JP2017088522A - Gene repair activation action exhibiting hesperetin derivative and method for producing the same - Google Patents
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Abstract
Description
この発明は遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体及びその製造方法に関するものである。 The present invention relates to a hesperetin derivative exhibiting an activation effect of gene repair and a method for producing the same.
細胞の老化とともに遺伝子の損傷の発生頻度が増加する。もともと細胞には遺伝子修復の機能が備わっているものの、遺伝子の損傷の速度がさらに増加するため、遺伝子の修復が追いつかずに損傷が蓄積する。 The frequency of genetic damage increases with cellular aging. Although cells originally have a function of gene repair, the rate of gene damage is further increased, so that gene repair cannot catch up and damage accumulates.
この結果として蛋白質の合成が減少する。細胞内の蛋白質が多くの生命維持のために消耗すると細胞自体が次第に損傷を受け、死滅し、変異して機能が低下する。体の各器官において、多くの細胞がそのような状態に達すると、器官自体の能力を弱め、そして、次第に病気の症状となって現れるようになる。遺伝子修復の働きには、数種類が認められている。たとえば、ＤＮＡポリメラーゼとリガーゼの組み合わせによる修復機能がある。また、活性酸素による塩基の障害に対してはＯＧＧ１、つまり、８ヒドロキシル−２−デオキシグアノシン（８ＯＨｄＧと略される）の修復酵素である８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼである。 This results in a decrease in protein synthesis. When proteins in a cell are consumed for many life-supporting purposes, the cell itself is gradually damaged, killed, mutated and reduced in function. In many organs of the body, when many cells reach such a state, the ability of the organ itself weakens and gradually becomes manifest as a symptom of the disease. Several types of gene repair work are recognized. For example, there is a repair function by a combination of DNA polymerase and ligase. Further, OGG1, that is, 8-oxoguanine DNA glycosylase, which is a repair enzyme of 8-hydroxyl-2-deoxyguanosine (abbreviated as 8OHdG), is used for base damage caused by active oxygen.
さらに、ＤＮＡポリメラーゼ３を介したＳＯＳ修復機能も存在し、いろいろな障害に対する修復機能が存在している。これらの遺伝子修復機能を活性化することは加齢や化学物質による遺伝子の障害を修復し、疾患を遺伝子から回復させることから好ましい。この遺伝子修復機能を活性化する研究が行われている。 Furthermore, there is also an SOS repair function via DNA polymerase 3, and there are repair functions for various disorders. Activating these gene repair functions is preferable because it repairs a disorder of a gene caused by aging or a chemical substance and recovers the disease from the gene. Research has been conducted to activate this gene repair function.
遺伝子修復機能を活性化させる発明としては、たとえば、標的ＤＮＡのインビボ除去による遺伝子修復があるものの、細胞レベルでの治療であり生体には応用が限られる（例えば、特許文献１参照。）。また、ＤＮＡの標的改変の発明ではベクターによる遺伝子の調整が記載されている（例えば、特許文献２参照。）。 As an invention for activating the gene repair function, for example, although there is gene repair by in vivo removal of target DNA, it is a treatment at the cellular level and its application to living bodies is limited (for example, see Patent Document 1). In addition, in the invention of DNA target modification, gene preparation by a vector is described (for example, see Patent Document 2).
既存の物質による遺伝子修復の活性化作用は軽度であり、産業上への利用が限定されるという課題があり、また、化学合成された物質では安全性に問題があり、利用が限られている。 The activation effect of gene repair by existing substances is mild, and there is a problem that its use in industry is limited, and there is a problem in safety with chemically synthesized substances, and its use is limited .
そこで、副作用が弱く優れた遺伝子修復の活性化作用を呈する天然物及びそれを効率良く製造する製造方法が望まれている。 Therefore, a natural product exhibiting an excellent gene repair activating effect with weak side effects and a production method for efficiently producing the natural product are desired.
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は下記の式（１）で示される遺伝子修復の活性化作用を有するヘスペレチン誘導体に関するものである。 In order to achieve the above object, the invention described in claim 1 relates to a hesperetin derivative having an activating action of gene repair represented by the following formula (1).
上記の目的を達成するために、請求項２に記載の発明は遺伝子修復の活性化作用を有するヘスペレチン誘導体の製造方法に関するものである。 In order to achieve the above object, the invention described in claim 2 relates to a method for producing a hesperetin derivative having an activation action for gene repair.
この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。 Since this invention is comprised as mentioned above, there exist the following effects.
請求項１に記載のヘスペレチン誘導体は遺伝子修復の活性化作用に優れている。 The hesperetin derivative according to claim 1 is excellent in the activation effect of gene repair.
請求項２に記載の製造方法によれば、効率良く遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体を製造することが可能である。 According to the production method of claim 2, it is possible to efficiently produce a hesperetin derivative that exhibits an activation effect of gene repair.
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。 Hereinafter, embodiments embodying the present invention will be described in detail.
遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体とは、下記の式（１）で示される構造からなるものである。 The hesperetin derivative exhibiting an activation action for gene repair has a structure represented by the following formula (1).
前記の式（１）のように遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体はヘスペレチンの１分子及びフェルラ酸の２分子から構成されている。これらの分子及びその結合はすべて自然界に存在する天然型であり、各分子間はエーテル結合を介して結合している。 As shown in the above formula (1), the hesperetin derivative exhibiting the gene repair activating action is composed of one molecule of hesperetin and two molecules of ferulic acid. These molecules and their bonds are all naturally occurring in nature, and each molecule is bonded via an ether bond.
このヘスペレチン誘導体はヘスペレチン及びフェルラ酸を原料として化学合成により得ることができる。しかし、その化学的な合成では原料の損失が多く、製造コストが高くなるため、産業への利用は限定される。化学合成された純度の高いヘスペレチン誘導体は分析の標準品や微量な試供品を得るために用いられる。 This hesperetin derivative can be obtained by chemical synthesis using hesperetin and ferulic acid as raw materials. However, in the chemical synthesis, the loss of raw materials is large, and the production cost is high, so that the industrial use is limited. Chemically synthesized hesperetin derivatives with high purity are used to obtain analytical standards and trace samples.
このヘスペレチン誘導体の構造を解析することは有効成分の特定ができる点から好ましい。また、製品や製剤に利用して販売する際の有効成分の含有量の指標として利用できることから好ましい。 It is preferable to analyze the structure of this hesperetin derivative from the viewpoint that an active ingredient can be specified. Further, it is preferable because it can be used as an index of the content of an active ingredient when it is used and sold in products and preparations.
このヘスペレチン誘導体の構造解析の一例として化学合成された高純度（純度９５％以上）の標準品を用いて重水素化ジメチルスルホキシド中の９０ＭＨｚのＨ−ＮＭＲにより解析した場合、ピークの位置は２．９９２、３．１４３、３．９３９、４．１５５、４．２１６、４．２４８、５．６０３、６．８３０、６．９９６、７．１２５、７．２１０、７．２４６、７．５６８、７．７２５、７．７３６、８．１４３、９．０７４、１０．０１０及び１３．２７４ｐｐｍに認められる。 As an example of the structural analysis of this hesperetin derivative, when a chemically synthesized standard product of high purity (purity of 95% or more) was used for analysis by 90 MHz H-NMR in deuterated dimethyl sulfoxide, the peak position was 2. 992, 3.143, 3.939, 4.155, 4.216, 4.248, 5.603, 6.830, 6.996, 7.125, 7.210, 7.246, 7.568, 7.725, 7.736, 8.143, 9.074, 10.010 and 13.274 ppm.
さらに、このヘスペレチン誘導体は高速液体クロマトグラフィーや質量分析装置で解析され、その構造が同定される。 Further, this hesperetin derivative is analyzed by high performance liquid chromatography or a mass spectrometer, and its structure is identified.
