JP2017048249A - 活性化血小板に対する組織因子の標的化 - Google Patents
活性化血小板に対する組織因子の標的化 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017048249A JP2017048249A JP2016236487A JP2016236487A JP2017048249A JP 2017048249 A JP2017048249 A JP 2017048249A JP 2016236487 A JP2016236487 A JP 2016236487A JP 2016236487 A JP2016236487 A JP 2016236487A JP 2017048249 A JP2017048249 A JP 2017048249A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acids
- seq
- sequence
- htf
- ptt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 title description 155
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 title description 155
- 230000008685 targeting Effects 0.000 title description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 266
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 266
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 claims abstract description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 460
- 101000797340 Homo sapiens Trem-like transcript 1 protein Proteins 0.000 claims description 241
- 102100032885 Trem-like transcript 1 protein Human genes 0.000 claims description 197
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 166
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 61
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 claims description 56
- 101000737793 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related antigen 1 Proteins 0.000 claims description 56
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 claims description 54
- 102100035361 Cerebellar degeneration-related protein 2 Human genes 0.000 claims description 43
- 101000737796 Homo sapiens Cerebellar degeneration-related protein 2 Proteins 0.000 claims description 43
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 34
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 34
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims description 29
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 claims description 15
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 114
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 110
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 abstract description 20
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 abstract description 16
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 abstract description 16
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 15
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 abstract description 13
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 10
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 abstract description 8
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 abstract description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 362
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 173
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 173
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 129
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 99
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 85
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 82
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 82
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 65
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 61
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 61
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 56
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 54
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 53
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 45
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 43
- 102000052455 human TREML1 Human genes 0.000 description 42
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 41
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 38
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 38
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 38
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 37
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 37
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 35
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 31
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 29
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 28
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 28
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 27
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 26
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 23
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 23
- 238000011161 development Methods 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 20
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 20
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 19
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 18
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 17
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 17
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 17
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 16
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 16
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 15
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 13
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 101000635804 Homo sapiens Tissue factor Proteins 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 11
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 11
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 11
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 11
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 102200098671 rs1041981 Human genes 0.000 description 11
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 10
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 10
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 10
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 10
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 10
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 10
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 10
- 102220061392 rs786203866 Human genes 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 9
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 8
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 8
- 229910052805 deuterium Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N Deuterium Chemical compound [2H] YZCKVEUIGOORGS-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 7
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 7
- 102200017272 rs28931576 Human genes 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 6
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 6
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 6
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 6
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 6
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 6
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 6
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 6
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 6
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 108010090444 Innovin Proteins 0.000 description 5
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 5
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 5
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 102220105280 rs879254406 Human genes 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 102220533605 Single-strand selective monofunctional uracil DNA glycosylase_M91A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 4
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 3
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 3
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 3
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102100025698 Cytosolic carboxypeptidase 4 Human genes 0.000 description 3
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 3
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 3
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 description 3
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 3
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 108010022425 Platelet Glycoprotein GPIIb-IIIa Complex Proteins 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 3
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 3
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 3
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 102200059996 rs137854890 Human genes 0.000 description 3
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XHTORJWGZKCDGL-GRGSLBFTSA-N (2s)-1-[(2r,3r)-2-amino-3-methylpentanoyl]-n-[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-(4-nitroanilino)-1-oxopentan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound CC[C@@H](C)[C@@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XHTORJWGZKCDGL-GRGSLBFTSA-N 0.000 description 2
- GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N (8R,11R,12R,13E,15S)-11,15-Dihydroxy-9-oxo-13-prostenoic acid Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 1,3-diisopropylcarbodiimide Chemical compound CC(C)N=C=NC(C)C BDNKZNFMNDZQMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102220556880 ATPase WRNIP1_L42A_mutation Human genes 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 2
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102220592449 Non-homologous end-joining factor 1_Q43A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 102220602177 Synaptotagmin-3_F54A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 201000000839 Vitamin K Deficiency Bleeding Diseases 0.000 description 2
- 206010047634 Vitamin K deficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000012556 adjustment buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000711 alprostadil Drugs 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000013011 aqueous formulation Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001977 collision-induced dissociation tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 108010089485 convulxin Proteins 0.000 description 2
