JP2017093367A - Method and kit to determine whether eel is anguilla japonica - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and a kit for determining whether an eel is a Japanese eel.
ウナギはウナギ属に属する魚であり、東南アジアを中心に世界で１９種・亜種が知られている。ウナギの養殖は、天然のウナギの稚魚（シラスウナギ）を河口で漁獲して蓄養することにより行われる。一般的に、ニホンウナギの方が他の外国種のウナギより高価で取引されることから、ニホンウナギ以外のウナギの稚魚をニホンウナギと偽って販売する例が後を絶たない。このため、消費者の食の安心・安全の確保、生産者の商品力維持、悪質な食品関連業者への牽制等の観点から、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する技術が求められている。 Eels are a fish belonging to the genus Eel, and 19 species and subspecies are known around the world mainly in Southeast Asia. Eel farming is carried out by catching and farming natural eel fry (Shirasu eel) at the estuary. In general, Japanese eels are more expensive than other foreign eels, so there are many examples of selling eel fry other than Japanese eels as fake Japanese eels. For this reason, technology is required to determine whether eels are Japanese eels from the viewpoints of ensuring food safety and safety for consumers, maintaining product strength of producers, and restraining malicious food-related businesses. ing.
また、ニホンウナギの稚魚は、１９６０年代から激減しており、現在は絶滅危惧種に指定されている。このため、ニホンウナギがワシントン条約の附属書リストに登録される可能性がある。リストに登録された場合には、税関等でウナギがニホンウナギであるか否かを判定することが必要になる。 Japanese eel fry has been drastically reduced since the 1960s and is now designated as an endangered species. For this reason, there is a possibility that Japanese eels will be added to the Washington Convention Annex List. When registered in the list, it is necessary to determine whether or not the eel is a Japanese eel at customs.
例えば、特許文献１には、ウナギの稚魚を撮像する撮像手段と、該撮像手段で撮像した画像に基づいてウナギの稚魚の種を判別する判別手段と、を具備した種判別装置が記載されている。 For example, Patent Document 1 describes a species discriminating apparatus including an imaging unit that images a eel fry and a discriminating unit that discriminates a species of eel fry based on an image captured by the imaging unit. Yes.
しかしながら、ウナギ属の形態には変異が乏しく、形態で種を判定することは困難な場合がある。そこで、本発明は、ウナギがニホンウナギであるか否かを高い精度で容易に判定することができる技術を提供することを目的とする。 However, the eel genus form is poorly mutated and it may be difficult to determine the species by form. Then, an object of this invention is to provide the technique which can determine easily whether it is a Japanese eel with high precision.
本発明は以下の態様を含む。
（１）ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を決定する工程と、決定した前記塩基配列のうち、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域の塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性を算出する工程と、前記配列同一性が９５％以上であった場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、前記配列同一性が９５％未満であった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法。
（２）ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法。
（３）ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法。
（４）配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を備える、ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット。
（５）配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を備える、ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット。
（６）配列番号２に記載の塩基配列において、前記センスプライマーと、前記アンチセンスプライマーとに挟まれる領域内の連続する１５〜４０ヌクレオチド又は前記ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなり、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するプローブを更に備える、（４）又は（５）に記載のキット。
The present invention includes the following aspects.
(1) A method for determining whether an eel is a Japanese eel, the step of determining the base sequence of the eel mitochondrial 16S rRNA, and the base sequence described in SEQ ID NO: 1 among the determined base sequences A step of calculating the sequence identity between the base sequence of the region corresponding to the sequence and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and when the sequence identity is 95% or more, the eel is a Japanese eel Determining and determining that the eel is not a Japanese eel if the sequence identity is less than 95%.
(2) A method for determining whether an eel is a Japanese eel, wherein any one of the 1193rd to 1195th bases of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 using the eel mitochondrial DNA as a template In the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 with any one of the 1193rd to 1195th bases as the 3 ′ end and continuous 15 to Among the nucleotide sequence consisting of 40 nucleotides, among the sense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions and the 1211th to 1704th base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 Of the nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence consisting of nucleotides or the 1211th to 1704th nucleotide sequences of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 A step of performing a gene amplification reaction using an antisense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in a complementary sequence of a base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, and a gene by the gene amplification reaction A step of determining that the eel is a Japanese eel when amplification of a fragment is observed, and a step of determining that the eel is not a Japanese eel when amplification of a gene fragment is not recognized.
(3) A method for determining whether or not an eel is a Japanese eel, wherein the eel mitochondrial DNA is used as a template and the first to 1178th nucleotide sequences of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 are consecutive. In the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides, or the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides among the first to 1178th base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, one or several bases Complementation of a base sequence consisting of 15 to 40 consecutive nucleotides with the 5 'end of any of the 1192 to 1194th bases of the sense primer consisting of a base sequence having substitution and the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 In the sequence or the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, any one of the 1192 to 1194th bases is the 5 ′ end, and a continuous 1 A step of performing a gene amplification reaction using an antisense primer comprising a base sequence having one or several base substitutions in a complementary sequence of a base sequence comprising -40 nucleotides, and amplification of a gene fragment by the gene amplification reaction A eel is determined to be a Japanese eel, and a gene fragment amplification is not determined to determine that the eel is not a Japanese eel.
(4) Of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, any one of the 1193rd to 1195th bases is the 3 ′ end, and the base sequence is composed of continuous 15-40 nucleotides, or the base set forth in SEQ ID NO: 2. A sense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in a base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides with any base from 1193 to 1195th as the 3 ′ end in the sequence; Among the 1211th to 1704th base sequences of the base sequence described in No. 2, the complementary sequence of the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, or the 1211st to 1704th positions of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 Among the base sequences, a salt having one or several base substitutions in the complementary sequence of the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides And a antisense primer consisting of SEQ, whether determination kit eel is Japanese eel.
