence intensity obtained using a standard sample containing a known concentration of dopamine, The amount of dopamine contained in the sample can be easily quantified. That is, the present invention also includes the following aspects:
A method for measuring the concentration of dopamine present in a sample, the step of adding a fluorescent reagent to the sample and measuring the fluorescence generated by the reaction between dopamine in the sample and the fluorescent reagent, and the fluorescence Comparing the fluorescence intensity value obtained by the measurement step with a calibration curve of fluorescence intensity and dopamine concentration determined in advance to determine the concentration of dopamine in the sample.
A person skilled in the art can previously create a calibration curve of the relationship between the fluorescence intensity of the fluorescent reagent of the present invention and the dopamine concentration, and based on this, the dopamine concentration in the sample to be measured can be measured.
(１．化合物１およびその鉄錯体の合成)
化合物１およびその鉄錯体は、図１に示す合成スキームに従って合成した。以下に詳細な合成方法を記載する。
(１−１．Diethyl 2,2'-(5-formyl-2-hydroxybenzylazanediyl)diacetateの合成)
下記式(ｉ)に記載の方法により、Diethyl 2,2'-(5-formyl-2-hydroxybenzylazanediyl)diacetateを合成した。
得られた目的化合物の1H-NMRを測定した。その結果を以下に示す。当該結果により、Diethyl 2,2'-(5-formyl-2-hydroxybenzylazanediyl)diacetateが得られたことがわかった。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, r.t., TMS, d/ppm) 1.24 (6H, t), 3.53 (4H, s), 4.04 (2H, s), 4.21 (4H, q), 6.99 (1H, d), 7.57 (1H, s), 7.75 (1H, d), 9.81 (1H, s) 10.54 (1H, bs).
(1. Synthesis of Compound 1 and its iron complex)
Compound 1 and its iron complex were synthesized according to the synthetic scheme shown in FIG. The detailed synthesis method is described below.
(1-1. Synthesis of
1 H-NMR of the obtained target compound was measured. The results are shown below. From the results, it was found that
1 H-NMR (CDCl 3 , 400MHz, rt, TMS, d / ppm) 1.24 (6H, t), 3.53 (4H, s), 4.04 (2H, s), 4.21 (4H, q), 6.99 (1H, d), 7.57 (1H, s), 7.75 (1H, d), 9.81 (1H, s) 10.54 (1H, bs).
(１−２．(E)-diethyl2,2'-(5-(2-(4-(dicyanomethylene)-6-methyl-4H-pyran-2-yl)vinyl)
-2-hydroxybenzyl azanediyl)diacetateの合成)
下記式(ｉｉ)に記載の方法により、
(E)-diethyl2,2'-(5-(2-(4-(dicyanomethylene)-6-methyl-4H-pyran-2-yl)vinyl)
-2-hydroxybenzyl azanediyl)diacetateを合成した。
得られた目的化合物の1H-NMRを測定した。その結果を以下に示す。当該結果により、(E)-diethyl2,2'-(5-(2-(4-(dicyanomethylene)-6-methyl-4H-pyran-2-yl)vinyl)
-2-hydroxybenzyl azanediyl)diacetateが得られたことがわかった。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, r.t., TMS, d/ppm) 1.29 (6H, t), 2.38 (s, 3H), 3.54 (4H, s), 4.02 (2H, s ), 4.22 (4H, q), 6.50-6.53 (2H, m), 6.62 (1H, s), 6.94 (1H, d), 7.18 (1H, s), 7.40-7.42 (2H, m), 9.95 (1H, bs).
(1-2. (E) -diethyl2,2 '-(5- (2- (4- (dicyanomethylene) -6-methyl-4H-pyran-2-yl) vinyl)
-2-hydroxybenzyl azanediyl) diacetate)
By the method described in the following formula (ii),
(E) -diethyl2,2 '-(5- (2- (4- (dicyanomethylene) -6-methyl-4H-pyran-2-yl) vinyl)
-2-hydroxybenzyl azanediyl) diacetate was synthesized.
1 H-NMR of the obtained target compound was measured. The results are shown below. According to the result, (E) -diethyl2,2 '-(5- (2- (4- (dicyanomethylene) -6-methyl-4H-pyran-2-yl) vinyl)
-2-hydroxybenzyl azanediyl) diacetate was obtained.