- 238000002447 crystallographic data Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 2
- BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N diisopropylcarbodiimide Natural products CC(C)NC(=O)NC(C)C BGRWYRAHAFMIBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 2
- 229940125542 dual agonist Drugs 0.000 description 2
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 108010075079 isoleucyl-prolyl-arginine-4-nitroanilide Proteins 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 2
- WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N pentobarbital Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O WEXRUCMBJFQVBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N prostaglandin E1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1CCCCCCC(O)=O GMVPRGQOIOIIMI-DWKJAMRDSA-N 0.000 description 2
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000016794 vitamin K deficiency hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 2
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 2
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 2
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 2
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 2
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUVRGYVESPRHSZ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2-azaniumylethoxy)ethoxy]acetate Chemical compound NCCOCCOCC(O)=O RUVRGYVESPRHSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 1
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001593 Bernard-Soulier syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 101710204168 Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 208000028702 Congenital thrombocyte disease Diseases 0.000 description 1
- OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N Cys-Cys Chemical class SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O OABOXRPGTFRBFZ-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010017866 Gastritis haemorrhagic Diseases 0.000 description 1
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 1
- 206010059484 Haemodilution Diseases 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000932590 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010065042 Immune reconstitution inflammatory syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 108010022337 Leucine Enkephalin Proteins 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710159910 Movement protein Proteins 0.000 description 1
- 101710151833 Movement protein TGBp3 Proteins 0.000 description 1
- 101001033003 Mus musculus Granzyme F Proteins 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010000020 Platelet Factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100038394 Platelet glycoprotein VI Human genes 0.000 description 1
- 101710194982 Platelet glycoprotein VI Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241001493546 Suina Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102220522306 THAP domain-containing protein 1_K46A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220522314 THAP domain-containing protein 1_R41A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 208000001435 Thromboembolism Diseases 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 206010046788 Uterine haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007950 acidosis Effects 0.000 description 1
- 208000026545 acidosis disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 229940127218 antiplatelet drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003698 antivitamin K Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003549 asthenia Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229940105772 coagulation factor vii Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001425 electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000008497 endothelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006624 extrinsic pathway Effects 0.000 description 1
- 201000007386 factor VII deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000005376 factor X deficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000007219 factor XI deficiency Diseases 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003712 glycosamine group Chemical group 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 229960000900 human factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002631 hypothermal effect Effects 0.000 description 1
- 102000027596 immune receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008915 immune receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N leu-enkephalin Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1CC(N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 URLZCHNOLZSCCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 238000013178 mathematical model Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000013160 medical therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- -1 pH 7.5 Substances 0.000 description 1
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 1
- 101150093826 par1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229960001412 pentobarbital Drugs 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000004175 ponceau 4R Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000018338 positive regulation of fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229940019333 vitamin k antagonists Drugs 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
(i)少なくとも1つの組織因子ポリペプチドまたはその生物学的機能性変異体もしくは断片と、それが共有結合している、(ii)リガンドとを含む融合タンパク質であって、(ii)が、(iii)受容体および/またはその断片もしくは変異体と結合することができ、該受容体が活性化血小板の表面上でのみ発現している、融合タンパク質を提供する。融合タンパク質/構築物は、(i)組織因子またはその生物学的機能性変異体もしくは断片と、(iii)TLT-1と結合する、(ii)リガンドとを含んでよい。本発明によれば、(ii)は、モノクローナル抗体、またはモノクローナル抗体の抗原結合部分でよい。例えば、(ii)は、Fab断片、F(ab’)2断片、Fab’断片、Fd断片、Fv断片、dAb断片または単離相補性決定領域(CDR)からなる群から選択することができる。本発明によれば、(ii)は、0012(2F105)LCの可変ドメインを含んでよい。本発明によれば、(ii)は、0012(他に2F105と呼ばれる)LCの可変ドメインを、ヒトLC、カッパの定常領域、およびHPC4タグと一緒に含んでよい(pTT-0012LC.HPC4、pTT-2F105LC.HPC4とも呼ばれる)。
・配列番号41のアミノ酸50〜54(DYFMY)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸69〜85(YISNGGDSSSYPDTVKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸118〜129(NKNWDDYYDMDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号42のアミノ酸44〜60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸76〜82(WASTRES)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸115〜122(KQSYNLLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号43のアミノ酸50〜54(DYSMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号43のアミノ酸69〜85(VISTYYGDVRYNQKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号43のアミノ酸118〜129(APMITTGAWFAY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号44のアミノ酸44〜54(KASQSVSNDVA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号44のアミノ酸70〜76(YASSRYT)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号44のアミノ酸109〜117(QQDYSSPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号49のアミノ酸50〜54(SHWIE)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号49のアミノ酸69〜85(EILPGSGNTNYNEKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号49のアミノ酸118〜130(GYYGLNYDWYFDV)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号46のアミノ酸44〜54(RASQDISNYLN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号46のアミノ酸70〜76(YTSRLHS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号46のアミノ酸109〜117(QQDTKLPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号47のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号47のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYNPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号47のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号48のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号48のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号48のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号39のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号40のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号56のアミノ酸50〜54(NYWLG)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号56のアミノ酸69〜85(DIYPGGGYNKYNENFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号56のアミノ酸118〜128(EYGNYDYAMDS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む。
・配列番号57のアミノ酸44〜59(RSSRSLLHSNGNTYLC)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号57のアミノ酸75〜81(RMSNLAS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号57のアミノ酸114〜122(MQHLEYPFT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む。
を含む。
を含む。
を含む。
融合タンパク質「mAb 0012-(HC-L0-hTF.1-219)2;LC2」では:
・「mAb 0012」:モノクローナル抗体0012。
・「(HC-L0-hTF.1-219)2」:1つのhTF.1-219が各HCと融合している; hTF.1-219のN末端が重鎖のC末端と融合している。
・「L0」:リンカーは存在しない。
・LC2: 2つの軽鎖があり、それらは何とも融合していない。
融合タンパク質「mAb 0023-(HC-L4a-hTF.1-219)2;(LC-HPC4)2」では:
・「mAb 0023」はモノクローナル抗体0023である。
・「(HC-L4a-hTF.1-219)2」は、1つのhTF.1-219がリンカーを介して各HCと融合している;hTF.1-219のN末端がリンカーL4aのC末端と融合し、そのリンカーのN末端がmAbの重鎖のC末端と融合していることを示す。
・「(LC-HPC4)2」は、HPC4タグが各LCのC末端と融合していることを示す。
融合タンパク質「mAb 0012-(LC-L5-hTF.1-219)2;HC2」では:
・(LC-L5-hTF.1-219)2は、hTF.1-219のN末端がリンカーL5のC末端と融合し、そのリンカーのN末端が軽鎖のC末端と融合していることを示す。
・HC2は、2つの重鎖があり、それらは何とも融合していないことを示す。
融合タンパク質「mAb 0012-(hTF.1-219-L4b-LC)2;HC2」では:
・(hTF.1-219-L4b-LC)2は、hTF.1-219のC末端がリンカーL4bと融合し、そのリンカーが軽鎖のN末端と融合していることを示す。
融合タンパク質「Fab 0012-VH-CH1-L0-hTF.1-219;LC-HPC4」では:・「Fab 0012」:mAb 0012のFab断片。
・「VH-CH1-L0-hTF.1-219」:hTF.1-219のN末端がFab断片のVH-CH1ドメインと直接融合している。
・「HPC4」:精製タグが軽鎖のN末端にある。
融合タンパク質「Fab 0012-hTF.1-219-L4b-VH-CH1;LC-HPC4」では:
・「hTF.1-219-L4b-VH-CH1」:組織因子のC末端がリンカー4bのN末端と融合し、そのリンカーがFab断片のVH-CH1ドメインと融合していることを示す。
・融合タンパク質がFVII/FVIIaと結合する能力;
・融合タンパク質のTF構成成分が活性化血小板上でFVIIa媒介FX活性化を選択的に亢進する能力;
・融合タンパク質のTF構成成分がTLT-1濃縮リン脂質小胞上でFVIIa媒介FX活性化を亢進する能力;
・融合タンパク質が血友病様多血小板血漿中でフィブリンクロット形成を促進する能力・融合タンパク質が血友病様全血中でフィブリンクロット形成を促進する能力
を試験する方法が含まれる。in vivoでは、融合タンパク質は、ヒト血小板を輸血した血友病マウスにおける尾出血モデルで試験することができる。さらにin vivoでは、融合タンパク質は、ヒトTLT-1遺伝子を挿入した(TLT-1について「ヒト化した」)血友病マウスにおける尾出血モデルで試験することができる。
以下は、本発明の実施形態の非限定的なリストである。