(5) Among the 1st to 1178th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides or the 1st to 1178th positions of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 Among the base sequences of 15 to 40 nucleotides, a sense primer comprising a base sequence having one or several base substitutions, and 1192 to 1194 of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Any one of the first bases is the 5 ′ end, and the complementary sequence of the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, or any one of the 1192th to 1194th bases of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 It consists of a base sequence having one or several base substitutions in a complementary sequence of a base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides that is continuous at the 5 ′ end. Comprising an antisense primer, and whether the determination kit eel is Japanese eel.
(6) In the base sequence described in SEQ ID NO: 2, the nucleotide sequence consists of 15 to 40 nucleotides continuous in a region sandwiched between the sense primer and the antisense primer, or a nucleotide complementary to the nucleotide. The kit according to (4) or (5), further comprising a probe having a fluorescent substance on one of the 3 ′ ends and a quenching substance on the other.
本発明によれば、ウナギがニホンウナギであるか否かを高い精度で容易に判定することができる。 According to the present invention, it can be easily determined with high accuracy whether or not an eel is a Japanese eel.
［ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法］
（第１実施形態）
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第１実施形態は、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を決定する工程と、決定した前記塩基配列のうち、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域の塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性を算出する工程と、前記配列同一性が９５％以上であった場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、前記配列同一性が９５％未満であった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法である。
[How to determine whether an eel is a Japanese eel]
(First embodiment)
A first embodiment of a method for determining whether an eel is a Japanese eel is a method for determining whether a target eel is a Japanese eel, and determining the nucleotide sequence of the eel mitochondrial 16S rRNA. Among the determined base sequence, a step of calculating sequence identity between the base sequence of the region corresponding to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and the base sequence described in SEQ ID NO: 1, and the sequence Determining that the eel is a Japanese eel if the identity is 95% or more, and determining that the eel is not a Japanese eel if the sequence identity is less than 95%. It is.
発明者らは、ニホンウナギ、ルソンウナギ、オオウナギ及びバイカラウナギの多数（ｎ＝２００〜３００）の個体について、ミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の塩基配列を同定し比較することにより、種間変異及び種内変異の存在を明らかにした。これらの塩基配列データに基づき、ニホンウナギの種内変異の存在に関わらず、ニホンウナギとそれ以外のウナギを特異的に判別することが可能な塩基配列領域を見出し、本発明を完成させた。 By identifying and comparing the base sequence of mitochondrial 16S ribosomal RNA (16S rRNA) for a large number (n = 200-300) of Japanese eel, Luzon eel, Eel eel and Baikaluna eel, the inventors have identified interspecies variation and species. The existence of internal mutation was clarified. Based on these base sequence data, the present inventors have completed the present invention by finding a base sequence region capable of specifically discriminating Japanese eels and other eels regardless of the presence of intra-specific variation in Japanese eels.
配列番号１に、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列のうち、発明者らが特定した領域の塩基配列を示す。発明者らは、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの配列番号１に対応する領域には、種内変異を考慮しても最大１つの塩基変異しか存在しないことを明らかにした。 SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of the region specified by the inventors of the Japanese eel mitochondrial 16S rRNA. The inventors have clarified that there is only a maximum of one base mutation in the region corresponding to SEQ ID NO: 1 of Japanese eel mitochondrial 16S rRNA even when intra-species variation is considered.
一方、例えばルソンウナギの場合この領域には最低でも５つの変異が存在する。また、オオウナギの場合この領域には最低でも７つの変異が存在する。また、バイカラウナギの場合この領域には最低でも４つの変異が存在する。 On the other hand, for example, in the case of Luzon eel, there are at least 5 mutations in this region. In the case of a eel, there are at least seven mutations in this region. In addition, in the case of Baikaraunagi, there are at least four mutations in this region.
したがって、対象のウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を同定し、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域の塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性を算出することにより、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定することができる。 Therefore, the base sequence of the target eel mitochondrial 16S rRNA is identified, and the sequence identity between the base sequence of the region corresponding to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is calculated. Thus, it can be determined whether or not the target eel is a Japanese eel.
ここで、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の塩基数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
配列同一性（％）＝一致した塩基数／対象塩基配列の総塩基数×１００ （１）
Here, the sequence identity of the target base sequence with respect to the reference base sequence can be determined, for example, as follows. First, the reference base sequence and the target base sequence are aligned. Here, each base sequence may include a gap so as to maximize the sequence identity. Subsequently, in the reference base sequence and the target base sequence, the number of bases of the matched bases is calculated, and the sequence identity can be obtained according to the following formula (1).
Sequence identity (%) = number of matched bases / total number of bases of target base sequence × 100 (1)
上述したように、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの場合、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域には、最大でも１つの変異しか存在しない。また、配列番号１の総塩基数は９２塩基である。このため、対象のウナギがニホンウナギである場合には、下記式（２）に示すように、少なくとも９８．９％の配列同一性がある。
９１／９２×１００＝９８．９１％ （２）
As described above, in the case of Japanese eel mitochondrial 16S rRNA, there is at most one mutation in the region corresponding to the base sequence described in SEQ ID NO: 1. The total number of bases of SEQ ID NO: 1 is 92 bases. Therefore, when the target eel is a Japanese eel, there is at least 98.9% sequence identity as shown in the following formula (2).