1 H-NMR (CDCl 3 , 400MHz, rt, TMS, d / ppm) 1.29 (6H, t), 2.38 (s, 3H), 3.54 (4H, s), 4.02 (2H, s), 4.22 (4H, q), 6.50-6.53 (2H, m), 6.62 (1H, s), 6.94 (1H, d), 7.18 (1H, s), 7.40-7.42 (2H, m), 9.95 (1H, bs).
(１−３．(E)-2,2'-(5-(2-(4-(dicyanomethylene)-6-methyl-4H-pyran-2-yl)vinyl)-2-hydroxybenzyl azanediyl)diacetic acidの合成)
下記式(ｉｉｉ)に記載の方法により、(E)-2,2'-(5-(2-(4-(dicyanomethylene)-6-methyl-4H-pyran-2-yl)vinyl)-2-hydroxybenzyl azanediyl)diacetic acidを合成した。
得られた目的化合物の1H-NMRを測定した。その結果を以下に示す。当該結果により、(E)-2,2'-(5-(2-(4-(dicyanomethylene)-6-methyl-4H-pyran-2-yl)vinyl)-2-hydroxybenzyl azanediyl)diacetic acidが得られたことがわかった。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, r.t., TMS, d/ppm) 2.39 (s, 3H), 3.53 (4H, s), 4.01 (2H, s ), 6.50-6.54 (2H, m), 6.61 (1H, s), 6.95 (1H, d), 7.17 (1H, s), 7.40-7.43 (2H, m), 9.96 (1H, bs).
(1-3. (E) -2,2 '-(5- (2- (4- (dicyanomethylene) -6-methyl-4H-pyran-2-yl) vinyl) -2-hydroxybenzyl azanediyl) diacetic acid Composition)
By the method described in the following formula (iii), (E) -2,2 ′-(5- (2- (4- (dicyanomethylene) -6-methyl-4H-pyran-2-yl) vinyl) -2- Hydroxybenzyl azanediyl) diacetic acid was synthesized.
1 H-NMR of the obtained target compound was measured. The results are shown below. According to the result, (E) -2,2 '-(5- (2- (4- (dicyanomethylene) -6-methyl-4H-pyran-2-yl) vinyl) -2-hydroxybenzyl azanediyl) diacetic acid was obtained. I found out.
1 H-NMR (CDCl 3 , 400MHz, rt, TMS, d / ppm) 2.39 (s, 3H), 3.53 (4H, s), 4.01 (2H, s), 6.50-6.54 (2H, m), 6.61 ( 1H, s), 6.95 (1H, d), 7.17 (1H, s), 7.40-7.43 (2H, m), 9.96 (1H, bs).
(１−４．化合物１鉄錯体の調製)
上記１−３．で得られた(E)-2,2'-(5-(2-(4-(dicyanomethylene)-6-methyl-4H-pyran-2-yl)vinyl)-2-hydroxybenzyl azanediyl)diacetic acidとFeCl2とを5μMとなるように20.0mM HEPES(pH7.2)に溶解した。
また、上述の溶解過程において、25℃の条件下、吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定(励起波長：450nm)を行った。その結果、鉄イオンの存在下では、吸収スペクトルにおいては試薬単体の場合と異なり、415nm近傍における吸光度が下がり、470nm〜700nm付近に新たな吸収帯が観察された(図２)。また、鉄イオン非存在下の溶液の色は黄色であったが、鉄イオンを添加した溶液では薄い赤色への変色が観察された。
蛍光スペクトル測定において、化合物１の励起スペクトルと蛍光スペクトルとを測定したところ、450nmに極大励起波長、560nm近傍に極大蛍光波長を持つ蛍光スペクトルが観察された(図３)。
以上の結果から、(E)-2,2'-(5-(2-(4-(dicyanomethylene)-6-methyl-4H-pyran-2-yl)vinyl)-2-hydroxybenzylazanediyl)diacetic acidと鉄イオンとが錯体を形成することが確認された。
(1-4. Preparation of Compound 1 Iron Complex)
1-3. (E) -2,2 '-(5- (2- (4- (dicyanomethylene) -6-methyl-4H-pyran-2-yl) vinyl) -2-hydroxybenzyl azanediyl) diacetic acid and FeCl 2 was dissolved in 20.0 mM HEPES (pH 7.2) to a concentration of 5 μM.