・配列番号41のアミノ酸50〜54(DYFMY)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸69〜85(YISNGGDSSSYPDTVKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸118〜129(NKNWDDYYDMDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態24および25のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号42のアミノ酸44〜60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸76〜82(WASTRES)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸115〜122(KQSYNLLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態24から26のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号41のアミノ酸50〜54(DYFMY)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸69〜85(YISNGGDSSSYPDTVKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号41のアミノ酸118〜129(NKNWDDYYDMDY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つを異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号42のアミノ酸44〜60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸76〜82(WASTRES)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号42のアミノ酸115〜122(KQSYNLLT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つを異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態24から25のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号41のアミノ酸50〜54(DYFMY)のCDR1配列;
・配列番号41のアミノ酸69〜85(YISNGGDSSSYPDTVKG)のCDR2配列;および
・配列番号41のアミノ酸118〜129(NKNWDDYYDMDY)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、・配列番号42のアミノ酸44〜60(KSSQSLLNSRTRKNYLA)のCDR1配列;および
・配列番号42のアミノ酸76〜82(WASTRES)のCDR2配列;および
・配列番号42のアミノ酸115〜122(KQSYNLLT)のCDR3配列
を含む、実施形態28に記載の融合タンパク質。
・配列番号43のアミノ酸50〜54(DYSMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号43のアミノ酸69〜85(VISTYYGDVRYNQKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号43のアミノ酸118〜129(APMITTGAWFAY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態30から31のいずれか1つに記載の融合タンパク質。
・配列番号44のアミノ酸44〜54(KASQSVSNDVA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号44のアミノ酸70〜76(YASSRYT)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号44のアミノ酸109〜117(QQDYSSPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態30から32のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号43のアミノ酸50〜54(DYSMH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号43のアミノ酸69〜85(VISTYYGDVRYNQKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号43のアミノ酸118〜129(APMITTGAWFAY)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号44のアミノ酸44〜54(KASQSVSNDVA)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号44のアミノ酸70〜76(YASSRYT)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号44のアミノ酸109〜117(QQDYSSPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態30から31のいずれか1つに記載の融合タンパク質。
・配列番号43のアミノ酸50〜54(DYSMH)のCDR1配列;および
・配列番号43のアミノ酸69〜85(VISTYYGDVRYNQKFKG)のCDR2配列;および
・配列番号43のアミノ酸118〜129(APMITTGAWFAY)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号44のアミノ酸44〜54(KASQSVSNDVA)のCDR1配列;および
・配列番号44のアミノ酸70〜76(YASSRYT)のCDR2配列;および
・配列番号44のアミノ酸109〜117(QQDYSSPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態34に記載の融合タンパク質。
・配列番号49のアミノ酸50〜54(SHWIE)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号49のアミノ酸69〜85(EILPGSGNTNYNEKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号49のアミノ酸118〜130(GYYGLNYDWYFDV)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態36から37のいずれか1つに記載の融合タンパク質。
・配列番号46のアミノ酸44〜54(RASQDISNYLN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号46のアミノ酸70〜76(YTSRLHS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号46のアミノ酸109〜117(QQDTKLPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態36から38のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号49のアミノ酸50〜54(SHWIE)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号49のアミノ酸69〜85(EILPGSGNTNYNEKFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号49のアミノ酸118〜130(GYYGLNYDWYFDV)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号46のアミノ酸44〜54(RASQDISNYLN)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号46のアミノ酸70〜76(YTSRLHS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または・配列番号46のアミノ酸109〜117(QQDTKLPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態36から39のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号49のアミノ酸50〜54(SHWIE)のCDR1配列;および
・配列番号49のアミノ酸69〜85(EILPGSGNTNYNEKFKG)のCDR2配列;および
・配列番号49のアミノ酸118〜130(GYYGLNYDWYFDV)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号46のアミノ酸44〜54(RASQDISNYLN)のCDR1配列;および
・配列番号46のアミノ酸70〜76(YTSRLHS)のCDR2配列;および
・配列番号46のアミノ酸109〜117(QQDTKLPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態40に記載の融合タンパク質。
・配列番号47のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号47のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYNPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号47のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態42から45のいずれか1つに記載の融合タンパク質。
・配列番号48のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号48のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号48のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態42から46のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号47のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYNPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号47のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号48のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号48のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号48のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態42から47のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号47のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列;および
・配列番号47のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYNPSLKD)のCDR2配列;および
・配列番号47のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号48のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列;および
・配列番号48のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列;および
・配列番号48のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態48に記載の融合タンパク質。
・配列番号50のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号50のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYAPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号50のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号48のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号48のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号48のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態42から45のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号50のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列;および
・配列番号50のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYAPSLKD)のCDR2配列;および
・配列番号50のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、・配列番号48のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列;および
・配列番号48のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列;および
・配列番号48のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態50に記載の融合タンパク質。
・配列番号39のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態52から54のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号40のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態52から55のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号39のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号39のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号40のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または・配列番号40のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号40のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸で置換されていてもよい配列
を含む、実施形態52から56のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号39のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列;および
・配列番号39のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列;および
・配列番号39のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列
を含み、(ii)の軽鎖が、
・配列番号40のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列;および
・配列番号40のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列;および
・配列番号40のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列
を含む、実施形態57に記載の融合タンパク質。
・配列番号56のアミノ酸50〜54(NYWLG)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号56のアミノ酸69〜85(DIYPGGGYNKYNENFKG)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号56のアミノ酸118〜128(EYGNYDYAMDS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つもしくは3つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態21から23のいずれかに記載の融合タンパク質。
・配列番号57のアミノ酸44〜59(RSSRSLLHSNGNTYLC)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つもしくは4つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号57のアミノ酸75〜81(RMSNLAS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列;および/または
・配列番号57のアミノ酸114〜122(MQHLEYPFT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つもしくは2つが異なるアミノ酸により置換されていてもよい配列
を含む、実施形態21から23のいずれかに記載の融合タンパク質。
hTLT-1 ECD-His抗原のクローニングおよび発現。C末端His-6タグと一緒になった、ヒトTLT-1(hTLT-1)(図1)の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列を、コザック配列と一緒にHindIII認識部位を含有する順向プライマーならびに終止コドンおよびEcoRI認識部位を含有する逆向プライマーを用いてPCRで増幅した(図2)。HindIIIおよびEcoRIで消化したPCR断片を、pTTを基礎とする発現ベクターのHindIIIおよびEcoRI部位に挿入した。pTTベクターは、本質的に、Durocher, Y.ら、(2002年) Nucleic Acid Res、30巻:E9頁に記載されている。得られた発現プラスミドをpTT-hTLT-1 ECD-Hisと称した。hTLT-1 ECD-Hisを一過性に発現させるために、pTT-hTLT-1 ECD-HisをHEK293-6E浮遊細胞にトランスフェクトした。1% P/S(GIBCOカタログ番号15140-122)、0.1%プルロニック(GIBCO、カタログ番号24040-032)および25ug/mL Geneticin(GIBCO、カタログ番号10131-019)を補充したFreestyle HEK293培地(GIBCO、カタログ番号12338-018)中でHEK293-6E細胞を増殖させ、293fectin(Invitrogen、カタログ番号12347-019)を使用して1mill/mLの細胞密度で細胞をトランスフェクトした。1mgのpTT-hTLT-1 ECD-His DNAを30mLのOptimem中に希釈し(希釈液A)、1mlの293fectinを30mLのOptimem中に希釈する(GIBCO、カタログ番号51985-026、希釈液B)ことによって、各リットルのHEK293-6E細胞についてトランスフェクションを行った。希釈液AおよびBを混合し、室温で30分間インキュベートした。この後、そのトランスフェクションミックスをHEK293-6E細胞に添加し、軌道回転(125rpm)する加湿インキュベーター中で細胞を37℃でインキュベートした。トランスフェクション後7日目に、遠心分離によって細胞を除去し、得られたhTLT-1 ECD-Hisを含有する上清を精製前に滅菌濾過した。
hTLT1 ECD-Hisタンパク質の精製および特徴付け。1)コバルトを添加した樹脂TALON(Clontech、カタログ番号635506)を使用するHis-アフィニティークロマトグラフィー、および2)微粒子樹脂Source 15Q(GE Healthcare、カタログ番号17-0947)を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーから構成される2ステップのプロセスとしてhTLT1 ECD-Hisタンパク質の精製を行った。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を行った。第1の精製ステップに使用した緩衝系は、20mM Hepes、pH7.0、150 mM NaClから構成される平衡化緩衝液、20mM Hepes、pH 7.0、0.5 M NaClから構成される洗浄緩衝液、および20mM Hepes、pH 7.0、150mMイミダゾールから構成される溶出緩衝液であった。細胞上清を、何も調製せずに、予め平衡化したTALONカラムに直接かけた。20カラム容の平衡化緩衝液で、20カラム容の洗浄緩衝液で、最後に20カラム容の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。およそ5カラム容の溶出緩衝液中にタンパク質を均一濃度で溶出させた。SDS-PAGE/Coomassie NuPage 4〜12 % Bis-Trisゲル(Invitrogen、カタログ番号NP0321BOX) およびMicro-flexシステム(Bruker Daltonics)のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)の設定を使用して、溶出したタンパク質の分子量を分析した。ここで、ほとんど等しい量のおよそ16.7および33.4kDaの2つの異なるタンパク質の質量が観察された。観察された質量は、hTLT1 ECD-Hisのモノマーおよびダイマー形態に対応していた。タンパク質を還元すると、SDS-PAGE/Coomassie分析から判断されるように33.4kDaのタンパク質が完全に消失し、一方16.7kDaのタンパク質が増強された。したがって、hTLT-1 ECD-Hisタンパク質は、連結したC-Cダイマーを含有していた。ダイマーからモノマーを分離するために、第2の精製ステップを使用した。この精製ステップに使用した緩衝系は、50mM Hepes、pH 8.0から構成される平衡化緩衝液および50mM Hepes、pH 8.0、1M NaClから構成される溶出緩衝液であった。1M NaOHを使用して試料をpH8.0に調整し、次いでおよそ10mS/cmの伝導率に希釈した。タンパク質を、予め平衡化したSource 15Qカラムにかけ、5カラム容の平衡化緩衝液で洗浄し、20カラム容を超える0〜100%溶出緩衝液を使用して溶出した。UV280のモニタリングに基づいて、2つのピークがほとんどベースラインの分離で明らかとなった。SDS-PAGE/Coomassie、MALDI-TOF MSおよびDynapro機器(Wyatt Technology)を使用した動的光散乱(DLS)分析を使用してその2つのピークにわたる分画を分析すると、最初に溶出するピーク中にモノマーhTLT-1 ECD-Hisタンパク質の存在が、2番目に溶出するピーク中にCys-Cysダイマーの存在が示された。モノマーhTLT-1 ECD-Hisタンパク質のみを含有するプールを調製した。Agilent LC 1100/1200システムのサイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC-HPLC)法の設定に基づき、BIOSep-SEC-S3000 300×7.8mmカラム(Phenomenex、カタログ番号00H-2146-K0)ならびに200mMリン酸Na pH 6.9、300mM NaClおよび10%イソプロパノールから構成されるランニング緩衝液を使用して、最終的なタンパク質の完全性を分析した。保持時間およそ9.9分、流速1ml/分で、単一の対称的なピークとしてタンパク質が溶出した。