91/92 × 100 = 98.91% (2)
したがって、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性が９５％以上であった場合には、対象のウナギはニホンウナギであると判定し、配列同一性が９５％未満であった場合に対象のウナギはニホンウナギでないと判定することができる。 Therefore, when the sequence identity with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 is 95% or more, it is determined that the target eel is a Japanese eel, and the sequence identity is less than 95%. It can be determined that the target eel is not a Japanese eel.
対象のウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を同定するためには、まず、ウナギのミトコンドリアＤＮＡを調製して試料とする。試料は、ミトコンドリアＤＮＡを含んでいればよく、ウナギのゲノムＤＮＡを試料として使用してもよい。あるいは、ウナギのミトコンドリアＤＮＡを抽出して試料として用いてもよい。あるいは、ウナギの全ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写して試料として用いてもよい。これらの試料の調製には、市販のキット等を使用することができる。 In order to identify the base sequence of the target eel mitochondrial 16S rRNA, eel mitochondrial DNA is first prepared and used as a sample. The sample only needs to contain mitochondrial DNA, and eel genomic DNA may be used as the sample. Alternatively, eel mitochondrial DNA may be extracted and used as a sample. Alternatively, eel total RNA may be extracted, reverse transcribed into cDNA using reverse transcriptase, and used as a sample. A commercially available kit or the like can be used for the preparation of these samples.
試料の調製は、生体のウナギの組織から行ってもよい。あるいは、加熱・調理されたウナギの組織から試料を調製することもできる。あるいは、ウナギが入っていた容器内に存在する糞や、ウナギから剥がれた組織等から試料を調製してもよい。 The sample may be prepared from a living eel tissue. Alternatively, a sample can be prepared from a heated and cooked eel tissue. Alternatively, the sample may be prepared from feces present in the container in which the eel was contained, tissue removed from the eel, or the like.
続いて、調整した試料を鋳型として、ミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を同定する。例えば、一般的な魚類のミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅することができる、配列番号３に記載のセンスプライマー及び配列番号４に記載のアンチセンスプライマーを用いた遺伝子増幅により、ミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、常法により塩基配列を決定してもよい。 Subsequently, the base sequence of mitochondrial 16S rRNA is identified using the prepared sample as a template. For example, a mitochondrial 16S rRNA gene is amplified by gene amplification using a sense primer set forth in SEQ ID NO: 3 and an antisense primer set forth in SEQ ID NO: 4, which can amplify mitochondrial 16S rRNA of a general fish, The base sequence may be determined by a conventional method.
（第２Ａ実施形態）
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ａ実施形態は、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法である。
(Second Embodiment A)
The second embodiment of the method for determining whether an eel is a Japanese eel is a method for determining whether the target eel is a Japanese eel, using the mitochondrial DNA of the eel as a template and SEQ ID NO: Among the base sequences described in 2, the base sequence consisting of any one of the 1193rd to 1195th bases at the 3 ′ end and consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 A sense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in a base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides with any base from 1193 to 1195 as the 3 ′ end, and the sequence number 2 Of the 1211th to 1704th base sequences of the base sequence, a complementary sequence of 15 to 40 nucleotide base sequences, or a sequence Antisense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in the complementary sequence of the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides among the 1211-1704th base sequences of the base sequence of No. 2 And a step of performing a gene amplification reaction using, and when amplification of a gene fragment is recognized by the gene amplification reaction, the eel is determined to be a Japanese eel, and when amplification of the gene fragment is not observed Determining that the eel is not a Japanese eel.
上述したように、発明者らは、複数の種のウナギの多数の個体について、ミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を同定した。配列番号２に、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を示す。なお、配列番号１に記載の塩基配列は、配列番号２に記載の塩基配列の第１１６９〜１２６０番目の塩基配列に対応する。 As described above, the inventors identified the base sequence of mitochondrial 16S rRNA for many individuals of multiple species of eel. SEQ ID NO: 2 shows the base sequence of Japanese eel mitochondrial 16S rRNA. The base sequence described in SEQ ID NO: 1 corresponds to the 1169th to 1260th base sequence of the base sequence described in SEQ ID NO: 2.
発明者らは、配列番号２に記載の塩基配列において、第１１９３〜１１９４番目の「Ｇ（グアニン）Ｔ（チミン）」の塩基配列が、ニホンウナギに特有のものであることを明らかにした。したがって、対象のウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型とし、配列番号２の第１１９３〜１１９５番目のいずれかの領域を３’末端とするセンスプライマーを用いた遺伝子増幅を行うことにより、遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定することができる。なお、配列番号２の第１１９５番目の塩基を３’末端とするセンスプライマーを上記判定に用いることができるのは、遺伝子増幅においてはセンスプライマーの３’末端がアニーリングすることが特に重要であるためである。 The inventors clarified that the base sequence of the 1193rd to 1194th “G (guanine) T (thymine)” in the base sequence described in SEQ ID NO: 2 is unique to the Japanese eel. Therefore, amplification of the gene fragment was confirmed by performing gene amplification using the primordial eel mitochondrial DNA as a template and a sense primer having any one of the 1193 to 1195th regions of SEQ ID NO: 2 as the 3 ′ end. If the eel is determined to be a Japanese eel, it can be determined that the eel is not a Japanese eel. It should be noted that the sense primer having the 1195th base of SEQ ID NO: 2 as the 3 ′ end can be used for the above determination, because the 3 ′ end of the sense primer is particularly important in gene amplification. It is.
第２Ａ実施形態の判定方法は、センスプライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡにアニーリングすることができるか否かによって、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法である。 The determination method of the second embodiment is a method for determining whether or not the target eel is a Japanese eel depending on whether or not the 3 'end of the sense primer can be annealed to the template DNA.
本明細書において、センスプライマー及びアンチセンスプライマーの塩基配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することができれば配列番号２に記載の塩基配列と完全に一致している必要はなく、配列番号２に記載の塩基配列に対して変異を有していてもよい。ここで、変異としては置換変異が挙げられる。 In the present specification, the base sequences of the sense primer and the antisense primer do not need to completely match the base sequence described in SEQ ID NO: 2 as long as the 16S rRNA gene can be amplified. You may have a variation | mutation with respect to a base sequence. Here, a substitution mutation is mentioned as a variation | mutation.
すなわち、センスプライマーは、配列番号２に記載の塩基配列の第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列からなるものであってもよいし、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるものであってもよい。 That is, the sense primer may have a base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides with any of the 1193 to 1195th bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 as the 3 ′ end. Of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2, any one of the 1193rd to 1195th bases is the 3 ′ end, and the base sequence comprises 15 to 40 nucleotides and has one or several base substitutions It may consist of an array.
同様に、アンチセンスプライマーは、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列からなるものであってもよいし、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるものであってもよい。 Similarly, the antisense primer may be composed of a complementary sequence of a base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides among the 1211st to 1704th base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2. Among the 1211 to 1704th nucleotide sequences of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, consisting of a nucleotide sequence having one or several nucleotide substitutions in a complementary sequence of nucleotide sequences consisting of consecutive 15 to 40 nucleotides It may be.
本明細書において、１若しくは数個とは、１〜５個であってもよく、１〜４個であってもよく、１〜３個であってもよく、１〜２個であってもよい。また、プライマーの３’末端から２塩基には塩基置換が存在しないことが好ましい。 In this specification, 1 or several may be 1-5, may be 1-4, may be 1-3, may be 1-2. Good. Further, it is preferable that no base substitution is present at 2 bases from the 3 'end of the primer.
プライマーの長さは、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅することができれば特に制限されないが、１５〜４０塩基であり、１５〜３５塩基であってもよく、１５〜３０塩基であってもよく、１５〜２５塩基であってもよい。 The length of the primer is not particularly limited as long as the 16S rRNA gene can be amplified, but is 15 to 40 bases, 15 to 35 bases, 15 to 30 bases, or 15 to 25 bases. It may be a base.
遺伝子増幅反応による遺伝子断片の増幅の検出は、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により、増幅された遺伝子断片を観察することにより行ってもよい。あるいは、ＳＹＢＲグリーン等のインターカレーター色素の存在下で遺伝子増幅反応を行い、インターカレーター色素の蛍光を検出する、リアルタイムＰＣＲ法により行ってもよい。 Detection of amplification of a gene fragment by gene amplification reaction may be performed by observing the amplified gene fragment by, for example, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, or the like. Alternatively, it may be performed by a real-time PCR method in which a gene amplification reaction is performed in the presence of an intercalator dye such as SYBR Green, and the fluorescence of the intercalator dye is detected.
（第２Ｂ実施形態）
ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ｂ実施形態は、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であって、前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、を備える方法である。
(Second Embodiment)
The 2B embodiment of the method for determining whether or not the eel is a Japanese eel is a method for determining whether or not the target eel is a Japanese eel, using the mitochondrial DNA of the eel as a template and SEQ ID NO: Among the 1st to 1178th base sequences of the base sequence described in 2, the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, or the 1st to 1178th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 , A sense primer comprising a base sequence having one or several base substitutions in a base sequence comprising 15 to 40 nucleotides, and any one of the 1192 to 1194th positions among the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 Of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, or the complementary sequence of the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides with the base at the 5 ′ end, An antisense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in a complementary sequence of a base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides and having any base from 1192 to 1194 as the 5 ′ end, The step of performing the gene amplification reaction used, and when the amplification of the gene fragment is recognized by the gene amplification reaction, the eel is determined to be a Japanese eel, and when the amplification of the gene fragment is not observed, the eel Determining that it is not a Japanese eel.
第２Ｂ実施形態の判定方法は、アンチセンスプライマーの３’末端が鋳型ＤＮＡにアニーリングすることができるか否かによって、対象のウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法であり、その他の点は第２Ａ実施形態の判定方法と同様である。 The determination method of the second embodiment is a method for determining whether or not the target eel is a Japanese eel depending on whether or not the 3 ′ end of the antisense primer can be annealed to the template DNA. The point is the same as the determination method of the 2A embodiment.
［ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット］
（第１Ａ実施形態）
対象のウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キットの第１Ａ実施形態は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を備えるものである。
[Kit for judging whether eels are Japanese eels]
(1A embodiment)
The 1A embodiment of the kit for determining whether or not the target eel is a Japanese eel is one in which any one of the 1193rd to 1195th bases in the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is the 3 ′ end, and In the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides, or the base sequence consisting of consecutive 15 to 40 nucleotides with any of the 1193rd to 1195th bases as the 3 'end of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 Complementation of a base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides continuous among a sense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions and the 1211-1704th base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 From the 15th to 40th consecutive nucleotides in the 1211th to 1704th base sequences of the sequence or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 In the complementary sequence of that nucleotide sequence, but comprising an antisense primer consisting of 1 or a nucleotide sequence having several base substitutions, the.
第１Ａ実施形態のキットにおいて、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ａ実施形態におけるものと同様である。本実施形態の判定用キットを用いることにより、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ａ実施形態を実施することができる。 In the kit of the 1A embodiment, the sense primer and the antisense primer are the same as those in the 2A embodiment of the method for determining whether the eel is a Japanese eel as described above. By using the determination kit of this embodiment, the above-described 2A embodiment of the method for determining whether an eel is a Japanese eel can be implemented.
（第１Ｂ実施形態）
対象のウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キットの第１Ｂ実施形態は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、を備えるものである。
(1B embodiment)
The 1B embodiment of the kit for determining whether or not the target eel is a Japanese eel is composed of 15 to 40 nucleotides continuous from the 1st to 1178th nucleotide sequences of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2. Of the base sequence or the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides in the first to 1178th base sequences of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2, the base sequence has one or several base substitutions Of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and the sense primer, the complementary sequence of the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides with any of the 1192 to 1194th bases as the 5 ′ end, or SEQ ID NO: 2 The base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides having any one of the 1192 to 1194th bases as the 5 ′ end among the base sequences described in. In complementary sequence, but comprising an antisense primer consisting of 1 or a nucleotide sequence having several base substitutions, the.
第１Ｂ実施形態のキットにおいて、センスプライマー及びアンチセンスプライマーは、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ｂ実施形態におけるものと同様である。本実施形態の判定用キットを用いることにより、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ｂ実施形態を実施することができる。 In the kit of the 1B embodiment, the sense primer and the antisense primer are the same as those in the 2B embodiment of the method for determining whether or not the eel is a Japanese eel as described above. By using the determination kit of the present embodiment, the above-described second embodiment of the method for determining whether or not the eel is a Japanese eel can be implemented.
（第２実施形態）
対象のウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キットの第２実施形態は、上述した第１Ａ実施形態のキット又は第２Ａ実施形態のキットが、プローブを更に備えるものである。
(Second Embodiment)
In the second embodiment of the kit for determining whether or not the target eel is a Japanese eel, the kit of the first A embodiment or the kit of the second A embodiment described above further includes a probe.
プローブとしては、上述した第１Ａ実施形態のキット又は第２Ａ実施形態のキットの、センスプライマーとアンチセンスプライマーとに挟まれる配列番号２の塩基配列上の領域内の、連続する１５〜４０ヌクレオチド又は前記ヌクレオチドに相補的なヌクレオチドからなり、５’末端又は３’末端の一方に蛍光物質を有し、他方に消光物質を有するものが挙げられる。 As the probe, continuous 15 to 40 nucleotides in the region on the base sequence of SEQ ID NO: 2 sandwiched between the sense primer and the antisense primer of the kit of the first embodiment or the kit of the second embodiment, or Examples include those consisting of nucleotides complementary to the nucleotides, having a fluorescent substance at one of the 5 ′ end and the 3 ′ end and a quenching substance at the other.
プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いることもできる。使用可能な蛍光物質としては、ＦＡＭ、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＶＩＣ（登録商標）等が挙げられる。また、使用可能な消光物質としては、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等が挙げられる。 A TaqMan (registered trademark) probe can also be used as the probe. Examples of the fluorescent material that can be used include FAM, Yakima Yellow (registered trademark), fluorescein, fluorescein isothiocyanate (FITC), VIC (registered trademark), and the like. Further, examples of the quenching substance that can be used include carboxytetramethylrhodamine (TAMRA).
上記のプローブの存在下で遺伝子増幅反応を行うと、プローブが増幅対象のＤＮＡ断片にアニーリングする。そして、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが分解される。その結果、プローブ分子上で近接して存在していた消光物質と蛍光物質が離れ、蛍光物質が蛍光を発するようになる。この蛍光を定量することにより、遺伝子増幅反応の進行を定量的に測定することができる。 When the gene amplification reaction is performed in the presence of the above probe, the probe anneals to the DNA fragment to be amplified. Then, the probe is degraded by the 5 ′ → 3 ′ exonuclease activity of the DNA polymerase. As a result, the quenching substance and the fluorescent substance that existed close to each other on the probe molecule are separated, and the fluorescent substance emits fluorescence. By quantifying the fluorescence, the progress of the gene amplification reaction can be quantitatively measured.
本実施形態のキットにおけるプローブの長さは、センスプライマー及びアンチセンスプライマーよりも先に鋳型ＤＮＡにアニーリングすることができれば（センスプライマー及びアンチセンスプライマーよりも融解温度（Ｔｍ）が高ければ）特に制限されず、例えば１５〜４０塩基であってもよく、１５〜３５塩基であってもよく、１５〜３０塩基であってもよく、１５〜２５塩基であってもよい。 The length of the probe in the kit of this embodiment is particularly limited if it can be annealed to the template DNA prior to the sense primer and the antisense primer (if the melting temperature (Tm) is higher than that of the sense primer and the antisense primer). For example, it may be 15 to 40 bases, 15 to 35 bases, 15 to 30 bases, or 15 to 25 bases.
本実施形態のキットを用いることにより、上述した、ウナギがニホンウナギであるか否かを判定する方法の第２Ａ実施形態又は第２Ｂ実施形態をリアルタイムＰＣＲ法により実施することができる。 By using the kit of this embodiment, the above-described second A embodiment or second B embodiment of the method for determining whether or not the eel is a Japanese eel can be performed by the real-time PCR method.
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Next, although an Example is shown and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to a following example.
［実験例１］
（ニホンウナギの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の検討）
ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、便宜的和名：ルソンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓ）、オオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｍａｒｍｏｒａｔａ）、ヨーロッパウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ａｎｇｕｉｌｌａ）、アメリカウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｒｏｓｔｒａｔａ）、便宜的和名：インド洋型バイカラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｂｉｃｏｌｏｒ ｂｉｃｏｌｏｒ）、便宜的和名：太平洋型バイカラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｂｉｃｏｌｏｒ ｐａｃｉｆｉｃａ）、便宜的和名：東方オーストラリアウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、便宜的和名：西方オーストラリアウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ａｕｓｔｒａｌｉｓ ｓｃｈｍｉｄｔｉ）、便宜的和名：東方ベンガレンシスウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、便宜的和名：西方ベンガレンシスウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ ｌａｂｉａｔａ）、便宜的和名：セレベスウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｃｅｌｅｂｅｓｅｎｓｉｓ）、便宜的和名：ディフェンバッキウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈｉｉ）、便宜的和名：インテリオリスウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｉｎｔｅｒｉｏｒｉｓ）、便宜的和名：メガストマウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｍｅｇａｓｔｏｍａ）、便宜的和名：モザンビークウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｍｏｓｓａｍｂｉｃａ）、便宜的和名：レインハルディウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、便宜的和名：ボルネオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｂｏｒｎｅｅｎｓｉｓ）、便宜的和名：オブスキュラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｏｂｓｃｕｒａ）について、ミトコンドリア１６ＳリボソームＲＮＡ（１６Ｓ ｒＲＮＡ）の塩基配列を比較した。特に、ニホンウナギ（ｎ＝４０８）、オオウナギ（ｎ＝４８７）、ルソンウナギ（ｎ＝２０７）、インド洋型バイカラウナギ（ｎ＝２１５）、太平洋型バイカラウナギ（ｎ＝４３０）、ヨーロッパウナギ（ｎ＝８７）、アメリカウナギ（ｎ＝５０）については、多数の個体の塩基配列を同定して比較した。図１は、各種のウナギの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列をアラインメントした結果を示す図である。
[Experimental Example 1]
(Examination of the base sequence of 16S rRNA of Japanese eel)
Japanese eel (Anguilla anguilla), Japanese eel (Anguilla anguilla), American eel (Anguilla anguilla), American eel (Anguilla anguilla) bicolor), convenient Japanese name: Pacific-style Baikaluna eel (Anguilla bicolor Pacifica), convenient Japanese name: Eastern Australian eel (Anguilla australis australis), convenient Japanese name: Western Australian eel (Anguilla laus) Touhou Bengalenshi Japanese eel (Anguilla bengalensis bengalensis), convenient Japanese name: West Bengalensis labia, convenient Japanese name: cerebens eel Japanese name: Intelligent eel (Anguilla interioris), convenient Japanese name: Megastuma eel (Anguilla megagastoma), convenient Japanese name: Mozambique mossambica, convenient Japanese name: reinhard unagi Japanese name: Borneo eel (Anguilla b) rneensis), conveniently Common names: For obscura eel (Anguilla obscura), was compared the nucleotide sequences of the mitochondrial 16S ribosomal RNA (16S rRNA). In particular, Japanese eel (n = 408), Eel eel (n = 487), Ruson eel (n = 207), Indian Ocean type bay eel (n = 215), Pacific type bay eel (n = 430), European eel (n = 87) For the American eel (n = 50), the base sequences of a large number of individuals were identified and compared. FIG. 1 is a diagram showing the results of alignment of 16S rRNA base sequences of various eels.
その結果、ニホンウナギに特有の塩基配列を有する領域が明らかとなった。また、各種のウナギには種内変異が存在することが明らかとなった。 As a result, a region having a base sequence peculiar to the Japanese eel was clarified. In addition, it has been clarified that intra-species variation exists in various eels.
図２は、ニホンウナギの種内変異を示す図である。多数の個体のミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を同定した結果、図２中、ＪＡＰ−ＨＴ０１〜ＪＡＰ−ＨＴ１３と示す１３種類の種内変異を同定することができた。 FIG. 2 is a diagram showing intraspecific variation of Japanese eel. As a result of identifying the base sequences of mitochondrial 16S rRNA of a large number of individuals, 13 types of intra-species mutations indicated as JAP-HT01 to JAP-HT13 in FIG. 2 could be identified.
また、図３は、ルソンウナギの種内変異を示す図である。多数の個体のミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を同定した結果、図３中、ＬＵＺ−ＨＴ０１〜ＬＵＺ−ＨＴ０５と示す５種類の種内変異を同定することができた。 Moreover, FIG. 3 is a figure which shows the intraspecific variation | mutation of a Luzon eel. As a result of identifying the base sequences of mitochondrial 16S rRNA of a large number of individuals, it was possible to identify five types of intraspecific mutations indicated as LUZ-HT01 to LUZ-HT05 in FIG.
［実験例２］
（特異的検出用プライマーを用いたニホンウナギの判定）
各種のウナギのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行い、ニホンウナギであるか否かの判定を行った。
[Experiment 2]
(Determination of Japanese eels using specific detection primers)
A PCR reaction was carried out using genomic DNA of various eels as a template to determine whether or not it was a Japanese eel.
具体的には、まず、ウナギの尾部周辺の組織（約２ｍｍ角）を摘出し、アルカリ溶液中で溶解した後に中和して、ゲノムＤＮＡを調製し試料とした。ウナギとしては、ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヨーロッパウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ａｎｇｕｉｌｌａ）、太平洋型バイカラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｂｉｃｏｌｏｒ ｐａｃｉｆｉｃａ）、ルソンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓ）及びオオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｍａｒｍｏｒａｔａ）を用いた。ウナギは、各種について数検体ずつ用いた。 Specifically, first, a tissue (about 2 mm square) around the tail of an eel was extracted, dissolved in an alkaline solution and neutralized, and genomic DNA was prepared and used as a sample. As eels, Japanese eels (Anguilla japonica), European eels (Anguilla anguilla), Pacific bay eels (Anguilla bicolor Pacifica), Luzon eels (Anguilla luzonensis) and Anguilla lunaris (Anguilla luzonensis) and eel eels (Anguilla luzonensis) Several samples of eel were used for each type.