Further, in the above-described dissolution process, absorption spectrum measurement and fluorescence spectrum measurement (excitation wavelength: 450 nm) were performed at 25 ° C. As a result, in the presence of iron ions, in the absorption spectrum, the absorbance in the vicinity of 415 nm decreased, and a new absorption band was observed in the vicinity of 470 nm to 700 nm, unlike the case of the reagent alone (FIG. 2). In addition, the color of the solution in the absence of iron ions was yellow, but in the solution to which iron ions were added, discoloration to a light red color was observed.
In the fluorescence spectrum measurement, when the excitation spectrum and fluorescence spectrum of Compound 1 were measured, a fluorescence spectrum having a maximum excitation wavelength at 450 nm and a maximum fluorescence wavelength near 560 nm was observed (FIG. 3).
From the above results, (E) -2,2 '-(5- (2- (4- (dicyanomethylene) -6-methyl-4H-pyran-2-yl) vinyl) -2-hydroxybenzylazanediyl) diacetic acid and iron It was confirmed that ions form a complex.
(２．化合物２およびその鉄錯体の合成)
化合物２およびその鉄錯体は、図４に示す合成スキームに従って合成した。以下に詳細な合成方法を記載する。
(２−１．4-methyl-1-undecylpyridinium bromideの合成)
下記式(ｉｖ)に記載の方法により、4-methyl-1-undecylpyridinium bromideを合成した。
得られた目的化合物の1H-NMRを測定した。その結果を以下に示す。当該結果により、4-methyl-1-undecylpyridinium bromideが得られたことがわかった。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, r.t., TMS, d/ppm) 0.87 (3H, t), 1.26〜1.44 (17H, m), 2.03〜2.09 (2H, m), 2.75 (3H, s ), 5.06 (2H, t), 8.14 (2H, d), 9.64 (2H, d).
(2. Synthesis of
(2-1. Synthesis of 4-methyl-1-undecylpyridinium bromide)
4-methyl-1-undecylpyridinium bromide was synthesized by the method described in the following formula (iv).
1 H-NMR of the obtained target compound was measured. The results are shown below. From the results, it was found that 4-methyl-1-undecylpyridinium bromide was obtained.
1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz, rt, TMS, d / ppm) 0.87 (3H, t), 1.26 to 1.44 (17H, m), 2.03 to 2.09 (2H, m), 2.75 (3H, s), 5.06 (2H, t), 8.14 (2H, d), 9.64 (2H, d).
(２−２．(E)-4-(3-((bis(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino)methyl)-4-hydroxystyryl)-1-undecylpyridinium bromideの合成)
下記式(ｖ)に記載の方法により、(E)-4-(3-((bis(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino)methyl)-4-hydroxystyryl)-1-undecylpyridinium bromideを合成した。
得られた目的化合物の1H-NMRを測定した。その結果を以下に示す。当該結果により、(E)-4-(3-((bis(2-ethoxy-2-oxoethyl)amino)methyl)-4-hydroxystyryl)-1-undecylpyridinium bromideが得られたことがわかった。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, r.t., TMS, d/ppm) 0.87 (3H, t), 1.22〜1.29 (23H, m), 1.98〜2.00 (2H, m), 3.56 (6H, s ), 3.97 (2H, s), 4.17〜4.23 (7H, m), 4.58 (2H, t), 6.77〜6.81 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.42 (1H, d), 7.58 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.79 (1H, d).
(2-2. Synthesis of (E) -4- (3-((bis (2-ethoxy-2-oxoethyl) amino) methyl) -4-hydroxystyryl) -1-undecylpyridinium bromide)
(E) -4- (3-((bis (2-ethoxy-2-oxoethyl) amino) methyl) -4-hydroxystyryl) -1-undecylpyridinium bromide was synthesized by the method described in the following formula (v).
1 H-NMR of the obtained target compound was measured. The results are shown below. From the results, it was found that (E) -4- (3-((bis (2-ethoxy-2-oxoethyl) amino) methyl) -4-hydroxystyryl) -1-undecylpyridinium bromide was obtained.
1 H-NMR (CDCl 3 , 400MHz, rt, TMS, d / ppm) 0.87 (3H, t), 1.22 to 1.29 (23H, m), 1.98 to 2.00 (2H, m), 3.56 (6H, s), 3.97 (2H, s), 4.17 to 4.23 (7H, m), 4.58 (2H, t), 6.77 to 6.81 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.42 (1H, d), 7.58 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.79 (1H, d).
(２−３．(E)-4-(3-((bis(carboxymethyl)amino)methyl)-4-hydroxystyryl)-1-undecylpyridinium bromideの合成)
下記式(ｖｉ)に記載の方法により、(E)-4-(3-((bis(carboxymethyl)amino)methyl)-4-hydroxystyryl)-1-undecylpyridinium bromideを合成した。
得られた目的化合物の1H-NMRを測定した。その結果を以下に示す。当該結果により、(E)-4-(3-((bis(carboxymethyl)amino)methyl)-4-hydroxystyryl)-1-undecylpyridinium bromideが得られたことがわかった。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, r.t., TMS, d/ppm) 0.87 (3H, t), 1.22〜1.29 (17H, m), 1.98〜2.00 (2H, m), 3.56 (6H, s ), 3.97 (2H, s), 4.17〜4.23 (3H, m), 4.58 (2H, t), 6.77〜6.81 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.42 (1H, d), 7.58 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.79 (1H, d) .
(2-3. Synthesis of (E) -4- (3-((bis (carboxymethyl) amino) methyl) -4-hydroxystyryl) -1-undecylpyridinium bromide)
(E) -4- (3-((bis (carboxymethyl) amino) methyl) -4-hydroxystyryl) -1-undecylpyridinium bromide was synthesized by the method described in the following formula (vi).
1 H-NMR of the obtained target compound was measured. The results are shown below. From the result, it was found that (E) -4- (3-((bis (carboxymethyl) amino) methyl) -4-hydroxystyryl) -1-undecylpyridinium bromide was obtained.
1 H-NMR (CDCl 3 , 400 MHz, rt, TMS, d / ppm) 0.87 (3H, t), 1.22 to 1.29 (17H, m), 1.98 to 2.00 (2H, m), 3.56 (6H, s), 3.97 (2H, s), 4.17 to 4.23 (3H, m), 4.58 (2H, t), 6.77 to 6.81 (2H, m), 7.36 (1H, s), 7.42 (1H, d), 7.58 (1H, d), 7.78 (1H, d), 8.79 (1H, d).
(２−４．化合物２鉄錯体の調製)
上記２−３．で得られた(E)-4-(3-((bis(carboxymethyl)amino)methyl)-4-hydroxystyryl)-1-undecylpyridinium bromideとFeCl2とを5μMとなるように20.0mM HEPES(pH7.2)に溶解させ、化合物２鉄錯体を得た。
また、上述の溶解過程において、25℃の条件下、吸収スペクトル測定および蛍光スペクトル測定(励起波長：450nm)を行った。その結果、図５に示す通り、可視光(444nmに極大励起波長がある)において励起可能であり、また、560nmにおいて極大蛍光波長を有していた。
(2-4. Preparation of
2-3. (E) -4- (3-((bis (carboxymethyl) amino) methyl) -4-hydroxystyryl) -1-undecylpyridinium bromide and FeCl 2 obtained in 20.0 mM HEPES (pH 7.2) The
Further, in the above-described dissolution process, absorption spectrum measurement and fluorescence spectrum measurement (excitation wavelength: 450 nm) were performed at 25 ° C. As a result, as shown in FIG. 5, it was excitable in visible light (having a maximum excitation wavelength at 444 nm) and had a maximum fluorescence wavelength at 560 nm.
(３−１．ドーパミン存在下における化合物１鉄錯体の蛍光スペクトル)
化合物１鉄錯体を含む溶液中に、ドーパミンを添加した際の蛍光スペクトルを測定した。
具体的には、化合物１鉄錯体とドーパミンとをそれぞれ5μM(終濃度)となるように、20.0mM HEPES(pH7.2)に添加し、調製後の溶液(「化合物１鉄錯体＋ドーパミン」)の蛍光スペクトルを測定した。また、対照として、「化合物１鉄錯体のみ(ドーパミン非存在下)」および「化合物１」を含む20.0mM HEPES(pH7.2)溶液の蛍光スペクトルも測定した。なお、蛍光スペクトルの測定は25℃の条件下で行い、励起波長は450nmとした。
その結果を図６に示す。上述のように、「化合物１」を含む溶液にFe2+を添加すると、560nm近傍に存在していた極大蛍光波長の蛍光強度の顕著な減少が確認された(すなわち、化合物１鉄錯体は、560nm近傍に極大蛍光波長を有しない)。一方で、化合物１鉄錯体にドーパミンを添加すると蛍光強度の増加が観察された。この状態のとき、「化合物１」を含む溶液の蛍光強度と同程度まで回復した。これは、ドーパミンを添加することにより、Fe2+が化合物１から解離したことを示す(図７)。
このように、化合物１鉄錯体は、ドーパミン存在下において560nm近傍の極大蛍光波長を生じることが示された。なお、ドーパミンの添加による560nm近傍の極大蛍光波長においては、ドーパミン非存在下と比較して、約12倍の蛍光強度の差が生じていた。このような鉄錯体形成の有無による蛍光強度の大きな差は、化合物１を用いたドーパミンの検出感度が高いことを示す。
(3-1. Fluorescence spectrum of compound 1 iron complex in the presence of dopamine)
The fluorescence spectrum when dopamine was added to the solution containing the compound 1 iron complex was measured.