モノクローナルTLT-1抗体の調製。50μgのhTLT-1 ECD-Hisを注射することによって、RBFマウスを免疫感作した。経皮でのFCAに続いてFIA中のhTLT-1 ECD-His20μgを2回注射した。25μgのhTLT-1 ECD-Hisを用いて高応答マウスを静脈内で追加免疫し、3日後に脾臓を採取した。脾臓細胞をミエローマFox細胞系統と融合させた。特異的ELISA ならびにhTLT-1をトランスフェクトしたまたは偽トランスフェクトしたCHO細胞をそれぞれ陽性および陰性標的細胞として利用するFACSアッセイにおいて、hTLT-1特異的抗体産生について上清をスクリーニングした。ヒト、カニクイザル、イヌ、ウサギまたはマウス由来の休止対二重アゴニスト活性化血小板に対して二次スクリーニングを行った。
ハイブリドーマからの抗TLT-1 mAb LCおよびHC cDNAのクローニングおよび配列決定。0012Hyb(別名2F105/2F105A3)、0023Hyb、0051Hybおよび0052Hybと称する4つの異なる抗TLT-1 mAbを発現しているハイブリドーマから全RNAを抽出した。RNeasy miniキット(Qiagen、カタログ番号74106)を使用してハイブリドーマ細胞からRNAを抽出し、得られたRNAのアリコートを、5’RACEについて製造業者の使用説明書に従ってSMART RACE cDNA増幅キット(Clontech、カタログ番号634914)を使用し、5’RACE CDSプライマーAをSMART II A RNAオリゴヌクレオチドと一緒に使用する第1鎖cDNA合成の鋳型として使用した。この後、4つの抗TLT-1ハイブリドーマそれぞれの軽鎖(LC)および重鎖(HC)コード領域cDNAを、UPM順向プライマーミックスをマウスLC、カッパ特異的逆向プライマー(逆向プライマー番号339、348、または610)と一緒にまたはマウスIgG1、IgG2a、IgG2bもしくはIgG3配列を認識する逆向プライマー(逆向プライマー番号341、347、613、614、615、または616、プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)と一緒に使用して、PCRで増幅した。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号:F-531L)を使用してPCR反応を行った。配列決定用Zero blunt Topo PCRクローニングキット(Invitrogen、カタログ番号K287540)を使用して、得られたPCR断片をクローニングし、配列を決定した。0012LCおよびHCの可変ドメインの配列は図3に示されている。
pTT-0012HC、pTT-0023HC、pTT-0051HCおよびpTT-0052HC発現構築物の開発。4つの異なる抗TLT-1ハイブリドーマそれぞれから単離されたHC可変ドメイン(VH)をコードするDNA配列を、クローニングする目的でHinDIII制限酵素部位を含有する順向プライマーおよびNheI制限酵素部位を含有する逆向プライマーを用いてPCRで増幅した。以下のプライマー番号の対:490(順向)+491(逆向)、546(順向)+547(逆向)、627(順向)+628(逆向)、および617(順向)+618(逆向、プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)それぞれを用いて、phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用して0012VH、0023VH、0051VHおよび0052VH DNA配列をPCRで増幅し、ヒトIgG4 HCの定常領域をコードする配列(すなわちCH1-ヒンジ-CH2-CH3)を含有する、pTT-hIgG4と称するpTTを基礎とするベクター(図22+23)のHinDIIIおよびNheI制限酵素部位にそれを挿入した。pTTベクターは、本質的に、Durocher, Y.ら、(2002年) Nucleic Acid Res、30巻:E9頁に記載されている(図22)。得られたベクターを、pTT-0012HC(図5)、pTT-0023HC、pTT-0051HC、およびpTT-0052HCと称した。発現ベクターによってコードされる抗TLT-1 HCアミノ酸配列が示されている(配列番号:0012HC:39、0023HC:41、0051HC:43、0052HC:45)。
pTT-0012LC、pTT-0023LC、pTT-0051LCおよびpTT-0052LC発現構築物の開発。4つの異なる抗TLT-1ハイブリドーマそれぞれから単離されたLC可変ドメイン(VL)をコードするDNA配列を、クローニングする目的でHinDIII制限酵素部位を含有する順向プライマーおよびBsiWI制限酵素部位を含有する逆向プライマーを用いてPCRで増幅した。以下のプライマー番号の対:493(順向)+495(逆向)、548(順向)+549(逆向)、492(順向)+494(逆向)、および619(順向)+620(逆向プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)それぞれを用いて、0012VL、0023VL、0051VLおよび0052VL DNA配列をPCRで増幅し、ヒトLC、カッパの定常領域をコードする配列を含有する、pTT-hLC、カッパと称するpTTを基礎とするベクター(図24)のHinDIIIおよびBsiWI制限酵素部位にそれを挿入した。得られたベクターを、pTT-0012LC、pTT-0023LC、pTT-0051LC、およびpTT-0052LCと称した。発現ベクターによってコードされる抗TLT-1 LC アミノ酸配列が(配列番号:0012LC:40、0023LC:42、0051LC:44、0052LC:46)に示されている。
pTT-0012HC.T60N、pTT-0012HC.T60A、pTT-0012LC.C36AおよびpTT-0052HC.C91Yの開発。0012VHアミノ酸配列は、潜在的なN結合グリコシル化部位(T60、kabatの番号付け)を含有し、0012VLおよび0052VHアミノ酸配列は不対のCys(それぞれC36およびC91、kabatの番号付け)をそれぞれ含有する。製造業者の使用説明書に従って部位特異的突然変異生成(Quickchange II、Stratagene、カタログ番号20523-5)を使用して、0012HC.T60Nまたは0012HC.T60Aまたは0012LC.C36Aまたは0052HC.C91Yをコードする発現ベクターを開発した。a)pTT-0012HC.T60Nについては鋳型であるpTT-0012HC DNAおよびプライマー番号682(順向)+683(逆向)、b)pTT-0012HC.T60Aについては鋳型であるpTT-0012HC DNAおよびプライマー番号688(順向)+689(逆向)、c)pTT-0012LC.C36Aについては鋳型であるpTT-0012LC DNAおよびプライマー番号598(順向)+599(逆向)、d)pTT-0052HC.C91Yについては鋳型であるpTT-0052HC DNAおよび以下のプライマー番号684(順向)+685(逆向、プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)を使用して、部位特異的突然変異生成反応を行った。DNA配列を検証するために、得られた発現ベクターの配列を決定した。pTT-0012HC.T60N、pTT-0012HC.T60AおよびpTT-0012LC.C36A発現ベクターによってコードされる抗TLT-1 HCおよびLCアミノ酸配列は、(配列番号:0012HC.T60N:47、0012HC.T60A:50、0012LC.C36A:48)に示されている。
pTT-0012LC-HPC4、pTT-0012LC.C36A-HPC4、pTT-0023LC-HPC4、pTT-0051LC-HPC4およびpTT-0052LC-HPC4発現構築物の開発。4つの異なる抗TLT-1ハイブリドーマそれぞれから単離されたVLをコードするDNA配列を、クローニングする目的でHinDIII制限酵素部位を含有する順向プライマーおよびBsiWI制限酵素部位を含有する逆向プライマーを用いてPCRで増幅した。以下のプライマー番号:493(順向)+495(逆向)、548(順向)+549(逆向)、492(順向)+494(逆向)、および619(順向)+620(逆向、プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)それぞれを用いて、phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用して0012VL、0012VL.C36A、0023VL、0051VLおよび0052VL DNA配列をPCRで増幅した。順向プライマー番号486および逆向プライマー番号485を用いて、ヒトCL、カッパをコードする配列をPCRで増幅した。クローニングする目的で順向プライマー番号486はBsiWI 制限酵素部位を含有し、逆向プライマー485はHPC4タグ(配列番号69)、その後に終止コドンをコードし、3’に隣接するEcoRI部位を含有する。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用してPCR反応を行った。HindIII+BsiWIで消化した0012VL PCR断片を、BsiWI+EcoRIで消化したヒトCL、カッパ-HPC4 PCR断片と混合し、pTTを基礎とする発現ベクターのHinDIII+EcoRI部位にそれを挿入してpTT-0012LC-HPC4が得られた(図4)。残っている3つの抗TLT-1 LC配列のLC-HPC4バージョンをコードする、対応する発現ベクターを開発するために、pTT-0012LC-HPC4中の0012VL配列をHinDIII+BsiWIで切り出し、HinDIII+BsiWIで消化した0023VL、0051VL、0052VLおよび0012VL.C36A PCR断片と置き換えた。得られた4つの発現ベクターを、pTT-0023LC-HPC4、pTT-0051LC-HPC4、pTT-0052LC-HPC4およびpTT-0012LC.C36A.HPC4と称した。
pTT-0012VH-CH1、pTT-0012VH-CH1-HPC4、pTT-0023VH-CH1、pTT-0023VH-CH1-HPC4、pTT-0051VH-CH1、pTT-0051VH-CH1-HPC4、pTT-0052VH-CH1およびpTT-0052VH-CH1-HPC4発現構築物の開発。0012Hyb、0023Hyb、0051Hyb、0052Hybから単離された0012VH、0023VH、0051VH、および0052VH配列を、プライマー番号:490(順向)+491(逆向)、546(順向)+547(逆向)、627(順向)+628(逆向)、617(順向)+618(逆向、プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)それぞれを用いて、phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用してPCRで増幅した。クローニングする目的で全ての順向プライマー(490、546、627、および617)がHinDIII部位を含有し、全ての逆向プライマー(491、547、628、および618)がNheI部位を含有していた。プライマー番号489(順向)+488(逆向)、またはプライマー番号489(順向)+487(逆向)を用いて、ヒトIgG4 CH1領域をPCRで増幅した。クローニングする目的で順向プライマー番号489はNheI部位を含有し、488逆向プライマー番号は終止コドンおよびEcoRI部位を含有し、487逆向プライマー番号はHPC4タグをコードする配列、終止コドン、その後にEcoRI部位を含有していた。HinDIII+NheIで消化した0012VH PCR断片を、NheI+EcoRIで消化したヒトIgG4 CH1 PCR断片またはNheI+EcoRIで消化したヒトIgG4 CH1-HPC4 PCR断片と組み合わせ、pTTを基礎とするベクターのHindIII+EcoRI部位にクローニングした。得られたベクターを、それぞれpTT-0012VH-CH1およびpTT-0012VH-CH1-HPC4と称した。その後、HindIII+NheI消化によってpTT-0012VH-CH1およびpTT-0012VH-CH1-HPC4のVHドメインを切り出し、HinDIII+NheIで消化した0197-0000-0023VH、0197-0000-0051VHおよび0197-0000-0052VH PCR断片を挿入した。得られた発現ベクターを、pTT-0023VH-CH1、pTT-0023VH-CH1-HPC4、pTT-0051VH-CH1、pTT-0051VH-CH1-HPC4、pTT-0052VH-CH1、およびpTT-0052VH-CH1-HPC4と称した。
pTT-0012VH.T60N-CH1およびpTT-0012VH.T60N-CH1-HPC4発現構築物の開発。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、クローニングする目的でHinDIII制限酵素部位を含有する順向プライマー番号572およびEcoRI部位を含有する逆向プライマー番号488またはクローニングする目的でEcoRI部位と一緒にHPC4タグをコードする配列を含有する逆向プライマー487(プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)を使用して、pTT-0012HC.T60Nから0012VH.T60N-CH1配列(シグナルペプチドをコードする配列を含む)をPCRで増幅した。得られたPCR断片をHinDIII+EcoRIで消化し、pTTを基礎とするベクターのHinDIII+EcoRI部位にそれを挿入した。得られた発現ベクターを、pTT-0012VH.T60N-CH1およびpTT-0012VH.T60N-CH1-HPC4と称した。
pTT-L4a-hTF.1-219およびpTT-hTF. 1-219-L4b発現構築物の開発。N末端の17アミノ酸Gly-Serリンカー(L4a:GSGGGGSGGGGS GGGGS、配列番号61)、およびシグナルペプチドをコードする配列を除くヒト組織因子の細胞外ドメイン(hTF.1-219、配列番号14)をコードする発現構築物を作製した。最初に、phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、L4aをコードするDNA配列を含有するプライマー番号466(順向)および逆向プライマー449(プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)を使用して、hTF.1-219 cDNA配列をPCRで増幅してL4a-hTF.1-219 PCR断片が得られた。プライマー番号483(順向)および449(逆向)を用いて、第1のPCR断片を鋳型として使用して第2のPCR増幅ステップを行った。第2のPCRステップは、クローニングする目的でPCR断片にHinDIIIとEcoRIの両方の部位を取り込むために行った。得られたPCR断片はL4a-hTF.1-219をコードし、将来クローニングする目的でGly-Serリンカーの一部として(L4a中の下線の配列)BamHI部位を含有していた。pTTを基礎とするベクターのHinDIIIおよびEcoRI部位にDNA断片を挿入し、得られたベクターをpTT-L4a-hTF. 1-219と称した(図25)。
pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219、pTT-hTF.1-219-L4b-0012LCおよびpTT-0012LC.C36A-L4a-hTF.1-219発現構築物の開発。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、順向プライマー番号493および逆向プライマー番号552を使用して、pTT-0012LCから0012LC cDNA(シグナルペプチドをコードする配列を含む)をPCRで増幅した。クローニングする目的で順向プライマー493は5’末端HinDIII制限酵素部位を挿入し、逆向プライマー552は3’末端BamHI制限酵素部位を挿入していた(プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)。得られた0012LC PCR断片をpTT-L4a-hTF.1-219のHinDIII+BamHI部位に挿入して、pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219と称する、0012LC-L4a-hTF.1-219をコードする発現ベクターが得られた。
pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219およびpTT-hTF.1-219-L4b-0012HC発現構築物の開発。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、順向プライマー番号490および逆向プライマー番号513を使用して、pTT-0012HCから0012HC配列(シグナルペプチドをコードする配列を含む)をPCRで増幅した。クローニングする目的で順向プライマー490は5’末端HinDIII制限酵素部位を挿入し、逆向プライマー513は3’末端BamHI制限酵素部位を挿入していた。0012HC PCR断片をpTT-L4a-hTF.1-219のHinDIII+BamHI部位に挿入して、pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219と称する、0012HC-L4a-hTF.1-219発現構築物が得られた。
pTT-0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219およびpTT-hTF.1-219-L4b-0012VH-CH1構築物の開発。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、順向プライマー番号490および逆向プライマー番号514を使用して(プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)、pTT-0012HCから0012VH-CH1コードするDNA配列(シグナルペプチドをコードする配列を含む)をPCRで増幅した。クローニングする目的で順向プライマー490は5’末端HinDIII制限酵素部位を挿入し、逆向プライマー514は3’末端BamHI制限酵素部位を挿入していた。0012VH-CH1 PCR断片をpTT-L4a-hTF.1-219のHinDIII+BamHI部位に挿入して、pTT-0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219と称する、0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219発現構築物が得られた(図6)。
リンカーの長さが異なるpTT-0012LC-TF:L0(無リンカー)、L1(2GS)、L2(7GS)、L3(12GS)、L5(22GS)、L6 (27GS)、L7(32GS)、L8(37GS)、L9(42GS)の開発。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、5’末端HinDIII部位を含有する順向プライマー番号574 および長さが5 GSのGSリンカー+BamHI部位(逆向プライマー番号590)、10GS+BamHI部位(逆向プライマー番号585)、15GS(逆向プライマー番号583)+BamHI部位、20GS+BamHI部位(逆向プライマー番号584)、25GS+BamHI部位(逆向プライマー番号591、プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)のどちらかをコードする3’末端配列を含有する逆向プライマーを使用して、0012LC cDNA配列(シグナルペプチドをコードする配列を含む)をPCRで増幅した。得られた0012LC PCR断片をHinDIII+BamHIで消化し、それをpTT-L4a-hTF.1-219に挿入して、pTT-0012LC-L5-hTF.1-219(22GSリンカー)、pTT-0012LC-L6-hTF.1-219(27GSリンカー)、pTT-0012LC-L7-hTF.1-219(32GSリンカー)、pTT-0012LC-L8-hTF.1-219(37GSリンカー)およびpTT-0012LC-L9-hTF.1-219(42GSリンカー)と称する発現ベクターが得られた。
