JP2017086031A - Screening method of substance having reducing effect of blood uric acid value - Google Patents
Screening method of substance having reducing effect of blood uric acid value Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017086031A JP2017086031A JP2015223659A JP2015223659A JP2017086031A JP 2017086031 A JP2017086031 A JP 2017086031A JP 2015223659 A JP2015223659 A JP 2015223659A JP 2015223659 A JP2015223659 A JP 2015223659A JP 2017086031 A JP2017086031 A JP 2017086031A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- uric acid
- substance
- buffer solution
- amount
- test substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Abstract
Description
本発明は、血中尿酸値低下作用を有する物質のスクリーニング法に関する。本発明は、また、上記スクリーニング法により見いだされた物質を含む血中尿酸値を低下させるための医薬組成物に関する。 The present invention relates to a screening method for a substance having a blood uric acid level lowering action. The present invention also relates to a pharmaceutical composition for lowering blood uric acid levels containing a substance found by the above screening method.
高尿酸血症は、血中の尿酸濃度が高い状態を意味し、痛風や尿路結石のほか種々の疾患の誘因となる状態である。図１に示すように、尿酸は肝臓中で複数の酵素が関わるプリン体の代謝によって生じる。そのため、プリン体の過剰摂取は高尿酸血症の誘因の一つとされる。
高尿酸血症または痛風等の治療剤となりうる血中尿酸値低下作用を有する物質の探索は、これまで、上記代謝に関わる酵素の阻害活性を指標とする方法、または高尿酸血症動物モデルに直接投与して確認する方法などにより行われてきた。例えば、キサンチンオキシダーゼは尿酸の前駆体であるキサンチンから尿酸を生成させる酵素であるが、非特許文献１および２においては、キサンチンオキシダーゼ阻害作用を有する物質を、高尿酸血症モデルマウスに投与してその血中尿酸値低下作用を確認した例が開示されている。
一方、非特許文献３においては、種々のフラボノイドのキサンチンオキシダーゼ阻害作用が比較されている。
Hyperuricemia means a state in which the concentration of uric acid in the blood is high, and is a state that triggers various diseases besides gout and urinary calculi. As shown in FIG. 1, uric acid is produced by the metabolism of purines that involve multiple enzymes in the liver. Therefore, excessive purine intake is considered to be one of the causes of hyperuricemia.
The search for a substance having a blood uric acid level lowering action that can be used as a therapeutic agent for hyperuricemia or gout has hitherto been conducted in a method using an inhibitory activity of an enzyme involved in metabolism as an index, or an animal model of hyperuricemia. It has been performed by methods such as direct administration and confirmation. For example, xanthine oxidase is an enzyme that generates uric acid from xanthine, which is a precursor of uric acid. In Non-Patent Documents 1 and 2, a substance having an inhibitory action on xanthine oxidase is administered to a hyperuricemia model mouse. An example of confirming the blood uric acid level lowering effect is disclosed.
On the other hand, Non-Patent Document 3 compares the xanthine oxidase inhibitory action of various flavonoids.
酵素の阻害活性を指標とする上記の方法では、その酵素に対しては阻害活性を有しないが血中尿酸値低下作用を有する物質を候補物質として選択することができない。すなわち、例えば、他の酵素への作用で血中尿酸値低下作用を示す物質を見逃してしまう。一方、動物を用いた方法は、貴重な被験物質を相当量必要とすることに加え、時間や費用を要する。そのため、一次スクリーニング法としては、血中尿酸値低下作用を有しうる候補物質を広く同定することが可能であるとともに、動物を用いない方法が望まれる。
本発明の課題は、血中尿酸値低下作用を有しうる物質を候補物質として漏れなく同定することが可能であるとともに、動物を用いないスクリーニング法を提供することである。また、本発明は血中尿酸値を低下させるための医薬組成物を提供することを課題とする。
In the above-described method using the inhibitory activity of an enzyme as an index, a substance that has no inhibitory activity against the enzyme but has an effect of lowering blood uric acid level cannot be selected as a candidate substance. That is, for example, a substance exhibiting a blood uric acid level lowering action due to an action on another enzyme is missed. On the other hand, the method using animals requires time and cost in addition to requiring a considerable amount of valuable test substances. Therefore, as a primary screening method, it is possible to widely identify candidate substances that can have a blood uric acid level lowering action, and a method that does not use animals is desired.
An object of the present invention is to provide a screening method that can identify a substance that can have a blood uric acid level lowering action as a candidate substance without omission and that does not use an animal. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for reducing the blood uric acid level.
本発明者らは、この知見に基づいて本発明を完成させた。
すなわち、本発明は下記の［１］〜［９］を提供するものである。
The present inventors have completed the present invention based on this finding.
That is, the present invention provides the following [1] to [9].
［１］血中尿酸値低下作用を有しうる候補物質を同定する方法であって、
被検物質の存在下、緩衝溶液中で肝臓細胞を維持すること、および
上記維持後の上記緩衝溶液中の尿酸量を測定することを含み、
上記被検物質の存在により上記尿酸量が減少する場合に、上記被検物質が上記候補物質として同定される、方法。
［２］上記緩衝溶液が上記被検物質を含む［１］に記載の方法。
［３］上記緩衝溶液が尿酸前駆体を含む［１］または［２］に記載の方法。
［４］上記尿酸前駆体がアデノシン、グアノシン、イノシン、ヒポキサンチン、グアニン、およびキサンチンからなる群より選択される１種以上である［３］に記載の方法。
［５］上記尿酸前駆体がグアノシン、イノシンからなる群より選択される１種以上である［３］に記載の方法。
［６］上記肝臓細胞がマウス培養細胞である［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］上記緩衝溶液が緩衝塩類液である［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］式（Ｉ）で表される化合物もしくはその薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物を有効成分として含む、血中尿酸値を低下させるための医薬組成物：
[1] A method for identifying a candidate substance that can have a blood uric acid level lowering action,
Maintaining liver cells in a buffer solution in the presence of a test substance, and measuring the amount of uric acid in the buffer solution after the maintenance,
A method in which the test substance is identified as the candidate substance when the amount of uric acid decreases due to the presence of the test substance.
[2] The method according to [1], wherein the buffer solution contains the test substance.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the buffer solution contains a uric acid precursor.
[4] The method according to [3], wherein the uric acid precursor is one or more selected from the group consisting of adenosine, guanosine, inosine, hypoxanthine, guanine, and xanthine.
[5] The method according to [3], wherein the uric acid precursor is one or more selected from the group consisting of guanosine and inosine.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the liver cells are mouse cultured cells.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the buffer solution is a buffered saline solution.
[8] A medicament for reducing blood uric acid level, comprising a compound represented by formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate or solvate thereof as an active ingredient Composition:
式中、ＸはＣＨ2またはＣ＝Ｏを示し、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれＨまたはＯＨを示す。
［９］ＸがＣ＝Ｏであり、Ｒ1〜Ｒ4がそれぞれＯＨであり、Ｒ5がＨである［８］に記載の医薬組成物。
In the formula, X represents CH 2 or C═O, and R 1 to R 5 each represent H or OH.
[9] The pharmaceutical composition according to [8], wherein X is C═O, R 1 to R 4 are each OH, and R 5 is H.
本発明により、血中尿酸値低下作用を有しうる物質を候補物質として漏れなく同定することが可能であるとともに、動物を用いないスクリーニング法が提供される。また、本発明においては、上記スクリーニング法により、血中尿酸値低下作用が知られていなかった物質にこの作用があることを見いだした。この物質により血中尿酸値を低下させるための医薬組成物を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to identify a substance capable of lowering blood uric acid level as a candidate substance without omission and provide a screening method without using an animal. Further, in the present invention, the above screening method has found that a substance whose blood uric acid level lowering action was not known has this action. This substance can provide a pharmaceutical composition for lowering the blood uric acid level.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のスクリーニング法は、血中尿酸値低下作用を有しうる候補物質を同定する方法である。本明細書において、血中尿酸値低下作用というとき、血中尿酸値を低下させる作用であってもよく、血中尿酸値の上昇を抑制する作用であってもよい。血中尿酸値低下作用を有しうる候補物質とは、血中尿酸値低下作用を有する蓋然性の高い物質であり、さらなる評価やスクリーニング法に供して、血中尿酸値低下作用を有する物質として選択することができる物質である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The screening method of the present invention is a method for identifying candidate substances that can have a blood uric acid level lowering effect. In the present specification, the blood uric acid level lowering action may be an action of lowering the blood uric acid level or an action of suppressing an increase in the blood uric acid level. Candidate substances that can lower blood uric acid levels are substances that have a high probability of having blood uric acid level lowering effects, and are selected as substances that have blood uric acid level lowering actions for further evaluation and screening methods. It is a substance that can do.