Specifically, compound 1 iron complex and dopamine are added to 20.0 mM HEPES (pH 7.2) so as to be 5 μM (final concentration), respectively, and the solution after preparation (“compound 1 iron complex + dopamine”) The fluorescence spectrum of was measured. Further, as a control, the fluorescence spectrum of a 20.0 mM HEPES (pH 7.2) solution containing “Compound 1 iron complex alone (in the absence of dopamine)” and “Compound 1” was also measured. The fluorescence spectrum was measured at 25 ° C., and the excitation wavelength was 450 nm.
The result is shown in FIG. As described above, when Fe 2+ was added to the solution containing “Compound 1”, a significant decrease in the fluorescence intensity at the maximum fluorescence wavelength that existed in the vicinity of 560 nm was confirmed (that is, the Compound 1 iron complex was It does not have a maximum fluorescence wavelength in the vicinity of 560 nm). On the other hand, an increase in fluorescence intensity was observed when dopamine was added to the compound 1 iron complex. In this state, it recovered to the same level as the fluorescence intensity of the solution containing “Compound 1”. This shows that Fe 2+ was dissociated from Compound 1 by adding dopamine (FIG. 7).
Thus, it was shown that the compound 1 iron complex produces a maximum fluorescence wavelength near 560 nm in the presence of dopamine. In addition, at the maximum fluorescence wavelength near 560 nm due to the addition of dopamine, there was a difference in fluorescence intensity of about 12 times that in the absence of dopamine. Such a large difference in fluorescence intensity depending on the presence or absence of iron complex formation indicates that the detection sensitivity of dopamine using Compound 1 is high.
(３−２．ドーパミン存在下における化合物２鉄錯体の蛍光スペクトル)
化合物２鉄錯体を含む溶液中に、ドーパミンを添加した際の蛍光スペクトルを測定した。
具体的には、上記３−１．と同様にして、化合物２鉄錯体とドーパミンとを5μM(終濃度)含む20.0mM HEPES(pH 7.2)溶液を調製し、蛍光スペクトルを測定した。また、対照として、「化合物２(ドーパミン非存在下)」を含む20.0mM HEPES(pH 7.2)溶液の蛍光スペクトルを測定した。
その結果を図８に示す。図８に示すように、化合物２鉄錯体は、化合物１と同様にドーパミンの添加による蛍光強度の増加が確認された。なお、ドーパミンの添加による560nm近傍の極大蛍光波長においては、ドーパミン非存在下と比較して、約10倍の蛍光強度の差が生じていた。このような鉄錯体形成の有無による蛍光強度の大きな差は、化合物２を用いたドーパミンの検出感度が高いことを示す。
(3-2. Fluorescence spectrum of
The fluorescence spectrum when dopamine was added to the solution containing the compound 2 iron complex was measured.
Specifically, the above 3-1. In the same manner, a 20.0 mM HEPES (pH 7.2) solution containing 5 μM (final concentration) of the compound 2 iron complex and dopamine was prepared, and the fluorescence spectrum was measured. As a control, a fluorescence spectrum of a 20.0 mM HEPES (pH 7.2) solution containing “Compound 2 (in the absence of dopamine)” was measured.
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 8, the
(４−１．種々のアミン類存在下における化合物１鉄錯体の蛍光スペクトル)
種々のアミン類存在下における化合物１鉄錯体の蛍光強度(560nmの蛍光波長)を測定した。化合物１鉄錯体を含む溶液に対する種々のアミンの添加は、上記３．のドーパミンの添加の試験例と同様にして行った。なお、アミン類としては、ドーパミン、カダベリン、システイン、GABA、グルタミン酸、グルタチオン、グリシン、ヒスチジン、プトレスチン、セロトニンを用い、アミン類は溶液中に5μM(終濃度)となるように添加した。
その結果を図９示す。図９に示すように、ドーパミン以外の他のアミン類については蛍光強度の回復は観察されなかった。
(4-1. Fluorescence spectrum of compound 1 iron complex in the presence of various amines)
The fluorescence intensity (fluorescence wavelength of 560 nm) of the compound 1 iron complex in the presence of various amines was measured. Compound 1 Addition of various amines to a solution containing an iron complex is as described in 3. above. The test was conducted in the same manner as in the test example of addition of dopamine. As the amines, dopamine, cadaverine, cysteine, GABA, glutamic acid, glutathione, glycine, histidine, putrestin, and serotonin were used, and the amines were added to the solution to a concentration of 5 μM (final concentration).
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 9, no recovery of fluorescence intensity was observed for amines other than dopamine.
(４−２．種々のカテコールアミン誘導体存在下における化合物１鉄錯体の蛍光スペクトル)
種々のカテコールアミン誘導体存在下における化合物１鉄錯体の蛍光強度(560nmの蛍光波長)を測定した。化合物１鉄錯体を含む溶液に対する種々のカテコールアミン誘導体の添加は、上記３．のドーパミンの添加の試験例と同様にして行った。カテコールアミン誘導体としては、ドーパミン、アスコルビン酸、L-3,4-ジヒドロキシフェニルアラニン(L-DOPA)、3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸(DOPAC)、アドレナリン、ホモバニリン酸(HVA)、3-メトキシチラミン(3-MT)、ノルアドレナリン、フェニルアラニン、p-チラミン、m-チラミン、チロシンを用いた。なお、カテコールアミン類は溶液中に5μM(終濃度)となるように添加した。
その結果を図１０示す。図１０に示すように、ドーパミン以外の他のカテモールアミン誘導体については蛍光強度の回復は観察されなかった。また、ドーパミンを添加した時が最も高い蛍光強度が確認された。
(4-2. Fluorescence spectra of compound 1 iron complex in the presence of various catecholamine derivatives)
The fluorescence intensity (fluorescence wavelength of 560 nm) of the compound 1 iron complex in the presence of various catecholamine derivatives was measured. Compound 1 Addition of various catecholamine derivatives to a solution containing an iron complex is as described in 3. above. The test was conducted in the same manner as in the test example of addition of dopamine. Catecholamine derivatives include dopamine, ascorbic acid, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), 3,4-dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC), adrenaline, homovanillic acid (HVA), 3-methoxytyramine (3- MT), noradrenaline, phenylalanine, p-tyramine, m-tyramine, and tyrosine. Catecholamines were added to the solution so as to be 5 μM (final concentration).
The result is shown in FIG. As shown in FIG. 10, no recovery of fluorescence intensity was observed for other catemolamine derivatives other than dopamine. Moreover, the highest fluorescence intensity was confirmed when dopamine was added.
(５．ドーパミン濃度変化に対する化合物１鉄錯体の蛍光強度)
ドーパミンの濃度変化と化合物１鉄錯体の蛍光強度との影響について測定した。
化合物１鉄錯体またはカルセインブルー鉄錯体(参照化合物)を1μM(終濃度)となるように、20.0mM HEPES(pH7.2)に溶解した。また、各溶液中に、0〜5μMのドーパミンを添加しそれぞれの溶液中の蛍光強度(560nmの蛍光波長)を測定した。
その結果を図１１示す。化合物１鉄錯体にドーパミンを添加した時の560nmにおける蛍光強度をドーパミン濃度に対してプロットしたところ、1mMまでのドーパミン濃度において良好な直線関係が得られた(図１１中の●)。比較として、参照化合物についても同様の測定を行ったところ図１１中の△に記したような結果が得られたが、化合物１鉄錯体のほうがドーパミン濃度変化に対する蛍光強度変化が大きく、より低濃度領域まで計測可能であることが示された。
(5. Fluorescence intensity of compound 1 iron complex with respect to dopamine concentration change)
The influence of the concentration change of dopamine and the fluorescence intensity of the compound 1 iron complex was measured.
Compound 1 Iron complex or calcein blue iron complex (reference compound) was dissolved in 20.0 mM HEPES (pH 7.2) so as to be 1 μM (final concentration). Further, 0 to 5 μM dopamine was added to each solution, and the fluorescence intensity (fluorescence wavelength of 560 nm) in each solution was measured.
The result is shown in FIG. When the fluorescence intensity at 560 nm when dopamine was added to the compound 1 iron complex was plotted against the dopamine concentration, a good linear relationship was obtained at dopamine concentrations up to 1 mM (● in FIG. 11). As a comparison, the same measurement was performed for the reference compound, and the results shown by Δ in FIG. 11 were obtained. However, the compound 1 iron complex had a larger fluorescence intensity change with respect to the dopamine concentration change, and the lower concentration. It was shown that measurement was possible up to the area.
生化学、医療、分析化学における高感度、高選択的かつ簡便な分析法として利用が可能である。本発明のように溶液中の定性・定量分析だけに留まらず、生体組織中のドーパミンの可視化イメージング色素、簡易分析キットに応用して、販売することもできる。 It can be used as a highly sensitive, highly selective and simple analytical method in biochemistry, medicine, and analytical chemistry. In addition to qualitative / quantitative analysis in solution as in the present invention, it can also be applied to visual imaging dyes and simple analysis kits for dopamine in biological tissues and sold.
Claims (10)
Ａ−Ｓ−Ｂ (Ｉ)
(ここで、式(Ｉ)中、Ａは、下記の式(Ａ−１)〜(Ａ−１３)からなる群より選択されるいずれか一つを示し：
また、式(Ｉ)中、Ｂは、下記式(Ｂ)で表される：
また、式(Ｉ)中、Ｓは炭素数1〜4のアルキル基、炭素数1〜4のアルケニル基、または、炭素数1〜4のアルキニル基を示す。) A compound represented by the following general formula (I) or a salt thereof:
A-S-B (I)
(In the formula (I), A represents any one selected from the group consisting of the following formulas (A-1) to (A-13):
In the formula (I), B is represented by the following formula (B):
In the formula (I), S represents an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 4 carbon atoms, or an alkynyl group having 1 to 4 carbon atoms. )
前記式(Ｉ)中、Ａが、下記の式(Ａ−５)または(Ａ−７)である、化合物またはその塩：
(ａ)下記式(ＩＩＩ)で示される化合物、パラホルムアルデヒド、および、炭素数2〜4のアルコールを含む溶媒中に4-ヒドロキシベンズアルデヒドを溶解させる工程を含む、製造方法：
(a) A production method comprising a step of dissolving 4-hydroxybenzaldehyde in a solvent containing a compound represented by the following formula (III), paraformaldehyde, and an alcohol having 2 to 4 carbon atoms:
(ａ)下記式(ＩＩＩ)で示される化合物、パラホルムアルデヒド、および、炭素数2〜4のアルコールを含む溶媒中に4-ヒドロキシベンズアルデヒドを溶解させる工程と
(ｂ)前記工程(ａ)により得られた化合物および蛍光色素を、炭素数1〜4のアルコールと第二級アミンまたは第三級アミンとを含む溶媒中で反応させる工程と
(ｃ)前記工程(ｂ)で得られた化合物の保護基を、塩基性条件下で脱保護する工程と
を含む、製造方法。 A process for producing a compound of formula (I), comprising:
(a) dissolving 4-hydroxybenzaldehyde in a solvent containing a compound represented by the following formula (III), paraformaldehyde, and an alcohol having 2 to 4 carbon atoms;
(b) reacting the compound obtained in the step (a) and the fluorescent dye in a solvent containing an alcohol having 1 to 4 carbon atoms and a secondary amine or tertiary amine;
(c) A step of deprotecting the protecting group of the compound obtained in the step (b) under basic conditions.
ドーパミンを測定したい部位に請求項４または５に記載の蛍光試薬を投与する工程と
当該蛍光試薬の蛍光を測定する工程と
を含む、方法。 A method for detecting or measuring dopamine released from nerve cells in a living body,
A method comprising the steps of administering the fluorescent reagent according to claim 4 or 5 to a site where dopamine is to be measured, and measuring the fluorescence of the fluorescent reagent.
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2015
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