続いて、各試料を鋳型として、一般的な魚類のミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡを増幅することができるセンスプライマー（配列番号３）及びアンチセンスプライマー（配列番号４）を用いたＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により解析した。 Subsequently, using each sample as a template, a PCR reaction was performed using a sense primer (SEQ ID NO: 3) and an antisense primer (SEQ ID NO: 4) that can amplify mitochondrial 16S rRNA of a general fish. Was analyzed by agarose gel electrophoresis.
図４（ａ）は、アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。図４中、「＋」は陽性対照を表し、「Ｎ」は陰性対照を表す。陽性対照としては以前に遺伝子増幅が見られることが確認されたニホンウナギのゲノムＤＮＡを用いた。また、陰性対照としては蒸留水を用いた。その結果、全てのウナギ試料について遺伝子増幅が認められ、ミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの存在が確認された。 FIG. 4 (a) is a photograph showing the results of agarose gel electrophoresis. In FIG. 4, “+” represents a positive control and “N” represents a negative control. As a positive control, Japanese eel genomic DNA, which was previously confirmed to have gene amplification, was used. Moreover, distilled water was used as a negative control. As a result, gene amplification was observed for all eel samples, and the presence of mitochondrial 16S rRNA was confirmed.
続いて、各試料を鋳型として、ニホンウナギの特異的検出用プライマーを用いたＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ増幅産物をアガロースゲル電気泳動により解析した。プライマーとしては、ニホンウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡを特異的に増幅することができるセンスプライマー（配列番号５）及びアンチセンスプライマー（配列番号６）を用いた。 Subsequently, a PCR reaction was performed using each sample as a template and primers for specific detection of Japanese eel, and the PCR amplification products were analyzed by agarose gel electrophoresis. As primers, a sense primer (SEQ ID NO: 5) and an antisense primer (SEQ ID NO: 6) capable of specifically amplifying Japanese eel mitochondrial 16S rRNA were used.
図４（ｂ）は、アガロースゲル電気泳動の結果を示す写真である。その結果、ニホンウナギ特異的に遺伝子増幅が認められた。この結果は、特異的検出用プライマーを用いた遺伝子増幅反応により、ニホンウナギを特異的に検出できることを示す。 FIG. 4B is a photograph showing the results of agarose gel electrophoresis. As a result, gene amplification was observed specifically for Japanese eel. This result shows that Japanese eel can be specifically detected by gene amplification reaction using a specific detection primer.
［実験例３］
（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたニホンウナギの判定）
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ反応を行い、ニホンウナギであるか否かの判定を行った。
[Experiment 3]
(Determination of Japanese eel using TaqMan (registered trademark) probe)
A real-time PCR reaction using a TaqMan (registered trademark) probe was performed to determine whether or not it was a Japanese eel.
まず、実験例２と同様にして、ニホンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、ヨーロッパウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ａｎｇｕｉｌｌａ）、太平洋型バイカラウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｂｉｃｏｌｏｒ ｐａｃｉｆｉｃａ）、ルソンウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｌｕｚｏｎｅｎｓｉｓ）及びオオウナギ（Ａｎｇｕｉｌｌａ ｍａｒｍｏｒａｔａ）のゲノムＤＮＡを調製し試料とした。 First, in the same manner as in Experimental Example 2, Japanese eels (Anguilla japonica), European eels (Anguilla anguilla), Pacific bay eels (Anguilla bicolor Pacifica), Ruson eels (Anguilla luzonen genome) A sample was used.
続いて、各試料を鋳型として、センスプライマー（配列番号５）、アンチセンスプライマー（配列番号６）及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号７）を用いたリアルタイムＰＣＲ反応を行った。なお、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（配列番号７）は２７ｍｅｒであり、Ｔｍ値は６３．５℃であった。また、センスプライマー（配列番号５）及びアンチセンスプライマー（配列番号６）のＴｍ値は、それぞれ５４．４℃及び５６．１℃であった。 Subsequently, using each sample as a template, a real-time PCR reaction using a sense primer (SEQ ID NO: 5), an antisense primer (SEQ ID NO: 6) and a TaqMan (registered trademark) probe (SEQ ID NO: 7) was performed. The TaqMan (registered trademark) probe (SEQ ID NO: 7) was 27mer, and the Tm value was 63.5 ° C. Further, the Tm values of the sense primer (SEQ ID NO: 5) and the antisense primer (SEQ ID NO: 6) were 54.4 ° C. and 56.1 ° C., respectively.
リアルタイムＰＣＲ反応の反応液（２０μＬ）の組成は、１０μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（ＡＢＩ社）、９００ｎＭセンスプライマー、９００ｎＭアンチセンスプライマー、２００ｎＭ ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、３μＬの鋳型ＤＮＡ（１０ｎｇ／μＬ）とした。また、リアルタイムＰＣＲ反応は、５０℃２分間、９５℃１０分間の処理後、９５℃１０秒間と６０℃６０秒間の反応を５０回繰り返すことにより行った。反応及び解析にはリアルタイムＰＣＲ装置（型式「ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７３００」、ＡＢＩ社）を用いた。 The composition of the reaction solution (20 μL) of the real-time PCR reaction is 10 μL of TaqMan® universal PCR master mix (ABI), 900 nM sense primer, 900 nM antisense primer, 200 nM TaqMan® probe, 3 μL of template DNA. (10 ng / μL). The real-time PCR reaction was performed by repeating the reaction at 95 ° C. for 10 seconds and 60 ° C. for 60 seconds 50 times after treatment at 50 ° C. for 2 minutes and 95 ° C. for 10 minutes. For the reaction and analysis, a real-time PCR apparatus (type “ABI PRISM 7300”, ABI) was used.
その結果、ニホンウナギのゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合には、Ｃｔ値が３０弱であったのに対し、その他の種のゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合には、Ｃｔ値が４０以上であったか又はシグナルが確認されなかった。 As a result, when Japanese eel genomic DNA was used as a template, the Ct value was a little less than 30, whereas when other species of genomic DNA were used as templates, the Ct value was 40 or more. There was no signal.
この結果は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ反応により、ニホンウナギを特異的に検出できることを示す。 This result shows that Japanese eel can be specifically detected by real-time PCR reaction using TaqMan (registered trademark) probe.
本発明によれば、ウナギがニホンウナギであるか否かを高い精度で容易に判定することができる。 According to the present invention, it can be easily determined with high accuracy whether or not an eel is a Japanese eel.
Claims (6)
前記ウナギのミトコンドリア１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を決定する工程と、
決定した前記塩基配列のうち、配列番号１に記載の塩基配列に対応する領域の塩基配列と、配列番号１に記載の塩基配列との配列同一性を算出する工程と、
前記配列同一性が９５％以上であった場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、前記配列同一性が９５％未満であった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、
を備える方法。 A method for determining whether an eel is a Japanese eel,
Determining the base sequence of the eel mitochondrial 16S rRNA;
Of the determined base sequences, calculating the sequence identity between the base sequence of the region corresponding to the base sequence described in SEQ ID NO: 1 and the base sequence described in SEQ ID NO: 1,
Determining that the eel is a Japanese eel if the sequence identity is 95% or more, and determining that the eel is not a Japanese eel if the sequence identity is less than 95%;
A method comprising:
前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、
配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９３〜１１９５番目のいずれかの塩基を３’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、
配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、
を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、
前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、
を備える方法。 A method for determining whether an eel is a Japanese eel,
Using the eel mitochondrial DNA as a template,
Of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, any one of the 1193rd to 1195th bases is the 3 ′ end, and the base sequence is composed of continuous 15-40 nucleotides, or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 A sense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides, with any base from 1193 to 1195 as the 3 ′ end,
Of the 1211th to 1704th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, the complementary sequence of the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides in sequence, or the 1211st to 1704th positions of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 An antisense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in a complementary sequence of the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides of
Performing a gene amplification reaction using
Determining that the eel is a Japanese eel when amplification of the gene fragment is observed by the gene amplification reaction, and determining that the eel is not a Japanese eel when amplification of the gene fragment is not recognized;
A method comprising:
前記ウナギのミトコンドリアＤＮＡを鋳型として、
配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１〜１１７８番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるセンスプライマーと、
配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、
を用いた遺伝子増幅反応を行う工程と、
前記遺伝子増幅反応により遺伝子断片の増幅が認められた場合に前記ウナギはニホンウナギであると判定し、遺伝子断片の増幅が認められなかった場合に前記ウナギはニホンウナギでないと判定する工程と、
を備える方法。 A method for determining whether an eel is a Japanese eel,
Using the eel mitochondrial DNA as a template,
Among the 1st to 1178th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, or the 1st to 1178th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 Among them, in a base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, a sense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions;
Of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, any one of the 1192 to 1194th bases is the 5 ′ end, and the complementary sequence of the nucleotide sequence consisting of consecutive 15 to 40 nucleotides, or the nucleotide set forth in SEQ ID NO: 2 An antisense consisting of a base sequence having one or several base substitutions in a complementary sequence of a base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides in sequence, with any base from 1192 to 1194 as the 5 'end. A primer,
Performing a gene amplification reaction using
Determining that the eel is a Japanese eel when amplification of the gene fragment is observed by the gene amplification reaction, and determining that the eel is not a Japanese eel when amplification of the gene fragment is not recognized;
A method comprising:
配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列の第１２１１〜１７０４番目の塩基配列のうち、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、
を備える、ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット。 Of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, any one of the 1193rd to 1195th bases is the 3 ′ end, and the base sequence is composed of continuous 15-40 nucleotides, or the base sequence described in SEQ ID NO: 2 A sense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides, with any base from 1193 to 1195 as the 3 ′ end,
Of the 1211th to 1704th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, the complementary sequence of the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides in sequence, or the 1211st to 1704th positions of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 An antisense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions in a complementary sequence of the base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides of
A kit for determining whether or not an eel is a Japanese eel.
配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列、又は、配列番号２に記載の塩基配列のうち、第１１９２〜１１９４番目のいずれかの塩基を５’末端とし、連続する１５〜４０ヌクレオチドからなる塩基配列の相補配列において、１若しくは数個の塩基置換を有する塩基配列からなるアンチセンスプライマーと、
を備える、ウナギがニホンウナギであるか否かの判定用キット。 Among the 1st to 1178th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2, the base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, or the 1st to 1178th base sequences of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 Among them, in a base sequence consisting of continuous 15 to 40 nucleotides, a sense primer consisting of a base sequence having one or several base substitutions;
Of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2, any one of the 1192 to 1194th bases is the 5 ′ end, and the complementary sequence of the nucleotide sequence consisting of consecutive 15 to 40 nucleotides, or the nucleotide set forth in SEQ ID NO: 2 An antisense consisting of a base sequence having one or several base substitutions in a complementary sequence of a base sequence consisting of 15 to 40 nucleotides in sequence, with any base from 1192 to 1194 as the 5 'end. A primer,
A kit for determining whether or not an eel is a Japanese eel.
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