この構成成分であるヘスペレチンは天然に存在している化合物である。ヘスペレチンの化学式はＣ１６Ｈ１４Ｏ６であり、分子量は３０２．３である。 This component, hesperetin, is a naturally occurring compound. The chemical formula of hesperetin is C16H14O6 and the molecular weight is 302.3.
もともと、このヘスペレチンはフラバノンの一種であり、抗炎症作用、抗腫瘍作用、脂肪燃焼作用、神経保護作用に働きを呈するものの、吸収、体内動態や薬力学的に十分ではなかった。そこで、より吸収が良く、効果の強い誘導体が望まれていた。 Originally, hesperetin is a kind of flavanone, and although it has anti-inflammatory action, anti-tumor action, fat burning action, and neuroprotective action, it was not sufficient in absorption, pharmacokinetics and pharmacodynamics. Therefore, a derivative having better absorption and stronger effect has been desired.
このヘスペレチン誘導体ではヘスペレチンはベンゼン環の２つ水酸基で２分子のフェルラ酸のメソキシ基とそれぞれエーテル結合を形成している。すなわち、ヘスペリチンのベンゼン環の４位及び５位である。脱メチルによるエーテル結合である。 In this hesperetin derivative, hesperetin forms an ether bond with the two methoxy groups of ferulic acid at the two hydroxyl groups of the benzene ring. That is, they are the 4th and 5th positions of the benzene ring of hesperitin. Ether bond by demethylation.
このヘスペレチンとフェルラ酸の結合によりこのヘスペレチン誘導体は安定的に、かつ、吸収率と反応性が高くなる。つまり、ベンゼン環による疎水性とフェルラ酸の水酸基による水溶性が加わり、両親媒性を呈することにより吸収が高まる。ヘスペリチン単体と比較して約３倍に増加する。さらに、ヘスペリチンの複素環の５位と７位のフリーの水酸基の反応性が高まることは好ましい。 This combination of hesperetin and ferulic acid makes this hesperetin derivative stable and has high absorption and reactivity. That is, the hydrophobicity due to the benzene ring and the water solubility due to the hydroxyl group of ferulic acid are added, and the absorption is enhanced by exhibiting amphipathic properties. Increased about 3 times compared to hesperitin alone. Furthermore, it is preferable that the reactivity of the 5-position and 7-position free hydroxyl groups of the hesperitin heterocycle is increased.
もう一つの構成成分であるフェルラ酸は化学式Ｃ１０Ｈ１０Ｏ４で天然に存在する桂皮酸の一種である。このフェルラ酸は植物や動物に保持され、フェニルアラニンなどから生合成される。 Ferulic acid, which is another constituent, is a kind of cinnamic acid that naturally exists in the chemical formula C10H10O4. This ferulic acid is retained in plants and animals and biosynthesized from phenylalanine and the like.
フェルラ酸はもともとシナモンなどの植物の葉や果実から採取される成分であり、抗酸化作用が強いことから防腐剤、抗菌剤、抗アレルギー剤として利用されており、その安全性は確認されている。 Ferulic acid is a component originally collected from leaves and fruits of plants such as cinnamon, and because of its strong antioxidant effect, it is used as an antiseptic, antibacterial agent and antiallergic agent, and its safety has been confirmed. .
このヘスペレチン誘導体ではフェルラ酸部分は抗酸化作用の他に、ＤＮＡの分子を加齢、酸化、活性酸素や紫外線から防御して遺伝子を保護する働きがある。遺伝子の安定化に寄与している。また、ラジカルスカベンジャー作用を呈してラジカルを消去する。 In this hesperetin derivative, the ferulic acid moiety has a function of protecting the gene by protecting the DNA molecule from aging, oxidation, active oxygen and ultraviolet rays in addition to the antioxidant action. Contributes to gene stabilization. It also exhibits radical scavenger action and eliminates radicals.
さらに、フェルラ酸のカルボン酸部分は弱酸性に荷電していることから、耐酸性が強く、経口摂取された場合に、胃酸に対して抵抗性を示し、吸収率が高まることは、好ましい。また、弱酸性であるため、皮膚に塗布した場合、皮膚に対して刺激性がないことは好ましい。 Furthermore, since the carboxylic acid portion of ferulic acid is weakly charged, it is preferable that the acid resistance is strong, and when taken orally, it exhibits resistance to gastric acid and increases the absorption rate. Moreover, since it is weakly acidic, when applied to the skin, it is preferable that it is not irritating to the skin.
このヘスペレチン誘導体は両親媒性であることにより、細胞内に浸透しやすく、また、核膜内に到達しやすく、遺伝子に直接作用することは好ましい。 Since this hesperetin derivative is amphipathic, it easily penetrates into cells and easily reaches the nuclear membrane, and preferably acts directly on the gene.
ミトコンドリアの内膜でヘスペレチン部分は疎水性的に核膜に浸透して遺伝子修復酵素を活性化する。標的になる遺伝子修復酵素はＤＮＡポリメラーゼ及び８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼまたは８−ヒドロキシルデオキシグアニンＤＮＡグリコシターゼ（いずれもＯＧＧ１と略す）が主体である。 In the mitochondrial inner membrane, the hesperetin portion hydrophobically penetrates the nuclear membrane and activates the gene repair enzyme. The target gene repair enzymes are mainly DNA polymerase and 8-oxoguanine DNA glycosylase or 8-hydroxyl deoxyguanine DNA glycosidase (all abbreviated as OGG1).
ＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子の修復はＳＯＳ修復といわれ、塩基の変化や付加体に働き、ＤＮＡ鎖の切断と複製を行う工程からなる。このＤＮＡポリメラーゼによる修復は１日に１万回以上行われている。 Gene repair by DNA polymerase is referred to as SOS repair, and it consists of a process of cleaving and replicating DNA strands by acting on base changes and adducts. This DNA polymerase repair is performed 10,000 times or more per day.
ＯＧＧ１による遺伝子修復は８ＯＨｄＧのような塩基の酸化体の排除と正常な塩基の組み込みを行う工程である。このヘスペレチン誘導体はこれらの遺伝子修復酵素の活性化を行うこと及び遺伝子を酸化物質や活性酸素から防御する働きにより遺伝子修復を活性化させる。遺伝子修復酵素の活性化には酵素活性の活性化と酵素のｍＲＮＡ転写レベルでの活性化の両方による。 Gene repair by OGG1 is a process for eliminating oxidized bases such as 8OHdG and incorporating normal bases. This hesperetin derivative activates these gene repair enzymes and activates gene repair by protecting the gene from oxidizing substances and active oxygen. Activation of gene repair enzymes depends on both activation of the enzyme activity and activation of the enzyme at the mRNA transcription level.
このヘスペレチン誘導体による遺伝子修復の活性化は核内に遺伝子が存在するすべての細胞に働く。 Activation of gene repair by this hesperetin derivative works on all cells in which the gene is present in the nucleus.
遺伝子の障害の方法も活性酸素、フリーラジカル、紫外線、化学物質、医薬品の副作用、金属、加齢などすべての物質による障害に対応する。 The methods for genetic damage also deal with damage caused by all substances such as active oxygen, free radicals, ultraviolet rays, chemical substances, pharmaceutical side effects, metals, and aging.
また、このヘスペレチン誘導体は脂溶性と水溶性の両方の性質を呈することから動物の細胞膜及び植物や酵母の細胞壁を通過し、細胞内に吸収されやすい。 Moreover, since this hesperetin derivative exhibits both fat-soluble and water-soluble properties, it passes through the cell membrane of animals and the cell walls of plants and yeasts and is easily absorbed into cells.
さらに、皮膚の角質細胞膜も通過しやすく、角質層のバリア機能を維持することは肌の件健康や美容の点から好ましい。また、このヘスペレチン誘導体は細胞膜を通過し、皮膚細胞内で遺伝子修復を活性化して細胞の再生や機能を促進することから好ましい。 Furthermore, it is preferable from the viewpoint of skin health and beauty to maintain the barrier function of the stratum corneum because the keratinocyte membrane of the skin easily passes through. This hesperetin derivative is preferable because it passes through the cell membrane and activates gene repair in skin cells to promote cell regeneration and function.
植物に対してはこのヘスペレチン誘導体が植物の細胞壁と細胞膜を通過して植物細胞内に入り、遺伝子修復を促進し、花の開花や結実、果実の成長を促進して植物の寿命を延長することは好ましい。すなわち、植物活性化剤としての働きがある。 For plants, this hesperetin derivative passes through plant cell walls and cell membranes and enters plant cells, promotes gene repair, promotes flowering and fruiting, and fruit growth to extend plant life. Is preferred. That is, it functions as a plant activator.
また、このヘスペレチン誘導体は両親媒性であり、水溶性の化粧水と油性のクリームのいずれにも配合できる点は好ましい。 Moreover, this hesperetin derivative is amphiphilic, and it is preferable that it can be blended in both water-soluble lotion and oily cream.
このヘスペレチン誘導体は遺伝子の修復に働き、細胞の増殖、正常なコラーゲンやエラスチン産生を促進することにより皮膚細胞機能を促進することは好ましい。 It is preferable that this hesperetin derivative works for gene repair and promotes skin cell function by promoting cell growth, normal collagen and elastin production.
神経細胞においても細胞内の遺伝子修復を活性化する。神経細胞は認知症、アルツハイマー症などで活性酸素やアミロイドβたんぱく質による遺伝子の障害を受けやすく、遺伝子は修復されにくいという弱点がある。そのため、このヘスペレチン誘導体による遺伝子修復の活性化は神経の働きを回復させることは神経疾患の防御と回復の目的で好ましい。 It also activates intracellular gene repair in nerve cells. Nerve cells suffer from dementia, Alzheimer's disease, etc., and are susceptible to gene damage due to active oxygen and amyloid β protein, and genes are not easily repaired. Therefore, activation of gene repair by this hesperetin derivative preferably restores the function of nerves for the purpose of protection and recovery of neurological diseases.
また、神経終末からの神経伝達物質の放出を促進して神経伝達を高めることは好ましい。 It is also preferred to enhance neurotransmission by promoting the release of neurotransmitters from nerve endings.
運動神経細胞の神経末端からのアセチルコリンの放出を高めることにより筋肉の収縮を高めて神経と筋肉の活動性を増すことは好ましい。 It is preferred to increase nerve and muscle activity by increasing muscle contraction by increasing the release of acetylcholine from nerve endings of motor neurons.
また、このヘスペレチン誘導体は皮膚細胞の遺伝子修復を高めてコラーゲンやエラスチンの産生を高めることは好ましい。化粧料としての利用が高まることから好ましい。 Further, it is preferable that this hesperetin derivative enhances gene repair of skin cells and enhances production of collagen and elastin. It is preferable because use as a cosmetic is increased.
このヘスペレチン誘導体は心筋梗塞においては冠状動脈の梗塞や虚血状態でも心筋細胞の遺伝子修復を活性化して心臓の活動を活性化して強心作用を発揮することは好ましい。 In the case of myocardial infarction, it is preferable that this hesperetin derivative activate cardiomyocyte gene repair by activating cardiomyocyte gene repair even in coronary artery infarction or ischemia, and exert a cardiotonic effect.
特に、梗塞部位の血管においてはこのヘスペレチン誘導体は血管新生を促進し、血流の改善し、血圧を低下させる。 In particular, in the blood vessel at the infarct site, this hesperetin derivative promotes angiogenesis, improves blood flow, and lowers blood pressure.
また、このヘスペレチン誘導体はアスリートや運動時、筋肉を増強したい場合、筋肉細胞での脂肪の輸送を促進して遺伝子レベルでのエネルギー産生を活性化することから好ましい。 Further, this hesperetin derivative is preferable because it promotes fat transport in muscle cells and activates energy production at the gene level when it is desired to strengthen muscles during athletes or exercise.
このヘスペレチン誘導体は生体内では腎臓や肝臓のエステラーゼにより分解され、尿中に排泄される。分解されて構成成分である安全性の高いヘスペレチン及びフェルラ酸に分解される。したがって、このヘスペレチン誘導体は体内に蓄積されることはなく、分解も生体内酵素で行われ、分解物も天然物であることから安全性が高い。 This hesperetin derivative is degraded in vivo by kidney and liver esterases and excreted in urine. It is decomposed into highly safe hesperetin and ferulic acid as constituents. Therefore, this hesperetin derivative is not accumulated in the body, is decomposed by an in vivo enzyme, and is highly safe because the decomposed product is a natural product.
さらに、ヘスペレチン部分には植物の生育を促進する植物活性化作用があることからこのヘスペレチン誘導体にも植物の生育を促進できる点は産業上の利用の点から好ましい。 Furthermore, since the hesperetin moiety has a plant activating action for promoting the growth of plants, the point that this hesperetin derivative can also promote the growth of plants is preferable from the viewpoint of industrial use.
また、植物が細菌やウイルスに感染した場合、遺伝子が障害を受ける場合がある。このような遺伝子の障害に対して遺伝子修復を活性化することは好ましい。 In addition, when a plant is infected with bacteria or viruses, the gene may be damaged. It is preferable to activate gene repair for such genetic disorders.
このヘスペレチン誘導体は天然にも存在しており、キンカンやマルキンカンなどのかんきつ類や植物にも極微量認められる。 This hesperetin derivative also exists in nature, and is found in trace amounts in citrus and plants such as kumquat and mulkinkan.
このヘスペレチン誘導体を精製により上記の植物から抽出することは可能である。ただし、精製には大量の原料を必要とし、有機溶媒などを利用することから産業上への利用は制限される。 This hesperetin derivative can be extracted from the above plant by purification. However, refining requires a large amount of raw materials and uses organic solvents, which limits the industrial use.
このヘスペレチン誘導体はキンカンの果実を発酵法などにより増加させることは好ましい。発酵法としては大豆と混合して納豆菌やベニコウジ菌により発酵させて得る。用いる菌体は食用に利用できるものであるため、安全性が高い。 This hesperetin derivative preferably increases kumquat fruit by fermentation or the like. As a fermentation method, it is obtained by mixing with soybeans and fermenting with Bacillus natto or Bacillus subtilis. Since the microbial cells to be used can be used for food, they are highly safe.
この製造方法は食経験があり、ヘスペレチン誘導体の産生量も多いことから好ましい。 This production method is preferred because it has dietary experience and the amount of hesperetin derivative produced is large.
得られたヘスペレチン誘導体を医薬品素材として利用する場合、目的とするヘスペレチン誘導体を精製することは、目的とするヘスペレチン誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。 When the obtained hesperetin derivative is used as a pharmaceutical material, it is preferable to purify the target hesperetin derivative because the purity of the target hesperetin derivative is increased and impurities can be removed.
医薬品としては注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。 Used as pharmaceuticals as parenterals such as injections, oral preparations or coatings, and quasi-drugs used in tablets, capsules, drinks, soaps, coatings, gels, toothpastes, etc. The
経口剤としては錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤はシェラックまたは砂糖などで被覆することもできる。 Examples of oral preparations include tablets, capsules, powders, syrups, and drinks. When mixed with the above-mentioned tablets and capsules, it can be used together with a binder, excipient, swelling agent, lubricant, sweetener, flavoring agent and the like. The tablets can be coated with shellac or sugar.
また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を添加することができる。 Moreover, in the case of the said capsule, liquid carriers, such as fats and oils, can be further contained in said material. In the case of the above syrup and drink, sweeteners, preservatives, pigment flavoring agents and the like can be added.
非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。 Examples of parenteral preparations include injections in addition to external preparations such as ointments, creams, and liquids. Vaseline, paraffin, fats and oils, lanolin, macro gold, etc. are used as a base material for external preparations, and can be made into ointments, creams, and the like by ordinary methods.
注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。 Injections include liquids, and other lyophilization agents. This is used aseptically dissolved in distilled water for injection or physiological saline at the time of use.
食品製剤としては遺伝子修復を活性化するため、エナジードリンクや強壮性の食品に利用される。神経活動を促進することから神経細胞の遺伝子の障害を介した神経のリハビリ用食品や学習時の食事などに利用される。また、美容食品にも利用される。保健機能食品として栄養機能食品や特定保健用食品に利用することは好ましい。 As a food preparation, it is used for energy drinks and tonic foods to activate gene repair. Because it promotes neural activity, it is used for food for nerve rehabilitation through a disorder of a neuronal gene or a meal for learning. It is also used for beauty foods. It is preferable to use it as a health functional food for a nutritional functional food or a food for specified health use.
得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットや家畜動物に利用する場合、筋肉の遺伝子の障害の回復、老化の抑制と運動能力の向上を目的とした飼料やペット用サプリメントとして利用される。 When the obtained food preparation is used for pets and livestock animals such as dogs and cats, it is used as a feed or a supplement for pets for the purpose of recovering a muscular gene disorder, suppressing aging and improving exercise ability.
化粧料として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。 As a cosmetic, it can be used together with a surfactant, a solvent, a thickener, an excipient and the like according to a conventional method. For example, it can be in the form of cream, gel for hair, facial cleanser, cosmetic liquid, lotion and the like.
化粧料の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。 The form of the cosmetic is arbitrary, and can be used as a solution, cream, paste, gel, gel, solid or powder.
ここで製造された化粧料は皮膚の障害された遺伝子の修復やコラーゲンやエラスチンなどの増加及び肌の健康維持の目的で利用される。 The cosmetics produced here are used for the purpose of repairing damaged genes in the skin, increasing collagen and elastin and maintaining the health of the skin.
また、このヘスペレチン誘導体は遺伝子が障害された歯肉細胞の機能の維持を目的とした歯磨き剤、洗口液や歯磨きペーストなどに利用できる。 In addition, this hesperetin derivative can be used for toothpastes, mouthwashes, toothpastes, and the like for the purpose of maintaining the function of gingival cells whose genes are impaired.
また、植物に対しては遺伝子の障害を回復させることにより果実の結実と収穫量の増加を目的とした植物活性化剤として利用することができる。 In addition, it can be used as a plant activator for the purpose of fruit set and increase in yield by recovering genetic damage to plants.
この植物活性化剤は希少な蘭やマツバランなどの花の栽培促進の目的で利用でき、果実や野菜、穀類の栽培を安定化させる。植物工場における野菜や果実の栽培にも利用でき、栽培効率を上げることができる。 This plant activator can be used for the purpose of promoting the cultivation of flowers such as rare orchids and pine baluns, and stabilizes the cultivation of fruits, vegetables and cereals. It can also be used for cultivation of vegetables and fruits in plant factories, thus increasing cultivation efficiency.
次に、キンカンの果実、大豆粉末と納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液を紅麹本舗製のベニコウジ菌で発酵する工程からなる遺伝子修復の活性化作用を呈するヘスペレチン誘導体の製造方法について説明する。 Next, hesperetin derivatives exhibiting the activity of gene repair consisting of the process of fermenting fermented liquor with fermented kumquat fruit, soybean powder and natto natto bacteria fermented with Benikouji bacterium from red rice honpo A manufacturing method will be described.
ここでいうヘスペレチン誘導体とはヘスペレチンの１分子及びフェルラ酸の２分子から構成されている。これらの結合はすべて天然型であり、物質の間はエーテル結合を介して結合している。 The hesperetin derivative here is composed of one molecule of hesperetin and two molecules of ferulic acid. These bonds are all natural types, and the substances are bonded through ether bonds.
このヘスペレチン誘導体のヘスペレチン及びフェルラ酸は天然に存在し、食経験も豊富であり、安全性が認められていることから好ましい。 The hesperetin derivatives hesperetin and ferulic acid are preferable because they exist in nature, have abundant food experience, and are recognized as safe.
この誘導体は皮膚、神経、骨、筋肉、肝臓や腎臓などにも働き、障害された遺伝子を修復させることにより、身体機能を回復させる。 This derivative also works on skin, nerves, bones, muscles, liver, kidneys, etc., and restores body functions by repairing damaged genes.
この製造方法とはキンカンの果実、大豆粉末と納豆本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵液を紅麹本舗製のベニコウジ菌で発酵する工程からなる。 This production method comprises a step of fermenting fermented liquor fermented by adding kumquat fruit, soybean powder and natto honto natto bacteria with Benikouji bacterium from red rice honpo.
原料となる物質はキンカンの果実、大豆粉末、納豆本舗製の納豆菌及び紅麹本舗製のベニコウジ菌である。 The raw materials are kumquat fruit, soybean powder, natto bacterium from Natto Honpo and Benikouji fungus from Benito Honpo.
ここでいうキンカン学名Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａは金柑であり、ミカン科キンカン属 の常緑低木の総称である。別名はマルミキンカン、マルキンカンである。果実は果皮ごと食され、果皮のついたまま甘く煮て、砂糖漬け、蜂蜜漬け、甘露煮にもされ、食経験が豊富である。また、民間薬として咳や、のどの痛みに効果がある。 The kumquat scientific name Fortunella japonica here is a gold citrus and is a general term for evergreen shrubs belonging to the genus Kumquat. Another name is Marumikkankan, Marukinkan. The fruits are eaten together with the peels, boiled sweetly with the peels, candied, honeyed, and boiled in sweet dew. It is also effective as a folk medicine for cough and sore throat.
使用するのはキンカンの果実であり、種子を含有していても良い。果肉と果実の両方を含むことはコスト的に好ましい。 The kumquat fruit to be used may contain seeds. It is preferable in terms of cost to include both pulp and fruit.
キンカンの果実は日本、アメリカ、アジア、その他の国で採取されたいずれのものでも良いが、品質が高く、価格の点から、日本産は品質が良いことから好ましい。 The kumquat fruit may be any of those collected in Japan, the United States, Asia, and other countries, but it is preferable because it is high in quality and has good quality in terms of price.
キンカンの果実は乾燥され、粉末化されることが好ましく、発酵の前にオートクレーブ滅菌されることは発酵をスムーズに行うることから好ましい。 The kumquat fruit is preferably dried and pulverized, and sterilization by autoclave before fermentation is preferable because fermentation can be performed smoothly.
３マイクロメーター以下の粒子サイズの粉末が発酵の工程を実施しやすくすることから好ましい。 A powder having a particle size of 3 micrometers or less is preferable because it facilitates the fermentation process.
原料となる大豆粉末は、日本産、中国産、アメリカ産、ロシア産などいずれの産地の大豆でも利用できるが、トレーサビリティーが確実であり、生産者が明確である日本産が好ましい。 The soybean powder used as a raw material can be used in soybeans of any origin such as Japanese, Chinese, American, and Russian, but is preferably Japanese because of its reliable traceability and clear producers.
このうち、有機栽培や無農薬で栽培された大豆は有害な農薬や金属を含有しないことから、さらに好ましい。 Of these, soybeans cultivated organically or without agricultural chemicals are more preferred because they do not contain harmful agricultural chemicals or metals.
大豆は使用に際して、株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０、中山技術研究所製ＤＭ−６などの粉砕機で粉砕される。これにより発酵の工程が効率的に進行されやすい。 When using soybeans, Nara Machinery Co., Ltd. free mill, super free mill, sample mill, goblin, super clean mill, micros, small vacuum dryer manufactured by Toyo Riko as vacuum dryer, small size manufactured by Matsui Co., Ltd. It is pulverized by a pulverizer such as a vacuum heat transfer dryer DPTH-40, clean dry VD-7, VD-20 manufactured by AKM Kyushu Technos Co., Ltd., DM-6 manufactured by Nakayama Technical Research Institute. Thereby, the process of fermentation tends to advance efficiently.
さらに、キンカンの果実と大豆は粉砕後、オートクレーブなどにより滅菌されることは雑菌の繁殖を防御できることから好ましい。 Further, it is preferable to sterilize kumquat fruits and soybeans by autoclaving after pulverization because they can prevent propagation of various bacteria.
用いる納豆本舗製の納豆菌は学名バチルス サブチリスで日本では納豆の製造に汎用され、食経験が豊富で有用な食用菌である。沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。用いる納豆菌は納豆本舗製であり、高い発酵性を呈する。 The natto bacterium produced by Natto Honpo is the scientific name Bacillus subtilis, which is widely used in the production of natto in Japan. Bacteria species from Japan such as Okinawa and Kagoshima, and from Southeast Asia such as China and Taiwan are used. The Bacillus natto used is manufactured by Natto Honpo and exhibits high fermentability.
この納豆菌はキンカンの果実と大豆からなるヘスペレチンとフェルラ酸の結合反応を促進する。 This Bacillus natto promotes the binding reaction of hesperetin and ferulic acid consisting of kumquat fruit and soybean.
前記の発酵に関するそれぞれの添加量はキンカンの果実の乾燥粉末１重量に対し、大豆粉末は０．０１〜６重量及び納豆本舗製の納豆菌は０．００１〜０．０６重量が好ましい。納豆菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。 The amount of each of the above-mentioned fermentations is preferably 0.01 to 6 weights for soybean powder and 0.001 to 0.06 weight for natto bacteria manufactured by Natto Honpo with respect to 1 weight of dry powder of kumquat fruit. It is preferable to pre-cultivate natto bacteria before being fermented, because the initial time of fermentation is shortened and the fermentation time is shortened.
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。 The fermentation is carried out in a clean culture tank, and it is preferable to mix the materials with sterilized tap water.
また、この発酵は４１〜４４℃に加温され、発酵は１日間から１４日間行われる。目的とするヘスペレチン誘導体をＨＰＬＣやＴＬＣにより定量することならびに菌体の増殖性を確認することにより、発酵の工程管理を実施することは産生量が調整されることから好ましい。 Moreover, this fermentation is heated at 41-44 degreeC, and fermentation is performed for 14 days from 1 day. It is preferable to carry out the fermentation process control by quantifying the target hesperetin derivative by HPLC or TLC and confirming the growth of the cells, because the production amount is adjusted.
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。 The fermentation is carried out in a clean culture tank, and it is preferable to mix the materials with sterilized tap water.
この発酵の工程によって生成されるヘスペレチン誘導体はその結合が不安定であり、分解されやすいことから次の紅麹本舗製のベニコウジ菌による発酵を行い、目的とするヘスペレチン誘導体の結合を安定化させる。 Since the binding of the hesperetin derivative produced by this fermentation process is unstable and is easily decomposed, the next fermentation with Benikouji fungus made by Benito Honpo is performed to stabilize the binding of the target hesperetin derivative.
用いる紅麹本舗製のベニコウジ菌は学名Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓの糸状菌であり、古くから日本、中国や台湾において紅酒や豆腐ようなどの発酵食品に利用されている。また、沖縄や鹿児島などの日本産、中国や台湾の東南アジア原産の菌種が用いられる。紅麹本舗製のベニコウジ菌は発酵効率に優れており、また、安全性も高い。 Benikouji fungus made by Benihon Honpo to be used is a filamentous fungus of the scientific name Monascus purpureus and has long been used in fermented foods such as red sake and tofu in Japan, China and Taiwan. In addition, bacterial species from Japan such as Okinawa and Kagoshima, and from Southeast Asia in China and Taiwan are used. Benikouji bacteria manufactured by Kurisu Honpo have excellent fermentation efficiency and high safety.
前記の発酵に関するそれぞれの添加量は前記の発酵物１重量に対してベニコウジ菌は０．０００５〜０．０９重量が好ましい。紅麹本舗製のベニコウジ菌は発酵される前に、前培養することは、発酵の初発時間を短縮し、発酵時間が短縮されることから好ましい。 As for each addition amount regarding the said fermentation, 0.0005-0.09 weight is preferable with respect to 1 weight of said fermented products. It is preferable to pre-cultivate Benikouji fungus made by Kurisu Honpo before fermentation because it shortens the initial time of fermentation and shortens the fermentation time.
前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、滅菌された水道水により前記の材料を混合することは好ましい。 The fermentation is carried out in a clean culture tank, and it is preferable to mix the materials with sterilized tap water.
また、この発酵は４０〜４４℃に加温され、発酵は１日間から２１日間行われる。この発酵の工程によってベニコウジ菌の酸化及び還元作用によりこのヘスペレチン誘導体の構造が安定化される。 Moreover, this fermentation is heated at 40-44 degreeC, and fermentation is performed for 21 days from 1 day. This fermentation process stabilizes the structure of this hesperetin derivative by the oxidation and reduction action of Aspergillus niger.
前記の発酵物は含水エタノールで抽出されることは、生成物を効率良く回収し、菌を滅菌でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。また、得られた発酵物を超音波処理することは、生成物が分離しやすいことから、好ましい。また、凍結乾燥などにより、濃縮することは、以下の工程が短時間に実施できることから好ましい。 It is preferable that the fermented product is extracted with water-containing ethanol because the product can be efficiently recovered, the bacteria can be sterilized, and the next step can be easily performed. Moreover, since the product is easy to isolate | separate, it is preferable to ultrasonically treat the obtained fermented material. Moreover, it is preferable to concentrate by freeze drying or the like because the following steps can be performed in a short time.
前記の還元反応物から、目的とするヘスペレチン誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。 Separating and purifying the target hesperetin derivative from the reduction reaction product is preferable because the intake can be reduced as a highly pure substance. As a purification method, it is preferable to use a purification operation such as a separation resin.
例えば、分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするヘスペレチン誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。 For example, the target hesperetin derivative can be obtained by separation with a separation carrier or resin and fractionation. As the separation carrier or resin, porous polysaccharides, silicon oxide compounds, polyacrylamide, polystyrene, polypropylene, styrene-vinylbenzene copolymers, etc., whose surfaces are coated as described later, are used. Those having a particle size of 0.1 to 300 μm are preferred. The finer the particle size, the higher the accuracy of the separation, but the longer the separation time.
例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。 For example, a reverse phase carrier or resin whose surface is coated with a hydrophobic compound is used for separation of a highly hydrophobic substance. Those coated with a cationic substance are suitable for the separation of anionically charged substances. Also, those coated with an anionic substance are suitable for separating a cationically charged substance. When a specific antibody is coated, it is used as an affinity carrier or resin for separating only a specific substance.
アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。 The affinity carrier or resin is used for specific preparation of an antigen using an antigen-antibody reaction. A partitionable carrier or resin is used for isolation of a substance such as silica gel (manufactured by Merck) if there is a difference in partition coefficient between the substance and the solvent for separation.
これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。 Among these, an adsorbent carrier or resin, a dispersible carrier or resin, a molecular sieve carrier or resin, and an ion exchange carrier or resin are preferable from the viewpoint of reducing production costs. Furthermore, the reverse phase carrier or resin and the dispersible carrier or resin are more preferable because the difference in the distribution coefficient with respect to the separation solvent is large.
分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。 When an organic solvent is used as the separation solvent, a carrier or resin having resistance to the organic solvent is used. Moreover, the carrier or resin used for pharmaceutical manufacture or food manufacture is preferable.
これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。 From these points, Diaion (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) and XAD-2 or XAD-4 (Rohm and Haas) are used as the adsorptive carrier, and Sephadex LH-20 (Amersham Pharmacia) is used as the molecular sieve carrier. Silica gel as the distribution carrier, IRA-410 (Rohm and Haas) as the ion exchange carrier, and DM1020T (Fuji Silysia) as the reverse phase carrier are more preferable.
これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。 Of these, Diaion, Sephadex LH-20 and DM1020T are more preferred.
得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して２〜４０倍量が好ましく、４〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から１０〜３０℃が好ましく、１２〜２５℃がより好ましい。 The obtained extract is dissolved in a solvent for swelling the carrier for separation or the resin before separation. The amount thereof is preferably 2 to 40 times the weight of the extract from the viewpoint of separation efficiency, and more preferably 4 to 20 times the amount. The separation temperature is preferably 10 to 30 ° C., more preferably 12 to 25 ° C. from the viewpoint of the stability of the substance.
分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。 As the separation solvent, water or a lower alcohol containing water, a hydrophilic solvent, or a lipophilic solvent is used. As the lower alcohol, methanol, ethanol, propanol and butanol are used, and ethanol used for food is preferable.
セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。 When Sephadex LH-20 is used, a lower alcohol is preferable as the separation solvent. When silica gel is used, the separation solvent is preferably chloroform, methanol, acetic acid or a mixture thereof.
ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。 When Diaion and DM1020T are used, the separation solvent is preferably a lower alcohol such as methanol or ethanol or a mixed solution of lower alcohol and water.
ヘスペレチン誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするヘスペレチン誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから好ましい。 It is preferable that the fraction containing the hesperetin derivative is collected and the solvent is removed by drying or vacuum drying to obtain the target hesperetin derivative as a powder or a concentrated solution because the influence of the solvent can be excluded.
また、最終抽出を食用油や化粧料に用いる油脂で実施することは、得られるヘスペレチン誘導体が安定に維持されることから好ましい。例えば、大豆油、米ぬか油、グレープシード油、オリーブ油、ホホバ油で抽出することは好ましい。 Moreover, it is preferable to carry out the final extraction with fats and oils used for edible oils and cosmetics because the obtained hesperetin derivative is stably maintained. For example, extraction with soybean oil, rice bran oil, grape seed oil, olive oil or jojoba oil is preferred.
また、このヘスペレチン誘導体を粉末化することは防腐の目的から好ましい。 In addition, it is preferable to powder this hesperetin derivative for the purpose of preserving.
以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。なお、これらは一例であり、素材、原料や検体の違いに応じて常識の範囲内で条件を変更させることが可能である。 Hereinafter, the embodiment will be specifically described with reference to examples and test examples. These are merely examples, and conditions can be changed within the range of common sense according to differences in materials, raw materials, and specimens.
静岡県で栽培されたキンカン（学名Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の果実を静岡県清水市の紅光から購入して用いた。この果実を水道水で水洗後、天日で乾燥させ、粉砕機（株式会社奈良機械製作所製のスーパー自由ミル）にて粉砕し、キンカンの果実の乾燥粉末粉砕物を１．０ｋｇ得た。なお、種皮及び種子も含有していた。 The fruit of kumquat (scientific name Fortunella japonica) cultivated in Shizuoka Prefecture was purchased from Red Light in Shimizu City, Shizuoka Prefecture. The fruit was washed with tap water, dried in the sun, and pulverized with a pulverizer (Super Free Mill manufactured by Nara Machinery Co., Ltd.) to obtain 1.0 kg of a dry powder pulverized product of kumquat fruit. It also contained seed coat and seeds.
また、北海道産の大豆（学名Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）をミキサー（クイジナート製）に供し、大豆の粉砕物１．０ｋｇを得た。前記のキンカンの果実と大豆の粉砕物をオートクレーブ（ＳＤＬ−３２０、トミー製）に供し、１２１℃、２０分間、滅菌した。 In addition, soybeans from Hokkaido (scientific name Glycine max) were supplied to a mixer (manufactured by Kuisinart) to obtain 1.0 kg of soybean pulverized material. The kumquat fruit and soybean ground product were subjected to autoclave (SDL-320, manufactured by Tommy) and sterilized at 121 ° C. for 20 minutes.
これらを清浄な発酵タンク（滅菌された発酵用丸形４０リットルタンク、遠藤科学製）に入れ、滅菌された水道水５ｋｇを添加し、攪拌した。 These were put into a clean fermentation tank (sterilized round 40-liter tank for fermentation, manufactured by Endo Kagaku), and 5 kg of sterilized tap water was added and stirred.
これとは別に、納豆本舗製の粉末納豆菌（学名Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の１０ｇを上記の発酵タンクに供し、滅菌した大豆粉末と前培養させた発酵準備液を用意した。 Separately, 10 g of powdered natto bacteria (scientific name: Bacillus subtilis) manufactured by Natto Honpo was used in the fermentation tank, and a sterilized soybean powder and a pre-cultured fermentation preparation solution were prepared.
前記の前培養した納豆菌の発酵準備液とキンカンの果実の乾燥粉末と大豆とを入れた発酵タンクに添加し、攪拌後、４１〜４３℃の温度範囲で加温し、発酵させた。 It added to the fermentation tank which put the fermented preparation liquid of the said Bacillus natto, the dried powder of the kumquat fruit, and the soybeans after the said pre-culture, and it heated and fermented in the temperature range of 41-43 degreeC after stirring.
発酵過程では通気によりバブリングと攪拌を行いつつ、発酵液のサンプリングを行い、７日間発酵させた。発酵終了後、発酵タンクより発酵物を取り出し、煮沸滅菌した。この発酵物を濾過布により濾過して、納豆菌による発酵液１．２ｋｇを得た。この発酵液１ｋｇに対して紅麹本舗製のベニコウジ菌（学名Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）の１０ｇを添加して４１〜４２℃で７日間発酵させた。 During the fermentation process, the fermentation liquor was sampled while bubbling and stirring by aeration, and fermented for 7 days. After completion of fermentation, the fermented product was taken out from the fermentation tank and sterilized by boiling. This fermented product was filtered with a filter cloth to obtain 1.2 kg of a fermented solution of Bacillus natto. To 1 kg of this fermentation broth, 10 g of Benikouji fungus (scientific name: Monascus purpureus) manufactured by Kurisu Honpo was added and fermented at 41-42 ° C. for 7 days.
この発酵物にエタノールを添加して発酵を停止した。さらに、煮沸滅菌した。これを濾過し、濾過液を目的とするヘスペレチン誘導体とした。これを検体１とした。 The fermentation was stopped by adding ethanol to the fermented product. Furthermore, it was sterilized by boiling. This was filtered to obtain a target hesperetin derivative as a filtrate. This was designated as Sample 1.
さらに、構造解析及び実験の目的で精製物を得た。つまり、前述の検体１のヘスペレチン誘導体の１００ｇに７％エタノール含有精製水の２Ｌを添加し、ダイヤイオン（ＡＭＰ０３型、三菱化学製）５００ｇを７％エタノール液に懸濁して充填したガラス製カラム（遠藤科学製）に供した。 Furthermore, a purified product was obtained for the purpose of structural analysis and experiment. That is, a glass column in which 2 L of 7% ethanol-containing purified water is added to 100 g of the above-described hesperetin derivative of Sample 1 and 500 g of Diaion (AMP03 type, manufactured by Mitsubishi Chemical) is suspended and packed in a 7% ethanol solution ( Made by Endo Kagaku).
これに１０Ｌの７％エタノール液を添加して清浄し、さらに、２５％エタノール液を１Ｌ添加して洗浄した。また、６０％エタノール液を１Ｌ添加して目的とするヘスペレチン誘導体を溶出させ、この溶出液を濃縮して精製した。精製されたヘスペレチン誘導体を減圧蒸留により、エタノール部分を除去し、水溶液とした。これを真空乾燥させ、ヘスペレチン誘導体の精製物５５ｇを得てこれを検体２とした。収率は約５．５％であり、天然物から製造するには十分な収量であり、この製造方法が優れた製法であることが確認された。 To this, 10 L of 7% ethanol solution was added for cleaning, and further 1 L of 25% ethanol solution was added for washing. Further, 1 L of 60% ethanol solution was added to elute the target hesperetin derivative, and the eluate was concentrated and purified. The ethanol portion was removed from the purified hesperetin derivative by distillation under reduced pressure to obtain an aqueous solution. This was vacuum-dried to obtain 55 g of a purified product of hesperetin derivative, which was used as Sample 2. The yield was about 5.5%, which was a sufficient yield for production from natural products, and it was confirmed that this production method was an excellent production method.
以下に、ヘスペレチン誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）
Below, the test method regarding the structural analysis of a hesperetin derivative and a result are demonstrated.
(Test Example 1)
上記のように得られた検体２をエタノールに溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析した。 The specimen 2 obtained as described above was dissolved in ethanol and analyzed by high performance liquid chromatography with a mass spectrometer (HPLC, Shimadzu Corporation).
さらに、これを核磁気共鳴装置（９０ＭＨｚ、Ｈ−ＮＭＲ、ブルカー製）で解析した結果、検体１と検体２からヘスペレチンの１分子とフェルラ酸の２分子からなるヘスペレチン誘導体が検出された。 Furthermore, as a result of analyzing this with a nuclear magnetic resonance apparatus (90 MHz, H-NMR, manufactured by Bruker), a hesperetin derivative consisting of one molecule of hesperetin and two molecules of ferulic acid was detected from sample 1 and sample 2.
すなわち、重水素化ジメチルスルホキシド中のＨ−ＮＭＲ測定の結果、ピークの位置は２．９９２、３．１４３、３．９３９、４．１５５、４．２１６、４．２４８、５．６０３、６．８３０、６．９９６、７．１２５、７．２１０、７．２４６、７．５６８、７．７２５、７．７３６、８．１４３、９．０７４、１０．０１０及び１３．２７４ｐｐｍに認められた。 That is, as a result of H-NMR measurement in deuterated dimethyl sulfoxide, the peak position was 2.992, 3.143, 3.939, 4.155, 4.216, 4.248, 5.603, 6.603. 830, 6.996, 7.125, 7.210, 7.246, 7.568, 7.725, 7.736, 8.143, 9.074, 10.010 and 13.274 ppm.
上記の解析結果から化学的に合成した標準品と同一構造を呈することが判明した。すなわち、検体２からヘスペレチン１分子とフェルラ酸の２分子がエーテル結合した目的とするヘスペレチン誘導体であると確認できた。 From the above analysis results, it was found that it had the same structure as the chemically synthesized standard product. That is, it was confirmed from the specimen 2 that the target hesperetin derivative was obtained by ether-binding one molecule of hesperetin and two molecules of ferulic acid.
以下にヒト皮膚表皮細胞を用いた皮膚作用試験について述べる。なお、この試験方法は生化学的に成分の効果を検証できる再現性のある常法である。
（試験例２）
The skin effect test using human skin epidermal cells is described below. This test method is a reproducible conventional method that can verify the effects of components biochemically.
(Test Example 2)
クラボウより購入したヒト由来表皮細胞（表皮由来、エピーダーセル）を用いた。培養液として５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレ（ＦＡＬＣＯＮ製）に播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。ここに紫外線照射装置（クオークテクノロジー製）により２８０ｎｍの紫外線を１時間照射した。ここに、前記の検体１、検体２及び陽性対照としてＥＧＦ（フナコシ製、表皮成長因子）をいずれも０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養して試験した。 Human-derived epidermis cells (derived from epidermis, epider cells) purchased from Kurabo Industries were used. 1000 cells cultured using 5% fetal calf serum-containing MEM medium (manufactured by Sigma) as a culture solution were seeded in a 35 mm culture dish (manufactured by FALCON), and cultured at 37 ° C. under 5% carbon dioxide gas. This was irradiated with ultraviolet rays of 280 nm for 1 hour by an ultraviolet irradiation device (manufactured by Quark Technology). Here, EGF (manufactured by Funakoshi, epidermal growth factor) as a positive control was added at a final concentration of 0.1 mg / ml. This was cultured for 48 hours and tested.
培養液を採取後、表皮細胞の生存率をトリパンブルー法により計数した。その後、表皮細胞の懸濁液を調製した。ここからｍＲＮＡを核酸抽出キット（フナコシ製）により抽出した。常法に従い、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＤＮＡポリメラーゼ及び８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１と略す）のｍＲＮＡを定量した。同時に、細胞懸濁液中の８−ＯＨｄＧ量をキット（日本老化制御研究所製）にて定量した。８−ＯＨｄＧに特異的なモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡキットである。 After collecting the culture solution, the survival rate of epidermal cells was counted by trypan blue method. Thereafter, a suspension of epidermal cells was prepared. From this mRNA was extracted with a nucleic acid extraction kit (Funakoshi). According to a conventional method, mRNA of DNA polymerase and 8-oxoguanine DNA glycosylase (abbreviated as OGG1) was quantified by RT-PCR. At the same time, the amount of 8-OHdG in the cell suspension was quantified with a kit (manufactured by Japan Aging Control Laboratory). This is an ELISA kit using a monoclonal antibody specific for 8-OHdG.
なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。溶媒を添加した溶媒対照群と比較した。 In addition, the petri dish calculated the average value using five sheets. It compared with the solvent control group which added the solvent.
その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加によりヒト由来表皮細胞数は溶媒対照群に比して平均値として１８９％に増加した。また、検体２では２７４％に増加した。一方、ＥＧＦでは１６６％となった。この結果、検体１及び検体２の方がＥＧＦよりも優れた細胞活性化作用を呈した。 As a result, the addition of 0.1 mg / ml of Specimen 1 increased the number of human-derived epidermal cells to 189% as an average value compared to the solvent control group. In Sample 2, it increased to 274%. On the other hand, EGF was 166%. As a result, Specimen 1 and Specimen 2 exhibited a cell activation effect superior to EGF.
上記の細胞中のＤＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では１２コピー、検体１処理群では２４４コピー、検体２処理群では１４８０コピ−、ＥＧＦ処理群では１２９コピーであった。 The mRNA expression level (copy number) of DNA polymerase in the cells was 12 copies in the solvent control group, 244 copies in the sample 1 treatment group, 1480 copies in the sample 2 treatment group, and 129 copies in the EGF treatment group.
ＤＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で著しく、ＥＧＦより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復酵素の活性化作用を示していた。 The mRNA expression level of DNA polymerase was remarkably higher in Sample 1 and Sample 2, and was superior to EGF. This showed the activation action of the gene repair enzyme by Sample 1 and Sample 2.
上記の細胞中のＯＧＧ１のｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では１８コピー、検体１処理群では３１１コピー、検体２処理群では２０９８コピ−、ＥＧＦ処理群では２２１コピーであった。 The OGG1 mRNA expression level (copy number) in the cells was 18 copies in the solvent control group, 311 copies in the sample 1 treatment group, 2098 copies in the sample 2 treatment group, and 221 copies in the EGF treatment group.
ＯＧＧ１のｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で高く、ＥＧＦより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復酵素の活性化作用を示していた。 The expression level of OGG1 mRNA was high in Sample 1 and Sample 2, and superior to EGF. This showed the activation action of the gene repair enzyme by Sample 1 and Sample 2.
上記の細胞中の８ＯＨｄＧ量は溶媒対照群では５７０ｎｇ、検体１処理群では４３ｎｇ、検体２処理群では２６ｎｇ、ＥＧＦ処理群では４８８ｎｇであった。 The amount of 8OHdG in the cells was 570 ng in the solvent control group, 43 ng in the sample 1 treatment group, 26 ng in the sample 2 treatment group, and 488 ng in the EGF treatment group.
８ＯＨｄＧは遺伝子が活性酸素により修飾された変異した状態であり、遺伝子の障害をあらわしている。検体１及び検体２でこの値が低く、ＥＧＦの働きより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復の活性化作用を示していた。 8OHdG is a mutated state in which a gene is modified with active oxygen, and represents a disorder of the gene. This value was low in Sample 1 and Sample 2, which was superior to the action of EGF. This indicated an activation effect of gene repair by Sample 1 and Sample 2.
一方、安全性試験の一環として人工皮膚であるＥｐｉＳｋｉｎ（ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ社製）を用いた皮膚刺激性実験では、検体１及び検体２の添加により刺激性は認められず、安全性が確認された。なお、この方法は細胞を用いる皮膚刺激性試験評価法として動物を使用しない方法として確立されている。 On the other hand, in a skin irritation experiment using EpiSkin (manufactured by SkinEthic), which is an artificial skin, as part of the safety test, no irritation was observed due to the addition of Sample 1 and Sample 2, and safety was confirmed. This method has been established as a method for evaluating skin irritation using cells without using animals.
以下にヒト神経細胞の障害モデルを用いた障害に対する試験について述べる。なお、この試験方法は生化学的に成分の働きを検証できる再現性のある常法である。
（試験例３）
The following describes tests for damage using a human neuronal cell damage model. This test method is a reproducible conventional method that can verify the action of components biochemically.
(Test Example 3)
コスモバイオから購入したヒト神経細胞（Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｎｓ（ＨＮ））を用いた。培養液として専用の培養液（神経細胞増殖培地）を用いて培養した１０００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。これに１％の神経毒であるアクリルアミド水溶液を添加して神経細胞を刺激した。 Human neurons (Human Neurons (HN)) purchased from Cosmo Bio were used. 1000 cells cultured using a dedicated culture solution (neural cell growth medium) as a culture solution were seeded in a 35 mm culture dish and cultured at 37 ° C. in 5% carbon dioxide gas. Nerve cells were stimulated by adding an aqueous acrylamide solution of 1% neurotoxin.
ここに、前記の実施例１で得られた検体１及び検体２、陽性対照としてＮＧＦ（フナコシ(株)、ヒトタイプ）をいずれも０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。これを４８時間培養した。 Sample 1 and sample 2 obtained in Example 1 above and NGF (Funakoshi Co., Ltd., human type) as a positive control were added at a final concentration of 0.1 mg / ml. This was cultured for 48 hours.
培養終了後、細胞数を顕微鏡的に計数した。さらに、上記と同様の方法により、遺伝子修復の働きを検証した。すなわち、細胞の懸濁液を調製し、ここからｍＲＮＡを核酸抽出キット（フナコシ製）により抽出した。常法に従い、ＲＴ−ＰＣＲ法によりＤＮＡポリメラーゼ及び８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ（ＯＧＧ１と略す）のｍＲＮＡを定量した。同時に、細胞懸濁液中の８−ＯＨｄＧ量をキット（日本老化制御研究所製）にて定量した。８−ＯＨｄＧに特異的なモノクローナル抗体を使用したＥＬＩＳＡキットである。 After completion of the culture, the number of cells was counted microscopically. Furthermore, the function of gene repair was verified by the same method as described above. That is, a cell suspension was prepared, and mRNA was extracted therefrom using a nucleic acid extraction kit (manufactured by Funakoshi). According to a conventional method, mRNA of DNA polymerase and 8-oxoguanine DNA glycosylase (abbreviated as OGG1) was quantified by RT-PCR. At the same time, the amount of 8-OHdG in the cell suspension was quantified with a kit (manufactured by Japan Aging Control Laboratory). This is an ELISA kit using a monoclonal antibody specific for 8-OHdG.
その結果、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加により神経細胞数は溶媒対照群に比して平均値として１６１％に増加した。また、検体２では２２６％に増加した。一方、ＮＧＦでは１３８％となった。この結果、検体１及び検体２の方がＮＧＦよりも優れた細胞活性化作用を呈した。 As a result, the addition of 0.1 mg / ml of Specimen 1 increased the number of neurons to 161% as an average value compared to the solvent control group. In Sample 2, it increased to 226%. On the other hand, NGF was 138%. As a result, Sample 1 and Sample 2 exhibited a cell activation action superior to NGF.
上記の細胞中のＤＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では２０コピー、検体１処理群では２５０コピー、検体２処理群では１５１１コピ−、ＮＧＦ処理群では１２８コピーであった。 The mRNA expression level (copy number) of DNA polymerase in the cells was 20 copies in the solvent control group, 250 copies in the sample 1 treatment group, 1511 copies in the sample 2 treatment group, and 128 copies in the NGF treatment group.
ＤＮＡポリメラーゼのｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で高く、ＮＧＦより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復酵素の活性化作用を示していた。 The mRNA expression level of DNA polymerase was high in Sample 1 and Sample 2, and superior to NGF. This showed the activation action of the gene repair enzyme by Sample 1 and Sample 2.
上記の細胞中のＯＧＧ１のｍＲＮＡ発現量（コピー数）は溶媒対照群では２４コピー、検体１処理群では２３９コピー、検体２処理群では１７７８コピ−、ＮＧＦ処理群では１９１コピーであった。 The OGG1 mRNA expression level (copy number) in the cells was 24 copies in the solvent control group, 239 copies in the sample 1 treatment group, 1778 copies in the sample 2 treatment group, and 191 copies in the NGF treatment group.
ＯＧＧ１のｍＲＮＡ発現量は検体１及び検体２で高く、ＮＧＦより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復酵素の活性化作用を示していた。 The expression level of OGG1 mRNA was high in Sample 1 and Sample 2, and superior to NGF. This showed the activation action of the gene repair enzyme by Sample 1 and Sample 2.
上記の細胞中の８ＯＨｄＧ量は溶媒対照群では２４９ｎｇ、検体１処理群では３１ｎｇ、検体２処理群では１９ｎｇ、ＮＧＦ処理群では１９１ｎｇであった。 The amount of 8OHdG in the cells was 249 ng in the solvent control group, 31 ng in the sample 1 treatment group, 19 ng in the sample 2 treatment group, and 191 ng in the NGF treatment group.
８ＯＨｄＧは遺伝子が活性酸素により修飾された変異した状態であり、遺伝子の障害をあらわしている。検体１及び検体２でこの値が低く、ＮＧＦの働きより優っていた。これは検体１及び検体２による遺伝子修復の活性化作用を示していた。 8OHdG is a mutated state in which a gene is modified with active oxygen, and represents a disorder of the gene. This value was low in Sample 1 and Sample 2, which was superior to the action of NGF. This indicated an activation effect of gene repair by Sample 1 and Sample 2.
本発明で得られるヘスペレチン誘導体は遺伝子修復を活性化させ、皮膚細胞や神経細胞などの細胞機能を増進させる。これにより国民のＱＯＬを改善し、健康な労働人口を増加させ、かつ、医療費を削減できる。 The hesperetin derivative obtained in the present invention activates gene repair and enhances cell functions such as skin cells and nerve cells. This can improve the people's QOL, increase the healthy workforce, and reduce medical costs.
本発明で得られるヘスペレチン誘導体は皮膚の細胞を増加させ、遺伝子修復作用を活性化した。これにより化粧料としてシワやタルミなどの皮膚トラブルに悩む方の皮膚の改善に貢献し、化粧品業界の発展に寄与する。 The hesperetin derivative obtained in the present invention increased skin cells and activated the gene repair action. This contributes to the improvement of the skin of those suffering from skin problems such as wrinkles and tarmi as a cosmetic, and contributes to the development of the cosmetic industry.
本発明で得られるヘスペレチン誘導体は発酵法により製造されることから機能性を有する食品として利用でき、食品産業や発酵業界の発展に寄与する。 Since the hesperetin derivative obtained in the present invention is produced by a fermentation method, it can be used as a functional food and contributes to the development of the food industry and the fermentation industry.
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