本発明のスクリーニング法は、種々の機構で血中尿酸値低下作用を有する物質を見いだすことが可能である。特定の酵素の活性に着目する方法ではないためである。また本発明のスクリーニング法は、動物の利用が不要であって、安価で簡便である。本発明のスクリーニング法は、例えば、モデル動物を利用したスクリーニングの前の一次スクリーニングとして使用することができる。 The screening method of the present invention can find a substance having a blood uric acid level lowering action by various mechanisms. This is because the method is not focused on the activity of a specific enzyme. The screening method of the present invention does not require the use of animals, and is inexpensive and simple. The screening method of the present invention can be used, for example, as a primary screening prior to screening using a model animal.
本発明のスクリーニング法は、被検物質の存在下、緩衝溶液中で肝臓細胞を維持すること、および上記培養後の上記肝臓細胞の上記緩衝溶液中の尿酸量を測定することを含む。本明細書において、「維持」は、「定温放置」または「培養」の意味で用いられる。被検物質の存否による肝臓細胞での尿酸の産生量の増減は被検物質の血中尿酸値低下作用活性の指標となると考えられる。本発明者らは、後述の実施例で示すように肝臓細胞中で産生される尿酸は大部分がその肝臓細胞を維持する緩衝溶液中に漏出することを確認し、上記の培養後の緩衝溶液中の尿酸量が肝臓細胞による尿酸の産生量を反映していることを見いだした。すなわち、被検物質の存在により上記の維持後の緩衝溶液中の尿酸量が減少する場合に、この被検物質を血中尿酸値低下作用を有しうる候補物質として同定することができることを見出した。 The screening method of the present invention includes maintaining liver cells in a buffer solution in the presence of a test substance, and measuring the amount of uric acid in the buffer solution of the liver cells after the culture. In the present specification, “maintenance” is used to mean “incubation” or “culture”. The increase or decrease in the amount of uric acid produced in liver cells depending on the presence or absence of the test substance is considered to be an indicator of the activity of the test substance in reducing blood uric acid level. The present inventors confirmed that most of the uric acid produced in the liver cells leaks into the buffer solution that maintains the liver cells, as described in the examples below, and the buffer solution after the culture described above. It was found that the amount of uric acid in the sample reflects the amount of uric acid produced by liver cells. That is, when the amount of uric acid in the buffer solution after the maintenance is decreased due to the presence of the test substance, the test substance can be identified as a candidate substance that can have a blood uric acid level lowering effect. It was.
被検物質の添加により肝臓細胞による尿酸の産生量が減少するか否かは、対照との比較において確認することができる。
例えば、被検物質を２つ以上の異なる濃度で添加した緩衝溶液中でそれぞれ肝臓細胞を維持し、より高い濃度で被検物質を添加した緩衝溶液での尿酸量がより低い濃度で被検物質を添加した緩衝溶液での尿酸量よりも少ない場合に、被検物質が血中尿酸値低下作用を有しうる候補物質であると判定することができる。ここで２つ以上の異なる濃度のうちの一つは実質的にゼロであってもよい。すなわち、被検物質を添加しなかった緩衝溶液と添加した緩衝溶液とを比較して、添加した緩衝溶液で尿酸量が少ない場合に、その被検物質を候補物質であると判定してもよい。この際、被検物質の添加量に応じた上記尿酸量の低下の程度に基準を設けて、基準量以上減少した場合に候補物質であると判定してもよい。
また、複数の被検物質について、それぞれ、同じ条件で培養と尿酸量の測定とを行い、より少ない尿酸量を示した被検物質を候補物質として選別してもよい。
Whether or not the amount of uric acid produced by liver cells is reduced by the addition of the test substance can be confirmed in comparison with the control.
For example, each liver cell is maintained in a buffer solution to which a test substance is added at two or more different concentrations, and the test substance is at a lower concentration of uric acid in the buffer solution to which the test substance is added at a higher concentration. When the amount of uric acid in the buffer solution to which is added is smaller, it can be determined that the test substance is a candidate substance that can have a blood uric acid level lowering effect. Here, one of the two or more different concentrations may be substantially zero. That is, the buffer solution to which the test substance is not added is compared with the buffer solution to which the test substance is added, and when the amount of uric acid is small in the added buffer solution, the test substance may be determined to be a candidate substance. . At this time, a criterion may be set for the degree of decrease in the uric acid amount according to the amount of the test substance added, and the substance may be determined to be a candidate substance when the amount of the uric acid is decreased by more than the reference amount.
In addition, for each of a plurality of test substances, culture and measurement of the uric acid amount may be performed under the same conditions, and the test substances showing a lower uric acid amount may be selected as candidate substances.
本明細書において、「被検物質の存在下」での維持は、通常、肝臓細胞を維持する緩衝溶液に被検物質を添加することにより達成できる。具体的には、被検物質が存在する緩衝溶液中で肝臓細胞を維持し、その後この緩衝溶液中の尿酸量が測定されることが好ましい。緩衝溶液中の被検物質の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１μＭ〜１ｍＭ、好ましくは１μＭ〜５００μＭ、より好ましくは１μＭ〜３００μＭの範囲で適宜選択すればよい。
被検物質の少なくとも一部が肝臓細胞中に存在しうる状態とされるかぎり、そのほかの方法で肝臓細胞に被検物質を添加することもできる。
In the present specification, the maintenance in the “in the presence of the test substance” can be usually achieved by adding the test substance to a buffer solution that maintains the liver cells. Specifically, it is preferable that the liver cells are maintained in a buffer solution containing the test substance, and then the amount of uric acid in the buffer solution is measured. The concentration of the test substance in the buffer solution is not particularly limited. For example, it may be appropriately selected within the range of 0.1 μM to 1 mM, preferably 1 μM to 500 μM, more preferably 1 μM to 300 μM.
As long as at least a part of the test substance can be present in the liver cells, the test substance can be added to the liver cells by other methods.
肝臓細胞は哺乳動物の肝臓細胞であることが好ましく、マウスの肝臓細胞、またはヒトもしくは類人猿（テナガザル、オランウータン、チンパンジー、ゴリラ）の肝臓細胞であることがより好ましい。肝臓細胞としては、市販の細胞培養株を用いてもよい。例えば、ＡＴＣＣ(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)またはコスモ・バイオ社から入手可能な肝臓細胞株、特にマウス培養細胞を用いてもよい。 The liver cells are preferably mammalian liver cells, more preferably mouse liver cells or human or ape (eg, gibbon, orangutan, chimpanzee, gorilla) liver cells. Commercially available cell culture strains may be used as the liver cells. For example, a liver cell line available from ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) or Cosmo Bio, particularly mouse cultured cells may be used.
肝臓細胞は被検物質または尿酸前駆体を添加する前にマルチウェルプレート等の容器に播種して培養を行うことが好ましい。培養は、一般的に細胞の培養に用いられている条件にて行えばよい。例えば、１０％(v/v)牛胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地とハムＦ−１２培地の１：１混合培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地）を用いてｐＨ６．０〜８．０、好ましくは７．０〜７．５の条件下で、培養を行えばよい。なお、本明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。培養温度は一般的に肝臓細胞の培養に用いられる温度（例えば３７℃）で、１２〜９６時間の培養を行えばよい。 It is preferable to culture the liver cells by seeding them in a container such as a multiwell plate before adding the test substance or uric acid precursor. The culture may be performed under conditions generally used for cell culture. For example, pH 6.0 to 8 using a 1: 1 mixed medium (DMEM / F-12 medium) of Dulbecco's modified Eagle medium containing 10% (v / v) fetal bovine serum (FBS) and Ham F-12 medium. The culture may be performed under a condition of 0.0, preferably 7.0 to 7.5. In the present specification, “to” is used to mean that the numerical values described before and after it are included as a lower limit value and an upper limit value. The culture temperature is generally a temperature used for culturing liver cells (for example, 37 ° C.), and culture may be performed for 12 to 96 hours.
培養後の肝臓細胞は洗浄することが好ましい。洗浄は、例えばリン酸緩衝生理食塩水を用いて行うことができる。特に、カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水で洗浄することが好ましい。洗浄後の肝臓細胞に、例えば被検物質または尿酸前駆体を含む緩衝溶液を加えればよい。 It is preferable to wash the cultured liver cells. Washing can be performed using, for example, phosphate buffered saline. In particular, it is preferable to wash with phosphate buffered saline containing no calcium or magnesium. For example, a buffer solution containing a test substance or a uric acid precursor may be added to the washed liver cells.
培養後に尿酸量を測定する緩衝溶液は使用する肝臓細胞の維持が可能であるかぎり、どのようなものを用いてもよい。
緩衝溶液のｐＨは６．０〜８．０であればよく、７．０〜７．５であることが好ましく、７．２〜７．４であることがより好ましい。緩衝溶液の例としては、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（４−（２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジンエタン−１−スルホン酸塩溶液）、トリス（Ｔｒｉｓ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン）塩酸緩衝液などが挙げられる。また、緩衝塩類液（ＢＳＳ）として知られる、緩衝溶液も好ましい。緩衝塩類液（ＢＳＳ）は細胞に不可欠な無機塩を含み，血清や組織液と等張になるように調合されている緩衝機能を有する生理的塩類溶液である。ＢＳＳとしては、Ｅａｒｌｅ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎが特に好ましい。
Any buffer solution for measuring the amount of uric acid after culturing may be used as long as the used liver cells can be maintained.
The pH of the buffer solution may be 6.0 to 8.0, preferably 7.0 to 7.5, and more preferably 7.2 to 7.4. Examples of buffer solutions include phosphate buffered saline (PBS), HEPES buffer (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethane-1-sulfonate solution), Tris (Tris: hydroxymethylamino) (Methane) hydrochloric acid buffer and the like. Also preferred is a buffered solution known as buffered saline (BSS). Buffered saline (BSS) is a physiological salt solution having a buffering function that contains inorganic salts essential for cells and is formulated to be isotonic with serum and tissue fluid. As BSS, Earle's balanced salt solution is particularly preferable.
培養後に尿酸量を測定する緩衝溶液における維持においての温度は特に限定されず、一般的に肝臓細胞の培養に用いられる温度（例えば３７℃）で、行えばよい。維持時間は、３０分〜９６時間であればよく、１時間〜２４時間であることが好ましい。実施例で示すように２時間程度の維持であってもよい。通常、維持時間は上記緩衝溶液を肝臓細胞に添加した時または被検物質添加時を始点とすればよい。 The temperature in the maintenance in the buffer solution for measuring the amount of uric acid after the culture is not particularly limited, and it may be performed at a temperature generally used for culture of liver cells (for example, 37 ° C.). The maintenance time may be 30 minutes to 96 hours, and is preferably 1 hour to 24 hours. As shown in the examples, it may be maintained for about 2 hours. Usually, the maintenance time may be set as the starting point when the buffer solution is added to the liver cells or when the test substance is added.
本発明のスクリーニング法では尿酸前駆体を使用することも好ましい。例えば、肝臓細胞の維持を、尿酸前駆体を含む緩衝溶液中で行ってもよく、または肝臓細胞の培養の際の培地に尿酸前駆体を加えてもよく、尿酸前駆体の少なくとも一部が肝臓細胞中に存在しうる状態とされるかぎり、その他の方法で肝臓細胞に尿酸前駆体を添加することもできる。このうち、肝臓細胞の維持を尿酸前駆体を含む緩衝溶液中で行うことが好ましく、具体的には、尿酸前駆体が存在する緩衝溶液中で肝臓細胞を維持し、その後この緩衝溶液中の尿酸量が測定されることが好ましい。被検物質および尿酸前駆体を含む緩衝溶液中で肝臓細胞を維持することも好ましい。 It is also preferable to use a uric acid precursor in the screening method of the present invention. For example, liver cells may be maintained in a buffer solution containing uric acid precursors, or uric acid precursors may be added to the medium during culturing of liver cells, and at least some of the uric acid precursors are liver. The uric acid precursor can be added to the liver cells by other methods as long as it can be present in the cells. Of these, it is preferable to maintain the liver cells in a buffer solution containing a uric acid precursor. Specifically, the liver cells are maintained in a buffer solution containing the uric acid precursor, and then the uric acid in the buffer solution is maintained. It is preferred that the amount is measured. It is also preferred to maintain the liver cells in a buffer solution containing the test substance and uric acid precursor.
緩衝溶液への尿酸前駆体の添加量は緩衝溶液での最終濃度が１０〜４００μＭとなる添加量であることが好ましく、５０〜２００μＭとなる添加量であることがより好ましい。
また、本発明のスクリーニング法では既に肝臓細胞内に存在している尿酸や尿酸前駆体に基づき被検物質の添加による尿酸量の変化を測定してもよい。
The addition amount of the uric acid precursor to the buffer solution is preferably such that the final concentration in the buffer solution is 10 to 400 μM, more preferably 50 to 200 μM.
In the screening method of the present invention, the change in the amount of uric acid due to the addition of a test substance may be measured based on uric acid or uric acid precursor already present in the liver cells.
尿酸前駆体としては、アデノシン一リン酸、イノシン一リン酸、アデノシン三リン酸、イノシン三リン酸、グアノシン一リン酸、アデノシン、グアノシン、イノシン、ヒポキサンチン、グアニン、キサントシン一リン酸、キサントシン、キサンチンおよびフルクトースなどが挙げられる。これらのうち、アデノシン、グアノシン、イノシン、ヒポキサンチン、グアニン、キサントシン一リン酸、キサントシン、キサンチンが好ましく、アデノシン、グアノシン、イノシンがより好ましく、グアノシン、イノシンがさらに好ましい。尿酸前駆体は１種用いても、２種以上用いてもよい。グアノシンおよびイノシンの混合物、またはアデノシン、グアノシン、イノシンおよびキサントシンの混合物を用いることも好ましい。 Uric acid precursors include adenosine monophosphate, inosine monophosphate, adenosine triphosphate, inosine triphosphate, guanosine monophosphate, adenosine, guanosine, inosine, hypoxanthine, guanine, xanthosine monophosphate, xanthosine, xanthine And fructose. Among these, adenosine, guanosine, inosine, hypoxanthine, guanine, xanthosine monophosphate, xanthosine and xanthine are preferable, adenosine, guanosine and inosine are more preferable, and guanosine and inosine are more preferable. One or more uric acid precursors may be used. It is also preferred to use a mixture of guanosine and inosine, or a mixture of adenosine, guanosine, inosine and xanthosine.
同一の被検物質を利用して異なる尿酸前駆体を添加した同一条件の培養を行って尿酸量の測定を行ってもよい。候補物質の同定をより確実にすることができる。また、添加する尿酸前駆体によって、尿酸量の増減に変化がある場合は、例えば被検物質が図１に示すプリン体の代謝経路のどの段階、またはどの酵素に、作用しているかを類推することも可能である。 The amount of uric acid may be measured by culturing under the same conditions to which different uric acid precursors are added using the same test substance. Can identify candidate substances more reliably. Further, when there is a change in the increase or decrease in the amount of uric acid depending on the uric acid precursor to be added, for example, it is inferred which stage in the metabolic pathway of the purine body shown in FIG. It is also possible.
緩衝溶液中の尿酸量の測定は、例えば、リンタングステン酸法、ＴＰＴＺ（2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine）法、ＨＰＬＣ法、またはウリカーゼ法などにより行えばよい。ＴＰＴＺ法は、尿酸存在下でＴＰＴＺ(2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine)と鉄イオンが結合し、青色の錯体を形成することを利用した方法である。形成された錯体を比色定量することで尿酸量を測定する。ウリカーゼ法は、尿酸がウリカーゼの作用によって酸化されてアラントインおよび二酸化炭素と過酸化水素を生ずることを利用するものである。尿酸に特異的であり薬剤などの妨害物質の影響が少ないため好ましい。ウリカーゼ法には、ウリカーゼ反応により産生した過酸化水素を利用して発色物質を生じさせ、これを比色定量する方法と、ウリカーゼを加える前後で波長２９２ｎｍにおける紫外部吸光度を測定し、その差から尿酸値を求めるＵＶ法がある。これらのうち、比色定量法が好ましい。 The amount of uric acid in the buffer solution may be measured, for example, by the phosphotungstic acid method, the TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine) method, the HPLC method, or the uricase method. The TPTZ method is a method utilizing the fact that TPTZ (2, 4, 6-tripyridyl-s-triazine) and iron ions are combined in the presence of uric acid to form a blue complex. The amount of uric acid is measured by colorimetric determination of the complex formed. The uricase method utilizes the fact that uric acid is oxidized by the action of uricase to produce allantoin, carbon dioxide and hydrogen peroxide. It is preferable because it is specific to uric acid and is less affected by interfering substances such as drugs. The uricase method uses a hydrogen peroxide produced by the uricase reaction to produce a color-developing substance, which is colorimetrically determined, and the UV absorbance at a wavelength of 292 nm is measured before and after the addition of uricase. There is a UV method for determining uric acid levels. Of these, the colorimetric method is preferred.
本発明のスクリーニング法により見いだされた候補物質はさらに動物実験に付して、インビボで血中尿酸値低下作用を確認することが好ましい。動物実験については、Journal of Ethnopharmacology 103(3), 357-365 (2006)またはJournal of Food Science, 78(12), H1935-H1939 (2013)に記載の方法等を参照することができる。 It is preferable that the candidate substance found by the screening method of the present invention is further subjected to animal experiments to confirm the action of lowering blood uric acid level in vivo. For animal experiments, the method described in Journal of Ethnopharmacology 103 (3), 357-365 (2006) or Journal of Food Science, 78 (12), H1935-H1939 (2013) can be referred to.
本発明者らは、本発明のスクリーニング法を一次スクリーニングとして用いて、式（Ｉ）で表される化合物が血中尿酸値低下作用を有することを見いだした。 The present inventors have found that the compound represented by the formula (I) has a blood uric acid level lowering action by using the screening method of the present invention as a primary screening.
式（Ｉ）中、ＸはＣＨ2またはＣ＝Ｏを示し、Ｒ1〜Ｒ5はそれぞれＨまたはＯＨを示す。Ｒ1〜Ｒ5中、２つ以上がＯＨであることが好ましく、３つ以上がＯＨであることがより好ましく、４つ以上がＯＨであることがさらに好ましい。また、ＸがＣ＝ＯのときはＲ3がＨであることが好ましく、ＸがＣＨ2のときはＲ3がＯＨであることが好ましい。式（Ｉ）において、ＸがＣ＝Ｏであり、Ｒ1〜Ｒ4がそれぞれＯＨであり、Ｒ5がＨである化合物が特に好ましい。この化合物はタキシフォリンまたはジヒドロケルセチンと呼ばれる公知の化合物である。タキシフォリンはカラマツなどの森林樹木から抽出される成分で、ロシアや米国では食品サプリメントとして知られている。タキシフォリンとしては、天然抽出成分を用いてもよく、合成品を用いてもよい。 In formula (I), X represents CH 2 or C═O, and R 1 to R 5 each represent H or OH. In R 1 to R 5 , two or more are preferably OH, more preferably three or more are OH, and still more preferably four or more are OH. When X is C═O, R 3 is preferably H, and when X is CH 2 , R 3 is preferably OH. In the formula (I), a compound in which X is C═O, R 1 to R 4 are each OH, and R 5 is H is particularly preferable. This compound is a known compound called taxifolin or dihydroquercetin. Taxifolin is an ingredient extracted from forest trees such as larch and is known as a food supplement in Russia and the United States. As taxifolin, natural extract components or synthetic products may be used.
式（Ｉ）で表される化合物は２個または３個の不斉炭素を有するが、このような不斉炭素の立体化学についてはそれぞれ独立して（Ｒ）体または（Ｓ）体のいずれかをとることができる。式（Ｉ）で表される化合物は光学異性体またはジアステレオ異性体などの立体異性体として存在することがある。純粋な形態の任意の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などは、いずれも本発明の範囲に包含される。タキシフォリンの場合、クロマン環構造の２位と３位の立体配置につき、（２Ｒ，３Ｒ）、（２Ｒ，３Ｓ）、（２Ｓ，３Ｒ）、及び（２Ｓ，３Ｓ）の４つの立体異性体を取り得る。これらのいずれの立体異性体でもよいが、（＋）−タキシフォリン（（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケルセチン）が好ましい。 The compound represented by the formula (I) has two or three asymmetric carbons, and the stereochemistry of such asymmetric carbons is independently either (R) or (S). Can be taken. The compound represented by the formula (I) may exist as a stereoisomer such as an optical isomer or a diastereoisomer. Any stereoisomer in pure form, any mixture of stereoisomers, racemates and the like are all included within the scope of the present invention. In the case of taxifolin, four stereoisomers of (2R, 3R), (2R, 3S), (2S, 3R), and (2S, 3S) are taken for the configuration at the 2nd and 3rd positions of the chroman ring structure. obtain. Any of these stereoisomers may be used, but (+)-taxifolin ((2R, 3R) -dihydroquercetin) is preferred.
式（Ｉ）で表される化合物は、その薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物として用いてもよい。
塩としては、塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩や、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸及び安息香酸等の有機酸との塩が挙げられる。塩や遊離形態の化合物の他、これらの任意の水和物あるいは溶媒和物を有効成分として用いてもよい。上記の溶媒和物を形成し得る溶媒としては、例えば、エタノール、イソプロパノール、アセトン、酢酸エチル、塩化メチレン等が挙げられる。
The compound represented by the formula (I) may be used as a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate or a solvate thereof.
Salts include mineral salts such as hydrochloride and sulfate, and salts with organic acids such as acetic acid, propionic acid, tartaric acid, fumaric acid, maleic acid, malic acid, oxalic acid, succinic acid, citric acid and benzoic acid. Is mentioned. In addition to salts and free form compounds, any hydrates or solvates of these may be used as active ingredients. Examples of the solvent that can form the solvate include ethanol, isopropanol, acetone, ethyl acetate, and methylene chloride.
医薬組成物としては、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下剤、または液剤などの経口投与の製剤、あるいは注射剤、座剤、軟膏、貼付剤などの非経口投与用の製剤を例示することができる。特に経口投与の製剤とすることが好ましい。 The pharmaceutical composition includes tablets, capsules, fine granules, powders, pills, troches, sublingual or liquid preparations, or parenteral administration such as injections, suppositories, ointments and patches. The formulation for can be illustrated. In particular, a preparation for oral administration is preferable.
式（Ｉ）で表される化合物またはその塩等は、血液中の尿酸値を低下させる作用を有し、高尿酸血症または高尿酸血症に起因する疾患の予防及び治療上有効である。高尿酸血症に起因する疾患としては、痛風、腎障害、尿路結石等が挙げられる。また、式（Ｉ）で表される化合物は、２型糖尿病の悪化防止にも有効である。
タキシフォリンなどの式（Ｉ）で表される化合物は、すでに食品サプリメントの成分として公知の成分であり、安全性は高い。
The compound represented by the formula (I) or a salt thereof has an action of lowering the uric acid level in blood, and is effective in preventing and treating hyperuricemia or diseases caused by hyperuricemia. Examples of the diseases caused by hyperuricemia include gout, kidney damage, urinary calculus and the like. In addition, the compound represented by the formula (I) is also effective in preventing the deterioration of type 2 diabetes.
The compounds represented by formula (I) such as taxifolin are already known as ingredients of food supplements and have high safety.
そのため、式（Ｉ）で表される化合物もしくはその薬学的に許容される塩、またはそれらの水和物もしくはそれらの溶媒和物は、血中尿酸値を低下させるための医薬組成物の有効成分として有用である。医薬組成物は、血中尿酸値上昇抑制用の飲食品、高尿酸血症の予防および／または治療用の飲食品として提供されていてもよい。飲食品としては、飲料、ビスケット、クッキー、チョコレート、ドロップなどの形態とすることができる。
式（Ｉ）で表される化合物またはその塩等は、例えば、体重１ｋｇ当たり５０ｍｇ〜１ｇ程度、好ましくは１００ｍｇ〜５００ｍｇ程度で、１日１〜５回程度、ヒトまたはそのほかの哺乳動物等に投与することができる。
Therefore, the compound represented by formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a hydrate or a solvate thereof is an active ingredient of a pharmaceutical composition for lowering blood uric acid level. Useful as. The pharmaceutical composition may be provided as a food or drink for suppressing an increase in blood uric acid level, or a food or drink for preventing and / or treating hyperuricemia. The food and drink can be in the form of beverages, biscuits, cookies, chocolate, drops, and the like.
The compound represented by the formula (I) or a salt thereof is, for example, about 50 mg to 1 g per kg body weight, preferably about 100 mg to 500 mg, and is administered to humans or other mammals about 1 to 5 times a day. can do.
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、試薬、物質量とその割合、操作等は本発明の趣旨から逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。 The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. The materials, reagents, amounts and ratios of substances, operations, and the like shown in the following examples can be appropriately changed without departing from the gist of the present invention. Therefore, the scope of the present invention is not limited to the following examples.
統計処理
実施例において、統計処理は以下のように行った。
データは平均値±標準誤差で示した。尿酸前駆体添加によるＡＭＬ１２細胞の尿酸産生量の経時的変化の検討では、同一の経過時間における尿酸前駆体間の尿酸産生量の比較は繰り返しのある二元配置分散分析（Two-way repeated measures ＡＮＯＶＡ）を行った後にＴｕｋｅｙ法にて多重比較検定を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とし、アルファベットの異なる群間（図に示すグラフにおいて記載のa〜cの文字）において有意差があるとした。濃度の異なる尿酸前駆体を添加した際のＡＭＬ１２細胞の尿酸産生量の検討では、同一の尿酸前駆体における濃度間の比較は一元配置分散分析（One-way ＡＮＯＶＡ）を行った後に前駆体無添加群 (０μＭ)をコントロールとしてＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて多重比較検定を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。アロプリノールおよびタキシフォリンを添加した際のＡＭＬ１２細胞の尿酸産生量の検討では、各群間の比較は一元配置分散分析（One-way ＡＮＯＶＡ）を行った後にＴｕｋｅｙ法にて多重比較検定を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とし、アルファベットの異なる群間（図に示すグラフにおいて記載のa〜cの文字）において有意差があるとした。高尿酸血症モデルマウスを用いた検討では、各群間の比較は一元配置分散分析（One-way ＡＮＯＶＡ）を行った後に高尿酸血症モデルマウス群をコントロールとしてＤｕｎｎｅｔｔ法を用いて多重比較検定を行った。ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。全ての統計解析は、GraphPad Prism 6(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)を用いて行った。
In the statistical processing examples, statistical processing was performed as follows.
Data are shown as mean ± standard error. In the study of changes in uric acid production in AML12 cells over time due to the addition of uric acid precursors, comparison of uric acid production between uric acid precursors at the same elapsed time was repeated using two-way repeated measures ANOVA. ), A multiple comparison test was performed by the Tukey method. p <0.05 was considered statistically significant, and there was a significant difference between the different groups of the alphabet (letters a to c described in the graph shown in the figure). In the examination of the amount of uric acid produced by AML12 cells when uric acid precursors having different concentrations were added, the comparison between the concentrations of the same uric acid precursors was made after one-way ANOVA was performed and no precursor was added. Multiple comparison tests were performed using the Dunnett method with the group (0 μM) as a control. p <0.05 was considered statistically significant. In the examination of the amount of uric acid produced by AML12 cells when allopurinol and taxifolin were added, comparison between each group was performed by one-way analysis of variance (One-way ANOVA) and then subjected to multiple comparison test by Tukey method. p <0.05 was considered statistically significant, and there was a significant difference between the different groups of the alphabet (letters a to c described in the graph shown in the figure). In the study using hyperuricemia model mice, comparison between each group was performed by one-way analysis of variance (One-way ANOVA), and then multiple comparison test using Dunnett method with hyperuricemia model mice as control Went. p <0.05 was considered statistically significant. All statistical analyzes were performed using GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
細胞培養
ＡＭＬ１２細胞をＡＴＣＣより購入し、実験に用いた。１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ，ＵＳＡ）、５μｇ／ｍｌインスリン（ヒト組換え体、和光純薬工業株式会社）、５μｇ／ｍｌトランスフェリン（和光純薬工業株式会社）、３ｎｇ／ｍｌ セレン（シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））、４０ｎｇ／ｍｌ デキサメタゾン（和光純薬工業株式会社）および１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）にて３７℃、５％ＣＯ2の条件下で培養した。
Cell culture AML12 cells were purchased from ATCC and used for experiments. 10% FBS (fetal bovine serum, Hyclone, Logan, UT, USA), 5 μg / ml insulin (human recombinant, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 5 μg / ml transferrin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 3 ng / ml Selenium (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA), 40 ng / ml Dexamethasone (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 1% penicillin-streptomycin (Nacalai Tesque) The cells were cultured in DMEM / F-12 medium (Life technologies, Grand Island, NY, USA) at 37 ° C. and 5% CO 2 .
ＡＭＬ１２を２４ウェルマルチプレートに１．０×１０5細胞／ウェル（４００μＬ）になるように播種し、１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で培養した。播種して７２時間後に無血清ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で２４時間培養した。次いで、ＡＭＬ１２細胞をリン酸緩衝食塩液ＰＢＳ（−）、和光純薬工業株式会社）で洗浄した。なお、実施例において、「ＰＢＳ（−）」はカルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩液を示す。 AML12 was seeded in a 24-well multiplate at 1.0 × 10 5 cells / well (400 μL) and cultured in 10% FBS / DMEM / F-12 medium. 72 hours after seeding, the cells were cultured in serum-free DMEM / F-12 medium for 24 hours. Next, AML12 cells were washed with phosphate buffered saline PBS (−), Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). In the examples, “PBS (−)” indicates a phosphate buffered saline containing no calcium or magnesium.
尿酸前駆体存在下または非存在下での細胞維持および尿酸量
尿酸前駆体として、キサンチン（シグマアルドリッチ社）、グアノシン（シグマアルドリッチ社）、イノシン（シグマアルドリッチ社）、もしくはアデノシン（シグマアルドリッチ社）を選び、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業株式会社）に溶解し、下記の緩衝塩類液（ＢＳＳ）中でＤＭＳＯの最終濃度が０．０５％（ｖ/ｖ）かつ各尿酸前駆体の最終濃度が１００μＭとなるように添加した。用いた緩衝塩類液（ＢＳＳ）の組成は、１８８ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．８ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ グルコース（全て和光純薬工業株式会社））であり、上記のように洗浄後の肝臓細胞にこの緩衝塩類液を３００μＬ添加した。また、上記尿酸前駆体のいずれも添加せずＤＭＳＯのみ添加した上記緩衝塩類液（３００μＬ）を加える群も設けた。
細胞を３７℃で維持し、上記添加の０、３０、６０、９０および１２０分後に、緩衝塩類液を３０μＬずつ回収した。
Xanthine (Sigma Aldrich), Guanosine (Sigma Aldrich), Inosine (Sigma Aldrich), or Adenosine (Sigma Aldrich) as cell maintenance and uric acid amount uric acid precursor in the presence or absence of uric acid precursor Selected, dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the final concentration of DMSO was 0.05% (v / v) and the final concentration of each uric acid precursor in the following buffered saline solution (BSS) Was added to 100 μM. The composition of the buffered saline (BSS) used was 188 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 0.8 mM CaCl 2 , 25 mM NaHCO 3 , 1 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM HEPES, 5 mM glucose (all Wako Pure Chemical Industries Ltd.) 300 μL of this buffered saline solution was added to the liver cells after washing as described above. In addition, a group to which the buffer saline solution (300 μL) in which only DMSO was added without adding any of the uric acid precursors was also provided.
Cells were maintained at 37 ° C., and 30 μL of buffered saline was collected at 0, 30, 60, 90 and 120 minutes after the addition.
緩衝塩類液に交換して１２０分後にＰＢＳ（−）で細胞を洗浄後、３００μＬの１ｍＭリン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５、シグマアルドリッチ社）に交換した。緩衝塩類液中の尿酸濃度は、ＴＰＴＺ法（ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（登録商標）Ｕｒｉｃ Ａｃｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ、測定波長５９０ｎｍ）を用いて測定した。肝臓細胞タンパク量１ｍｇ当たりの緩衝塩類液中の尿酸量（ｎｍｏｌ）を尿酸産生量（ｎｍｏｌ／ｍｇ タンパク質）として算出した。 After replacing with buffered saline solution, cells were washed with PBS (-) 120 minutes later and then replaced with Tris buffer solution (pH 7.5, Sigma-Aldrich) containing 300 μL of 1 mM sodium phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). did. The uric acid concentration in the buffered saline solution was measured using the TPTZ method (QuantChrom (registered trademark) Uric Acid Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA, measurement wavelength 590 nm). The amount of uric acid (nmol) in buffered saline per 1 mg of liver cell protein was calculated as the amount of uric acid produced (nmol / mg protein).
結果を図２に示す。いずれの例においても、時間に応じて尿酸量の増加が見られた。尿酸前駆体を加えない例においても尿酸量の増加が見られたため、本発明のスクリーニング法では、尿酸前駆体を加えなくても、被検物質が尿酸量に与える影響を確認することができることがわかる。
なお、図には示さないが尿酸量は２時間を過ぎた時間で増加が見られなくなった。
The results are shown in FIG. In all examples, the amount of uric acid increased with time. Since an increase in the amount of uric acid was observed even in the case where the uric acid precursor was not added, the screening method of the present invention can confirm the influence of the test substance on the uric acid amount without adding the uric acid precursor. Recognize.
Although not shown in the figure, the amount of uric acid did not increase after 2 hours.
複数の尿酸前駆体添加量での細胞維持および尿酸量
尿酸前駆体として、キサンチン（シグマアルドリッチ社）、グアノシン（シグマアルドリッチ社）、イノシン（シグマアルドリッチ社）、もしくはアデノシン（シグマアルドリッチ社）を選び、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業株式会社）に溶解し、下記の緩衝塩類液（ＢＳＳ）中でＤＭＳＯの最終濃度が０．１％（ｖ/ｖ）かつ各尿酸前駆体の最終濃度が０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、もしくは２００μＭとなるように添加した。用いた緩衝塩類液（ＢＳＳ）の組成は、１８８ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．８ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ グルコース（全て和光純薬工業株式会社））であり、上記のように洗浄後の肝臓細胞にこの緩衝塩類液を３００μＬ添加し、３７℃で１時間維持した。その後、緩衝塩類液を２００μＬ回収した。ＰＢＳ（−）で洗浄後、３００μＬの１ｍＭリン酸ナトリウム （和光純薬工業株式会社）を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５、シグマアルドリッチ社）に交換し、セルスクレイパーで細胞を回収した。緩衝塩類液および細胞中の尿酸濃度は、ＴＰＴＺ法 （ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ（登録商標）Ｕｒｉｃ Ａｃｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，ＢｉｏＡｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ，ＵＳＡ、測定波長５９０ｎｍ）を用いて測定した。また回収した細胞のタンパク量は、ビシンコニン酸法（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。肝臓細胞タンパク量１ｍｇ当たりの緩衝塩類液中の尿酸量（ｎｍｏｌ）を尿酸産生量（ｎｍｏｌ／ｈ／ｍｇタンパク質）として算出した。
As a cell maintenance and uric acid amount uric acid precursor with a plurality of uric acid precursor addition amount , xanthine (Sigma Aldrich), guanosine (Sigma Aldrich), inosine (Sigma Aldrich) or adenosine (Sigma Aldrich) is selected, Dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), the final concentration of DMSO was 0.1% (v / v) and the final concentration of each uric acid precursor was 0 μM in the following buffered saline solution (BSS). , 50 μM, 100 μM, or 200 μM. The composition of the buffered saline (BSS) used was 188 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 0.8 mM CaCl 2 , 25 mM NaHCO 3 , 1 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM HEPES, 5 mM glucose (all Wako Pure Chemical Industries Ltd.) 300 μL of this buffered saline was added to the washed liver cells as described above and maintained at 37 ° C. for 1 hour. Thereafter, 200 μL of buffered saline was recovered. After washing with PBS (−), the medium was replaced with a Tris buffer (pH 7.5, Sigma-Aldrich) containing 300 μL of 1 mM sodium phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the cells were collected with a cell scraper. The buffered saline solution and the uric acid concentration in the cells were measured by using the TPTZ method (QuantChrom (registered trademark) Uric Acid Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA, measurement wavelength 590 nm). The amount of protein in the collected cells was measured using the bicinchoninic acid method (Pierce BCA protein assay kit, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). The amount of uric acid (nmol) in the buffered saline per 1 mg of liver cell protein was calculated as the amount of uric acid produced (nmol / h / mg protein).
結果を図３に示す。緩衝塩類液中で尿酸量の増加が見られた（図３（ａ））一方で、細胞中では尿酸量の増加が見られず（図３（ｂ））、肝臓細胞中で産生した尿酸は全て肝臓細胞培養の緩衝塩類液に放出されていることが確認された。このことは緩衝塩類液中の尿酸量が肝臓細胞の尿酸産生量の指標となることを示した。 The results are shown in FIG. While an increase in the amount of uric acid was observed in the buffered saline (FIG. 3 (a)), an increase in the amount of uric acid was not observed in the cells (FIG. 3 (b)), and the uric acid produced in the liver cells was It was confirmed that all were released into the buffered saline solution of the liver cell culture. This indicated that the amount of uric acid in the buffered saline was an indicator of the amount of uric acid produced by the liver cells.
アロプリノールおよび尿酸前駆体存在下での細胞維持
アロプリノールは血中尿酸値低下作用を有する物質として公知の化合物である。
上記のように洗浄後の細胞に、アロプリノール０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭ、ならびにグアノシンおよびイノシンをそれぞれ１００μＭ含む緩衝塩類液を添加し、３７℃で２時間維持後に緩衝塩類液を回収した。その中の尿酸濃度をウリカーゼ比色法にて確認した。
結果を図４に示す。
図４から分かるように、アロプリノールを添加しない例（０ｎＭ）と比較して、添加した例において尿酸量が低下しており、本発明のスクリーニング法により、血中尿酸値低下物質が候補物質として判定できることが示された。
Cell maintenance allopurinol in the presence of allopurinol and uric acid precursor is a compound known as a substance having a blood uric acid level lowering action.
Buffer saline containing allopurinol 0 nM, 1 nM, 10 nM, or 100 nM, and 100 μM guanosine and inosine, respectively, was added to the cells after washing as described above, and the buffered saline was recovered after maintaining at 37 ° C. for 2 hours. The uric acid concentration therein was confirmed by the uricase colorimetric method.
The results are shown in FIG.
As can be seen from FIG. 4, the amount of uric acid decreased in the added example compared to the case where allopurinol was not added (0 nM), and the blood uric acid level-decreasing substance was determined as a candidate substance by the screening method of the present invention. It was shown that it can be done.
被検物質および尿酸前駆体存在下での細胞維持
下記の緩衝塩類液（ＢＳＳ）中での各尿酸前駆体最終濃度が１００μＭのキサンチン（シグマアルドリッチ社）、１００μＭのグアノシン（シグマアルドリッチ社Ａ）、１００μＭのイノシン（シグマアルドリッチ社）または１００μＭのグアノシン＋１００μＭのイノシンとなるように緩衝塩類液（１８８ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．８ｍＭ ＣａＣｌ2，２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3，１ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５ｍＭグルコース（全て和光純薬工業株式会社））に添加した。タキシフォリン（（＋）−タキシフォリン、シグマアルドリッチ社）をＤＭＳＯに溶解し、これら各前駆体を含む緩衝塩類液中での最終濃度が０、５０、１００または２００μＭとなるように調製した緩衝塩類液２００μＬ（ＤＭＳＯとしての塩類液中での最終濃度は０．１５％）を、上記のように洗浄後の肝臓細胞に加え３７℃で２時間維持した。
Cell maintenance in the presence of the test substance and uric acid precursor The final concentration of each uric acid precursor in the following buffered saline (BSS) is 100 μM xanthine (Sigma Aldrich), 100 μM guanosine (Sigma Aldrich A), Buffer saline solution (188 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , 0.8 mM CaCl 2 , 25 mM NaHCO 3 , 1 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM) to be 100 μM inosine (Sigma Aldrich) or 100 μM guanosine + 100 μM inosine HEPES, 5 mM glucose (all Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)). 200 μL of buffered saline prepared by dissolving taxifolin ((+)-taxifolin, Sigma-Aldrich) in DMSO and having a final concentration of 0, 50, 100 or 200 μM in buffered saline containing each of these precursors (The final concentration in DMSO as a saline solution is 0.15%) was added to the liver cells after washing as described above and maintained at 37 ° C. for 2 hours.
尿酸産生量測定
その後、緩衝塩類液を１５０μＬ回収した。ＰＢＳ（−）で洗浄後、３００μＬの１ｍＭリン酸ナトリウム（和光純薬工業株式会社）を含むトリス緩衝液（ｐＨ７．５、シグマアルドリッチ社）に交換した。緩衝塩類液中の尿酸濃度は、ウリカーゼ比色法（尿酸Ｃ−テストワコー，和光純薬工業株式会社）を用いて測定した。測定波長は５５５ｎｍで行った。肝臓細胞タンパク質の量１ｍｇ当たりの緩衝塩類液中の尿酸量（ｎｍｏｌ）を尿酸産生量（ｎｍｏｌ／２ｈ／ｍｇ タンパク質）として算出した。結果を図５に示す。なお、図５に示すグラフで示される個々の値は平均±標準誤差（ｎ＝６）である。
After measuring the amount of uric acid produced , 150 μL of buffered saline was collected. After washing with PBS (−), the solution was replaced with a Tris buffer (pH 7.5, Sigma-Aldrich) containing 300 μL of 1 mM sodium phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The uric acid concentration in the buffered saline was measured using a uricase colorimetric method (uric acid C-Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The measurement wavelength was 555 nm. The amount of uric acid (nmol) in the buffered saline per 1 mg of liver cell protein was calculated as the amount of uric acid produced (nmol / 2h / mg protein). The results are shown in FIG. In addition, each value shown by the graph shown in FIG. 5 is an average +/- standard error (n = 6).
図５に示す結果から分かるように、キサンチン、グアノシン、イノシンおよびグアノシン＋イノシンのいずれの尿酸前駆体の存在下においても、タキシフォリン添加によりＡＭＬ１２細胞の尿酸の産生量は統計的に有意に抑制された。キサンチンおよびグアノシン同時存在下、特にグアノシン存在下では、５０、１００および２００μＭタキシフォリン添加群の尿酸産生量は、タキシフォリン非添加群と比べて有意に低い値を示した。イノシン存在下、ならびにグアノシンおよびイノシンの存在下では、１００μＭタキシフォリン添加群および２００μＭタキシフォリン添加群の尿酸産生量は非添加群と比べて有意に低い値を示した。以上の結果より、タキシフォリンにはＡＭＬ１２細胞の尿酸産生抑制作用があることが示唆された。 As can be seen from the results shown in FIG. 5, in the presence of any urate precursor of xanthine, guanosine, inosine, and guanosine + inosine, the production of uric acid in AML12 cells was statistically significantly suppressed by the addition of taxifolin. . In the presence of xanthine and guanosine, particularly in the presence of guanosine, the amount of uric acid produced in the 50, 100 and 200 μM taxifolin-added groups was significantly lower than that in the non-taxifolin-added group. In the presence of inosine, and in the presence of guanosine and inosine, the uric acid production in the 100 μM taxifolin added group and the 200 μM taxifolin added group was significantly lower than that in the non-added group. From the above results, it was suggested that taxifolin has an action to suppress uric acid production of AML12 cells.
動物実験
雄性ＩＣＲマウス４週齢を日本チャールズ・リバー株式会社より購入し、通常食（ＣＲＦ−１、オリエンタル酵母工業株式会社）で一週間予備飼育した。その後、マウスを体重が均等になるようにして以下のように群分けを行った。すなわち、正常マウス群、高尿酸血症モデルマウス群、アロプリノール群、タキシフォリン低用量群および高用量群の５群とし（１０匹／群）、試験に供した。予備飼育終了後、マウスに４時間の絶食を課し、０．５％(w/v)カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ−Ｎａ、和光純薬工業株式会社）溶液で懸濁したタキシフォリン（Ａｄｏｏｑ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＬＬＣ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を体重１ｋｇ当たりタキシフォリン低用量群には１００ｍｇ、高用量群には３００ｍｇ経口投与した。アロプリノール群には０．５％ＣＭＣ−Ｎａ溶液で懸濁したアロプリノールを体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ経口投与し、正常マウス群および高尿酸血症モデルマウス群には０．５％ＣＭＣ−Ｎａ溶液のみを経口投与した。サンプルの経口投与を３日間連続で行い、３日目の投与後１時間後に正常マウス群以外のマウスにＰＢＳ（−）に溶解したグアノシン ５’−モノリン酸（ＧＭＰ、東京化成工業株式会社）とイノシン ５’−モノリン酸（ＩＭＰ、東京化成工業株式会社）の両方をそれぞれ３００ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。正常マウス群にはＰＢＳ（−）のみを投与した。腹腔内投与の１時間後に、イソフルラン（Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）麻酔下でマウスを開腹し、腹部下大静脈より採血を行った。回収した血液はヘパリン（和光純薬工業株式会社）処理を行い、４℃で８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し、血漿試料を得た。血漿中尿酸濃度は、ウリカーゼ比色法（尿酸Ｃ−テストワコー，和光純薬工業株式会社））を用いて測定した。
Animal Experiment Male ICR mice 4 weeks old were purchased from Charles River Japan Co., Ltd. and preliminarily raised for 1 week on a normal diet (CRF-1, Oriental Yeast Co., Ltd.). Thereafter, the mice were grouped as follows so that the body weights were equal. That is, the normal mouse group, the hyperuricemia model mouse group, the allopurinol group, the taxifolin low-dose group and the high-dose group were grouped into 5 groups (10 mice / group) and used for the test. After pre-breeding, mice were fasted for 4 hours, and taxifolin (Adoq Bioscience, LLC) suspended in 0.5% (w / v) sodium carboxymethylcellulose (CMC-Na, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution. , Irvine, CA, USA) per kg of body weight was orally administered at 100 mg for the taxifolin low dose group and 300 mg for the high dose group. In the allopurinol group, allopurinol suspended in 0.5% CMC-Na solution was orally administered at 10 mg per kg body weight, and only 0.5% CMC-Na solution was orally administered to the normal mouse group and the hyperuricemia model mouse group. Administered. Samples were orally administered for 3 consecutive days, and guanosine 5′-monophosphate (GMP, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) dissolved in PBS (−) in mice other than the normal mouse group 1 hour after administration on the 3rd day Both inosine 5'-monophosphate (IMP, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) were administered intraperitoneally at 300 mg / kg. Only PBS (-) was administered to the normal mouse group. One hour after intraperitoneal administration, the mouse was opened under anesthesia with isoflurane (Pfizer Inc., New York, NY, USA), and blood was collected from the inferior vena cava. The collected blood was treated with heparin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to obtain a plasma sample. The plasma uric acid concentration was measured using a uricase colorimetric method (uric acid C-Test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
結果を図６に示す
図６から、タキシフォリンの投与（３００ｍｇ/ｋｇ）により、高尿酸血症モデルマウスの血漿中尿酸濃度が用量依存的かつ有意（Ｐ＜０．０５）に低下していることが分かり、肝臓細胞を用いたスクリーニング法において尿酸量の低下を示した物質の血中尿酸値低下活性が示された。
タキシフォリンはJournal of Natural Products, 61(1), 71-76 (1998)において、キサンチンオキシダーゼ阻害活性が極めて低いことが示されていた化合物であるが、本発明のスクリーニング法においてタキシフォリンは血中尿酸値低下物質であることを示す結果が得られ、本スクリーニング系の優れた網羅性を示した。
The results are shown in FIG. 6. FIG. 6 shows that the administration of taxifolin (300 mg / kg) resulted in a dose-dependent and significant (P <0.05) decrease in plasma uric acid concentration in hyperuricemia model mice. From the results, it was shown that a substance that showed a decrease in the amount of uric acid in the screening method using liver cells showed a blood uric acid level lowering activity.
Taxifolin is a compound that was shown to have extremely low xanthine oxidase inhibitory activity in the Journal of Natural Products, 61 (1), 71-76 (1998), but in the screening method of the present invention, taxifolin is a blood uric acid level. A result indicating that the substance is a reducing substance was obtained, and the excellent coverage of this screening system was demonstrated.
図５に示す結果から分かるように、タキシフォリン添加による尿酸産生量の抑制は、尿酸前駆体としてグアノシンまたはイノシンを添加した場合よりもグアノシンを添加したときに顕著である。グアノシンからの尿酸産生のみにかかわる主な酵素としてはグアニンデアミナーゼが知られている（図１参照）。そのため、タキシフォリンの血中尿酸値低下活性は、主にタキシフォリンがグアニンデアミナーゼ阻害活性を有することによるものと考えられる。 As can be seen from the results shown in FIG. 5, the suppression of uric acid production by adding taxifolin is more remarkable when guanosine is added than when guanosine or inosine is added as a uric acid precursor. Guanine deaminase is known as a main enzyme involved only in uric acid production from guanosine (see FIG. 1). Therefore, taxifolin's blood uric acid level lowering activity is considered to be mainly due to the fact that taxifolin has guanine deaminase inhibitory activity.
Claims (9)
被検物質の存在下、緩衝溶液中で肝臓細胞を維持すること、および
前記維持後の前記緩衝溶液中の尿酸量を測定することを含み、
前記被検物質の存在により前記尿酸量が減少する場合に、前記被検物質が前記候補物質として同定される、方法。 A method for identifying a candidate substance that can have a blood uric acid level lowering effect,
Maintaining liver cells in a buffer solution in the presence of a test substance, and measuring the amount of uric acid in the buffer solution after the maintenance,
A method in which the test substance is identified as the candidate substance when the amount of uric acid decreases due to the presence of the test substance.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015223659A JP6486259B2 (en) | 2015-11-16 | 2015-11-16 | Screening method for substances that lower blood uric acid level |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015223659A JP6486259B2 (en) | 2015-11-16 | 2015-11-16 | Screening method for substances that lower blood uric acid level |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019008236A Division JP2019068854A (en) | 2019-01-22 | 2019-01-22 | Screening method for substances having action of lowering blood uric acid value |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017086031A true JP2017086031A (en) | 2017-05-25 |
| JP6486259B2 JP6486259B2 (en) | 2019-03-20 |
Family
ID=58769437
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2015223659A Active JP6486259B2 (en) | 2015-11-16 | 2015-11-16 | Screening method for substances that lower blood uric acid level |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6486259B2 (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008082869A (en) * | 2006-09-27 | 2008-04-10 | Mitsutoyo Corp | Phase unwrapping method in interference fringe analysis |
| WO2010067904A1 (en) * | 2008-12-12 | 2010-06-17 | 国立大学法人東京大学 | Three-dimensional hierarchic cell coculture method |
| WO2011102532A1 (en) * | 2010-02-16 | 2011-08-25 | 国立大学法人九州大学 | Induced hepatocytes |
| WO2014078956A1 (en) * | 2012-11-20 | 2014-05-30 | Revive Therapeutics Inc. | The use of bucillamine in the treatment of gout |
| WO2015170694A1 (en) * | 2014-05-08 | 2015-11-12 | 株式会社フェニックスバイオ | Hyperuricemia model |
-
2015
- 2015-11-16 JP JP2015223659A patent/JP6486259B2/en active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008082869A (en) * | 2006-09-27 | 2008-04-10 | Mitsutoyo Corp | Phase unwrapping method in interference fringe analysis |
| WO2010067904A1 (en) * | 2008-12-12 | 2010-06-17 | 国立大学法人東京大学 | Three-dimensional hierarchic cell coculture method |
| WO2011102532A1 (en) * | 2010-02-16 | 2011-08-25 | 国立大学法人九州大学 | Induced hepatocytes |
| WO2014078956A1 (en) * | 2012-11-20 | 2014-05-30 | Revive Therapeutics Inc. | The use of bucillamine in the treatment of gout |
| WO2015170694A1 (en) * | 2014-05-08 | 2015-11-12 | 株式会社フェニックスバイオ | Hyperuricemia model |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6486259B2 (en) | 2019-03-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102373245B1 (en) | Compositions and methods for treating anemia | |
| RU2576512C2 (en) | Method and compositions for ageing suppression | |
| US9642874B2 (en) | Compositions of selenoorganic compounds and methods of use thereof | |
| JP2020514352A (en) | Pharmaceutical composition for combination therapy | |
| EP2048145B9 (en) | Protein kinase c activity enhancer containing alkyl ether derivative or salt thereof | |
| KR20150131221A (en) | Pyrazole-amide compound and medicinal uses therefor | |
| EP3277675B1 (en) | Heterocyclic modulators of lipid synthesis | |
| Zou et al. | Protective role of α-lipoic acid in hyperuricemia-induced endothelial dysfunction | |
| TW201900167A (en) | Method for treating liver disease | |
| JP5008932B2 (en) | Protein ubiquitination inhibitor | |
| Murer et al. | Identification of broad anti-coronavirus chemical agents for repurposing against SARS-CoV-2 and variants of concern | |
| KR20230023642A (en) | Combination treatment of liver failure | |
| Hennessey et al. | Identification and validation of small-gatekeeper kinases as drug targets in Giardia lamblia | |
| Dalal et al. | Amino acid efflux by asexual blood-stage Plasmodium falciparum and its utility in interrogating the kinetics of hemoglobin endocytosis and catabolism in vivo | |
| WO2017192413A1 (en) | Glutarate compounds for treating ischemia-reperfusion injuries | |
| JP2019068854A (en) | Screening method for substances having action of lowering blood uric acid value | |
| JP6486259B2 (en) | Screening method for substances that lower blood uric acid level | |
| WO2014077409A1 (en) | Agent for mitigating side effect of sunitinib | |
| EP3855180B1 (en) | Method for evaluating pathology of cardiac failure | |
| WO2022251679A1 (en) | Nitroxide radicals for use as antiviral treatment for coronavirus infection | |
| KR101270123B1 (en) | Antioxidant composition | |
| TW201729809A (en) | Drug comprising aripiprazole and cilostazol | |
| JP2018131419A (en) | Pharmaceutical and food compositions for reducing blood uric acid levels | |
| Levy et al. | The effect of changes in thiol subcompartments on T-cell colony formation and cell cycle progression: relevance to AIDS | |
| Murer et al. | Arrayed multicycle drug screens identify broadly acting chemical inhibitors for repurposing against SARS-CoV-2 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181024 |
|
| A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20181024 |
|
| A975 | Report on accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971005 Effective date: 20181115 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181204 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190122 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190205 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190219 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6486259 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |