JP2017070252A - Method for producing organic acid - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、藍藻を用いた有機酸の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing an organic acid using cyanobacteria.
近年、地球温暖化や資源枯渇に関する懸念から、再生可能な資源であるバイオマスへの期待が高まっている。なかでも石油の代替資源の開発は重要な課題である。
有機酸は、利用価値の高い化合物である。例えば、有機酸である乳酸からは、優れた生分解性プラスチックであるポリ乳酸を製造可能である。なかでもコハク酸は、汎用の化学・工業原料であり、ポリブチレンサクシネート（ＰＢＳ）の原料や、化学品中間体、溶剤、可塑剤として広く利用されている。例えば、コハク酸を原料として製造されるポリブチレンサクシネートは、農業用マルチフィルム、包装材、農場・土木資材等に使用され、２０１１年の出荷量は約３１００ｔにのぼる。
現在、コハク酸は、主に石油を原料として製造されているが、石油の代わりにバイオマスを利用しようとする流れがある。例えば、非特許文献１には、従属栄養微生物を用いてコハク酸を生産する技術が開示されている。いくつかの企業ではバクテリア又は酵母の発酵により、コハク酸の生産を開始している。
In recent years, due to concerns about global warming and resource depletion, expectations for biomass, a renewable resource, are increasing. In particular, the development of alternative oil resources is an important issue.
Organic acids are highly valuable compounds. For example, polylactic acid, which is an excellent biodegradable plastic, can be produced from lactic acid, which is an organic acid. Among them, succinic acid is a general-purpose chemical and industrial raw material, and is widely used as a raw material for polybutylene succinate (PBS), a chemical intermediate, a solvent, and a plasticizer. For example, polybutylene succinate produced using succinic acid as a raw material is used for agricultural multi-films, packaging materials, farm / civil engineering materials, etc., and the shipment amount in 2011 is about 3100 t.
Currently, succinic acid is mainly produced from petroleum, but there is a trend to use biomass instead of petroleum. For example, Non-Patent Document 1 discloses a technique for producing succinic acid using heterotrophic microorganisms. Some companies have started producing succinic acid by fermentation of bacteria or yeast.
上記の非特許文献等に開示された方法では、有機酸原料として、微生物に対するグルコース等の植物由来の炭素源の供給が必須である。しかし、このような植物由来の炭素源は、食糧としても利用されているため、糖価格の高騰や安定供給体制に対する不安がある。
一方、藍藻は上記微生物とは異なり、光合成により二酸化炭素と光エネルギーを直接資源化することができる。
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、藍藻を用いて高効率に有機酸を製造可能な、有機酸の製造方法の提供を課題とする。
In the methods disclosed in the above-mentioned non-patent documents and the like, it is essential to supply a plant-derived carbon source such as glucose to a microorganism as an organic acid raw material. However, since these plant-derived carbon sources are also used as food, there is concern about rising sugar prices and a stable supply system.
On the other hand, unlike the above-mentioned microorganisms, cyanobacteria can directly make carbon dioxide and light energy into resources by photosynthesis.
This invention is made | formed in view of the said situation, and makes it a subject to provide the manufacturing method of an organic acid which can manufacture an organic acid with high efficiency using cyanobacteria.
本発明は、下記の特徴を有する有機酸の製造方法を提供するものである。 The present invention provides a method for producing an organic acid having the following characteristics.
（１）ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している藍藻、又はヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失している藍藻、を培養物で培養して有機酸を製造させ、前記藍藻内及び／又は前記培養後の前記培養物中から前記有機酸を採取することを含む、有機酸の製造方法。
（２）前記ヒドロゲナーゼがＨｏｘであり、前記藍藻が、ｈｏｘＨ遺伝子及び／又は前記ｈｏｘＨ遺伝子の発現調節領域の配列が改変されたものである、前記（１）に記載の有機酸の製造方法。
（３）前記ｈｏｘＨ遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子である前記（２）に記載の有機酸の製造方法。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、Ｈｏｘにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、Ｈｏｘにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（４）前記藍藻を培養物中で培養することが、前記藍藻を好気培養した後に嫌気培養することを含む、前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
（５）前記好気培養において、前記培養物中の窒素イオン濃度が１ｍＭ以下の低窒素期間を有する前記（４）に記載の有機酸の製造方法。
（６）前記嫌気培養開始時に藍藻が非休眠状態である、前記（５）に記載の有機酸の製造方法。
（７）前記嫌気培養を暗条件下で行う、前記（４）〜（６）のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
（８）前記有機酸がコハク酸及び／又は乳酸である、前記（１）〜（７）のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
（９）前記培養液中から前記有機酸を採取する、前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
（１０）前記藍藻がシネコシスティス（Synechocystis）属の藍藻である、前記（１）〜（９）のいずれか一つに記載の有機酸の製造方法。
(1) Cyanobacteria in which the expression of the hydrogenase gene is suppressed or lost, or Cyanobacteria in which the hydrogenase activity is reduced or lost are cultured in a culture to produce an organic acid, and in the cyanobacteria and / or after the cultivation A method for producing an organic acid, comprising collecting the organic acid from the culture.
(2) The method for producing an organic acid according to (1), wherein the hydrogenase is Hox, and the cyanobacteria are modified in the sequence of the hoxH gene and / or the expression regulatory region of the hoxH gene.
(3) The method for producing an organic acid according to (2), wherein the hoxH gene is a gene encoding a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c).
(A) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added A protein having a hydrogenase activity in Hox (c) a protein having a sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of 80% or more and having a hydrogenase activity in Hox (4) The method for producing an organic acid according to any one of (1) to (3), wherein culturing cyanobacteria in a culture includes anaerobic culture after the aerobic culture of the cyanobacteria.
(5) The method for producing an organic acid according to (4), wherein in the aerobic culture, the nitrogen ion concentration in the culture has a low nitrogen period of 1 mM or less.
(6) The method for producing an organic acid according to (5), wherein the cyanobacterium is in a non-dormant state at the start of the anaerobic culture.
(7) The method for producing an organic acid according to any one of (4) to (6), wherein the anaerobic culture is performed under dark conditions.
(8) The method for producing an organic acid according to any one of (1) to (7), wherein the organic acid is succinic acid and / or lactic acid.
(9) The method for producing an organic acid according to any one of (1) to (8), wherein the organic acid is collected from the culture solution.
(10) The method for producing an organic acid according to any one of (1) to (9), wherein the cyanobacteria are cyanobacteria belonging to the genus Synechocystis.
本発明に係る藍藻は、光合成により二酸化炭素と光エネルギーを直接資源化でき、かつ有機酸の生産能に優れている。このため、本発明によれば、藍藻により高効率に有機酸を製造可能である。 The cyanobacteria according to the present invention can directly utilize carbon dioxide and light energy by photosynthesis, and has an excellent ability to produce organic acids. Therefore, according to the present invention, an organic acid can be produced with high efficiency from cyanobacteria.
本発明の有機酸の製造方法は、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している藍藻、又はヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失している藍藻、を培養物で培養して有機酸を製造させ、前記藍藻内及び／又は前記培養後の前記培養物中から前記有機酸を採取することを含む。
以下、本発明の一実施形態の有機酸の製造方法について説明する。
In the method for producing an organic acid of the present invention, an organic acid is produced by culturing a cyanobacteria in which expression of a hydrogenase gene is suppressed or lost, or a cyanobacteria in which a hydrogenase activity is reduced or lost, in a culture, Collecting the organic acid from within and / or after the culture.
Hereinafter, the manufacturing method of the organic acid of one Embodiment of this invention is demonstrated.
＜藍藻＞
藍藻はシアノバクテリアとも呼ばれ、光合成を行う真正細菌である。他の大部分の藻類が真核生物であるのに対し、原核生物に分類される。
実施形態に係る藍藻は、藍藻が本来有する内在性のヒドロゲナーゼの、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している藍藻、又はヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失している藍藻である。
<Cyanobacteria>
Cyanobacteria are also called cyanobacteria and are eubacteria that perform photosynthesis. While most other algae are eukaryotic, they are classified as prokaryotic.
The cyanobacteria according to the embodiment is a cyanobacteria in which the expression of the hydrogenase gene is suppressed or lost, or the cyanobacteria in which the hydrogenase activity is reduced or lost.
本明細書中において、「有機酸」とは、実施形態に係る藍藻が生合成した有機化合物の酸のことをいう。有機酸は、実施形態に係る藍藻が嫌気呼吸によって生合成した有機酸であってもよく、実施形態に係る藍藻が解糖系及び／又はＴＣＡ回路の生化学反応によって生合成した有機酸であってもよい。有機酸としては、例えば、乳酸、ピルビン酸、クエン酸、α−ケトグルタル酸（２−オキソグルタル酸）、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等が挙げられる。 In the present specification, the “organic acid” refers to an acid of an organic compound biosynthesized by the cyanobacteria according to the embodiment. The organic acid may be an organic acid biosynthesized by the blue-green algae according to the embodiment by anaerobic respiration, or an organic acid biosynthesized by the biochemical reaction of the glycolytic system and / or the TCA cycle by the blue-green algae according to the embodiment. May be. Examples of the organic acid include lactic acid, pyruvic acid, citric acid, α-ketoglutaric acid (2-oxoglutaric acid), succinic acid, fumaric acid, malic acid and the like.
「ヒドロゲナーゼ」は、２Ｈ＋＋２ｅ−←→Ｈ２の反応を触媒する酵素である。藍藻のヒドロゲナーゼには、取り込み型のＨｏｘヒドロゲナーゼと双方向型のＨｕｐヒドロゲナーゼが知られている。ヒドロゲナーゼはＨｏｘであってもよく、Ｈｕｐであってもよい。
藍藻において、Ｈｏｘヒドロゲナーゼは、５つのタンパク質(ＨｏｘＥＦＵＹＨ)から構成されることが知られている（文献：Carrie Eckert et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 52, pp. 43502-43515,"Genetic Analysis of the Hox Hydrogenase in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 Reveals Subunit Roles in Association, Assembly, Maturation, and Function"参照）。ＨｏｘＹとＨｏｘＨは、ヒドロゲナーゼ部分を構成する。ＨｏｘＥとＨｏｘＦとＨｏｘＵは、ＮＡＤＨからＮＡＤ＋を生成するジアホラーゼ部分を構成する。このように、ヒドロゲナーゼが複数のタンパク質から構成されている場合、ヒドロゲナーゼの活性に寄与するものであれば、実施形態に係るヒドロゲナーゼに包含される。
“Hydrogenase” is an enzyme that catalyzes the reaction of 2H + + 2e − ← → H 2 . As the cyanobacterial hydrogenase, an uptake-type Hox hydrogenase and a bidirectional Hup hydrogenase are known. The hydrogenase may be Hox or Hup.
In cyanobacteria, Hox hydrogenase is known to be composed of five proteins (HoxEFUYH) (Reference: Carrie Eckert et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 52, pp. 43502-43515 , "Genetic Analysis of the Hox Hydrogenase in the Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 Reveals Subunit Roles in Association, Assembly, Maturation, and Function"). HoxY and HoxH constitute the hydrogenase moiety. HoxE, HoxF and HoxU constitute a diaphorase moiety that produces NAD + from NADH. Thus, when hydrogenase is comprised from several protein, if it contributes to the activity of hydrogenase, it will be included by the hydrogenase which concerns on embodiment.
藍藻内でヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量が抑制されていることとは、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、ヒドロゲナーゼ遺伝子産物の量が抑制されていることである。藍藻内でヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量が喪失していることとは、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、ヒドロゲナーゼ遺伝子産物が喪失していることである。遺伝子産物としては、例えば、ヒドロゲナーゼｍＲＮＡ、ヒドロゲナーゼタンパク質等が挙げられる。遺伝子の発現量は、公知の測定方法により測定可能であり、リアルタイムＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の方法を採用可能である。結果の比較は、比較可能な同条件のもとに行われた実験結果によるものとする。 The expression level of the hydrogenase gene being suppressed in the cyanobacteria means that the amount of the hydrogenase gene product is suppressed as compared to a wild-type cyanobacteria such as a wild type as a control. The loss of the expression level of the hydrogenase gene in the cyanobacteria means that the hydrogenase gene product has been lost as compared to the wild-type cyanobacteria such as the wild type as a control. Examples of gene products include hydrogenase mRNA, hydrogenase protein, and the like. The expression level of the gene can be measured by a known measurement method, and methods such as real-time PCR and Western blotting can be employed. The comparison of results shall be based on the results of experiments conducted under comparable conditions.
藍藻内でヒドロゲナーゼ活性が低下していることとは、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、ヒドロゲナーゼ活性が低下していることである。藍藻内でヒドロゲナーゼ活性が喪失していることとは、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、ヒドロゲナーゼ活性が喪失していることである。 The fact that the hydrogenase activity is reduced in the cyanobacteria means that the hydrogenase activity is reduced as compared to a wild-type cyanobacteria such as a wild type as a control. The loss of hydrogenase activity in cyanobacteria means that the hydrogenase activity is lost as compared with wild-type cyanobacteria such as wild-type as a control.
藍藻におけるヒドロゲナーゼ活性は、公知の測定方法により測定可能である。例えば、活性測定対象の藍藻から得た細胞抽出物から、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりヒドロゲナーゼを分離し、その際メチルビオローゲン等の指示薬を用いて活性染色を行って染色強度を測定することにより、ヒドロゲナーゼ活性を求めることができる。
或いは、発生した水素量に基づき、藍藻におけるヒドロゲナーゼ活性を求めてもよい。例えば、活性測定対象の藍藻または藍藻から得た細胞抽出物を、ヒドロゲナーゼの水素発生条件を満たした密閉容器内で反応させ、反応後の密閉容器内の気体の水素濃度を測定してもよい。コントロールとなる野生型等の藍藻と活性測定対象の藍藻とを比較して、活性測定対象の藍藻のほうが容器内の水素濃度が低く、ヒドロゲナーゼ活性が水素蓄積量の律速となっていると認識できる場合、測定対象の藍藻のヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失していると判断できる。結果の比較は、比較可能な同条件のもとに行われた実験結果によるものとする。野生型の藍藻としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＧＴ株を例示できる。なお、藍藻におけるヒドロゲナーゼ活性測定方法は上記方法に限定されない。
The hydrogenase activity in cyanobacteria can be measured by a known measurement method. For example, hydrogenase is separated from a cell extract obtained from a cyanobacteria subject to activity measurement by polyacrylamide gel electrophoresis, and at that time, activity staining is performed using an indicator such as methyl viologen to measure the staining intensity. Activity can be determined.
Alternatively, the hydrogenase activity in cyanobacteria may be determined based on the amount of hydrogen generated. For example, cyanobacteria to be measured for activity or a cell extract obtained from cyanobacteria may be reacted in a sealed container that satisfies the hydrogen generation conditions for hydrogenase, and the hydrogen concentration of the gas in the sealed container after the reaction may be measured. Comparing wild-type blue algae as a control with the blue-green algae for activity measurement, it can be recognized that the blue-green algae for activity measurement have a lower hydrogen concentration in the container and the hydrogenase activity is the rate-determining hydrogen accumulation amount. In this case, it can be determined that the hydrogenase activity of the cyanobacteria to be measured is reduced or lost. The comparison of results shall be based on the results of experiments conducted under comparable conditions. An example of the wild-type cyanobacteria is Synechocystis GT strain. The method for measuring hydrogenase activity in cyanobacteria is not limited to the above method.
コントロールとなる藍藻とは、藍藻が本来有する内在性のヒドロゲナーゼの遺伝子及びヒドロゲナーゼ活性を有する、野生型と同等の藍藻である。 The control cyanobacteria are cyanobacteria equivalent to the wild type having the endogenous hydrogenase gene and hydrogenase activity inherent in cyanobacteria.
発明者らは、後述する実施例において示すように、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制された藍藻では、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、有機酸生産能が向上していることを見出した。なお、後述の実施例に示すように、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量が抑制又は喪失された藍藻であれば、対応するヒドロゲナーゼの活性が低下若しくは喪失しているものと理解される。
本実施形態に係る藍藻は、ヒドロゲナーゼ活性が低下又は喪失している藍藻であってもよい。本実施形態に係る藍藻は、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制又は喪失しており、ヒドロゲナーゼ活性が低下又は喪失している藍藻であってもよい。
The inventors have found that cyanobacteria in which the expression of the hydrogenase gene is suppressed has improved organic acid-producing ability as compared to wild-type algae such as a wild type as a control, as shown in the Examples described later. It was. In addition, as shown in the below-mentioned Example, if it is a cyanobacteria in which the expression level of the hydrogenase gene is suppressed or lost, it is understood that the activity of the corresponding hydrogenase is reduced or lost.
The cyanobacteria according to this embodiment may be cyanobacteria in which the hydrogenase activity is reduced or lost. The cyanobacteria according to the present embodiment may be cyanobacteria in which the expression of the hydrogenase gene is suppressed or lost and the hydrogenase activity is reduced or lost.
実施形態に係る藍藻が、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制している藍藻の場合、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の抑制の程度は、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、藍藻に有機酸生産能の向上が認められる程度であればよい。
実施形態に係る藍藻が、ヒドロゲナーゼ活性が低下している藍藻の場合、ヒドロゲナーゼ活性の低下の程度は、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、藍藻に有機酸生産能の向上が認められる程度であればよい。
When the cyanobacteria according to the embodiment is a cyanobacteria in which the expression of the hydrogenase gene is suppressed, the degree of suppression of the expression of the hydrogenase gene is higher in the ability of the cyanobacteria to produce an organic acid than in the wild type algae as a control. It is sufficient that the improvement is recognized.
When the cyanobacteria according to the embodiment is a cyanobacteria in which hydrogenase activity is reduced, the degree of reduction in hydrogenase activity is recognized by cyanobacteria as compared to wild-type cyanobacteria that serve as a control and the organic acid-producing ability is improved. Any degree is acceptable.
藍藻における有機酸生産能の向上は、公知の測定方法により測定可能であり、後述に実施例に記載の方法により行うことができる。例えば、有機酸生産能の測定対象の藍藻から得た細胞抽出物中の有機酸濃度を測定することにより、求めることができる。また、例えば、生産能測定対象の藍藻を培養した培養物中の有機酸濃度を測定することにより、求めることができる。
コントロールとなる野生型等の藍藻と、有機酸生産能の測定対象の藍藻とを比較して、生産能測定対象の藍藻のほうで、細胞抽出物中の有機酸濃度が高い場合、測定対象の藍藻の有機酸蓄積能（有機酸生産能）が向上していると判断できる。
コントロールとなる野生型等の藍藻と、有機酸生産能の測定対象の藍藻とを比較して、生産能測定対象の藍藻のほうで、培養物中の有機酸濃度が高い場合、測定対象の藍藻の細胞外への有機酸生産能（有機酸生産能）が向上していると判断できる。
結果の比較は、比較可能な同条件のもとに行われた実験結果によるものとする。野生型の藍藻としては、Synechocystis GT株を例示できる。なお、藍藻における有機酸生産能の測定方法は上記方法に限定されない。
The improvement of the organic acid production ability in cyanobacteria can be measured by a known measurement method, and can be performed by the method described in Examples below. For example, it can obtain | require by measuring the organic acid density | concentration in the cell extract obtained from the blue-green algae of the measuring object of organic acid production ability. Moreover, it can obtain | require, for example by measuring the organic acid density | concentration in the culture | cultivation which culture | cultivated the blue-green algae of a production ability measurement object.
Compare the wild-type cyanobacteria as a control with the cyanobacteria whose organic acid production ability is measured. If the cyanobacteria whose production ability is measured has a higher organic acid concentration in the cell extract, It can be judged that the organic acid accumulation ability (organic acid production ability) of cyanobacteria is improved.
When the wild-type blue algae as a control is compared with the cyanobacteria whose organic acid production ability is measured, and the cyanobacteria whose production ability is measured has a higher organic acid concentration in the culture, the cyanobacteria to be measured It can be judged that the organic acid production ability (organic acid production ability) to the outside of the cell is improved.
The comparison of results shall be based on the results of experiments conducted under comparable conditions. An example of the wild-type cyanobacteria is Synechocystis GT strain. In addition, the measuring method of the organic acid production ability in cyanobacteria is not limited to the said method.
本実施形態に係る藍藻は、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、有機酸生産能が向上している。
前記有機酸は、コハク酸及び／又は乳酸であることが好ましい。実施形態に係る藍藻は、例えば、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、細胞内のコハク酸蓄積能が２倍以上であってもよく、１０倍以上であってもよく、１５倍以上であってもよい。実施形態に係る藍藻は、例えば、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、細胞外へのコハク酸生産能が２倍以上であってもよく、３倍以上であってもよく、５倍以上であってもよい。
実施形態に係る藍藻は、例えば、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、細胞内の乳酸蓄積能が２倍以上であってもよく、４倍以上であってもよい。実施形態に係る藍藻は、例えば、コントロールとなる野生型等の藍藻に対し、細胞外への乳酸生産能が２倍以上であってもよく、５倍以上であってもよく、１０倍以上であってもよい。
The cyanobacteria according to this embodiment has an organic acid-producing ability improved compared to a wild-type cyanobacteria that serves as a control.
The organic acid is preferably succinic acid and / or lactic acid. The cyanobacteria according to the embodiment may have, for example, a succinic acid accumulation capacity of 2 times or more, 10 times or more, or 15 times or more of the wild type algae as a control. There may be. The cyanobacteria according to the embodiment may have, for example, a succinic acid-producing ability to the outside of the cell that is 2 times or more, 3 times or more, or 5 times or more with respect to the wild type algae as a control It may be.
For example, the cyanobacteria according to the embodiment may have an intracellular lactic acid accumulation capacity of 2 times or more, or 4 times or more of the wild type algae as a control. For example, the cyanobacteria according to the embodiment may have a lactic acid production capacity of 2 times or more, 5 times or more, or 10 times or more of the wild type algae as a control. There may be.
ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の抑制は、例えば、ヒドロゲナーゼ遺伝子に対するｍｉＲＮＡやｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの核酸の発現を生じさせる核酸をモデル動物に導入することで、達成されてもよい。 Suppression of the expression of the hydrogenase gene can be achieved, for example, by introducing into the model animal a nucleic acid that causes the expression of RNAi nucleic acid such as miRNA or siRNA against the hydrogenase gene, nucleic acid such as antisense nucleic acid, aptamer or ribozyme. Good.
実施形態の藍藻は、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制若しくは喪失するよう、又は、ヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失するよう、ゲノム配列が改変されたものであることが好ましい。係る藍藻としては、ヒドロゲナーゼ遺伝子及び／又はヒドロゲナーゼ遺伝子の発現調節領域の配列が改変された藍藻が挙げられる。藍藻のヒドロゲナーゼ遺伝子の配列を改変することにより、ヒドロゲナーゼ遺伝子を破壊又は機能低下させ、藍藻内での機能的なヒドロゲナーゼの生産を抑制又は喪失させることが可能である。ヒドロゲナーゼ遺伝子とは、構造遺伝子の領域が挙げられる。藍藻のヒドロゲナーゼ遺伝子の発現調節領域の配列を改変することにより、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現調節領域を破壊又は機能低下させ、藍藻内でのヒドロゲナーゼ遺伝子産物の発現量を抑制又は喪失させることが可能である。発現調節領域とは、プロモータ、エンハンサー等の領域が挙げられる。 The cyanobacteria of the embodiments are preferably those in which the genomic sequence is modified so that the expression of the hydrogenase gene is suppressed or lost, or the hydrogenase activity is reduced or lost. Examples of such cyanobacteria include cyanobacteria in which the sequence of the hydrogenase gene and / or the expression control region of the hydrogenase gene is modified. By altering the sequence of the cyanobacterial hydrogenase gene, it is possible to destroy or reduce the function of the hydrogenase gene, thereby suppressing or losing the production of functional hydrogenase in the cyanobacteria. The hydrogenase gene includes a structural gene region. By altering the sequence of the expression control region of the cyanobacterial hydrogenase gene, it is possible to destroy or reduce the function of the expression control region of the hydrogenase gene, thereby suppressing or losing the expression level of the hydrogenase gene product in the cyanobacteria. Examples of expression regulatory regions include promoters and enhancers.
実施形態に係る藍藻が、ヒドロゲナーゼ遺伝子及び／又はヒドロゲナーゼ遺伝子の発現調節領域の配列が改変された藍藻である場合、上記コントロールの藍藻とは、当該配列が改変されていない野生型等の藍藻を指す。 When the cyanobacteria according to the embodiment is a cyanobacteria in which the sequence of the hydrogenase gene and / or the expression control region of the hydrogenase gene is modified, the control cyanobacteria refers to a wild-type cyanobacteria that has not been modified in the sequence. .
配列の改変方法としては任意の方法を採用でき、例えば、ヒドロゲナーゼ遺伝子及び／又はヒドロゲナーゼ遺伝子の発現調節領域における、一部又は全部の塩基配列の欠失、置換、挿入、付加、及びそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、ヒドロゲナーゼ遺伝子の配列が欠失されることにより、機能的なヒドロゲナーゼの生産を抑制又は喪失させることができる。例えば、ヒドロゲナーゼ遺伝子の配列に別の配列が挿入されることにより、フレームシフトが生じ、機能的なヒドロゲナーゼの生産を抑制又は喪失させることができる。例えば、ヒドロゲナーゼ遺伝子の配列に別の配列が付加されることにより、遺伝子産物の構造変化が生じ、機能的なヒドロゲナーゼの生産を抑制又は喪失させることができる。例えば、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現調節領域の配列が改変されることにより、ｍＲＮＡの転写の抑制又は喪失が生じ、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現量を抑制又は喪失させることができる。 Arbitrary methods can be adopted as a method for modifying the sequence, for example, deletion, substitution, insertion, addition, and combinations thereof of a part or all of the base sequence in the hydrogenase gene and / or the expression control region of the hydrogenase gene. Can be mentioned. For example, the production of functional hydrogenase can be suppressed or lost by deleting the sequence of the hydrogenase gene. For example, by inserting another sequence into the sequence of the hydrogenase gene, a frame shift occurs, and production of functional hydrogenase can be suppressed or lost. For example, the addition of another sequence to the sequence of the hydrogenase gene causes a structural change in the gene product, which can suppress or lose the production of functional hydrogenase. For example, by altering the sequence of the expression control region of the hydrogenase gene, mRNA transcription is suppressed or lost, and the expression level of the hydrogenase gene can be suppressed or lost.
配列の改変の手法は、当該分野においてよく知られており、種々の遺伝子工学的方法を採用可能である。例えば、変異原性物質（Mutagen）による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、Cre-loxP系等による条件的ノックアウト、CRISPR/Casシステム等によるゲノム編集等の手法を用いて行うことができる。藍藻においては、容易に相同組み換えが可能であり、所望の配列を容易に改変することが可能である。
一般的に使われるシアノバクテリア野生株であるＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＧＴ株などは、一般的に培養物にＤＮＡを加えると、それを細胞の中に取り込み、相同組換えが進む（Ｎａｔｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）。Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３（ＧＴ株）は、Ｎａｔｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎが可能である。
Techniques for modifying sequences are well known in the art, and various genetic engineering methods can be employed. For example, treatment with mutagen (Mutagen), UV irradiation, gene targeting by homologous recombination technology, conditional knockout by Cre-loxP system, genome editing by CRISPR / Cas system, etc. it can. In cyanobacteria, homologous recombination can be easily performed, and a desired sequence can be easily modified.
Synechcystis GT strain, which is a commonly used cyanobacterial strain, generally adds DNA to the culture and incorporates it into the cell to promote homologous recombination (Natural Transformation). Synechocystis sp. PCC 6803 (GT strain) is capable of Natural Transformation.
実施形態に係るヒドロゲナーゼはＨｏｘであることが好ましく、実施形態に係る藍藻は、ｈｏｘヒドロゲナーゼ遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している藍藻、又はＨｏｘヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失している藍藻であることが好ましい。 The hydrogenase according to the embodiment is preferably Hox, and the cyanobacterium according to the embodiment is a cyanobacterium in which the expression of the hox hydrogenase gene is suppressed or lost, or the cyanobacterium in which the Hox hydrogenase activity is reduced or lost. preferable.
実施形態に係るヒドロゲナーゼ遺伝子がｈｏｘである場合、改変されるｈｏｘは、ｈｏｘＹ、ｈｏｘＨ、ｈｏｘＥ、ｈｏｘＦ及びｈｏｘＵからなる群から選ばれる一つ以上であってもよく、ｈｏｘＹ及びｈｏｘＨからなる群から選ばれる一つ以上であってもよい。
ＨｏｘＨの機能が喪失した藍藻では、Ｈｏｘヒドロゲナーゼの活性が喪失することが知られている（Appel et al. (2000) The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis. Arch. Microbiol. 173(5-6)333-338）。係る観点から、実施形態に係る前記ヒドロゲナーゼ遺伝子はｈｏｘＨであることが好ましい。実施形態に係る藍藻は、ｈｏｘＨ遺伝子の発現が抑制若しくは喪失している藍藻、又はＨｏｘＨが構成するヒドロゲナーゼ活性が低下若しくは喪失していてもよく、さらにｈｏｘＨ遺伝子及び／又はｈｏｘＨ遺伝子の発現調節領域の配列が改変された藍藻であることが好ましい。
When the hydrogenase gene according to the embodiment is hox, the modified hox may be one or more selected from the group consisting of hoxY, hoxH, hoxE, hoxF and hoxU, and selected from the group consisting of hoxY and hoxH. It may be one or more.
It is known that the activity of Hox hydrogenase is lost in cyanobacteria that have lost the function of HoxH (Appel et al. (2000) The bidirectional hydrogenase of Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis. Arch. Microbiol 173 (5-6) 333-338). From such a viewpoint, the hydrogenase gene according to the embodiment is preferably hoxH. The cyanobacteria according to the embodiment may be a cyanobacteria in which the expression of the hoxH gene is suppressed or lost, or the hydrogenase activity of the HoxH may be reduced or lost, and further the expression regulatory region of the hoxH gene and / or the hoxH gene. A cyanobacteria with a modified sequence is preferred.
藍藻では、ゲノムに同一の遺伝子が複数コピー存在する場合がある。藍藻がヒドロゲナーゼ遺伝子を複数コピー有している場合、ヒドロゲナーゼ遺伝子の全てのコピーが改変されていてもよく、ヒドロゲナーゼ遺伝子の一部のコピーが改変されていてもよい。例えば、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＧＴ株では、１０個のｈｏｘＨ遺伝子のコピーを有しているとされる。改変されるコピーの割合は、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現の抑制若しくは喪失の程度、又はヒドロゲナーゼ活性の低下若しくは喪失の程度を考慮し、適宜定めればよい。例えば、１０個すべてのｈｏｘＨ遺伝子の全部の遺伝子配列が完全に欠損されている場合、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は喪失し、ヒドロゲナーゼ活性が喪失した藍藻となる。例えば、１０個のうち５個のｈｏｘＨ遺伝子の全部の遺伝子配列が完全に欠損されている場合、ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現は抑制され、ヒドロゲナーゼ活性が抑制された藍藻となる。改変する条件を適宜変化させることにより、１０個のうち６個以上の個数（１０個を含む）のｈｏｘＨ遺伝子の全部の遺伝子配列を完全に欠損させることも可能である。なお、１０個のうち１０個全部のｈｏｘＨ遺伝子の遺伝子配列を完全に欠損させるよりも、１０個のうち１０未満の個数のｈｏｘＨ遺伝子の全部の遺伝子配列を完全に欠損させる方が、改変が容易である。
ヒドロゲナーゼ遺伝子の全コピーのうち、改変されるコピーの割合は、コントロールとなる野生型等の藍藻と比較して、藍藻に有機酸生産能の向上が認められる程度であればよい。有機酸生産能の向上については上記のとおりである。
In cyanobacteria, multiple copies of the same gene may exist in the genome. When the cyanobacterium has a plurality of copies of the hydrogenase gene, all copies of the hydrogenase gene may be modified, or some copies of the hydrogenase gene may be modified. For example, Synechocystis GT strain is said to have 10 copies of the hoxH gene. The proportion of copies to be modified may be appropriately determined in consideration of the degree of suppression or loss of hydrogenase gene expression or the degree of reduction or loss of hydrogenase activity. For example, when all the gene sequences of all 10 hoxH genes are completely deleted, the expression of the hydrogenase gene is lost, resulting in a cyanobacteria with lost hydrogenase activity. For example, when the entire gene sequence of 5 hoxH genes out of 10 is completely deleted, the expression of the hydrogenase gene is suppressed, resulting in a cyanobacteria with suppressed hydrogenase activity. It is also possible to completely delete the entire gene sequence of 6 or more (including 10) hoxH genes by changing the conditions for modification as appropriate. In addition, it is easier to completely modify the entire gene sequence of less than 10 of the 10 hoxH genes than to completely delete the gene sequence of all 10 of the 10 hoxH genes. It is.
The ratio of copies to be modified among all copies of the hydrogenase gene may be such that the cyanobacteria have an improved ability to produce organic acids as compared to wild-type cyanobacteria such as controls. The improvement of the organic acid production ability is as described above.
本明細書中において、ヒドロゲナーゼは、ヒドロゲナーゼ活性に寄与する限り、いかなるものであってもよい。したがって、後述する実施例で具体的に示されたヒドロゲナーゼ以外であっても、例えば当該ヒドロゲナーゼと同等の機能を有するホモログは、実施形態に係るヒドロゲナーゼに包含される。
有機酸の製造に用いる藍藻のヒドロゲナーゼが既知である場合、その情報に基づき、対象とする藍藻のヒドロゲナーゼ遺伝子を容易に特定可能である。
有機酸の製造に用いる藍藻のヒドロゲナーゼが未知である場合であっても、当業者であれば、既知ヒドロゲナーゼの配列情報等に基づき、対象とする藍藻におけるヒドロゲナーゼ遺伝子を、容易に特定可能である。
In the present specification, the hydrogenase may be anything as long as it contributes to the hydrogenase activity. Therefore, even if it is other than the hydrogenase specifically shown by the Example mentioned later, the homolog which has a function equivalent to the said hydrogenase is included by the hydrogenase which concerns on embodiment.
When the cyanobacterial hydrogenase used to produce the organic acid is known, the target cyanobacterial hydrogenase gene can be easily identified based on the information.
Even if the hydrogenase of cyanobacteria used for the production of organic acid is unknown, those skilled in the art can easily identify the hydrogenase gene in the target cyanobacteria based on the sequence information of the known hydrogenase.
一例として、ヒドロゲナーゼがＨｏｘである場合、前記ｈｏｘＨ遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、Ｈｏｘにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、Ｈｏｘにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
As an example, when the hydrogenase is Hox, the hoxH gene may be a gene encoding a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c).
(A) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added A protein having hydrogenase activity in Hox (c) a protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having hydrogenase activity in Hox
配列番号１で表されるアミノ酸配列は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３株のＨｏｘＨのアミノ酸配列である。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is Synechocystis sp. It is the amino acid sequence of HoxH of PCC 6803 strain.
一般的に、アミノ酸配列から１〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたポリペプチドも、元のポリペプチドと同等の機能を有することが知られている。
したがって、本発明の一実施形態に係るＨｏｘＨは、以下の（ｂ）のアミノ酸配列を有するものである。（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるポリペプチド。
In general, it is known that a polypeptide in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted or added from an amino acid sequence also has a function equivalent to that of the original polypeptide.
Therefore, HoxH according to one embodiment of the present invention has the following amino acid sequence (b). (B) A polypeptide comprising a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
（ｂ）のアミノ酸配列において、「１〜数個」の塩基とは、例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜５個、又は１〜３個であってもよい。
（ｂ）のポリペプチドにおいて、「塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列」とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、アミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列であってもよく、欠失、置換、挿入及び付加からなる群から選ばれる少なくとも一種の改変又は変異により、改変前の配列番号１に示されるアミノ酸配列に対して、１〜数個のアミノ酸の相違が生じたものであってもよい。
In the amino acid sequence of (b), “1 to several” bases may be, for example, 1 to 30, 1 to 20, 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3. Good.
In the polypeptide of (b), the “base sequence in which a base is deleted, substituted, inserted or added” means that the amino acid is deleted, substituted, inserted and / or compared to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may be an added amino acid sequence, and at least one modification or mutation selected from the group consisting of deletion, substitution, insertion, and addition, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is 1 to Several amino acid differences may occur.
一般的に、アミノ酸配列との配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドも、元のポリペプチドと同等の機能を有することが知られている。
したがって、本発明の一実施形態に係るＨｏｘＨは、以下の（ｃ）のアミノ酸配列を有するものである。（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｃ）のポリポリペプチドにおいて、配列番号１に示されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であり、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上であってもよい。
アミノ酸配列同士の配列同一性は、公知のシーケンスアライメントのアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ （Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やｂｌａｓｔｐを用いて算出可能である。
In general, it is known that a polypeptide comprising an amino acid sequence having sequence identity with an amino acid sequence also has a function equivalent to that of the original polypeptide.
Therefore, HoxH according to one embodiment of the present invention has the following amino acid sequence (c). (C) A polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
In the polypeptide (c), the sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 80% or more and less than 100%, for example, 85% or more, 90% or more, 95% or more, or 98% or more It may be.
The sequence identity between amino acid sequences can be calculated using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) or blastp, which are known sequence alignment algorithms.
「Ｈｏｘにおいてヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、Ｈｏｘヒドロゲナーゼの複合体において、ヒドロゲナーゼの活性に寄与することをいう。 The phrase “having hydrogenase activity in Hox” means contributing to the activity of hydrogenase in a complex of Hox hydrogenase.
前記（ａ）のタンパク質をコードする遺伝子としては、配列番号２で表される塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられる。
配列番号２で表される塩基配列は、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３株のｈｏｘＨのコーディング領域の塩基配列である。
Examples of the gene encoding the protein (a) include a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2.
The base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is Synechocystis sp. It is the base sequence of the coding region of hoxH of PCC 6803 strain.
実施形態に係る藍藻の種類としては、有機酸生産能を有するものであれば、特に制限されない。例えば、Synechocystis sp. PCC 6803等のSynechocystis属藍藻；Gloeobacter violaceus PCC 7421等のGloeobacter属藍藻；Anabaena sp. PCC 7120、Anabaena variabilis ATCC 29413等のAnabaena属藍藻；Synechococcus sp. PCC 6301、Synechococcus sp. PCC 7002、Synechococcus elongatus PCC 7942、Synechococcus sp. WH8102、Synechococcus sp. WH 7803、Synechococcus sp. CC9311、Synechococcus sp. CC9605、Synechococcus sp. CC9902、Synechococcus sp. JA-2-3B'a(2-13)、Synechococcus sp. JA-3-3Ab、Synechococcus sp. RCC307等のSynechococcus属藍藻；Prochlorococcus marinus SS120、Prochlorococcus marinus MED4、Prochlorococcus marinus MIT 9313、Prochlorococcus marinus str. MIT 9211、Prochlorococcus marinus str. MIT 9215、Prochlorococcus marinus str. MIT 9301、Prochlorococcus marinus str. MIT 9303、Prochlorococcus marinus str. MIT 9312、Prochlorococcus marinus str. MIT 9515、Prochlorococcus marinus str. NATL1A、Prochlorococcus marinus str. NATL2A、Prochlorococcus marinus str. AS9601等のProchlorococcus属藍藻；Cyanothece sp. ATCC 51142、Cyanothece sp. PCC 7424、Cyanothece sp. PCC 7425、Cyanothece sp. PCC 8801等のCyanothece属藍藻；Acaryochloris marina MBIC11017等のAcaryochloris属藍藻；Thermosynechococcus elongatus BP-1等のThermosynechococcus属藍藻；Gloeobacter violaceus PCC 7421等のGloeobacter属藍藻；Microcystis aeruginosa NIES-843等のMicrocystis属藍藻；Nostoc punctiforme ATCC 29133等のNostoc属藍藻；Chlorobium tepidum TLS等の、Chlorobium属藍藻；Rhodopseudomonas palustris CGA009等のRhodopseudomonas属藍藻；Trichodesmium erythraeum IMS101等のTrichodesmium属藍藻；Arthrospira platensis NIES-39等のArthrospira属藍藻等が挙げられる。上記に例示した藍藻のなかでも、実施形態に係る藍藻の種類としては、シネコシスティス（Synechocystis）属の藍藻であることが好ましい。 The kind of cyanobacteria according to the embodiment is not particularly limited as long as it has an organic acid-producing ability. For example, Synechocystis sp. PCC 6803 and other Synechocystis genus cyanobacteria; Gloeobacter violaceus PCC 7421 and other Gloeobacter genus cyanobacteria; Anabaena sp. , Synechococcus elongatus PCC 7942, Synechococcus sp.WH8102, Synechococcus sp.WH 7803, Synechococcus sp.CC9311, Synechococcus sp.CC9605, Synechococcus sp.CC9902, Synechococcus sp. JA-3-3Ab, Synechococcus sp. RCC307 and other Synechococcus genus cyanobacteria; Prochlorococcus marinus SS120, Prochlorococcus marinus MED4, Prochlorococcus marinus MIT 9313, Prochlorococcus marinus str. MIT 9211, Prochlorococcus marinus str. MIT 9215, ProchlorocoMIT , Prochlorococcus marinus str.MIT 9303, Prochlorococcus marinus str.MIT 9312, Prochlorococcus marinus str.MIT 9515, Prochlorococcus marinus str.NATL1A, Prochlorococcus marinus str.NATL2A, Prochlorococcus marinus str. AS9601 and other Prochlorococcus genus cyanobacteria; Cyanothece sp. ATCC 51142, Cyanothece sp. PCC 7424, Cyanothece sp. PCC 7425, Cyanothece sp. Thermosynechococcus genus cyanobacteria such as Gloeobacter violaceus PCC 7421 Gloeobacter genus cyanobacteria such as Microcystis aeruginosa NIES-843 Microcystis genus cyanobacteria such as Nostoc punctiforme ATCC 29133 etc. Rhodopseudomonas genus cyanobacteria such as Trichodesmium erythraeum IMS101, etc .; Arthrospira genus cyanobacteria such as Arthrospira platensis NIES-39, and the like. Among the cyanobacteria exemplified above, the kind of cyanobacteria according to the embodiment is preferably a cyanobacteria belonging to the genus Synechocystis.
＜培養＞
本発明の一実施形態において、有機酸の製造方法は、上記実施形態の藍藻を培養物で培養して有機酸を製造させ、藍藻内及び／又は培養後の培養物中から前記有機酸を採取することを含む。
<Culture>
In one embodiment of the present invention, the organic acid production method comprises culturing the cyanobacteria of the above embodiment in a culture to produce the organic acid, and collecting the organic acid from the culture inside the cyanobacteria and / or after the culture. Including doing.
本明細書中において、培養物とは、藍藻を培養するために用いられるものであり、その中又はその上で藍藻が生育可能な物質である。培養物としては、例えば、培地、バッファー、水、水溶液などである。培養物は液体であっても、固体であってもよいが、有機酸を生産させる際には、藍藻又は有機酸の回収が容易であることから、液体であることが好ましい。 In the present specification, a culture is a substance used for culturing cyanobacteria, and a substance in which cyanobacteria can grow therein or thereon. Examples of the culture include a medium, a buffer, water, and an aqueous solution. The culture may be liquid or solid, but when producing an organic acid, it is preferable that it is a liquid because cyanobacteria or organic acid can be easily recovered.
効率的な有機酸製造の観点から、藍藻に有機酸を生産させるための培養は、嫌気培養であることが好ましい。これは、藍藻が嫌気条件下にさらされると、藍藻内で解糖系の反応が優先的に進むため、効率的に藍藻に有機酸を製造させることが可能と考えられるためである。本明細書中において嫌気培養とは、藍藻において嫌気発酵が可能な培養系においての培養のことをいう。培養系内は、例えば、藍藻を培養する容器内のことを指す。藍藻の嫌気発酵が可能な条件下は公知であり、例えば、培養系内の気相の酸素濃度が０〜１体積％であってもよく、０〜０．５体積％であってもよく、０〜０．２体積％であってもよく、０体積％であってもよい。
藍藻を培養する培養系内を、藍藻が嫌気発酵可能な条件下とする方法としては、例えば、密閉され、光照射が遮られた培養容器内で藍藻を培養することで、藍藻の呼吸により培養容器内の酸素を消費させる方法が挙げられる。したがって、本実施形態の有機酸の製造方法においては、嫌気培養は暗条件下で行うことが好ましい。
別例として、例えば、培養容器内に窒素ガスを流入させ、培養容器内の酸素を窒素で置換する方法が挙げられる。
From the viewpoint of efficient organic acid production, the culture for causing cyanobacteria to produce an organic acid is preferably anaerobic culture. This is because when the cyanobacteria are exposed to anaerobic conditions, the glycolytic reaction preferentially proceeds in the cyanobacteria, and it is considered possible for the cyanobacteria to efficiently produce an organic acid. As used herein, anaerobic culture refers to culture in a culture system capable of anaerobic fermentation in cyanobacteria. The culture system refers to, for example, a container for culturing cyanobacteria. Conditions under which anaerobic fermentation of cyanobacteria is known, for example, the oxygen concentration in the gas phase in the culture system may be 0 to 1% by volume, may be 0 to 0.5% by volume, It may be 0-0.2% by volume or 0% by volume.
As a method of making the culture system for cultivating cyanobacteria under conditions that allow anaerobic fermentation of cyanobacteria, for example, by culturing cyanobacteria in a sealed culture vessel that is shielded from light irradiation, culturing by respiration of cyanobacteria The method of consuming oxygen in a container is mentioned. Therefore, in the method for producing an organic acid of the present embodiment, it is preferable that the anaerobic culture is performed under dark conditions.
As another example, for example, a method of flowing nitrogen gas into a culture vessel and replacing oxygen in the culture vessel with nitrogen can be mentioned.
前記藍藻を培養物中で培養することは、前記藍藻を好気培養した後に嫌気培養することを含むことが好ましい。まず、藍藻を好気培養することで、藍藻の生育や増殖を促したり、藍藻内に有機酸原料を蓄積させる利点がある。好機培養は明条件下で行うことが好ましく、且つ培養系内に二酸化炭素が存在することが好ましい。光が照射された培養容器内で藍藻を培養することで、藍藻の光合成により、有機酸の原料となる炭素源が合成される。藍藻が光合成可能な条件下は公知であり、例えば、藍藻に対し、２０〜２００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１程度の光が照射される条件が挙げられる。 It is preferable that culturing the cyanobacteria in a culture includes anaerobic culture after the aerobic culture of the cyanobacteria. First, aerobic culture of cyanobacteria has advantages such as promoting the growth and proliferation of cyanobacteria and accumulating organic acid raw materials in cyanobacteria. The favorable culture is preferably performed under bright conditions, and it is preferable that carbon dioxide is present in the culture system. By culturing cyanobacteria in a culture container irradiated with light, a carbon source as a raw material for organic acids is synthesized by photosynthesis of cyanobacteria. The conditions under which blue-green algae can be photo-synthesized are known, and examples include conditions where cyanobacteria are irradiated with light of about 20 to 200 μmol photons m −2 s −1 .
前記好気培養において、前記培養物中の窒素イオン濃度が１ｍＭ以下の低窒素期間を有することが好ましい。好機培養において、窒素イオン濃度が１ｍＭ以下の低窒素状態で藍藻を培養することにより、続く嫌気培養において、藍藻の有機酸の生産能を向上させることができる。このメカニズムは明らかではないが、培養物中の窒素が少なくなると、藍藻体内でグリコーゲン、デンプン等の炭素源の蓄積が進むためと考えられる。
ここで、低窒素とは、藍藻にとって窒素が欠乏した状態ではなく、その前段階の状態のことを指す。藍藻にとって窒素が欠乏した状態が続くと、藍藻が休眠状態に移行することが知られている。発明者は、窒素が欠乏して休眠状態へ移行した藍藻よりも、その前段階の状態の藍藻のほうが、有機酸の生産能が高いことを見出した。
したがって、嫌気培養開始時に、藍藻は非休眠状態であることが好ましい。藍藻が休眠状態か非休眠状態かを判断するには、藍藻の色の変化を指標とすればよい。休眠状態への移行に伴い、藍藻の色は、緑色から黄色へと変化することが知られている。これは、フィコビリソームと呼ばれる集光装置を壊して、窒素原を回収するためである。
The aerobic culture preferably has a low nitrogen period in which the nitrogen ion concentration in the culture is 1 mM or less. By culturing cyanobacteria in a low nitrogen state with a nitrogen ion concentration of 1 mM or less in opportunity culture, the ability of cyanobacteria to produce organic acids can be improved in subsequent anaerobic culture. Although this mechanism is not clear, it is thought that when nitrogen in the culture decreases, carbon sources such as glycogen and starch progress in the cyanobacterium.
Here, low nitrogen refers not to a state in which nitrogen is deficient for cyanobacteria but to a state in the previous stage. It is known that cyanobacteria will transition to a dormant state if they remain deficient in nitrogen. The inventor has found that the cyanobacteria in the previous stage have higher ability to produce organic acids than the cyanobacteria that have transitioned to a dormant state due to lack of nitrogen.
Therefore, it is preferable that the cyanobacterium is in a non-dormant state at the start of anaerobic culture. To determine whether the cyanobacteria are dormant or non-dormant, the color change of the cyanobacteria may be used as an index. It is known that the color of cyanobacteria changes from green to yellow with the transition to the dormant state. This is because the light collecting device called phycobilisome is broken to recover the nitrogen source.
藍藻を培養する培養物は、藍藻の培養が可能なものであればよく、藍藻の培地として用いることのできる培地を使用してもよい。培地としては、例えば、ＢＧ−１１培地や、ＢＧ−１１０培地、ＡＡ培地等が挙げられる。これらの培地は、藍藻が利用可能な栄養源が豊富に含まれている。
上記に例示したような培地は、好機培養、嫌気培養のいずれにも使用可能であるが、嫌気培養では、主に藍藻内に蓄積された炭素源を用いて有機酸の生産が行われるため、栄養源を含む培地を使用せずともよい。嫌気発酵では、例えば、培地の代わりとして、藍藻を生存させることが可能なバッファーを、培養物として使用できる。
The culture for cultivating cyanobacteria is not particularly limited as long as cyanobacteria can be cultured, and a medium that can be used as a cyanobacteria medium may be used. As the medium, for example, BG-11 medium, BG-11 0 medium, AA medium, and the like. These media are rich in nutrients available to cyanobacteria.
The medium as exemplified above can be used for both the opportunity culture and the anaerobic culture, but in the anaerobic culture, the organic acid is produced mainly using the carbon source accumulated in cyanobacteria, It is not necessary to use a medium containing a nutrient source. In anaerobic fermentation, for example, a buffer that can survive cyanobacteria can be used as a culture instead of a medium.
藍藻を培養する温度は、使用する藍藻の種やその他の条件を加味して適宜定めればよいが、例えば、１５〜５０℃程度でおこなってもよく、２０℃〜４０℃でおこなってもよく、２５℃〜３０℃程度とすることが好ましい。
藍藻を培養する期間は、培養物中の藍藻の濃度や有機酸の生産量に応じて適宜定めればよい。上記好気培養の期間は、１時間〜２０日程度としてもよく、１日〜１０日程度としてもよく、１〜３日程度としてもよい。好機培養は、振とう培養や通気培養により行ってもよい。上記嫌気培養の期間は、１時間〜２０日程度としてもよく、１日〜１０日程度としてもよく、１〜３日程度としてもよい。
The temperature for culturing cyanobacteria may be appropriately determined in consideration of the species of cyanobacteria to be used and other conditions. For example, it may be performed at about 15 to 50 ° C, or may be performed at 20 to 40 ° C. The temperature is preferably about 25 ° C to 30 ° C.
The period for culturing cyanobacteria may be appropriately determined according to the concentration of cyanobacteria in the culture and the amount of organic acid produced. The period of the aerobic culture may be about 1 hour to 20 days, about 1 day to 10 days, or about 1 to 3 days. The opportunity culture may be performed by shaking culture or aeration culture. The period of the anaerobic culture may be about 1 hour to 20 days, about 1 day to 10 days, or about 1 to 3 days.
藍藻が藍藻体内に有機酸を蓄積している場合、藍藻内から前記有機酸を採取すればよく、例えば、培養後の培養物から藍藻を回収し、藍藻の細胞を破砕して、その破砕物から、有機酸を採取すればよい。
藍藻が藍藻外に有機酸を放出している場合、培養後の培養物中から前記有機酸を採取すればよい。例えば、上記実施形態の藍藻を培養物で培養して有機酸を製造させ、培養後の培養物中からコハク酸及び／又は乳酸を採取してもよい。当該培養後の培養物は、遠心分離や濾過等の分離処理が施され藍藻が分離されたものであってもよく、藍藻が分離されていない状態であってもよい。分離処理された培養物中では、藍藻が完全に除かれてなくともよい。
When cyanobacteria accumulate organic acids in the cyanobacteria body, the organic acid may be collected from the cyanobacteria. For example, the cyanobacteria are collected from the cultured product, the cells of the cyanobacteria are crushed, and the crushed product The organic acid may be collected from the sample.
In the case where cyanobacteria have released an organic acid outside the cyanobacteria, the organic acid may be collected from the cultured product. For example, the cyanobacteria of the above embodiment may be cultured in a culture to produce an organic acid, and succinic acid and / or lactic acid may be collected from the cultured culture. The culture after the culture may be one in which cyanobacteria have been separated by performing a separation treatment such as centrifugation or filtration, or may be in a state in which cyanobacteria have not been separated. In the separated culture, the cyanobacteria may not be completely removed.
有機酸の採取と製造は同時に行われてもよく、別々に行われてもよい。有機酸の採取と製造が同時に行われる場合としては、例えば、有機酸を生産している藍藻の培養液の上清を回収して、有機酸を採取する場合が挙げられる。 The collection and production of the organic acid may be performed simultaneously or separately. Examples of the case where the organic acid is collected and manufactured simultaneously include, for example, the case where the organic acid is collected by collecting the supernatant of the culture solution of cyanobacteria producing the organic acid.
本実施形態の有機酸の製造方法は、採取した有機酸を精製することを含んでいてもよい。精製は、採取と同時におこなってもよく、採取した後におこなってもよい。精製の方法としては、例えば、結晶化精製によるもの、ＨＰＬＣによるクロマトグラフィーやイオン交換樹脂等のカラム精製によるもの等が挙げられる。 The manufacturing method of the organic acid of this embodiment may include refine | purifying the extract | collected organic acid. Purification may be performed at the same time as collection or after collection. Examples of the purification method include crystallization purification, HPLC chromatography, and column purification such as ion exchange resin.
本実施形態に係る藍藻は、光合成により二酸化炭素と光エネルギーを直接資源化でき、かつ有機酸の生産能に優れている。本実施形態の有機酸の製造方法によれば、藍藻により高効率に有機酸を製造することができる。そのため、従来法と比べ経済的にも環境的にも大変優れた方法である。 The blue-green algae according to the present embodiment can directly use carbon dioxide and light energy by photosynthesis and have excellent organic acid production ability. According to the method for producing an organic acid of this embodiment, an organic acid can be produced with high efficiency by cyanobacteria. Therefore, it is a method that is very excellent both economically and environmentally compared to the conventional method.
以下、本発明を、実施例を挙げて、より具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated more concretely, this invention is not limited to these.
１． ｈｏｘＨ発現抑制株の作製
・ｐＵＣ１１９へのクローニング
ＷＥＢ公開されたＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３株のゲノム情報（http://genome.microbedb.jp/cyanobase/Synechocystis）の、ｈｏｘＨの遺伝子情報（ＩＤ：ｓｌｌ１２２６）に基づき、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ． ＰＣＣ ６８０３株から、以下のプライマーセットでｈｏｘＨを増幅した［ｈｏｘＨＦ： ５’−ＴＴＣＣＧＣＡＴＧＣＴＴＡＣＡＡＧＡＴＣＣＧＧＣＴＴＴＣ−３’（配列番号３）、ｈｏｘＨＲ： ５’−ＴＴＡＡＧＡＴＡＴＣＡＧＣＣＣＧＴＴＧＣＣＧＡＴＡＴＴ−３’（配列番号４）］。ｈｏｘＨＦプライマーとｈｏｘＨＲプライマーには、それぞれ、ＳｐｈＩ（Ｆｏｒｗａｒｄ）サイト、ＥｃｏＲＶ（Ｒｅｖｅｒｓｅ）サイトを付けている。
増幅したｈｏｘＨをＳｐｈＩとＥｃｏＲＶで切断し、ｐＵＣ１１９プラスミドのＳｐｈＩ、ＳｍａＩサイトに導入し、得られたプラスミドをｐＵＣ−ｈｏｘＨと名付けた。
1. Construction of hoxH expression-suppressed strain and cloning into pUC119 Synechocystis sp. Based on the gene information (ID: sll1226) of hoxH in the genome information of PCC 6803 strain (http://genome.microbedb.jp/cyanobase/Synechocystis), Synechocystis sp. From PCC 6803 strain, hoxH was amplified with the following primer set [hoxHF: 5′-TTCCCGCATGCCTTACAAGATCCCGCTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 3), hoxHR: 5′-TTAAGATATCAGCCCGGTGCCCATTATT-3 ′ (SEQ ID NO: 4)]. The hoxHF primer and the hoxHR primer are provided with a SphI (Forward) site and an EcoRV (Reverse) site, respectively.
The amplified hoxH was cleaved with SphI and EcoRV, introduced into the SphI and SmaI sites of the pUC119 plasmid, and the resulting plasmid was named pUC-hoxH.
・プロモータと薬剤耐性マーカーの導入
ｐＴＧＰ２０３１Ｖプラスミドの薬剤マーカー領域及びプロモータ領域を、下記のプライマーセットで増幅した［ｐＵＣ−Ｒｅｇ４５−ＩｎｔｅｇＦ： ５’−ＴＡＴＴＣＴＧＧＧＣＣＣＴＴＴＧＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＣＧＡＧ−３’（配列番号５）、ｐＵＣ−Ｒｅｇ４５−ＩｎｔｅｇＲ： ５’−ＴＡＴＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＴＴＡＡＣ−３’（配列番号６）］。プライマーには、それぞれ、ＡｐａＩサイトを付けている。
上記で得られたｐＵＣ−ｈｏｘＨをＭｓｃＩで切断し、ＭｓｃＩサイトに上記で得られたｐＴＧＰ２０３１Ｖプラスミドの薬剤マーカー領域及びプロモータ領域を連結した。得られたプラスミドを、ｐＴＧＰ１２２６と名付けた。
ｐＴＧＰ１２２６では、ｈｏｘＨ遺伝子の構造遺伝子配列の一部に、薬剤マーカー及びプロモータの配列などが挿入された配列を有している。
-Introduction of promoter and drug resistance marker The drug marker region and promoter region of the pTGP2031V plasmid were amplified with the following primer set [pUC-Reg45-IntegrF: 5'-TATTCTGGCCCTTTGCTTCATCGCTCGAG-3 '(SEQ ID NO: 5), pUC-Reg45- IntegR: 5′-TATCAAGGGGCCCATCCAATGGAGGTTAC-3 ′ (SEQ ID NO: 6)]. Each primer is attached with an ApaI site.
The pUC-hoxH obtained above was cleaved with MscI, and the drug marker region and promoter region of the pTGP2031V plasmid obtained above were ligated to the MscI site. The resulting plasmid was named pTGP1226.
pTGP1226 has a sequence in which a drug marker, a promoter sequence, and the like are inserted in part of the structural gene sequence of the hoxH gene.
・形質転換
Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．ＰＣＣ ６８０３株をＢＧ−１１液体培地に植菌し、通常の培養条件（３０℃、１％ ＣＯ２、５０〜１００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ−２ｓ−１）で３〜４日培養した。ＯＤ７３０＝３〜４の培養物１００〜５００μＬに対し、上記で得られたｐＴＧＰ１２２６プラスミドを１００〜３００ｎｇ／μｌの濃度で含む溶液を１〜２μｌ加え、プラスミド混合培養液を得た。
ＢＧ−１１ ｐｌａｔｅ上に、ニトロセルロース膜（ミリポア、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＮＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＨＡＴＦ０８２５０、Ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ０．４５ μｍ、Ｃｕｔ ｓｉｚｅ ８２ｍｍ）を載せ、その上にプラスミド混合培養液を塗り広げ、一晩培養した。
終濃度３μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＢＧ−１１プレートに、上記培養後のメンブレンを移し３〜４週間培養した。得られたコロニーを別の上記ＢＧ−１１プレートに再播種して数日間培養した。培養及び再播種を２、３回繰り返した。ＢＧ−１１培地の組成を以下に示す。
-Transformation Synechocystis sp. The PCC 6803 strain was inoculated into a BG-11 liquid medium and cultured under normal culture conditions (30 ° C., 1% CO 2 , 50 to 100 μmol photons m −2 s −1 ) for 3 to 4 days. 1-2 μl of a solution containing the pTGP1226 plasmid obtained above at a concentration of 100-300 ng / μl was added to 100-500 μL of the culture with OD 730 = 3-4, thereby obtaining a plasmid mixed culture.
A nitrocellulose membrane (Millipore, Immobilon-NC, Cat. No. HATF08250, Pore size 0.45 μm, Cut size 82 mm) was placed on the BG-11 plate, and the plasmid mixed culture solution was spread on the plate. Cultured.
The membrane after the above culture was transferred to a BG-11 plate containing gentamicin at a final concentration of 3 μg / ml and cultured for 3 to 4 weeks. The obtained colonies were replated on another BG-11 plate and cultured for several days. Culturing and reseeding were repeated a few times. The composition of BG-11 medium is shown below.
２．ｈｏｘＨの発現解析
上記で得られた形質転換体候補株に対しｈｏｘＨ発現解析を行った。形質転換体候補株からｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、リアルタイムＰＣＲでｈｏｘＨのｍＲＮＡ量を測定した。ｈｏｘＨのｍＲＮＡ量の測定に用いたプライマーセットは、以下のとおりである［ｈｏｘＨＦ： ５’−ＧＧＣＡＡＴＴＴＧＧＣＣＡＡＡＣＧＧＴＡ−３’（配列番号７）、ｈｏｘＨＲ： ５’−ＴＣＣＡＣＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＣＴＧＣＣ−３’（配列番号８）］。
結果を図１に示す。発現解析の結果、野生型のＧＴ株と比べて、ｈｏｘＨのｍＲＮＡの発現量が約半分にまで低下したｈｏｘＨ発現抑制株（△ｈｏｘＨ）が得られたことが確認できた。
2. Expression analysis of hoxH hoxH expression analysis was performed on the transformant candidate strain obtained above. MRNA was extracted from the transformant candidate strain to synthesize cDNA, and the amount of hoxH mRNA was measured by real-time PCR. The primer sets used for measuring the amount of mRNA of hoxH are as follows [hoxHF: 5′-GGCAATTTGGCCAAACGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 7), hoxHR: 5′-TCCACAATCCATTGTTCTGCC-3 ′ (SEQ ID NO: 8)].
The results are shown in FIG. As a result of the expression analysis, it was confirmed that a hoxH expression-suppressed strain (ΔhoxH) in which the expression level of hoxH mRNA was reduced to about half compared to the wild type GT strain was obtained.
３．水素量の測定
上記ｈｏｘＨ発現抑制株又はＧＴ株を、ＯＤ７３０＝２０になるよう１０ ｍＬ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）に濃縮し、暗条件下の密閉容器内で３日間嫌気培養した。培養後の密閉容器内の気相に対し、ＧＣ−ＴＣＤ（ガスクロマトグラフ−熱伝導度検出器）を用いて水素量を測定した。
結果を図２に示す。野生型のＧＴ株と比べ、ｈｏｘＨ発現抑制株では密閉容器内に蓄積した水素量の値が低下していた。
3. Measurement of hydrogen amount The above hoxH expression-suppressed strain or GT strain was concentrated to 10 mL HEPES-KOH (pH 7.8) so that OD 730 = 20, and anaerobically cultured in a closed container under dark conditions for 3 days. The amount of hydrogen was measured using GC-TCD (gas chromatograph-thermal conductivity detector) for the gas phase in the sealed container after the culture.
The results are shown in FIG. Compared with the wild type GT strain, the value of the amount of hydrogen accumulated in the sealed container was decreased in the hoxH expression-suppressed strain.
４．＜実施例１＞有機酸の製造
（好機培養）
５０ ｍｌ程度のＢＧ−１１液体培地に、ｈｏｘＨ発現抑制株をプレートから植菌し、３０℃、空気（１％ＣＯ２）、白色光５０〜８０ μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓｍ−２ｓ−１の明条件で３〜４日間、前培養した。７０ｍｌ ＢＧ−１１０ （窒素源の入っていない培地） ＋５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌに、ＯＤ７３０＝０．４となるように、遠心して回収した前培養の細胞を加え、上記と同じ明条件で３日間培養した。３日間培養後の培地中のアンモニアの濃度は１ｍＭ以下（検出限界以下）であった。また、３日間培養後の藍藻の細胞は、低窒素条件下であっても、休眠していない状態であった。
（嫌気培養）
上記好機培養後の細胞を回収し、１０ｍＬの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）にＯＤ７３０＝２０となるよう、細胞を再懸濁した。この再懸濁物をガスクロバイアル瓶に入れ、ブチルゴムで密栓して栓にシリンジを２本連結した。片方のシリンジから、１時間Ｎ２ガスをガスクロバイアル瓶に吹き込み、瓶内の空気をＮ２ガスに置換した。Ｎ２ガスを止めてシリンジを栓から抜き、瓶をアルミ箔で覆い、密閉状態で３日間、暗条件で振盪培養し培養液を得た。ＢＧ−１１培地０＋５ｍＭ ＮＨ４Ｃｌの組成を以下に示す。
4). <Example 1> Production of organic acid (opportunity culture)
About 50 ml of BG-11 liquid medium is inoculated with a hoxH expression-suppressed strain from a plate, and 3 under light conditions of 30 ° C., air (1% CO 2 ), white light 50-80 μmol photonsm −2 s −1 Pre-cultured for ~ 4 days. 70 ml of BG-11 0 (medium not containing nitrogen source) +5 mM NH 4 Cl was added to the precultured cells collected by centrifugation so that OD 730 = 0.4, and for 3 days under the same light conditions as above Cultured. The concentration of ammonia in the medium after culturing for 3 days was 1 mM or less (below the detection limit). In addition, the cells of cyanobacteria after culturing for 3 days were not dormant even under low nitrogen conditions.
(Anaerobic culture)
The cells after the opportunity culture were collected, and the cells were resuspended in 10 mL of 20 mM Hepes-KOH (pH 7.8) so that OD 730 = 20. This resuspended product was put into a gas chromatography vial, sealed with butyl rubber, and two syringes were connected to the stopper. From one syringe, N 2 gas was blown into the gas chromatography vial for 1 hour, and the air in the bottle was replaced with N 2 gas. The N 2 gas was stopped, the syringe was removed from the stopper, the bottle was covered with aluminum foil, and the culture solution was obtained by shaking culture under dark conditions for 3 days in a sealed state. The composition of BG-11 medium 0 +5 mM NH 4 Cl is shown below.
＜参考例１＞
上記実施例１において、瓶内の空気をＮ２ガスに置換せず、嫌気培養に代えて好機培養を行った以外は、実施例１と同様にして培養を行い、培養液を得た。
<Reference Example 1>
In Example 1 above, the culture in the same manner as in Example 1 was carried out except that the air in the bottle was not replaced with N 2 gas and instead of anaerobic culture, the culture was performed to obtain a culture solution.
＜比較例１＞
上記実施例１において、ｈｏｘＨ発現抑制株に代えて野生株（ＧＴ株）を用いた以外は、実施例１と同様にして培養を行い、培養液を得た。
<Comparative Example 1>
In Example 1, except that a wild strain (GT strain) was used instead of the hoxH expression-suppressed strain, culture was performed in the same manner as in Example 1 to obtain a culture solution.
＜比較例２＞
上記比較例１において、瓶内の空気をＮ２ガスに置換せず、嫌気培養に代えて好機培養を行った以外は、比較例１と同様にして培養を行い、培養液を得た。
<Comparative example 2>
In Comparative Example 1 above, the culture in the same manner as in Comparative Example 1 was performed except that the air in the bottle was not replaced with N 2 gas, and instead of anaerobic culture, opportunity culture was performed to obtain a culture solution.
５−１．細胞内の有機酸量の測定
上記の暗条件で振盪培養して得られた実施例１、参考例１、比較例１及び比較例２の培養液のそれぞれを、ＯＤ７３０＝１×１０ｍｌ分サンプリングし、フィルター濾過し、フィルターに細胞を集めた。
１μＭの１０−カンファースルホン酸を含む５００μＬメタノールを氷冷したものを抽出液として用意した。この抽出液に上記のフィルターを浸して、ボルテックスミキサーを用いて２０秒間撹拌した。撹拌後の抽出液に、氷冷した５００μＬクロロホルム及び氷冷した２００μＬの滅菌水を加えた後、ボルテックスミキサーを用いて３０秒間撹拌し、その後１５，０００ｒｐｍ×５分， ４℃の条件で遠心分離させた。分離した上清３００μｌを新しいチューブに移し、１ｍＭ ピメリン酸を７μＬ加えたものを定法に沿って調製し、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）により成分を分析した。
5-1. Measurement of the amount of organic acid in cells Each of the culture solutions of Example 1, Reference Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 obtained by shaking culture under the above dark conditions was sampled for OD 730 = 1 × 10 ml. And filtered and cells were collected on the filter.
An ice-cooled 500 μL methanol containing 1 μM 10-camphorsulfonic acid was prepared as an extract. The filter was immersed in this extract and stirred for 20 seconds using a vortex mixer. After adding ice-cooled 500 μL chloroform and ice-cooled 200 μL sterilized water to the extract after stirring, the mixture is stirred for 30 seconds using a vortex mixer, and then centrifuged at 15,000 rpm × 5 minutes at 4 ° C. I let you. 300 μl of the separated supernatant was transferred to a new tube, 7 μL of 1 mM pimelic acid was added according to a conventional method, and components were analyzed by a gas chromatograph mass spectrometer (GC-MS).
結果を図３に示す。図３に示すグラフの縦軸は、サンプルに加えたピメリン酸の値を標準物質とし、比較例２の培養液（ＧＴ＿Ａｅｒｏｂｉｃ）から得られた藍藻の細胞内の各有機酸の濃度に対する相対値である。
実施例１の培養液から得られた藍藻（ｈｏｘＨ＿Ａｎａｅｒｏｂｉｃ）では、参考例１の培養液から得られた藍藻（ｈｏｘＨ＿Ａｅｒｏｂｉｃ）、比較例１の培養液から得られた藍藻（ＧＴ＿Ａｎａｅｒｏｂｉｃ）、及び比較例２の培養液から得られた藍藻（ＧＴ＿Ａｅｒｏｂｉｃ）と比べて、細胞内の有機酸（ピルビン酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸）の量が顕著に増加していることが明らかとなった。
The results are shown in FIG. The vertical axis of the graph shown in FIG. 3 is a relative value with respect to the concentration of each organic acid in the cells of cyanobacteria obtained from the culture solution (GT_Aerobic) of Comparative Example 2 using the value of pimelic acid added to the sample as a standard substance. is there.
In the cyanobacteria (hoxH_Anaerobic) obtained from the culture solution of Example 1, the cyanobacteria (hoxH_Aerobic) obtained from the culture solution of Reference Example 1, the cyanobacteria (GT_Anaerobic) obtained from the culture solution of Comparative Example 1, and Comparative Example 2 It was revealed that the amount of intracellular organic acids (pyruvic acid, lactic acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid) was remarkably increased as compared with cyanobacteria (GT_Aerobic) obtained from the culture solution of .
５−２．細胞外（培養物中）の有機酸量の測定
上記の暗条件で振盪培養して得られた実施例１及び比較例１の培養液のそれぞれを遠心分離し、上清１ｍｌを集めた。上清を凍結乾燥させ、得られた固体成分を移動相である３ｍＭ ＨＣｌＯ４溶液１００μｌに溶解し、これらを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） ＬＣ−２０００ Ｐｌｕｓ（日本分光）を用い、定法に沿って成分分析した。
5-2. Measurement of extracellular (in culture) organic acid amount Each of the culture solutions of Example 1 and Comparative Example 1 obtained by shaking culture under the above dark conditions was centrifuged, and 1 ml of the supernatant was collected. The supernatant was lyophilized, and the obtained solid component was dissolved in 100 μl of 3 mM HClO 4 solution as a mobile phase, and these were dissolved in accordance with a conventional method using high performance liquid chromatography (HPLC) LC-2000 Plus (JASCO). Component analysis was performed.
ＨＰＬＣの測定条件は以下のとおりである。
移動相：３ｍＭ過塩素酸水溶液
反応液：０．２ｍＭブロモチモールブルー（ＢＴＢ），１５ｍＭ リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＲＳｐａｋ ＫＣ−８１１ ｘ２
HPLC measurement conditions are as follows.
Mobile phase: 3 mM perchloric acid aqueous solution Reaction solution: 0.2 mM bromothymol blue (BTB), 15 mM sodium hydrogen phosphate (Na 2 HPO 4 · 12H 2 O)
Column: Shodex RSpak KC-811 x2
結果を図４に示す。図４に示すグラフの縦軸は、ＨＰＬＣにより得られた各有機酸の測定値を培養液１Ｌあたりの有機酸の量（ｍｇ／Ｌ）に換算した値である。
図４に示す結果から、ｈｏｘＨ発現抑制株により有機酸（コハク酸、乳酸）の細胞外生産が可能であることが示された。実施例１で得られた培養液（ｈｏｘＨ）では、比較例１で得られた培養液（ＧＴ）と比べて、培養液中の有機酸（コハク酸、乳酸）の量が顕著に増加していることが明らかとなった。
The results are shown in FIG. The vertical axis | shaft of the graph shown in FIG. 4 is the value which converted the measured value of each organic acid obtained by HPLC into the quantity (mg / L) of organic acid per 1L of culture solutions.
The results shown in FIG. 4 indicate that extracellular production of organic acids (succinic acid, lactic acid) is possible with the hoxH expression-suppressed strain. In the culture solution (hoxH) obtained in Example 1, the amount of organic acid (succinic acid, lactic acid) in the culture solution was significantly increased as compared with the culture solution (GT) obtained in Comparative Example 1. It became clear that
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。また、本発明は各実施形態によって限定されることはなく、請求項（クレーム）の範囲によってのみ限定される。 The configurations and combinations thereof in the embodiments described above are examples, and the addition, omission, replacement, and other modifications of the configurations can be made without departing from the spirit of the present invention. Further, the present invention is not limited by each embodiment, and is limited only by the scope of the claims.
Claims (10)
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有し、Ｈｏｘにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列との配列同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を有し、Ｈｏｘにおいてヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質 The method for producing an organic acid according to claim 2, wherein the hoxH gene is a gene encoding a protein selected from the group consisting of the following (a) to (c).
(A) A protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (b) In the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, an amino acid sequence in which 1 to several amino acids are substituted, deleted, inserted or added A protein having hydrogenase activity in Hox (c) a protein having an amino acid sequence having a sequence identity of 80% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having hydrogenase activity in Hox
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