リンカーの長さが異なるpTT-0023LC-TF:L3(12GS)、L4a(17GS)、L5(22GS)、L6 (27GS)、L7(32GS)、L8(37GS)、L9(42GS)の開発。HinDIII+BsiWI制限酵素を使用してpTT-0023LCから0023VL cDNA配列(シグナルペプチドをコードする配列を含む)を切り出し、それをpTT-0012LC-L3-hTF.1-219(12GSリンカー)、pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219(17GSリンカー)、pTT-0012LC-L5-hTF.1-219(22GSリンカー)、pTT-0012LC-L6-hTF.1-219(27GSリンカー)、pTT-0012LC-L7-hTF.1-219(32GSリンカー)、pTT-0012LC-L8-hTF.1-219(37GSリンカー)およびpTT-0012LC-L9-hTF.1-219(42GSリンカー)のHinDIII+BsiWI制限酵素部位に挿入し、すなわち0012VL cDNA配列を0023VLと置き換えた。得られた発現ベクターを、pTT-0023LC-L3-hTF.1-219(12GSリンカー)、pTT-0023LC-L4a-hTF.1-219(17GSリンカー)、pTT-0023LC-L5-hTF.1-219(22GSリンカー)、pTT-0023LC-L6-hTF.1-219(27GSリンカー)、pTT-0023LC-L7-hTF.1-219(32GSリンカー)、pTT-0023LC-L8-hTF.1-219(37GSリンカー)およびpTT-0023LC-L9-hTF.1-219(42GSリンカー)と称した。
リンカーの長さが異なるpTT-0023HC-TF:L1(2GS)、L2(7GS)、L3(12GS)、L4a(17GS)、L5(22GS)、L6 (27GS)、L7(32GS)、L8(37GS)、L9(42GS)の開発。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、5’末端HindIII制限酵素部位を含有する順向プライマー番号546、および1)BamHI部位と一緒に5GSをコードする配列を含有する逆向プライマー番号592、または2)BamHI部位と一緒に10GSをコードする配列を含有する逆向プライマー番号589、または3)BamHI部位と一緒に15GSをコードする配列を含有する逆向プライマー番号587、または4)BamHI部位と一緒に20GSをコードする配列を含有する逆向プライマー番号588、または5)BamHI部位と一緒に25GSをコードする配列を含有する逆向プライマー番号593(プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)を使用して、0023HC cDNA配列(シグナルペプチドをコードする配列を含む)をPCRで増幅した。得られたPCR断片をHinDIII+BamHIで消化し、それをpTT-0012LC-L4a-hTF.1-219のHinDIII+BamHI制限酵素部位に挿入し、すなわち0012LCをコードする配列を置き換えた。得られた発現ベクターを、pTT-0023HC-L5-hTF.1-219(22GSリンカー)、pTT-0023HC-L6-hTF.1-219(27GSリンカー)、pTT-0023HC-L7-hTF.1-219(32GSリンカー)、pTT-0023HC-L8-hTF.1-219(37GSリンカー)、pTT-0023HC-L9-hTF.1-219(42GSリンカー)と称した。
リンカーの長さが異なるpTT-0012HC-TF:L0(無リンカー)、L1(2GS)、L2(7GS)、L3(12GS)、L5(22GS)、L6 (27GS)、L7(32GS)、L8(37GS)、L9(42GS)の開発。HinDIII+NheIを使用してpTT-0012HCから0012VHをコードするcDNA配列を切り出し、得られたcDNA断片をpTT-0023HC-L1-hTF.1-219、pTT-0023HC-L2-hTF.1-219、pTT-0023HC-L3-hTF.1-219、pTT-0023HC-L5-hTF.1-219、pTT-0023HC-L6-hTF.1-219、pTT-0023HC-L7-hTF.1-219、pTT-0023HC-L8-hTF.1-219またはpTT-0023HC-L9-hTF.1-219に挿入し、すなわち0023VHを置き換えた。得られた発現ベクターを、1)pTT-0012HC-L1-hTF.1-219、pTT-0012HC-L2-hTF.1-219、pTT-0012HC-L3-hTF.1-219、pTT-0012HC-L5-hTF.1-219、pTT-0012HC-L6-hTF.1-219、pTT-0012HC-L7-hTF.1-219、pTT-0012HC-L8-hTF.1-219またはpTT-0012HC-L9-hTF.1-219と称した。
pTT-0012VH-CH1-L10-hTF.1-219、pTT-0012VH.T60N-CH1-L10-hTF.1-219およびpTT-0012VH.T60A-CH1-L10-hTF.1-219の開発。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、5’末端HindIII制限酵素部位を含有する順向プライマー番号572およびhTF.1-219の5’末端配列の一部を含有する逆向プライマー番号686を使用して、pTT-0012HCプラスミドから0012VH-CH1-ヒンジcDNA配列(シグナルペプチドをコードする配列を含む) をPCRで増幅した。逆向プライマー686は、pTT-0012HCプラスミドのhIgG4ヒンジ領域とアニールし、2つの遊離システインを除去するために2つの点突然変異C239SおよびC242S(Kabatの番号付け)を取り込んでいた。クローニングする目的で0012VH-CH1-ヒンジcDNAの3’末端の配列を含有する順向プライマー番号687およびEcoRI制限酵素部位を含有する逆向プライマー番号449(プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)を使用して、ヒトTF.1-219 cDNA配列をPCRで増幅した。得られた0012VH-CH1-ヒンジcDNAおよびhTF.1-219 PCR断片を組み合わせ、順向プライマー番号572および逆向プライマー番号449を使用する第2のPCR反応(重複PCR)での鋳型としてそれを使用した。得られた0012VH-CH1-ヒンジ-hTF.1-219をコードするPCR断片をHindIII+EcoRIで消化し、pTTを基礎とする発現ベクターにそれを挿入して、pTT-0012VH-CH1-L10-hTF.1-219と称する発現ベクターが得られた。
pTT-0012VH-CH1-L0-hTF.1-219の開発。phusion PCRミックス(FinnZymes、カタログ番号F-531L)を使用し、HinDIIIを含有する順向プライマー番号572、およびhTF.1-219 cDNA配列の5’末端と重複しているDNA配列を含有する逆向プライマー番号702を使用して、pTT-0012HCプラスミドから0012VH-CH1をコードするDNA配列をPCRで増幅した。クローニングする目的で0012VH-CH1の3’末端cDNA配列と重複しているcDNA配列を含有する順向プライマー番号701およびEcoRI制限酵素部位を含有する逆向プライマー番号449を使用して、hTF.1-219 cDNA配列をPCRで増幅した。得られたPCR断片を組み合わせ、順向プライマー番号572および逆向プライマー番号449を使用する第2のPCR反応(重複PCR)でそれを使用した。得られたPCR断片をHinDIII+EcoRIで消化し、pTTを基礎とする発現ベクターのHinDIII+EcoRI制限部位にそれを挿入して、pTT-0012VH-CH1-無リンカー-hTF.1-219と称する発現ベクターが得られた。
pTT-0023VH-CH1-L4a-hTF.1-219、pTT-0051HC-L4a-hTF.1-219、pTT-0051VH-CH1-L4a-hTF.1-219、pTT-0052HC-L4a-hTF.1-219およびpTT-0052VH-CH1-L4a-hTF.1-219の開発。HinDIII+NheI制限酵素を使用して、pTT-0023HC、pTT-0051HCまたはpTT-0052HCから0023VH、0051VHおよび0052VH cDNA配列を切り出した。得られたDNA断片をpTT-0012HC-L4a-hTF.1-219またはpTT-0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219のHinDIII+NheI制限酵素部位に挿入し、すなわち0012VH DNA配列を置き換えた。得られた発現ベクターを、pTT-0023VH-CH1-L4a-hTF.1-219、pTT-0051HC-L4a-hTF.1-219、pTT-0051VH-CH1-L4a-hTF.1-219、pTT-0052HC-L4a-hTF.1-219およびpTT-0052VH-CH1-L4a-hTF.1-219と称した。
pTT-0051LC-L4a-hTF.1-219およびpTT-0052LC-L4a-hTF.1-219の開発。HinDIII+BsiWI制限酵素を使用して、pTT-0051LCまたはpTT-0052LCから0051VLおよび0052VL cDNA配列を切り出した。得られたDNA断片をpTT-0012LC-L4a-hTF.1-219のHinDIII+BsiWI制限酵素部位に挿入し、すなわち0012VL DNA配列を置き換えた。得られた発現ベクターを、pTT-0051LC-L4a-hTF.1-219またはpTT-0052LC-L4a-hTF.1-219と称した。
pTT-アイソタイプ対照LC-L4a-hTF.1-219、pTT-アイソタイプ対照LC-HPC4、pTT-アイソタイプ対照HC-L4a-hTF.1-219、pTT-アイソタイプ対照HC、pTT-アイソタイプ対照VH-CH1-HPC4、およびpTT-アイソタイプ対照VH-CH1-L4a-TFの開発。アイソタイプ対照FabまたはmAb配列に基づいてhTF.1-219融合タンパク質を発現させるために、抗トリニトロフェニル(ATNP)CDR配列に基づいてVHおよびVL cDNA配列を回収した。ATNP VL配列を以下のプラスミド:pTT-0012LC、pTT-0012LC-HPC4およびpTT-0012LC-L4a-hTF.1-219のHinDIII+BsiWI制限酵素部位に挿入し、すなわち0012VL配列を置き換えて、以下の発現プラスミド:pTT-アイソタイプ対照-LC、pTT-アイソタイプ対照-LC-HPC4およびpTT-アイソタイプ対照-LC-L4a-hTF.1-219が得られた。
pTT-AP-3LC-17GS-TF.1-219、pTT-AP-3LC.C34S-17GS-TF.1-219およびpTT-AP-3VH-CH1-HPC4の開発。抗GPIIbIIIa mAbを発現しているAP-3ハイブリドーマをATCCから購入し(ATCC番号:HB-242)、AP3 LCおよびHCの可変ドメインをコードする配列を決定した。RNeasy miniキット(Qiagen、カタログ番号74106)を使用してAP-3ハイブリドーマ細胞から全RNAを単離し、SMART RACE(clontech、カタログ番号PT3269-1)、Primescript逆転写酵素(Takara Bio Inc、コード番号2680A)を使用し、5-CDSプライマーおよびSMART IIAオリゴヌクレオチド(どちらもSMART RACEキットに含まれている)を用いて第1鎖cDNAを作製した。LCについてはプライマー番号69と一緒にUPMプライマーミックス(SMART RACEキットに含まれている)を、HCについてはプライマー番号312と一緒にUPMプライマーミックスを使用して(プライマー配列は配列番号70〜155に示されている)、LCおよびHC可変ドメイン配列をPCRで増幅した。製造業者の使用説明書に従って配列決定用Zeroblunt Topo PCRクローニングキット(Invitrogen、カタログ番号K287520)を使用して、PCR断片を配列決定ベクターにクローニングした。
HEK293-6E細胞の一過性トランスフェクション。発現プラスミドを細胞に一過性にトランスフェクトすることによって、全てのmAb、Fab、およびhTF.1-219融合タンパク質をHEK293-6E浮遊細胞中で発現させた。得られた特定のタンパク質化合物の根底にある個々のプラスミドの組合せはTable 6(表6)に示されている。1% P/S(GIBCOカタログ番号15140-122)、0.1%プルロニック(GIBCO、カタログ番号24040-032)および25ug/mL Geneticin(GIBCO、カタログ番号10131-019)を補充したFreestyle HEK293培地(GIBCO、カタログ番号12338-018)中でHEK293-6E細胞を増殖させ、製造業者の使用説明書に従って293fectin(Invitrogen、カタログ番号12347-019)を使用しておよそ1mill/mLの細胞密度で細胞をトランスフェクトした。簡潔に述べると、合計1mgのDNAを30mLのOptimem中に希釈し(希釈液A)、1mlの293fectinを30mLのOptimem中に希釈する(GIBCO、カタログ番号51985-026、希釈液B)ことによって、各リットルのHEK293-6E細胞についてトランスフェクションを行った。希釈液AおよびBを混合し、室温で30分間インキュベートした。この後、そのトランスフェクションミックスをHEK293-6E細胞に添加し、軌道回転(125rpm)する加湿インキュベーター中で細胞を37℃でインキュベートした。トランスフェクション後5〜7日目に、遠心分離によって細胞を除去し、得られた細胞培養上清を精製前に滅菌濾過した。2つの発現プラスミドの同時トランスフェクションを使用する全ての一過性トランスフェクション実験で、トランスフェクトする各リットルのHEK293-6E細胞について総DNA量1mgを使用して1:1(ug:ug)のプラスミド比でプラスミドを同時にトランスフェクトした。タンパク質0120および0121(Table 6(表6))の発現では、1:1:1(ug:ug:ug)のプラスミド比でHEK293-6E細胞に3つの発現プラスミドを同時にトランスフェクトした。
pcDNA3.1(+)-hTLT-1 ECD-HPC4 ala突然変異プラスミド。table 7(表7)に従って40種のhTLT-1 ECD-HPC4 Ala突然変異発現構築物を設計した。外部請負業者GENEART AG(Im Gewerbepark B35、93059 Regensburg、Germany)によって発現構築物が開発され、40種の発現構築物は全て、pcDNA3.1(+)と称する発現ベクターを基礎として作製された。各hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突然変異タンパク質(Table 7(表7))を一過性に発現させるために、40種のhTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+)発現構築物それぞれのDNAのアリコートをHEK293-6E浮遊細胞にトランスフェクトした。HEK293-6E細胞の一過性トランスフェクションおよび培養は、実施例Zに記載のように行った。
モノクローナル抗TLT-1抗体の精製および特徴付け。Protein A MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare、カタログ番号17-5438-01)を使用するアフィニティークロマトグラフィー、および26/60 Superdex 200 PrepGradeカラム(GE Healthcare、カタログ番号17-1071-01)を使用するゲル濾過クロマトグラフィーから構成される2ステップのプロセスによって、table 1(表1)に記載の組換えにより発現させた7つのモノクローナル抗TLT-1抗体の精製を行った。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を行った。アフィニティー精製ステップに使用した緩衝系は、20mMリン酸Na pH7.2、150mM NaClから構成される平衡化緩衝液、10mMギ酸、pH3.5から構成される溶出緩衝液、および0.5Mリン酸Na pH9.0から構成されるpH調整緩衝液であった。細胞上清を、何も調製せずに、予め平衡化したMabSelect SuReカラムに直接かけた。15カラム容の平衡化緩衝液でカラムを洗浄し、およそ2〜5カラム容の溶出緩衝液中にモノクローナル抗体を均一濃度で溶出させた。溶出後直ちに、記載したpH調整緩衝液を使用して、プールした分画を中性pHに調整した。前記ゲル濾過カラムを使用してタンパク質をさらに精製し緩衝液を交換した。サイズ排除クロマトグラフィーに使用したランニング緩衝液は、25mM His pH6.5、135mM NaClであった。使用した流速は2.5ml/分であり、モノクローナル抗TLT1抗体がおよそ0.4カラム容で単一のピークとして溶出した。前述のSEC-HPLC法(実施例2に記載されている)を使用したピーク全体にわたる分画の分析に基づいて、およそ8.5分で対称的なピークとして溶出する純粋な抗体タンパク質を含有し、初期に溶出する高分子量タンパク質の含量が最小限であるプールを調製した。
組換えにより発現させたFab-hTF.1-219タンパク質の精製および特徴付け。抗HPC4樹脂(Roche、カタログ番号11815024001)を使用するアフィニティークロマトグラフィーおよび最終的な緩衝液シフトから構成される2ステップのプロセスを使用して、table 6(表6)で概略を示したFab-hTF.1-219融合タンパク質の精製を行った。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を行った。精製ステップに使用した緩衝系は、20mM Hepes、pH7.5、1.0mM CaCl2、100 mM NaClおよび0.005(体積)%Tween-80から構成される平衡化緩衝液、20mM Hepes、pH7.5、1.0mM CaCl2、1.0M NaClおよび0.005(体積)%Tween-80から構成される洗浄緩衝液、ならびに20mM Hepes、pH7.5、5.0mM EDTAおよび100mM NaClから構成される溶出緩衝液であった。終濃度1mM CaCl2で細胞上清をpH7.5に調整し、予め平衡化した抗HPC4カラムにかけた。5カラム容の平衡化緩衝液で、5カラム容の洗浄緩衝液で、最後に5カラム容の平衡化緩衝液でカラムを洗浄した。およそ4カラム容の溶出緩衝液中にFab-hTF1-219タンパク質を均一濃度で溶出させた。上述のように(実施例1および28に記載のように)SDS-PAGE/Coomassie、SEC-HPLCおよびMALDI-TOF MS分析を使用してFab-hTF1-219タンパク質を分析し、分子量78〜86kDaの純粋かつ均質なタンパク質が得られたことが示された。Fab-hTF1-219構築物のアミノ酸配列の理論的な質量が73〜77kDaであるため、発現させた全てのタンパク質は翻訳後修飾を含有していた。Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette 10kDa MWCO(Pierce、カタログ番号66453)を使用してPBS緩衝液に、もしくは25mM His、135mM NaCl、pH6.5から構成される緩衝液に透析することによって、または適当なカラムに詰めた脱塩樹脂Sephadex G-25(GE、カタログ番号17-0033)を使用することによって、アッセイ分析用にタンパク質を調製した。最終的なタンパク質濃度を測定するために、NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)を、吸光係数1.31〜1.47と一緒に使用した。
組換えにより発現させたmAb-hTF.1-219タンパク質の精製および特徴付け。Protein A MabSelect SuRe樹脂(GE Healthcare、カタログ番号17-5438-01)または抗HPC4樹脂(Roche、カタログ番号11815024001)に基づくアフィニティークロマトグラフィーから構成される2ステップのプロセスによって、table 6(表6)に記載のmAb-hTF.1-219融合タンパク質の精製を行った。hTF.1-219が重鎖とC末端で融合したmAb-hTF.1-219構築物の精製には抗HPC4樹脂を使用した。これらは、化合物0197-0000-0013、0197-0000-0018、0197-0000-0086、0197-0000-0087、0197-0000-0088、0197-0000-0089、0197-0000-0090、0197-0000-0091、0197-0000-0092、0197-0000-0093、0197-0000-0034、0197-0000-0056、0197-0000-0060、0197-0000-0096、および0197-0000-0116を含んでいた。残っているtable 6(表6)に記載のmAb-hTF.1-219融合タンパク質は、Protein A MabSelect SuRe樹脂を使用して精製した。最終仕上げの精製としてゲル濾過クロマトグラフィー法を使用した。ここで、26/60 Superdex 200 PrepGradeカラム(GE Healthcare、カタログ番号17-1071-01)を使用した。全ての精製は、AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して行い、本質的に前述のクロマトグラフィーの手順に基づいていた。mAb-hTF.1-219タンパク質がおよそ0.4カラム容で単一のピークとして溶出した。前述のSEC-HPLC分析法を使用したピーク全体にわたる分画の分析に基づいて、およそ9分で対称的なピークとして溶出する純粋なタンパク質を含有し、初期に溶出する高分子量タンパク質の含量が最小限であるプールを調製した。
0120と称するヘテロダイマータンパク質の精製および特徴付け。1)Ni-NTA樹脂(QIAGEN、カタログ番号30430)を使用するHis-アフィニティークロマトグラフィー、2)HiPrep 26/10脱塩カラム(GE Healthcare、カタログ番号17-5087-01)を使用する緩衝液交換、3)Q Sepharose_HP(GE Healthcare、カタログ番号17-1014-03)を使用する陰イオン交換クロマトグラフィー、および4)HiLoad 16/60 Superdex 200(GE Healthcare、カタログ番号17-1069-01)を使用するサイズ排除クロマトグラフィーから構成される4ステップのプロセスとして、table 6(表6)中で番号0120と称するヘテロダイマータンパク質の精製を行った。AktaExplorerクロマトグラフィーシステム(GE Healthcare、カタログ番号18-1112-41)を使用して精製を行った。第1の精製ステップに使用した緩衝系は、50mM Tris、pH7.5、300mM NaCl、10mMイミダゾールから構成される平衡化緩衝液、および50mM Tris、pH7.5、300mM NaCl、500mMイミダゾールから構成される溶出緩衝液であった。終濃度10mMイミダゾールで細胞上清をpH7.5に調整し、予め平衡化したNi-NTAカラムにかけた。4カラム容の2%溶出緩衝液でカラムを洗浄した。およそ4カラム容の60%溶出緩衝液中にタンパク質を均一濃度で溶出させた。UV280モニタリングに基づく主要なピークを収集しプールした。第2のステップでは、脱塩カラムを使用して50mM Tris、pH7.5緩衝液にシフトすることにより、陰イオン交換クロマトグラフ用にタンパク質を調製した。第3の精製ステップに使用した緩衝系は、50mM Tris、pH7.5から構成される平衡化緩衝液、および50mM Tris、pH7.5、1M NaClから構成される溶出緩衝液であった。第2のステップのプールを、予め平衡化したQ Sepharose HPカラムに直接かけ、2カラム容の平衡化緩衝液で洗浄し、10カラム容にわたる0〜100%溶出緩衝液の勾配、その後3カラム容の100%溶出緩衝液中に溶出させた。主要なピークを収集しプールした。第4のステップで使用した緩衝液はPBSであった。ステップ3のタンパク質のプールをHiLoad 16/60 Superdex 200カラムに直接かけた。主要なピークを収集し-80℃で貯蔵した。SDS-PAGE/Coomassie 8〜15%分析、SEC-HPLCおよびLC-MSから、純粋なタンパク質が得られたことが示された。1つの濃いタンパク質バンドがSDS-PAGE/Coomassie分析から観察され、これは前記ヘテロダイマータンパク質複合体に対応していた。タンパク質を還元すると、タンパク質複合体のバンドが完全に消失し、一方タンパク質複合体の3つのサブユニットを示す3つのバンドが出現した。Waters LC 2795/2996システムのSEC-HPLC法の設定に基づき、BIOSep-SEC-S3000 300×7.8mmカラム(Phenomenex、カタログ番号00H-2146-K0)およびPBSから構成されるランニング緩衝液を使用して、最終的なタンパク質の完全性を分析した。保持時間およそ8.2分、流速1ml/分で、単一の対称的なピークとしてタンパク質が溶出した。最終的なタンパク質濃度を測定するために、NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)を、吸光係数1.34と一緒に使用した。各サブユニットの分子量はLC-MSによって決定した。LCサブユニットの質量デコンボリューション(mass deconvolution)は、予想された値と等しい質量を示した。HC-Hisサブユニットの質量デコンボリューションは、G0F、G1FおよびG2F N-グリカンで予想された値と等しい質量を示した。組織因子の重いグリコシル化により、Fc-sTFの質量スペクトルシグナルは低すぎてデコンボリューションできなかった。
0121と称するヘテロダイマータンパク質の精製および特徴付け。番号121と称するヘテロダイマータンパク質の精製は、本質的に、ヘテロダイマー番号120について記載されたものと同じであった。ここで、3カラム容の平衡化緩衝液中でタンパク質を洗浄し、8カラム容にわたる0〜40%溶出緩衝液の勾配、その後3カラム容の100%溶出緩衝液中に溶出させた。この勾配溶出により、確実にFc-Hisホモダイマーとヘテロダイマーが完全に分離されるようにした。SDS-PAGE/Coomassie 8〜15%、SEC-HPLCおよびLC-MSから、純粋なタンパク質が得られたことが示された。1つの濃いタンパク質バンドがSDS-PAGE/Coomassieで観察され、これは前記ヘテロダイマータンパク質複合体に対応していた。タンパク質を還元すると、タンパク質複合体のバンドが完全に消失し、一方タンパク質複合体の3つのサブユニットを示す3つのバンドが出現した。Waters LC 2795/2996システムのSEC-HPLC法の設定に基づき、BIOSep-SEC-S3000 300×7.8mmカラム(Phenomenex、カタログ番号00H-2146-K0)およびPBSから構成されるランニング緩衝液を使用して、最終的なタンパク質の完全性を分析した。保持時間およそ8.2分、流速1ml/分で、単一の対称的なピークとしてタンパク質が溶出した。最終的なタンパク質濃度を測定するために、NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific)を、吸光係数1.34と一緒に使用した。各サブユニットの分子量はLC-MSによって決定した。FC-Hisサブユニットの質量デコンボリューションは、G0F、G1FおよびG2F N-グリカンで予想された値と等しい質量を示した。HCサブユニットの質量デコンボリューションは、観察された質量がG0F、G1FおよびG2F N-グリカンに対応していたが、C末端のLys切断にも対応していたことを示した。組織因子の重いグリコシル化により、LC-sTFの質量スペクトルシグナルは低すぎてデコンボリューションできなかった。
TF融合タンパク質とFVIIaの結合。アミド分解アッセイを使用して、FVIIaの活性を刺激する能力によりTF融合タンパク質とFVIIaの結合を試験した。その効果を、hTF.1-219と同一である可溶性TF(sTF)によって誘導される刺激と比較した。TFとFVIIaが結合すると、FVIIaの触媒活性が著明に増大する;好都合なことに、発色基質S2288(Ile-Pro-Arg-pNA)を用いたFVIIaのアミド分解活性を使用してsTFおよびTF構築物の結合を測定した。hTF.1-219とFVIIaの結合は、FVIIaの触媒活性を増大させる。FVII/FVIIaが活性化血小板の表面に位置するようにTF融合タンパク質を設計した。したがって、タンパク質とTFの融合は、FVIIaとその結合に著しい影響を及ぼさないはずであり、非融合TF(hTF.1-219)で得られたものと同一の、最適な条件下でTF融合タンパク質によって誘導されるFVIIa活性の濃度依存的な刺激が予想される。図7では、50nM FVIIa、50mM Hepes、0.1M NaCl、5mM CaCl2、1mg/ml BSA pH 7.4および様々な濃度(0〜100nM)のsTF(白抜きの四角)またはFab-TF融合タンパク質(白抜きの記号)またはmAb-TF融合タンパク質(黒の記号)を用いたアッセイでTF融合タンパク質を試験した。1mMの発色基質S2288を用いてFVIIaアミド分解活性を測定した。室温における405nmでの吸光度の増大によりFVIIaの活性を測定し、1mM S2288の添加により反応を開始した。Fab-hTF.1-219融合タンパク質は、hTF.1-219によって誘導されるものと区別できない濃度依存的な形でFVIIaアミド分解活性を刺激し、このことは、これらの構築物が、1:1の化学量論で、hTF.1-219と類似する親和性でFVIIaと結合することを示している。同様に、mAb-hTF.1-219融合タンパク質は、hTF.1-219と同一の濃度依存的な形でFVIIaの活性を刺激する。しかし、この場合化学量論は、これらの構築物が、mAb-TF融合タンパク質上の両方のTF部分に自由に到達することで予想されるように、1つのmAb当たり2つのFVIIaと結合することを示す。
mAb結合およびTLT-1との結合についての様々なmABの競合。
材料:
対象とするmAbを、CM5チップに直接、またはCM5チップに固定化されたヒトFc捕捉mAbを介した捕捉により固定化した。使用した試薬はtable 8(表8)に示されている。
mAb 0061、0023、0051および0062の結合定数をBiacore分析によって概算した(table 9(表9)を参照)。
mAb 0061およびmAB 0051は、結合について他のmAbのいずれとも競合しない(table 10(表10)を参照)。mAb 0023およびmAb 0062は互いに競合する(table 10(表10)を参照)。
FACS分析による活性化血小板との結合。以下に記載するように、FACS分析による活性化血小板との結合は、TLT-1をトランスフェクトした細胞と特異的に活性化した血小板の両方と結合することを示した。
TF融合タンパク質とTLT-1受容体の結合による活性化前の血小板の表面へのFVIIa/TF複合体の局在化によるFVIIa媒介FX活性化の亢進。TF融合タンパク質が活性化血小板上でFVIIa媒介活性化を特異的に刺激する能力は、図9Aにおいて2ステップのアッセイで試験した。TF融合タンパク質がFVIIからFVIIaへの活性化も媒介する能力は、図9Bにおいて試験した。この目的で、Biopal(REF 50710、ロットR088001)の凍結乾燥(活性化)血小板を使用した。終濃度が血小板数67.000/μlの血小板の不在下または存在下で、2ステップのアッセイでFX活性化を測定した。50mM Hepes、0.1M NaCl、5mM CaCl2、1mg/ml BSA pH 7.4中で100pM rFVIIa(LASa 15860-008)を175nM FX(Enzyme Research、ヒト第X因子、HFX 3170 PAL)と室温で混合した。アリコートを各ウェルから除去して10分後にFX活性化を停止し、等体積の氷冷停止緩衝液(50mM Hepes、0.1M NaCl、20mM EDTA、1mg/ml BSA pH 7.5)を添加した。次いで、50μlの混合物をマイクロタイタープレートのウェルに移し、25μlのChromozyme X(最終0.42mg/ml)をウェルに添加することにより、発色アッセイにおいて試料中で生じたFXaの量を決定した。マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で、405nmでの吸光度を連続的に測定した。図9Aは、血小板の不在下または存在下でのFVIIa媒介FX活性化に対するi)0.03nM Innovin(登録商標)、ii)10nM hTF.1-219、iii)10nM 0011 Fab-hTF.1-219、iv)10nM 0010 Fab抗体またはv)10nM 0012 mAb抗体の効果を示す。図9Bは、アッセイ中のrFVIIaを酵素前駆体のrFVIIと置き換えた効果を示す。
TLT-1受容体との結合による活性化血小板の表面へのFVIIa/TF複合体の局在化によるFVIIa媒介FX活性化の亢進。
図10Aにおいて、様々な濃度の休止または活性化血小板の存在下で、0011 hTF.1-219融合タンパク質およびhTF.1-219を2ステップのアッセイで(実施例36を参照)試験した。(休止血小板ではなく)活性化血小板は、その表面上にTLT-1受容体を露出した。TLT-1受容体に対するTF融合タンパク質の標的化の結果、活性化血小板のリン脂質表面上でのFX活性化の刺激に好ましい位置にTF/FVIIa複合体が集合すると考えられる。図10Bは、0011 hTF.1-219融合タンパク質を、TLT-1抗体をアネキシンV(AV)に置き換えた、0.1nMのAV-hTF.1-219融合タンパク質に置き換えた際の結果を示す。
活性化血小板上でのFX活性化の刺激に対するFVII/FVIIaおよびTF標的化構築物の濃度の効果。血友病患者において仮定される凝固促進効果を有するTLT-1標的化TF融合タンパク質は、生理的な条件で優勢な条件下で機能し、血中でFVII/FVIIa組成物を利用することができるはずである。実施例36に記載のアッセイを用いて、様々な濃度のFVII/FVIIa(図11)および様々な濃度のTF融合タンパク質(図12)で、活性化血小板上でのFXのFVIIa媒介活性化に対するTF融合タンパク質の刺激効果を調べることが可能であった。図に示されているように、添加したrFVIIaまたはrFVIIの存在下で刺激が得られた。
20:80のPS:PC小胞の調製ならびにTLT-1のクローニング、発現、リフォールディングおよび再脂質付加。TFの代わりにTLT-1を使用した以外はSmithおよびMorrissey(2005年)、J. Thromb. Haemost.、2巻、1155〜1162頁に記載のように、界面活性剤としてTriton X-100を使用して20:80のPS:PC小胞中の再脂質付加TLT-1を調製した。
Sub. Lab. BaのLB培地。カナマイシン(50mg/ml)。カナマイシンSigma K-0254
1000mM IPTG(IPTG Sigma 1-6758)
溶解緩衝液:50mM Tris-HCl、100mM NaCl、2mM EDTA、pH8.0中のBugbuster(Novagen)。0.5mg/mlリゾチーム+DNAseIを添加。1×完全インヒビターカクテル(Roche)を添加
IB洗浄緩衝液1:IB緩衝液中の1:10 bugbuster。50μg/mlリゾチーム+0.5×完全インヒビターカクテル(Roche)を添加IB洗浄緩衝液2:IB緩衝液中の1:10 Bugbuster
IB緩衝液:50mM Tris-HCl、100mM NaCl、2mM EDTA、pH8.0
GndHCl緩衝液:6MグアニジウムHCl、50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.1%Triton X-100 red.、pH8.0
リフォールディング緩衝液:50mM Tris-HCl、800mMアルギニン、0.1%Triton X-100 red.、5mM還元型グルタチオン、0.5mM酸化型グルタチオン、pH8.5
透析緩衝液:20mM Tris-HCl、0.1%Triton X-100 Red.、pH8.0
DTT:還元型グルタチオン(Sigma G4251)、酸化型グルタチオンSigma G4376
PC:クロロホルム中の10mg/ml L-α-ホスファチジルコリン(卵、ニワトリ)(Avanti Polar Lipids Inc.)カタログ番号840051C。Mw 760.09
PS:クロロホルム中の10mg/ml L-α-ホスファチジルセリンナトリウム塩(脳、ブタ)(Avanti Polar Lipids Inc.)カタログ番号840032C。Mw 812.05
Triton X-100:10%Triton X-100、水素化、タンパク質グレード界面活性剤、滅菌濾過。Calbiochemカタログ番号648464、濃度159mM(Mw 628)
HBS緩衝液:50mM HEPES、100mM NaCl、pH7.4
Bio-Beads:Bio-Beads SM2 Adsorbent、20〜50メッシュ、BioRad Laboratoriesカタログ番号152-3920。
発現:プライマー1004(配列番号183)および1005(配列番号184)ならびに鋳型であるpTT-hTLT-1を使用して、細胞外ドメイン、リンカーおよび膜貫通ドメインを含むTLT-1(TLT-1 18-188;配列番号182)をpET24aにクローニングした。DNA調製の標準的な技術を使用した。
TLT-1濃縮リン脂質小胞に基づくFX活性化スクリーニングアッセイの確立。実施例37に記載の新鮮に精製した血小板の使用は、原理の証明をするのによく合っている。しかし、個々のドナー由来の活性化血小板を用いて、大量の一連のTLT-1標的化TF融合タンパク質をスクリーニングし順位付けることは最適でない。各血小板調製物は、限られた数の試験しか行えず、ドナー間の変動にもさらされる。活性化精製血小板の代わりにTLT-1濃縮リン脂質小胞を使用して代替のFX活性化スクリーニングアッセイを確立する。小胞の表面は、活性化血小板のリン脂質の組成を模倣するように構成される。
抗TLT-1-mAbまたはその分画との融合に最適な条件を決定するためのTF融合タンパク質のスクリーニングは、薬物候補の選択に有用である。TLT-1濃縮リン脂質小胞を用いたアッセイは、大量の一連のTF融合タンパク質の包括的なスクリーニングを可能にした。実施例41で適用したFX活性化法で得られたデータとの比較により、このスクリーニングによって得られたデータの傾向も試験した。活性化血小板の各調製物を用いて得られた刺激を、100%に設定した、0020 Fab-hTF.1-219融合タンパク質を用いて得られた刺激と比較した。同じ相対スケールを、TLT-1濃縮リン脂質小胞を用いたアッセイに使用した。そのようなスクリーニングの結果を図27A(mAB融合タンパク質)および27B(Fab融合タンパク質)で比較する。
T F融合タンパク質は、血友病様全血中でフィブリンクロット形成を促進する。クエン酸塩で安定化した正常なヒト全血(HWB)を、10μg/ml抗FVIII抗体(ヒツジ抗ヒト第VIII因子;Hematologic Technologies Inc)とともに室温で30分間インキュベートすることによって、血友病様の状態が得られた。クエン酸塩添加HWBの再石灰化後の自発的な凝固が、抗FVIII抗体の存在によって強く阻害された。TF融合タンパク質をHWBに添加して、これらのタンパク質が、抗FVIII抗体をHWBに添加することによって誘導される血友病様の状態を反転させる能力を実証した。
TLT1-Fab0043-TFは、ヒト血小板を輸血したFVIII-KOマウスにおいて尾出血を低減した。ヒト血小板を輸血した血友病マウス(FVIII-KOマウス)における尾出血モデルでTLT-1-Fab0043-TF構築物の効果を試験した。
TLT1とフィブリノーゲンの結合およびTLT1 mAbとフィブリノーゲンの間の結合の競合の分析。TLT-1はフィブリノーゲンと結合し、これはSPR分析によって試験される。さらに、Biacore T100機器でのSPR分析によって、フィブリノーゲンならびに4つのmAb:mAb 0012、mAb 0023、mAb 0051およびmAb 0062のそれぞれの同時結合を試験した。
供給業者によって推奨される標準的な手順を使用して、ヒトTLT1をおよそ1000RUのレベルまでCM5チップ上に固定化した(酢酸Na、pH 4.0で希釈した50μg/ml)。固定化されたTLT1との結合について200nM〜0.2nMのヒトフィブリノーゲンの4倍希釈物を試験した。ランニングおよび希釈緩衝液:10mM HEPES、150mM、0.005% p20、pH 7.4。10mMグリシン、pH 1.7によって再生を行った。Biacore T100評価ソフトウェアを使用して、TLT1およびフィブリノーゲンの1:1の相互作用を想定して動態および結合定数(kon、koff、KD)の決定を行った。
フィブリノーゲン(HCI-0150R)はフィブリノーゲンと結合する。mAb 0023およびmAb 0062はこの結合部位と競合する。mAb 0012およびmAb 0051は競合しない。
水素交換質量分析(HX-MS)によるエピトープマッピング。HX-MS技術を使用して、4つのモノクローナル抗体mAb 0023、mAb 0051、mAb 0062およびmAb 0061によってカバーされるTLT-1結合エピトープを同定した。
機器類およびデータ記録
HX実験は、重水素交換反応の開始、反応時間の調節、失活反応、UPLCシステムへの注射、および消化時間の調節を行う、LeapShellソフトウェア(Leap Technologies Inc.)によって作動するLeapロボット(H/D-x PAL;Leap Technologies Inc.)によって自動化された。Leapロボットは、2つの温度調節スタックを備え、これらはそれぞれ緩衝液貯蔵およびHX反応用に20℃に維持され、タンパク質および失活溶液の貯蔵用に2℃に維持されていた。Leapロボットは、1℃でペプシン、プレおよび分析カラム、ならびにLCチューブおよび切替弁を保持する冷却Trio VSユニット(Leap Technologies Inc.)をさらに含有していた。切替弁は、HPLCからMicrobore UHPLC切替弁(Cheminert, VICI AG)にアップグレードした。インラインのペプシン消化では、200pmolのTLT-1を含有する100μLの失活試料を添加し、均一濃度の流速200μL/分(0.1%ギ酸:CH3CN 95:5)を使用してPoroszyme(登録商標)固定化ペプシンカートリッジ(2.1×30mm(Applied Biosystems))を通過させた。得られたペプチドを捕らえ、VanGuardプレカラムBEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters Inc.))で脱塩した。その後、弁を切り替えて、分析カラムUPLC-BEH C18 1.7μm (2.1×100mm(Waters Inc.))とインラインのプレカラムを配置し、AQUITY UPLCシステム(Waters Inc.)から150μL/分で送達される15〜40%Bの9分の勾配を使用してペプチドを分離した。移動相は、A:0.1%ギ酸およびB:CH3CN中の0.1%ギ酸からなっていた。ESI MSデータ、および個別データ依存的MS/MS取得(CID)および高エネルギー(MSE)実験を、Q-Tof Premier MS(Waters Inc.)を使用して陽イオンモードで取得した。ロイシン-エンケファリンをロック質量として使用し(m/z 556.2771で[M+H]+イオン)、データを連続モードで収集した。
標準的なCID MS/MSまたはMSE法(Waters Inc.)を使用して別々の実験で消化ペプチドを同定した。BiopharmaLynx 1.2(017版)を使用してMSEデータを処理した。Mass-Lynxソフトウェアおよび社内MASCOTデータベースを使用してCIDデータ依存的MS/MS取得を分析した。
対応する重水素化緩衝液(すなわちD2Oで調製したPBS、最終96%D2O、pH7.4(非補正値))中へのmAb 0023の存在下または不在下でhTLT-1.20-125の30倍希釈物によってアミド水素/重水素交換(HX)を開始した。HX反応は全て20℃で実施され、2.4μM mAb 0023の不在下または存在下で4μM hTLT-1.20-125を含有し、それによってmAb結合部位が1.2倍モル過剰となった。10秒〜8時間の適当な時間間隔で、最終pHが2.6(非補正値)となる等体積の氷冷失活緩衝液(1.35M TCEP)によってHX反応のアリコートを失活させた。
hTLT-1.20-125を使用して別々の実験でmAb 0051およびmAb 0062のエピトープマッピングを行い、上記に記載のmAb 0023のマッピングと同様に実施した。
hTLT-1.16-162タンパク質またはhTLT-1.126-162ペプチドを使用して、2つの別々の実験でmAb 0061のエピトープマッピングを行った。
mAb 0023のエピトープマッピング
TLT-1の一次配列を100%カバーする20個のペプチドのHX時間経過を10秒〜8時間にかけてmAb 0023の存在下または不在下でモニタリングした。
TLT-1の一次配列を100%カバーする22個のペプチドのHX時間経過を10秒〜1000秒にかけてmAb 0051の存在下または不在下でモニタリングした。
TLT-1の一次配列を100%カバーする22個のペプチドのHX時間経過を10秒〜1000秒にかけてmAb 0062の存在下または不在下でモニタリングした。
hTLT-1.16-162タンパク質またはhTLT-1.126-162を使用して、2つの別々の実験でmAb 0061のエピトープをマッピングした。
hTLT1 ECD-HPC4 Ala突然変異体の産生、特徴付けおよび結合分析。table 7(表7)に従ってhTLT-1 ECD-HPC4アラニン突然変異構築物を設計した。外部請負業者GENEART AG(Im Gewerbepark B35、93059 Regensburg、Germany)によって発現構築物が開発され、発現構築物は全て、pcDNA3.1(+)と称する発現ベクターを基礎として作製された。各hTLT-1 ECD-HPC4 Ala突然変異タンパク質(Table 7(表7))を一過性に発現させるために、40種のhTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+)発現構築物それぞれのDNAのアリコートをHEK293-6E浮遊細胞にトランスフェクトした。HEK293-6e細胞の一過性トランスフェクションおよび培養は、実施例Aに記載のように行った。
抗TLT-1 FabとTLT-1ストークペプチドとの結晶構造複合体。
結晶化用0100抗TLT-1 Fabの発現:一般化された手順に従って、配列番号162に対応する重鎖および配列番号163に対応する軽鎖を含む抗TLT-1 Fab断片Fab0100をHEK293細胞中で一過性に発現させた。
Table 15および16(表15および16)に示されるように、抗TLT-1はTLT-1のストークと有効に結合する。CCP4プログラムスイートのソフトウェアプログラムAREAIMOLを使用して、抗TLT-1とTLT-1とのペアワイズ相互作用において排除された平均面積が764Å2と算出された。Fab0100:hTLT-1.126-162複合体のペアワイズ相互作用において排除された平均面積は、抗TLT-1およびTLT-1についてそれぞれ656および871Å2を示した。
ペプチドウォークによるエピトープマッピング。ペプチドウォーキングELISAでペプチドの最小限の結合領域が定義された。これは、ストレプトアビジンプレート中で、TLT-1のストーク領域中に1残基のフレームシフトを有するビオチン化ペプチドを被覆し、その後対象とする抗体(mAb 0061)を結合させることによって確立された。検出用二次抗体を添加し、450nmで結合を測定した。陽性対照:ビオチン化TLT-1との結合。
10×PBS:10×GPBS 14200 Gibco
Tween20:Aldrichカタログ番号27,434-8、ロット番号S30950-315
プレート:96ウェルストレプトアビジン被覆プレート、Nunc番号466014
BSA:A7030-100g、ロット番号057K0737
ブロッキング/希釈緩衝液:1×PBS pH=7.4、2%BSA、0.5%Tween20
洗浄緩衝液:1×PBS+0.5%Tween20
標準物質:ビオチン化TLT-1 04/09-08 1mg/ml
mAb:0197-0000-0061-4A-0.55mg/ml
検出Ab:ヤギ抗ヒトIgG HRP標識 1mg/ml、製品番号NEF802001EA
TMB基質:使用準備済、カタログ番号4390L、ロット番号70904
停止溶液:2M H3PO4
1mg/ml->6.3ng/ml(158500×希釈)
ウェル中の濃度:0.63ng
概算濃度2〜5mg/ml(2.5mg/ml)
2.5mg/ml->10000×希釈(25ng/ウェル):各ウェル中に各ペプチドを100μl。
0.55mg/ml->100ng/ml(5500×希釈)
ウェル中の濃度:10ng
1mg/ml->0.2μg/ml(5000×希釈)
標準的な固相ペプチド合成を使用してビオチン化ペプチドを合成した。N-メチルピロリジノン(NMP)中0.3Mの1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)中0.3MのFmoc保護アミノ酸の溶液を、ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を使用して1〜4時間結合させた。96マイクロタイターフィルタープレート(Nunc)中で固体支持体としてRinkアミドLL樹脂(Merck)を使用し、1ウェル当たり約20mgの樹脂を使用した。Intavis、Germanyの Multipep RSペプチド合成機を使用して合成を行い、製造業者のプロトコールを使用した。NMP中25%のピペリジンを使用してFmocの除去を行った。全てのペプチドをN末端でビオチンと結合させ、ビオチンとペプチドの間のスペーサーとして8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸を使用した。合成プロトコール(IRIS biotech、Germany)に従って、Fmoc保護構成単位としてもこのスペーサーを結合させた。
90%トリフルオロ酢酸(TFA)、5%トリイソプロピルシランおよび5%H2Oを使用して最終的な脱保護を3時間行った。1ウェル当たりに合計1mlのTFAを使用した。TFAを96深型ウェル(Nunc)に濾過し、蒸発によってTFAの体積を1ウェル当たり約100〜200ulに減らし、ペプチドを沈殿させるためにジエチルエーテルを全てのウェルに添加した。ジエチルエーテル中のペプチドの懸濁液をsolvinert 96ウェルフィルタープレート(0.47um、Millipore)に移し、ペプチドをジエチルエーテルで2回洗浄し乾燥させた。ペプチドを80%DMSOおよび20%水中で再溶解して、約1〜3mg/mlのストック溶液が得られた。
75%DMSO/H2O中2〜5mg/ml(N末端でビオチン化):
ペプチドの番号は左に示されている:
75%DMSO/H2O中2〜5mg/ml:
エピトープマッピングは、TLT-1のストーク領域の2つの系列のビオチン化ペプチドとmAb 0061の結合からなっていた。ビオチン化ペプチドをストレプトアビジンプレートと結合させた。
LNILPPEEEEETHKIGSLAENAFSDPAGSANPLEPSQDEKSIPL
1)1残基のフレームシフトを有する20merペプチドのマッピング(20,1)(材料を参照)
2)1残基のフレームシフトを有する16merペプチドのマッピング(16,1)(材料を参照)
2. 100μlのビオチン化ペプチド溶液を添加した(マスタープレートから、10000×希釈、1ウェル当たり1つのペプチド)
3. RTで1時間または+5℃で終夜インキュベートした
4. 洗浄緩衝液で3回洗浄した
5. 100μlの一次抗体を添加した(希釈は上記を参照)
6. RTで1時間インキュベートした7. 洗浄緩衝液で3回洗浄した
8. 100μlの二次抗体を添加した(希釈は上記を参照)
9. RTで1時間インキュベートした
10. 洗浄緩衝液で3回洗浄した
11. 100μlの基質/発色緩衝液を添加した(反応時間3分)
12. 100μlの2M H3PO4を添加した
13. 450nmで終点を読み取った
ビオチン化ペプチドを以下のようにウェルに入れた:
行A:ペプチド2〜12 (20mer)
行B:ペプチド13〜24 (20mer)
行C:ペプチド25〜27 (20mer)
行C:ペプチド29〜36 (16mer)
行D:ペプチド37〜48 (16mer)
行E:ペプチド49〜58 (16mer)
ペプチドウォーキングELISAで、アミノ酸残基の以下のストレッチ:KIGSLAENAFとして、mAb 0061との結合についてのエピトープの最小限の結合区域が定義された。このストレッチは、実際に、結晶構造により上記で定義されたエピトープ:ETHKIGSLAENAFSDPの一部である。
配列番号1は、ヒト(h)TLT-1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号2は、hTLT-1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号3は、hTLT-1-His6の細胞外ドメインのヌクレオチド配列を提供する。
配列番号4は、hTLT-1-His6の細胞外ドメインのアミノ酸配列を提供する。
配列番号5〜8は、hTLT-1断片:hTLT-1.20-125、hTLT-1.16-162、hTLT-1.126-162およびhTLT-1.129-142のアミノ酸配列を提供する。
配列番号9は、mAb 0012(2F105)、LCの可変ドメインのヌクレオチド配列を提供する。
配列番号10は、mAb 0012(2F105)、LCの可変ドメインのアミノ酸配列を提供する。
配列番号11は、0012(2F105)HCの可変ドメインのヌクレオチド配列を提供する。
配列番号12は、0012(2F105)HCの可変ドメインのアミノ酸配列を提供する。
配列番号13は、hTF.1-219の核酸配列を提供する。
配列番号14は、hTF.1-219のアミノ酸配列を提供する。
配列番号15は、ヒト組織因子の核酸配列を提供する。
配列番号16は、ヒト組織因子のアミノ酸配列を提供する。
配列番号17は、mAb 0012の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号18は、mAb 0012およびFab 0012の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号19は、mAb 0023の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号20は、mAb 0023およびFab 0023の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号21は、mAb 0051の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号22は、mAb 0051およびFab 0051の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号23は、mAb 0052の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号24は、mAb 0062の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号25は、mAb 0052、Fab 0052およびmAb 0062の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号26は、mAb 0061の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号27は、mAb 0082の重鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号28は、mAb 0061、Fab 0061、mAb 0082およびFab 0082の軽鎖のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号29は、Fab 0012 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号30は、Fab 0023 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号31は、Fab 0051 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号32は、Fab 0052 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号33は、Fab 0061 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号34は、Fab 0082 VH-CH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号35は、Fab AP-3 VH-VH1のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号36は、Fab AP-3 LCのヌクレオチド配列を提供する。
配列番号37は、Fab-AP-3 LC.C34Sのヌクレオチド配列を提供する。
配列番号38は、hIgG4ヒンジ-CH2-CH3のヌクレオチド配列を提供する。
配列番号39は、mAb 0012、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号40は、mAb 0012、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)およびFab 0012、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号41は、mAb 0023、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号42は、mAb 0023、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)およびFab 0023、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号43は、mAb 0051、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号44は、mAb 0051、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)およびFab 0051、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号45は、mAb 0052、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号46は、mAb 0052、LC(マウスVL-ヒトカッパCL);Fab 0052、LC(マウスVL-ヒトカッパCL);mAb 0062、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号47は、mAb 0061、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号48は、mAb 0061、LC(マウスVL-ヒトカッパCL);Fab 0061、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)およびmAb 0082、LC(マウスVL-ヒトカッパCL);Fab 0082、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号49は、mAb 0062、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号50は、mAb 0082、HC(マウスVH-ヒトIgG4 CH1-CH2-CH3)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号51は、Fab 0012、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号52は、Fab 0023、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号53は、Fab 0051、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号54は、Fab 0052、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号55は、Fab 0082、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号56は、Fab AP-3、マウスVH-ヒトIgG4 CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号57は、Fab AP-3、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号58は、Fab AP-3.LC.C34S、LC(マウスVL-ヒトカッパCL)のアミノ酸配列を提供する。
配列番号59〜68は、任意選択リンカーL2〜L10のアミノ酸配列を提供する。任意選択リンカーは、Table 3(表3)で番号付けられ列挙されている。
配列番号69は、精製タグHPC4のアミノ酸配列を提供する。
配列番号70〜155は、実施例4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20、24、25に記載の発現構築物の開発の間に使用されたプライマーの核酸配列を提供する。
配列番号156は、Fab 0061 VH-CH1のアミノ酸配列を提供する。
配列番号157は、hIgG4-ヒンジ-CH2-CH3のアミノ酸配列を提供する。
配列番号158は、His6タグのアミノ酸配列を提供する。
配列番号159は、hTLT-1.18-188のアミノ酸配列を提供する。
配列番号160は、プライマーno.1004の核酸配列を提供する。
配列番号161は、プライマーno.1005の核酸配列を提供する。
配列番号162は、Fab 0100 HCのアミノ酸配列を提供する。
配列番号163は、Fab 0100 LCのアミノ酸配列を提供する。
Claims (13)
- 配列番号2又は配列番号4のK133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145及びA146からなる群から選択される1つ又は複数の残基を含むエピトープを有する、TREM様転写物1(TLT−1)又はその断片と特異的に結合するモノクローナル抗体又はその断片。
- 前記エピトープが、配列番号2又は配列番号4のアミノ酸K133、I134、G135、S136、L137、A138、N140、A141、F142、S143、D144、P145及びA146を含む、請求項1に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
- 前記抗TLT−1の軽(L)鎖(配列番号40)のH50、Y56、H58、Y73、F79、S115、T116、V118及びY120、並びに前記抗TLT−1の重(H)鎖(配列番号39)の残基V20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118及びT120からなる群から選択される1つ又は複数の残基を含むパラトープを有する、請求項1又は2に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
- 前記パラトープが、前記抗TLT−1の軽(L)鎖(配列番号40)のH50、Y56、H58、Y73、F79、S115、T116、V118及びY120、並びに前記抗TLT−1の重(H)鎖(配列番号39)のV20、F45、R49、Y50、W51、E68、T75、N77、S116、G117、V118及びT120を含む、請求項3に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
- 前記重鎖が、
● 配列番号39のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、CDR1配列、及び/又は
● 配列番号39のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つ又は4つが、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、CDR2配列、及び/又は
● 配列番号39のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ又は3つが、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含み、
前記軽鎖が、
● 配列番号40のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つ又は4つが、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、CDR1配列、及び/又は
● 配列番号40のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ又は2つが、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、CDR2配列、及び/又は
● 配列番号40のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ又は2つが、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、CDR3配列
を含む、
請求項1〜4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。 - 前記重鎖が、
● 配列番号50のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つが、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、CDR1配列、及び/又は
● 配列番号50のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYAPSLKD)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つ又は4つが、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、CDR2配列、及び/又は
● 配列番号50のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つが、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい、CDR3配列
を含み、
前記軽鎖が、
● 配列番号48のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列であって、これらのアミノ酸の1つ、2つ、3つ又は4つが、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、CDR1配列、及び/又は
● 配列番号48のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列であって、これらのアミノ酸の1つ又は2つが、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、CDR2配列、及び/又は
● 配列番号48のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列であって、これらのアミノ酸の1つ又は2つが、異なるアミノ酸で置換されていてもよい、CDR3配列
を含む、
請求項1〜4のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。 - 前記重鎖が、
● 配列番号39のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列、
● 配列番号39のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYTPSLKD)のCDR2配列、及び
● 配列番号39のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列
を含み、
前記軽鎖が、
● 配列番号40のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列、
● 配列番号40のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列、及び
● 配列番号40のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列
を含む、
請求項5に記載のモノクローナル抗体又はその断片。 - 前記重鎖が、
● 配列番号50のアミノ酸49〜53(RYWMT)のCDR1配列、
● 配列番号50のアミノ酸68〜84(EINPDSSTINYAPSLKD)のCDR2配列、及び
● 配列番号50のアミノ酸117〜121(GVFTS)のCDR3配列
を含み、
前記軽鎖が、
● 配列番号48のアミノ酸43〜58(RSSQSLVHRNGNTYFH)のCDR1配列、
● 配列番号48のアミノ酸74〜80(KVSNRFS)のCDR2配列、及び
● 配列番号48のアミノ酸113〜121(SQSTHVPYT)のCDR3配列
を含む、
請求項6に記載のモノクローナル抗体又はその断片。 - ヒト化モノクローナル抗体又はその断片である、請求項1〜8のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片。
- Fab、F(ab’)2、Fab’、Fd、Fv、ScFv、dAb及び単離相補性決定領域(CDR)からなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の抗体断片。
- Fab断片である、請求項10に記載の抗体断片。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片と同じエピトープと特異的に結合する、凝固促進性融合タンパク質又は構築物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体又はその断片を含む、凝固促進性融合タンパク質又は構築物。
Applications Claiming Priority (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP09168833 | 2009-08-27 | ||
EP09168833.3 | 2009-08-27 | ||
US23914209P | 2009-09-02 | 2009-09-02 | |
US61/239,142 | 2009-09-02 | ||
US28894409P | 2009-12-22 | 2009-12-22 | |
US61/288,944 | 2009-12-22 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012526070A Division JP2013503140A (ja) | 2009-08-27 | 2010-08-26 | 活性化血小板に対する組織因子の標的化 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017048249A true JP2017048249A (ja) | 2017-03-09 |
JP6693860B2 JP6693860B2 (ja) | 2020-05-13 |
Family
ID=41170106
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012526070A Withdrawn JP2013503140A (ja) | 2009-08-27 | 2010-08-26 | 活性化血小板に対する組織因子の標的化 |
JP2016236487A Active JP6693860B2 (ja) | 2009-08-27 | 2016-12-06 | 活性化血小板に対する組織因子の標的化 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012526070A Withdrawn JP2013503140A (ja) | 2009-08-27 | 2010-08-26 | 活性化血小板に対する組織因子の標的化 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20120178908A1 (ja) |
EP (2) | EP2470561A1 (ja) |
JP (2) | JP2013503140A (ja) |
CN (1) | CN102574908B (ja) |
ES (1) | ES2898683T3 (ja) |
WO (1) | WO2011023785A1 (ja) |
Families Citing this family (23)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
CA2718869C (en) | 2008-03-19 | 2018-10-30 | China Synthetic Rubber Corporation | Methods and agents for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma |
WO2010104747A2 (en) | 2009-03-10 | 2010-09-16 | Baylor Research Institute | Antigen presenting cell targeted vaccines |
MX2011009438A (es) | 2009-03-10 | 2012-04-02 | Baylor Res Inst | Anticuerpos anti-cd40 y usos de los mismos. |
MX2013000301A (es) | 2010-07-09 | 2013-05-09 | Biogen Idec Hemophilia Inc | Factores quimericos de coagulacion. |
CN103429256B (zh) | 2011-03-02 | 2022-09-13 | 诺和诺德保健股份有限公司 | 凝血因子向活化的血小板上的tlt-1的靶向 |
AU2014228938B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-02 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor IX polypeptide formulations |
US9493552B2 (en) | 2013-11-15 | 2016-11-15 | China Synthetic Rubber Corporation | Therapeutic biologic for treatment of hepatocellular carcinoma |
US10286058B2 (en) | 2014-01-13 | 2019-05-14 | Baylor Research Institute | Vaccines against HPV and HPV-related diseases |
US11566082B2 (en) | 2014-11-17 | 2023-01-31 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
RU2018140056A (ru) * | 2016-04-15 | 2020-05-15 | Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания | Композиции и способы с использованием т-клеток с химерным рецептором аллоантигена |
CN109311949B (zh) | 2016-05-11 | 2022-09-16 | 思拓凡生物工艺研发有限公司 | 储存分离基质的方法 |
US10730908B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-08-04 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
US10654887B2 (en) | 2016-05-11 | 2020-05-19 | Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab | Separation matrix |
US10889615B2 (en) | 2016-05-11 | 2021-01-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Mutated immunoglobulin-binding polypeptides |
US10703774B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-07-07 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Separation method |
ES2874974T3 (es) | 2016-05-11 | 2021-11-05 | Cytiva Bioprocess R & D Ab | Matriz de separación |
US11753438B2 (en) | 2016-05-11 | 2023-09-12 | Cytiva Bioprocess R&D Ab | Method of cleaning and/or sanitizing a separation matrix |
WO2019028182A2 (en) * | 2017-08-01 | 2019-02-07 | Remd Biotherapeutics, Inc. | TREATMENT OF CANCER USING ANTIBODIES BINDING TO THE HUMAN CD134 RECEPTOR (OX40) |
US10610585B2 (en) | 2017-09-26 | 2020-04-07 | Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) | Methods and compositions for treating and preventing HIV |
WO2020212415A1 (en) * | 2019-04-17 | 2020-10-22 | Novo Nordisk A/S | Bispecific antibodies |
CN113891896B (zh) * | 2019-05-07 | 2023-09-26 | 庄亚(北京)生物科技有限公司 | 单域抗体融合蛋白及其在止血中的应用 |
EP4149527A4 (en) * | 2020-05-14 | 2024-07-10 | Ascendo Biotechnology Inc | SELECTIVE TARGETING OF TREML1/MD2 INTERACTION BY SMALL PEPTIDES OR PROTEINS AND ITS USE FOR VACCINE ADJUVANTS |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040180409A1 (en) * | 2003-03-16 | 2004-09-16 | Mcvicar Daniel | TLT-1, a novel platelet-associated receptor and uses therefor |
US20080131423A1 (en) * | 2006-12-04 | 2008-06-05 | Government Of The Us, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Anti-TREM-like transcript-1 (TLT-1) antibodies, methods and compositions |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE60238435D1 (de) * | 2001-10-26 | 2011-01-05 | Scripps Research Inst | Gezielte thrombose durch gewebefaktor polypeptiden |
AR045563A1 (es) * | 2003-09-10 | 2005-11-02 | Warner Lambert Co | Anticuerpos dirigidos a m-csf |
US7393833B2 (en) * | 2005-03-09 | 2008-07-01 | The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma | Chimeric proteins with phosphatidylserine binding domains |
US8204167B2 (en) * | 2007-05-21 | 2012-06-19 | Infineon Technologies Ag | Master slave interface |
-
2010
- 2010-08-26 WO PCT/EP2010/062519 patent/WO2011023785A1/en active Application Filing
- 2010-08-26 US US13/391,755 patent/US20120178908A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-26 EP EP10747035A patent/EP2470561A1/en not_active Withdrawn
- 2010-08-26 ES ES17150751T patent/ES2898683T3/es active Active
- 2010-08-26 JP JP2012526070A patent/JP2013503140A/ja not_active Withdrawn
- 2010-08-26 CN CN201080037936.1A patent/CN102574908B/zh active Active
- 2010-08-26 EP EP17150751.0A patent/EP3219723B1/en active Active
-
2016
- 2016-04-04 US US15/090,002 patent/US10106606B2/en active Active
- 2016-12-06 JP JP2016236487A patent/JP6693860B2/ja active Active
-
2018
- 2018-09-13 US US16/130,339 patent/US20190062429A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040180409A1 (en) * | 2003-03-16 | 2004-09-16 | Mcvicar Daniel | TLT-1, a novel platelet-associated receptor and uses therefor |
US20080131423A1 (en) * | 2006-12-04 | 2008-06-05 | Government Of The Us, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Anti-TREM-like transcript-1 (TLT-1) antibodies, methods and compositions |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20120178908A1 (en) | 2012-07-12 |
US10106606B2 (en) | 2018-10-23 |
CN102574908B (zh) | 2018-08-03 |
EP2470561A1 (en) | 2012-07-04 |
EP3219723B1 (en) | 2021-10-06 |
US20160272710A1 (en) | 2016-09-22 |
WO2011023785A1 (en) | 2011-03-03 |
EP3219723A1 (en) | 2017-09-20 |
CN102574908A (zh) | 2012-07-11 |
JP2013503140A (ja) | 2013-01-31 |
JP6693860B2 (ja) | 2020-05-13 |
US20190062429A1 (en) | 2019-02-28 |
ES2898683T3 (es) | 2022-03-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6693860B2 (ja) | 活性化血小板に対する組織因子の標的化 | |
JP7366747B2 (ja) | 血液凝固抗体 | |
US11135275B2 (en) | Coagulation factor-targeting to TREM-like transcript 1 (TLT-1) on activated platelets | |
US20160297892A1 (en) | Novel Methods and Antibodies for Treating Coagulapathy | |
TWI716059B (zh) | 經改良的促凝血抗體 | |
JP2022529036A (ja) | 二重特異性抗体 | |
US20130052192A1 (en) | Activatable Constructs |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161220 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171127 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180119 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180528 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181105 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190121 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190426 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20190917 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200116 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20200123 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200323 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200416 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6693860 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |